CZ20033438A3 - Způsoby pro indukování cytotoxické imunitní reakce a přípravky rekombinantního opičího adenoviru použitelné v těchto způsobech - Google Patents

Způsoby pro indukování cytotoxické imunitní reakce a přípravky rekombinantního opičího adenoviru použitelné v těchto způsobech Download PDF

Info

Publication number
CZ20033438A3
CZ20033438A3 CZ20033438A CZ20033438A CZ20033438A3 CZ 20033438 A3 CZ20033438 A3 CZ 20033438A3 CZ 20033438 A CZ20033438 A CZ 20033438A CZ 20033438 A CZ20033438 A CZ 20033438A CZ 20033438 A3 CZ20033438 A3 CZ 20033438A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
virus
adenovirus
recombinant
gly
thr
Prior art date
Application number
CZ20033438A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ304169B6 (cs
Inventor
Hildegund C. J. Ertl
James M. Wilson
Original Assignee
The Wistar Institute Of Anatomy And Biology
The Trustees Of The University Of Pennsylvania
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by The Wistar Institute Of Anatomy And Biology, The Trustees Of The University Of Pennsylvania filed Critical The Wistar Institute Of Anatomy And Biology
Publication of CZ20033438A3 publication Critical patent/CZ20033438A3/cs
Publication of CZ304169B6 publication Critical patent/CZ304169B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/235—Adenoviridae
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10361—Methods of inactivation or attenuation
    • C12N2710/10362—Methods of inactivation or attenuation by genetic engineering
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
    • C12N2740/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
    • C12N2740/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/20011—Rhabdoviridae
    • C12N2760/20111—Lyssavirus, e.g. rabies virus
    • C12N2760/20122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/20011—Rhabdoviridae
    • C12N2760/20111—Lyssavirus, e.g. rabies virus
    • C12N2760/20134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/001—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination
    • C12N2830/002—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination inducible enhancer/promoter combination, e.g. hypoxia, iron, transcription factor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/55—Vector systems having a special element relevant for transcription from bacteria
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Způsoby pro indukování cytotoxické imunitní reakce a přípravky rekombinantního opičího adenoviru použitelné v těchto způsobech
Oblast vynálezu
Předkládaný vynález popisuje způsob pro indukování CD8+ T reakce proti vybrané molekule tím, že se dodá molekula pomocí rekombinantního opičího adenoviru. Vynález také poskytuje způsoby pro indukování interferonu-α a interferonu-β u jedince pomocí podání rekombinantního opičího adenoviru jedinci. Způsoby a prostředky podle předkládaného vynálezu jsou vhodné pro profylaxi a léčbu infekcí Virem lidské imunodeficience a lidským papilloma virem, a též v protinádorové terapii.
Dosavadní stav techniky
Rekombinantní adenoviry lidského sérotypu 5 byly testovány jako nosiče ve vakcínách pro různé antigeny z virů, parazitů nebo nádorových buněk. Výsledky byly povzbudivé, protože rekombinantní adenoviry s deletovaným El vyvolávaly imunitní reakce k produktům transgenu. Adenovirus lidského sérotypu 5 (Ad5) je všudypřítomným nepatogenním virem, který infikuje většinu lidí během prvního roku jejich života. Předkladatelé vynálezu zjistili, že pre-existující imunita k běžným lidským serotypům redukuje účinnost adenovirové rekombinantní vakcíny na bázi homologního sérotypu viru. V některých případech může být tato redukce účinnosti překonána podáním vyšších dávek rekombinantního lidského adenoviru. Nicméně, tyto vyšší dávky mohou být asociované s dalšími nežádoucími vedlejšími účinky.
Existuje tedy potřeba prostředků použitelných pro indukci imunitní reakce na vybranou molekulu, které by neměly nedostatky spojené se současnými způsoby podání.
Podstata vynálezu
Předkládaný vynález poskytuje způsob pro přednostní indukci cytotoxické imunitní reakce na heterologní molekulu, při kterém je molekula podána hostiteli pomocí rekombinantního opičího adenoviru. Předkladatelé vynálezu neočekávaně zjistili, že rekombinantní opičí adenoviry, použité podle předkládaného vynálezu, prezentují imunogen způsobem, který indukuje významně silnější CD8+ Tlymfocytární reakci, než když je imunogen dodán srovnatelným lidským virem typu 5. Dále předkladatelé vynálezu zjistili, že rekombinantní šimpanzí adenoviry indukují přibližně 5krát vyšší hladiny interferonu-α a interferopu-β než lidské adenoviry.
V jednom aspektu tedy předkládaný vynález poskytuje způsob přednostního indukování CD8+ T-lymfocytární reakce na heterologní molekulu u jedince, při kterém je jedinci podán rekombinantní opičí adenovirus nesoucí molekulu. Ve výhodném provedení je rekombinantním opičím adenovirem rekombinantní šimpanzí adenovirus.
V jiném aspektu vynález poskytuje způsob indukce produkce interferonu-α a/nebo interferonu-β u jedince, při kterém je jedinci podán rekombinantní opičí gdenovirus.
V ještě dalším aspektu vynález poskytuje imunogenní prostředek použitelný pro indukci CD8+ T-lymťocytární reakce proti viru lidské imunodeficience. Prostředek obsahuje rekombinantní opičí adenovirus obsahující optimalizcpvanou
sekvenci nukleóvé kyseliny kódující modifikovaný gag protein viru lidské imunodeficience-1 a fyziologicky kompatibilní nosič.
V ještě jiném aspektu vynález poskytuje způsob pro indukci CD8+ T-lymfocytární reakce proti viru lidské imůnodeficience u savců, při kterém je savcům podán imunogenní prostředek podle předkládaného vynálezu.
V ještě dalším aspektu vynález poskytuje způsob indukování CD8+ T-lymfocytární reakce proti lidskému papilloma viru, při kterém je savci podán rekombinantní opičí adenovirus kódující imunogenní protein z lidského papilloma viru.
Další výhody předkládaného vynálezu budou zřejmé z následujícího podrobného popisu vynálezu.
Popis obrázků na připojených výkresech
Obr. 1 shrnuje genetickou organizaci genomu šimpanzího adenoviru C68. Na obr. 1A je genem C68 šimpanzího adenoviru schématicky znázorněn horním rámečkem. Invertované terminální repetitivní sekvence jsou černě a časné regiony jsou šedě. Šipky nad rámečkem ukazují směr exprese časných genů. Čára pod boxem představuje rozdělení genomu na 100 mapových jednotek. Šipky dole ukazují pět pozdních genových regionů a proteinů kódovaných v každém regionu. Čísla pod rámečkem nebo šipky ukazují start (promotor nebo iniciační kodon) a konec (kanonický PolyA signál) pro každý region. ★ označuje E2A pozdní promotor. Obr. 1B ilustruje Pstl klony; Obr. IC ilustruje BamHI klony. Obr. ID ilustruje HindlII klony. Pro části 1B-1D ukazují nestínované regiony, že fragment byl klonovaný do plasmidového vektoru, jak je • · uvedeno v tabulce 1, zatímco stínované regiony ukazují, že restrikční fragment nebyl klonovaný. Pro každou část je pod rámečkem uvedeno jméno fragmentu, alfabeticky s tím, že A je největší fragment, a velikost fragmentu, a konce fragmentů jsou označeny pod rámečkěm.
Obr. 2 ukazuje srovnání několika sekvencí hexonových proteinů. Odvozené aminokyselinové sekvence vysoce podobných lidských adenovirových hexonů byly srovnávány s šimpanzím adenovirem za použití CLUSTAL X. Serotypy a podskupiny jsou uvedeny na levém okraji a po nich je uvedeno číslo zbytku. Číslice označují pozici aminokyseliny vzhledem ke startu translace. Aminokyseliny jsou označené s ohledem na C8 6, aby byly zvýrazněny podobnosti sekvence (šedě) a identity sekvence (černě). Zespoda je označeno sedm hypervariabilních regionů se smyčkovými doménami DE1 a FG1 a tyto odpovídají následujícím Ad2 sekvencím v seřazení: HVR1, 137-188; HVR2, 194-204; HVR3, 222-229; HVR4, 258-271; HVR5, 278-294; HVR6, 316-327; a HVR7, 433-465. GenBank přírůstková číslo pro sekvence jsou následující: AAD03657 (Ad4), S37216 (Adl6), S39298 (Ad3), AAD03663 (Ad7) a NP040525 (Ad2).
Podrobný popis předkládaného vynálezu
Pří srovnání imunogenity rekombinantních adenovirů lidského kmene 5 a šimpanzího adenovirů kmene 68, které oba exprimují zkrácené sekvence gag, bylo prokázáno, že šimpanzí adenovirus je účinnější. Podobné výsledky byly pozorovány pro rekombinantní šimpanzí adenoviry exprimující zelený fluorescentní protein a glykoprotein viru vztekliny. Tato vyšší účinnost rekombinantní šimpanzího adenovirů není s největší pravděpodobností vázána na vyšší expresi transgenu, protože pokusy byly provedeny jak s Ad, tak s šimpanzími rekombinanty nesoucími podobné expresní kazety, • ·
ve kterých je transgen řízen časným cytomegalovirovým promotorem. Zde uvedená data také naznačují, že je nepravděpodobné, aby byly rozdíly v důsledku tropismu, protože jak šimpanzí, tak Ad5 virus využívá stejný buněčný receptor. Místo toho výsledky ukazují, že rekombinant šimpanzí adenovirus, použitý způsobem podle předkládaného vynálezu, má neočekávaně vyšší účinnost v adjuvanci než lidský adenovirus. Tato lepší ádjuvantní účinnost má výrazný vliv na velikost a kinetiku imunitní reakce specifické pro transgen, která je indukována šimpanzím adenovirem.
Výhodné je, že tato vyšší účinnost umožňuje použití nižších dávek šimpanzího adenoviru, než jsou dávky, které by byly nutné pro lidský adenovirový transportní systém. Dále předkladatelé vynálezu zjistili, že rekombinantní šimpanzí adenoviry indukují přibližně 5-krát výšší koncentrace interferonu-α a interferonu-β než lidské adenoviry.
Dále bylo zjištěno, že rekombinantní šimpanzí adenoviry mají přibližně stejný vliv na dendritické buňky jako lidský adenovirus typu 5. Tento vliv, stejné jako neočekávaná účinnost opičích adenovirů, poskytuje významné výhody v indukci cytotoxické imunitní reakce na vybraný antigen a v léčbě stavů, u kterých je žádoucí zvýšená indukce interferonu-α a/nebo interferonu-β.
I. Rekombinantní opičí adenovirus
A. Zdroje
Různé sekvence šimpanzího adenoviru jsou dostupné z
American Type Culture Collection, 10801 University
Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209, a z jiných zdrojů.
Požadovanými šimpanzími kmeny jsou Pan 5 [ATCC VR-591], Pan • · [ATCC VR-592] a Pan 7 [ATCC VR-593]. Nejvhodnějšími jsou šimpanzí adenovirové kmeny Bertha nebo Cl [ATCC přírůstkové č. VR-20] a šimpanzí adenovirus kmene Pan 9 nebo CV68 [ATCC VR-594]. Virus CV68 j pro zjednodušení označován v předkládaném vynálezu jako C68. Viry byly původně izolovány ze stolice [Cl, Rowe et al, Proč. Soc. Exp. Med., 91:260 (1956)] nebo z mesenteriálních mízních uzlin [C68, Basnight et al, Am.J. Epidemiol., 94:166 (1971)] infikovaných šimpanzů. Sekvence těchto kmenů a lokalizace adenovirových genů Ela, Elb, E2a, E2b, E3, E4, LI, L2, L3,
L4 a L5 jsou uvedeny v US Patentu 6,083,716, který je zde uveden jako odkaz. Volitelftě mohou být non-šimpanzí opičí adenovirové sekvence použity při přípravě rekombinantních vektorů podle předkládaného vynálezu. Takové non-šimpanzí adenoviry zahrnují ty, které jsou získány z paviáních adenovirových kmenů [např., ATCČ VR275], adenovirových kmenů izolovaných od makaků rhesus [např., ATCC VR-209, ATCC VR275, ATCC VR-353, ATCC VR-355], a adenovirových kmenů izolovaných z afrických makaků [např., ATCC VR-541; ATCC VR941; ATCC VR-942; ATCC VR-943].
Rekombinantní šimpanzí (nebo jiné opičí) adenoviry podle předkládaného vynálezu mohou obsahovat adenQvirové sekvence získané z jednoho nebo více opičích adenovirových kmenů.
Tyto sekvence mohou být získané z přirozených zdrojů, mohou být produkovány rekombinantně, synteticky nebo jinými chemickými metodami nebo technikami genetického inženýrství.
B. Rekombinantní opičí adenoviry
Rekombinantní opičí adenoviry použitelné v předkládaném vynálezu jsou virové částice, které se skládají z rekombinantních opičích adenovirových sekvencí nesoucích heterologní molekulu a/nebo kapsidové proteiny opičího adenoviru. Tyto opičí adenoviry, a zejména šimpanzí C68 a Cl sekvence, jsou také vhodné pro přípravu hybridních vektorů s jinými opičími nebo neopičími adenoviry, a při přípravě pseudotypovaných rekombinantních virů, tj. rekombinantních virů s adenovirovým vektorem nesoucím heterologní molekulu, která je sbalena v heterologním kapsidovém proteinu opičího původu.
1. Rekombinantní opičí adenovirus
Minimálně rekombinantní opičí adenovirus použitelný v předkládaném vynálezu obsahuje cis-elementy opičího adenoviru nutné pro replikaci a enkapsidaci viru, kde tyto cis-elementy obklopují heterologní gen. To znamená, že vektor obsahuje cis-působící 5' invertované terminální repetitivní (ITR) sekvence adenovirů, ktéré účinkují jako sekvence rozpoznávající počátek replikace), přirozené 5' balící domény/zesilovače transkripce (které obsahují sekvence nutné pro balení lineárních Ad genomů a zesilovací prvky pro El promotor), heterologní molekulu, a 5' ITR sekvenci. Viz, například, techniky pro přípravu minimálního lidského Ad vektoru v US Patentu 6,203,975, který je zde uveden jako odkaz, a které mohou být snadno upraveny pro rekombinantní opičí adenovirus.
Volitelně rekombinantní opičí adenoviry použitelné v předkládaném vynáležu obsahují více než minimální opičí adenovirovou sekvenci definovanou výše. Tyto další Ad vektory mohou být charakterizovány jako vektory mající modifikace, které destruují schopnost adenoviru exprimovat jeden nebo více vybraných genových produktů. Výraz funkční delece je zde použit pro popsání takových modifikací.
Takové funkční delece mají typicky formu delece celého genu nebo části genu viru. Nicméně, takové funkční delece • ··
mohou mít také formu mutace spočívající v posunu čtecího rámce. Odborníkům v oboru budou jasné i další modifikace, které mohou být použity pro dosažení funkčních delecí.
V konkrétním požadovaném provedení jsou opičí adenoviry defektní v replikaci v důsledku absence schopnosti exprimovat adenovirové Ela a Elb, tj. tyto viry jsou funkčně deletované v Ela a Elb. Tyto rekombinantní opičí adenoviry mohou také nést funkční delece v jiných genech.
Například může být adenovirový opožděný časný gen E3 eliminován ze sekvence opičího adenoviru, která tvoří část rekombinantního viru. Funkce E3 není nutná pro produkci rekombinantních adenovirových částic. Tak není nutné nahrazovat funkci tohoto genového produktu pro sbalení rekombinantního opičího adenoviru použitelného v předkládaném vynálezu.
Rekombinantní opičí adenoviry mohou být také konstruovány tak, že mají funkční delece v E4 genu, ačkoliv může být žádoucí zachovat funkci E4 ORF6. Ještě jiný vektor použitelný v předkládaném vynálezu obsahuje deleci v opožděném časném genu E2a. Delece může být také provedena v jakémkoliv z pozdních genů LI až L5 genomu opičího adenoviru. Delece ve vmezeřených genech IX a IVa2 mohou být také užitečné pro některé účely. Jiné delece mohou být provedeny v dalších strukturálních i nestrukturálních genech. Výše uvedené delece mohou být použity samostatně, tj. adenovirové sekvence podle předkládaného vynálezu mohou obsahovat delece pouze v El. Alternativně mohou být delece v celýčh genech nebo v jejich částech, účinné pro destrukcí jejich biologické aktivity, použity v jakékoliv kombinaci. Například, v jednom příkladném vektoru mohou mít adenovirové sekvence delece v El genu a v E4 genu, nebo v El, E2a a E3 • · © * · • · · · · genech, nebo v El a E3 genech, nebo v El, E2a a E4 genech, s nebo bez delece E3, a tak dále. Takové delece mohou být použity V kombinaci s dalšími mutacemi, jako jsou teplotněsensitivní mutace, pro dosažení požadovaného výsledku.
Transgen. může být insertován do jakéhokoliv deletovaného regionu opičího adenoviru. Alternativně může být transgen insertován do existujícího genového regionu za účelem narušení funkce tohoto regionu, pokud je to žádoucí.
Bez ohledu na to, zda rekombinantní opičí adenovirus obsahuje pouze minimální Ad sekvenci nebo celý Ad genom pouze s funkčními delecemi v El a/nebo E3 regionech, obsahuje rekombinantní virus opičí adenovirovou kapsidu. Alternativně mohou být ve způsobech podle předkládaného vynálezu použity rekombinantní pseudotypované adenoviry. Takové pseudotypované adenoviry využívají kapsidové proteiny opičího adenoviru, ve kterých je sbalena molekula nukleové kyseliny nesoucí heterologní sekvence opičího adenoviru, nebo sekvence z jiného než opičího adenoviru. Tyto rekombinantní opičí adenoviry podle předkládaného vynálezu mohou být produkovány způsoby, které jsou známé odborníkům v oboru.
C. Produkce rekombinantních virových částic
Způšoby pro produkci rekombinantních opičích adenovirů využívají techniky, které jsou dobře známé odborníkům v oboru, např. techniky popsané v US Patentu 6,083,716. Při konstrukci rekombinantních opičích adenovirů pro transport heterologní molekuly do jedince (např. člověka, psa, kočky nebo jiného savce) může být sekvence adenovirové nukleové kyseliny použitá ve vektorech získána z různých opičích zdrojů.
·· · • · · • · · · • 9 9999 • · · ♦ ·
Vektor obsahující sekvence opičího (např., šimpanzího) adenoviru, kterým chybí opičí adenovirové sekvence nutné pro produkci infekčních rekombinantních virových částic, mohou být použity společně s pomocným virem nebo vektorem. Pomocný virus poskytuje základní genové produkty nutné pro infektivitu a propagaci opičího adenoviru. Když je jedna nebo více delecí provedena v genech opičího adenoviru v jinak funkčním virovém vektoru, tak mohou být deletované genové produkty doplněny v procesu produkce virového vektoru propagací vektoru ve vybraných balících buňkách.
Tyto funkce mohou být poskytnuty v permanentně transformované buněčné linii, která poskytuje jednu nebo všechny funkce adenoviru, které jsou nutné pro balení, například jakoukoliv z Ela, Elb, E2a, E4 ORF6, VA RNA, které chybí ve vektoru. Pokud je to nutné nebo vhodné, mohou být balící buňkou poskytnuty další adenovirové funkce, pomocí transfekce nebo infekce konstruktem obsahujícím tyto funkce. Volitelně může být adenovirové funkce vybrána tak, aby umožňovala balení virového vektoru nesoucího minigen do heterologního opičího adenovirového kapsidového proteinu. Vhodné metody pro pseudotypování za použití opičího (např., C68) kapsidového proteinu budou jasné na základě skutečností známých v oboru týkajících se pseudotypoVání lidského adenoviru. Viz, např., US Patent 6,203,975.
Sestavení vybraných DNA sekvencí adenoviru a transgenu a dalších vektorových elementů do různých plasmidů a přenosových vektorů, a použití plasmidů a vektorů pro produkci rekombinantních virových částic, se provede za použití běžných technik. Mezi takové techniky patří běžné techniky klonování cDNA, které jsou popsané v učebnicích [Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd • ·· · · > ♦ · · ·
Ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1989)], použití překrývajících se oligonukleotidových sekvencí adenovirových genomů, polymerasové řetězové reakce, jakékoliv techniky, které vedou k zisku požadované nukleotidové sekvence. Použijí se standardní techniky transfekce a ko-transfekce, např. CaPCh srážení. Mezi další běžně používané techniky patří homologní rekombinace virových genomů, plakování virů v agarové krycí vrstvě, způsoby měření generování signálu a podobně.
Například, po konstrukci a sestavení požadovaného člunkového vektoru obsahujícího transgen se člunkový vektor transfektuje in vitro do hostitelské buňky pro balení. Hostitelská buňka má nebo jí je dodána jakákoliv chybějící adenovirová funkce. Homologní rekombinace probíhá mezi pomocnou a vektorovóu sekvencí, což umožňuje replikování sekvence adenovírus-transgen ve vektoru a její sbalení do virionových kapsid, což vede ke vzniku rekombinantních adenovirových částic.
Předkladatelé vynálezu zjistili, že El proteiny lidského adenoviru transkomplementují El-defektní opičí adenovirus a tím umožňují jeho balení do opičích adenovirových částic. Nicméně, vzhledem k nízkému stupni homologie mezi lidským Ad El a sekvencí obklopující deletovanou opičí Ad El sekvenci, existuje minimální riziko, že bude opičí Ad El homologně rekombinovat za produkce replikace-kompetentního opičího adenoviru.
