ES2322043T3 - Procedimientos de indusccion de una respuesta citotoxica inmune y composiciones de adenovirus de simio recombinante utiles en los mismos. - Google Patents

Procedimientos de indusccion de una respuesta citotoxica inmune y composiciones de adenovirus de simio recombinante utiles en los mismos. Download PDF

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Abstract

Un vector adenoviral de simio defectivo de replicación que contiene, en un cápside adenoviral de simio, ciselementos adenovirales de simio y un gen heterólogo enlazado operablemente a una secuencia de control de expresión, en el que el cápside adenoviral de simio se deriva de un adenovirus de chimpancé elegido en el grupo consistente en Pan 5, Pan 6 y Pan 7.

Description

Procedimientos de inducción de una respuesta citotóxica inmune y composiciones de adenovirus de simio recombinante útiles en los mismos.
Este trabajo ha sido financiado a partir de concesiones procedentes del Instituto Nacional de Sanidad, P30 DK 47757-08 y P01 HL59407-02 y la concesión AI 49766-01 del NAID. El gobierno de los Estados Unidos puede tener derechos sobre esta invención.
Antecedentes de la invención
Los recombinantes adenovirales del serotipo 5 humano, han sido ensayados como portadores de vacuna para una diversidad de antígenos derivados de los virus, parásitos o células tumorales. Los resultados fueron alentadores puesto que los recombinantes adenovirales con E1 suprimido produjeron respuestas inmunes al producto transgén. Un adenovirus del serotipo 5 humano (Ad5) es un virus ubicuo del resfriado común que infecta a la mayor parte de los humanos dentro de su primer año de vida. Los inventores han encontrado que la inmunidad preexistente a los serotipos humanos comunes reduce la eficacia de la vacuna recombinante adenoviral basada en el serotipo homólogo del virus. En algunos casos, esta reducción de eficacia puede ser obviada mediante el suministro de dosis más altas del recombinante adenoviral humano. Sin embargo, estas dosis más altas pueden estar asociadas a otros efectos colaterales indeseados.
Lo que se necesita son composiciones útiles para inducir una respuesta inmune a una molécula seleccionada, que evite los problemas asociados a los procedimientos de suministro habituales.
Sumario de la invención
La presente invención proporciona medios para inducir preferentemente una respuesta citotóxica inmune a una molécula heteróloga, mediante el suministro de la molécula a un anfitrión por medio de un adenovirus recombinante de simio. Los inventores han encontrado inesperadamente que los adenovirus de simio, utilizados de acuerdo con la presente invención, presentan un inmunógeno de una manera que induce un respuesta de la célula CD8+ T significativamente más potente que cuando el inmunógeno se suministra mediante un virus comparable de tipo 5 humano. Además, los inventores han encontrado que los adenovirus de chimpancé recombinantes inducen niveles aproximadamente cinco veces más altos de interferón-\alpha y de interferón-\beta de lo que lo hacen los adenovirus humanos.
La invención proporciona, en un aspecto, un vector adenoviral de simio defectivo de replicación, que contiene, en un cápside adenoviral de simio, cis-elementos adenovirales de simio y un gen heterólogo enlazado operativamente a una secuencia de control de expresión, en el que el cápside adenoviral de simio se deriva de un adenovirus de chimpancé elegido en el grupo consistente en Pan 5, Pan 6, y Pan 7.
La invención proporciona también un procedimiento de producción de tal vector, que comprende ensamblar un gen heterólogo y la secuencia IRT del elemento cis de adenovirus de simio.
En otro aspecto, la invención proporciona el uso de un adenovirus recombinante según se ha descrito, en la preparación de un medicamento para inducir una respuesta de célula T a un inmunógeno en un sujeto, que se caracteriza porque dicho adenovirus de simio recombinante induce preferentemente una respuesta de célula CD8+ T al inmunógeno cuando se suministra sub-cutáneamente, y que se caracteriza además porque dicho adenovirus recombinante comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un inmunógeno bajo el control de secuencias reguladoras que dirigen la expresión del inmunógeno en el sujeto.
En un aspecto adicional, la invención proporciona el uso de un adenovirus recombinante según se ha descrito, en la preparación de un medicamento para inducir una respuesta de anticuerpo a un inmunógeno en un sujeto, que se caracteriza porque dicho adenovirus de simio recombinante induce preferentemente una respuesta de anticuerpo al inmunógeno a bajas dosis cuando se suministra la mucosa, y que se caracteriza además porque dicho adenovirus recombinante comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un inmunógeno bajo el control de secuencias reguladoras que dirigen la expresión del inmunógeno en el sujeto.
Todavía según otro aspecto, la invención proporciona una composición inmunogénica útil para reducir una respuesta citolítica inmune respecto al virus de inmunodeficiencia humana, que comprende: (a) un adenovirus de simio recombinante según se ha descrito, que comprende una secuencia de ácido nucleico optimizada que codifica una proteína de obstrucción modificada del virus-1 de inmunodeficiencia humana, y (b) un portador fisiológicamente compatible.
La invención proporciona además el uso de tal composición inmunogénica en la preparación de un medicamento para inducir una respuesta de célula CD8+ T frente al virus de inmunodeficiencia humana en los mamíferos.
En un aspecto adicional, la invención proporciona el uso de un adenovirus de simio recombinante según se ha descrito, que codifica una proteína inmunogénica derivada del virus del papiloma humano, para la preparación de un medicamento para inducir una respuesta de la célula CD8+ T frente al virus del papiloma humano en los mamíferos.
En un aspecto alternativo, la invención proporciona el uso de un adenovirus de simio recombinante según se ha descrito, que codifica una proteína inmunogénica derivada del virus de la rabia, en la preparación de un medicamento para inducir una respuesta de anticuerpo neutralizante contra la rabia en los mamíferos.
En un aspecto alternativo adicional, la invención proporciona una vacuna para el virus de inmunodeficiencia humana según se ha descrito, que comprende un adenovirus defectivo-de replicación recombinante de simio, que comprende un antígeno del virus de inmunodeficiencia humana (VIH-1).
Todavía en un aspecto alternativo adicional, la invención proporciona una vacuna para la rabia que comprende un adenovirus defectivo-de replicación recombinante de simio según se ha descrito, que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un antígeno de la rabia bajo el control de secuencias reguladoras que dirigen la expresión del antígeno de la rabia.
Todavía existen otras ventajas de la presente invención que se pondrán de manifiesto a partir de la descripción detallada que sigue de la invención.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 resume la organización genérica del genoma C68 de adenovirus de chimpancé. En la Figura 1A, el genoma C68 de adenovirus de chimpancé ha sido representado esquemáticamente mediante la casilla que aparece en la parte superior. Las repeticiones terminales invertidas han sido sombreadas en negro, y las regiones cercanas están sombreadas en gris. Las puntas de flecha situadas por encima de la casilla indican la dirección de expresión de los genes cercanos. La línea por debajo de la casilla representa la división del genoma en 100 unidades de mapeo. Las flechas por debajo de la línea representan las cinco últimas regiones de gen y las proteínas codificadas en cada región. Los números por debajo de la casilla o las flechas indican el inicio (codón promotor o de iniciación) y el final (señal PolyA canónica) para cada región. * representa el último promotor E2A. La Figura 1B ilustra los clones PstI; la Figura 1C ilustra los clones BamHI. La Figura 1D ilustra los clones HindIII. Para las partes 1B-1D, las regiones sin sombrear indican que un fragmento fue clonado en un vector plásmido, según se relaciona en la Tabla 1, mientras que las regiones sombreadas indican que el fragmento de restricción no ha sido clonado. Para cada sección, el nombre del fragmento, el carácter alfabético con A que es el fragmento más ancho, y el tamaño del fragmento, aparecen relacio-
nados por encima de la casilla, y los puntos extremos del fragmento aparecen relacionados por debajo de la casilla.
La Figura 2 proporciona un alineamiento de secuencia múltiple de proteínas hexón. Las secuencias de aminoácido deducidas de hexones de adenovirus humano altamente similares, fueron comparadas con el adenovirus de chimpancé utilizando CLUSTAL X. Los serotipos y los subgrupos aparecen indicados en el margen izquierdo, seguido del número de residuo. La numeración se refiere a la posición de aminoácido con respecto al inicio de la traducción. Los aminoácidos están sombreados con respecto al C68, para destacar las similitudes (gris) y las identidades (negro). Las siete regiones híper-variables del interior de los dominios de bucle DE1 y FG1, están etiquetados a lo largo de la parte inferior y corresponden a las secuencias Ad2 siguientes del alineamiento: HVR1, 137-188; HVR2, 194-204; HVR3; 222-229; HVR4, 258-271; HVR5, 278-294; HVR6, 316-327; y HVR7, 433-465. Los números de acceso de GenBank para las secuencias mostradas, son como sigue: AAD03657 (Ad4), S37216 (Ad16), S39298 (Ad3), AAD03663 (Ad7), y NP040525 (Ad2).
Descripción detallada de la invención
En una comparación de la inmunogenicidad de los recombinantes adenovirales de la cepa 5 humana con los de la cepa 68 de adenovirus de chimpancé, expresando ambas una secuencia truncada de obstrucción, se mostró que el adenovirus de chimpancé era más potente. Se han observado resultados similares con adenovirus recombinantes de chimpancé que expresan la proteína fluorescente verde y una glicoproteína del virus de la rabia. Esta potencia más alta del adenovirus recombinante del chimpancé es más probable que no esté enlazada a expresión de transgén más alta según los estudios que se realizaron con ambos recombinantes Ad y de chimpancé que portan casetes de expresión similares en los que el transgén está controlado por el promotor del citomegalovirus cercano. Los datos que aquí se presentan indican también que es improbable reflejar diferencias de tropismo, puesto que ambos virus de chimpancé y de Ad5 utilizan el mismo receptor celular. Por el contrario, estos resultados demuestran que los adenovirus recombinantes de chimpancé, utilizados de acuerdo con la presente invención, tienen inesperadamente una capacidad adyuvante que difiere del adenovirus humano. Esta mejor adyuvancia tiene un efecto profundo sobre la magnitud y la cinética de la respuesta inmune específica del transgén, inducida por el adenovirus de chimpancé.
Ventajosamente, esta potencia más alta permite el uso de dosis más bajas de adenovirus de chimpancé que las que se necesitarían para un sistema de suministro adenoviral humano. Además, los inventores han encontrado que los adenovirus recombinantes de chimpancé inducen aproximadamente niveles cinco veces más altos de interferón-\alpha y de interferón-\beta de lo que lo harían los adenovirus humanos.
Además, se ha encontrado que los adenovirus de chimpancé recombinantes tienen aproximadamente la misma capacidad sobre células dendríticas que los virus de tipo 5 de adenovirus humano. Esta capacidad, acoplada con la inesperada potencia de los adenovirus de simio, proporciona ventajas significativas en cuanto a la inducción de una respuesta citotóxica inmune a un antígeno seleccionado, y en cuanto al tratamiento de condiciones para las que resulta deseable una inducción incrementada del interferón-\alpha y del interferón-\beta.
I. Adenovirus de simio recombinante A. Fuentes
Una diversidad de fuentes de secuencias de adenovirus de chimpancé se encuentran disponibles en la American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209, y en otras fuentes. Las cepas de chimpancé deseables son la Pan 5 [ATCC VR-591], Pan 6 [ATCC VR-592], y Pan 7 [ATCC VR-593]. Cepas de adenovirus de chimpancé particularmente deseables son la cepa de adenovirus de chimpancé Bertha o C 1 [ATCC Accesión núm. VR-20] y la cepa de adenovirus de chimpancé Pan 9 o CV68 [ATCC VR-594]. Por conveniencia, el virus CV68 va a ser mencionado a través de la presente descripción como "C68". Los virus fueron aislados originalmente a partir de excrementos [C1, Rowe et al., Proc. Soc. Exp. Med. 91-280 (1956)] o de nodo linfático mesentérico [C68, Basnight et al., Am. J. Epidemiol., 94: 166 (1971)] de chimpancés infectados. Las secuencias de estas cepas, y la posición de los genes E1a, E1b, E2a, E2b, E3, E4, L1, L2, L3, L4 y L5 del adenovirus, se proporcionan en la Patente US 6.083.716, la cual se incorpora aquí como referencia. Opcionalmente, se pueden utilizar secuencias adenovirales de simio que no sean de chimpancé en la preparación de los vectores recombinantes de la invención. Tales adenovirus que no son de chimpancé incluyen los obtenidos a partir de cepas de adenovirus de babuino [por ejemplo, ATCC VR-275], cepas de adenovirus aisladas a partir de monos rhesus [por ejemplo, ATCC VR-209, ATCC VR-275, ATCC VR-353, ATCC VR-355], y cepas de adenovirus aisladas a partir de monos verdes africanos [por ejemplo, ATCC VR-541; ATCC VR-941; ATCC VR-942; ATCC VR-943].
Los adenovirus recombinantes de chimpancé (o de otro simio) aquí descritos, pueden contener secuencias adenovirales derivadas de una o de más de una cepa adenoviral de simio. Estas secuencias pueden ser obtenidas a partir de fuentes naturales, producidas recombinantemente, sintéticamente, o mediante otros procedimientos químicos o de ingeniería genética.
B. Adenovirus de simio recombinantes
Los adenovirus de simio recombinantes útiles en la presente invención son partículas virales que están compuestas por secuencias de adenovirus de simio recombinantes que portan una molécula heteróloga y/o proteínas cápside de adenovirus de simio. Estos adenovirus de simio, y en particular las secuencias C68 y C1 de chimpancé, son también útiles para la formación de vectores híbridos con otros adenovirus de simio y de no-simio, y en la formación de virus recombinantes seudotipados, es decir, virus recombinantes con un vector adenoviral que porta una molécula heteróloga que está empaquetada en una proteína de cápside heteróloga de origen simial.
1. Adenovirus recombinante de simio
Como mínimo, un adenovirus recombinante de simio útil en la invención, contiene los cis-elementos de adenovirus de simio necesarios para replicación y encapsidación de virión, cuyos cis-elementos flanquean el gen heterólogo. Es decir, el vector contiene las secuencias de repetición invertidas (ITR) cis-actuadoras 5' de los adenovirus, que funcionan como orígenes de la replicación), los dominios de empaquetamiento/incrementador naturales 5' (que contienen las secuencias necesarias para empaquetar genomas Ad lineales y elementos incrementadores para el promotor de E1), la molécula heteróloga, y las secuencias 5' ITR. Véanse, por ejemplo, las técnicas descritas para la preparación de un vector Ad "minimal" en la Patente US 6.203.975, la cual se incorpora como referencia, que pueden ser adaptadas fácilmente para el adenovirus de simio recombinante.
Opcionalmente, los adenovirus de simio recombinantes útiles en esta invención, contienen más secuencias de adenovirus de simio minimal que las definidas en lo que antecede. Estos otros vectores Ad pueden estar caracterizados por tener modificaciones que destruyen la capacidad del adenovirus para expresar uno o más de los productos de gen seleccionados. La frase "supresión funcional" se utiliza aquí para describir esas modificaciones. Tales "supresiones funcionales" adoptan típicamente forma de una supresión de la totalidad o de una parte de un gen del virus. Sin embargo, las supresiones funcionales pueden adoptar también forma de mutación por cambio de marco. Aún más, otras manipulaciones adecuadas que consiguen supresión funcional resultarán evidentes para los expertos en la materia.
En una realización particularmente preferida, los adenovirus de simio son de replicación defectiva debido a la ausencia de capacidad para expresar los E1a y E1b adenovirales, es decir, la funcionalidad suprimida en los E1a y E1b. Estos adenovirus recombinantes de simio son también supresiones funcionales en otros genes.
Por ejemplo, el gen E3 próximo retardado del adenovirus puede ser eliminado de la secuencia de adenovirus de simio que forma parte del virus recombinante. La función del E3 no es necesaria para la producción de la partícula de adenovirus recombinante. De ese modo, resulta innecesario sustituir la función de producto genético con a efectos de empaquetar un adenovirus de simio recombinante útil en la invención.
Los adenovirus de simio recombinantes pueden ser también construidos de modo que tengan una supresión funcional del gen E4, aunque puede ser deseable conservar la función ORF6 del E4. Aún más, otro vector de esta invención contiene una supresión en el gen E2a contiguo retrasado. Las supresiones pueden ser realizadas en cualquiera de los últimos genes L1 a L5 del genoma de adenovirus del simio. De forma similar, las supresiones en los genes IX e IVa_{2} pueden ser útiles a algunos efectos. Otras supresiones pueden ser realizadas en otros genes de adenovirus estructurales o no estructurales. Las supresiones discutidas anteriormente pueden ser utilizadas individualmente, es decir, una secuencia de adenovirus para su uso en la presente invención puede contener supresiones de E1 solamente. Alternativamente, las supresiones de los genes completos o de porciones de los mismos, efectivas para destruir su actividad biológica, pueden ser utilizadas según combinaciones cualesquiera. Por ejemplo, en un ejemplo de vector, la secuencia de adenovirus puede tener supresiones del gen E1 y del gen E4, o de los genes E1, E2a y E3, o de los genes E1 y E3, o de los genes E1, E2a y E4, con o sin supresión de E3, y así sucesivamente. Tales supresiones pueden ser utilizadas en combinación con otras mutaciones, tales como mutaciones sensibles a la temperatura, para conseguir un resultado deseado.
