OA10258A

OA10258A - Oxathiolanes leur procédé de préparation et les compositions pharmaceutiques qui en referment

Info

Publication number: OA10258A
Application number: OA60770A
Authority: OA
Inventors: Anne-Sophie Charvet-Faury; Michel Camplo; Jean-Louis Kraus
Original assignee: Laphal Laboratoires Sa
Priority date: 1994-05-24
Filing date: 1996-01-24
Publication date: 1997-10-07
Also published as: CA2167930A1; WO1995032200A1; FR2720397B1; HU219299B; AP9600784A0; FI960316A0; NO306299B1; CN1080264C; HUT75112A; KR960703903A; AU2620995A; FR2720397A1; FI960316L; CZ21996A3; US5708000A; KR100242891B1; RU2142462C1; FI960316A7; PL181713B1; JPH09502453A

Description

010258

OXATHIOLANES, LEUR PROCEDE DE PREPARATIONET LES COMPOSITIONS PHARMACEUTIQUES QUI EN RENFERMENT 5

La présente invention se rapporte au domaine de la chimie organique et plusprécisément à celui de la chimie thérapeutique.

Elle a plus particulièrement pour objet des 2'.3'-didesoxynuc!éosides substitués enio position 2 par un cycle 1,3-oxathiolane.

Elle a spécifiquement pour objet îes 5-(cyiosinyl-1) 1,3-oxathio!anes de configurationcis (2R-5S ou 2S-5R) répondant à la formule générale

que l'on peut représenter sous l'une des deux représentations spatiales

20 dans laquelle R est un radical acyle ou aralcoyle. dérivés d'un hétérocycle mono- ou bicyclique azoté et le groupe hydroxyméthyle en position 2 est en position cis par rapport au plan déterminé par les positions 2 et 5. 010258

Parmi les différentes définitions prises par le substituant R. on différenciera a) les dérivés nicotimques où l’hétérocycle est une structure pyridique et le5 groupement acyle est en position 2, 3 ou 4. de formule la (X) n

( la ) dans laquelle X représente de l'hydrogène, un atome d'halogène, un groupe nitroίο un alcoxy inférieur ou un radical trifluorométhyle et n est un nombre entier variant de 1 à 3 b) les dérivés dihydropyridiques où l’hétérocycle est une 1,4-dihydropyridinô et leradical acyle est en position 2, 3 ou 4, de formule ib

R 1 dans laquelle R-j est un radical alcoyle ayant de 1 à 10 atomes de carboneX et n sont définis comme précédemment c) les dérivés nicotiniques quaternisés où l'atome d'azote porte un substituantalcoyle et le radical acyle est en position 2, 3 ou 4, ayant la formule générale le

*1 dans laquelle A est un amon minéral ou organique R] X et n sont définis comme précédemment *»»®>3Π5ϊ5·5Η9^Β8Β*3Π3 010258 d) les dérivés quinolèiques où l'hétérocycle est une structure bicyclique ayant laformule générale ld

(fd) dans laquelle le radical carbonyle peut être en position 2, 3 ou 4 X représente de l'hydrogène, un halogène, un radical trifluorométhyle, un alcoxyinférieur ou un groupe nitro et n' représente un nombre entier variant de 1 à 6, e) les dihydroquinoleines de formule générale le 10

de) 15 dans laquelle Rq et X sont définis comme précédemmentet n’ est un nombre entier variant de 1 à 6 f) les quinoléines quaternisées de formule générale If

,© (H) 20 dans laquelle Rq. X et n' sont définis comme précédemmentle radical acyle se trouve en position 2, 3 ou 4et A est un anion minéral ou organique 25 g) les (dihydropyridy!) alcoyles de formule générale lg U O 95/3220(1 PCT/FR95/00683 01 0258

<clt - (Ig) k, dans laquelle R-|, X et n sont définis comme précédemmentet m est un nombre variant de 1 à 6 ainsi que leurs sels d'addition avec un acide minéral ou organique.