II. Heterologní molekuly pro transport do hostitele
Rekombinantní opičí adenovirové částice produkované tímto způsobem mohou být izolovány a přečištěny za použití jakékoliv metody známé v oboru.
• · ··· ·
A. Imunogeny
Heterologní molekula nesená na opičím adenoviru pro transport do hostitelské buňky může být jakákoliv substance, včetně například polypeptidu, proteinu, enzymu, karbohydrátu, chemické skupiny nebo molekuly nukleové kyseliny, kterou může být oligonukleotid, RNA, DNA a/nebo RNA/DNA hybrid. V jednom výhodném provedení je molekulou nesenou na opičím adenoviru transgen. Transgen a molekula nukleové kyseliny obsahují sekvenci nukleové kyseliny, heterologní k adenovirové sekvenci, která kóduje protein, peptid, polypeptid, enzym nebo jiný požadovaný produkt a regulační sekvenci řídící transkripci a/nebo translaci kódovaného produktu v hostitelské buňce, a která umožňuje expresi kódovaného produktu v hostitelské buňce nebo jedinci. Složení transgenu závisí na požadovaném použití opičího adenoviru.
Například, jeden typ transgenu obsahuje reportérovou nebo markerovou sekvenci, která po expresi produkuje detekovatelný signál. Nicméně, nejdůležitější jsou genové produkty a jiné molekuly, proti kterým je indukována protilátková nebo - ještě lépe - buněčná imunitní reakce.
Tyto imunogenní genové produkty a molekuly mohou být z různých patogenních organismů, včetně virů, bakterií, hub nebo parazitů, které infikují člověka a jiné obratlovce, nebo mohou být z nádorových buněk. Imunogen může obsahovat peptidy nebo polypeptidy odvozené z proteinů. V některých případech obsahuje prostředek více než jeden imunogen. Požadované imunogenní prostředky obsahující tyto genové produkty a jiné molekuly zahrnují ty, které jsou určeny pro prevenci a/nebo léčbu onemocnění způsobených viry, jako je virus lidské imunodeficience, virus opičí imunodeficience, respiračně syncytiální virus, virus parainfluenzy typu 1-3, chřipkový virus (např., viry chřipky A a Β), Herpes simplex virus, lidský cytomegalovirus, viry hepatitidy (včetně viru hepatitidy A, hepatitidy B a viru hepatitidy C), lidský papillomavirus, poliovirus, rotaviry, calicivirusy, virus spalniček, planých neštovic, zarděnek, adenovirus, virus vztekliny, virus psinky, virus dobytčího morg, coronavirus, parvovirus, viry infekční rhinotracheitidy, virus kočičí leukemie, virus kočičí infekční peritonitidy, virus ptačí infekční bursitidy, Newcastle virus, virus Marekovi nemoci, virus prasečího respiračního a reprodukčního syndromu, virus koňské arteritidy a různé encephalitické viry.
Další imunogeny jsou určeny pro prevenci a/nebo léčbu onemocnění způsobených například bakteriemi, jako je Haemophilus influenzae (typovátelný a netypovatelný), Haemophilus somnus, Moraxella catarrhalis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Streptococcus faecalis, Helicobacter pylori, Neisseria meňingitidis, Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia psittaci, Bordetella pertussis, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Salmonella choleraesuis, Escherichia coli, Shigella, Vibrio cholerae, Corynebacterium diphtheriae, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium avium, Mycobacterium intracellulare complex, Próteus mirabilis, Próteus vulgaris, Staphylococcus aureus, Clostridium tetani, Leptospira interrogans, Borrelia burgdorfeni, Pasteurella haemolytica, Pasteurella multocida, Actinobacilus pleuropneumoniae a Mycoplasma gallisepticum.
Další imunogeny jsou určeny pro prevenci a/nebo léčbu onemocnění způsobených například houbami, jako je • fc fc • fc ·· · • · · ·· · • *· fcfc fc ···· * fcfc· « · fcfc fc····
Aspergillus, Blastomyces, Candida, Coccidiodes, Cryptococcus a Histoplasma.
Další imunogeny jsou určeny pro prevenci a/nebo léčbu onemocnění způsobených například parazity, jako je Leishmanía major, Ascaris, Trichunis, Giardia, Schisťosoma, Cryptosponidium, Trichomonas, Toxoplasma gondii a Pneumocystis carinii.
Mezi další výhodné imunogeny patří imunogeny určené pro vyvolání terapeutického nebo profylaktického protinádorového účinku u obratlovců, a mezi takové patří nádorové antigeny nebo antigeny asociované s nádory, jako je například prostatický specifický antigen, karcinoembryonální antigen, MUC-1, Her2, CA-125 a MAGE-3.
Příklady uvedené dále specificky ilustrují výhody způsobů a prostředků podle předkládaného vynálezu využívajících rekombinantní opičí adenovirový vektor, ze kterého je exprimován imunogenni peptid vztekliny (glykoprotein G nebo modifikovaný gag protein víru lidské imunodeficience-1. Jiné výhodné provedení využívá opičí adenovirus nesoucí imunogenni peptid z lidského papilloma viru. Nicméně, vynález není omezen na tyto imunogeny.
B. Regulační prvky
Transgen nebo jiná sekvence nukleové kyseliny, která vyžaduje transkripci, translaci a/nebo expresi pro získání požadovaného genového produktu v buňkách a hostitelích, může obsahovat vhodné sekvence, které jsou operabilně navázané na kódující sekvenci pro navození exprese kódovaného produktu. Termín operativně navázaná sekvence označuje jak sekvence řídící expresi, které navazují na požadovanou sekvenci • ·· ·· 9 ·· · ·· · · · ·· · · · • *·* · · · · · · · • · ··· · · · · ···· • · · · · · ··· • · · · * ·· · Φ· ·· · nukleové kyseliny, tak sekvence řídící expresi, které působí v trans nebo v určité vzdálenosti od dané sekvence nukleové kyseliny.
Mezi sekvence řídící expresi patří vhodné transkripčnx iniciační, terminační, promotorové a zesilovací sekvence; účinné signály pro zpracování mRNA, jako jsou sestřihové a polyadenylační signály; sekvence, které stabilizují cytoplasmatickou mRNA; sekvence, které zesilují účinnost translace (tj. Kozákovi konvenční sekvence); sekvence, které zvyšuji stabilitu proteinu; a pokud je to žádoucí, tak sekvence, které zvyšují sekreci proteinu. V oboru je známo mnoho sekvencí řídících expresi - přirozených, konvenčních, indukovatelných a/nebo tkáňově specifických - a tyto sekvence mohou být použity pro řízení exprese genu, v závislosti na požadovaném typu exprese. Pro eukaryotické buňky obsahují sekvence řídící expresi typicky promotor, zesilovač transkripce, například z imunoglobulinového genu, SV40, cytomegaloviru, atd, a polyadenylační sekvence, které mohou obsahovat sestřihová donorová a akceptorová místa. Polyadenylační (polyA) sekvence je obvykle insertována po sekvenci transgenu a před 3' adenovirovou ITR sekvencí.
V jednom provedení je vybrána polyA hovězího růstového hormonu. Opičí adenovirus podle předkládaného Vynálezu může také obsahovat intron, výhodně umístěný mezi sekvencí promotoru/zesilovače transkripce a tragsgenem. Jednou možnou intronovou sekvencí je sekvence z 5V-40, a je zde označována jako SV-40 T intronová sekvence. Jiný element, který může být také použit ve vektoru, je interní místo pro vstup ribosomu (IRES). IRES sekvence je použita pro produkci více než jednoho polypeptidu z jediného genového transkriptu.
IRES sekvence ipůže být použita pro produkci proteinu, který obsahuje více než jeden polypeptidový řetězec. Výběr těchtp a dalších běžných vektorových elementů je snadný a je
• ·» 99 9 9 9> •
·· · • 9 ·· * · 9
• ··· • · • • · • 9
• 9 9 • · · • 9 9 · ····
• 99 99 99 ··· • 9 9 •
k dispozici mnoho takových sekvencí (viz, např., Sambrook et al, a odkazy zde citované, například na stranách 3.18-3.26 a 16.17-16.27; a Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN
MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, 1989).
V jednom provedení může být žádoucí vysoká úroveň konstitutivní exprese. Příklady takových konstitutivních promotorů jsou, například, LTR promotor (volitelně s RSV zesilovačem transkripce) viru Rousova sarkomu, cytomegalovirový (CMV) promotor (volitelně s CMV zesilovačem transkripce) (viz, např., Boshart et al, Cpll, 41:521-530 (1985)), SV40 promotor, dihydrofolat-reduktasový promotor, β-aktinový promotor, fosfoglycerol-kinasový (PGK) promotor, a EFla promotor (Invitrogen). Indukovatelné promotory, regulované exogenně dodanými sloučeninami, jsou také použitelné a zahrnují zinkem-indukovatelný ovčí metállothioninový (MY) promotor, dexamethasonem (Dex)indukovatelný promotor viru myších mammárních nádorů (MMTV), T7 polymerasový promotorový systém (WO 98/10088); promotor pro svlékání hmyzu (No et al, Proč. Nati. Acad Sci. USA, 93:3346-3351(1996)), tetracyklinem-reprimovatelný systém (Gossen et al, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 89:55475551(1992)), tetracyklinem-indukovatelný systém (Gossen et al, Science, 268:1766-1769 (1995), viz též Uarvey et al, Curr. Opin. Chem. Biol.,, 2:512-518 (1998)), RU486indukovatelný systém (Wang et al, Nat. Biotech., 15:239243 (1997) a Wang et al, Gene Ther., 4:432-441 (1997)) a rapamycinem indukovatelný systém (Magari et al, J. Clin. Invest., 100:2865-2872 (1997)). Dalším typem indukovatelných promotorů, které mohou být použity v tomto kontextu, jsou ty, které jsou regulované specifickým fyziologickým stavem, jako je například teplota, akutní fáze, konkrétní diferenciační stadium buňky nebo replikace buňky.
V jiném provedení se použije přirozený promotor pro transgen. Přirozený promotor může být výhodný tehdy, když má požadovaná exprese transgenu napodobovat přirozenou expresi. Přirozený promotor může být použit tehdy, když musí být exprese transjenu regulována okamžitě nebo vývojově, nebo ve specifické tkáni, nebo v reakci na specifické trakskripční stimuly. V jiném provedení mohou být pro napodobení přirozené exprese použity jiné přirozené elementy řídící expresi, jako jsou zesilovače transkripce, polyadenylační místa nebo Kozákovi konvenční sekvence.
Jiným provedením transgenu je transgen operativně navázaný na tkáňově-specifický promotor. Například, pokud je žádoucí exprese v kosterním svalu, může být použit promotor aktivní ve svalech. Sem patří promotory z genů kódujících skeletový cc-aktin, myosinový lehký řetězec 2A, dystrofin, svalovou kreatinin kinasu, stejně jako syntetické svalové promotory s aktivitami vyššími než mají přirozené promotory {vize Li et al, Nat. Biotech., 17:241-245 (1999)). Příklady promotorů, které jsou tkáňově specifické, jsou známé pro játra (albumin, Miyatake et al. J. VirQl., 71:5124-32 (1997); promotor jádra viru hepatitidy B, Sandig et al.,
Gene Ther., 3:1002-9 (1996); α-fetoprotein (AFP), Arbuthnot et al., Hum. Gene Ther., 7:1503-14 (1996)), kostní osteokalcin (Stein et al., Mol. Biol. Rep., 24:185-96 (1997)); kostní sialoprotein (Chen et al., J. Bone Miner. Res., 11:654-64 (1996)), lymfocyty (CD2, Hansal et al., J. Immunol., 161:1063-8 (1998); imunoglobulinový těžký řetězec; T-lymfocytární receptor a řetězec), neuronální produkty, jako je promotor neuron-specifické enolasy (NSE) (Andersen et al. Cell. Mol. Neurobiol·., 13:503-15 (1993)), gen pro lehký řetězec neurofilament (Piccioli et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 88:5611-5 (1991)), a gen pro neuron18 specifický vgf (Piccioli et al., Neuron, 15:373-84 (1995)), a další.
Je jasné, že ne všechny sekvence řídící expresi účinkují stejně dobře v expresi všech transgenů podle předkládaného vynálezu. Nicméně, odborník v oboru může provést výběr mezi takovými sekvencemi řídícími expresi bez toho, že by se odchýlil od rozsahu předkládaného vynálezu. Vhodné promotorové sekvence/zesilovače transkripce mohou být vybrány odborníkem v oboru podle návodu uvedeného v předkládaném vynálezu. Takový výběr je rutinní záležitostí a není omezen na určité molekuly nebo konstrukty. Například je možné Vybrat jednu nebo více sekvencí řídících expresi, které mohou být operativně navázané na požadovanou kódující sekvenci, a tyto sekvence mohou být insertovány do transgenu, minigenu a přenosového viru podle předkládaného vynálezu. Za použití jedné z metod pro balení opičího adenovirů uvedených v předkládaném vynálezu, nebo jak jsou známé v oboru, je možné infikovat vhodné buňky in vitro nebo in vivo. Počet kopií minigenu v buňce může být sledován Southernovou hybridizací nebo kvantitativní PCR. Úroveň exprese RNA může být sledována Northernovou hybridizací nebo kvantitativní RT-PCR. Úroveň exprese může být sledována Westernovou hybridizací, imunohistochemicky, ELISA, RIA, nebo testováním biologické aktivity genových produktů. Tak je možné snadno testovat to, zda je konkrétní sekvence řídící expresi vhodná pro specifický produkt kódovaný transgenem, a podle toho vybrat vhodnou sekvencí řídící expresi. Alternativně, když přenášená molekula nevyžaduje expresi, například se jedná o karbohydrát, polypeptid, peptid, atd., tak sekvence řídící expresi nemusí tvořit součást rekombinantního opičího adenovirů nebo jiné molekuly.
··· · · · · • · · · 9 9 9 9 • · 9
9999
III. Příprava viru pro podání
Rekombinantní opičí adenoviry, výhodně suspendované ve fyziologicky kompatibilním nosiči, mohou být podány člověku nebo jinému subjektu. Vhodné nosiče může vybrat odborník v oboru podle indikace, pro kterou je přenosový virus určen. Například je jedním vhodným nosičem salinický roztok, který může být formulován s různými pufrovacími roztoky (např. fosfátem pufrovaný salinický roztok). Dalšími nosiči jsou sterilní salinický roztok, laktosa, sacharosa, fosforečnan vápenatý, želatina, dextran, agar, pektin, podzemnicový olej, sezamový olej a voda. Výběr nosiče nijak neomezuje předkládaný vynález.
Volitelně mohou prostředky podle předkládaného vynálezu obsahovat kromě rekombinantního opičího adenoviru a nosiče další běžné farmaceutické přísady, jako jsou konzervační činidla, chemické stabilizátory, nebo - pro vakcíny adjuvans. Mezi vhodná konzervační činidla patří chlorobutanol, kalium-sorbát, kyselina sorbová, oxid siřičitý, propylgallát, parabeny, ethyl-vanillin, glycerin, fenol a parachlorofenol. Mezi vhodná chemická stabilizační činidla patří želatina a albumin. Mezi vhodná adjuvans patří, mimo jiné, imunostimulační komplexy (ISCOMS), LPS analogy, včetně 3-0-deacylovaného monofosforyl lipidu A (Ribi Immunochem Research, lne.; Hamilton, MY), minerální olej a voda, hydroxid hlinitý, Amphigen, Avitdine,
L121/skvalen, muramyl-peptidy a saponiny, jako je Quil A.
IV. Podání rekombinantních virů pro léčbu a/nebo profylaxi
Rekombinantní, replikace defektní adenoviry, jsou podány ve farmaceuticky účinném množství, což znamená, že je podáno takové množství rekombinantního adenoviru, které je
při daném způsobu podání účinné v transfekci požadovaných buněk a vede k dostatečné úrovni exprese daného genu, která indukuje terapeutickou nebo vakcinační imunitní reakci, např,, vede k dosažení měřitelně hladiny protektivní imunity.
Mezi běžné a farmaceuticky přijatelné způsoby podání patří například intranasální, intramuskulámí, intratracheální, podkožní, intradermální, rektální, orální a jiné slizniční a parenterální způsoby podání. Termín slizniční podání označuje podání přes sliznice, například inhalačně, orálně, intranasálně, vaginálně nebo rektálně. Způsoby podání mohou být kombinovány, pokud je to potřebné, nebo mohou být upraveny podlé imunogenu nebo onemocnění. Například při profylaxi vztekliny je výhodné podkožní, intratracheální, intranasální a orální způsob pódání. Způsob podání primárně závisí na vlastnostech léčeného onemocnění.
Dávky nebo účinná množství rekombinantního replikacedefektního Ad viru závisí primárně na faktorech, jako jsou podmínky, vybraný gen, věk, hmotnost a zdravotní stav živočicha, a mohou být proto pro různé živočichy různé.
Dávky virového vektoru závisí primárně na faktorech, jako jsou typ léčeného onemocnění, vybraný gen, věk, hmotnost a zdravotní stav léčeného pacienta, a mohou být proto pro různé jedince (včetně člověka) různé. Neočekávaná účinnost rekombinantního opičího (např-, šimpanzího) adenoviru podle předkládaného vynálezu umožňuje použití významně nižších dávek rekombinantního šimpanzího adenoviru pro dosažení dávky dostatečné pro indukci požadovaného imunogenního účinku (např. indukci předem určené hladiny
CD8+ T-lymfocytů). Účinnou dávkou rekombinantního opičího
6 adenoviru může být například dávky 10 pfu a 10 pfu ·· ·· · ··· • · · · · ··· ttt 9 9 9 9 9 9 9 • ··· · 9 99 9999 šimpanzího adenoviru. Nicméně, mohou být použity i vyšší dávky, například v závislosti na způsobu podání. Virový vektor může být podán v dávce, například, od přibližně 100 μΐ do přibližně 100 ml, lépe od přibližně 1 ml do přibližně 10 ml, nosného roztoku, který obsahuje koncentrace v rozmezí od přibližně 1 x 104 jednotek vytvářejících plaky (pfu) od přibližně 1 x 1013 pfu viru/ml, a přibližně 1 x 109 až přibližhě lxlO11 pfu(ml viru, pro dospělého o hmotnosti 80 kg.Výhodná dávka je přibližně 50 ml salinického roztoku s koncentrací 2xlO10 pfu/ml. Výhodná dávka je přibližně 1 až 10 ml nosiče (například salinického roztoku) s výše uvedenou koncentrací. Terapeutické koncentrace, nebo hladiny imunity, vybraného genu mohou být sledovány, aby se určila potřeba dosycovacích imunizací. Podle stavu CD8+ T-lymfocytární reakce, nebo případně titrů protilátek, mohou být žádoucí další imunizace. Volitelně mohou být rekombinantní opičí adenoviry podávány za použití režimu primární-došycovací imunizace. V oboru byly popsány různé takové režimy a ty mohou být použity. Jedna vhodná metoda je popsána ve WO 00/11140, publikované 2.3.2000, která je zde uvedena jako odkaz.
V jednom výhodném provedení předkládaný vynález poskytuje způsob pro přednostní indukování CD8+ T-lymfocytární reakce na virus lidské imunodeficience u jedince pomocí podání rekombinantního opičího adenoviru obsahujícího modifikovaný gag protein. Modifikovaný gag protein ilustrovaný v následujících příkladech byl optimalizovaný, například způsobem popsaným v US Patentu 5,972,596. Kódující a proteinová sekvence jsou uvedeny v SEQ ID NO:6 a SEQ ID NO:7. Viz též G. Meyers et al., Eds., Human retroviruses and AIDS. A compilation and analysis of nucleic acid and amino acid sequences (Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, NM 1991). Nicméně, v oboru jsou známé různé metody pro • · ··· zlepšení exprese gag proteinu nebo jakéhokoliv jiného imunogenu nebo antigenu a tyto mohou být použity, příkladem je humanizace HIV-1 gag kodonové sekvence, odstranění HIV-1 gag sestřihového místa, inserce další vedoucí sekvence před gag sekvenci HIV-1, inserce Kozákovi sekvence před gag sekvenci HIV-1. Volba metody pro optimalizaci není nijakým omezením předkládaného vynálezu. Alternativně může být způsob podle předkládaného vynálezu použit pro podání rekombinantního opičího adenovíru nesoucího HIV obalový protein nebo HIV pol. Jedním vhodným HIV obalovým proteinnem je HIV glykoprotein 120, jehož sekvence jsou dostupné z GenBank. Nicméně, mohou být použity i jiné vhodné virové obalové proteiny. Sekvence pro HIV-1 pol je známá, stejně jako různé modifikovahé pol sekvence. Viz, například, US patent 5,972,596 a R. Scheider et al, J. Virol, 71(7):48924903 (July 1997).
V jiném výhodném provedení předkládaný vynález poskytuje způsob pro přednostní indukování CD8+ T-lymfócytární reakce na proteiny asociované s nádory specifické pro určitou malignitu pomocí podání rekombinantního opičího adenoviru obsahujícího protein asociovaný s nádory jedinci. Mezi takové proteiny patří buněčné onkogeny, jako je mutovaný ras nebo p53.
V jiném výhodném provedení předkládaný vynález poskytuje způsob pro přednostní indukování CD8+ T-lymfocytární reakce na proteiny asociované s nádory specifické pro určitou malignitu pomocí podání rekombinantního opičího adenoviru obsahujícího protein asociovaný s nádory jedinci.
Ještě další výhodné provedení zahrnuje podání rekombinantního opičího adenoviru obsahujícího protein odvozený z lidského papilloma viru za účelem prevence a
léčby a profylaxe onemocnění způsobených tímto virem.
Protein může být vybrán za skupiny zahrnující E6, E7 a/nebo LI (Seeclorf, K. et al, J. Virol., 145:181-185 (1985)). Když je onemocněním infekce respiračně syncytiálním virem, tak je protein vybrán ze skupiny zahrnující glyko- (G) protein a fúzní (F) protein, pro které jsou sekvence dostupné od GenBank.