El transgén puede ser insertado en cualquier región suprimida del adenovirus de simio. Alternativamente, el transgén puede ser insertado en una región de gen ya existente para interrumpir la función de esa región, si se desea.
Con independencia de si el adenovirus de simio recombinante contiene solamente secuencias Ad minimales, o el genoma Ad completo con supresiones funcionales solamente en las regiones E1 y/o E3, el virus recombinante contiene un cápside de adenovirus de simio. Alternativamente, en otras realizaciones, se pueden utilizar adenovirus seudotipados recombinantes en los procedimientos de la invención. Tales adenovirus seudotipados utilizan proteínas de cápside de adenovirus de simio en las que se ha empaquetado una molécula de ácido nucleico que porta secuencias heterólogas de adenovirus de simio, o secuencias de adenovirus que no sea de simio. Estos adenovirus recombinantes de simio de la presente invención, pueden ser producidos utilizando procedimientos que sean conocidos por los expertos en la materia.
C. Producción de la Partícula Viral Recombinante
Los procedimientos de producción de adenovirus de simio recombinantes adecuados, utilizan técnicas que son bien conocidas por los expertos en la materia, por ejemplo, los que se describen en la Patente U.S. 6.083.716. En la construcción de virus recombinantes de simio para el suministro de una molécula heteróloga a un sujeto (por ejemplo, un humano, un canino, un felino, u otro mamífero), las secuencias de ácido nucleico de adenovirus empleadas en los vectores pueden ser extraídas de una diversidad de fuentes simiescas.
Un vector que comprenda secuencias de adenovirus de simio (por ejemplo, de chimpancé), que carezca de las secuencias de adenovirus de simio necesarias para la producción de una partícula de virus recombinante infeccioso, puede ser utilizado junto con un virus o vector ayudante. El virus de ayuda proporciona los productos genéticos esenciales requeridos para la infectividad y la propagación viral del adenovirus de simio. Cuando solamente se realiza una o más supresiones de los genes de adenovirus de simio en un vector viral funcional de otra manera, los productos de gen suprimidos pueden ser suministrados en el proceso de producto del vector viral mediante la propagación del virus en una célula de empaquetamiento seleccionada.
De ese modo, se pueden proporcionar estas funciones en una línea celular permanentemente transformada que proporcione algunas, o todas, las funciones adenovirales que se requieren para el empaquetamiento de, por ejemplo, cualquiera de los E1a, E1b, E2a, E4 ORF6, VA ARNs, que falten en el vector. En caso necesario, o alternativamente, cualquiera de las funciones adenovirales adicionales requeridas puede ser proporcionada a la célula de empaquetamiento mediante transfección o infección de una construcción que contenga estas funciones. Opcionalmente, las funciones adenovirales pueden ser seleccionadas de modo que permitan el empaquetamiento de un vector viral que porte el minigén en una proteína de cápside adenoviral de simio heterólogo. Los métodos adecuados de "seudotipado" que utilizan las proteínas de cápside de simio (por ejemplo, la C68), resultarán evidentes en base a lo que se conoce en la técnica con relación al seudotipado de adenovirus humanos. Véase, por ejemplo, la Patente US 6.203.975.
El ensamblaje de las secuencias de ADN seleccionadas del adenovirus, y el transgén y otros elementos de vector en diversos plásmidos intermedios y vectores lanzadera, y el uso de los plásmidos y vectores para producir una partícula viral recombinante, se consiguen todos utilizando técnicas convencionales. Tales técnicas incluyen técnicas convencionales de clonación de cADN tales como las descritas en los textos [Sambrook et al., Clonación Molecular: Un Manual de Laboratorio, 2ª Ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1989)], el uso de secuencias de oligonucleótido de solapamiento de los genomas de adenovirus, reacción de cadena de polimerasa, y cualquier procedimiento adecuado que proporcione la secuencia de nucleótido deseada. Se emplean técnicas estándar de transfección y co-trasnfección, por ejemplo, técnicas de precipitación de CaPO_{4}. Otros métodos convencionales incluyen la recombinación homóloga de los genomas virales, formación de placa de virus en recubrimiento de agar, métodos de medición de generación de señal, y similares.
Por ejemplo, siguiendo la construcción y ensamblaje del vector lanzadera contenedor de transgén deseado, el vector lanzadera es transfectado in vitro en la célula anfitrión a efectos de empaquetamiento. La célula anfitrión tiene, o está dotada de, algunas funciones adenovirales faltantes. La recombinación homóloga ocurre entre el asistente y las secuencias de vector, lo que permite que las secuencias de transgén de adenovirus presentes en el vector sean replicadas y empaquetas en cápsides de virión, dando como resultado las partículas adenovirales recombinantes.
Ventajosamente, los inventores han encontrado que las proteínas del adenovirus humano E1 transcomplementan al adenovirus de simio defectuoso de E1 para permitir su empaquetamiento en partículas adenovirales de simio. Sin embargo, debido al bajo grado de homología entre el Ad E1 humano y las secuencias que flanquean las secuencias de Ad E1 suprimidas, existe un riesgo mínimo de que el Ad E1 de simio recombine homólogamente para producir adenovirus de simio competente de replicación.
Las partículas adenovirales de simio recombinantes, así producidas, pueden ser aisladas y purificadas mediante una cualquiera de una diversidad de métodos conocidos por los expertos en la materia, para su uso en el método de la invención.
II. Moléculas Heterólogas para su Suministro a un Anfitrión A. Inmunógenos
La molécula heteróloga portada por el adenovirus de simio para su suministro a una célula anfitrión puede ser cualquier sustancia deseada incluyendo, sin limitación, un polipéptido, una proteína, una enzima, un carbohidrato, una porción química, o una molécula de ácido nucleico que puede incluir oligonucleótidos, ARN, ADN, y/o híbridos de ARN/ADN. En una realización deseable, la molécula portada por el adenovirus de simio es un transgén. La molécula de ácido nucleico del transgén comprende una secuencia de ácido nucleico, heteróloga respecto a las secuencias de adenovirus, que codifica una proteína, un péptido, un polipéptido, una enzima u otro producto de interés, y secuencias heterólogas que dirigen la transcripción y/o la traducción del producto codificado en una célula anfitrión, y que permiten la expresión del producto codificado en la célula anfitrión o en el sujeto. La composición del transgén depende del uso previsto para el adenovirus de simio.
Por ejemplo, un tipo de transgén comprende una secuencia informadora o marcadora que, con la expresión, produce una señal detectada. Sin embargo, son particularmente deseables los productos de gen y otras moléculas con respecto a las cuales se induce una respuesta inmune de un anticuerpo y, más preferiblemente, mediada por célula.
Estos productos y moléculas de gen inmunogénico pueden consistir en una diversidad de microorganismos patogénicos inducidos, aunque sin limitación, a partir de virus, bacterias, hongos o microorganismos parásitos que infectan a los vertebrados humanos y no humanos, o a partir de células cancerígenas o de células tumorales. El inmunógeno puede comprender péptidos o polipéptidos derivados de proteínas. En algunos casos, se incluye más de un inmunógeno en la composición.
Las composiciones inmunogénicas deseables que contienen estos productos genéticos y otras moléculas, incluyen las dirigidas a la prevención y/o el tratamiento de las enfermedades causadas por, aunque sin limitación, virus tales como el virus de inmunodeficiencia humana, el virus de inmunodeficiencia de los simios, el virus sincitial respiratorio, los tipos 1-3 del virus parainfluenza, el virus de la gripe (por ejemplo, los virus A y B de la gripe), el virus del herpes simplex, el citomegalovirus humano, los virus de la hepatitis (incluyendo los virus de la hepatitis A, hepatitis B y hepatitis C), el papilomavirus humano, el virus de la polio, rotavirus, calicivirus, virus del sarampión, virus de las paperas, virus de la rubeola, adenovirus, virus de la rabia, virus del moquillo canino, virus de la ictericia, coronavirus, parvovirus, virus de la rinotraqueitis infecciosa, virus de leucemia felina, virus de peritonitis infecciosa felina, virus de la enfermedad bursal infecciosa aviar, virus de la enfermedad de Newcastle, virus de la enfermedad de Marek, virus del síndrome respiratorio y reproductor porcino, virus de la arteritis equina, y virus de la encefalitis.
Aún otros inmunógenos están dirigidos a la prevención y/o tratamiento de enfermedades causadas por, aunque sin limitación, bacterias tales como la Haemophilus influenzae, Haemophilus somnus, la Moraxelle catarrhalis, el Streptococcus pneumoniae, el Streptococcus pyogenes, el Streptococcus faecalis, la Helicobacter pylori, la Neisseria meningitidis, la Neisseria gonorrhoeae, la Chlamydia trachomatis, la Chlamydia pneumoniae, la Chlamydia psittaci, la Bordetella pertussis, la Salmonella typhi, la Salmonella typhimurium, la Salmonella cholerauesuis, la Escherichia coli, la Shigella, la Vibrio cholerae, la Corynebacterium diphteriae, la Mycobacterium tuberculosis, el complejo Mycobacterium avium-Mycobacterium intracellulare, la Proteus mirabilis, la Proteus vulgaris, la Staphylococcus aureus, la Clostridinium tetani, la Leptospira interrogans, la Borrelia burgdoferi, la Pasteurella haemolytica, la Pasteurella multocida, el Actinobacillus peluropneumoniae y la Mycoplasma gallisepticum.
Todavía otros inmunógenos deseables son los dirigidos a la prevención y/o el tratamiento de las enfermedades causadas por, aunque sin limitación, patógenos fungales tales como Aspergillis, Blastomyces, Candida, Coccidiodes, Cryptococcus y Histoplasma.
Adicionalmente, otros inmunógenos deseables son los dirigidos a la prevención y/o el tratamiento de las enfermedades causadas por, aunque sin limitación, parásitos tales como Leishmania major, Ascafris, Trichuris, Giardia, Schistosoma, Crystosporidium, Trichomonas, Toxoplasma gondii y Pneumocystiis carinii.
Además, los inmunógenos deseables incluyen los dirigidos a la obtención de un efecto anti-cáncer terapéutico o profiláctico en un anfitrión vertebrado, tal como, aunque sin limitación, los que utilizan un antígeno de cáncer o un antígeno asociado a un tumor incluyendo, aunque sin limitación, antígeno específico de proteasa, antígeno carcino-embriónico, MUC-1, Her2, CA-125 y MAGE-3.
Los ejemplos que se proporcionan en lo que sigue ilustran específicamente las ventajas de los métodos y composiciones de la invención, utilizando un vector adenoviral de simio recombinante a partir del cual se expresa un péptido inmunogénico de la rabia (glicoproteína G) o del virus-1 de inmunodeficiencia humana (proteína de obstrucción modificada). Otra realización deseable utiliza un adenovirus de simio que porta un péptido inmunogénico procedente del virus del papiloma humano. Sin embargo, la invención no se limita a esas fuentes de inmunógenos.
Elementos Reguladores
El diseño de un transgén o de otra secuencia de ácido nucleico que requiera transcripción, traducción y/o expresión para obtener el producto genético deseado en las células y anfitriones, puede incluir secuencias apropiadas que estén enlazadas operablemente a las secuencias de codificación de interés para fomentar la expresión del producto codificado. Las secuencias "operablemente enlazadas" incluyen tanto secuencias de control de expresión que son contiguas con las secuencias de ácido nucleico de interés, como secuencias de control de expresión que actúan en trans o a una distancia para controlar las secuencias de ácido nucleico de interés.
Las secuencias de control de expresión incluyen secuencias apropiadas de iniciación, terminación, promotoras e intensificadoras de transcripción; señales procesamiento eficiente de ARN, tales como señales de unión y de poliadenilación; secuencias que estabilizan el mARN citoplásmico; secuencias que incrementan la eficacia de la traducción (es decir, la secuencia de consenso de Kozak); secuencias que incrementan la estabilidad de la proteína; y cuando se desee, secuencias que aumentan la secreción de proteína. Se conoce en el estado de la técnica un gran número de secuencias de control de expresión (naturales, constitutivas, inducibles y/o específicas del tejido), y que pueden ser utilizadas para conducir la expresión del gen, dependiendo del tipo de expresión deseada. Para células eucarióticas, las secuencias de control de expresión incluyen típicamente un promotor, un incrementador, tal como uno derivado del gen de inmunoglobulina, SV40, citomegalovirus, etc., y una secuencia de poliadenilación que puede incluir sitios de donante y de aceptador de unión. La secuencia de poliadenilación (polyA) se inserta generalmente a continuación de las secuencias de transgén y antes de la secuencia 3' de ITR de adenovirus. En una realización, se elige la polyA de la hormona del crecimiento bovino. Un adenovirus de simio de la presente invención contener también un intrón, situado deseablemente entre la secuencia de promotor/incrementador y el transgén. Una posible secuencia de intrón se deriva también del SV-40, y se menciona como la secuencia de intrón SV-40 T. Otro elemento que puede ser utilizado en el vector es un sitio de entrada de ribosoma interno (IRES). Una secuencia IRES se utiliza para producir más de un polipéptido a partir de un transcripto simple de un gen. Una secuencia IRES podría ser utilizada para producir una proteína que contenga más de una cadena de polipéptido. La selección de estos y de otros elementos de vector comunes, es convencional y muchas de tales secuencias se encuentran disponibles (véase, por ejemplo, Sambrook et al., y las referencias citadas en la presente, por ejemplo en las páginas 3.18-3.25 y 16.17-16.27; y Ausubel et al., PROTOCOLOS CORRIENTES EN BIOLOGÍA MOLECULAR, John Wiley & Sons, Nueva York, 1989).
En una realización, la expresión consultiva de alto nivel será la deseada. Ejemplos de promotores constitutivos útiles incluyen, sin limitación, el promotor LTR del virus de sarcoma Rous retroviral (RSV) (opcionalmente con un incrementador de RSV), el promotor de citomegalovirus (CMV) (opcionalmente con el incrementador de CMV) (véase, por ejemplo, Boshart et al., Cell, 41: 521-530 (1985)), el promotor de SV40, el promotor de dihidrofolato reductasa, el promotor de \beta-actina, el promotor de fosfoglicerol quinasa (PGK), el promotor de EF1\alpha (Invitrogén). Los promotores inducibles, regulados por compuestos suministrados exógenamente, son también útiles e incluyen el, promotor de metalotionina (MT) de oveja inducible con zinc, el promotor del virus de tumor mamario (MMTV) de ratón inducible por dexametasona (DEX), El sistema T7 promotor de polimerasa (Documento WO 98/10088); el promotor de insecto ecdísono (No et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 3348-3351 (1996)), el sistema reprimible por tetraciclina (Gossen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5547-5551 (1992)), el sistema inducible por tetraciclina (Gossen et al., Science, 268: 1776-1769 (1995), véase también Harvey et al., Curr. Opin. Chem. Biol., 2: 512-518 (1998)), el sistema inducible por RU-486 (Wang et al., Nat. Biotech., 15: 239-243 (1997) y Wang et al., Gene Ther., 4: 432-441 (1997) y el sistema inducible por rapamicina (Magari et al., J. Clin. Invest., 100: 2865-2872 (1997)). Otros tipos de promotores inducibles que pueden ser útiles en este contexto, son los que están regulados por un estado fisiológico específico, por ejemplo la temperatura, una fase aguda, un estado de diferenciación particular de la célula, o en células replicantes solamente.
En otra realización, se utilizará el promotor natural para el transgén. Se puede preferir el promotor natural cuando se desee que la expresión del transgén mimetice la expresión natural. El promotor natural puede ser utilizado cuando la expresión del transgén deba ser regulada temporalmente o experimentalmente, o de una manera específica del tejido, o en respuesta a estímulos transcripcionales específicos. En una realización adicional, se pueden utilizar también otros elementos naturales de control de expresión, tal como elementos incrementadores, sitios de poliadenilación o secuencias de consenso de Kozak, para mimetizar la expresión natural.
Otra realización del transgén incluye un transgén enlazado operativamente a una promotor específico del tejido. Por ejemplo, si se desea expresión en el músculo esquelético, se deberá utilizar un promotor activo en el músculo. Éstos incluyen los promotores procedentes de genes que codifican la \alpha-actina esquelética, cadena 2A ligera de miosina, distrofina, creatina quinasa muscular, así como también promotores musculares sintéticos con actividades más altas que los promotores que se producen de forma natural (véase Li et al., Nat. Biotech., 17: 241-245 (1999)). Se conocen ejemplos de promotores que son específicos del tejido para el hígado (albúmina, Miatake et al., J. Virol., 71: 5124-32 (1997); promotor del núcleo del virus de la hepatitis B, Sandig et al., Gene Ther., 3: 1002-9 (1998); alfa-fetoproteína (AFP), Arbuthnot et al., Hum. Gene Ther., 7: 1503-14 (1996)), osteocalcina ósea (Stein et al., Mol. Biol. Rep., 24: 185-98 (1997)); sialoproteína ósea (Chen et al., J. Bone Miner. Res., 11: 654-64 (1996)), linfocitos (CD2, Hansal et al., J. Immunol., 161: 1063-8 (1998); cadena pesada de inmunoglobulina; cadena del receptor \alpha de célula T, promotor neuronal tal como el promotor de enolasa específica de la neurona (NSE) (Andersen et al., Cell. Mol. Neurobiol., 13: 503-15 (1993)), gen de cadena ligera de neurofilamento (Piccioli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 5611-5 (1991)), y el gen vgf específico de neurona (Piccioli et al., Neurona, 15: 373-84 (1995)), entre otros.
