CZ21996A3

CZ21996A3 - Oxathiolates, process of their preparation and pharmaceutical compositions containing thereof

Info

Publication number: CZ21996A3
Application number: CZ96219A
Authority: CZ
Inventors: Faury Anne-Sophie Charvet; Michel Camplo; Jean Louis Kraus
Original assignee: Laphal Laboratoires Sa
Priority date: 1994-05-24
Filing date: 1995-05-24
Publication date: 1996-05-15
Also published as: CA2167930A1; WO1995032200A1; FR2720397B1; HU219299B; AP9600784A0; OA10258A; FI960316A0; NO306299B1; CN1080264C; HUT75112A; KR960703903A; AU2620995A; FR2720397A1; FI960316L; US5708000A; KR100242891B1; RU2142462C1; FI960316A7; PL181713B1; JPH09502453A

Description

Vynález se týká oblasti organické chemie, přesněji farmaceutických přípravku. Jeho předmětem jsou zvláště 2',3'-didesoxynukleosidy substituované v poloze 2 cyklem

1,3-oxathiolanu.

Dosavadní stav techniky

Retrovirální infekce jsou příčinou vážných nemocí, zvláště syndromu získané imunodeficience (AIDS) což je fatální virový stav vzhledem k o stupeň menším hepatitidám. Některé látky typu nukleosidú nebo hetero-nukleosidú jsou v součastné době klinicky používány pro léčení retrovirálních zápalů.

Jsou to deriváty AZT (3’-azido-2^,,3'-didesoxythymidin) (Proč. Nati. Acad. Sci 82, 7096-7100), ddC (2',3'-didesoxycytidin) (Proč. Nati. Acad. Sci. 86. 1911-15, 1986), d4T (2',3'-didehydro-3'-desoxythymidin) (Biochem. Biophys. Ras. Comm. 142, 128-34, 1987), ddl (2’,3'-didesoxyinosin) (Antiviral. Chem. Chemother 2, 221, 1991), BCH-189 nebo 3TC (2',3'-dideoxy 3-thiacytidin) popsaný v evropské patentové přihlášce 90 301335.7 a ostatních. Množství omezení těchto antiretrovirových sloučenin, které jsou k dispozici lékařům a jejich omezená terapeutická účinnost volají po výzkumu nových

-2látek jejichž terapeutický účinek bude přínosem, přičemž vedlejší účinky budou omezeny.

Jsou známy deriváty 2-[(1-hydroxymethyl) 1,3-oxathiolan 5-yl] cytosin a zvláště estery s funkcí hydroxymethylu (evropská patentová přihláška 0.382.526) nebo deriváty halogenů v poloze 5* pyridinového jádra (R.F. SCHINAZI et al. Antimicrob Agents and Chemotherapy 36 (1992) 2423-2431.

Podstata vynálezu.

Podstatou vynálezu jsou 5-(cytosinyl-1) 1,3 oxathiolany v konfiguraci cis (2R-5S nebo 25-5R) odpovídající obecnému vzorci I

který může býti v jednom z následujících prostorových uspořádání

NH— R ve kterém R je zbytek acylu nebo aralkylu, mono-nebo dvojdusíkaté deriváty heterocyklú a skupina hydroxymethylová v poloze 2 a v poloze cis vzhledem k rovině určené polohami 2 nebo 5.

Mezi různými významy uvažovanými pro R se jedná zvláště o:

a) nikotinové deriváty, kde heterocykl má strukturu pyridinu a acylová skupina je v poloze 2,3 nebo 4 obecného vzorce la (X), co_ (Ia) ve kterém X představuje vodík, atom halogenu, nitro skupinu, nižší alkoxyi nebo zbytek trifluormethylu a n je celé číslo mezi 1 a 3

b) deriváty dihydropyridinu, kde heterocykl je 1,4-dihydropyridin a acylový zbytek je v poloze 2, 3, nebo 4 obecného vzorce lb

ve kterém RI je alkylový zbytek mající 1 až 10 atomu uhlíku, X a n jsou definovány jako výše

c) kvarterní deriváty nikotinu, kde atom dusíku nese alkylový substituent a acylový zbytek je v poloze 2,3, nebo 4 mající obecný vzorec Ic de)

-ži-

ve kterém A je anorganický nebo organický anion

R|, X a n jsou definovaný jako výše

d) chinolinové deriváty, kde heterocykl je. bicyklické struktury mající obecný vzorec Id

ve kterém karbonylový zbytek může býti v poloze 2,3, nebo A X představuje vodík, halogen , trifluormethylový zbytek, nižší alkoxyl nebo nitro skupinu a n představuje celé číslo od 1 do 6.

e) dihydrochinoliny obecného vzorce le

ve kterém R| a X jsou definovány jako výše a n je celé číslo od 1 do 6

f) kvarterní-chinol iny obecného vzorce lf

(if) ve kterém R], X a n jsou jsou definovány jako výše alkylový zbytek se nachází v poloze 2,3 nebo 4 a a A je anorganický nebo organický anion

g) (dihydropyridyl) alkyly obecného vzorce Ig (Ig)

N «I ve kterém R |, X a n jsou definovány jako výše a m je číslo měnící se od 1 do 6 jakož i jejich adiční soli s minerální nebo organickou kyselinou.