Následující příklady jsou uvedeny pro ilustrování předkládaného vynález a nijak neomezují jeho rozsah. Odborníkům v oboru bude jasné, že ačkoliv jsou popsány specifické podmínky a reakční činidla, existují různé další modifikace, které spadají do rozsahu předkládaného vynálezu.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1 - Příprava vektoru na bázi šimpanzího adenoviru C68 s deletováným El 1
Replikace-defektní verze C68 se izolovala pro použití v genovém přenosu. Použila se klasická strategie pro přípravu rekombinantního viru s deletovaným El, za použití homologní rekombinace v buněčné linii exprimující El. Prvním krokem bylo vytvoření plasmidu obsahujícího m.u. 0 až 1.3 a potom se přidal minigen exprimující zesílený zelený fluorescentní protein (GFP) z CMV promotoru a C68 sekvenci od 9 do 16.7 m.u. Tento linearizovaný plasmid se kotransfektoval do El exprimující buněčné linie s SSpItráveným C68 plasmidem (SspI štěpí v 3.6 m.u. a ponechává 4644 bp pro homologní rekombinaci). Experimenty se nejprve provedly s 293 buňkami nesoucími El z lidského Ad5 s nadějí, že toto bude dostatečné pro transkomplementaci. Vznikly plaky, které představovaly požadované rekombinanty. Vzniklý vektor se označil C68-CMV-GFP.
444
4 «
Strategie pro generování rekombinantů se modifikovala tak, aby umožnila účinnou a rychlou izolaci rekombinantů. Nejprve se DNA pro alkalickou fosfatasu v prvotním přenosovém vektoru nahradila prokaryotickým GFP genem řízeným prokaryotickým promotorem z lacZ. Toto umožnilo účinný skríning bakteriálních transformací při pokusu o inkorporaci požadované eukaryotické RNA pol II transkripční jednotky do přenosového vektoru. Vzniklé transformace mohou být testovány na expresi GFP; bílé kolonie jsou rekombinantní, zatímco zelené kolonie jsou reziduální původní plasmidy.
Selekce mezi bílými a zelenými koloniemi se použila pro testování produktů kotransfekce pro izolování lidských Ad5 rekombinantů (A.R. Davis et al, Gene Thera., 5:1148-1152 (1998)); tento postup se adaptoval na C68 systém. Prvotní přenosovýž vektor byl upraven tak, aby obsahoval prodlouženou 3' sekvenci od 9 do 26 MU. Tento vektor byl kotransfektován s virovou DNA z původního C68-CMV-GFP izolátu, který byl restrikcně tráven Xba I, který štěpí v MU
16.5 a ponechává přesah 9,5 Kb pro homologní rekombinaci. Vzniklé plaky se prohlížely pod mikroskopem s fázovým kontrastem za účelem vyhledání nefluoreskujících izolátů, které představují požadované rekoitíbinanty. Toto značně zjednodušilo skríning ve srovnání se standardními metodami založenými na struktuře nebo expresi transgenu,
A. Přenosový plasmid
Pro konstrukci plasmidového přenosového vektoru pro přípravu rekombinantního C68 viru se plasmid pSP72 (Promega,
Madison, WI) modifikoval trávením Bgl II a potom doplněním konců Klenow enzymem (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) ·· a ligací se syntetickým 12 bp Pac I linkerem (New England Biolabs, Beverly, MA) za zisku pSP72-Pac. 456 bp Pac I/SnaB 1 fragment velikosti mapové jednotky (m.u. nebo MU) 0-1,3 C68 genomu se izoloval z pNÉB-BamE plasmidu obsahujícího BamHI E fragment C68 genomu a klonoval se do Pac I a EcoR V zpracovaného pSP72-Pac za zisku pSP-C68-MU 0-1,3. Minigenová kazeta skládající se z cytomegalovirového časného promotoru řídícího lacZ s SV40 póly A signálem se separovala z ρΟΜνβ (Clontech, Palo Alto, CA) jako 4,5 kb EcoRI/SalI fragment a ligovala se do pSP-C6 8-MU 0-1,3 restrikčně tráveného stejnou sadou enzymů, za zisku pSP-C68-MU 0-1,3CMVLacZ.
V prvním kroku izolace 9-16,7 MU regionu C68 se pGEM-3Z (Promega, Madison, Ml) a pBS-C68-BamF dvakrát trávily BamHI a Sph I enzymy. Potom se 293 bp fragment z pBS-C68-BamF ligoval se pGEM-3Z skeletem za zisku pGEM-C68-MU 9-9,8. 2,4 kb fragment obsahující C68 MU 9,8-16,7 se získal z pBS-C68 BamRB klonu po trávení Xbal, doplnění v reakci s následným zpracováním BamHI a klonoval se do BamHI/Smal dvojitě tráyeného pGEM-C68-MU 9-9,8 za zisku pGEM-C68-MU 9-16,7. C68
9-16,7 m.u. region se izoloval z pGEM-C68-MU 9-16,7 trávením EcoRI, doplněním na koncích Klenow enzymem (Boehringer Mannheim, Indianápolis, IN), ligací se Syntetickým 12 bp HindlII linkerem (NEB) a potom trávením HindlII. Tento 2,7 kb fragment v rozsahu C68 MU 9-16,7 se klonoval do HindlII místa pSP-C68-MU 0-1,3-CMVlacZ za zisku konečného přenosového plasmidu pC68-CMV-LacZ. Dále se 820 bp cDNA fragment pro alkalickou fosfatasu (AP) izoloval z pAdCMVALP (K. J. Fisher, et al., L Virol., 70:520-532 (1996)) a zaměnil se za lacZ v Not I místech pC68-CMV-lacZ, za zisku pČ68-CMV-AP.
B. Konstrukce rekombinantního viru ·· ·* · ·· · • · · · · · · · ··· · · 6 · · · · • · · · · · · · · ·· ·
Pro přípravu rekombinantního C68-CMVEGFP vektoru s deletovaným El se nejprve připravil pC6S-CMV-EGFP přenosový plasmid, pomocí nahrazení lacZ transgenu v pCG8CMV-lacZ genem pro zesílený zelený fluorescentní protein (EGFP). Nahrazení se provedlo následujícím způsobem. Další Notl restrikční místo se vložilo na 5' konec EGFP kódující sekvence v pEGFP-1 (Clontech, Palo Alto, CA) pomocí BamHI trávení, doplnění v reakci a ligace s 8 bp syntetickým Notl linkerem (NEB). Po restrikčním trávení obou konstruktů Notl se EGFP sekvence izolovala z modifikovaného pEGFP-1 a použila se pro nahrazení lacZ genu v pC68-CMV-lacZ. pC68CMVEGFP konstrukt (3 pg) se kotransfektoval se Ssp Itrávenou C68 genomovou DNA (1 gg) do 293 buněk za účelem homologní rekombinace, jak byla popsána dříve (G. Gao, et al, J. Virol, 70:8934-8943 (1996)). Zelené plaky vizualizované fluorescentní mikroskopií se izolovaly pro dvě kola přečištění plaků, expanzi a přečištění CsCl gradientovou sedimentací (G. Gao, et al, výše).
Ve snaze o použití běžného procesu selekce bílých/zelených plaků (A. R. Davis, et al., Gene Thera., 5:1148-1152 (1998)) pro konstrukci rekombinantních C68 vektorů se 7,2 kb fragment v rozsahu 9 až 36 MU izoloval z pBSC68-BamB plasmidu reakcí s Agel a Bsiwl restrikčními endonukleasami a klonoval se do Asp718 a Agel míst pC68-CMVAP přenosového plasmidu, což vedlo k zisku nového plasmidu označeného jako pC68CMV-AP-MU36. Další modifikace se provedla pro odstranění 26 až 36 m.u. z pC68CMV-AP-MU36 pomocí trávení Eco47III a Nrul. Nový přenosový plasmid označený jako pC68cMV-AP-MU26 měl kratší region pro homologní rekombinaci (tj., 16,7-26 MU) 3' k minigenu. Pro přípravu rekombinantního C68 vektoru se alkalická fosfatasa (AP) nahradila požadovaným genem. Vzniklý pC68CMV-Nugene27
• 9 • · · • ·· · ·
MU26 konstrukt se ko-transfektoval s Xba I (16,5 MU) restrikčně trávenou C68-CMVGFP virovou DNA do 2 93 ť>uněk a potom se buňky překryly agarem. Plaky rekombinantního viru (bílé) se generovaly homologní rekombinaci v regionu 16,7-26 MU, který je společný pro pC6SCMV-Nugene konstrukt a C68 virový skelet; rekombinanty, které tvořily bílé plaky, se odlišovaly od zelených plaků neštěpeného C68-CMVGFP viru.
Selekce podle bílých/zelených plaků se také použila v procesu klonování požadovaného genu do pC68 přenosového plasmidu. AP gen v pC68CMV-AP-MU36 a pC68CMV-AP-MU26 se nahradil kazetou prokaryotického GFP genu řízeného lacZ promotorem izolovaným z pGFPMU31 (Clontech, Palo Alto, CA) . Tak bílé kolonie bakteriálních transformantů obsahovaly rekombinantní plasmid. Tento proces selekce bílých/zelených plaků pro bakteriální kolonie eliminuje potřebu přípravy a charakterizace velkého počtu minipřípravků DNA a tak dále zvyšuje účinnost konstrukce rekombinantních C68 vektorů.
Příklad 2 - Exprese antigenu (Gag sekrece) v TK buňkách infikovaných vakcinačními konstrukty opičího adenovirů
Adenovirové rekombinanty šimpanzího kmene 68 (Adchimp68) a lidského kmene 5 (Adhu5) nesoucí nukleotidovou sekvenci modifikované verze zkrácené formy gag genu HIV-1 clade B se připravily již popsaným způsobem (v příkladu 1 a Z.Q. Xiang, et al, Virol. 219, 200 (1996)). Transkripty strukturálních proteinů HIV-1, včetně gag, obsahují geneticky nestabilní elementy, které výžadují přítomnost rev proteinu pro jaderný export a účinnou expresi v cytoplasmě (S. Schwartz et al., J Virol 66, 7176 (1992); S.Schwartz, et al, J Virol 66, 150159 (1992); G. Nasioulas et al., J. Virol 68, 2986 (1994)). Adenoviry působí na základě jaderné transkripce a proto • ·· • · · • ·· · ··· ·· ·· ··· ·· vyžadújí rev pro expresi HIV-1 proteinů. Pro překonání závislosti na Rev se sekvence s modifikovanými kodony, ze které byly elementy s genetickou nestabilitou odstraněny místně cílenou mutagenesí (R. Schneider et al., J Virol 71, 4892 (1997); S. Schwartz et al., J Virol 66, 7176 (1992); S. Schwartz, et al., J Virol 66, 150 (1992)), insertovala do adenovirového vektoru. Vložený gen kodoval zkrácený p37gag protein (pl7 a p24 regiony). Zkrácený gag protein netvořil virové částice a byl částečně secernován do supernatantu transfektovaných lidských buněk (R. Schneider et al,, J Virol 71, 4892 (1997)). Mutované gag konstrukty se použily pro vakcinační experimenty a způsobovaly indukci buněčné a protilátkové imunitní reakce u myší a u primátů (J.T. Qiu et al., J Virol 73, 9145, (1999)).
Adchimp68 a Adhu5 rekombinanty se generovaly a propagovaly na 293 buňkách transfektovaných El adenoviru lidského kmene 5. Předkladatelé vynálezu zjistili, že tento heterologpí El je vhodný pro komplementování Adchimp68 rekombinantních virů s deletovaným El, za snížení rizika rekombinace a reverze na replikace-kompetentní přirozený virus.
Přítomnost gag proteinu v supernatantu TK kultur se analyzovala westernovou hybridizací za použití myších monoklonálních protilátek k gag. TK buňky (1x10 ) se infikovaly po dobu 48 hodin Adhu5gag37 nebo Adchimp68gag37 virem (10 pfu na buňku) . Další TK- buňky se infikovaly Adhu5 nebo Adchimp68 konstruktem exprimujícím glykoprotein viru vztekliny. Proteiny v supernatantech kultur se separovaly na 12% denaturujícím polyakrylamidovém gelu a přenesly se elektrohybridizací na PVDF membránu. Skvrna se barvila monoklonální protilátkou 183-H12-SC k HIV-1 p24 (B. Chelsebro, et al. J. Virol. 66: 6547 (1992).
Dva adenovirové rekombinantní klony (Adhu5gag37, Adchimp68gag37) nesoucí tuto modifikovanou sekvenci gag exprimovaly trahsgen ve srovnatelných koncentracích, jak bylo zjištěno analýzou westernovým přenosem. Protein očekávané velikosti (37 kDa), kterýs e vázal na monoklonální protilátku proti gag HIV-1, byl detekován v supernatantech TK buněk infikovaných 10 jednotkami vytvářejícími plaky (pfu) každého rekombinantu s adenovirovým gag. Kontrolní buňky infikované Ahu5 nebo Adchimp68 rekombinanty exprimujícími glykoprotein viru vztekliny (Adhu5rab.gp a Adchimp68.gp) neprodukovaly tento protein.
Příklad 3 - Indukce CD8+ T-lymfocytární reakce na gag u savců pomocí opičího adenoviru
Následující pokus ukazuje, že splenocyty myší, kterým byl injekčně intramuskulárně (i.m.) aplikován Adhu5gag37 nebo Adchimp68gag37 rekombinantní virus, reagovaly na imunodominaňtní epitop (B. Doe and C.M. Walker, AIDS 10, 793 (1996)) gag proteinu uvolňováním cytokinů, tj. interferonu (IFN)-y, stejně jako lýzou cílových buněk.
A. Test uvolňování cytokinů
Skupiny 3 Balb/c myší se imunizovaly i.m. 2xl05, 2xl06 nebo 2xl07 pfu Adchimp68gag37 viru, 2xl06 pfu AdhuSLl viru (H.C.J. Ertl, et al., J. Virol, 63:2885 (1989)), 2xl06 pfu Adhu5gag37 viru nebo 2x1O7 pfu VVgag viru. Splenocyty se o deset dnů později testovaly na CD8+ T-lymfocytární reakci.
Pro testování produkce cytokinů (IFN-γ) se splenocyty (lxl06/vzorek) kultivovaly po dobu 5 hodin při 37°C s 3 gg/ml AMQMILKETI peptidu (SEQ ID NO:1), který obsahuje imunodominantní CD8+ T-lymfocytární epitop pro H-2d haplotyp, asi gg/ml Brefeldinu A (GolgiPlug, PharMingen, San Diego, ·· · • · · • · · © • · · ···· • · · ·· · ·· ··· • · • · · ·· ·· ··©
CA), v 96-jamkové kultivační plotně s kulatým dnem v
Dulbecco modifikovaném Eagle mediu (DMEM) doplněném 2% fetálním hovězím sérem (FBS) a 10”6 M 2-merkaptoethanolu. Buňky se promyly PBS a inkubovaly se po dobu 30 minut při 4 OC s FITC značenou protilátkou k myším CD8. Buňky se promyly a permeabilizovaly se v IX Cytofix/Cytoperm (PharMingen) po dobu 20 m inut při 4°C. Buňky se třikrát promyly v Perm/Wagh (PharMingen) a inkubovaly se po dobu 30 minut při 4 °C s PE značenou protilátkou k myšímu IFN-γ. Po promytí se buňky vyšetřovaly dvoubarevnou průtokovou cytometrií a analyzovaly se za použití WinmDi softwaru. Čísla v pravém horním rohu ukazují procento CD8+ buněk barvících se pozitivně na IFN-γ vzhledem k celkovému počtu CD8+ buněk.
Sedm až deset dní po jediné imunizaci produkovala měřitelná frakce celé populace sleziných CD8+ T-lymfocytů IFN-γ v reakci na gag peptid. Primární splenocyty byly testované bez další in vitro expanze lyžovaných H-2 kompatibilních cílových buněk předem ošetřených gag peptidem. Gag-specifická aktivita CD8+ T-lymfocytů byla vyšší po imunizaci Adchimp68 konstruktem, kdy bylo dosaženo 16-19% CD8+ T-lymfocytů specifických pro gag z celé populace slezinných CD8+ T-lymfocytů. Reakce byla závislá na dávce Adchimp68gag37 vir, kdy dávky pouze 2xl05 pfu viru stále vyvolávaly frekvence okolo 10%. Adhu5gag37 rekombinanty indukovaly optimální frekvence 9% při 2x10 pfu. Tyto frekvence nebyly významněji vyšší při vyšší dávce této vakcíny (data nejsou uvedena). Rekombinantní virus vakcinie exprimující kompletní gag (VVgag, označený jako vDKl v S. Chacarabarti et al., Mol. Cell. Biol. 5, 3403 (1985)), stimuloval významně nižší frekvence CD8+ T-lymfocytů podle intracelulárního barvení na cytokiny.
·· 99 9 99 9
9 9 9 99 9 9 9
999 9 9 9 9 9 9 9
999999 9 9 9 9 9999
999 99 99 999 99 9
B. Lýza cílových T-lymfocytů.
Splenocyty od myší imunizovaných o deset dnů dříve jednou dávkou adenovirových rekombinantů (ja]c je popsáno v oddíle A) nebo dvěmi dávkami Wgag rekombinantů, kdy první dávka byla aplikována i.m. a druhá o 2 týdny později intraperitoneální injekcí, byly testovány v 5-hodinovém testu uvolňování 51Cr s různými poměry efektorových a cílových buněk na lxlO4 P815 buňkách, které byly ošetřeny během 16-24 hodin při teplotě místnosti buď peptidem pro gag {plné čtverečky) nebo kontrolním peptidem 31D (X) odděleným ze sekvence nukleoproteinu viru vztekliny (H.C.J. Ertl et al., J. Virol. 63 : 2885 (1989)). Dvě imunizace Wgag vakcáínou byly nutné pro indukci defekovatelné T-lymfocyty zprostředkované gag-specifické primární cytolýzy.
C. Kinetiky CD8+ T-lymfocytární reakce na gag
Skupiny 4 Balb/c myší se imunizovaly 5xl06 pfu Adhu5gag37 nebo Adchimp68gag37 virů. Splenocyty se odebraly o 6-12 dnů později a testovaly se na produkci IFN-γ a na lýzu cílových buněk, jak bylo popsáno výše. Kinetiky CD8+ Tlymfocytární reakce na gag vyvolané dvěma adenovirovými rekombinanty byly odlišné. Odpověď na gag u Adhu5gag37 viru vrcholila o 2-4 dny dříve než CD8+ T-lymfocytární reakce na Adchimp68gag37 rekombinanty.
Příklad 4 - Exfekt předchozí expozice lidskému adenoviru na opičí adenovirovou vakcínu
Pro výzkum vlivu předchozí expozice běžnému lidskému kmenu 5 adenoviru se myši imunizovaly jednou dávkou Adhu5 rekombinantů exprimujícího irelevantní antigen (lidský
papilloma virus LI). O dva týdny později se myši vakcinovaly buď Adhu^gagB? nebo Adchimp68gag37 vakcínou.
θ
Přesněji, myši se imunizovaly i.m. 10 pfu Adhu5Ll vakcíny. 0 dva týdny později se Adhu5-imunním, stejně jako naivním myším injekčně podalo 2x10 nebo 2x10 pfu Adhu5gag37 nebo Adchimp68gag37 rekombinantů (4-5 myší na skupinu).
Další skupiny AdhuSLl imunních nebo naivních myší se imunizovaly 2xl06 pfu Adhu5gag31 nebo Adchimp68gag37 viru. O devět dnů později se myším intraperitoneálně podalo 10 pfu rekombinantního viru vakcinie exprimujícího kompletní gag. Myši se utratily za 5 dnů po injekci viru vakcinie.
Myši předem imunní k Adhu5 viru neodpovídaly na gag po vakcinaci Adhu5gag37 vakcínou. Tyto myši vykazovaly, frekvence CD8+ gag-specifických T-lymfocytů podobnou jako kontrolní myši a v souladu s tím jejich splenocyty nelyžovaly gag exprimující cílové T-lymfocyty. Naopak, CD8+ T-lymfocytární reakce na gag byla pouze mírně snížena u Adhu5-imunních myší vakcinovaných Adchimp68gag37 konstruktem. Frekvence CD8+ T-lymfocytů namířených proti gag byla redukována o pouze 30% a cytolytická aktivita splenocytů byla snížena o 50% při různých poměrech efektorových a cílových buněk.
Tak oba adenovirové rekombinanty indukují frekvence CD8+ T-lymfocytů specifických pro gag, které jsou lepší než frekvence popisované pro předešlé vakcíny, jako jsou vakcíny využívající holé DNA nebo poxvirových rekombinantů (S.Schwartz, et al., J Viral 66, 150-159 (1992)) . Frekvence byly také vyšší než frekvence pozorované u chronicky infikovaných jedinců (D.H. Barouch et al. Proč. Nati. Acad. Sci USA. 97, 4192 (2000); T.U. Vogel et al. J. Immunol. 164, 4968 (2000); P.A. Goepfert et al. J. Virol. 74, 10249 • · · ···· ·· 9 9 9 9 9 •••••9 9999999 ···’··’ *··* ··· *··’ * (2000); C.R. Rinaldo Jr. et al. AIDS Res. & Hum. Retr.,
14:1423 (1998)). Tyto výsledky ukazujína potenciál adenovirových rekombinantních vakcín.
Příklad 5 - Efekt primární imunizace a dosycovací imunizace antigenem na CD8+ T-lymfocyty
Primární splenocyty z buněk naivních nebo Adhu5-imunních myší imunizovaných 2xl07 pfu Adhu5gag37 nebo Adchimp68gag37 viru se srovnávaly se splenocyty od naivních nebo Adhu5 imunních myší vakcinovaných 2xl06 pfu Adhu5gag37 nebo Adchimp68gag37 viru a potom dosycených 106 pfu Wgag viru. Splenocyty se analyzovaly o 5 dnů později na CD8 a intracelulární IFN-γ. Tyto testy se provedly v podstatě způsobem popsaným výše, s tou výjimkou, že se nepróvedla žádná kultivace in vitro pro lýzu P815 buněk ošetřených gag peptidem nebo kontrolním peptidem 31D v 5 hodinovém testu uvolňování 51Cr.
Primární nebo dosycovací imunizace heterologním vakcinačním konstruktem, Wgag rekombinantem, selhala v obnovení CD8 T-lymfocytární reakce na gag present Adhu5 rekombinantní vakcínou. Ačkoliv Adhu5 vakcinovaná zvířata dosycená Adhu5gagp37 a Wgag měla až 7,1% splenických CD8+ T-lymfocytů produkujících IFN-γ v reakci na gagm, byly tyto CD8+T-lymfocyty zcela bez cytolytické aktivity proti cílovým T-lymfocytům prezentujícím gag. Tyto výsledky naznačují, že preexpozice antigenům nosiče vakcíny nemají pouze kvantitativní, ale též kvalitativní vliv na CD8+ Tlymfocytární reakci na produkt transgenu adenoviróvého rekombinantu. CD8+ T-lymfocytární reakce na gag u Adhu5 imuních myší vakcinovaných Adchimp68gag37 vykazovala efekt dosycovací dávky po Wgag imunizaci podobný efektu pozorovanému u naivních myší.
• ·
• ···· ··· ··· ·· · · · · · • ··· · · · · · · · · • · ··· · · © ·· · · ··· ·· · • ··
Frekvence CD8+ T-lymfocytů specifických pro gag, stejně jako lýza primárních cílových buněk, může být dále zvýšena (není uvedeno) dalši primární imunizací nebo dosycením heterologním vakcinačním nosičem, jako je VVgag rekombinant. Po i.m. primární imunizaci adenovirovými rekombinanty následované o 9 dnů později i.p. dosycovací imunizací VVgag, tvořily CD8+ gag-specifické T-lymfocyty analyzované za 5 dnů po primární imunizaci 40% celé splenické populace CD8+ Tlymfocytů.
Pre-existující imunita k Adhu5 výrazně snižuje účinnost Adhu5gag37 vakcíny, ale pouze mírně snižuje CD8+ Tlymfocytární reakci na Adchimp68gag37 virus. Již dříve bylo popsáno, že myši imunizované k Adhu5 viru mají redukovanou B-lymfocytární odpověď na vakcinaci Adhu5 vakcínou proti viru vztekliny. Vyšší dávky vakcíny nebo použití DNA vakcíny exprimující stejný antigen viru vztekliny mohou překonat škodlivý vliv preexistující expozice Adhu5 viru (Z.Q. Xiang, et al., J. Immunol. 162, 6716 (1999)).
Naopak, CD8+ T-lymfocytární reakce na gag prezentovaný Adhu5 rekombinantní vakcínou byla zrušena u Adhu5 imunních myší a mohla být pouze částečně obnovena dalšími imunizacemi heterologni vakcínou proti gag. Toto může ukazovat na indukci CD8+ T-lymfocytů citlivějších na cirkulující virusneutralizační protilátky, ve srovnání se stimulací Blymfocytů.
Příklad 6 - Produkce rekombinantních adenovirů obsahujících glykoprotein viru vztekliny