Por supuesto, no todas las secuencias de expresión de control se comportan igualmente bien para expresar todos los transgenes de esta invención. Sin embargo, un experto en la materia puede hacer una selección entre estas secuencias de control de expresión sin apartarse del marco de esta invención. Se puede elegir secuencias promotoras/incrementadoras adecuadas, por parte de un experto en la materia, utilizando la guía proporcionada por esta solicitud. Tal selección es un tema rutinario y no una limitación de la molécula o de la construcción. Por ejemplo, se puede seleccionar una o más secuencias de control de expresión que puedan estar enlazadas operativamente con la secuencia de codificación de interés, e insertar en el transgén, el minigén, y el virus de transferencia de la invención. Después de seguir uno de los procedimientos para empaquetamiento del adenovirus de simio enseñados por esta solicitud, o según enseña la técnica habitual, se pueden infectar células adecuadas in vitro o in vivo. El número de copias del minigén en la célula puede ser monitorizado mediante manchado Southern o PCR cuantitativo. El nivel de expresión de ARN puede ser monitorizado mediante manchado Northern o mediante RT-PCR cuantitativo. El nivel de expresión puede ser monitorizado mediante manchado Western, inmunohistoquímica, ELISA, RIA, o ensayos de actividad biológica del producto genético. De ese modo, se puede probar fácilmente si una secuencia particular de control de expresión es adecuada para un producto específico codificado por el transgén, y elegir la secuencia de control de expresión más apropiada. Alternativamente, cuando la molécula de suministro no requiere expresión, por ejemplo un carbohidrato, un polipéptido, un péptido, etc., las secuencias de control de expresión no necesitan formar parte del adenovirus de simio recombinante o de otra molécula.
III. Formulación de virus para el suministro
Los adenovirus de simio recombinantes, con preferencia suspendidos en un portador fisiológicamente compatible, pueden ser administrados a un paciente mamífero humano o no humano. Los portadores adecuados pueden ser fácilmente seleccionados por un experto en la materia en vista de la indicación para la que el virus de transferencia va dirigido. Por ejemplo, un portador adecuado incluye solución salina, la cual puede ser formulada con una diversidad de soluciones tamponadoras (por ejemplo, solución salina tamponada de fosfato). Otros ejemplos de portadoras incluyen solución salina estéril, lactosa, sacarosa, fosfato de calcio, gelatina, dextrano, agar, pectina, aceite de cacahuete, aceite de sésamo, y agua. La selección del portador no constituye ninguna limitación de la presente invención.
Opcionalmente, las composiciones de la invención pueden contener, además del adenovirus de simio recombinante y el (los) portador(es), otros ingredientes farmacéuticos convencionales, tal como conservantes, estabilizadores químicos, para el uso de vacunas, adyuvantes. Ejemplos adecuados de conservantes incluyen clorobutanol, sorbato potásico, ácido sórbico, dióxido de azufre, propil galato, parabenos, etil vanilina, glicerina, fenol, y paraclorofenol. Los estabilizadores químicos adecuados incluyen gelatina y albúmina. Ejemplos de adyuvantes adecuados incluyen, entre otros, complejos de estimulación inmune (ISCOMS), análogos de LPS incluyendo lípido A de monofosforil 3-O-desacilado (Ribi Immunochem Research, Inc.; Hamilton, MT), aceite mineral y agua, hidróxido de aluminio, Amphigen, Avirdine, L21/escualeno, péptidos de muramilo, y saponinas tales como Quil A.
IV. Suministro de virus recombinante para tratamiento y/o profilaxis
Los adenovirus defectivos de replicación, recombinantes, se administran en una "cantidad farmacéuticamente efectiva", es decir, una cantidad de adenovirus recombinante que sea efectiva en una vía de administración para transfectar las células deseadas y proporcionar niveles de expresión suficientes del gen seleccionado para proporcionar una respuesta inmune terapéutica o vacunatoria, por ejemplo, algunos niveles medibles de inmunidad protectora.
Las vías convencionales y farmacéuticamente aceptables de administración incluyen, aunque sin limitación, la intranasal, intramuscular, intratraqueal, subcutánea, intradérmica, rectal, oral u otras vías mucosales y parenterales de administración. Según se utiliza en la presente, las vías mucosales de administración incluyen las de suministro a los tejidos mucosales, incluyendo, sin limitación, las vías de inhalación, oral, intranasal, vaginal y rectal. Las vías de administración pueden ser combinadas, si se desea, o ajustadas dependiendo del inmunógeno o de la enfermedad. Por ejemplo, en la profilaxis de la rabia, las vías subcutánea, intratraqueal, intranasal y oral son las preferidas. La vía de administración dependerá principalmente de la naturaleza de la enfermedad que se esté tratando.
Las dosis o cantidades efectivas del virus de Ad defectivo de replicación, recombinante, dependerán principalmente de factores tales como la condición, el gen seleccionado, la edad, el peso y estado de salud del animal, y puede variar entre animales.
Las dosificaciones del vector viral dependerán principalmente de factores tales como la condición que se esté tratando, la edad, el peso y el estado de salud del paciente, y puede variar por tanto entre los pacientes mamíferos (incluyendo los humanos). Ventajosamente, la potencia no esperada de los virus recombinantes de simio (por ejemplo, de chimpancé) de la invención, permite que el uso de una cantidad significativamente más baja de adenovirus de chimpancé recombinante proporcione una cantidad efectiva que induzca los efectos inmunogénicos deseados (por ejemplo, inducción de un nivel predeterminado de células CD8 + T). Por ejemplo, una dosis eficaz del adenovirus recombinante de simio puede ser proporcionada por 10^{4} pfu y 10^{6} pfu de adenovirus de chimpancé. Sin embargo, se pueden elegir fácilmente dosis más elevadas, por ejemplo dependiendo de la vía de suministro seleccionada. Por ejemplo, el vector viral puede ser suministrado en una cantidad que esté comprendida en la gama de entre alrededor de 100 \mul y alrededor de 100 ml, y más preferentemente, alrededor de 1 ml y alrededor de 10 ml, de solución portadora que contenga concentraciones comprendidas en la gama de entre aproximadamente 1 x 10^{4} unidades de formación de placa (pfu) hasta aproximadamente 1 x 10^{13} pfu de virus/ml, y aproximadamente 1 x 10^{9} a aproximadamente 1 x 10^{11} pfu/ml de virus, en base a un adulto de 80 kg de peso. Una dosificación preferida es la estimada en aproximadamente 50 ml de solución salina a 2 x 10^{10} pfu/ml. Una dosis preferida está comprendida entre aproximadamente 1 y aproximadamente 10 ml de portador (por ejemplo, solución salina) a las concentraciones anteriores. Los niveles terapéuticos, o niveles de inmunidad, del gen seleccionado, pueden ser monitorizados para determinar la necesidad, si la hay, de intensificadores. A continuación de la averiguación de una respuesta de células CD8+ T, u opcionalmente, de concentraciones de anticuerpo, en el suero, pueden ser deseables inmunizaciones intensificadoras opcionales. Opcionalmente, los virus de simio recombinantes pueden ser suministrados utilizando un régimen de intensificación inicial. Se han descrito una diversidad de regímenes en el estado de la técnica, y pueden ser seleccionados fácilmente. Un método particularmente deseable se encuentra descrito en el documento WO 00/11140, publicado el 2 de Marzo de 2000, incorporado por referencia.
En una realización deseable, la invención proporciona un procedimiento para inducir preferencialmente una respuesta de las células CD8+ T a un virus de inmunodeficiencia humana en sujeto mediante suministro de un adenovirus de simio recombinante que comprende una proteína de obstrucción modificada. La proteína de obstrucción modificada ilustrada en los ejemplos que siguen, ha sido optimizada, por ejemplo, según se describe en la Patente US 5.972.596. La codificación y las secuencias de proteína, se reproducen en la presente en SEQ ID núm. 6 y SEQ ID núm. 7. Véase también G. Meyers et al., Eds. Retrovirus humanos y SIDA. Una compilación y análisis de secuencias de ácido nucleico y de aminoácidos (Los Álamos National Laboratory, Los Álamos, NM 1991). Sin embargo, cualquiera de una pluralidad de métodos para mejorar la expresión de la proteína de obstrucción, o cualquier otro inmunógeno o antígeno seleccionado según se ha descrito en la presente, son conocidos por los expertos en la materia y pueden ser utilizados, por ejemplo, para la humanización de las secuencias de codón de obstrucción del VIH-1, la extracción del sitio de unión de obstrucción del VIH-1, la inserción de secuencias líder adicionales corriente arriba de las secuencias de codón de obstrucción del VIH-1, la inserción de una secuencia de Kozak corriente arriba de las secuencias de codón de obstrucción del VIH-1. La selección de método de optimización no constituye una limitación de la presente invención. Alternativamente, el procedimiento de la invención puede ser utilizado para suministrar un adenovirus de simio recombinante portador de una proteína envolvente de VIH, o un conjunto de productos de VIH, al sujeto. Una proteína envolvente de VIH deseable es la glicoproteína 120 de VIH, respecto a la que se encuentran disponibles las secuencias en GenBank. Sin embargo, se pueden utilizar otras proteínas envolventes de virus adecuadas. La secuencia para el conjunto de productos del VIH-1 es conocida, al ser una diversidad de secuencias de conjunto de productos modificadas. Véase, por ejemplo, la Patente US 5.927.596, y R. Scheider et al., J. Virol., 71(7): 4892-4903 (Julio de 1997).
En otra realización deseable, la invención proporciona un procedimiento para inducir preferencialmente una respuesta de la célula CD8+ T a una proteína asociada a un tumor específica para una malignidad seleccionada, mediante el suministro de un adenovirus de simio recombinante, que comprende una proteína asociada al tumor, a un sujeto. Tal proteína incluye oncogenes celulares tales como ras o p53 mutados.
En otra realización, la invención proporciona un procedimiento para inducir preferencialmente una respuesta de la célula CD8+ T a una proteína asociada a un tumor específica para una malignidad seleccionada, mediante suministro de adenovirus de simio recombinante que comprende una proteína asociada al tumor, al sujeto.
Todavía otra realización deseable incluye el suministro de un adenovirus de simio recombinante que comprende una proteína derivada del virus del papiloma humano para la prevención de la infección con el mismo, y para el tratamiento y la profilaxis de las condiciones asociadas. Por ejemplo, la proteína puede ser seleccionada en el grupo consistente en E6, E7 y/o L1 (Seedorf, K. et al. Virol. 145: 181-185 (1985)). Cuando la condición es una infección de virus sincitial respiratorio, la proteína se elige en el grupo consistente en glico- (G) proteína y proteína de fusión (F), cuyas secuencias están disponibles en GenBank.
Los ejemplos que siguen se proporcionan para ilustrar la invención y no limitan el alcance de la misma. Un experto en la materia podrá apreciar que aunque se mencionan reactivos y condiciones específicas en los ejemplos que siguen, se pueden realizar modificaciones que se entienda que están abarcadas por el espíritu y el alcance de la invención.
Ejemplo 1 Creación de un vector suprimido en E1 en base a adenovirus C68 de Chimpancé
Una versión defectiva de replicación del C68 fue aislada para su uso en transferencia de gen. Se persiguió la estrategia clásica de crear un recombinante con E1 suprimido, mediante recombinación homóloga en una en una línea celular de expresión de E1. La primera etapa consistió en la creación de un plásmido que contenía m.u. de 0 a 3, seguido de la adición de un minigén que una proteína fluorescente verde (GFP) intensificada a partir de un promotor de CMV y de una secuencia de C68 que se extiende sobre 9-16,7 m.u. Este plásmido linealizado fue co-transfectado en una línea celular de expresión de E1 con plásmido Ssp I-digerido C68 (SSpi corta en 3,6 m.u. dejando 4644 bp para recombinación homóloga). Los experimentos fueron realizados inicialmente con 293 células que albergan E1 a partir de Ad5 humano con la esperanza de que esto sería suficiente para la transcomplementación. En efecto, se formaron placas que representaban el recombinante deseado. El vector resultante se denominó C68-CMV-GFP.
La estrategia de generar recombinantes fue modificada para permitir una insolación eficiente y rápida de recombinantes. En primer lugar, el ADN de fosfatasa alcalina del vector lanzadera inicial fue reemplazado por un gen GFP procariótico impulsado por el promotor procariótico a partir de IacZ. Esto permitió una selección eficaz de las transformaciones bacterianas cuando se intentó incorporar una unidad transcripcional del conjunto II de ARN eucariótico en el vector lanzadera. La transformación resultante puede ser seleccionada para expresión de GFP; las colonias blancas son recombinantes, mientras que las colonias grises son plásmido parental residual.
Se ha utilizado una selección verde-blanca para seleccionar los productos de cotransfección para el aislamiento de recombinantes Ad5 humanos (A.R. Davis et al., Gene Thera., 5: 1148-1152 (1998)); ésta fue adaptada al sistema C68. El vector lanzadera inicial fue revisado para incluir secuencias 3' ampliadas, de entre 9 y 26 MU. Este vector fue cotransfectado con ADN viral procedente del aislado C68-CMV-GFP original que ha sido restringido con Xba.I, que corta a 16,5 MU permitiendo 9,5 Kb de solapamiento para recombinación homóloga. Las placas resultantes fueron seleccionadas bajo un microscopio fluorescente de contraste de fase respecto a los aislados no fluorescentes que representan los recombinantes deseados. Esto simplificó significativamente la selección en comparación con los procedimientos estándar basados en expresión de estructura o de transgén.
A. Plásmido Lanzadera
Para construir un vector lanzadera de plásmido, para la creación de virus C68 recombinante, el plásmido pSP72 (Promega, Madison, WI) fue modificado por digestión con BgI II, seguido de un relleno de los extremos con enzima Klenow (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) y ligación con un ligante Pac I de 12 bp sintético (New England Biolabs, Beverly, MA) para producir pSP72-Pac. Una unidad de mapeo que se extiende sobre el fragmento Pac I/SnaB I de 456 bp (m.u. o MU) 0-13 del genoma C68, fue aislada a partir de plásmido pNEB-BamE que contenía el fragmento BamHI E del genoma C68, y clonada en Pac I y EcoR V, tratada con pSP72-Pac para producir pSP-C68-MU 0-1,3. Un casete de minigén consistente en el promotor prematuro del citomegalovirus que impulsa IacZ con una señal poly A de SV40, fue separado a partir de pCMV \beta (Clontech, Palo Alto, CA) como un fragmento EcoRi/SaII de 4,5 kb, y ligado a pSP-C68-MU 0-1,3 restringido con el mismo grupo de enzimas, dando como resultado pSP-C68-MU 0-1,3-CMVLacZ.
Para la etapa inicial en el aislamiento de la región del 9-16,7 MU del C68, ambos pGEM (Promega, Madison, MI) y pBS-C88-BamF fueron doblemente digeridos con enzimas BamHI y Sph I. A continuación, el fragmento de 293 bp del pBS-C68-BmF fue ligado con el elemento principal del pGEM-3Z para formar pGEM-C68-MU 9-9,8. Un fragmento de 2,4 kb, que incluye el MU 9,8-16,7 de C68, fue obtenido a partir del clon pBS-C68 BamHB tras digestión de Xbal, reacción de rellenado y posterior tratamiento de BamHI, y clonado en pGEM-C68-MU 9-9,8 doble digerido BamHI/SmaI para generar pGEM-C68-MU 9-16,7. La región de C68 9-16,7 m.u. fue aislada del pGEM-C68-MU 9-16,7 por digestión con EcoRI, rellenado de los extremos con enzima Klenow (Boehringer Mannheim, Indianápolis, IN), ligación de un ligante HindIII sintético de 12 bp, y después digestión con HindIII. Este fragmento de 2,7 que se extiende sobre el C68 MU 9-16,7, fue clonado en el sitio HindIII del pSP-C68-MU 0-1,3-CMVIacZ para formar el plásmido pC68-CMV-LacZ de lanzadera final. Adicionalmente, un fragmento de cADN de fosfatasa alcalina (AP) de 820 bp fue aislado a partir de pAdCMVALP (K.J. Fisher et al., J. Virol. 70: 520-532 (1996)) intercambiado respecto a los sitios IacZ y Not I del pC68-CMV-IacZ, dando como resultado pC68-CMV-AP.
B. Construcción de Virus Recombinante
Para crear un vector de C68-CMVEGFP recombinante suprimido en E1, se construyó en primer lugar un plásmido lanzadera de pC68-CMV-EGFP sustituyendo el transgén IacZ en el pC68-CMV-IacZ por el gen de la proteína fluorescente verde intensificada (EGFP). El proceso de clonación de sustitución fue llevado a cabo como sigue. Un sitio de restricción NotI adicional, fue introducido en el extremo 5' de la secuencia de codificación de EGFP en el pEGFP-1 (Contech, Palo Alto, CA) mediante digestión de BamHI, reacción de rellenado y ligación de un ligante NotI sintético (NEB) de 8 bp. Tras la restricción NotI de ambas construcciones, la secuencia de EGFP fue aislada del pEGFP-1 modificado, y utilizada para reemplazar el gen IacZ en el pC68-CMV-IacZ. La construcción de pC68-CMVEGFP (3 \mug) fue co-transfectada con ADN genómico de C68 digestado de Ssp-I en 293 células, para recombinación homóloga según se ha descrito anteriormente (G. Gao, et al., J. Virol. 70: 8934-8943 (1996)). Placas verdes, visualizadas mediante microscopio fluorescente, fueron aisladas durante 2 rondas de purificación de placa, expansión y purificación mediante sedimentación de gradiente de CsCI (G. Gao, et al., mencionado anteriormente).