Les composés de formule I peuvent être dédoublés en leurs isomères optiques. Onobtient ainsi l'isomère (+) et l'isomère (-·). io Les infections rétrovirales sont la cause de maladies graves, en particulier dusyndrome d'immunodéficience acquise (SIDA) qui est une affection virale souventfatale, et à un degré moindre les hépatites. Plusieurs composés de typenucléosidiques ou hétéro-nucléosidiques, sont actuellement cliniquement utiliséspour Se traitement de ces affections rétrovirales. Ceux-ci sont les dérivés AZT (3‘- 15 azido-2’,3’-didesoxythymidine) (Proc. Naîl. Acad. Sci. 82, 7096-7100. 1985), ddC(2',3'-didesoxycytidine) (Proc. Natl. Acad. Sci. 85, 1911-15, 1986), d4T (2',3’-didéhydro-3'-désoxyîhymidine) (Bioehem. Biophys. Res. Comm. 142, 128-34, 1987),ddl (2',3'-didésoxyinosine) (Antiviral. Chem. Chemother 2, 221, 1991), BCH-189 ou3TC (2',3'-dideoxy 3'-thiacytidine) décrit dans la demande de brevet européen 90 20 30 1 335.7 et suivants. Le nombre restreint de ces composés antirétroviraux à la disposition du praticien, et leur efficacité thérapeutique limitée appelle la recherchede nouveaux composés dont les vertus thérapeutiques seraient accrues et les effetssecondaires diminués. 25 On connaît déjà des dérivés de 2~[(1-hydroxyméthy l) 1,3-oxathioian 5-yl) cytosine etnotamment les esters de la fonction hydroxyméthyle (demande de brevet européen0.382.526) ou les dérivés halogénés en position 5* du noyau pyrimidique (R.FSCHINAZI et al. Antimicrob Agents and Chemotherapy 36 (1992) 2423-2431). 30 Les composés de l'invention possèdent la propriété d'inhiber la réplication de rétrovirus humains, en particulier le VIH et le virus de I hépatite B (VHB). Ces composés, dérivés du BCH-189 ou 3TC. incluent dans leur structure une entité 1.4- dihydro-1-méthyl-3-quinoleyIcarbonyl fixée sur le groupement amine exocycîique de la cytidine Cette entite structurale particulière confère en pharmacologie \VO 95/32200 5 PCTAFR95/00683 010258 expérimentale la propriété d'augmenter et de faciliter le passage de la barrièrehemato-encéphalique (Pharmacol Ther 19. 337-396, 1983 - Methods Enzymol112, 381-396, 1985 - Drug. Des. Del, 1. 51-64. (1986) - J. Med. Chem 31, 244-249.1988 - J. Med. Chem 32. 1782-1788. 1989 - J. Med. Chem. 32, 1774-1781. 1989)

La synthèse chimique de ces composés a été effectuée à partir de protocolesexpérimentaux classiques. La mise au point de ces nouveaux hêtéronucléosidesnécessite comme composé de départ le dérivé 2’,3'-didéoxy-3'-thiacytidine dontplusieurs méthodes de synthèse sont décrites dans la littérature chimique (J. OrgChem. 56, 6503, 1991 - J. Org. Chem. 57. 2217, 1992 - Tet. Lett. 33, 4625, 1992 -Nucleosides and Nucléotides 12, 225, 1993). A partir de ce dérivé, la synthèse descomposés faisant l’objet de la présente invention et celle des intermédiaires qui s’yrapportent, sont décrites dans la présente demande de brevet. L'invention se rapporte aussi au procédé d’obtention des composés de formulegénérale l qui consiste à soumettre un 5-(cytosinyi-1) 1,3-oxaihiolane ci s à l'actiond'un dérivé fonctionnel d'acide carboxylique de formule ROH où R est un radicalacyle dérivé d'un hétérocycls aromatique ou dihydroaromatique. mono- oubicyclique azoté ou à l'action d'un dérivé actif araicoylé de formule R'Z où R' est unradical aralcoyle dérivé d'un héterocycle aromatique ou dihydroaromatique, mono-ou bicyclique, azoté et Z est un radical labile facilement clivable. D'une manière plus précise, le dérivé fonctionnel d'acide ROH est un halogénure, unanhydride, un anhydride mixte formé avec un carbodiimide ou un ester réactifcomme un ester de phénol.