Adenoviry lidských serotypů 2, 4, 5, 7, 12 a šimpanzíhp serotypu 68 se propagovaly a titrovaly na lidských 293 • * buňkách. Rekombinantní adenoviry na bázi lidského serotypu 5 exprimující glykoprotein ERA serotypu viru vztekliny nebo LI protein lidského papilloma viru (HPV)-16 byly popsány dříve (Z.Q. Xiang, et al, Virology 219: 220-227 (1996); D. W. Kowalcyk, et al, (2001) Vaccine regimen for prevention of sexually transmitted infections with human papillomavirus type 16, Vaccine). Byl vyvinut expresní systém na bázi adenovirů šimpanzího serotypu 68, jak je popsáno v příkladu 1.
Adenoviry se propagovaly na El (z lidského šepotypu 5)transfektovaných 293 buňkách (F. L. Graham, et. al., J. Gen. Virol. 36: 59-74 (1977)}. Viry se získávaly lyofilizací buněk. Pro některé pókusy se virus přečistil CsCl gradientovým přečištěním. Pro jiné pokusy se použil přečištěný supernatant infikovaných buněk nekrotizovaných třenmi koly lyofilizace. Viry se titrovaly na 293 buňkách pro stanovení jednotek tvořících plaky (pfu).
Adenovirový rekombinant šimpanzího 68 serotypu exprimující glykoprotein viru vztekliny, označený jako Adchimp68rab.gp, se připravil ve 293 buňkách transfektovaných El adenoviru lidského serotypu 5, jak je podrobně popsáno v tomto příkladu. Virové klony se nejprve testovaly nepřímou imunofluorescencí za použití monoklonální protilátky 509-6 namířené proti konformac^-dependentnímu epitopu glykoproteinu viru vztekliny. Po selekci stabilního adenovirového subklonu se exprese kompletního glykoproteinu viru vztekliny v Ad.chimp68rab.gp viru v infikovaných TK buňkách potvrdila imunoprecipitací, jak je popsáno v následujícím příkladu.
Příklad 7 - Exprese produktu transgenu adenovirovými rekombinanty.
Tento příklad ukazuje, že Adhu5 virus dosahuje znatelně vyšších hodnot exprese glykoproteinu viru vztekliny v TK” buňkách ve srovnání s Adchimp68 konstruktem. Koncentrace transkriptu pro tento transgen kopírovaly expresi proteinu, což naznačuje, že rozdíl nesouvisel s post-translační modifikací. TK-buňky jsou CAR pozitivní a stupeň transdukce virovými serotypy by proto měl být srovnatelný.
Pro tyto pokusy se savčí buňky, tj. fetální ledvinné křečci buňky (BHK)-21, El-tranšfektované 293 buňky a TK buňky, propagovaly v Dulbecco modifikovaném Eagle mediu (DMEM) doplněném glutaminem, Na-pyruvátem, non-esenciálními aminokyselinami, HEPES pufrem, antibiotiky a 10% fetálním hovězím sérem (FBS).
A. Imunoprecipitace
TK” buňky (106 na vzorek) se infikovaly 5 pfu na buňku adenovirových rekombinantů exprimujících glykoprotein viru vztekliny nebo kontrolními konstrukty exprimujičími nepříbuzný virový antigen. Po 48 hodinách sě buňky promyly dvakrát sterilním fosfátem pufrovaným salinickým roztokem (PBS) a potom se inkubovaly po dobu 90 minut v bezsérovém mediu před přidáním 20 μΐ 35S-značeného cysteinu a methióninu (Promix, NEN, Boston, MA). Po 4 hodinové inkubaci se buňky promyly PBS a potom se ošetřily během 20 minut 1 ml inhibitorů proteasy obsahujících RIPA pufr. Buňky a buněčná drť se odstranily z jamek, krátce se promísily a odstředily se během 2 minut při 12000 rpm. Supernataňt se inkuboval po dobu 90 minut při 4 °C s 15 μΙ/ml ascitické kapaliny Obsahující 509-6 monoklonální protilátku ke glykoproteinu viru vztekliny. Protein Sepharose G se přidala v dávce 75 μΐ na vzorek a inkubovala se při 4°C za mírného míšení po dobu minut. Vzorky se peletovaly odstředěním a promyly se 4krát RIPA pufrem. Pelety se resuspendovaly v 80 μΐ zaváděcího pufru a provedl se var po dobu 4 minut. Vzorky (20 μΐ) se potom separovaly na 12% SDS-polyakrylamidovém (PAGE) gelu a srovnávaly se se standardy molekulové hmotnosti. Gely se sušily na filtračních papírech, které se exponovaly po dobu 48 hodin na Kodak Scientific Imaging Film (X-Omat Blge XB-1).
Adchimp68rab.gp rekombinant exprimoval protein předpokládané velikosti, který se vázal na 509-6 protilátku. Sraženina z TK-buněk infikovaných Adhu5rab-gp virem vykazovala proužek identické velikosti, který nebyl přítomen v lyzátech z buněk infikovaných adenovirovými rekombinanty exprimujícími produkt nepříbuzného transgenu. Exprese glykoproteinu viru vztekliny byla výraznější v buňkách infikovaných Adhu5rab.gp konstruktem. Odlišnosti v expresi transgenu mohou být důsledkem post-translačních dějů, jako jsou rozdíly ve vychytávání viru, rychlosti transkripce nebo stability transkriptu. Alternativně, translační nebo posttranslační odlišnosti, jako jsou různé modifikace vedlejšího řetězce, mohou vést ke kvantitativním odlišnostem v serologicky detekovatelném proteinu.
Pro další odlišení mezi těmito dvěíai možnostmi se celková RNA izolovala z TK buněk infikovaných jedním z adenovirových rekombinantů. Reversně transkribovaná mRNA glykoproteinu viru vztekliny a housekeeping genu se amplifikovala realtime PCR provedéným způsobem popsaným v oddíle B.
B. Reál time reversní transkripční polymerasová řetězová reakce (PCR) • ···
Konfluentní monovrstvy TK- buněk se infikovaly ve dvojích vzorcích 10 pfu jednoho z adenovirových rekombinantů. Buňky se izolovaly o 24 hodin později a RNA se extrahovala TRI činidlem podle návodu výrobce (Mol. Res. Center, Cincinnati, OH). RNA se zpracovala DNAsou bez RNAsy, přečistila se fenolovou extrakcí a upravila se na 50 ng RNA na vzorek. RNA se reverzně transkribovala a amplifikovala se pomocí Light Cycler-RNA amplifikačního kitu SYBR green (Roche, Mannheim, Germany; Z. He, et al, Virology 270: 1461617 (2000)) za použití primerů pro glykoprotein viru vztekliny (SEQ ID NO:2: 5' AA GCA TTT CCG CCC AAC AC; SEQ ID NO: 3: 3' GGT TAG TGO AGC AGT AGO TAG A) a housekeeping gen glutaraldehyd-3-fosfát dehydrogenasu (GAPDH) (SEQ ID NO:4:
5' GGT GAA GGT CGG TGT GAA CGG ATT T; £EQ ID NO:5: 3' AAT GCC AAA GTT GTC ATG GAT GAC C).
Data v tabulce 1 uvádějí výsledky. Uvedená data jsou průměrné hodnoty pro dvojí měření ± SD.
Tabulka 1
Zdroj RNA Relativní kvalita transkriptu
GAPDH Rab.gp Poměr (GAPDH/rab.gp)
TK“, Adhu5rab. gp 3,2 ± 0,2 3494 ± 18 1082
TK~,Adchimp68rab.gp 0,52 ± 0,01111 64 ± 6 64
Jak ukazují tato data, vykazují transgenové transkripty upravené na transkripty housekeeping genu kvantitativní rozdíly srovnatelné s rozdíly pozorovanými pro serologicky detekovatelný protein.
V datech neuvedených v tomto příkladu se další dva Adchimp68 rekombinanty exprimující zelený fluorescentní
• fl
protein a zkrácený gag protein viru lidské imunodeficience 1 s modifikovanými kodony srovnávaly s Adhu5 rekombinanty exprimujícími stejné transgenové produkty a prokázala se ekvivalentní exprese proteinu v TK buňkách. Z tohoto výsledku lze usoudit, že redukovaná exprese glykoproteinu viru vztekliny Adchimp68 virem není důsledkem vychytávání viru ani rychlosti transkripce, a oba konstrukty jsou regulovány stejnými kontrolními elementy.
Příklad 8 - Imunizace myší za použití antigenu viru Vztekliny
Protilátková reakce specifická k viru vztekliny na Ad.chimp68rab.gp virus se srovnávala s reakcí na Adhu5rab.gp virus u inbredních a outbredních kmenů ťnyší. Myším se injikovaly sériová ředění rekombinantů podaných s.c. nebo i.n. Sérum se odebíralo o 14 dnů později a testovalo se na protilátky proti glykoproteinu viru vztekliny ELISA a testem na neutralizaci viru. Adenovirové rekombinanty exprimující nepříbuzný transgen, tj. gag HIV-1 (popsané ve výše uvedených příkladech) se použily jako kontroly. Tyto rekombinanty selhaly v indukci protilátkové reakce k viru vztekliny detekovatelné jedním z těchto testů. Podrobnější popis tohoto pokusu a výsledků je uveden dále.
Samice C3H/He a C57B1/6 mýší staré 6-8 týdnů se zakoupily od Jackson Laboratory, Bar Harbor Maine. Outbrední ICR myši se zakoupily od Charles River (Wilmington, MA).
Myším se ínjekčně podaly různé dávky adenovirových rekombinantů, které se aplikovaly ve 100 μΐ salinického roztoku podkožně (s.c.) nebo v 50 μΐ intranasálně (i.n.). Myši se infikovaly virem vztekliny kmene CVS-11 podaným v dávce 10 průměrných letálních dávek (LD50) intracerebrálně • «9 ·« (i.c.). Virus vztekliny Evelyn Rokitniki-Abelseth (ERA) a Challenge Virus Standard (CVS)-11 se propagovaly na BHK-21 buňkách. ERA virus se přečistil přes sacharosový gradient, inaktivoval se ošeteřním betapropionolaktonem a upravil se na koncentraci proteinu 0,1 mg/ml. CVS-11 virus se titroval na BHK-21 buňkách a pomocí intracerebrální injekce dospělým ICR myším (Z.Q. Xiang, Z.Q. & H.C. Ertl, J. Vírol. Meth. 47:103-16 (1994)). Po infekci še myši kontrolovaly každých 24-43 hodin po dobu nejméně 21 dnů. Myši se utratily poté, co se vyvinula paralýza zadních tlapek, která ukazuje na terminální stadium encephalitidy způsobené virem vztekliny.
Serologická analýza zahrnovala enzymově vázaný imunoadsorbentní test (ELISA), isotypový profil protilátek a test na neutralizaci viru.
A. ELISA
Myším se odebírala krev v různých intervalech po imunizaci punkcí retroorbitální žíly. Připravila se séra a ta se testovala na protilátky proti viru vztekliny na plotnách potažených 0,1 gg/jamku inaktivovaríého vipu vztekliny. Séra se testovala na protilátky k adenoviru na plotnách potažených 0,1 gg/jamku přečištěným El-deletovaným adenovirovým rekombinantem s GFP lidského serotypu 5 nebo šimpanzího serotypu 68. ELISA se provedly v podstatě způsobem popsaným dříve (Z. Q. Xiang, et al., Virology 219, 220-227 (1996)). Plotny se potáhly přes noc. Potom se plotny blokovaly po dobu 24 hodin PBS obsahujícím 3% hovězí sérový albumin (BSA). Po promytí se séra naředěná v PBS-3% BSA přidala na dobu 60 minut. Po promytí se na jednu hodinu na ledu přidalo ředění 1:100 kozí antí-myší Ig protilátky konjugované s alkalickou fosfatasou (Cappel). Po promytí se na 20-30 minut při tepíotě místnosti přidal substrát.
Optická densita se odečítala při 405 nm.
B. Isotypy protilátek
Isotypy protilátek k viru vztekleny se stanovily na ELISA plotnách potažených ERA virem za použití Calbiochem Hybridoma Subisotyping (La Jolla, CA) kitu s určitými drobnými dříve popsanými modifikacemi (Xíang, Virol, 1996, citováno výše).
Izotypový profil protilátek se lišil při s.c. imunizaci, ale byl srovnatelný při i.n. aplikaci dvou adenovirových vakcín. Oba rekombinanty, po pQdání jakýmkoliv způsobem, indukovaly IgG2a protilátky k antigenu viru vztekliny.
Oba rekombinanty po i.n. imunizaci a AdhuSrab.gp vakcína po s.c. podání indukovaly výraznou IgGl odpověď, což ukazuje na aktivaci Th2 buněk, která chybí v reakci na
Ad.chimp68rab.gp konstrukt podaný s.c.
C. Neutralizační protilátky
Séra se testovala na neutralizační protilátky k viru vztekliny kmene CVS-11, který je antigenně blízce příbuzný ERA kmenu (Z. Q. Xiang, et al, Virology. 214: 398-404 (1996)). WHO referenční sérum se použilo pro srovnání. Titry se uvedly v mezinárodních jednotkách.
Adchimp68rab.gp virus podaný s.c. indukoval slabší Blymfocytární reakci na transgenní produkt ve srovnání s AdhuSrab.gp konstruktem. Rozdíly ve velikosti protilátkové reakce, které byly pozorovány ve všech testovaných bodech, závisely na kmenu myší a was less pronounced byly menší u outbredních ICR než u inbredních C3H/He myší. Naopak, při i.n. imunizaci indukovaly obě vakcíny srovnatelné titry protilátek, jak bylo stanoveno ELISA a testy na neutralizaci viru.
Zvýrazněná Thl reakce na Adchimp68rab.gp rekombinanty po s.c. imunizaci kontrastující s Thl/Th2 reakcí po injekci Adhu5rab.gp svědčí pro odlišnosti v adjuvanticitě. Po aplikaci do dýchacích cest přirozený způsob infekce pro Adhu5 virus a patrně též pro Adchimp68 rekombinantní viry indukuje protilátkové titry k transgenovému produktu, které jsou srovnatelné ve velikosti a izotypovém profilu. Toto naznačuje, že předpokládané rozdíly v tropismu a/nebo adjuvanticitě jsou závislé na tkáních, tj. chybí nebo jsou méně výrazné v dýchacích cestách ve srovnání s podkožím.
Příklad 9 - Přednostní indukce cytotoxické T-lymfocytární reakce při použití rekombinantního šimpanzího adenoviru
Vakcínou indukovaná ochrana proti viru vztekliny koreluje s protilátkami neutralizujícími virus (VNAs, F. L. Graham, et. al., J. Gen. Virol. 36, 59-74 (1977)). Pokusy s proteinem vztekliny se zaměřily na toto rameno imunitního systému. Ve všech pokusech se myši imunizovaly
Adchimp68rab.gp virem a - paralelně - dříve popsaným Adrab.gp virem na bázi lidského serotypu 5. V této přihlášce je terito rekombinant označován jako Adhu5rab.gp virus.
Oba adenovirové rekpmbinanty indukovaly ochranu proti infekci virem vztekliny. C3H/He myši imunizované 5 x 106 pfu jednoho z adenovirový rekombinantů podaných s.c. zůstávaly bez známek nemoci, když byly za 3 měsíce infikovány 10 průměrnými letálními dávkami (LD50) viru Vztekliny kmene CVS. Tento viřus vztekliny je antigenně blízce příbuzný ERA • fc • fc • · · kmeni, ale u hlodavců je virulentnější. Při nižší dávce vakcíny (5xl05 pfu) poskytoval Adhu5rab.gp virus stále ještě kompletní ochranu, zatímco malé procento myší imunizovaných Adchimp68rab.gp skonalo na infekci. Další redukce dávky vakcíny vedla ke ztrátě účinnosti Adchimp68rab.gp vakcíny.
Po i.n. imunizaci poskytovaly obě vakcíny kompletní ochranu, když byly podány v dávce 5xl05 pfu. Při nižší dávce 5xl04 pfu se u 50% myší vakcinovaných Adhu5rab.gp vakcínou rozvinulo progresivní onemocnění, zatímco myši vakcinované stejnou dávkou Adchimp68rab.gp rekombinantů byly chráněné. U všech myší imunizovaných adenovirovými rekombinanty jakéhokoliv serotypu exprimujícími nepříbuzný antigen nebo 5xl03 pfu jednoho z adenovirových rekombinantů pro glykoprotein viru vzetkliny se rozvinula fatální encephalitida způsobená virem vztěkliny.
Příklad 10 - Efekt pre-existující imunity k různým serotypům lidských adenovirů na protilátkovou reakci na virus vztekliny
Pro testování toho, zda předcházející infekce jakýmkoliv z běžných serotypů lidského adenoviru (např. lidskými serotypy 2, 4, 5, 7 a 12) búde inhibovat protilátkovou reakci na Adchimp68rab.gp vakcínu se skupiny C3H/He myší imunizovaly 4xl08 pfu replikace-kompetentními adenoviry lidského serotypu 2, 4, 5, 7 nebo 12 nebo šimpanzího serotypu 68 (kde poslední serotyp má deletovaný El). O dva týdny později se myši vakcinovaly s.c. buď Adhu5rab.gp nebo Adchimp68rab.gp virem. Adhu5rab.gp rekombinant se použil v dávce 2xl05 pfu na myš, Adchimp68rab.gp rekombinant, který při podání s.c. v této dávce indukuje pouze marginální protilátkovou reakci u C3H/He myší, se injikoval v dávce 2xl07 pfu na myš. Sérum se odebíralo o dva týdny později a testovalo se na protilátky ke glykoproteinu viru vztekliny • · • 9
9 9
ELISA- Reakce specifická pro virus vztekliny na Adhu5rab.gp byla u naivních myší o něco lepší než reakce na Adchimp68 virus. Reakce na Adhu5rab.gp virus byla u Adhu5 pre-imunních myší zcela inhibována. Určitá redukce byla také pozorována u myší preimuních k adenovirů lidského serotypu 4, 2, 7 a 12. Reakce nebyla ovlivněna u myší, které byly předem infikované Adchimp68 virem. Reakce na Adchimp68rab.gp virus byla výrazně inhibována u myší, které byly pre-imunní k homolognímu viru. Myši, které se dříve setkaly s adenovirem lidského serotypu 2 vykazovaly mírnou redukci protilátkové reakce na antigen viru vztekliny prezentovaný Adchimp68 vakcínou. Myši očkované jakýmkoliv jiným serotypem lidského adenovirů měly titry protilátek k viru vztekliny po vakcinaci Adchinip68rab.gp virem, které byly buď podobné velikosti, nebo vyšší než u myší, které byly naivní před vakcinaci. Konkrétně, u myší pre-imunních k Adhu5 viru se vyvinuly vyšší titry protilátek při vakcinaci
Adchimp68rab.gp konstruktem, což může odrážet přítomnost Thelper lymfocytů, které podporují reakci B-lymfocytů na produkt transgenu.
Pro další stanovení toho, zda stejné dávky
Adchimp68rab.gp vakcíny indukují lepší titry protilátek ve srovnání s AdhuSrab.gp virem u myší preimunních na Adhu5 virus se provedl pokus s titrací vakcíny. Skupiny C3H/He θ myší se imunizovaly s.c. 4x10 pfu adenovirového rekombinantu s deletovaným El k LI antigenu HPV-16. Myši se vakcinovaly o 2 týdny později buď Adhu5rab.gp nebo Adchímp68rab.gp vírem podaným s.c. v různých dávkách. Myším se odebrala krev o dva týdny později a titry sérových protilátek k viru vztekliny se stanovily ELISA (není uvedeno) a testem na neutralizaci viru. Ani jeden test neukázal významnější redukci protilátkové reakce na Adcbimp68rab.gp konstrukt u Adhu5-imunních myší. Závažnost
snížení titrů protilátek k viru vztekliny prezentovaný Adhu5 konstruktem u myší preimunních k homolognímu viru závisela na dávce vakcíny. Protilátková reakce na nižší dávky vakcíny byla ovlivněna yíce než reakce na vyšší dávky vakcíny. VNA titry byly sníženy významně víCe než ELISA titry. Titry VNA při nejvyšší dávce vakcíny byly poloviční u myší preimunních k Adhu5 viru, zatímco při dvoou nižších dávkách vakcíny byly titry sníženy více než 20-krát. Při jakékoliv testované dávce indukoval Adchimp68rab.gp rekombinant vyšší VNA titry k vzteklině u Adhu5 preimunních myší než jsou titry dosažené při stejné dávce Adhu5rab.gp vakcíny. Škodlivý efekt preexistující imunity k Adhu5 na účinnost Adhu5 vakcíny byl dále prokázán v pokusu s ochranou před infekcí. Naivní myši imunizované 2xl05 pfu Adhu5rab.gp nebo Adchimp68rab.gp viru byly plně chráněné před ipfekcí CVS-11 virem. Většina (65%) Adhu5 pre-imunních myší imunizovaných touto dávkou Adhu5rab.gp vakcíny podlehla infekci virem vztekliny, zatímco myši vakcinované stejnou dávkou Adchimp68rab.gp viru β
zůstaly ochráněné. Dávka Adhu5rab.gp viru zvýšená na 2x10 pfu na myš obnovila účinnost vakcíny.
Protilátková odpověď na produkt transgenu exprimovaný Adchimp68 rekombinanty nebyla ovlivněna pre-existující imunitou k běžným lidským serotypům adenovirů, která inhibuje odpověď na odpovídající rekombinantní lidský serotyp 5. Po preimunizaci replikace-kompetentními viry byla imunitní reakce na Adhuárab.gp vakcínu eliminována u Adhu5 pre-imunních myší a snížena u myší pre-imunních k jiným lidským serotypům sdenoviru, jako je serotyp 2 a 4. Odpověď na Adchimp68 rekombinan byla, jak se předpokládalo, inhibována u myší pré-imunních k homolognímu viru. Toto nemá klinický význam, protože Adchimp68 virus necirjculqje v lidské populaci a běžné lidské serotypy nemají společné neutralizační epitopy s Adchimp6S virem.
·· 9
Pre-infekce replikace-defektním Adhu5 virem také redukuje protilátkovou odpověď na glykoprotein viru vztekliny prezentovaný Adhu5 rekombinanty, ačkoliv tento vliv není tak významný jako u myší dříve infikovaných replikacekompetentním virem. Sérum od myší pre-imunních k replikacedefektnímu Adhu5 viru měla snížené, ale Snadno detekovatelné koncetrace protilátek k viru vztekliny po imunizaci Adhu5rab.gp vakcínou. Zvýšené dávky Adhu5rab.gp Konstruktu mohou částečně překonat vliv pre-existující imunity. Vakcínou indukovaná ochrana proti viru vztekliny vyžaduje VNA, které nejsou indukovány tak účinně u pťeimuních myší Adhu5 vakcínou, zejména pří použití nižších dávek. U AdhuS pre-imunních myší byla VNA reakce na Adchimp68rab.gp konstrukt lepší při všech testovaných dávkách než na Adhuh vakcínu, což více než kompenzuje o něco nižší účinnost této vakcíny při s.c. imunizaci.
Adchimp68 rekombinanty tak jsou atraktivními alternativními nosiči pro vakcíny pro použití u člověka. Jak je zde uvedeno, jsou účinné i při použití dávek 2x10 pfu pří neinvazívních způsobech podání, jako je aplikace do horních cest dýchacích. Slizniční imunizace i.n. aplikací má další výhodu v tom, že usnadňuje indukci odpovědi slizničního imunitního systému, která je odlišná od reakce centrálního imunitního systému indukované ínjekčně podávanými vakcínami, i když je s centrální reakcí spojená.
Příklad 11 - Zdroj šimpanzího C68 viru a jeho replikace
Následující příklady 11 až 5 dále charakterizují šimpanzí C68. je třeba si uvědomit, že odborník v oboru tyto informace může snadno použít ke konstrukci nových rekombinantních šimpanzích adenovirových kohstruktů.
• · · · • · · · · · 4