En un intento de aplicar el proceso de selección del verde/blanco conveniente (A.R. Davis, et al., Gene Thera. 5: 1148-1152 (1998)) a la construcción de vectores C68 recombinantes, un fragmento de 7,2 kb que se extiende sobre 9 a 36 MU, fue aislado del plásmido pBSC68-BamB mediante tratamiento con endonucleasas de restricción AgeI y BsiwI, y clonado en sitios Asp718 y AgeI del plásmido lanzadera de pBSC68-CMV-AP, dando como resultado un nuevo plásmido denominado pC68CMV-AP-MU36. Se realizó una modificación adicional para extraer de 26 a 36 m.u. del pC68CMV-AP-MU36 mediante digestiones de Eco47III y NruI. El nuevo plásmido lanzadera conocido como pC68CMV-AP-MU26 tiene una región más corta para la recombinación homóloga (es decir, 16,7-25 MU) 3' en el minigén. Para realizar un vector C68 recombinante, la fosfatasa alcalina (AP) se sustituye por el gen de interés. La construcción de pC68CMV-Nugene-MU26 resultante es co-transfectada con ADN viral de C68-CMVGFP de Xba I (16,5 MU) en 293 células, seguido de un solapamiento de agar superior. Las placas de virus recombinante (blancas) son generadas por medio de recombinación homóloga en la región de 16,7-26 MU que es compartida entre la construcción pC68CMV-Nugene y el elemento principal viral del C68; los recombinantes que forman placas blancas se eligen a partir de placas verdes de virus C68-CMVGFP sin seccionar.
El mecanismo de selección verde/blanco fue introducido también en el proceso de clonación del gen de interés en el plásmido lanzadera pC68. El gen AP en ambos pC68CMV-AP-MU36 y pC68CMV-AP-MU26 fue sustituido con un casete de gen GFP procariótico impulsado por el promotor LacZ aislado a partir de pGFPMU31 (Clontech, Palo Alto, CA). De ese modo, las colonias blancas de transformantes bacterianos contendrán el plásmido el plásmido recombinante. Este proceso de selección de verde/blanco para las colonias bacterianas evitó la necesidad de realizar y caracterizar grandes cantidades de ADNs mini-preparados y de ese modo incrementar además la eficacia en cuanto a la creación de vectores de C68 recombinantes.
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Ejemplo 2 Expresión de Antígeno (Sección de obstrucción) en Células TK^{-} infectadas con Formaciones de Vacuna de Adenovirus de Simio
Se construyeron recombinantes adenovirales de la cepa 68 de chimpancé (Adchimp68) y de la cepa 5 humana (Adhu5) que portan una versión modificada de secuencia nucleótida de una forma truncada del gen de obstrucción de clase B del VIH-1, según se ha descrito (en el Ejemplo 1 y por Z.Q. Xiang, et al., Virol. 219, 200 (1996)). Lo transcriptos de proteínas estructurales de VIH-1, que incluyen obstrucción contienen elementos de inestabilidad genética, que requieren la presencia de proteína rev para exportación nuclear y expresión eficiente en el citoplasma (S. Schwartz et al., J. Virol. 66, 7176 (1992); S. Schwartz, et al., J. Virol. 66, 150-159 (1992); G. Nasioulas et al., J. Virol. 68, 2986 (1994)). Los adenovirus se basan en transcripción nuclear y por ello requieren rev para expresión de proteínas de VIH-1. Para evitar la dependencia Rev, una secuencia de obstrucción modificada con codón de la que se habían eliminado los elementos de inestabilidad genética por mutagénesis dirigida al sitio (R. Schneider et al., J. Virol. 71, 4892 (1997); S. Schwartz et al., J. Virol. 66, 7176 (1992); S. Schwartz, et al., J. Virol. 66, 150 (1992)), fue insertada en el vector adenoviral. El gen introducido codifica la proteína de obstrucción p37 truncada (regiones p17 y p24). La proteína de obstrucción truncada no forma partículas virales y es secretada parcialmente en el sobrenadante de células humanas transfectadas (R. Schneider et al., J. Virol. 71, 4892 (1997)). Las construcciones de obstrucción mutadas han sido utilizadas en experimentos de vacunación y han dado como resultado la generación de respuestas inmunes celular y humoral en el ratón y en los primates (J.T. Qiu et al., J. Virol. 73, 9145 (1999)).
El Adchimp68 y el Adhu5 recombinantes fueron generados y propagados sobre 293 células transfectadas con el E1 de adenovirus de la cepa 5 humana. Los inventores han encontrado que el heterólogo E1 es adecuado complementar los recombinante del virus Adchimp68 suprimidos en E1, reduciendo de ese modo el riesgo de recombinación y de reversión en virus de tipo salvaje competentes para replicación.
Se analizó la presencia de proteína de obstrucción en sobrenadantes de cultivo de TK^{-} mediante manchado Western, utilizando anticuerpos monoclonales de ratón para la obstrucción. Células TK^{-} (1 x 10^{6}) fueron infectadas durante 48 horas con virus Adhu5gag37 o Adchimp68gag37 (10 pfu por célula). Células TK^{-} adicionales fueron infectadas con una construcción de Adhu5 o una de Adchimp68 que expresa la glicoproteína del virus de la rabia. Las proteínas presentes en el sobrenadante fueron separadas sobre un gel de poliacrilamida desnaturalizante al 12%, y transfectadas mediante electro-manchado a una membrana PVDF. La mancha fue teñida con el anticuerpo monoclonal 183-H12-5C para p24 del VIH-1 (B. Shelcebro, et al., J. Virol. 66: 6547 (1992)).
Los dos clones recombinantes adenovirales (Adhu5gag37, Adchimp68gag37) portadores de esta secuencia modificada de obstrucción, expresaron el producto transgén a niveles comparables según se muestra mediante análisis Western Blot. Una proteína del tamaño esperado (37 kDa) que estaba enlazada a un anticuerpo monoclonal para obstrucción de VIH-1, fue detectada en el sobrenadante de células TK^{-} infectadas con 10 unidades de formación de placa (pfu) de cualquier recombinante de obstrucción de adenovirus. Las células de control infectadas con glicoproteína de expresión de recombinante de Adhu5 o Adchimp68 del virus de la rabia (Adhusrab.gp y Adchimp68.gp) dejaron de producir esta proteína.
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Ejemplo 3 Inducción de respuestas de la célula CD8^{+} T para obstrucción en mamíferos mediante Adenovirus de Simio
El experimento que sigue demuestra que los esplenocitos de ratón inyectados intramuscularmente (i.m.) tanto con el recombinante Adgu5gag37 como con el Adchimp68gag37, respondieron a un epítope inmunodominante (B. Doe y C.M. Walker, SIDA 10, 793 (1986)) de la proteína gag mediante liberación de citoquina, es decir, interferón (IFN)-\gamma, así como mediante lisis celular objetiva.
A. Ensayo de Liberación de Citoquina
Grupos de 3 ratones Balb/c fueron inmunizados i.m. con 2 x 10^{5}, 2 x 10^{6} ó 2 x 10^{7} pfu de virus Adchimp68gag37, 2 x 10^{6} pfu de virus Adhu5L1 (H.C.J. Ertl, et al., J. Virol. 63: 2885 (1989)), 2 x 10^{6} pfu de virus Adhu5 gag37, o 2 x 10^{7} pfu de virus VVgag. Se probaron esplenocitos en cuanto a respuesta de célula CD8^{+} T para obstrucción 10 días más tarde. Para la producción de citoquina del ensayo (IFN-\gamma), se cultivaron esplenocitos (1 x 10^{6}/muestra) durante 5 horas a 37ºC con 3 \mug/ml del péptido AMQMLKETI (SEQ ID núm. 1) que porta el epítope inmunodominante de célula CD8^{+} T para el halotipo H-2^{d}, y 1 \mug/ml de Brefeldin A (GolgiPlug, PharMingen, San Diego, CA) en 96 pocillos de microtítulo de fondo de pocillo redondo en un medio Eagles modificado Dulbeccos (DMEM) suplementado con un 2% de suero bobino fetal (FBS) y 10^{-6} M de 2-mercaptoetanol. Las células fueron lavadas con PBS e incubadas durante 30 minutos a 4ºC con un anticuerpo etiquetado como FITC en CD8 de murina. Las células fueron lavadas y permeabilizadas en 1X Cytofix/Cytoperm (PharMingen) durante 20 minutos a 4ºC. Las células fueron lavadas 3 veces con Perm/Wash (PharMingen) e incubadas en la misma solución tampón durante 30 minutos a 4ºC con un anticuerpo etiquetado como PR en murina IFN-\gamma. Tras el lavado, las células fueron examinadas mediante colorimetría de flujo de dos colores, y los datos fueron analizados mediante software WinmDi. El número de la esquina de la derecha muestra el porcentaje de células CD8^{+} sobre todas las células CD8^{+} T que se tiñeron en positivo para el INF-\gamma.
De siete a diez días después de una inmunización simple, una fracción ajustable en tamaño de la población completa de células CD8^{+} T esplénicas, produjeron IFN-\gamma en respuesta al péptido de obstrucción. Los esplenocitos primarios ensayados sin expansión in vitro adicional, lisaron células objetivo compatibles con H-2, pre-tratadas con el péptido de obstrucción. La actividad de la célula CD8^{+} T específica de obstrucción, fue superior tras la inmunización con la formación Adchimp68, lo que consiguió frecuencias de célula CD8^{+} T para la obstrucción de \sim16-19% de la población completa de células CD8^{+} esplénicas. La respuesta fue dependiente de la dosis, según se ha representado para el virus Adchimp68gag37, en el que una dosis baja de 2 x 10^{5} pfu de virus todavía elicitó frecuencias de alrededor de un 10%. El recombinante de Adhu5gag37 indujo frecuencias óptimas de \sim9% a 2 x 10^{6} pfu. Estas frecuencias no se incrementaron significativamente tras el incremento de la dosis de esta vacuna (datos no representados). Un recombinante de virus de vacuna que expresa una obstrucción de longitud completa (VVgag, designado como vDK1 en S. Chacarabarti et al., Mol. Cell. Biol. 5, 3403 (1985)), estimuló frecuencias más bajas de células CD8^{+} T mediante teñido de citoquina intracelular.
B. Lisis de células objetivo
Los esplenocitos de ratones inmunizados 10 días antes con una dosis única de los recombinantes adenovirales según se ha descrito en A, o con dos dosis del recombinante Wgag, suministrado el primero i.m. seguido 2 semanas más tarde de una inyección intraperitoneal, fueron probados en un ensayo de liberación de ^{51}Cr de 5 horas a relaciones variadas de efector respecto a objetivo, sobre 1 x 10^{4} células P815 que habían sido tratadas durante 16-24 horas a temperatura ambiente con el péptido para obstrucción (cuadrados rellenos) o bien con el péptido de control 31D(X) delineado a partir de la secuencia de la nucleoproteína del virus de la rabia (H.C.J. Erti et al., J. Virol. 63: 2885 (1989)). Se necesitaron dos inmunizaciones con la vacuna de Wgag para inducir citolisis primaria detectable específica de obstrucción mediada por célula T.
C. Cinética de la respuesta de célula CD8^{+} T a la obstrucción
Grupos de 4 ratones Balb/c fueron inmunizados con 5 x 10^{6} pfu de virus Adhu5gag37 o Adchimp68gag37. Se cultivaron esplenocitos 6-12 días después y se probaron en cuanto a producción de IFN-\gamma y lisis de células objetivo. La cinética de la respuesta de célula CD8^{+} T a obstrucción inducida por los dos recombinantes de adenovirus, fue diferente. La respuesta a la obstrucción presentada por el virus Adhu5gag37 presentó un pico 2-4 días más pronto que la respuesta de célula CD8^{+} T al recombinante de Adchimp68gag37.
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Ejemplo 4 Efecto de la Exposición Anterior a Vacuna de Adenovirus Humano sobre Adenovirus de Simio
Para estudiar el impacto de la exposición previa a la cepa 5 humana común de adenovirus, los ratones fueron inmunizados con una sola dosis de un recombinante de Adhu5 que expresa un antígeno irrelevante (virus L1 del papiloma humano). Dos semanas más tarde, los ratones fueron vacunados con vacuna ya sea de Adhu5gag37 o ya sea de Adchimp68gag37.
De manera más particular, los ratones fueron inmunizados i.m. con 10^{8} pfu de la vacuna de Adhu5L1. Dos semanas más tarde, los ratones inmunes con Adhu5 y también los ratones sin afectación natural, fueron inyectados con 2 x 10^{6} pfu de recombinantes de Adhu5gag37 o de Adchimp68gag37 (4-5 ratones por grupo). Los grupos adicionales de ratones inmunes por Adhu5hL1 o sin afectación natural, fueron inmunizados con 2 x 10^{6} pfu del virus Adhu5gag37 o del Adchimp68gag37. Nueve días después fueron inyectados intraperitonealmente con 10^{6} pfu de un recombinante de virus de vacuna que expresó obstrucción de la longitud completa. Los ratones fueron sacrificados cinco días después de la inyección del virus de vacuna.
Los ratones pre-inmunes al virus Adhu5, fallaron en cuanto a respuesta a obstrucción después de la vacunación con la vacuna Adhu5gag37. Los mismos mostraron frecuencias de células CD8^{+} T específicas de obstrucción, similares a las apreciadas en los ratones de control y en consecuencia, sus esplenocitos fallaron en cuanto a obstrucción de lisis que expresaron las células objetivo. Por el contrario, la respuesta de la célula CD8^{+} T solamente se redujo ligeramente en ratones Adhu5-inmunes vacunados con la construcción Adchimp68gag37. Las frecuencias de las células CD8^{+} T para la obstrucción, se redujeron solamente en \sim30%, y la actividad citolítica de los esplenocitos fue rebajada solamente en \sim5% comparando relaciones diferentes de efector con respecto a célula objetivo.
De ese modo, ambos recombinantes adenovirales inducen frecuencias de células CD8^{+} T respecto a obstrucción, que superan las inducidas por vacunas descritas anteriormente tales como recombinantes de ADN sin protección o de poxivirus (S. Schwartz, et al., J. Virol. 66, 150-159 (1992)). Las frecuencias fueron también más altas que las apreciadas generalmente en individuos infectados crónicamente (D.H. Barouch et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97, 4192 (2000); T.U. Vogel et al., J. Immunol. 164, 4968 (2000); P.A. Goepfert et al., J. Virol. 74, 10249 (2000); C.R. Rinaldo Jr, et al. AIDS Res. & Hum. Retr. 14: 1423 (1998)). Estos resultados enfatizan el poder de las vacunas recombinantes adenovirales.
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Ejemplo 5 Efecto de Imprimación e Intensificación de células CD8^{+} T frente a Antígeno
Los esplenocitos primarios de las células de ratones Adhu5-inmunes o sin afectación natural, inmunizados con 2 x 10^{7} pfu de virus Adhu5gag37 o Adchimp68gag37, fueron comparados con los esplenocitos de ratones sin afectación natural o Adhu5 inmunes vacunados con 2 x 10^{6} pfu de virus Adhutgag37 o Adchimp68gag37, y a continuación intensificados con 10^{6} pfu de virus VVgag. Los esplenocitos fueron analizados 5 días más tarde en cuanto a CD8 e IFN-\gamma intracelular. Estos ensayos se realizaron esencialmente según se ha descrito en lo que antecede, con la excepción de que no existió ningún cultivo adicional in vitro para lisis de células P815 tratadas con péptido de obstrucción o con el péptido 31D de control en un ensayo de 5 horas de liberación de ^{51}Cr.
Con la imprimación o inmunización intensificadora con una construcción de vacuna heteróloga, el recombinante VVgag falló en cuanto a restablecer la respuesta celular de la CD8 T respecto a obstrucción, presentada por la vacuna recombinante de Adhu5. Aunque los animales vacunados con Adhu5 intensificada con Adhu5gag37 y VVgag mostraron como mucho un 7,1% de células CD8^{+} T esplénicas para producir respuesta IFN-\gamma-in a la obstrucción de estas células CD8^{+} T, carecieron completamente de actividad cíclica frente a las células objetivo que presentan obstrucción. Estos resultados indican que la pre-exposición a los antígenos del portador de vacuna no sólo no tuvo una influencia cuantitativa sino tampoco cualitativa sobre la respuesta de la célula CD8^{+} T al producto transgén del recombinante adenoviral. La respuesta de célula CD8^{+} T a obstrucción en ratones inmunes por Adh5 vacunados con Adchimp68gag37 mostraron un efecto intensificador tras una inmunización con VVgag similar a la apreciada en ratones naturales.
Las frecuencias de las células CD8^{+} T para la obstrucción, así como también la lisis primaria de la célula objetivo, pudieron ser aumentadas mediante imprimación adicional (no representada) o intensificación con un portador de vacuna heteróloga, tal como el recombinante VVgag. Tras la imprimación i.m. con los recombinantes adenovirales, seguida 9 días más tarde por una inmunización intensificadora i.p. con el VVgag, se analizaron células CD8^{+} T específicas de obstrucción 5 días después de la imprimación, comprendiendo \sim40% de la población completa de células CD8^{+} esplénicas.