Sloučeniny obecného vzorce I mohou býti rozštěpeny na jejich optické izoméry. Takto se získá isomer -D a isomer -L.

- 6 Sloučeniny podle vynálezu vykazují vlastnost inhibice replikace lidského retroviru, zvláště viru HIV a viru hepatitidy B (HBV). Tyto látky, deriváty BCH-189 nebo 3TC, zahrnují v jejich struktuře jednotku 1,4-dihydro-1-methy1-3-chinoleylkarbonyl vázanou na aminovou exocyklickou skupinu cytidinu. Tato strukturní jednotka v experimentální farmakologii zvyšuje a usnadňuje průchodnost hemato-encefal ickou bariérou (Pharmacol. Ther. 19, 337-396, 1983 - Methods Enzymol. 112, 381-396, 1985 - Drug. Des. Del. 1, 51-64 (1986) - J. Med. Chem. 31_t 244-249, 1988 - J. Med. Chem. 32, 1782-1788, 1989 - J. Med. Chem. 32, 1774-1781, 1989).

Chemická syntéza těchto sloučenin byla prováděna způsobem podle klasických experimentů. Způsob přípravy těchto nových heteronukleosidů potřebuje jako počáteční produkt derivát 2',3'-dideoxy-3’-thiacitidin, jehož různé způsoby syntézy jsou popsány v chemické literatuře (J Org. Chem. 56, 6503, 1991 - J. Org. Chem- 57, 2217, 1992 - Tet. Lett. 33, 4625, 1992 Nucleosides and Nucleotides 12, 225, 1993). Vycházejíce z tohoto derivátu, syntéza sloučenin podle předkládaného vynálezu, jakož i k ní se vztahujících meziproduktů, je popsána v předložené přihlášce patentu.

Vynález se také týká způsobu přípravy látek obecného vzorce I, spočívající v tom, že se 5-(cytosiny1-1) 1,3-oxathiolan cis podrobí působení funkčního derivátu kyseliny karboxylové vzorce ROH, kde R je acylový zbytek odvozený od aromatického nebo dihydroaromatického heterocyklu, dusíkatého mono- nebo bicyklu nebo se podrobí působení aktivního aralkylu obecného vzorce R'Z, kde R’ je aralkýlový zbytek odvozený od dusíkatého aromatického

-Ί nebo dihydroaromatického mono- nebo bicyklického heterocyklu a Z je nestabilní zbytek, který lze lehce odštípnout.

Blíže specifikováno, funkční derivát kyseliny ROH je halogenid, anhydrid, smíšený anhydrid, vytvořený s. karbodiimidem nebo reaktivní ester jako je například fenolester.

V případě aralkylového derivátu je Z atomem vodíku a nebo skupinou alkyl- nebo aryl sulfonyl ovou..

Vynález rovněž popisuje farmaceutické sloučeniny s antivirálním účinkem, vyznačující se tím, že jakožto účinnou látku obsahují alespoň jednu sloučeninu obecného vzorce I nebo některou z jejich adičních solí s anorganickou nebo organickou kyselinou, v asociaci nebo ve směsi s excipientem nebo inertním, netoxickým a farmeceuticky přijatelným vehikulem, obzvláště pro topické nebo všeobecné použití.

V těchto látkách je obsah účinné látky obecného vzorce I v rozmezí od 0.1 mg do 100 mg na jednotku dávky v závislosti na způsobu podávání.

Příklady provedení vynálezu

Následující příklady provedení vynález ilustrují, aniž by jej omezovaly.

-8Príklad I.

Isomery cis 2-(difenylterbutylsi ly luxy methy D5-[N^-(3-pyridinylkarbonyl)cytosin-1 '-y 1J-1,3-oxathiolanui

Při teplotě okolí a v dusíkové atmosféře se do směsi dichlormethanu (7 ml) a dimethylformamidu (2 ml) přidá 1 ekvivalent kyseliny nikotinové (27 mg, 0,21 molu), 1,1 ekvivalentu BOP ( hexafluorofosfát) (93 mg, 0,23 molu), 1,1 ekvivalentu HOBT ( 1-hydroxybenzotriazol) (31 mg, 0,23 molu), 1 ekvivalent

5’-terbutyldifenylsilyl-2',3‘-didesoxy-3'-thiacytidinu (39 mg, 0,23 molu) a 4 ekvivalenty DIEA ( N,N'-diisopropyl-N-ethylamin) (146 míkrolitrú, 0,84 mmolů). Směs se míchá jednu noc při teplotě okolí, promývá 5 % roztokem kyseliny citrónové (10 ml) a poté vodným roztokem 5% kyselého uhličitanu sodného (10 ml). Vzniklá směs se extrahuje octanem ethylnatým (3x10 ml), suší na síranu sodném a odpaří. Residuum se purifikuje na vrstvě silikagelu. Takto se získá 48 mg čisté sloučeniny.