Zdroj C68 viru byl získán z ATCC (Rockville, MD) a virus se propagoval na 293 buňkách (ATCC) kultivovaných v DMEM (Sigma, St. Louis, MO) doplněném 10% fetálním telecím sérem (FCS; Sigma nebo Hyklon, Logan, UT) a 1% PenicillinemStreptomycinem (Sigma). Infekce 293 buněk se provedla v DMEM doplněném 2% FCS během prvních 24 hodin, a potom se přidalo FCS na konečnou koncetraci 10%. Infikované buňky se odebraly tehdy, když 100% buněk vykazovalo virem-indukovaný cytopatický efekt (CPE), buňky se odebraly a koncentrovaly se odstředěním. Buněčné pelety se resuspendovaly v 10 mM Tris (pH 8,0) a lyžovaly se 3 cykly zmrazení a rozmražení. Přípravky viru se získaly po 2 cyklech ultraodstředění na densitních gradientech chloridu cesia a zásoba viru sě naředila na lxlO12 částic/ml v 10 mM Tris/100 mM NaCl/50% glycerol a uskladnila se při teplotě -70°C.
Příklad 12- Klonování a sekvenování virové genomové DNA
Genomová DNA se izolovala z přečištěných virových přípravků za použití standardních metod a trávila se panelem 16 restrikčních enzymů podle návodu výrobce. Pokud není uvedeno jinak, byly všechny restrikční a modifikační enzymy získány od Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN. Genomová DNA se trávila BamHI, Pstl, Sall, HindlII nebo Xbal a fragmenty se subklonovaly do plasmidů (K-.L. Berkner and Ρ.Ά. Sharp, Nucl. Acids Res., 11:6003-20 (1983)). Po deproteinaci se syntetické 10 bp Pad linkery (New England Biolabs, Beverly, MA) dvojitě trávily PacI a BamHI nebo Pstl.
Pstl, BamHI a HindlII klony získané ze C68 jsou zobrazeny na obr. 1, oddílech C, D a E, v příslušném pořadí. Fragmenty v šrafovaných boxech nebyly klonované, ale sekvence celého genomu byla určena pomocí sekvenování překrývajících se
• · • · · klonů a přímo virové DNA (nešrafováné rámečky). Klonované fragmenty jsou popsány v tabulce 2.
9
9 9
9 9 9
99999 • · · • ·
Tabulka 2: C68 plasmidoVé klony a velikost insertů
9
999
9 9 • 99
99 9 9
Název konstruktu Velikost insertu (bp) 5'konec fragmentu • 3' konec fragmentu 5'mapová jednotka 3'mapová jednotka
Pst-I fragmenty
C68-Pst-A 6768 24784 31551 67.9% 86.4%
pBS:C68-Pst-B 6713 4838 11550 . 13.2% 31.6%
pBS:C68-Pst-C 5228 14811 20038 40.6% 54.9%
pBS:C68-Pst-D 2739 12072 14810 33.1% 40.6%
pBS:C68-Pst-E 2647 20039 22685 54.9% 32.1%
pBS:C68-Pst-F 1951 32046 33996 87.8% 93.1%
pNEB:C68-Pst-G 1874 1 1874 0.0% 5.1%
pBS:C68-Pst-H 1690 23094 24783 63.2% 67.9%
pBS:C68-Pst-I 1343 33997 35339 93.1% 96.8%
pNEB:C68-Pst-J 1180 35340 36519 96.8% 100.0%
pBS:C68-Pst-K 1111 2763 3873 7.6% 10.6%
pBS:C6S-Pst-L 964 3874 4837 10.6% 13.2%
pBS:C68-Pst-M 888 1875 2762 5.1% 7.6%
pBS:C68-Pst-N 408 -'·· 22686 23093 62.1% 63.2%
C68-Pst-O 380 31666 32045 86.7% 87.7%
pBS:C68-Pst-P 285 11551 11835 31.6% 32.4%
C68-Pst-Q 236 11836 12071 32.4% 33.1%
pBS:C68-Pst-R 114 31552 31665 86.4% 86.7%
BamHI . fragmenty 5
C6S-Bam-A 16684 19836 36519 54.3% 100.0%
pBS:C68-Bam-B 8858 3582 12439 9.8% 34.1%
pBS:C68-Bam-C 4410 12440 16849 34.1% 46.1%
pBS:C68-Bam-D 2986 16850 19835 46.1% 54.3%
pNEB:C68-Bam-E 2041. 1- 2041. 0.0% 5.6%
pBS:C68-Bam-F 1540 2042 ·. 3581 : 5.6% 9.8%
tíindDI fragmenty
pBR:C68-Hind-B 9150 23471 32620 64.3% 89.3%
pBS = pBluescript SK+ klon pNEB = pNEB 193 klon pBR = pBR322 klon bez předpony = neklonovaný fragment ··
9 ·· 9
99
9
999
9
9
999 99 ·
• · · • ···» • 9
Šimpanzí adenovirus, C68, byl získán z ATCC a byl propagován v lidských 293 buňkách. Virová genomová DNA se izolovala 2 přečištěných virionů za použití zavedených postupů (A. R. Davis, et al., Gene Thera., 5:1148-1152 (1998)) a trávila se panelem restrikčních enzymů; data byla v souladu s předchozími pokusy (data nejsou uvedena) (G. R. Kitchingman, Gene, 20:205-210 (1982); Q. Li a G. Wadell,
Arch Virol. 101:65-77 (1998); R. Wigand, et al.,
Intervirology. 30:1-9 (1989)). Restrikční fragmenty pokrývající celý genom C68 se subklonovaly do plasmidů. Schématické znázornění C68 genomu je uvedeno na obr. 1A a Pst-I, BamHI a HindlII fragmenty, které byly klonovány do plasmidových vektorů, jsou uvedeny v nešrafováných rámečcích, na obr. 1B, IC a ID, v příslušném pořadí. Klonované fragmenty, velikost fragmentů a genomová pozice jsou také uvedeny v tabulce 2. Oba plasmidové klony a genomová DNA se použily jako templáty pro sekvenování. Genom se sekvenoval nejprve procházeném v obou směrech a každá baze byla průměrem čtyřech reakcí.
C68 genom má délku 36521 bp [viz US Patent 6,083,716]. Předběžné srovnání s GenBank sekvencemi ukázalo různý stupeň podobnosti s dalšími lidskými a zvířecími adenoviry v celé délce virového genomu. V C68 genomu byly nalezeny regiony s homologií ke všem dříve popsaným adenovirovým genetickým jednotkám, časné regiony 1-4 a hlavní pozdní geny (Obr. 1A) . DNA homologie mezi C68 a lidskými adenoviry, které byly kompletně sekVenovány, Ad2 (NC001405), AdS (NC001405), Adl2 (NC001460), Adl7 (NC002067) a Ad40 (NC01464), se použila pro seřazení klonů. Určily se otevřené čtecí rámce (ORF) a identifikovaly se geny na základě homologie s jinými lidskými adenoviry. Všechny hlavní adenovirové časné a pozdní geny jsou přítomné v C68. Inverfpvané terminální repetitivní sekvence (ITR=s) mají délku 130 bp.
• 9 ·
9
9 9 9 • · 9 • · 9 • 99 99 • 9 9 • 9 9 9 • · · 9999 •99 99 9
Příklad 13 - Analýza C68 sekvence
Kompletní nukleotidové sekvence všech členů Mastadenovirové čeledi dostupné z GenBank, včetně izolátů z různých druhů, se testovaly na identitu s C68. Ad4 minigenom se sestavil z následující GenBank sekvence: Levostranný ITR (J01964); E1A region (M14918); DNA pol a pTP (X74508, 74672); VA RNA-I, II (U10682); 52, 55K (U52535); pVII (U70921); hexon (X84646); endoproteasa (M16692); DNAvazebný protein (M12407); fiber (X76547); pravostranný ITR (J01965). Ad7 kompozitní genom se vytvořil z dat pro následující sekvence: Mu 3-21 (X03000); VA RNA-I, II, pTP & 52, 55K (U52574); penton (AD001675); pVI, hexon a endoproteasa (AF065065); DNA-vazebný protein (K02530); E3 a fiber region (AFI 04384); pravostranný ITR (V00037).
Seřazení aminokyselinové sekvence se provedlo za použití Clustal X, editované s Jalview (http://www.ebi.ac.uk/michele/jalview/), a analýza se provedla za použití Boxshade (http://www.ch.embnet.org/software/BQX form.html). Veřejně dostupné sekvence hexonových proteinů od všech lidských adenovirových serotypů se nejprve seřadily pro to, aby se identifikovala sada vykazující nejvyšší homologii s C68.
Nukleotidová sekvence a předpokládaná aminokyselinová sekvence všech významných otevřených čtecích rámců v C68 genomu se srovnávaly se známými DNA a proteinovými sekvencemi. Nukleotidová sekvence C68 se srovnávala se sekvencí Ad 2, 4, 5, 7, 12, 17 a 40. V souladu s předešlou restrikční analýzou (Kitchingman, viz výše; Li and Wgdell, viz výše) je C68 nejvíce podobný lidskému <Ad 4 (podskupina E) .
• fc
E1A region C68 se rozkládá od TATA boxu v nt 480 do póly A adičního místa v nt 1521, konvenční sestřihová donorová a akceptorová místa jsou v analogických pozicích jako místa lidského Ad, a 28.2K a 24.8K proteiny mají podobnou velikost jako proteiny lidského Ad. ORF pro nejmenší E1A protein C68 kóduje 101 zbytků, oproti přibližně 60 aminokyselinám pro jiné adenoviry. U C68 je TTA kodon ve zbytku 60, kde mají ostatní adenoviry často TGA stop kodon. Prvních 60 zbytků C68 E1A 100R proteinu má 85% identitu s Ad4 homologem.
C68 genoia kóduje čtyři E1B proteihy, 20.5K, 54.7K, 10.1K a 18.5K, stejně jako pIX. Všech pět C68 kódovaných proteinů má podobnou velikost jako E1B a pIX proteiny jiných adenovirů. Ad4 homolog E1B 21K proteinu je tvořen pouze 142 aminokyselinami, zatímco C68 má 186 zbytků a další lidské adenoviry mají 163-178 zbytků. C68 a Ad4 proteiny vykazují 95% identitu s prvními 134 aminokyselinami, potom podobnost končí a Ad4 protein končí ve 142 aminokyselině.
C68 genom kóduje homolog E2A 55K DNA vazebného proteinu a Iva2 maturačního proteinu, stejně jako E2B terminální protein a DNA polymerasu. Všechny proteiny E2 regionu mají podobnou velikost jako jejich protějšky u lidského Ad, a E2B proteiny jsou zejména dobře konzervovány. C68 E2B 123.6K DNA polymerasa má předpokládanou velikost 1124 zbytků, Ad4 má předpokládanou velikost 1193, ačkoliv jiné lidské adenoviry mají menší poiymerasy. Zbytky 1-71 Ad4 polymerasy nemají žádnou podobnost s jakoukoliv jinou Ad polymerasou, a je možné, že tento protein ve skutečnosti začíná na vnitřním ATG kodonu. V aminokyselinách 72-1193 mají Ad4 a C68 polymerasy 96% aminokyselinovou identitu.
Dosud sekvenované E3 regiony lidského adenoviry vykazují významnou variabilitu sekvence a kpdovací kapacity. Ad40 obsahuje pět genů E3 regionu, Adl2 šest, C68 a AdS sedm,
Ad38 osm a Ad3, stejně jako Ad7 (podskupina B lidského adenoviru) mají devět domnělých genů E3 regionu. Ad4 E3 region nebyl dosud sekvenován. Ve srovnání s E3 regionem Ad35 byly v C68 genomu identifikováno všech 7 homologů E3 genu (C. F. Basler and M.S. Horwitz, J Virology, 215:165-177 (1996)).
C68 E4 region má 6 ORF a každý je homologní s próteiny v lidském Ad5, 12 a 40 E4 regionech. E4 nomenklatura je zmatená, protože ORF2 homology C6&, Adl2 a Ad40, mají přibližně 130 zbytků, zatímco v Ad5 jsou dva ORF kódující proteiny o 64 a 67 zbytcích s homologií, v příslušném pořadí, s amino a karboxy konci větších ORF2 proteinů. ORF5 byl v naší nomenklatuře vynechán, protože 5. ORF v E4 regionu je homologní s rozsáhle studovaným ORF6 proteinem lidského Ad5.
Hlavní pozdní proiftotor a trojdílná vedoucí sekvence C68 genomu byly lokalizované. ORF s potenciálem ke kódování 15 hlavních pozdních proteinů byly lokalizované. Všechny C68 pozdní proteiny mají podobnou velikost jako jejich protějšky v lidském Ad. Procento aminokyselinové identity mezi šimpanzími a lidskými Ad pozdními proteiny se značně lišilo. C68 fiber protein má předpokládané 90% aminokyselinovou identitu s Ad4 proteinem, ale mndhem menší podobnost s fiber proteiny jiných lidských Ad. CAR vazebné místo v kulovitém zakončení fiber proteinu je přítomné v C68.
• ·
Přiklad 14- Test na protilátky neutralizující virus
Několik pokusů bylo provedeno pro stanovení toho, zda existuje zkřížená reaktivita mezi typově specifickým antisérem C68 a lidským adenovirem. Neutralizační aktivita séra se testovala následujícím způsobem. Panely séra od normálních jedinců (N=50), makaků rhesus (N=52) a šimpanzů (N=20) se hodnotily na neutralizační protilátky k vektorům na bázi Ad5 a C68 za použití 293 buněk jako indikátorové buněčné linie. Séra odebraná od jednotlivých lidí, makaků rhesus nebo šimpanzů se inaktivovala při 56°C na dobu 30 minut. Sériová ředění každého vzorku (1:10, 1:20, 1:40,
1:80, 1:160, 1:320 v 100 μΐ DMEM obsahujícím 10% FCS) se přidala do stejných množství H5.010CMVEGFP (1000 PFU/jamku) nebo C68CMVEGFP viru a provedla se inkubace při 4 °C po dobu 2 hodin. 150 μΐ směsi se přeneslo na 2 x 10 293 buněk v 96 jamkové plotně s plochým dnem. Kontrolní jamky se infikovaly stejnou dávkou viru (bez přidání séra). Vzorky se inkubovaly při 37°C v 5% CO2 po dobu 48 hodin a vyšetřovaly se ve fluorescentním mikroskopu. Ředění vzorků, která vykazovala >50% redukci ložisek zelené fluorescence ve srovnání s infikovanými kontrolami se považovala za pozitivní na neutralizační protilátky.
Jak se předpokládalo, přibližně 35% normálních lidí mělo neutralizační protilátky k Ad5, což je frekvence mnohem vyšší než frekvence pozorovaná v sérech makaků rhesus a šimpanzů. Neutralizační protilátky k C68 byly pozorovány u 80% šimpanzů a pouze u 2% normálních lidí nebo makaků rhesus. Titry neutralizačních protilátek u jiných než cílových druhů byly obecně nízké.
Pro další hodnocení zkřížené reaktivity C68·s lidskými adenovirovými vektory se myši imunizovaly 2 x 107 plaky • ·
• · • · • ·« tvořících jednotek (pfu) Ad 2, 4, 5, 7 a 12, stejně jako C68. Sérum se odebralo o dva týdny později a testovalo se na protilátky, které neutralizují Ad5 nebo C68 vektory. Neutralizační protilátky k Ad5 vektoru byly detekovány pouze u zvířat imunizovaných Ad5. Důležité je to, že jedinými zvířaty s neutralizačními protilátkami k C68 vektoru byla ta zvířata, která byla imunizovaná C68 vektorem; žádné testované lidské serotypy, včetně Ad4, negenerovaly u myší protilátky, ktefé by neutralizovaly C68 in vitro.
Pro použití C68 vektoru u člověka je důležitá absence neutralizačních protilátek v lidské populaci. V naší studii vyšetření 50 normálních lidí nedetekovalo žádné významné neutralizační protilátky (>1:10) při použití stejného testu, který detekoval neutralizační protilátky u >50% šimpanzů. Dále, sérum od myší imunizovaných více serotypy lidského Ad, včetně Ad4, neneutralizovalo infekci C68.
V jiném pokusu se skupiny 10-12 ICR myší vakcinovaly různými dávkami Adhu5rab.gp něbo AdC68rab.gp vakcíny podanými podkožně (s.c.), intranasálně (i.n.) nebo orálně (per os). Myším se odebrala krev o 21 dnů později a určily se titry protilátek neutralizujících virus (VNA) v mezinárodních jednotkách. Myši se ?a 4 týdny po vakcinaci infikovaly 10 průměrnými letálními dávkami CVS-24 viru, které se aplikovaly přímo do centrálního nervového systému.
Titry VNA (% přežití po infekci)
Dávka vakcíny 5xl07 5xl0e 5xl35 5xl04
Adhu5rab.gp,s.c. 972(100) 324 (100) 108 (100) 12 (100)
AdC6Srab.gp, s.c. 240 (100) 36 (100) 12(30) 8 (80)
Adhu5rah.gp, i.n. nt 162 (100) 162 (100) 18 (50)
AdC68rab.gp, i.n. nt 54 (100) 162 (100) 18 (50)
2xl07 2xl06 2xl05 2xl04
Adhu5rab.gp, per os 108 (100) 54 (88) 18 (80) 4(30)
AdC68rab.gp, per os 108 (100) 36 (78) 12 (55) 0,2(0)
Tato data ukazují, že AdC68 konstrukt neočekávaně indukuje lepší protektivní protilátkovou odpověď při nižší intranasální dávce než lidský typ 5.
Příklad 15 - Strukturální analýza hexonových proteinů
Absence neutralizačních protilátek mezi C68 a lidskými serotypy nás donutila opatrněji hodnotit strukturální odlišnosti v regionech hexonu, o kterých se předpokládá, že nesou typově specifické epitopy. Předešlé pokusy naznačily, že tyto epitopy jsou lokalizované v 7 hypervariabilních regionech hexonu, které určily Crawford-Miksza a Schnurr (J. Virol, 70:1836-1844 (1996)). Srovnání aminokyselinových sekvencí hexonových proteinů mezi C68 a několika lidskými adenoviry je uvedeno na obr. 2. Dále, C68 je významně odlišný ve významných regionech těchto hypervariabilních sekvencí. Přesnější modelování trojrozměrné struktury hexonu C68 se provedlo pro mapování jedinečné sekvence. Modely • · ·
struktury hexonu z C68 a Ad4 se připravily na základě rentgenové krystalové struktury hexonů pro Ad2 a Ad5.
Rentgenové krystalové struktury Ad5 hexonu (Protein Data Bank identifikační označení 1RUX) (J. J, Rux a R. M.
Burnett, Mol. Ther. 1:18-30 (2000}}, a struktury Ad2 hexonu (F. K. Athappilly, et al, J. Mol. Biol., 242: 430-455 (1994)), byly dále upraveny tak, aby se získaly současné modely hexonů (Rux a Burnett, bude publikováno jinde).
Modely homologních C68 a Ad4 hexonů byly nejprve produkovány za použití Swiss-Pdb Viewer protein-modelovacího prostředí (N. Guez and M.C. Peitsch, Electrophoresis, 18:2714-2723 (1997)). Tento automatizovaný postup se použil pro seřazení aminokyselinových sekvencí C68 a Ad4 hexonů s krystalovou strukturou Ad2 a Ad5 hexonů. Seřazení sekvencí se použilo pro dosazení modelové sekvence do známých molekulárních struktur. Pozice zbytků ve vedlejších řetězcích nenalezené ve známých strukturách se vybraly z knihovny protomerů vedlejších řetězců. Tyto počáteční molekulové modely se potom manuálně upravily tak, aby se zlepšilo automatické seřazení, pomocí přesunu mezer do exponovaných variabilních regionů a optimalizací sbalení vedlejších řetězců. Pozice externích smyček nepozorovaných v Ad2 a Ad5 templátových strukturách se buď vybraly z knihovny známých smyček, nebo se upravily manuálně. Konformace každého modelu byla dále upravena minimimalizací energie za použití programu pro molekulární mechaniku CHARMM (B. R. Brooks, et al, J. Comp. Chem., 4:187-217 (1983)). Struktury těchto C68 a Ad4 hexonových modelů se potom porovnaly a vypočetlo se nové seřazení sekvence. Odlišnosti mezř dvěma strukturálně seřazenými sekvencemi se použily pro barevné zobrazení modelů homologie. Grafické znázornění připravené v Swiss-PdbViewer programu se exportovalo a převedlo se do
Persistence of Vision Ray Tracer programu (POV-Ray 2000,
Version 3,lg).
Ačkoliv je celková C68 sekvence velmi podobná sekvenci Ad4 hexonu, jsou odlišnosti mezi těmito dvěma sekvencemi primárně přítomné v DE1 a FG1 smyčkách a tyto smyčky obsahují všech sedm hypervariabilních regionů. DE1, FG1 a FG2 smyčky, každá z jiné podjednotky, intimně asociují a tvoří věžovitou doménu na vrcholu trimerické molekuly. Hexonová věž tvoří značnou část zevního povrchu virionu a vytváří místa pro navázání protilátek. Strany a baze hexonů jsou v kontaktu s kapsidou a tak jsou tyto regiony chráněny před vazbou protilátky a jejich sekvence jsou konzervované. Naopak, sekvence C68 a Ad4 jsou dosti odlišné od v různých hexonových věžích. Toto vysvětluje, proč nejsou protilátky proti těmto virům zkříženě reaktivní.
Všechny publikace citované v této přihlášce a seznam sekvencí jsou zde uvedeny jako odkazy. Ačkoliv byl vynález popsán na konkrétních provedeních, je jasné, že existují modifikace uvedených provedení, které spadají do rozsahu předkládaného vynálezu, jak je definován v připojených patentových nárocích.
Seznam sekvencí <110> The Wistar Institute of Anatomy and Biology
The Trustees of The University of Pennsylvanxa ' Ertl, Hildegund. C.ď.
Wilson; James M.
. Způsoby pro indukování cytotoxické knunibú reakce a přípravky rekombinantního i opičího adenoviru použitelné v těchto způsobech <130> WST104A/UPNN2628A <150> US 60/300,131 <151> 2001-06-22 <150> US 60/304,843 <151> 2001-07-12 <160> 13 <17 0> Patentln version 3.1 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> ,Artificiální sekvence» <223> Syntetický peptid nesoucí imunodominantni CD8+ T-lymfocytárm epitop pro H 2d haplotyp <400> 1*
Ala Met Gin Met Leu Lys Glu Thr Ile 1 5 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> i Artificiální sekvence s <223> 5' primer pro glykoprotein viru vztekliny <400> Z 19 aagcatttcc gcccaacac ' .
<210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificiální sekvence e <223? 3' Primer Pro glykoprotein viru vztekliny <400> 3 ggttagtgga gcagtaggta ga 22 <2l0> 4 .
<211>. 25 <212> DNA. ' <213 > ; Artificiální sekvence <220>
<223> 5' primer pro glutaraldehyd-3-fosfát-dehydrogenasu (GAPDH) < >
<400> 4 ggtgaaggtc ggtgtgaacg gattt 25 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <2i3> Artificiální sekvence <220>
<223> 3'primer pro GAPDH <400> 5 aatgccaaag ttgtcatgga tgacc 25 <210> 6 <211> 7228 <212> DNA <213 > Artificiální sekvence <
<220>
<223> Modifikovaná HIV-1 gag sekvence <22 0>
<221> CDS <222> (729)..(1820) <223>
<400> 6 tggaagggct aatttggtcc caaaaaagac aagagatcct cacáaggcta cttccctgat tggcagaact acacaccagg tgaccťttgg atggtgcttc aagttagtac cagttgaacc aataaggaga gaagaacagc ttgttacacc ctatgagcca agggagaagt attagtgtgg aagtttgaca gcctcctagc agctgcat.cc ggagtactac aaagactgct gacatcgagc ctggggactt tccagggagg tgtggcctgg gcgggactgg
tgatctgtgg atctaccaca 60
gccagggatc agatatcóac 120
agagcaagta gaagaggcca 180
gcatgggatg gaggacccgg 240
atttcgtcac atggcccgag 300
tttctacaag ggactttccg 360
ggagtggcga gccctcagat 420
• *··· gctacatata agcagctgct ttttgcctgt gcctgggagc tctctggcta actagggaac tgágtgctca aagtagtgtg tgcccgtctg.
agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct cgaaagtaaa gccagaggag atctcfccgac acagagag atg ggt gcg aga gcg tea Met Gly Ala Arg Ala Ser ί 5
tctggttaga ccagatctga 480
agcctcaata aagcttgcct 540
ctggtaacta gagatčcctc ' 600
cccgaacagg gacttgaaag 660
gcfctgetgaa gcgcgcgtcg 720
: ggg gga gaa tta gat 770
Val Leu Ser Gly Gly Glu Leu Asp 10
ega Arg 15 tgg gaa aaa att cgg tta agg Arg cca ggg gga aag aag aag tac aag 818
Trp Glu Lys lle Arg Leu 20 Pro Gly Gly 25 Lys Lys Lys Tyr Lys 30
cta aag cac atc gta tgg gca age agg gag cta gaa ega ttc gca gtt 866
Leu Lys His lle Val 35 Trp Ala Ser Arg Glu Leu 40. Glu Arg Phe Ala 45 Val
aat cct ggc ctg tta gaa aca tea gaa ggc tgt aga caa ata ctg gga 914
Asn Pro Gly Leu Leu 50 Glu Thr Ser Glu Gly Cys 55 Arg Gin lle Leu 60 Gly
cag cta caa. cca. tcc ctt cag aca gga tea gag gag ctt ega tea cta 952
Gin Leu Gin 65 Pro Ser Leu Gin Thr 70 Gly Ser Glu Glu Leu Arg Ser 75 Leu
tac aac aca gta gca acc ctc tat tgt gtg cac cag cgg atc gag atc 1010