La inmunidad preexistente al Adhu5, redujo severamente la eficacia de la vacuna Adhu5gag37, pero solamente redujo ligeramente la respuesta de la célula CD8^{+} T al virus Adchimp68gag37. Previamente se informó de que los ratones inmunizados respecto al virus Adhu5 desarrollaron una respuesta de célula B reducida a la vacunación con una vacuna de Adhu5 respecto al virus de la rabia. Incrementando la dosis de la vacuna o utilizando una vacuna de ADN que exprese el mismo antígeno del virus de la rabia, se pudo evitar fácilmente el efecto tamponador de la pre-exposición al virus Adhu5 (Z.Q. Xiang, et al., J. Immunol. 162, 6716 (1999)).
Por el contrario, la respuesta de célula CD8^{+} T a la obstrucción presentada por la vacuna de recombinante Adhu5 fue establecida en ratones inmunes por Adhu5 y solamente pudo ser restablecida parcialmente mediante inmunizaciones adicionales con una vacuna heteróloga en cuanto a obstrucción. Esto puede indicar una inducción de células CD8^{+} T que es más susceptible de interferencia por circulación de anticuerpos neutralizantes del virus en comparación con las células B de estimulación.
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Ejemplo 6 Producción de Adenovirus Recombinantes que Contienen Glicoproteína de la Rabia
Los adenovirus de los serotipos 2, 4, 5, 7, 12 humanos y del serotipo 68 del chimpancé, fueron propagados y titulados sobre 293 células humanas. Los adenovirus recombinantes basados en el serotipo 5 humano que expresan la glicoproteína del serotipo ERA del virus de la rabia o la proteína L1 del virus del papiloma humano (HPV)-16, han sido descritos previamente (Z.Q. Xiang, et al., Virology 219: 220-227 (1996); D.W. Kowalcyk, et al. (2001), Régimen de vacuna para prevención de infecciones transmitidas sexualmente con el tipo 16 de virus del papiloma humano. Vacuna). Un sistema de expresión basado en adenovirus del serotipo 68 del chimpancé fue desarrollado según se ha descrito en el Ejemplo 1.
Los adenovirus fueron propagados sobre 293 células E1 (derivadas del serotipo 5 humano) transfectadas (F.L Graham, et al., J. Gen. Virol. 36: 59-74 (1997)). Los virus fueron cultivados mediante congelación-licuación de las células. Para algunos experimentos, el virus fue purificado mediante purificación de gradiente de CaCl. Para otros experimentos, se utilizó el sobrenadante clarificado de las células infectadas necrotizado mediante tres rondas de congelación-licuación. Los virus fueron titulados sobre 293 células para determinar unidades de formación de placa (pfu).
El recombinante adenoviral del serotipo 68 del chimpancé que expresa la glicoproteína del virus de la rabia, denominado Adchim68rab.gp, fue generado en 293 células transfectadas con el E1 del serotipo 5 humano de adenovirus, según se describe con mayor detalle en este ejemplo. Los clones virales fueron protegidos inicialmente mediante inmunofluorescencia indirecta con el anticuerpo monoclonal 509-6 respecto a un epítope, de conformación dependiente, de la glicoproteína del virus de la rabia. Tras la selección de un sub-clon adenoviral estable, la expresión de la glicoproteína del virus dela rabia de longitud completa por el virus Ad.chimp68rab.gp en células TK- infectadas, fue confirmada por inmunoprecipitación, según se describe en el ejemplo que sigue.
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Ejemplo 7 Expresión del producto transgén por los recombinantes adenovirales
Este ejemplo muestra que el virus Adhu5 consiguió niveles marcadamente más elevados de expresión de glicoproteína del virus de la rabia en células TK^{-}, en comparación con la construcción Adchimp68. Los niveles de transcripción para este transgén paralelizaron la expresión de proteína indicando que la diferencia no estaba relacionada con las diferencias den las modificaciones post-traslacionales. Las células TK^{-} son CAR positivas, y las proporciones de transducción de los serotipos virales pueden ser así comparables.
Para su uso en estos experimentos, las células de mamífero, es decir, 21 células de riñón de cría de hámster (BHK), 293 células E1 transfectadas y células TK^{-}, fueron propagadas en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con glutamina, Napyrovate, aminoácidos no esenciales, tamponador HEPES, antibiótico y 10% de suero bovino fetal (FBS).
A. Inmunoprecipitación
Células TK^{-} (10^{6} por muestra) fueron infectadas con 5 pfu por célula, ya sea de glicoproteína del virus de la rabia que expresan recombinantes adenovirales, o ya sea construcciones de control que expresan un antígeno viral no relacionado. Después de 48 horas, las células fueron lavadas dos veces con solución salina tamponada de fosfato estéril (PBS), y después incubadas durante 90 minutos en un medio libre de suero con anterioridad a la adición de 20 \mul de cisteína etiquetada como ^{35}S y metionina (Promix, NEN, Boston, MA). Después de 4 horas de incubación, las células fueron lavadas con PBS y tratadas a continuación con 1 ml de inhibidores de proteasa que contenían tamponador RIPA. Las células y los detritos celulares, fueron extraídos desde los pocillos, agitados brevemente y centrifugados durante 2 minutos a 12.000 rpm. El sobrenadante fue incubado durante 90 minutos a 4ºC con 15 \mul/ml de fluido ascítico que contenía el anticuerpo monoclonal 509-6 en la glicoproteína del virus de la rabia. Se añadió proteína Sefarosa G a razón de 75 \mul por muestra, y se incubó a 4ºC bajo agitación suave durante 30 minutos. Las muestras fueron peletizadas por centrifugación y lavadas 4 veces con tamponador RIPA. Las bolitas fueron suspendidas en 80 \mul de tamponador de carga, hervidas durante 4 minutos. A continuación se extrajeron muestras (20 \mul) sobre gel SDS-poliacrilamida (PAGE) al 12%, en comparación con un peso molecular estándar. Los geles fueron secados sobre papel filtro, los cuales fueron expuestos durante 48 horas a una Película Kodak de Obtención Científica de Imágenes (X-Omat Blue XB-1).
El recombinante Adchimp68rab.gp expresó una proteína del tamaño esperado que estaba enlazada al anticuerpo 509-6. El precipitado de células TK^{-} infectadas con el virus Adhu5rab.gp mostró una banda de tamaño idéntico que carecía de lisatos procedentes de células infectadas con recombinantes adenovirales que expresan un producto transgén no relacionado. La expresión de la glicoproteína del virus de la rabia fue más pronunciada en células infectas con la construcción Adhu5rab.gp. La diferencia de expresión del producto transgén puede reflejar eventos pre-traslacionales tales como diferencias en absorción viral, velocidad de transcripción o estabilidad de transcripción. Alternativamente, las diferencias traslacionales o post-traslacionales tales como distintas modificaciones de cadena lateral pueden dar como resultado diferencias cuantitativas en la proteína serológicamente detectable.
Para distinguir mejor entre estas dos posibilidades, el ARN total fue aislado de las células TK^{-} infectadas con cualquiera de los recombinantes adenovirales. El mARN transcripto inverso en la glicoproteína del virus de la rabia y en un gen de administración, fue amplificado mediante una PCR en tiempo real, realizada según se describe en la parte B.
B. Transcripción inversa en tiempo real - reacción de cadena de polimerasa (PCR)
Las monocapas confluentes de células TK^{-} fueron infectadas en muestras duplicadas con 10 pfu de cualquiera de los recombinantes adenovirales. Las células fueron aisladas 24 horas después y el ARN fue extraído con el reactivo TRI de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Mol. Res. Center, Cincinnati, OH). El ARN fue tratado con ADNasa libre de ARNasa, purificado mediante extracción de fenol, y ajustado a 50 ng de ARN por muestra. El ARN transcripto inverso y amplificado con el kit SYBR verde de Light Cycler-amplificación de ARN (Roche, Mannheim, Alemania; Z. He, et al., Virology 270: 146-1617 (2000)), utilizando imprimadores para la glicoproteína del virus de la rabia (SEQ ID núm. 2: 5' AA GCA TTT CCG CCC AAC AC; SEQ IN núm. 3: 3' GGT TAG TGG AGC AGT AGG TAG A) y el gen de administración deshidrogenasa de glutaraldehído-3-fosfato (GAPDH (SEQ ID núm. 4; 5' GCT GAA GGT CGG TGT GAA CGG ATT T; SEQ ID núm. 5: 3' AAT GCC AAA GTT GTC ATG GAT GAC C).
Los datos de la Tabla 1 proporcionan los resultados. Los datos muestran los valores medios para mediciones duplicadas \pm SD.
TABLA 1
1
Según se muestra mediante estos datos, los transcriptos del transgén ajustados a los del gen de gobierno mostraron una diferencia cuantitativa comparable a la de la proteína detectable serológicamente.
En datos no proporcionados en este ejemplo, otros dos recombinantes de Adchimp68 que expresan la proteína fluorescente verde y una proteína de obstrucción truncada modificada por codón del virus-1 de inmunodeficiencia humana fueron comparados con los recombinantes Adhu5 que expresan los mismos productos de transgén, mostraron niveles equivalentes de expresión de proteína en células TK^{-}. A partir de todo esto, se ha podido concluir que la expresión reducida de la glicoproteína del virus de la rabia por el virus Adchimp68 no refleja ninguna diferencia ni en la captación viral ni en la proporción de transcripción, que en ambas construcciones están reguladas por los mismos elementos de control.
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Ejemplo 8 Inmunización de ratones utilizando un antígeno del virus de la rabia
La respuesta del anticuerpo específico del virus de la rabia al virus de obstrucción Ad.Chimp68rab.gp fue comparada con la del virus Adhu5rab.gp en cepas endogámicas y exogámicas de ratón. Los ratones fueron inyectados con diluciones serie de cualquiera de los recombinantes s.c. o i.n. dados. Se cultivaron sueros durante 14 días y se pr4obaron en cuanto a anticuerpos para la glicoproteína del virus de la rabia mediante un ensayo ELISA y de neutralización de virus. Los recombinantes adenovirales que expresan un transgén no relacionado, es decir, la obstrucción del VIH-1 (descrito en los Ejemplos anteriores), fueron utilizados como controles. Estos recombinantes fallaron en cuanto a la inducción de una respuesta de anticuerpo al virus de la rabia detectable mediante cualquier ensayo. Una discusión más detallada de este estudio y de los resultados se expone a continuación.
Ratones hembra C3H/He y C57B1/6 de 6-8 semanas de edad, fueron adquiridos en Jackson Laboratory, Bar Harbor Maine. Los ratones ICR de exogamia fueron adquiridos en Charles River (Wilmington, MA).
Los ratones fueron inyectados con dosis variadas de adenovirus o de recombinantes adenovirales proporcionados en 100 \mul de solución salina, subcutáneamente (s.c.) o en 50 \mul intranasalmente (i.n.). Los ratones fueron estimulados con virus de la rabia de la cepa CVS-11 proporcionado en 10 dosis medias letales (LD_{50}) intracerebralmente (i.c.). Los virus de la rabia de la cepa Evelyn Rokitniki -Abelseth (ERA) y de la cepa Challenge Virus Standar (CVS)-11 fueron propagados sobre células BHK-21. El virus ERA fue purificado sobre gradiente de sacarosa, desactivado mediante tratamiento con betapropionolactona, y ajustado a una concentración de proteína de 0,1 mg/ml. El virus CVS-11 fue titulado sobre células BHK-21 y mediante inyección intracerebral de ratón ICR adulto (Z.Q. Xiang, Z.Q. & H.C. Ertl, J. Virol. Meth. 47: 103-16 (1994)). Tras la estimulación, los ratones fueron comprobados cada 24-28 horas durante al menos 21 días. Los ratones fueron sacrificados una vez que desarrollaron parálisis completa de las patas traseras, lo que es indicativo de encefalitis terminal del virus de la rabia.
Los ensayos serológicos incluyeron un ensayo inmunoadsorbente enlazado por enzima (ELISA), perfil isotipo de anticuerpos, y ensayos de neutralización de virus.
A. ELISA
Los ratones Los ratones fueron sangrados a intervalos de tiempo variados tras la inmunización, mediante punción retro-orbital. Se prepararon sueros y se probaron respecto a anticuerpos para el virus de la rabia sobre placas recubiertas con 0,1 \mug/pocillo de virus de la rabia inactivado. Los sueros fueron probados en cuanto a anticuerpos para adenovirus sobre placas recubiertas con 0,1 \mug/pocillo de recombinantes de adenovirus suprimido en E1 respecto a GPF del serotipo 5 humano o del serotipo 68 de chimpancé. Se realizaron ELISASs básicamente según se ha descrito anteriormente (Z.Q. Xiang, et al., Virología 219, 220-227 (1996)). Las placas fueron recubiertas durante toda la noche. A continuación fueron bloqueadas durante 24 horas con PBS que contenía un 3% de albúmina de suero bovino (BSA). Tras un lavado, se añadieron los sueros diluidos en PBS-3% BSA durante 60 minutos. Tras el lavado, se añadió una dilución 1:100 de fosfatasa alcalina e Ig (Capel) conjugado de cabra anti-ratón durante 1 hora sobre hielo. Tras el lavado, se añadió substrato durante 20-30 minutos a temperatura ambiente. La densidad óptica fue leída a 405 nm.
B. Isotipos de Anticuerpos
Los isotipos de anticuerpos para el virus de la rabia fueron determinados mediante un ELISA sobre lacas recubiertas con virus ERA desactivado utilizando el kit Calibiochem Hybridoma Subisotyping (La Jolla, CA), con algunas modificaciones menores descritas anteriormente (Xiang, Virol. 1996, mencionado anteriormente).
El perfil isotipo de los anticuerpos también difería tras inmunización s.c., pero era comparable tras aplicación i.n. de los dos vacunas adenovirales. Ambos recombinantes, tras el suministro a través de cualquier vía de inoculación, extrajeron anticuerpos IgG2a en al antígeno del virus de la rabia.
Ambos recombinantes, tras inmunización i.n., y la vacuna Adhu5rab.gp tras administración s.c., indujeron un pronunciada respuesta IgG1 indicativa de ayuda Th2, lo que faltaba en la respuesta a la construcción Ad.chimp68rab.gp suministrada s.c.
B. Anticuerpos Neutralizantes
Se probaron sueros para anticuerpos neutralizantes para el virus de la rabia de la cepa CVS-11, la cual está relacionada de forma antigénicamente cercana a la cepa ERA (Z.Q. Xiang, et al., Virología, 214: 398-404 (1996)). Se utilizó un suero de referencia WHO para la comparación. Los títulos se han expresado en Unidades Internacionales.
El virus Adchimp68rab.gp proporcionado s.c., indujo una respuesta de células B menos potente al producto transgén en comparación con la construcción Adhu5rab.gp. La diferencia de magnitud de la respuesta anticuerpo, que fue apreciada en todos los momentos comprobados, dependió de la cepa de ratón y fue menos pronunciada en ratones ICR exogámicos que en ratones C3H/He endogámicos. Por el contrario, tras inmunización i.n., ambas vacunas de inmunización indujeron títulos comparables de anticuerpos según se determinó mediante ELISA y mediante ensayo de neutralización de virus.
La pronunciada respuesta Th1 al recombinante Adchimp68rab.gp tras inmunización s.c. que contrasta con la respuesta Th1/Th2 más equilibrada tras la inyección del Adhu5rab.gp argumenta una diferencia en cuanto adyuvanticidad. Tras la aplicación a las vías aéreas, la vía natural de infección para los ambos recombinantes del virus Adhu5 y presumiblemente del virus Adchimp68, indujo títulos de anticuerpo para el producto transgén que eran comparables en cuanto a magnitud y a su perfil isotipo. Esto sugiere que las diferencias postuladas en cuanto a tropismo y/o a adyuvanticidad son dependientes del tejido, es decir, que no aparecen o son menos pronunciadas en las vías aéreas que si en comparación con la subcutánea.
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Ejemplo 9 Inducción Preferencial de Respuesta Celular T Citotóxica con Adenovirus de Chimpancé Recombinante
La protección inducida por vacuna para el virus de la rabia se correlaciona con los anticuerpos de neutralización de virus (VNAs, F.L. Graham, et al., J. Gen. Virol. 36, 59-74 (1977)). Los estudios de la proteína de la rabia fueron así enfocados sobre estimulación de esta rama del sistema inmune. A través de todos los experimentos, los ratones fueron inmunizados con el virus Adchimp68rab.gp y, en paralelo, con el virus Adrab.gp descrito anteriormente basado en el serotipo 5 humano. Dentro de esta aplicación, este recombinante se menciona como virus Adhu5rab.gp.