[>H] NMR: 5(CDCl₃)=l.l (s, 9H, tBu); 3,1-3.6 (m, 2H, CH₂-0);

3,7-42 (m, 2H, C₄H₂); 5,25 (t, 1H, C₅-H); 3.1-3.6 (m, 2H, CH₂-0);

5,5( d, 1H, C₅-H); 6,35 (q, 1 H,C₂-H); 7,4-7,8 (m, 1H, aromatické); 8.0 (d,lH, C$-H); 8.3 (d,lH, nikotinyl);8.8 (d,lH, nikotinyl), 8.8 (d, 1H, nikotínyl); 9,1 (s, IH, nikotiny!).

-9Příklad II

Isomery cis 2-(hydroxymethyl )-5[N⁴-(3-pyridinyIkarbony 1 )cytosiη-1 -yl]-1,3-oxythiolanu 2

Sloučenina ± (25 mg, 0,05 molu) se rozpustí v 3 ml bezvodého tetrahydrofuranu. Do tohoto roztoku se přidají 3 ekvivalenty (135 mikrolitrů, 0,15 mmolu) fluoridu tetrabutylamonia. Roztok se míchá při teplotě okolí po 3 hodiny. Po odpaření rozpouštědla je vzniklý produkt chromatograf ován na na desce s kysličníkem křemičitým (rozpouštědlo: toluen/CH₃OH 15 %). Získá se 13 mg požadované látky.

[^JH] NMR: δ( CDC1₃) =3.1-3.5 (m, 2H, CH₂-0); 3.7-42 (m, 2H, C₄H₂); 5.25 (t,IH, C₅-H); 5.5 (d, H, C₅’-H); 6,35 (q,lH, C₂-H);7,4-7.8 ( m, 1H, aromatický); 8,0 (d, 1H, Cg'-H); 8.3 (d, 1H, nikotinyl), 8.8 (d, 1H, nikotinyl); 9.1 (s, IH, nikotiny!).

Příklad III

Isomery cis 2-(terbutyl-difenyl-silyloxymethyl)-5[N⁴-(3-tosyl)-cytosin-1 ’-y 1 ]-1,3-oxathiolann4

Do roztoku derivátu 5 (56 mg, 0,12 mmolu) v pyridinu (3 ml) se přidájí při 60°C v dusíkové atmosféře 2 ekvivalenty chloridu kyseliny paratoluen sulfonové (46 mg, 0,24 molu). Po 20 hodinách míchání při teplotě okolí se směs odpaří do sucha, promývá 5 % roztokem kyseliny citrónové (10 m1)₍ poté se extrahuje v octanu ethylnatém (3x10 1). Spojené organické fáze se suší na síranu sodném a odpaří. Takto se získá 48 mg požadovaného produktu.

- 10 pH] NMR: δ (CDG1₃>= Η (S,9H, tbu); 2.45 (S,3H,CH₃tosyl); 3.15-3.55 (m, 2H, C₂-CH₂-O); 3.85-4.2(m,2H,C₄ H₂);5.25 (t, 1H, C₅-H); 6.3 (t, 1H, C₂-H); 7,3-7,7 (m, 14H , ArH); 8,05 (d,lH, C₆‘-H).

Příklad IV

Isomery cis 2-(difenylterbutylsilyloxymethyl)-5[N⁴-(3-pyridinylkarbonyl)-cytosin-1 -yl]-1,3-oxathiolanu3

Do roztoku sloučeniny 4 (47 mg, 0,075 mmolu) v lutidinu (2 ml) se v dusíkové atmosféře a při 90°C přidá 6 ekvivalentů (46 mikrolitrů, 0,45 mmolu) pyridinmethylaminu. Teplota se udržuje po 48 hodin při neustálém míchání. Po ochlazení se směs odpaří, promývá 5 % roztokem kyseliny citrónové (10 ml), poté extrahuje v octanu ethylnatém (3x10 ml) a suší nad síranem sodným. Po odpaření se residuum purifikuje chromatografií na silikagelu (rozpouštědlo EtOAC/MeOH 10/1)

Příklad V

Isomery cis 2-(terbutyldifenylsilyloxymethyl)-5(cytosin-1 '-yl)-1,3-oxathiolanu 5

Na roztok 2‘,3'-didesoxy-3'-thiacytidinu (105 mg, 0,45 molu) v pyridinu (6 ml) se v dusíkové atmosféře působí chloridem difenylterbutyIsilylu (140 mikrolitrů, O,5mmolu). Reakční směs se míchá po 24 hodin při teplotě okolí. Po zahuštění za vakua se přidá 30 ml vody a extrahuje se octanem sodným (3x20 ml). Spojené organické fáze se potom suší nad síranem sodným a zahustí se do sucha, čímž se získá sloučenina 5 (210 mg,

-11Rf (AcOEt/MeOH 2/1 )=0.62 [^JH] NMR (CDCI3) δ; 1.1 (s,9H,tbu); 3.1-3.6 (m, 2H,C₂-CH₂-0); 3,7-4,2 (m, 2H, C₄-H₂); 5,25 (t, 2H,C₅-H); 5,5 (d, H, C₅-H); 6.35( q, 1H, C₂-H); 7,4-7,8 (m,10H, 2Ph); 8,0 (d, 1H, C₆-H)