Tyr Asn 80 Thr Val Ala Thr Leu 85 Tyr Cys Val His Gin 90 Arg lle Glu lle
aag gac acc aag gaa get tta gac aag ata gag gaa gag caa aac aag 1058
Lys 95 Asp Thr Lys Glu Ala Leu 100 Asp Lys lle Glu 105 Glu Glu Gin Asn Lys 110
tec aag aag aag gcc cag cag gca gca get gac aca gga cac age aat 1106
Ser Lys Lys Lys Ala 115 Gin Gin Ala Ala Ala Asp 120 Thr Gly His Ser 125 Asn
cag gtc age caa aat tac cct ata gtg cag aac atc cag ggg caa atg 1154
Gin Val Ser Gin Asn Tyr Pro lle Val Gin Asn lle Gin Gly Gin Met
130 135 . Λ40 ...
gtá cat cag gcc ata tea cct aga act'tta aat gca· tgg gta .aaa gta . . 1202
Val His Gin 145 Ala lle Ser Pro Arg 150 Thr Leu Asn Ala Trp 155 Val Lys Val ‘
gta gaa gag aag get ttc age cca gaa gtg ata ccc atg ttt tea gca 1250
Val Glu 160 Glu Lys Ala Phe Ser 165 Pro Glu Val lle Pro 170 Met Phe Ser Ala
tta tea gaa gga gcc acc cca cag gac ctg aac acg atg ttg aac acc 1298
Leu Ser Glu Gly Ala Thr Pro Gin Asp Leu Asn Thr Met LeU Asn Thr
* • · · • · · · ♦ · · ··· • · · ·· *
175 180 185 190
gtg ggg gga cat caa gca gcc atg caa atg tta aaa gag Glu acc atc Thr Ile .205 aat Asn 1346
Val Gly Gly His Gin Ala 195 Ala Met Gin Met 200 Leu Lys
gág gaá gct gca gaa tgg gat aga gtg cat· cca gtg cat gca ggg cct · 1394
Glu Glu Ala Ala Glu Trp Asp Arg Val His Ero Val His Ala Gly Pro
210 -215 220
att gca cca ggc cag atg aga gaa cca agg gga agt gac ata gca gga 1442
Ile Ala Pro Gly Gin Met Arg Glu Pro Arg Gly Ser Asp Ile Ala Gly
225 230 235
act act agt acc ctt cag gaa caa ata gga tgg atg aca aat aat cca 1490
Thr Thr Ser Thr Leu Gin Glu Gin Ile Gly Trp Met Thr Asn Asn Pro
240 245 250
cct atc cca gta gga gag atc tac aag agg tgg ata atc ctg gga ttg 1538
Pro Ile Pro Val Gly Glu Ile Tyr Lys Arg Trp Ile Ile Leu Gly Leu
255 260 265 270
aac aag atc gtg agg atg tat agc cct acc agc att ctg gac ata aga 1586
Asn Lys Ile Val Arg Met Tyr Ser Pro Thr Ser Ile Leu Asp Ile Arg
275 280 285
caa gga cca aag gaa ccc ttt aga gac tat gta gac cgg ttc tat aaa 1634
Gin Gly Pro Lys Glu Pro Phe Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe Tyr Lys
290 295 300
act cta aga gčt gag caa gct tca cag gag gtá aáa aat tgg atg aca 1682
Thr Leu Arg Ala Glu Gin Ala Ser Gin Glu val Lys Asn Trp Met Thr
305Γ 310 315
gaa acc ttg ttg gtc caa aat gcg aac cca gat tgt aag acc atc ctg 1730
Glu Thr Leu Leu Val Gin Asn Ala Asn Pro Asp Cys Lys Thr Ile Leu
320 325 330
aag gct ctc ggc cca gcg gct aca cta gaa gaa atg atg aca gca tgt 1778
Lys Ala Leu Gly Pro Ala Ala Thr Leu Glu Glu Met Met Thr Ala Cys
335 340 345 350
cag gga gfca gga gga ccc gg= cat aag gca aga gtt ttg tag 1820
Gin Gly Val Gly Gly Pro Gly His Lys Ala Arg Val Leu
355 360 ggatccacta .gttctágacit cgaggggggg cccggtaccfc ttáagaccaa tgacttacaa.. 1880 .
ggcagctgta gatcttagcc actttttaaa agaaaagggg ggactggaag ggctaattca 1940 ctcccaaaga agacaagata tccttgatct gtggatctac cacacacaag gctacttccc 2000 tgattggcag aactacacac cagggccagg ggtcagatat ccactgacct ttggatggtg 2060 ctacaagcta gtaccagttg agccagataa ggtagaagag gccaataaag gagagaacac 2120 cagcttgtta cáccctgtga gcctgcatgg aatggatgac cctgagagag aagtgttaga 2180 \
gtggaggttt gacagccgcc tagcatttca tcacgtggcc cgagagctgc cttčaagasc tgctgacatc gagcttgcta cáagggactť tccgctgggg gaggcgtggc ctgggcggga ctggggagtg gcgagccctc agatgctgca tgctttttgc ctgtactggg tctctctggt tagaccaaat qtgagcctgg gctaactagg gaacccactg cttaagcctc aataaagctt gccttgagtg tgtgtgcccg tctgttgtgt gactctggta actagagatc cctcagaccc atccggagta 2240 actttccagg 2300. tataagcagc 2360 gagctctctg 2420 cttcaagtag 2480 ttttagtcag 2540
tgtggaaaat ctctagcacc ccccaggagg tagaggttgc agtgagccaa gatcgcgcca 2600
ctgcattcca gcctgggcaa gaaaacaaga ctgtctaaaa taataataat aagttaaggg 2660
tattaaatat atttatacat ggaggtcata aaaatatata tatttgggct gggcgcagtg 2720
gotcacacct gcgcccggcc ctttgggagg ccgaggcagg tggatcacct gagtttggga 2780
gttccagacc agcctgacca acatggagaa accccttctc tgtgtatttt tagtagattt 2840
tattttatgt gtattttatt cacaggtatt tctggaaaac tgaaactgtt tttcctctac 2900
tctgatacca caagaatcat cagcacagag gaagacttcfc gtgatcaaat gtggtgggag 2960
agggaggttt; tcaccagcac 'atgagcagtc agttctgccg cagactcggc gggtgtcctt 3020
cggttcagtt ccaacaccgc ctgcctggag agaggtcaga ccacagggtg agggctcagfc 3080
ccccaagaca taaacaccca agacataaac acccaacagg tccaccccgc ctgctgccca 3140
ggcagagccg attcaccaag acgggaatta ggatagagaa agagtaagtc acacagagcc 3200
ggctgtgcgg gagaacggag ttctattatg actcaaafcca gtctccccaa gcattcgggg 3260
atcagagttt ttaaggataa cttagtgtgt agggggccag tgagttggag atgaaagcgt 3320
agggagtcga aggtgtcctt ttgcgccgag tcagttcctg ggtgggggcc acaagatcgg ' 3380
atgagccagt ttatcaatcc gggggtgcca gctgatccat ggagtgcagg gtctgcaaaa 3440
ťatctcaagc actgattgat cttaggtttt acaatagtga tgttacccca ggaacaattt 3500
gggga&ggtc agaatcttgt agcctgtágc- tgcatgactc ctaaaccata atttcttttt 3560
tgtttttttt tttttatttt tgagacaggg tctcactctg tcacctaggc tggagtgcag 3620
tggtgcaatc acagctcact gcagccccta gagcggccgc caccgcggtg gagctccaat 3680
tcgcccťata gtgagtcgta ttacaattca ctggccgtcg ttttacaacg tcgtgactgg 3740
gaaaaccctg gcgtfcaccca acttaatcgc cttgcagcac atcccccttt cgccagctgg 3800
cgtaatagcg aagaggcccg caccgatcgc ccttcccaac agttgcgcag cctgaatggc 3860
• <
· gaatggcgcg atcagctcat tagaccgaga gtggactccá ccatcacccfc aaagggagcc gggaagaaag gtaaccacca ttcggggaaa atccgctcat tgagtattca tttttgctca gagtgggtta aagaacgttt gtattgacgc ttgagtaetc gcagtgctgc gaggaccgaa atcgttggga ctgtagcaat cccggcaaca cggcccttcc gcggtatcat čgacggggag cactgatfcaa taaaacttca ocaaaatccc aaggatcttc cacegctacc aaattgtaaa tttttaacca tagggttgag acgtcaaagg aafccaagttt cccgafcttag cgaaaggagc cacccgccgc tgfcgcgcgga gagacaataa acatttccgt cccagaaacg catcgaactg tccaatgatg cgggcaagag accagtcaca cataaccatg ggagctaacc accggagctg ggcaacaacg attaatagac ggctggctgg tgcagcactg tčaggcaact gcattggfcaa tttttaattt ttaacgtgag ttgagatcct agcggtggtt cgttaatatt ataggccgaa tgttgttcca •gcgaaaaácc fcttggggtcg agcttgacgg gggcgctagg gcttaatgcg acccctattt ccctgataaa gtcgccctta ctggtgaaag gatctcaaca agcactttta caactcggtc gáaaagcatc agtgataaca gcfctttttgc aatgaagcca ttgcgcaaac tggatggagg tttattgctg gggccagatg atggatgaac ctgtcagacc aaaaggatct ttttcgttcc ttttttctgc tgtttgccgg ttgttaaaat atcggcaaaa gtttggaaca gtctatcagg aggfcgccgta ggaaagccgg gcgctggcaa ccgctacagg gtttattttt tgcttcaata ttcccttttt taaaagatgc gcggtaagat aagttctgct gccgcatacá ttacggatgg ctgcggccaa acaacatggg taccaaacga tattaactgg cggataaagfc ataaatctgg gtaagccctc gaaatagaca aagtfctactc aggtgaagat actgagcgtc gcgtaatctg atcaagagct tcgcgttaaa tcccttataa agagtccact gcgátggccc aagcactaaa cgaacgfcggc gfcgtagcggt gcgcgtccca ctaaatacafc atattgaaaa tgcggcattt tgaagatcag ccttgagagt atgtggcgcg ctatfcctcag catgácagta cttacttctg ggatcatgta cgagcgtgac cgaactactt tgcaggacca agccggtgag ccgtatcgta gatcgctgag atatatactt cctfctttgafc agaccccgta ctgcttgcaa accaactctt tttfctgttaa atcaaaagaa attaaagaac actacgtgaa tcggaaccct gagaaaggaa cacgctgcgc ggtggcactt fccaaatatgt aggaagagta fcgccttcctg
-ttgggtgcac tttcgccccg gfcattatccc aatgacttgg agagaattat acaacgatcg actcgccttg accacgatgc actctagctt cttcfcgcgct cgtgggtctc gttatctaca ataggfcgcčt tagattgatt aatcfccafcga gaaaagatca acaaaaaaac tttccgaagg
3920
3980
4040.
4100
4160
4220 .4280
4340
4400
4460
4520
4580
4640
4700
47.60
4820
4880
4940
5000
5060
5120
5180
5240
5300
5360
5420
5480
5540
5600
taactggctt cagcagagcg cagataccaa atactgtcct tctagtgtag ccgtagttag 5660
gccaccactt caagaactct gtagcaccgc ctacafcacct cgctctgcta atcctgttac 5720
cagtggctgc tgccagtggc gataagfccgt gtcttaccgg gttggactca agacgatagť 5780
taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg 5840
agcgaacgac ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa agcgccacgc 5900
ttcccgaagg gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg cagggfccgga acaggagagc 5960
gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc 6020
acctctgact tgagcgtcga tttttgfcgat gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaaa 6080
acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc tggcctttfcg ctggcctttt gctcacatgt 6140
tctttcctgc gttatcccct gattctgtgg ataaccgtat taccgcctfct gagtgagctg 6200
ataccgctcg ccgcagccga acgaccgagc gcagcgagtc agtgagcgag gaagcggaag 6260
agcgcccaat acgcaaaccg cctctccccg cgcgttggcc gattcattaa tgcagctggc 6320
acgacaggtt tcccgactgg aaagcgggca gtgagcgcaa cgcaattaat gtgagttagc 6380
tcactcatta ggcaccccag- gctttacact ttatgcttcc ggctcgfcatg ttgtgtggaa 6440
ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa acagctatga čcatgattac gccaagctcg 6500
gaattaaccc-tcactaaagg gaacaaaagc tgctgcaggg tccctaactg ccaagcccca 6560
cagtgtgccc tgaggctgcc ccttccfctct agcggctgcc cccactcggc tttgctttcc 6620
ctagtttcag ttacttgcgt tcagccaagg fcctgaaacta ggtgcgcaca gagcggtaag 6680
actgcgagag aaagagacca gctttacagg gggtttatca cagtgcaccc tgacagtcgt 6740
cagcctcaca gggggtttat cacattgcac cctgacagtc gtcagcctca cagggggttt 6800
atcacagbgc acccttacaa tcattccatt tgattcacaa tttttttagt ctctactgtg 6860
cctaacttgt aagttaaatt tgatcagagg tgtgttccca gaggggaaaa cagtatatac · 6920
agggttcágt actatcgčát ttcaggcctč cacctgggto ttggaatgtg tcccccgagg 6980
ggtgatgact acctcagttg gátctccaca ggtfcacagtg acacaagata accaagacac 7040
ctcccaaggc taccacaatg ggccgcccfcc cacgtggaca tggccggagg aactgccatg 7100
tcggaggtgc aagcacacct gcgcatcaga gtccttggtg tggagggagg gaccagcgca 7160
gcttccagcc atccaccfcga tgaacagaac ctagggaaag ccccagtfcct acttacacca 7220
ggaaaggc
7228 • fa • fa ·· <210> Ί <211> 363 <212> PRT <213> Artificiální sekvence <220> . · ' ' <223> Modifikovaná HIV-1 gag sekvence <400> 7
Met 1 Gly Ala Arg Ala 5 Ser Val Leu Ser Gly 10 Gly Glu Leu Asp Arg 15 Trp
Glu Lys Ile Arg 20 Leu Arg Pro Gly Gly 25 Lys Lys Lys Tyr Lys 30 Leu Lys
His Xle Val 35 Trp Ala Ser Arg Glu 40 Leu Glu Arg Phe Ala 45 Val Asn Pro
Gly Leu 50 Leu Glu Thr Ser Glu 55 Gly Cys Arg Gin Ile 60 Leu Gly Gin Leu
Gin 65 Pro Ser Leu Gin Thr 70 Gly Ser Glu Glu Leu 75 Arg Ser Leu Tyr Asn 80
Thr Val Ala Thr Leu 85 Tyr Cys Val His Gin 90 Arg Ile Glu Ile Lys 95 Asp
Thr Lys Glu Ala 100 Leu Asp Lys Ile Glu 105 Glu Glu Gin Asn Lys 110 Ser Lys
Lys Lys Ala 115 Gin Gin Ala Ala Ala 120 Asp Thr Gly His Ser 125 Asn Gin Val
Ser Gin 130 Asn Tyr Pro Ile Val 135 Gin Asn Ile Gin Gly 140 Gin Met Val His
Glň 145 Ala íie . Sěř. Pro Arg 150 Thr Leu Asn. Ala Trp 155 Val'· Lys Val Vál Glu 160
Glu Lys Ala Phe Ser 165 Pro Glu Val Ile Pro 170 Met Phe Ser Ala Leu 175 Ser
Glu Giy Ala Thr 180 Pro Gin Asp Leu Asn 185 Thr Met Leu Asn Thr 190 Val Gly
fc • fc !*· · • · · · · 1 • · · · <
··· fcfc e· • fc • · • · · • ····
Gly His Gin Ala Ala Met Gin Met Leu Lys Glu Thr Ile Asn Glu Glu 205
195 200
Ala Ala Glu Trp Ásp Arg Val His Pro •Val His Ala Gly Pro Ile Ala
210 215 220
Pro Gly Gin Met Arg Glu Pro Arg Gly Ser Asp Ile Ala Gly Thr Thr
225 230 235 240
Ser Thr Leu Gin Glu Gin Xle Gly Trp Met Thr Asn Asn Pro Pro Ile
245 250 255
Pro Val Gly Glu Ile Tyr Lys Arg Trp Ile Ile Leu Gly Leu Asn Lys
260 265 270
Xle Val Arg Met Tyr Ser Pro Thr Ser Ile Leu Asp Ile Arg Gin Gly
275 280 285
Pro Lys Glu Pro Phe Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe Tyr Lys Thr Leu
290 295 300
Arg Ala Glu Gin Ála Ser Gin Glu Val Lys Asn Trp Met Thr Glu Thr
305 310 315 320
Leu Leu Val Gin Asn Ala Asn Pro Asp Cys Lys Thr Ile Leu Lys Ala
325 330 335
Leu Gly Pro Ala Ala Thr Leu Glu Glu Met Met Thr Ala Cys Gin Gly
340 345 350
Val Gly Gly Pro Gly His Lys Ala Arg Val Leu
355 350
<210> i & · ...
<2li> : 31Í
<212> PRT
<213> Šimpanzí typ adenoviru
<400> i s
Asn Thr Cys Gin Trp Thr Tyr Lys Ala Asp Gly Glu Thr Ala Thr Glu
1 5 10 15
Lys Thr Tyr Thr 20 Tyr Gly Asn Ala Pro 25 Val Gin Gly Ile Asn 30 Ile Thr
Lys Asp .Gly Ile Gin Leu Gly Thr Asp. Thr Asp Asp Gin Pro Ile Tyr
35 . 40 45’
Ala Asp 50 Lys Thr Tyr Gin Pro 55 Glu Pro Gin Val Gly Asp 60 Ala Glu Trp
His 65 Asp Ile Thr Gly Thr 70 Asp Glu Lys Tyr Gly 75 Gly Arg Ala Leu Lys 80
Pro Asp Thr Lys Met 85 Lys Pro Cys Tyr Gly 90 Ser Phe Ala Lys Pro 95 Thr
Asn Lys Glu Gly 100 Gly Gin Ala Asn Val 105 Lys Thr Gly Thr Gly 110 Thr Thr
Lys Glu Tyr 115 Asp Ile Asp Met Ala 120 Phe Phe Asp Asn Arg 125 Ser Ala Ala
Ala Ala Gly Leu Ala Přo Glu Ile Val Leu Tyr Thr Glu Asn Val Asp
130 135 140
Leu 145 Glu Thr Pro Asp Thr His Ile 150 Val Tyr Lys 155 Ala Gly Thr Asp Asp 160
Ser Ser Ser Ser Ile 165 Asn Leu Gly Gin Gin Ala 170 Met Pro Asn Arg 175 Pro
Val Tyr Ile Gly 180 Phe Arg Asp Asn Phe 185 Ile Gly Leu Met Tyr 190 Tyr Asn
Ser Thr Gly Asn Met Gly Val Leu Ala Gly Gin Ala Ser Gin Leu Asn
195 200 205
Ala Val 210 Val Asp Leu Gin Asp Arg 215 Asn Thr Glu Leu 220 Ser Tyr Gin Leu
Leu 225 Leu Asp Ser Leu Gly Asp Arg 230 Thr Arg Tyr 235 Phe Ser Met Trp Asn 240
Gin Ala Val Asp Ser Tyr Asp Pro Asp Val Arg Ile Ile Glu As» His * ·« ♦ · · ··· · · fc • · · · · fc • · fcfcfc • ·· ·· ··· • · · · « • · « • fc «
245 250 255
Gly. Val Glu Asp Glu Leu Pro Asn Tyr Cys Phe Pro Leu Asp Ala Val
260 265 27.0
Gly Arg Thr Asp Thr Tyr Gin Gly Ile Lys Ala Asn Gly Thr Asp Gin
275 280 285
Thr Thr Trp Thr Lys Asp Asp Ser Val Asn Asp Ala Asn Glu Ile Gly
290 295 300
Lys Gly Asn Pro Phe Ala Met
305
310 <210> 9 <211> 314 <212> PRT <213> Lidský adenovirus typu 4 <400> 9
Asn Thr Cys Gin Trp Lys Asp Ser Asp Ser Lys Met His Thr Phe Gly
1 5 10 15
Ala Ala Ala Met Pro Gly Val Thr Gly Lys Lys Ile Glu Ala Asp Gly
• 20 25 30
Leu Pro Ile Arg Ile Asp Ser Thr Ser Gly Thr Asp Thr Val Ile Tyr
35 40 45
Ala Asp Lys Thr Phe Gin Pro Glu Pro Gin Val Gly Asn Asp Ser Trp
50 55 60
Val Asp Thr Asn Gly Ala Glu Glu Lys Tyr Gly Gly Arg Ala Leu Lys
65 70 75 80
Asp Thr Thifc .Lys' Met Asn .Pro Cys Týr Gly Ser. Phe Ala Lys Pro -Thr
85 90 95
Asn Lys Glu Gly Gly Gin Ala Asn Leu Lys Asp Ser Glu Pro Ala Ala
100 105 110
Thr Thr Pro Asn Tyr Asp Ile Asp Leu Ala Phe Phe Asp Ser Lys Thr
115
120
125 • · · · · · · · ····· ·«··
70 • · · · · • ·
Ile Val Ala Asn Tyr Asp Pro Asp Ile Val Met Tyr Thr Glu Asn Val
130 135 140
Asp Leu Gin Thr Přo Asp Thr His Ile Val Tyr Lys Pro Gly-Thr Glu
145· · 150 155 ' ' 160
Asp Thr Ser Ser Glu Ser Asn Leu Gly Gin Gin Ala Met Pro Asp Arg
165 170 175
Pro Asn Tyr Ile Gly Phe Arg Asp Asn Phe Ile Gly Leu Met Tyr Tyr
180 185 190
Asn Ser Thr Gly Asn Met Gly Val Leu Ala Gly Glh Ala Ser Gin Leu
195 200 205
Asn Ala Val Val Asp Leu Gin Asp Arg Asn Ťhr Glu Leu Ser Tyr Gin
210 215 220
Leu Leu Leu Asp Ser Leu Gly Asp Arg Thr Arg Tyr Phe Ser Met Trp
225 230 235 240
Asn Gin Ala Val Asp.Ser Tyr Asp Pro Asp. Vál Arg Ile Ile Glu Asn
245 250 255
His Gly Val Glu Asp Glu Leu Pro Asn Tyr Cys Phe Pro Leu Asn Gly
260 265 270
Val Gly Leu Thr Asp Thr Tyr Gin Gly.Val Lys Val Lys Thr Asp Ala
275 280 285
Gly Ser Glu Lys Trp Asp Lys Asp Asp Thr Thr Val Ser Asn Ala Asn
290 . 295 300
Glu Ile His Val Gly Asn Pro Phe Ala Met'
305 310
<210> 10
<211> 318
<212> PRT
<213> Lidský adeno virus typu 16
<400> 10
Asn Thr Cys Gin Trp Lys Asp Ser Asp Ser Lys Met His Thr Phe Gly
210
100
115
130 •25
105
120
135
150
165 • 180
195 » · · • ·
110
125'
140
155
170
200
215
230
160
175
190
205
220
235
240 • · · · · · • · · ·· ·
Asn Gin Ala Val Asp 245 Ser Tyr Asp Pro Asp 250 Val Arg Ile Ile Glu 255 Asn
His Gly Val Glu 260 Asp Glu Leu Pro Asn 265 Tyr Cys Phe Pro Leu 270 Asn Gly
Val Gly Phe 275 Thr Asp Thr Tyr Gin 280 Gly Val Lys Val Lys 285 Thr Asp Ala
Val Ala 290 Gly Thr Ser Gly Thr 295 Gin Trp Asp Lys Asp Asp 300 Thr Thr Val
Ser Thr Ala Asn Glu Ile His Gly Gly Asn Pro Phe Ala Met
305 310
<210> 11
<211> 323
<212> PRT
<213> Lidský adenovirus typu 3
<400> 11 .
Ašn 1 Thr Ser Gin Trp 5 Ile Val Thr Thr Asn 10 Gly Asp Asn Ala Val 15 Thr
Thr Thr Thr Asn 20 Thr Phe Gly Ile Ala 25 Ser Met Lys Gly Gly 30 Asn Ile
Thr Lys Glu 35 Gly Leu Gin Ile Gly 40 Lys Asp Ile Thr Thr 45 Thr Glu Gly
Glu Glu 50 Lys Pro Xle Tyr Ala 55 Asp Lys Thr Tyr Gin 60 Pro Glu Pro Gin
Val 65 Gly Glu Glu Ser Trp 70 Thr Asp Thr Asp Gly 75 · Thr Asn Glu Lys Phe 80
cly Gly Arg Ala Leu 85 Lys Pro Ala Thr Asn 90 Met Lys Pro Cys Tyr 95 Gly
Ser Phe Ala Arg Pro Thr Asn Ile Lys Gly Gly Gin Ala Lys Asn Arg 100 105 110
Lys Val Lys 115 Pro Thr Thr Glu Gly Gly Val Glu Thr Glu Glu Pro Asp
120 125
Ile Asp Meť Glu Phě Phe Asp Gly Arg Asp Ala. Val Ala.Gly Ala Leu
130 135 140
Ala Pro Glu 145 Ile Val Leu 150 Tyr Thr Glu Asn Val Asn Leu Glu Thr Pro 155 160
Asp Ser His Val Val Tyr 165 Lys Pro Glu Thr Ser Asn Asn Ser His Ala 170 175
Asn Leu Gly Gin 180 Gin Ala Met Pro Asn Arg Pro Asn Tyr Ile Gly Phe 185 190
Arg Asp Asn 195 Phe Val Gly Leu Met 200 Tyr Tyr Asn Ser Thr Gly Asn Met 205
Gly Val Leu 210 Ala Gly Gin Ala 215 Ser Gin Leu Asn Ala Val Val Asp Leu 220
Gin Asp Arg 225 Asn Thr Glu 230 Leu Ser Tyr Gin Leu Leu Leu Asp Ser Leu 235 240
Gly Asp Arg Thr Arg Tyr 245 Phe Ser Met Trp Asn Gin Ala Val Asp Ser 250 255
Tyr Asp Pro Asp 260 Val Arg Ile Ile Glu Asn His Gly Ile Glu Asp Glu 265 270
Leu Pro Asn 275 Tyr Cys Phe Pro Leu 280 Asn Gly Ile Gly Pro Gly His Thr 285
Tyr Gin Gly Ile Lys Lys Val Lys Thr Asp Asp Thr Asn Gly Trp Glu
290 295 300.
Lys Asp Ala 305 Leu Ala Met Asn Val Ala 310 Pro Ala Asn Glu Ile Thr Ile Gly Asn Asn 315 320
<210> 12 *99 <211> 315 <212> PRT <213> Lidský adenovirus typu 7 <400> 12
Asn Thr Ser Gin Trp lle Val Thr Ala Gly Glu Glu Arg Ala Val Thr
1 5 10 15
Thr Thr Thr Asn Thr 20 Phe Gly lle Ala Ser Met Lys Gly Asp Asn lle 25 30
Thr Lys Glu Gly Leu 35 GlU lle Gly Lys Asp lle Thr Ala 40 45 Asp Asn Lys
Pro Xle Tyr Ala Asp 50 Lys Thr 55 Tyr Gin Pro Glu Pro Gin 60 Val Gly Glu
Glu 65 Ser Trp Thr Asp Thr 70 Asp Gly Thr Asn Glu Lys Phe 75 Gly Gly Arg 80
Ala' Leu Lys Pro Ala 85 · Thr Lys Met Lys Pro Cys Tyr Gly 90 Ser Phe Ala 95
Arg Pro Thr Asn lle 100 Lys Gly Gly Gin Ala Lys Asn Arg 105 Lýs Val Lys 110
Pro Thr Glu Gly Asp 115 Val Glu Thr Glu Glu Pro Asp lle 120 125 Asp Met Glu
Phe Phe Asp Gly Arg 130 Glu Ala 135 Ala Asp Ala Phe Ser Pro 140 Glu lle Val
Leu Tyr Thr Glu Asn Val Asn Leu Glu Thr Pro Asp Ser His Val Val
145 150 .155 160
Tyr Lys Pro Gly Thr * 165 Ser Ásp Asp Asn Ser His Ala Asn 170 Leu Gly Gin 175
Gin Ala Met Pro Asn 180 Arg Pro Asn Tyr lle Gly Phe Arg Asp Asn Phe 185 190
Val Gly Leu Met Tyr Týt Asn Set Thr Gly Asn Met Gly Val Leu Ala 195 200 205
75'
Gly Gin Ala Ser Gin Leu Asn Ala Val Val 215 Asp Leu Gin Asp Arg 220 Asn
210
Thr Glu Leu Ser Tyr Gin Leu Leu Leu Asp Ser' Leu Gly Asp Arg Thr
225 230 235 240
Arg Tyr Phe Ser Met Trp Asn Gin Ala Val Asp Ser Tyr Asp Pro Asp
245 250 255
Val Arg lle lle Glu Asn His Gly lle Glu Asp Glu Leu Pro Asn Tyr
260 265 270
Cys Phe Pro Leu Asp Gly lle Gly Pro Ala Lys Thr Tyr Gin Gly lle
275 280 285
Lys Ser Lys Asp Asn Gly Trp Glu Lys Asp Asp Asn Val Ser Lys Ser
290 295 300
Asn Glu lle Ala lle Gly Asn Asn Gin Ala Met
305 310 315
<210>· 13 <213> 345 <212> PRT <213> Lidský adenovirus typu 2 <400> 13
Asn 1 Ser Cys Glu Trp 5 Glu Gin Thr Glu Asp 10 Ser Gly Arg Ala Val Ala 15
Glu Asp Glu Glu 20 Glu Glu Asp Glu Asp 25 Glu Glu Glu GlU Glu 30 Glu Glu
Gin Asn Ala 35 Arg Asp Gin Ala Thr 40 Lys Lys Thr His Val 45... Tyr Ala Gin
Ala Pro 50 Leu Ser Gly Glu Thr 55 Leu Thr Lys Ser Gly 60 Leu Gin lle Gly
Ser 65 Lys Asn Ala Glu Thr 70 Gin Ala Lys Pro Val 75 Tyr Ala Asp Pro Ser 80
Tyr Gin Pro Glu Pro Gin lle Gly Glu Ser Gin Txp Asn Glu Ala Asp
85 90 95
Ala Asn Ala Ala Gly Gly Arg Val Leu Lys 100 · 105 Lys Thr Thr Pro Met Lys 110
Pro Tyr Gly Ser Tyr 115 Ala Arg Pro Thr Asn 120 Pro Phe Gly Gly Gin Ser 125
Val Leu Val Pro Asp 130 Glu Lys Gly Val Pro 135 Leu Pro Lys Val Asp Leu 140
Gin Phe Phe Ser Asn 145 Thr Thr Ser Leu Asn 150 Asp Arg Gin Gly Asn Ala 155 160
Thr Lys Pro Lys Val 165 Val LeU Tyr Ser Glu 170 Asp Val Asn Met Glu Thr 175
Pro Asp Thr His Leu 180 Ser Tyr Lys Pro Gly 185 Lys Gly Asp Glu Asn Ser 190
Lys Ala Met Leu Gly 195 Gin Gin Ser Met Pro ,200 Asn Arg Pro Asn Tyr lle 205
Ala Phe Arg Asp Asn 210 Phe lle Gly Leu Met 215 Tyr Tyr Asn Ser Thr Gly 220
Asn Met Gly Val Leu 225 Ala Gly Gin Ala Ser 230 Gin Leu Asn Ala Val Val 235 240
Asp Leu Gin Asp Arg 245 Asn Thr Glu Leu Ser 250 Tyr Gin Leu Leu Leu Asp 255
Šer lle Gly Asp Arg 260 Thr Arg Tyr Phe Ser 265 Met Trp Asn Gin Ala Val 270
Asp Set Tyr Asp Pro 275 Asp Val Arg lle lle 280 Glu Asn His Gly Thr Glu 285
Asp Glu Leu Pro Asn 290 Tyr Cys Phe Pro Leu 295 Gly Gly lle Gly Val Thr 300
Asp Thr Tyr Gin Ala 305 lle Lys Ala Asn Gly 310 Asn Gly Ser Gly Asp Asn 315 320
WO 03/000283
# · ♦ · φ • φφφ»
PCT/US02/1523Í)
Gly Asp Thr Thr Trp Thr Lys Asp Glu Thr Phe Ala Thr Arg Asn Glu 325 330 335
Xle Gly Val Gly Asn Asn Phe Ala Met