Ambos recombinantes adenovirales indujeron protección a la estimulación con virus de la rabia. Los ratones C3H/He inmunizados con 5 x 10^{6} pfu de cualquiera de los recombinantes adenovirales proporcionados s.c., se mantuvieron libres de enfermedad cuando se estimularon 3 semanas después con 10 dosis medias letales (LD_{50}) de virus de la rabia de la cepa CVS. Esta cepa de virus de la rabia es relacionado de forma antigénicamente cercana con la cepa ERA pero es más virulento en roedores. A una dosis de vacuna más baja de 5 x 10^{5} pfu, el virus Adhu5rab.gp proporcionó todavía una protección completa, mientras que un pequeño porcentaje de ratones inmunizados con Adchimp68rab.gp sucumbieron a la infección. La reducción adicional de la dosis de vacuna dio como resultado una pérdida de eficacia de la vacuna Adchimp68rab.rab. Tras inmunización i.n., ambas vacunas proporcionaron una protección completa si se suministraban a razón de 5 x 10^{5} pfu. Una dosis más baja de 5 x 10^{4} pfu en un 50% de ratones vacunados con la vacuna Adhu5rab.gp, desarrollaron enfermedad progresiva mientras que los inmunizados con esta dosis del recombinante Adchimp68rab.gp estuvieron protegidos. Todos los ratones inmunizados con recombinantes adenovirales de cualquier serotipo que expresa un antígeno no relacionado o con 5 x 10^{3} pfu de cualquiera de los recombinantes adenovirales para la glicoproteína del virus de la rabia, desarrollaron una encefalitis de la rabia fatal.
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Ejemplo 10 Efecto de Inmunidad Pre-existente a Diferentes Serotipos de Antivirus Humanos en la Respuesta de Anticuerpo al Virus de la Rabia.
Para probar si la pre-exposición a cualquiera de los serotipos comunes de adenovirus humanos (por ejemplo, el serotipo humano 2, 4, 5, 7 y 12) podría inhibir la respuesta de anticuerpo a la vacuna Adchimp68rab.gp, se inmunizaron grupos de ratones C3H/He con 4 x 10^{8} adenovirus competentes de replicación de los serotipos 2, 4, 5, 7 ó 12 humanos, o del serotipo 68 de chimpancé (este último serotipo suprimido en E1). Dos semanas más tarde, los ratones fueron vacunados s.c. con el virus Adhu5rab.gp o con el Adchimp68rab.gp. Se utilizó el recombinante Adhu5rab.gp a una dosificación de 2 x 10^{5} pfu por ratón, el recombinante Adchimp68rab.gp, que se proporcionó s.c., solamente indujo una respuesta de anticuerpo marginal en ratones C3H/He a una dosis tan baja inyectada de 2 x 10 ^{7} pfu por ratón. Se cultivaron sueros durante 2 semanas después y se probaron en cuanto a anticuerpos respecto a la glicoproteína del virus de la rabia mediante un ELISA. La respuesta específica del virus de la rabia para el Adhu5rab.gp fue ligeramente superior en ratones naturales que la deducida respecto al virus Adchimp68. La respuesta al virus Adhu5rab.gp fue completamente inhibida en ratones pre-inmunes de Adhu5. También se apreció alguna reducción en ratones pre-inmunes al adenovirus de los serotipos 4, 2, 7 y 12 humanos. La respuesta no se vio afectada en ratones que habían sido expuestos previamente al virus Adchimp68. La respuesta al virus Adchimp68rab.gp se vio fuertemente inhibida en ratones que eran pre-inmunes al virus homólogo. Los ratones que habían encontrado previamente adenovirus del serotipo 2 humano mostraron una ligera reducción de la respuesta de anticuerpo al antígeno del virus de la rabia presentada por la vacuna de Adchimp68. Los ratones inoculados con cualquiera de los otros serotipos de adenovirus humanos desarrollaron títulos de anticuerpo a la rabia tras el virus Adchimp68rab.gp que eran, o bien de magnitud similar o bien de magnitud incrementada en comparación con los ratones que estaban sin afectación natural con anterioridad a la vacunación. En particular, los ratones pre-inmunes al virus Adhu5 desarrollaron títulos de anticuerpo más altos tras la vacunación con la formación Adchimp68rab.gp que podían reflejar la presencia de células asistentes T de reacción cruzada que promovieron la respuesta de célula B al producto transgén.
Para determinar además si a dosis iguales de vacuna, la vacuna Adchimp68rab.gp inducía títulos de anticuerpo superiores en comparación con el virus Adhu5rab.gp en ratones pre-inmunes al virus Adhu5, se realizó un experimento de titulación de vacuna. Grupos de ratones C3H/He fueron inmunizados s.c. con 4 x 10^{8} pfu de un recombinante adenoviral suprimido en E1 respecto al antígeno L1 de HPV-16. Los ratones fueron vacunados 2 semanas después con virus Adhu5rab.gp o bien con Adchimp68rab.gp suministrados s.c., en dosis variadas. Los ratones fueron desangrados 2 semanas después y se determinaron los títulos de anticuerpo del suero respecto al virus de la rabia mediante un ELISA (no representado) y un ensayo de neutralización de virus. Ningún ensayo mostró una reducción significativa en cuanto a la respuesta de anticuerpo a la construcción Adchimp68rab.gp en ratones Adhu5-inmunes. La severidad de la reducción de títulos de anticuerpo al virus de la rabia presentada por la construcción Adhu5 en ratones pre-inmunes al virus homólogo, dependió de la dosis de vacuna. La respuesta de anticuerpo a dosis más bajas de vacuna se vio más afectada que la respuesta a dosis de vacuna más altas. Los títulos VNA fueron sustancialmente más reducidos que los títulos ELISA. Los títulos de VNAs a la dosis de vacuna más alta fueron la mitad en ratones pre-inmunes al virus Adhu5, mientras que a las dos dosis de vacuna más bajas los títulos se redujeron en más de 20 veces. A cualquiera de las dosis probadas, el recombinante Adchimp68rab.gp indujo títulos VNA más altos a la rabia en ratones pre-inmunes a Adhu5 en comparación con los conseguidos mediante una dosis igual de la vacuna Adhu5rab.gp. El efecto detrimental de inmunidad preexistente a Adhu5 sobre la eficacia de la vacuna Adhu5 se demostró adicionalmente en un experimento de protección. Ratones naturales inmunizados con 2 x 10^{5} pfu de virus Adhu5rab.gp o Adchimp68rab.gp, estuvieron protegidos completamente frente a estimulación con virus CVS-11. La mayoría (el 65%) de ratones pre-inmunes a Adhu5 inmunizados con esta dosis de la vacuna Adhu5rab.gp sucumbieron a una infección del virus de la rabia, mientras que los vacunados con la misma dosis del virus Adchimp68rab.gp se mantuvieron protegidos. El incremento de la dosis del virus Adhu5rab.gp a 2 x 10^{6} pfu por ratón, restableció la eficacia de la vacuna.
La respuesta de anticuerpo al producto transgén expresado por el recombinante Adchimp68, no se vio afectada por la inmunidad preexistente a serotipos comunes de adenovirus humanos, que inhibe la respuesta al recombinante correspondiente del serotipo 5 humano. Tras la pre-inmunización con virus competentes de replicación, la respuesta inmune a la vacuna de Adhu5rab.gp fue anulada en ratones pre-inmunes por Adhu5, y reducida en ratones pre-inmunes a otros serotipos humanos de adenovirus tales como el 2 y el 4. La respuesta al recombinante Adchimp68 fue inhibida, según se esperaba, en ratones pre-inmunes al virus homólogo. Esto no es un aspecto clínico puesto que el virus Adchimp68 no circula en la población humana, y los serotipos humanos comunes no comparten epítopes neutralizantes con el virus Adchimp68.
La pre-exposición al virus Adhu5 defectivo de replicación redujo también la respuesta de anticuerpo a la glicoproteína del virus de la rabia presentada por los recombinantes del Adhu5, aunque el impacto no fue tan severo como en los ratones previamente infectados con virus competente de replicación. El suero procedente de ratones pre-inmunes al virus Adhu5 defectivo de replicación desarrolló anticuerpos, reducidos pero fácilmente detectables, frente al virus de la rabia tras la inmunización con vacuna Adhu5rab.gp. El incremento de la dosis de la formación Adhu5rab.gp pudo evitar en parte el impacto de la inmunidad preexistente. La protección inducida por vacuna frente al virus de la rabia requiere VNAs, que no fueron inducidos tan eficazmente en ratones pre-inmunes por la vacuna Adhu5 especialmente cuando se utilizaron a dosis más bajas. En ratones pre-inmunes por Adhu5, la respuesta de VNA a la construcción Adchimp68rab.gp fue superior a todas las dosis probadas respecto a la vacuna de Adhu5, compensando así mejor la potencia ligeramente más baja de esta vacuna tras inmunización s.c.
Los recombinantes de Adch8mp68 proporcionan así una alternativa atractiva como portador de vacuna para su uso en humanos. Según se muestra en la presente, éstos son eficaces incluso cuando se aplican a dosis bajas de 2 x 10^{5} pfu a través de vías de administración no invasivas tales como las vías aéreas superiores. La inmunización mucosal por aplicación i.n. tiene la ventaja añadida de favorecer la inducción de respuesta del sistema inmune mucosal común, que es distinto de, aunque esté interconectado con, el sistema inmune central que constituye el objetivo de las vacunas inyectadas.
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Ejemplo 11 Tronco y Replicación del Virus C68 de Chimpancé
Los ejemplos 11 a 15 que siguen proporcionan caracterización adicional del C68 de chimpancé. Un experto en la materia podrá apreciar que esta información puede ser utilizada fácilmente en la construcción de nuevas formaciones adenovirales de chimpancé recombinantes.
El tronco del virus C68 fue obtenido a partir de ATCC (Rockville, MD) y propagado en 293 células (ATCC) cultivadas en DMEM (Sigma, St. Louis, MO) suplementadas con un 10% de suero de ternero fetal (FCS; Sigma o Hyclone, Logan, UT) y un 1% de Penicilina-Estreptomicina (Sigma). La infección de 293 células fue llevada a cabo en DMEM suplementado con un 2% de FCS durante las primeras 24 horas, después de lo cual se añadió FCS para llevar la concentración final a un 10%. Las células infectadas fueron cultivadas cuando el 100% de las células presentaron un efecto citopático inducido por virus (CPE), recopiladas y concentradas por centrifugación. Las bolitas de células fueron re-suspendidas en 10 mM Tris (pH 8,0), y lisadas mediante 3 ciclos de congelación y licuación. Las preparaciones de virus fueron obtenidas siguiendo 2 etapas de ultra-centrifugación sobre gradientes de densidad de cloruro de cesio, y los troncos de virus fueron diluidos a razón de 1 x 10^{12} partículas/ml en 10 mM Tris/100 mM de NaCl/50% glicerol, y almacenadas a -70ºC.
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Ejemplo 12 Clonación y secuenciamiento de ADN genómico viral
El ADN genómico fue aislado a partir de la preparación vírica purificada siguiendo métodos estándar, y digestado con un panel de 16 enzimas de restricción siguiendo las recomendaciones del fabricante. Excepto lo indicado, todas las enzimas de restricción y modificación fueron obtenidas en Boehringer Mannheim, Indianápolis, IN. El ADN genómico fue digestado con BamHI, PstI, S1II, HindIII o Xbal, y los fragmentos fueron sub-clonados en plásmidos (K.L. Berkner y P.A. Sharp, Nucl. Acids Res., 11: 6003-20 (1983)). Tras las desproteinación, los ligantes PacI 10 bp sintéticos (New England Biolabs, Beverly, MA) fueron doblemente digestados con PacI y BamHI, o con PstI.
Los clones PstI, BamHI y HindIII, generados a partir del C68, han sido ilustrados en la Figura 1, partes C, D y E, respectivamente. Los fragmentos indicados por las casillas sombreadas no fueron clonados, pero la secuencia del genoma completo ha sido determinada mediante secuenciamiento de clones de solapamiento y ADN viral directamente (casillas sin sombrear). Los fragmentos clonados están descritos en la Tabla 2.
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 2 Clones de plásmido C68 y tamaños de inserción
2
El adenovirus de chimpancé, el C68, fue obtenido en ATCC y propagado en 293 células humanas. El ADN genómico viral fue aislado a partir de viriones purificados utilizando procedimientos establecidos (A.R. Davis, et al., Gene Thera., 5: 1148-1152 (1998)), y digestado con un panel de enzimas de restricción; los datos fueron consistentes con estudios previos (datos no representados) (G.R. Kitchingman, Gene, 20: 205-210 (1982); Q. Li y G. Wadell, Arch Virol. 101: 65-77 (1998); R. Wigand, et al., Intervirology, 30: 1-9 (1989)). Los fragmentos de restricción que se extienden al genoma completo del C68, fueron sub-clonados en plásmidos. Un dibujo esquemático del C68 se muestra en la Figura 1A, y los fragmentos Pst-I, BamHI y HindIII que fueron clonados en vectores plásmidos están indicados mediante casillas sin sombrear, en las Figuras 1B, 1C, y 1D, respectivamente. Los fragmentos clonados, los tamaños de fragmento y la posición genómica, se han relacionado también en la Tabla 2. Ambos clones de plásmido y ADN genómico, fueron utilizados como plantillas para el secuenciamiento. El genoma fue secuenciado mediante imprimador que se mueve en ambas direcciones, y cada base fue incluida en una media de aproximadamente cuatro reacciones.
El genoma C68 es de 36521 bp de longitud [véase la Patente US 6.083.716]. La comparación preliminar con secuencias GenBank indicaron grados variables de similitud con otros adenovirus humanos y animales a lo largo de la longitud completa del genoma viral. Las regiones con homología a todos las unidades genéticas descritas anteriormente, regiones 1-4 cercanas y los últimos genes mayores, fueron encontrados en el genoma C68 (Figura 1A). La homología de ADN entre el C68 y los adenovirus humanos que han sido completamente secuenciados, el Ad2 (NC001405), Ad5 (NC001405), Ad12 (NC001460), Ad17 (NC002067) y Ad40 (NC01464), fueron utilizados para ordenar los clones. Los marcos de lectura abierta (ORF) fueron determinados, y los genes fueron identificados en base a la homología con otros adenovirus humanos. Todos los genes adenovirales principales próximos y lejanos, están presentes en el C68. Las repeticiones terminales invertidas (ITR = s) son de 130 bp de longitud.
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Ejemplo 13 Análisis de la secuencia del C68
La secuencia nucleótida completa de cada miembro del Mastadenovirus genus, accesible a partir en GenBank, que incluye aislados de diferentes especies, fue seleccionada en cuanto a identidad con el C68. El minigenoma Ad4 fue ensamblado a partir de las siguientes secuencias de GenBank: ITR izquierdas (J01964); región ERA (M14918); conjunto de productos de ADN y pTP (X74508; 74672); VA ARN-I,II (U10682); 52, 55K (U52535); pVII (U70921); hexón (X84646); endoproteasa (M16692); proteína de enlace de ADN (M12407); fibra (X76547); ITR derechas (J01965). El genoma compuesto Ad7 fue creado a partir de los siguientes datos de secuencia: Mu 3-21 (X03000): VA ARN-I, II, pTP & 52, 55K (U52574); pentón (AD001675); pVI, hexón y endoproteasa (AF065065); proteína de enlace de ADN (K02530); E3 y región de fibra (AF104384); ITR derechas (V00037).
El alineamiento de secuencia de aminoácido fue generado con Ciustal X, editado con Jalview (http://www.ebi.ac.uk/
michele/jalview/), y analizado con Boxshade (http://www.ch.embnet.org/software/BOX_{-}form.html). Las secuencias de proteína de hexón disponibles en la publicidad, procedentes de todos los serotipos de adenovirus humanos, fueron alineadas inicialmente para identificar el conjunto que muestra la homología más alta con respecto al C68.
La secuencia de nucleótido y las secuencias de aminoácido pronosticadas de todos los marcos significativos de lectura abierta en el genoma C68, fueron comparadas con las secuencias conocidas de ADN y de proteínas. La secuencia nucleótida del C68 se comparó con las secuencias de Ad 2, 4, 5, 7, 12, 17 y 40. De acuerdo con el análisis de restricción previo (Kitchingman, citado anteriormente; Li y Wadell, citados anteriormente) el C68 es el más similar al Ad4 humano (subgrupo E).
La región E1A del C68 se extiende desde la casilla TATA en nt 480, hasta el sitio de adición poly A en 1521. Los sitios de donante y aceptador de unión de consenso, están en la posición análoga de las contrapartes Ad humanas, y las proteínas 28.2K y 24.8K son similares en tamaño a las proteínas Ad humanas. Se ha pronosticado que la ORF para la proteína E1A más pequeña del C68 codifica 101 residuos en oposición a aproximadamente 60 aminoácidos para otros adenovirus. Existe un codón TTA en el residuo 60 para el C68 en el que los adenovirus tienen con frecuencia un codón de interrupción de TGA. Los primeros 60 residuos de la proteína E1A 100R del C68 tienen un 85% de identidad con el homólogo Ad4.
El genoma C68 codifica genes para cuatro proteínas E1B, 20.5K, 54.7K, 10.1K y 18.5K, así como también pIX. La totalidad de las cinco proteínas codificadas del C68 son de tamaño similar al de las otros proteínas E1B y pIX del Ad. El homólogo del Ad4 de la proteína E1B 21K tiene solamente 142 aminoácidos, en el que C68 tiene 168 residuos y otros adenovirus humanos tienen 163-178 residuos. Los proteínas del C68 y del Ad4 comparten un 95% de identidad sobre los primeros 134aa, con los extremos de similitud y la proteína Ad4 terminan a 142 aminoácidos.