Příklad VI

Isomery cis jodidu 2-hydroxymethyl-5[N⁴-( l -methyl-3pyridinylkarbonyl)-cytosin-1 '-yljl,3-oxathiolany6

V dusíkové atmosféře se k 1 ekvivalentu (46 mg, 0,14 mmolu) sloučeniny 2 rozpuštěné v 4 ml bezvodého acetonitrilu přidá 9 ekvivalentů (1,25 mmolu, 77 mikrolitrú) methyl jodidu. Vzniklý roztok se zahřívá na 50°C po 48 hodin. Po odpaření rozpouštědla se residuum purifikuje chromatograficky, rozpouštědlo BuOH/H₂O-kyselina octová [5:2,5:2,51. Získá se žlutá pevná látka (55 mg).

[IH] NMR: (DMSO d₆) δ=3.25 (t,2H,CH₂-4); 3.90 (dd,2H,C₂-CH₂);

4.45 (S3H, N⁺ -CH3); 5.25 (t, IH, CH-5); 6.30 (t, IH,CH-2); 6,92 (d,lH, CH-6'); 7.30 (d, 1 H.nikotinyl); 7,85 (d,lH, nikotinyl); 8.05 (d,1H CH-5'); 8.20 (d,IH,nikotinyl); 7.85 (d, IH, nikotinyl); 9.01 (d, 1H, nikotinyl).

Hmotnostní spektrum: (FAB⁺) 349 (Μ-1)⁺

- 12 Příklad Vil

Isomery cis 2-hydroxymethy 1-5[N⁴-( 1 -methyl-1 ,4-dihydro-3”-pyridinylkarbonyl)cytosin-1 -yl]-1,3-oxathiolann7

V roztoku 3 ml methanolu obsahujícího 10 % vody a zbaveného plynů se rozpustí 30 mg (0,06 mM) sloučeniny 6. Do tohoto roztoku se přidá 15 mg kyselého uhličitanům sodného a 60 mg dithionitu sodného, Reakční směs se míchá pod dusíkem po 3 hodiny. Roztok se stane oranžovým. Rozpouštědlo se potom odpaří a soli se znovu rozpustí v minimálním množství methanolu, pak se provede filtrace. Filtrát se čistí preparativní chromatografíí na tenké vrstvě (1 mm), (rozpouštědlo: toluen/methanol 1:1) a tím se získá 6 mg bíložluté pevné látky MS: (FAB⁺) 349 (Μ-1)⁺

Příklad Vlil

Isomery cis 2-hydroxymethyl-5[N⁴-(3-chi nol iny lkarbony 1 )-cyt os in-1 ‘-yl]-1,3-oxathiolarn8

Do 2 ml bezvodého dimethylformamidu se přidá 74,4 mg (0,43 mmolu) kyseliny 3-chinolinkarboxylové a potom 96 mg (0,47 mmolu) 1,3-dicykloxehylkarbodiimidu a 63,4 mg (0,47 mmolu) hydrátu hydroxybenzotriazolu. Směs se míchá po 1 hodinu při teplotě okolí pod dusíkovou atmosférou. Objeví se bílý precipitát dicyklohexylmočoviny a pak se přidá 100 mg (0,43 mmolu) 2,3‘-didesoxy-3'-thiacytidinu. Směs se míchá po jednu noc. Potom se pod sníženým tlakem odpaří dimethylformamid, residuum se hydrolysuje vodným nasyceným roztokem NaCl (10 ml). Residuum se nadvakrát extrahuje octanem ethylnatým (2x10 ml). Organické fáze se spojí, suší na síranu hořečnatém a potom

- 13 filtrují. Rozpouštědlo se odpaří. Produkt se čistí chromatograf cky (rozpouštědlo; octan ethylnatý-methano.1 99:2) a tím se získá bílá pevná látka (0,2 mmolu) při výtěžku 46,5 %.

PF = 116-118°C -IR = 1656 cm'¹ (karbonyl amidová funkce) [¹H] NMR; (DM50 d₅) δ = 1 1,75 (s, 1H, NH); 9,4 (d, 1 H,CH-2); 9,15 (d, 1H.CH-4); 8,65 (d, 1H-CH-5’); 8,20(m,2H,CH-8a-CH-5); 8,0 (m, IH,CH-6); 7,80 (m, IH, CH-7); 7,45 (d,IH, CH-6); 6,35 (t, 1H.CH-2); 5,55 (t,1H, CH-5); 3,98 (t 2H, C₂-CH₂-4) [¹³C]NMR: (DMSO d₆) δ =37,14 (C-4); 61,95 (CH₂0-C2); 87,28 (C-2); 8j8,29 (C-5); 95,85 (0-50,- 122,21 (C-3); 126,28 (C-6); 127,71 (C-5); 129,63 (C-10); 129,87 (C-7); 132,08 (C-8); 137,65 (C-4); 138,89 (C-6'); 148,91 (C-9); 149,29 (C-2); 163,16 (C-2‘); 164,51 (C-4')