Claims (34)

  1. Patentové
    1. Použití rekombinantního adenoviru v přípravě léčiva pro indukování T-lymfocytární reakce na imunogen u jedince, kde uvedený rekombinantní opičí adenovirus přednostně indukuje CD8+ T-lymfocytární reakci na imunogen, když je podán podkožně, a dále kde uvedený rekombinantní adenovirus obsahuje molekulu nukleové kyseliny kódující imunogen pod kontrolou regulační sekvence, která řídí expresi imunogenu u j edince.
  2. 2. Použití rekombinantního adenoviru v přípravě léčiva pro indukování protilátkově odpovědi na imunogen u jedince, kde uvedený rekombinantní opičí adenovirus přednostně indukuje protilátkovou odpověď na antigen, když je v nízkých dávkách aplikován na sliznici, a kde uvedený rekombinantní adenovirus obsahuje molekulu nukleové kyseliny kódující imunogen pod kdntrolou regulační sekvence, která řídí expresi imunogenu u jedince.
  3. 3. Způsob pro přednostní indukování CD8+ T-lymfocytární reakce na imunogen u jedince vyznačující se tím, že zahrnuje krok aplikování rekombinantního opičího adenóviru obsahujícího molekulu nukleové kyseliny kódující imunogen pod kontrolou regulační sekvence, která řídí expresi imunogenu u jedince, uvedenému jedinci.
  4. 4. Způsob podle nároku 3vyznačující se tím, že uvedený rekombinantní opičí adenovirus je aplikován podkožně.
    • to · to · · · · • ·
  5. 5. Způsob podle nároku 3 nebo nároku 4vyznačuj ící se t í m, že uvedený rekombinantní opičí adenovirus je podán v nízké dávce.
  6. 6. Způsob podle jakéhokoliv z nároků 3 až 5 vyznačující se tím, že uvedený rekombinantní opičí adenovirus je podán v účinné dávce, která je mezi 104 pfu a 106 pfu.
  7. 7. Způsob podle jakéhokoliv z nároků 3 až 6 vyznačující se tím, že uvedený rekombinantní opičí adenovirus je rekombinantní C68 šimpanzí adenovirus.
  8. 8. Způsob podle jakéhokoliv z nároků 3 až 7 vyznačující se tím, že imunogen je vybrán ze skupiny zahrnující peptid, polypeptid nebo protein odvozený z patogenního viru vybraného ze ékupiny zahrnující virus lidské imunodeficience-1, lidský papilloma virus a virus vztekliny.
  9. 9. Imunogenní kompozice použitelná pro indukci cytolytické imunitní reakce proti viru lidské imunodeficience vyznačující se tím, že obsahuje (a) rekombinantní opičí adenovirus obsahující optimalizovanou sekvenci nukleové kyseliny kódující modifikovaný gag protein viru lidské imunodeficience-1 a (b) fyziologicky kompatibilní nosič.
  10. 10. Způsob pro indukování CD8+ T-lymfocytární odpovědi na virus lidské imunodeficience u savců vyznačující se t i m, že zahrnuje pódání kompozice podle nároku 9 uvedeným savcům.
    • fcfc • fc
    80 ·..· .:. ·..
  11. 11. Použití imunogenni kompozice podle nároku 9 v přípravě léčiva pro indukování CD8+ T-lymfocytární reakce proti viru lidské imunodeficience u savců.
  12. 12. Způsob pro indukování CD8+ T-lymfocytární reakce proti lidskému papilloma viru u savců vyznačující se tím, že zahrnuje podání rekombinantního opičího adenoviru kódujícího imunogenni protein odvozený od lidského papilloma viru uvedenému savci.
  13. 13. Použití rekombinantního opičího adenoviru kódujícího imunogenni protein odvozený od lidského papilloma viru při přípravě léčiva pro indukci CD8+ T-lymfocytární reakce proti lidskému papilloma viru u savců.
  14. 14. Použití rekombinantního opičího adenoviru kódujícího imunogenni protein odvozený od viru vztekliny při přípravě léčiva pro indukování neutralizační protilátkové reakce proti viru vztekliny u savců.
  15. 15. Vakcína proti viru lidské imunodeficience vyznačující se tím, že obsahuje rekombinantní opičí replikace-defektní adenovirus obsahující antigen viru lidské imunodeficience-1 (HIV-1).
  16. 16. Vakcína podle nároku 15 vyznačující se tím, že antigen je vybrán ze skupiny zahrnující obalový, pol nebo gag region HIV-1.
  17. 17. Vakcína podle nářoku 16 vyznačující se tím, že antigenem je přirozený antigen, ze kterého byly odstraněny elementy genetické nestability.
    • fcfc · · • ft ·♦·
    Q1 ······· ol ··· ·· ·· ··· «
  18. 18. Vakcína podle nároku 16 vyznačující se tím, že antigenem je HIV-1 gag cDNA obsahující sekvenci SEQ ID NO:6.
  19. 19. Vakcína podle nároku 15 vyznačující se tím, že rekombinantním adenovirem je šimpanzí adenovirus s deletovaným El získaný ze šimpanzího kmene 68.
  20. 20. Vakcína proti vzteklině vyznačující se tím, že obsahuje rekombinantní opičí replikace-defektní adenovirus obsahujíc sekvenci nukleové kyseliny kódující antigen viru vztekliny pod kontrolou regulační sekvence, která řídí expresi antigenu viru vztekliny.
  21. 21. Způsob pro ihdukování CD8+ T-lymfocytární reakce a chránění zvířete před virem lidské imunodeficience vyznačující se tím, že zahrnuje podání vakcíny podle nároku 15 uvedenému zvířeti.
  22. 22. Replikace defektní opičí adenovirový vektor vyznačující se tím, že obsahuje, v kapsidě opičího adenoviru, cis-elementy opičího adenoviru a heterologní gen operativně navázaný na sekvence řídící expresi, kde kapsida opičího adenoviru je odvozena z šimpanzího adenoviru vybraného ze skupiny zahrnující Pan 5, Pan 6 a Pan 7.
  23. 23. Replikace defektní opičí adenovirový vektor vyznačující se tím, že obsahuje, v kapsidě opičího adenoviru, cis-elementy opičího adenoviru a heterologní gen operativně navázaný na sekvence řídící expresi, kde kapsida opičího adenoviru je odvozena z šimpanzího adenoviru vybraného ze skupiny zahrnující paviání adenovirus ATCC — VR 275, kmeny makaka rhesus, ATCC ···
    - VR 209, ATCC - VR 275, ATCC VR 353, ATCC VR 355, a kmeny afrického makaka ATCC VR -541, ATCC VR 941, ATCC VR 942 a ATCC 943.
  24. 24. Opičí ddenovirový vektor podle nároku 22 nebo nároku 23 vyznačující se tím, že je replikace-defektní v důsledku absence schopnosti exprimovat adenovirové Ela a Elb.
  25. 25. Opičí adenovirový vektor podle jakéhokoliv z nároků 22 až 24 vyznačující se tím, žejev něm eliminován oddálený časný gen E3.
  26. 26. Opičí adenovirový vektor podle jakéhokoliv z nároků 22 až 25 vyznačující se tím, že má funkční deleci v E4 genu.
  27. 27. Opičí adenovirový vektor podle jakéhokoliv z nároků 22 až 26 vyznačující se tím, že obsahuje deleci v oddáleném časném genu E2a.
  28. 28. Opičí adenovirový vektor podle jakéhokoliv z nároků 22 až 27 vyznačující sg tím, že má deleci v jakémkoliv z pozdních genů LI až L5 genomu opičího adenoviru.
  29. 29. Opičí adenovirový vektor podle jakéhokoliv z nároků 22 až 28 vyznačující se tím, že heterologní gen je určen k prevenci a léčbě onemocnění způsobeného virem vybraným ze skupiny zahrnující virus lidské imunodeficience, virus opičí imunodeficience, respiračně-syncytiální virus, virus parainfluenzy typu 1-3, chřipkový virus, herpes simplex virus, lidský cytomegalovirus, viry hepatitidy, lidský papillomavirus, poliovirus, rotavirus, caliciviry, ·· · • · · • · · · • ♦ · ··· virUs spalniček, virus zarděnek, virus příušnic, adenovirus, virus vztekliny, virus psinky, virus dobytčího moru, coronavirus, parvovirus, viry infekční rhinotracheitidy, virus kočičí leukemie, virus kočičí infekční peritonitidy, virus ptačí infekční bursitidy, virus Newcastle nemoci, virus Marekovi nemoci, virus prasečího respiračního a reprodukčního syndromu, virus koňské arteritidy a viry encephalitidy.
  30. 30. Opičí adenovirový vektor podle jakéhokoliv z nároků 22 až 28 vyznačující se tím, že heterologní gen je určen k prevenci a léčbě onemocnění způsobeného bakterií vybrané ze skupiny zahrnující Haemophilus influenzae, Haemophilus somnus, Moraxella catarrhalis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Streptococcus faecalis, Helicobacter pylori, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia psittaci, Bordetella pertussis, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Salmonella choleraesuis, Escherichia coli, Shigella, Vibrio cholerae, Corynebacterium diphtheriae, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium avium, Mycobacterium intracellulare complex, Próteus mirabilis, Próteus vulgaris, Staphylococcus aureus, Clostridium tetani, Leptospira interrogans, Borrelia burgdorferi, Pasteurella haemolytica, Pasteurella multocida, Actinobacillus pleuropneumoniae a Mycoplasma gallisepticum.
  31. 31. Opičí adenovirový vektor podle jakéhokoliv ž nároků 22 až 28 vyznačuj ící se tím, že heterologní gen je určen k prevenci a léčbě onemocnění způsobeného houbou vybranou ze skupiny zahrnující Aspergillis, Blastomyces, Candida, Coccidiodes, Cryptococcus a Histoplasma.
    • ·· • fl • · ·
  32. 32. Opičí adenovirový vektor podle jakéhokoliv z nároků 22 až 28 vyznačuj ící se tím, že heterologní gen je určen k prevenci a léčbě onemocnění způsobeného parazitem vybraným ze skupiny zahrnující Leishmania major, Ascaris, Trichuris, Giardia, Schistosoma, Cryptosporidium,
    Trichomonas, Toxoplasma gondii a Pneumocystis carinii.
  33. 33. Opičí adenovirový vektor podle jakéhokoliv z nároků 22 až 28 vyznačující se tím, že že heterologní gen je určen k vyvolání protinádorové reakce za použití nádorového antigenu nebo antigenu asociovaného s nádory vybraného ze skupiny zahrnující prostatický specifický antigen, karcino-embryonální antigen, MUC-1, Her2, CA-125 a MÁGE-3.
  34. 34. Způsob přípravy vektoru podle jakéhokoliv z nároků 22 až 23 vyznačující se tím, že zahrnuje sestavení heterologního genu a ITR sekvence cis elementu opičího adenoviru.
CZ20033438A 2001-06-22 2002-05-13 Replikacne defektní opicí adenovirový vektor, zpusob jeho prípravy a lécivo, imunogenní kompozice a vakcína obsahující rekombinantní adenovirus CZ304169B6 (cs)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US30013101P 2001-06-22 2001-06-22
US30484301P 2001-07-12 2001-07-12