El genoma C68 codifica homólogos de la proteína E2A 55K de enlace de ADN y de la proteína de maduración Iva2, así como la proteína terminal E2B y la polimerasa de ADN. Todas las proteínas de la región E2 son de tamaño similar a las contrapartes de Ad humano, y las proteínas E2B están particularmente bien conservadas. Se ha pronosticado que la polimerasa E2B 123.6K de ADN del C68 es de 1124 residuos, mientras que el Ad4 se pronosticó que tiene 1193, aunque los otros adenovirus humanos tienen polimerasas similares. Los residuos 1-71 de la polimerasa de Ad4 no tienen ninguna similitud con ninguna otra polimerasa de Ad, y es posible que esta proteína se inicie realmente en un codón ATG interno. A partir de los aminoácidos 72-1193, las polimerasas de Ad4 y C68 tienen un 96% de identidad de aminoácido.
Las regiones E3 de adenovirus humanos están secuenciadas de modo que presentan una variabilidad considerable de secuencia y de capacidad de codificación. El Ad40 tiene cinco genes de región E3, el Ad12 tiene seis, el C68 y el Ad5 tienen siete, el Ad38 y el Ad3 así como el Ad7 (subgrupo B de adenovirus humanos) tienen nueve genes putativos de región E3. La región E3 de Ad4 no ha sido aún secuenciada. En comparación con la región E3 de Ad35, la totalidad de los 7 homólogos del gen E3 fueron identificados en el genoma C68 (C.F. Basler y M.S. Horwitz, Virology, 215: 165-177 (1996)).
La región E4 del C68 tiene 6 ORFs, y cada uno es homólogo respecto a las proteínas de la región E4 de los Ad5, 12 y 40. La nomenclatura E4 es confusa debido a que los homólogos de la ORF2 del C68, del Ad12 y del Ad40, son de aproximadamente 130 residuos, mientras que en el Ad5 existen dos proteínas de codificación de ORFs de 64 y 67 residuos con homología, respectivamente, con los extremos terminales amino y carboxi de las proteínas ORF2 más grandes. La ORF5 ha sido omitida en nuestra nomenclatura debido a que la 5ª ORF de la región E4 es homologa de la proteína ORF6 ampliamente estudiada del Ad5 humano.
El último promotor importante y las secuencias líder tripartitas del genoma C68, han sido localizados. Se localizaron las ORFs con potencial para codificar las 15 últimas proteínas importantes. Todas las proteínas últimas del C68 son de tamaño similar a sus contrapartes del Ad humano. El porcentaje de identidad de aminoácido entre las proteínas terminales del Ad de los chimpancés y de los humanos, varía considerablemente. Se ha pronosticado que la proteína de fibra del C68 tiene un 90% de identidad de aminoácido con la proteína de Ad4, pero una similitud mucho menor con las otras proteínas de fibra de Ad humanas. El sitio de enlace CAR en el montículo de fibra está presente en el C68.
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Ejemplo 14 Ensayos de anticuerpo de neutralización de virus
Se han realizado varios estudios para determinar si existe reactividad cruzada entre el tipo de antisuero específico del 68 y el adenovirus humano. La actividad neutralizante del suero se probó como sigue. Paneles de suero procedentes de sujetos humanos normales (N = 50), monos rhesus (N = 52) y chimpancés (N = 20), fueron evaluados en cuanto a anticuerpos de neutralización contra el Ad5 y el C68 en base a vectores que utilizan 293 células como línea celular indicadora.
Los sueros recogidos a partir de seres humanos, monos rhesus o chimpancés individuales, fueron desactivados a 56ºC durante 30 minutos. Una dilución serie de cada muestra (:10, 1:20, 1:40: 1:80; 1:160; 1:320 en 100 \mul de DMEM que contenía un 10% de FCS) fue añadida a cantidades iguales de virus H5.010CMVEGFP (1000 PFU/pocillo) o C68CMVEGFP, e incubada a 4ºC durante dos horas. Ciento cincuenta microlitros de la mezcla fueron transferidos sobre placas de 2 x 10 de fondo plano con 293 células en 96 pocillos. Los pocillos de control fueron infectados con iguales cantidades de virus (sin adición de suero). Las muestras fueron incubadas a 37ºC en 5% de CO_{2} durante 48 horas, y examinadas bajo un microscopio fluorescente. Las diluciones de muestra que presentaron una reducción >50% de focos fluorescentes verdes en comparación con los controles infectados, fueron considerados como positivos en cuanto a anticuerpos neutralizantes.
Según se esperaba, aproximadamente un 35% de sujetos humanos presentaron anticuerpos neutralizantes contra el Ad5, una frecuencia mucho más alta que la observada en monos rhesus y chimpancés. El anticuerpo neutralizante respecto al C68 fue observado en un 80% de chimpancés y solamente un 2% de sujetos humanos normales o de monos rhesus. Los títulos de anticuerpos neutralizantes en las especies no objetivas, fueron generalmente bajos.
Para evaluar mejor la reactividad cruzada del C68 con los vectores de adenovirus humanos, se inmunizaron ratones con 2 x 10^{7} unidades de formación de placa (pfu) de Ad 2, 4, 5, 7 y 12, así como C68. Los sueros fueron cultivados durante 2 semanas después y probados frente a anticuerpos que neutralizaron los vectores Ad5 y C68. El anticuerpo neutralizante respecto al vector Ad5 fue detectado solamente en animales inmunizados con Ad5. De manera importante, los únicos animales con anticuerpo neutralizante frente al vector C68 fueron los inmunizados con vector C68; ninguno de los serotipos humanos detectados, incluyendo el Ad4, generó anticuerpos en ratones que neutralizaran el C68 in vitro.
Importante para la utilizad del vector C68 en pruebas humanas es la ausencia de anticuerpo neutralizante en la población humana. En nuestro estudio, una selección de 50 sujetos humanos normales falló en cuanto a la detección de cualesquiera anticuerpos neutralizantes significativos (>1:10) utilizando el mismo ensayo que mostró anticuerpos neutralizantes en >50% de los chimpancés. Además, los sueros de ratones inmunizados con múltiples serotipos de Ad humano, incluyendo el Ad4, no neutralizaron la infección con C68.
En otro estudio, grupos de diez a veinte ratones IRC fueron vacunados con dosis variadas de la vacuna AdC68rab.gp suministrada subcutáneamente (s.c.), intranasalmente (i.n.) u oralmente (per os). Los ratones fueron desangrados 21 días después y se determinaron los títulos de anticuerpo de neutralización viral (VNA), expresados como unidades internacionales. Los ratones fueron estimulados 4 semanas después de vacunados con 10 dosis medias letales de virus CVS-24 aplicadas directamente al sistema nervioso central.
3
Estos datos demuestran que la construcción AdC68 induce inesperadamente una mejora respuesta de anticuerpo protectora a dosis bajas intranasalmente que el tipo 5 humano.
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Ejemplo 15 Análisis estructural de proteínas de hexón
La ausencia de de anticuerpos neutralizantes entre el C68 y serotipos humanos, nos obligó a evaluar más cuidadosamente las diferencias estructurales en las regiones de hexón que se suponen que albergan tipos de epítopes específicos. Los estudios previos han sugerido que estos epítopes se localizan dentro de 7 regiones hipervariables de hexón, determinadas por Crawford-Miksza y Shnurr (J. Virol. 70: 1836-1844 (1996)). Una comparación de las secuencias de aminoácido de las proteínas hexón entre el C68 y varios adenovirus humanos ha sido representada en la Figura 2. En efecto, el C68 es sustancialmente distinto en regiones significativas de estas secuencias hipervariables. Se realizó una modelación más detallada de la estructura tridimensional del hexón del C68, para mapear las secuencias únicas. Modelos de estructuras de hexón del C68 y del Ad4, fueron generados en base a las estructuras de cristal con rayos X de hexones para el Ad2 y el Ad5.
Las estructuras de cristal por rayos X de un hexón de Ad5 (identificador 1RUX de Banco de Datos de Proteínas) (J.J. Rux y R.M. Burnett, Mol. Ther. 1: 18-30 (8200)), y para el Ad2 (F.K. Athappilly, et al., J. Mol. Biol., 242: 430-455 (1994)), han sido mejor refinadas para producir los modelos de hexón actuales (Rux y Burnett, publicados en otro lugar). Modelos de los hexones homólogos de C68 y Ad4, fueron producidos inicialmente utilizando el entorno de modelación con proteína Swiss-PdbViewer (N. Guez y M.C. Peitsch, Electrophoresis, 18: 2714-2723 (1997)). Se utilizó su procedimiento automatizado para alinear las secuencias de aminoácido de hexón del C68 y del Ad4 con las de las estructuras de cristal del hexón de Ad2 y Ad5. Los alineamientos de secuencia fueron utilizados para guiar el enroscado de las secuencias modelo sobre las estructuras moleculares conocidas. Se eligieron las posiciones de cadena lateral de los residuos no vistas en las estructuras conocidas a partir de una librería de promotores de cadena lateral. Estos modelos moleculares iniciales fueron ajustados después manualmente para mejorar el alineamiento automatizado moviendo espacios en regiones variables expuestas, y optimizando el empaquetamiento de cadenas laterales. Las posiciones de segmentos de bucle externos no observados en las estructuras de plantilla de Ad2 y de Ad5, fueron elegidas a partir de una librería de estructuras conocidas o acopladas manualmente. La conformación de cada modelo además refinada mediante minimización de energía utilizando el programa CHARMM de mecánica molecular (B.R. Brooks, et al., J. Comp. Chem., 4: 187-217 (1983)). Las estructuras de estos modelos de hexón de C68 y de Ad4, fueron alineadas a continuación y se calculó un nuevo alineamiento de secuencia. Las diferencias entre las dos secuencias de hexón estructuralmente alineadas se utilizaron para formar imágenes en color de modelos de homología. Las imágenes gráficas preparadas dentro del programa Swiss-PdbViewer, fueron exportadas y presentadas con el programa de Persistencia del Trazador de Rayo de Visión (POV-Ray 2000, Versión 3.1 g).
Mientras que la secuencia global de C68 es muy similar a la del hexón Ad4, las diferencias entre las dos secuencias están principalmente enfocadas en los bucles DE1 y FG1, y éstos contienen la totalidad de las siete regiones hipervariables. Los bucles DE1, FG1 y FG2, cada uno de ellos procedente de una sub-unidad diferente, son los que se asocian íntimamente para formar los dominios inferiores en la parte superior de la molécula trimérica. Las torres de hexón forman gran parte de la superficie exterior del virión, y son los sitios de fijación de anticuerpo. Puesto que los lados y la base de los hexones están empaquetados conjuntamente dentro del cápside, estas regiones están blindadas respecto a enlace de anticuerpo, y se conservan sus secuencias. Por el contrario, las secuencias del C68 y del Ad4 son completamente diferentes en las torres de hexón. Esto explica inmediatamente por qué los anticuerpos suscitados por cualquiera de estos virus no reaccionan de forma cruzada.
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Referencias citadas en la descripción
La lista de referencias citadas por el solicitante se proporciona únicamente por conveniencia para el lector. Ésta no forma parte del documento de Patente Europea. Incluso aunque se ha puesto un gran cuidado en el listado de las referencias, no se excluyen los errores u omisiones y la EPO declina toda responsabilidad en ese sentido.
Documentos de Patente citados en la descripción
- US 6083716 A
- US 5972596 A
- US 6203975 B
- US 60300131 B
- WO 9810088 A
- US 60304843 B
- WO 0011140 A
Literatura que no es de patentes, citada en la descripción
\bulletROWE et al. Proc. Soc. Exp. Med., 1956, vol. 91, 260
\bulletBASNIGHT et al. Am. J. Epidemiol., 1971, vol. 94, 166
\bulletSAMBROOK et al., Clonación Molecular: Un manual de Laboratorio. Cold Spring Harbor Press, 1989
\bulletSUSUBEL et al., PROTOCOLOS ACTUALES EN BIOLOGÍA MOLECULAR. John Wiley & Sons, 1989, 3.18-3.26 16.17-16.27
\bulletBOSHART et al., Cell, 1985, vol. 41, 521-530
\bulletNO et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, vol. 93, 3346-3351
\bulletGOSSEN et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, vol. 89, 5547-5551
\bulletGOSSEN et al., Science, 1995, vol. 268, 1766-1769
\bulletHARVEY et al., Curr. Opin. Chem. Biol., 1998, vol. 2, 512-518
\bulletWANG et al., Nat. Biotech, 1997, vol. 15, 239-243
\bulletWANG et al., Gene Ther., 1997, vol. 4, 432-441
\bulletMAGARI et al., J. Clin. Invest., 1997, vol. 100, 2865-2872
\bulletLI et al., Nat. Biotech., 1999, vol. 17, 241-245
\bulletMIYATAKE et al., J. Virol., 1997, vol 71, 5124-32
\bulletSANDIG et al., Gene Ther., 1996, vol. 3, 1002-9
\bulletARBUTHNOT et al., Hum. Gene Ther., 1996, vol. 7, 1503-14
\bulletSTEIN et al., Mol. Biol. Rep., 1997, vol. 24, 185-96
\bulletCHEN et al., J. Bone Miner. Res., 1996, vol. 11, 654-64
\bulletHANSAL et al., J. Immunol., 1998, vol. 161, 1063-8
\bulletANDERSEN et al., Cell. Mol. Neurobiol., 1993, vol. 13, 503-15
\bulletPICCIOLI et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991, vol. 88, 5611-5
\bulletPICCIOLI et al., Neuron, 1995, vol. 15, 373-84
\bullet Retrovirus Humano y SIDA. Compilación y análisis de secuencias de ácido nucleico y de aminoácido, 1991.
\bullet R. SCHEIDER et al., J. Virol., Julio 1997, vol. 71(7), 4892-4903
\bulletSEEDORF, K. et al., Virol., 1985, vol. 145, 181-185
\bullet A.R. DAVIS et al., Gene Thera., 1998, vol. 5, 1148-1152
\bullet K.J. FISHER et al., J. Virol., 1998, vol. 70, 520-532
\bullet G. GAO et al., J. Virol, 1996, vol. 70, 8934-8943
\bullet A.R. DAVIS et al., Gene Thera, 1998, vol. 5, 1148-1152
\bullet Z.Q. XIANG et al., Virol., 1996, vol. 219, 200
\bullet S. SCHWARTZ et al., J. Virol. 1992, vol. 66, 7176
\bullet S. SCHWARTZ et al., J. Virol., 1992, vol. 66, 150-159
\bullet G. NASIOULAS et al., J. Virol, 1994, vol. 68, 2986
\bullet R. SCHNEIDER et al., J. Virol, 1997, vol. 71, 4892
\bullet S. SCHWARTZ et al., J. Virol., 1992, vol. 66, 150
\bullet J.T. QIU et al., J. Virol., 1999, vol. 73, 9145
\bullet B. CHELSEBRO et al., J. Virol., 1992, vol. 66, 6547
\bullet B. DOE; C.M. WALKER. SIDA, 1996, vol. 10, 793
\bullet H.C.J. ERTL et al., J. Virol., 1989, vol. 63, 2885
\bullet S. CHACARABARTI et al., Mol. Cell. Biol., 1985, vol. 5, 3403
\bullet H.C.J. ERTL et al., J. Virol., 1989, vol. 63, 2885
\bullet D.H. BAROUCH et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 2000, vol. 97, 4192
\bullet T.U. VOGEL et al., J. Immunol., 2000, vol. 164, 4968
\bullet P.A. GOEPFERT et al., J. Virol., 2000, vol. 74, 10249
\bullet C.R. RINALDO JR. et al., SIDA Res. & Hum. Retr., 1998, vol. 14, 1423
\bullet Z.Q. XIANG et al., J. Immunol., 1999, vol. 162, 6716
\bullet Z.Q. XIANG et al., Virology, 1996, vol. 219, 220-227
\bullet D.W. KOWALCYK et al., Régimen de vacuna para prevención de infecciones transmitidas sexualmente con el tipo 16 del virus del papiloma humano. Vacuna, 2001.
\bullet F.L. GRAHAM. J. Gen. Virol., 1977, vol. 36, 59-74
\bullet Z. HE et al., Virology, 2000, vol. 270, 146-1617
\bullet Z.Q. XIANG Z.Q.; H.C. ERTL. J. Virol. Meth., 1994, vol. 47, 103-16
\bullet Z.Q. XIANG et al., Virology, 1996, vol. 214, 398-404
\bullet F.L. GRAHAM. J. Gen. Virol., 1977, vol. 36, 59-74
\bullet K.L. BERKNER; P.A. SHARP. Nucl. Acids Res., 1983, vol. 11, 6003-20
\bullet G.R. KITCHINGMAN. Gene, 1982, vol. 20, 205-210
\bullet Q. LI; G. WADELL. Arch. Virol., vol. 101, 65-77
\bullet R. WIGAND et al., Intervirology, 1989, vol. 30, 1-9
\bullet C.F. BASLER; M.S. HORWITZ. Virology, 1996, vol. 215, 165-177
\bulletCRAWFORD-MIKSZA; SCHNURR. J. Virol., 1996, vol. 70, 1836-1844
\bullet J.J. RUX; R.M. BURNETT. Mol. Ther., 2000, vol. 1, 18-30
\bullet F.K. ATHAPILLY et al., J. Mol. Biol., 1994, vol. 242, 430-455
\bullet N. GUEZ; M.C. PEITSCH. Electrophoresis, 1997, vol. 18, 2714-2723
\bullet B.R. BROOKS et al., J. Comp. Chem., 1983, vol. 4, 187-217.