Hmotové spektrum: (Fab ⁺) 385 (M+1)⁺, 769 (2M+1)⁺

Příklad IX

Isomery cis jodidu 2-hydroxymethyl-5[N⁴-(l-methyl-3-chinolinylkarbonyl)-cytosin-r-yl]1,3-oxathiolan(|9

Připraví se roztok sloučeniny 8 (78 mg, 0,20 mmolu) v 4 ml acetonitrilu. Přidá se 112 mikrolitrů (1,8 mmolu) methyljodidu^ směs se zahřívá na 40°C pod dusíkovou atmosférou po 24 hodin. Rozpouštědlo se odstraní a surové residuum se potom rozpustí v minimálním množství acetonitrilu. Je potom precipitováno přidáním etheru. Takto se získá oranžová pevná látka (60 mg, tedy výtěžek 55 %).

Teplota tání = 156-159°C.

- 14[¹H] NMR: (CD30D) δ = 3,32 (t,2H, CH2-4); 3,99 (dd,2H, C2-CH2); 4,80 (s,3H, ⁺N-CH3); 5,38 (t,JH,CH-5); 6,0 (d,1H,CH-6’); 6,33 (t,lH,CH-2); 8,13 (m, IH,CH-7); 8,39 (t,lH, CH-6); 8,60 (m, 2H, CH-8”); 8,72 (d, 1 H,CH-5·); 9,79 (d, IH, CH-4); 9,95(d, 1 H,CH-2). Hmotové spektrum: (Fab⁺) 399 [ Μ-1 ]⁺, 799 [2(M-1)]⁺

Příklad X

Isomery cis 2-hydroxymethyl-5[N⁴-( 1 -methyl-l,4-dihydro-3^,‘-chinol inylkarbonyl)cytosin-1 -yl]-1.3-oxathiolanulO

Do roztoku 30 mg (0,057 mmolu) sloučeniny 9 v 3 ml odplyněného vodného methanolu (3 ml obsahujícího 10 % vody) se přidá 15 mg kyselého uhličitanu sodného a 60 mg dithionitu sodného. Směs se míchá po jednu hodinu pod dusíkovou atmosférou. Rozpouštědlo se odpaří a surové residuum se čistí preparativní chromatografií (rozpouštědlo: octan ethylnatý-methanol 1:1). Takto se nakonec získá 10 mg žluté pevné sklovité látky, tedy výtěžek 46 %.

['HJ NMR: (D₂0) δ = 3,24 (m,3+2H, NCH₃+CH₂~4); 3,48 (m,2H,CH₂-4); 3,93 (m, 2H,C₂H₂); 5,29 (t, 1 H,CH-5); 6,96 (d, 1H,

CH-6’); 7,13 (m, 2H,CH-6+CH-7); 7,27 (m,2H,CH-5+CH-8);

7,45 (d, 1 H,CH-2”); 8,23 (d, 1 H,CH-5')

Hmotové spektrum: (Fab⁺) 399 (Μ-1)⁺

-15Príklad XI

Isomery cis 2-hydroxymethy 1-5[N⁴-(2-(a,a,a-trif1uor-m-to1uidin)nicotinyl)-cytosin-1 *-yl]1.3-oxathiolanal 1

Do roztoku 2',3'-didesoxy-3’-thiacytidinu (50 mg, 0,2 mmolu) v 5 ml bezvodého DMF ( Ν,Ν-dimethylformamidu) se přidá 1 ekvivalent BOP ( hexafluorofosfát) (93 mg, 0,23 mmolu), 1 ekvivalent kyseliny niflumikové (kyselina 2-(a,a,a-trifluor-m-toluidin)-nikotinové) a 4 ekvivalenty DIEA ( N,N‘-diisopropyl-N-ethylamin) (146 mikrolitrú, 0,84 mmolu). Směs se míchá po jednu noc při teplotě okolí, promývá roztokem 5 % kyseliny citrónové při (10 ml) a potom 5 % vodným roztokem kyselého uhličitanu sodného (10 ml). Vzniklá směs se extrahuje octanem ethylnatým (3x10 ml), suší na síranu sodném a potom odpaří. Residuum se purifikuje chromatografii na sloupci silikagelu (rozpouštědlo: octan ethylnatý/toluen 1:9). Získá se bílá pevná látka (49 mg, výtěžek 48 %).

Testy antivirálních účinků.

Testy anti-HIV - experimentální protokol.

a)obecnosti

Přístroje a vybavení: použitá ultracentrifuga je typu Beckman TL 100. Měření radioaktivních částic bylo prováděno přístrojem Hewlett Packard Tri-Carb Model 1600. Syncitia byla pozorována inverzním mikroskopem Labovert.