Dans le cas d'un dérivé araicoylé, Z est un atome d'halogène ou un radical alcoyl-ouaryl suîfonyle. L'invention a également pour objet les compositions pharmaceutiques à actionantivirale caractérisées en ce qu'elles renferment à titre de principe actif au moinsun composé de formule générale l ou un de ses sels d'addition avec un acideminéral ou organique, en association ou en mélange avec un excipient ou unvéhicule inerte, non-toxique, pharmaceutiquement compatible, notamment pourl'usage topique ou general.

Dans ces compositions, la teneur en principe actif de forme générale I s'échelonnede 0,1 mg à 100 mg par prise unitaire en fonction de la voie d'administration. V\O 95/322(1(, PCT/FR95/00683 010258 EXEMPLE 1

Isomères du Cis 2-(diphénylterbutylsilyloxyméthyl)-5 (N4-(3"- pyridinylcarbonyl) cytosine-1 '-yl]-1,3-oxathiolane 1 A température ambiante, sous atmosphère d'azote, on additionne dans un mélangede dichlorométhane (7 ml) et de diméthytformamide (2 ml). 1 eq. d'acide nicotinique(27 mg, 0.21 mmol) 1.1 eq. de 8OP (93 mg, 0.23 mmol). 1.1 eq. de HO8T (31 mg.0.23 mmol). 1 eq. de 5’-terbutyldiphénylsilyl-2',3’didesoxy-3'-thiacytidine (39 mg.m 0,23 mmol), 4 eq. de DlEA (146 pl, 0,84 mmol). Le mélange est agité pendant unenuit à température ambiante, lavé par une solution d'acide citrique à 5% (10 ml),puis par une solution aqueuse de bicarbonate de sodium à 5% (10 ml). Le mélangerésultant est extrait à l'acétate d'éthyle (3x10 ml), séché sur Na2SO4. et évaporé. Le résidu est purifié sur plaque de gel de silice. On obtient 48 mg de composé pur. 15 [1 H] RMN : δ (CDCI3) = 1.1 (s,9H.tBu); 3.1-3.6 (m,2H.CH2-O); 3.7-4.2 (m,2H,C4H2);5.25 (L1H.C5-H); 3.1-3.6 (m,2H,CH2-O); 5.5 (d,1H,C5-H); 6.35 (q,1H.C2-H); 7.4-7.8(m,1 H,aromatique); 8.0 (d,1H,Ce’-H); 8.3 (d.ÏH.nicotinyl); 8.8 (d.ÏH.nicotinyl); 8.8(d.ÏH.nicotinyl); 9.1 (d,1 H.nicotinyl). 20

EXEMPLE II

Isomères du Cis 2-{hydroxymethyi)-5 [N4-{3”-pyridinylcarbonyl) cytosine-l’-yî] -1,3-oxathiolane 2 25 Le composé 1 (25 mg, 0,05 mmol) est dissout dans 3 ml de tétrahydrofuraneanhydre. A cette solution, on ajoute 3 oq (135 pl, 0.15 mrnol) de fluorure detétrabutylammonium. La solution est agitée à température ambiante pendant 3 h.Après évaporation du solvant, le produit résultant est chromatographiè sur plaque desilice préparative (éluant : toluène/CH3OH 15%). On isole 13 mg de composé 30 désiré. (1 Hl RMN . δ (CDCI3) = 3.1-3.6 (m,2H,CH2-O); 3.7-4.2 (rn.2H.C4H2); 5.25 (L1H,C5-H). 5 5 (d.H.C5-H), 6.35 (q,1H,C2-H); 7.4-7.8 (m.1 H.aromatique); 8.0 (d,1 H.Cg'-H);8 3 (d.ÏH.nicotinyl); 8.8 (d.ÏH.nicotinyl). 9.1 (s, 1 H.nicotinyl). u

EXEMPLE III

Isomères du Cis 2-{terbutyl-diphényl-silyloxyméthyl)-5-[N4-(3’*-tosyl) cytosine-1 ’-yl]-1,3-oxathiolane 4 WO 95/32200 PCT7FR95/00683 010258 A une solution de dérivé 5 (56 mg, 0.12 mmol) dans la pyridine (3 ml), on additionneà 60°C sous atmosphère d'azote 2 eq. de chlorure d'acide paratoluène suffonique(46 mg. 0,24 mmol). Après 20 h d'agitation à température ambiante, le mélange ests évaporé à sec, lavé par une solution d'acide citrique à 5% (10 ml), puis extrait àl’acétate d'éthyle (3x10 ml). Les phases organiques réunies sont séchées sur

Na2SO4 et évaporées. On isole 48 mg de produit désiré.