<110> Instituto Wisar de Anatomía y Biología
\hskip1cm
Los Tutores de la Universidad de Pennsylvania 
\hskip1cm
Ertl, Hildegund C.J. 
\hskip1cm
Wilson, James M. 
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<120> Métodos de Inducción de una Respuesta Citotóxica Inmune y Composiciones de Adenovirus de Simio Recombinantes Útiles en los mismos
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<130> WST104A/UPNN2628A
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\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/300, 131
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 22-06-2001
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/304, 843
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 12-07-2001
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\vskip0.400000\baselineskip
<160> 13
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\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.1
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<210> 1
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<211> 9
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Péptido sintético que porta el epítope de célula CD8+ T inmunodominante para el haplotipo H-2d
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<400> 1
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<212> AND
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<213> Secuencia artificial
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<223> Imprimador 5' para la glicoproteína del virus de la rabia
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<223> Imprimador 5' para la deshidrogenasa del glutaraldehído-3-fosfato (GAPDH)
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ggtgaaggtc ggtgtgaacg gattt 
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<210> 5
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<211> 25
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Imprimador 3' para GAPDH
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<400> 5
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\hskip-.1em\dddseqskip
aatgccaaag ttgtcatgga tgacc 
\hfill
25 
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<210> 6
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<211> 7228
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Secuencia de obstrucción de VIH-1 modificada
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<220>
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<221> CDS
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<222> (729) ... (1820)
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<223>
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<400> 6
5
6
7
8
9
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<210> 7
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<211> 363
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Secuencia de obstrucción de VIH-1 modificada
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<400> 7
11
12 
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<210> 8
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<211> 311
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<212> PRT
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<213> Adenovirus de tipo chimpancé
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<400> 8
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13
14
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<210> 9
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<211> 314
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<212> PRT
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<213> Tipo 4 de adenovirus humano
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<400> 9
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16
17 
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<210> 10
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<211> 318
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<212> PRT
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<213> Tipo 16 de adenovirus humano
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<400> 10
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18
19
20 
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<210> 11
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<211> 323
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<212> PRT
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<213> Tipo 3 de adenovirus humano
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<400> 11
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21
22 
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<210> 12
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<211> 315
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<212> PRT
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<213> Tipo 7 de adenovirus humano
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<400> 12
23
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<210> 13
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<211> 345
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<212> PRT
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<213> Tipo 2 de adenovirus humano
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<400> 13
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Claims (27)

1. Un vector adenoviral de simio defectivo de replicación que contiene, en un cápside adenoviral de simio, cis-elementos adenovirales de simio y un gen heterólogo enlazado operablemente a una secuencia de control de expresión, en el que el cápside adenoviral de simio se deriva de un adenovirus de chimpancé elegido en el grupo consistente en Pan 5, Pan 6 y Pan 7.
2. Un vector adenoviral de simio según se reivindica en la reivindicación 1, que es defectivo de replicación debido a la ausencia de la capacidad para expresar EIa y EIb adenovirales.
3. Un vector adenoviral de simio según se reivindica en la reivindicación 1 ó 2, en el que se elimina el gen E3 próximo retrasado.
4. Un vector adenoviral de simio según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que tiene una delección funcional en el gen E4.
5. Un vector adenoviral de simio según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que contiene una delección en el gen E2a próximo retrasado.
6. Un vector adenoviral de simio según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que tiene una delección en cualquier de los últimos genes L1 a L5 del genoma adenoviral de simio.
7. Un vector adenoviral de simio según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el gen heterólogo codifica un producto inmunogénico a partir de un virus elegido en el grupo consistente en el virus de inmunodeficiencia humana, el virus de inmunodeficiencia de los simios, el virus sincitial respiratorio, los tipos 1-3 del virus parainfluenza, el virus de la gripe, el virus del herpes simplex, el citomegalovirus humano, los virus de la hepatitis, el papilomavirus humano, el virus de la polio, el rotavirus, los calicivirus, el virus del sarampión, el virus de las paperas, virus de la rubeola, el adenovirus, el virus de la rabia, el virus del moquillo canino, el virus de la ictericia, el coronavirus, el parvovirus, los virus de la rinotraqueitis infecciosa, el virus de la leucemia felina, el virus de la peritonitis infecciosa felina, el virus de la enfermedad bursal infecciosa aviar, el virus de la enfermedad de Newcastle, el virus de la enfermedad de Marek, el virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino, el virus de la arteritis equina, y el virus de la encefalitis.
8. Un vector adenoviral de simio según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el gen heterólogo codifica un producto inmunogénico a partir de una bacteria seleccionada en el grupo consistente en Haemophilus influenzae, Haemophilus somnus, Moraxelle catarrhalis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Streptococcus faecalis, Helicobacter pylori, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia psittaci, Bordetella pertussis, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Salmonella cholerauesuis, Escherichia coli, Shigella, Vibrio cholerae, Corynebacterium diphteriae, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium avium, el complejo Mycobacterium intracellulare, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Staphylococcus aureus, Clostridinium tetani, Leptospira interrogans, Borrelia burgdoferi, la Pasteurella haemolytica, Pasteurella multocida, Actinobacillus pleuropneumoniae y Mycoplasma
gallisepticum.
9. Un vector adenoviral de simio según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el gen heterólogo codifica un producto inmunogénico a partir de un hongo seleccionado en el grupo consistente en Aspergillis, Blastomyces, Candida, Coccidiodes, Cryptococcus y Histoplasma.
10. Un vector adenoviral de simio según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el gen heterólogo codifica un producto inmunogénico a partir de un parásito elegido en el grupo consistente en Leishmania major, Ascaris, Trichuris, Giardia, Schistosoma, Cryptosporidium, Trichomonas, Toxoplasma gondii y Pneumocystis carinii.
11. Un vector adenoviral de simio según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el gen heterólogo está dirigido a elicitar un efecto anti-cáncer utilizando un antígeno del cáncer o un antígeno asociado al tumor, elegido en el grupo consistente en antígeno específico de próstata, antígeno carcino embriónico, MUC-1, Her2, CA-125 y MAGE-3.
12. Un procedimiento de producción de un vector según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que comprende ensamblar un gen heterólogo y la secuencia ITR de cis-elemento de adenovirus de simio.
13. Uso de un adenovirus recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 en la preparación de un medicamento par inducir una respuesta de célula T a un inmunógeno en un sujeto,
que se caracteriza porque dicho adenovirus de simio recombinante induce preferentemente una respuesta de célula CD8+ T al inmunógeno cuando se suministra subcutáneamente, y
que se caracteriza además porque dicho adenovirus recombinante comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un inmunógeno bajo el control de secuencias reguladoras que dirigen la expresión del inmunógeno en el sujeto.
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14. Uso de un adenovirus recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 en la preparación de un medicamento para inducir una respuesta de anticuerpo a un inmunógeno en un sujeto,
que se caracteriza porque dicho adenovirus de simio recombinante induce preferentemente una respuesta de anticuerpo al inmunógeno a dosis bajas cuando se suministra a la mucosa, y
que se caracteriza además porque dicho adenovirus recombinante comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un inmunógeno bajo el control de secuencias reguladoras que dirigen la expresión del inmunógeno en el sujeto.
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15. Uso de acuerdo con la reivindicación 13 o la reivindicación 14, en el que dicho adenovirus de simio recombinante se formula para su administración subcutánea.
16. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, en el que dicho adenovirus de simio recombinante se formula para su administración a dosis bajas.
17. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16, en el que dicho adenovirus de simio recombinante se formula para su administración a una dosis efectiva que está comprendida entre 10^{4} pfu y 10^{6} pfu.
18. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16, en el que el inmunógeno se elige en el grupo consistente en un péptido, polipéptido o proteína, que deriva de un virus patogénico elegido en el grupo consistente en el virus-1 de inmunodeficiencia humana, el virus del papiloma humano, y el de la rabia.
19. Una composición inmunogénica útil para inducir una respuesta inmune citotóxica para el virus de inmunodeficiencia humana, que comprende: (a) un adenovirus de simio recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende una secuencia optimizada de ácido nucleico que codifica una proteína de obstrucción modificada del virus-1 de inmunodeficiencia humana, y (b) un portador fisiológicamente compatible.
20. Uso de una composición inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 19 en la preparación de un medicamento para inducir una respuesta de célula CD8+ T frente al virus de inmunodeficiencia humana en los mamíferos.
21. Uso de un adenovirus de simio recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que codifica una proteína inmunogénica derivada del virus del papiloma humano, en la preparación de un medicamento para inducir una respuesta de célula CD8+ T contra el virus del papiloma humano en los mamíferos.
22. Uso de un adenovirus de simio recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que codifica una proteína inmunogénica derivada del virus de la rabia, en la preparación de un medicamento para inducir una respuesta de anticuerpo neutralizante frente a la rabia en los mamíferos.
23. Una vacuna para el virus de inmunodeficiencia humana de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende un adenovirus defectivo de replicación de simio recombinante que comprende un antígeno del virus-1 de inmunodeficiencia humana (VIH-1).
24. La vacuna de acuerdo con la reivindicación 23, en la que el antígeno se elige entre los del grupo consistente en las regiones envolvente, de conjunto o de obstrucción del VHT-1.
25. La vacuna de acuerdo con la reivindicación 23, en la que el antígeno comprende un antígeno natural del que se han separado los elementos de inestabilidad genética.
26. La vacuna de acuerdo con la reivindicación 23, en la que el antígeno es cADN de obstrucción de VIH-1 que comprende las secuencias SEQ ID NO: 6.
27. Una vacuna para la rabia, que comprende un adenovirus defectivo de replicación de simio recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un antígeno de la rabia bajo el control de secuencias reguladoras que dirigen la expresión del antígeno de la rabia.
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Families Citing this family (43)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040136963A1 (en) * 2001-06-22 2004-07-15 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Simian adenovirus vectors and methods of use
AU2002365366B2 (en) 2001-11-21 2007-05-10 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Simian adenovirus nucleic acid and amino acid sequences, vectors containing same, and methods of use
CA2528511C (en) * 2003-06-20 2015-11-03 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods of generating chimeric adenoviruses and uses for such chimeric adenoviruses
DE602005017743D1 (de) 2004-01-23 2009-12-31 Angeletti P Ist Richerche Bio Impfstoffträger für schimpansen-adenovirus
AP2351A (en) 2004-10-13 2012-01-25 Crucell Holland Bv Improved adenoviral vectors and uses thereof.
AR053275A1 (es) * 2005-05-12 2007-04-25 Glaxo Group Ltd Composicion de vacuna
US9364525B2 (en) 2006-07-18 2016-06-14 Glaxosmithkline Biologicals Sa Vaccines for malaria
PL2137210T3 (pl) 2007-03-02 2017-06-30 Glaxosmithkline Biologicals Sa Nowy sposób i kompozycje
CA2679720A1 (en) * 2007-03-09 2008-09-18 Merck & Co., Inc. Papillomavirus vaccine compositions
AU2008331905B2 (en) * 2007-11-28 2014-09-18 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Simian subfamily B adenovirus SAdV-28 and uses thereof
PL2391638T3 (pl) * 2009-02-02 2018-11-30 Glaxosmithkline Biologicals Sa Sekwencje nukleotydowe i aminokwasowe małpiego adenowirusa, zawierające je wektory i ich zastosowania
WO2011057254A2 (en) * 2009-11-09 2011-05-12 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Simian adenoviral vector-based vaccines
WO2011133870A2 (en) * 2010-04-22 2011-10-27 Andrea Amalfitano Vaccines comprising adenovirus vectors and signaling lymphocyte activating molecule-associated protein (sap)
CN102060915A (zh) * 2010-10-29 2011-05-18 广州呼吸疾病研究所 人3型腺病毒六邻体的可修饰位点及其应用
ES2645156T3 (es) * 2011-03-21 2017-12-04 Altimmune Inc. Agente terapéutico inmunológico de acción rápida y prolongada
TWI623618B (zh) 2011-07-12 2018-05-11 傳斯堅公司 Ｈｂｖ聚合酶突變體
TW201318637A (zh) 2011-09-29 2013-05-16 Transgene Sa 免疫療法組成物及用於治療ｃ型肝炎病毒感染之療程（一）
WO2013045668A2 (en) 2011-09-29 2013-04-04 Transgene Sa Immunotherapy composition and regimen for treating hepatitis c virus infection
CN103468743B (zh) * 2013-08-19 2015-07-29 中国科学院上海巴斯德研究所 一种狂犬病疫苗及其制备方法
CN103937835A (zh) * 2013-08-19 2014-07-23 中国科学院上海巴斯德研究所 一种基于腺病毒AdC68的表达载体及其构建方法
WO2015063647A1 (en) 2013-11-01 2015-05-07 Pfizer Inc. Vectors for expression of prostate-associated antigens
US10799568B2 (en) 2014-05-19 2020-10-13 Valo Therapeutics Oy Modified adenoviruses for cancer vaccines development
MX384992B (es) 2014-06-13 2025-03-14 Glaxosmithkline Biologicals Sa Combinaciones inmunógenas.
BR112017026523A2 (pt) 2015-06-12 2018-08-14 Glaxosmithkline Biologicals Sa vetor recombinante, adenovírus recombinante, composição, uso de um vetor recombinante, de um adenovírus recombinante ou de uma composição, método para induzir uma resposta imune em um indivíduo, e, polinucleotídeo isolado.
EP3504230A1 (en) 2016-08-23 2019-07-03 GlaxoSmithKline Biologicals SA Fusion peptides with antigens linked to short fragments of invariant chain (cd74)
WO2018060288A1 (en) 2016-09-29 2018-04-05 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Compositions and methods of treatment of persistent hpv infection
GB201616904D0 (en) 2016-10-05 2016-11-16 Glaxosmithkline Biologicals Sa Vaccine
ES2959811T3 (es) * 2016-12-09 2024-02-28 Glaxosmithkline Biologicals Sa Construcciones de adenovirus de chimpancé con antígenos de Lyssavirus
GB201701239D0 (en) * 2017-01-25 2017-03-08 Glaxosmithkline Biologicals Sa Novel formulation
WO2019016756A1 (en) 2017-07-21 2019-01-24 Glaxosmithkline Biologicals Sa ANTIGEN CONSTRUCTS OF CHIKUNGUNYA VIRUSES
WO2019086466A1 (en) 2017-10-31 2019-05-09 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Adenovirus and uses thereof
CN111372943B (zh) 2017-10-31 2023-12-05 扬森疫苗与预防公司 腺病毒及其用途
WO2019086461A1 (en) 2017-10-31 2019-05-09 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Adenovirus vectors and uses thereof
WO2019086450A1 (en) 2017-10-31 2019-05-09 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Adenovirus and uses thereof
GB201721069D0 (en) 2017-12-15 2018-01-31 Glaxosmithkline Biologicals Sa Hepatitis B Immunisation regimen and compositions
GB201721068D0 (en) 2017-12-15 2018-01-31 Glaxosmithkline Biologicals Sa Hepatitis B immunisation regimen and compositions
BR112020012361A2 (pt) 2017-12-20 2020-11-24 Glaxosmithkline Biologicals S.A. constructos de antígeno do vírus epstein-barr
EP3581201A1 (en) 2018-06-15 2019-12-18 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Escherichia coli o157:h7 proteins and uses thereof
EP3587581A1 (en) 2018-06-26 2020-01-01 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Formulations for simian adenoviral vectors having enhanced storage stability
CA3132601A1 (en) 2019-03-05 2020-09-10 Glaxosmithkline Biologicals Sa Hepatitis b immunisation regimen and compositions
CN116322740A (zh) 2020-07-13 2023-06-23 特兰斯吉恩股份有限公司 免疫抑制的治疗
WO2023213764A1 (en) 2022-05-02 2023-11-09 Transgene Fusion polypeptide comprising an anti-pd-l1 sdab and a member of the tnfsf
CN117089577B (zh) * 2023-08-21 2024-06-25 暨南大学 重组的猴腺病毒、病毒载体及构建方法

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6174666B1 (en) * 1992-03-27 2001-01-16 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Method of eliminating inhibitory/instability regions from mRNA
IL113817A (en) * 1994-06-30 2001-03-19 Merck & Co Inc Polynucleotide vaccne for papillomavirus
US5698202A (en) * 1995-06-05 1997-12-16 The Wistar Institute Of Anatomy & Biology Replication-defective adenovirus human type 5 recombinant as a rabies vaccine carrier
US6019978A (en) * 1995-06-05 2000-02-01 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Replication-defective adenovirus human type 5 recombinant as a vaccine carrier
WO1998010087A1 (en) * 1996-09-06 1998-03-12 Trustees Of The University Of Pennsylvania Chimpanzee adenovirus vectors
WO2000011140A1 (en) * 1998-08-20 2000-03-02 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Methods of augmenting mucosal immunity through systemic priming and mucosal boosting

Also Published As

Publication number Publication date
KR20040043129A (ko) 2004-05-22
HUP0400297A3 (en) 2010-08-30
MXPA04000024A (es) 2004-05-21
NZ530245A (en) 2007-04-27
PL372294A1 (en) 2005-07-11
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PT1409012E (pt) 2009-05-11
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