-16SLožení pufru pro rozklad NTE:

tri-hydroxymethylaminomethan (10 mM): NaCl (100 mM): EDTA (1 mM).

b) testy antivirálních vlastností v buněčné kultuře

Určení antivirálního účinku je založeno na zkoumání cytopatogenního účinku viru HIV-1 na buněčnou populaci MT4 Populace MT4 vzniká z buněk T isolovaných od pacienta, které jsou transformovány virem VTLH-1. Cytopatogenní účinek viru H1V-I se přenáší vytvářením obřích multijaderných buněk nazývaných syncitie, viditelných pod mikroskopem. Tento účinek viru HIV-1 je pozorován 4 až 5 dní po infekce, je následován odumřením buněk.

Cytopatogenní účinek je přímo korelován s infekcí buněk virem při jejích intracelulární replikaci a s vytvářením virálních antigenú buňkami. Inhibice tohoto účinku tedy odpovídá inhibici rozmnožování viru HIV-1.

Buňky MT4 jsou uchovávány při koncentraci 3x10^ buněk na ml v prostředí RPMI 1640: 10 % plodového telecího séra rozložené po 30 minutách při 56 stupních (hormony, činitele sérového růstu...), 1 % glutaminu, 1 % penicilinu, streptomycinu a 2 mikrogramy na ml polyrenu, který usnadňuje adhesi viru na buňky.

Působení antivirálními látkami je permanentní. Antivirální látky jsou přítomny před, během a po virální infekci. Postupné zřeďování v 10 % plodovém telecím séru se provádí s cílem udržet kulturu MT4 po 8 dní a pozorovat formování synci ti í.

- 17Test MT4:

Před inf ikaci: 3x10⁶ buněk na 100 mikrolitrú je distribuováno na mikrodestičku 96 jamkami a centrifugováno po 3 minuty při 2000 otáčkách za minutu. Usazenina je potom preinkubována po I hodinu při 37°C s 100 mikrolitry antiviřální látky v různých koncentracích.

Infekce: infekce je prováděna v mikrojamkách přidáním 100 infekčních jednotek viru H1V-1 (které jsou určeny tak, aby vyvolávaly tvorbu syncitií po 4 až 5 dnech). Antiviřální látka je stále přítomna pé dobu infekce a zředění viru na 100TCIU.

Po infekci: po inkubaci po dobu 1 hodiny při 37°C jsou MT4 promývány třikrát prostředím RPNI 1640 a kultivovány po 3x10^ buňkách na mililitr každé z koncentrací testovaných sloučenin na destičce s 24 jamkami. V den J3 jsou buňky NT4 zředěny na jednu třetinu. Koncentrace antiviřální látky je udržována konstantní. Každý den je vznik syncitií pozorován mikroskopem, aby bylo možno určit eventuální zpoždění vzhledem k referenčnímu HIV-I. V den Jq je provedeno přidání inverzní transkriptázy. Jestliže buňky nejsou infikovány, znamená to, že došlo k jejich ochraně testovanou antiviřální látkou.

Dávkování inverzní transkriptázy.

Inverzní transkriptáza je DNK polymeráza závislá na RNK. Tento enzym dovoluje replikaci retroviru. Díky ní se RNK viru, zkopírované do DNK, integruje do buněčného genomu. Provirální DNK se transkribuje buněčnými enzymy na virální RNK. Aby byla určena aktivní koncentrace inverzní transkriptázy, koncentruje se stokrát 1 ml povrchové vrstvy kultury ultracentrifugováním po 5 minut při 95000 otáčkách za minutu, získaná virální usaze-18nina se suspenduje v 10 mikrolitrech pufru NTE+TRITON 0,1 % (ether polyoxyethylenu), které lyžují virus a uvolní inverzní transkriptázu. In vitro je prokazována aktivita inverzní transkriptázy. Tento enzym používá syntetickou póly A matrici, mající oligonárys, . mající 12 až 18 residuí. Radioaktivní substrát této reakce je [^H]dTTP (radioaktivní trifosfátovaný thimidin lmCi-ml), nově. zformované tritiované makromolekuly jsou precipitovány trichloroctovou kyselinou a separovány z volného [^HldTTP filtrací. Enzymatická aktivita inverzní transkriptázy se měří pomocí radioaktivity zabudované do komplexů poly-rA-poly-dT. Tato radioaktivita je určována v detektoru částic, po přidání scintilační tekutiny, plnící roli zesilovače.

Test anti-HBV - experimentální protokol.

Z různých metod, užívaných pro určování účinku sloučenin na virus hepatitidy B byla použita metoda kachního viru hepatitidy B (Duck VHB) (J. Med. Virology 1990, 31, 82-89; Viral Hepatitis and Liver Disease, 1988, 506-509; Hepatology, 1989, 10, 186-191). Materiál pro testování in vitro účinku anti-VHB sloučenin je představován hepatocyty kachny, infikovanými virem kachní hepatitidy B (DHBV), (Antimicrob. Agents Chemoter. 1989, 33, 336-339; J. Med Virology, 40, 59-64; Antivir. Res. 1993, 21, 155-171; Antimicrob. Agents Chemoter. 1993, 37, 1539-1542). Je tomu proto, že virus kachní hepatitidy B je znám jako velmi blízký viru lidské hepatitidy B (Viral Hepatitis and Liver Disease, 1988, 526-529; Antiviral Research, 1987,8, 189-199).