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ20033438A3 true CZ20033438A3 (cs) 2004-04-14
CZ304169B6 CZ304169B6 (cs) 2013-12-04

Family

ID=26971607

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20033438A CZ304169B6 (cs) 2001-06-22 2002-05-13 Replikacne defektní opicí adenovirový vektor, zpusob jeho prípravy a lécivo, imunogenní kompozice a vakcína obsahující rekombinantní adenovirus

Country Status (25)

Country Link
US (1) US20040241181A1 (cs)
EP (1) EP1409012B1 (cs)
JP (1) JP2005523233A (cs)
KR (1) KR20040043129A (cs)
CN (1) CN1518457A (cs)
AT (1) ATE422365T1 (cs)
AU (1) AU2002308713B2 (cs)
BR (1) BR0210586A (cs)
CA (1) CA2451864C (cs)
CY (1) CY1109059T1 (cs)
CZ (1) CZ304169B6 (cs)
DE (1) DE60231123D1 (cs)
DK (1) DK1409012T3 (cs)
ES (1) ES2322043T3 (cs)
HU (1) HU228327B1 (cs)
IL (2) IL159454A0 (cs)
MX (1) MXPA04000024A (cs)
NO (1) NO333252B1 (cs)
NZ (1) NZ530245A (cs)
PL (1) PL216200B1 (cs)
PT (1) PT1409012E (cs)
SG (1) SG153649A1 (cs)
SI (1) SI1409012T1 (cs)
WO (1) WO2003000283A1 (cs)
ZA (1) ZA200309360B (cs)

Families Citing this family (43)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040136963A1 (en) * 2001-06-22 2004-07-15 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Simian adenovirus vectors and methods of use
EP1453543B1 (en) 2001-11-21 2017-08-30 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Simian adenovirus nucleic acid and amino acid sequences, vectors containing same, and methods of use
WO2005001103A2 (en) 2003-06-20 2005-01-06 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods of generating chimeric adenoviruses and uses for such chimeric adenoviruses
ATE449105T1 (de) 2004-01-23 2009-12-15 Angeletti P Ist Richerche Bio Impfstoffträger für schimpansen-adenovirus
BRPI0516048A (pt) 2004-10-13 2008-08-19 Crucell Holland B V E Beth Isr batelada de um adenovìrus recombinante defectivo em replicação baseado em um sorotipo do subgrupo c
TW200716750A (en) * 2005-05-12 2007-05-01 Glaxo Group Ltd Vaccine composition
ES2437082T3 (es) 2006-07-18 2014-01-08 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Vacunas contra la malaria
HRP20161606T1 (hr) 2007-03-02 2017-01-13 Glaxosmithkline Biologicals Sa Novi postupak i pripravci
WO2008112125A1 (en) * 2007-03-09 2008-09-18 Merck & Co., Inc. Papillomavirus vaccine compositions
CA2706257C (en) * 2007-11-28 2017-06-06 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Simian subfamily b adenovirus sadv-28, -27, -29, -32, -33 and -35 and uses thereof
WO2010085984A1 (en) * 2009-02-02 2010-08-05 Okairos Ag Simian adenovirus nucleic acid- and amino acid-sequences, vectors containing same, and uses thereof
WO2011057254A2 (en) * 2009-11-09 2011-05-12 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Simian adenoviral vector-based vaccines
WO2011133870A2 (en) * 2010-04-22 2011-10-27 Andrea Amalfitano Vaccines comprising adenovirus vectors and signaling lymphocyte activating molecule-associated protein (sap)
CN102060915A (zh) * 2010-10-29 2011-05-18 广州呼吸疾病研究所 人3型腺病毒六邻体的可修饰位点及其应用
KR102104650B1 (ko) * 2011-03-21 2020-04-24 알티뮨 인크. 급속 및 지속적 면역학적제제-치료제
TWI623618B (zh) 2011-07-12 2018-05-11 傳斯堅公司 Ｈｂｖ聚合酶突變體
WO2013045658A1 (en) 2011-09-29 2013-04-04 Transgene Sa Immunotherapy composition and regimen for treating hepatitis c virus infection
WO2013045668A2 (en) 2011-09-29 2013-04-04 Transgene Sa Immunotherapy composition and regimen for treating hepatitis c virus infection
CN103468743B (zh) * 2013-08-19 2015-07-29 中国科学院上海巴斯德研究所 一种狂犬病疫苗及其制备方法
CN103937835A (zh) * 2013-08-19 2014-07-23 中国科学院上海巴斯德研究所 一种基于腺病毒AdC68的表达载体及其构建方法
JP2016535989A (ja) 2013-11-01 2016-11-24 ファイザー・インク 前立腺関連抗原を発現させるためのベクター
JP6705755B2 (ja) 2014-05-19 2020-06-03 バロ セラピューティクス オイＶａｌｏ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｏｙ 癌ワクチン開発のための改変アデノウイルス
CN106659777A (zh) 2014-06-13 2017-05-10 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 免疫原性组合产品
CN107921118B (zh) 2015-06-12 2022-11-08 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 腺病毒多核苷酸和多肽
MX2019002178A (es) 2016-08-23 2019-09-18 Glaxosmithkline Biologicals Sa Peptidos de fusion con antigenos enlazados a fragmentos cortos de cadena invariante (cd74).
EP3518966A1 (en) 2016-09-29 2019-08-07 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Compositions and methods of treatment of persistent hpv infection
GB201616904D0 (en) 2016-10-05 2016-11-16 Glaxosmithkline Biologicals Sa Vaccine
CA3045976A1 (en) * 2016-12-09 2018-06-14 Glaxosmithkline Biologicals Sa Chimpanzee adenovirus constructs with lyssavirus antigens
GB201701239D0 (en) * 2017-01-25 2017-03-08 Glaxosmithkline Biologicals Sa Novel formulation
WO2019016756A1 (en) 2017-07-21 2019-01-24 Glaxosmithkline Biologicals Sa ANTIGEN CONSTRUCTS OF CHIKUNGUNYA VIRUSES
WO2019086466A1 (en) 2017-10-31 2019-05-09 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Adenovirus and uses thereof
BR112020008435A2 (pt) 2017-10-31 2020-11-17 Janssen Vaccines & Prevention B.V. vetores de adenovírus e seus usos
WO2019086450A1 (en) 2017-10-31 2019-05-09 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Adenovirus and uses thereof
MA50502A (fr) 2017-10-31 2020-09-09 Janssen Vaccines & Prevention Bv Adénovirus et utilisations associées
GB201721068D0 (en) 2017-12-15 2018-01-31 Glaxosmithkline Biologicals Sa Hepatitis B immunisation regimen and compositions
GB201721069D0 (en) 2017-12-15 2018-01-31 Glaxosmithkline Biologicals Sa Hepatitis B Immunisation regimen and compositions
MX2020006225A (es) 2017-12-20 2020-12-07 Glaxosmithkline Biologicals Sa Constructos antigenicos del virus de epstein-barr.
EP3581201A1 (en) 2018-06-15 2019-12-18 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Escherichia coli o157:h7 proteins and uses thereof
EP3587581A1 (en) 2018-06-26 2020-01-01 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Formulations for simian adenoviral vectors having enhanced storage stability
TW202102256A (zh) 2019-03-05 2021-01-16 比利時商葛蘭素史密斯克藍生物品公司 B型肝炎免疫法及組合物
TW202217002A (zh) 2020-07-13 2022-05-01 法商傳斯堅公司 免疫抑制之治療
WO2023213764A1 (en) 2022-05-02 2023-11-09 Transgene Fusion polypeptide comprising an anti-pd-l1 sdab and a member of the tnfsf
CN117089577B (zh) * 2023-08-21 2024-06-25 暨南大学 重组的猴腺病毒、病毒载体及构建方法

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6174666B1 (en) * 1992-03-27 2001-01-16 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Method of eliminating inhibitory/instability regions from mRNA
IL113817A (en) * 1994-06-30 2001-03-19 Merck & Co Inc Polynucleotide vaccne for papillomavirus
US5698202A (en) * 1995-06-05 1997-12-16 The Wistar Institute Of Anatomy & Biology Replication-defective adenovirus human type 5 recombinant as a rabies vaccine carrier
AU6261696A (en) * 1995-06-05 1996-12-24 Trustees Of The University Of Pennsylvania, The A replication-defective adenovirus human type 5 recombinant as a vaccine carrier
WO1998010087A1 (en) * 1996-09-06 1998-03-12 Trustees Of The University Of Pennsylvania Chimpanzee adenovirus vectors
AU5677399A (en) * 1998-08-20 2000-03-14 Wistar Institute Of Anatomy And Biology, The Methods of augmenting mucosal immunity through systemic priming and mucosal boosting

Also Published As

Publication number Publication date
CY1109059T1 (el) 2014-07-02
AU2002308713B2 (en) 2008-05-15
IL159454A (en) 2009-09-01
HU228327B1 (en) 2013-03-28
NZ530245A (en) 2007-04-27
BR0210586A (pt) 2005-07-12
NO20035740L (no) 2004-02-16
HUP0400297A3 (en) 2010-08-30
IL159454A0 (en) 2004-06-01
ES2322043T3 (es) 2009-06-16
SG153649A1 (en) 2009-07-29
PL372294A1 (en) 2005-07-11
KR20040043129A (ko) 2004-05-22
DE60231123D1 (de) 2009-03-26
EP1409012A4 (en) 2005-08-03
NO20035740D0 (no) 2003-12-19
CZ304169B6 (cs) 2013-12-04
DK1409012T3 (da) 2009-05-18
WO2003000283A1 (en) 2003-01-03
ZA200309360B (en) 2005-07-27
CA2451864A1 (en) 2003-01-03
EP1409012B1 (en) 2009-02-11
ATE422365T1 (de) 2009-02-15
US20040241181A1 (en) 2004-12-02
SI1409012T1 (sl) 2009-08-31
EP1409012A1 (en) 2004-04-21
JP2005523233A (ja) 2005-08-04
HUP0400297A2 (en) 2007-05-02
CA2451864C (en) 2013-01-15
NO333252B1 (no) 2013-04-22
MXPA04000024A (es) 2004-05-21
AU2002308713A2 (en) 2003-01-08
PL216200B1 (pl) 2014-03-31
CN1518457A (zh) 2004-08-04
PT1409012E (pt) 2009-05-11
HK1061511A1 (en) 2004-09-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA2451864C (en) Methods of inducing a cytotoxic immune response and recombinant simian adenovirus compositions useful therein
US12365920B2 (en) Adenoviral vector
JP7113924B2 (ja) 組み換え改変ワクシニアウイルスアンカラ（ｍｖａ）フィロウイルスワクチン
EP3385387B1 (en) Simian adenovirus nucleic acid- and amino acid-sequences, vectors containing same, and uses thereof
DK2714916T3 (en) ABEADENOVIRUS AND HYBRID ADENOVIRUS VECTORS
AU2002308713A1 (en) Methods of inducing a cytotoxic immune response and recombinant simian adenovirus compositions useful therein
HUP0500987A2 (en) Simian adeniovirus nucleic acid and amino acid sequences, vectors containing same, and methods of use
US6511845B1 (en) Methods for producing an immune response against HIV-1
CA2519207A1 (en) Adenovirus serotype 34 vectors, nucleic acids and virus produced thereby
US20040253210A1 (en) Adenovirus type7 vectors
HK40068020A (en) Adenoviral vector
HK1061511B (en) Methods of inducing a cytotoxic immune response and recombinant simian adenovirus compositions useful therein
HK40006989B (en) Adenoviral vector
BR112017003908B1 (pt) Vacina contra filovírus de vírus de vaccinia modificado recombinante ankara (mva)

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20180513