-19Za standardních podmínek (Virologie, 1989, 171, 564-572), kultura kachních hepatocytú dovoluje úplnou replikaci DHBV.

Antivirální účinek testovaných sloučenn se měří jako funkce množství virální DNK produkované po 10 dní kulturou infektovaných hepatocytú.

Experimentální protokol:

Třítýdenní kachně, zasažené DHBV, je používáno pro přípravu hepatocytú. Kachna je pod anestesií zabita a isolace hepatocytú je provedena metodou podle Guillouzou (Research in isolated and cultured hepatocytes, J. Libbez Eurotex Ltd/INSERM, 1986). Buňky jsou suspendovány v Leibowitzově prostředí a 5 mikrogramech/ml dobytčího insulinu, 7x10“^ molu hemisuccinátu hydrokortizonu a přidá se 1,5 %DM50. Hustota buněk je 8x10^ buněk, umístěných v kultivačních nádobách 100x20 mm. Testované sloučeniny jsou do kultury přidávány po rozmístění buněk. Prostředí je měněno každý den po 10 dní: Produkce virální DNK viru kachní hepatítidy B v buňkách je odhadována hybridizační metodou Dot Blot podle Fourela a kol. (Viral Hepatitis and Liver Disease, 1988, 506-509; Hepatology, 1989, 10, 186-191). Inhibice se vyjadřuje v procentech množství DNK vyskytující se v buňkách v poměru ke kultuře, která byla infikována DHBV ale nebyla ošetřena nukleosidovými sloučeninami.

Virologické výsledky:

Test HIV:

Sloučeniny jejichž syntéza je popsána v předkládané přihlášce patentu a sloučeniny popsané v popisu dosavadního stavu inhibují

-20replikaci viru HIV-1 BRU (BRU: experimentální virový kmen) v případě, kdy infikované buňky jsou typu MT4 V tabulce I jsou popsány výsledky testu. Sloupec 1 podává jména hlavních ze studovaných sloučenin, sloupec 2 podává hodnoty nazývané IC50 (koncentrace sloučenin vykazující 50 % inhibici replikace viru HIV v infektovaných buňkách MT4, měřená v den J7 po infekci). Pozorováním a počítáním počtu vzniklých syncitií vzhledem k jejich počtu v případě buněk ΓΤΓ4, které byly infektovány, ale nebyly ošetřeny antivirální sloučeninou, je určena hodnota IC5Q.

Test DBHV:

Hlavní z popsaných sloučenin byly testovány na jejich účinek na replikaci viru Duck HBV (DHBV) podle protokolu popsaného v experimentální části tohoto dokumentu.

V tabulce 2 jsou popsány výsledky testu.

-21 Tabulka I

Účinek nukleosidú podle vynálezu na inhibici replikace viru HIV-l, vyjádřená v IC5Q

Sloučenina č.	Sloučeniny	^,c50
9		>100 μΜ
10		1-10 μΜ
8		10 μΜ
6

Sloučenina č.	. Sloučeniny	IC50
7
2		0.1-1 μΜ _i t 2 ; i
11
BCH-189 '(referenční sloučenina)		1 μΜ

-23Tabulka 2

Účinek nukleosidú podle vynálezu na inhibici replikace viru DHBV

Sloučenina č

SCH-189 (referenční sloučenina)

Sloučeniny *^c50

1+0.5 μΜ

2+0.5 μΜ μΜ μΜ

Sloučenina č.	<	>^c50
Sloučeniny
to		2 μΜ
6		i i i
7	-

-25Zkratky:

AcOEt: octan ethylnatý

AIDS: syndrom získané imunodeficience

DNK: kyselina desoxyribonukleová

APT5: kyselina para-toluen solfonová

RNK: kyselina ribonukleová

AZT: 3'-azido-2'-3'-dideoxy-thimidin neboli Zidovudin BOP: hexafluorofosfát benzotriazolyloxitrísdimethyl-aminofosfonium CCM: chromatografie na tenké vrstvě DCC: Ν,Ν'-dicyklohexylkarbodiimid DCU: Ν,Ν'-dicyklohexylmočovina DIEA: Ν,Ν'-diisopropyl-N-ethylamin DMF: N,N-dimethylformamid DHBV: B virus kachní hepatitidy FAB⁺: Fast positive Atomic Bombardment ^HdTTP: trifosfátovaný thymidin radioaktivní na ImCi/ml HIV: virus HIV

HOBT: 1 -hydroxybenzotriazol

IR: infračervený

NMR: magnetická nukleární resonance

PF: teplota tání

TBAF: tetrabutylamoníumfiuorid

TBDP5CI: tetrabuty Idi f eny 1 si ly Ichlorid

3-TC: (-)-(2R,3S)-2-hydroxymethyl-5(cytosin- Γ-yl)-1,3-oxathiolan neboli Lamivudin TCIU: infekční jednotka THF: tetrahydrofuran TsCl: tosylchlorid

-26UV: ultrafialový

VHB: virus B-hepatitidy

VTLH: virus lidských T-lymfotropických buněk

Průmyslová využitelnost

Oxathiolany, způsob jejich přípravy, jakož i přípravky s jejich obsahem podle vynálezu jsou farmaceutické chemii a to vzhledem ke svému účinku.

farmaceutické použitelné ve antivirálnímu

Claims

1. 5-(cytosiny 1-1)-1,3-oxathiolany v konfiguraci cis (buď 2R55 nebo 2S-5R), obecného vzorce I ve kterém R je zbytek acyl nebo aralkyl, derivát dusíkatého mono- nebo bicyklického heterocyklu a skupina hydroxymethyl v poloze 2 je v poloze cis vzhledem k rovině určené polohami 2 a 5.

2. 5-(cytosinyl-1)-1,

3-oxathiolany podle bodu 1, v konfiguraci 2R-55, obecného vzorce

-283. 5-(cytosinyl-1)-1,3-oxathiolany podle bodu 1 v konfiguraci 25-5R obecného vzorce

HO” CH

4. Nikotinické sloučeniny podle bodů 1 až 3 ve kterých R má vzorec I (Ia ) ve kterém X představuje vodík, atom halogenu, nitro skupinu, nižší alkoxy nebo zbytek trif luormethyl a n je celé číslo od 1 do 3 a kde acylový zbytek je v posici 2,3, nebo 4.

5. Dihydropyridinové sloučeniny podle bodu i až 3, ve kterých R má vzorec

-29(X).

R, (Ib) ve kterém R| je alkoylový zbytek mající od 1 do 10 atomů uhlíku,

X a n jsou definovány stejně jako výše a acylový zbytek je v poloze 2,3 nebo 4.

6. Kvarterní nikotinické sloučeninypodle některého z bodů 1 až 3 ve kterém R má obecný vzorec lc

O

I ve kterém A je anorganický nebo organický anion R], X a n jsou definovány stejně jako výše a acylový zbytek je v poloze 2,3 nebo 4.

7. Chinolinové sloučeniny podle některého z bodů 1 až 3, ve kterých R má obecný vzorec Id (X) o

_H _ Od)

-30ve kterém karbonylový zbytek je v poloze 2,3, nebo 4,

X představuje vodík, halogen, zbytek triflormethyl, nižší alkoxy nebo skupinu nitro a n‘ představuje celé číslo od 1 do 6.

8. Dihydrochinol inové sloučeniny podle některého z bodu 1 až 3, ve kterém R má obecný vzorec le «1 ve kterém R^ a X jsou definovány stejně jako výše a n* představuje celé číslo od 1 do 6.

9. Chinolinové kvaterní sloučeniny podle některého z bodu 1 až 3, ve kterém R má obecný vzorec lf ve kterém R j, X a n' jsou definovány stejně jako výše acylový zbytek se nachází v poloze 2,3 nebo 4 a A je anorganický nebo organický anion.

-31

10. (Dihydropyridyl alkoyl)-ové sloučeniny podle některého z bodu 1 až 3, ve kterém R má obecný vzorec Ig *1 ve kterém R], X a n jsou definovány stejně jako výše a m je celé číslo od 1 do 6.

11. Adiční soli sloučenin podle některého z bodu 1 až 10 s anorganickou nebo organickou kyselinou.

12. Optické isomery sloučenin podle některého z bodu 1 až 11.

13. Sloučenina cis 2-hydroxymethyl-5[N⁴-(3-pyridylkarbonyl)-cytosin-1 -yl]-1,3-oxathiolan podle bodu 1 nebo podle bodu 11 nebo podle bodu 12 a její adiční soli s anorganickou nebo organickou kyselinou ve formě racemické nebo opticky aktivní.

14 Způsob výroby sloučenin podle některého z bodů 1 až 13, vyznačující se tím, že se 5-(cytosinyl-1)-1,3-oxathiolan cis vystaví působení funkčního derivátu karboxylové kyseliny obecného vzorce ROH, kde R je acylový zbytek odvozený od aromatického nebo dihydroaromatického, mono- nebo bicykl ického dusíkatého heterocyklu nebo se vystaví působení aktivního aralkylového derivátu vzorce R'Z, kde R' je araikylový zbytek odvozený od dusíkatého aromatického nebo dihydroaroma

-32tického mono- nebo bicykl ického heterocyklu, a Z je nestabilní snadno odštípnutelný zbytek.

15. Farmaceutické sloučeniny s antivirálním účinkem, vyznačující se tím, že jako aktivní látku obsahují alespoň jednu ze sloučenin obecného vzorce I ve kterém R je acylový nebo aralkylový zbytek, odvozený od dusíkatého mono- nebo bicykl ického aromatického nebo dihydroaromatického heterocyklu a skupina hydroxymethyl v poloze 2 je v poloze cis vzhledem k rovině určené polohami 2 a 5 nebo jedna z jejich adičních solí s kyselinou v racemické nebo opticky aktivní formě ve směsi nebo v asociaci s inertním a netoxickým a farmaceuticky přijatelným excipientem.