[1H] RMN : (CDCI3) = 1.1 (s,9H,tbu); 2.45 (s.3H,CH3 îosyl); 3.15-3.55 (m.2H,C2- 10 CH2-O); 3.854.2 (m,2H,C4H2); 5.25 (t.1H,C5-H); 6.3 (t.1H,C2-H); 7.3-77 (m,14H,ArH); 8.05 (d,1H,Cg'-H);

EXEMPLE IV

Isomères du Cis 2-{ciiphény!terbutyls»lyloxyméthyl)-5-[N^(3"-pyridjnyl carbonyJ) 15 cytosine-1 ’-ylj-l ,3-oxaihiolane 3 A une solution de dérivé 4 (47 mg, 0,075 mmol) dans la iutîdine (2 ml) sousatmosphère d'azote à 90°C, on ajoute 6 eq. (46 pl, 0,45 mmol) depyridinylmethylamine. Le chauffage est maintenu pendant 48 h soüs agitation. Après 20 refroidissement, le mélange est évaporé, lavé par une solution d'acide citrique à 5%(10 ml), puis extrait à l’acétate d'éthyle (3x10 ml), séché sur ,Na2SO4. Aprèsévaporation, le résidu est purifié par chromatographie sur plaque de gel de silice,(éluant : EtOAC/MeOH. 10/1)

25 EXEMPLE V

Isomères du Cis 2-(ierbutyl-diphényl-sifyloxyméîhyl)-5-(cytosine-r-yl).1,3-oxathiolane 5

Une solution de 2',3'-didéoxy-3'-thiacytidine (105 mg, 0,45 mmole) dans la pyridine 30 (6 ml) est traitée sous atmosphère d'azote par du chlorure de diphényîierbutylsilyle (140 pl, 0.5 mmole). Le mélange réactionnel est agité pendant 24 heures à température ambiante. Après concentration sous vide, on ajoute 30 ml d'eau et on extrait à l'acétate d'éihyl (3x20 ml). Les phares organiques réunies sont alors séchées sur Na2SO4 et concentrées à sec pour donner le composé 5 (210 mg, Rdt 55 quantitatif) sous forme d'un solide blanc. WO 95/32200 PCT/FR95/00683 0 1 0258

Rf (AcOEt/MeOH 2/1 ) = 0.62 pH] RMN (CDCI3) o 1.1 (s,9H,tbu), 3.1-3,6 (m.2H,C2-CH2-0); 3,7-4,2 (m.2H,C4-H2); 5.25 (LIH.C5-H); 5.5 (d.H.C5-H); 6,35 (q,1H,C2-H) 7.4-7,8 (m,10H.2Ph); 8.0(d,1 H.Cg’-H)

EXEMPLE VI

Isomères du Cis iodure de 2-{hydroxyméîhyl)-5-[N4-( J"-méthyl-3”-pyridinylcarbonyl) cytosine-1'-ylj-1,3-oxatbiolane 6

Sous atmosphère d'azote à 1 eq (46 mg, 0,14 mmol) de composé 2 dissous dans 4ml d'acétonitrile anhydre, on ajoute 9 eq. (1,25 mmol, 77 pl) d'iodure de méthyle. Lasolution résultante est chauffée à 50°C pendant 48 h. Après évaporation dessolvants, le résidu est purifié par flash chromatographie, éluant BuOH/H2O/actdeacétique {5:2,5:2,5]. On obtient un solide jaune (55 mg).

[1 H] RMN : (DMSO d6) δ = 3.25 (t,2H,CH2-4); 3.90 <dd,2H,C2-CH2); 4.45 (s,3H,N+-CÎI3); 5.25 (t,1H,CH-5); 6.30 (t,1H,CH-2); 6.S2 (d,1H.CH-8’); 7.30 (d,1H,nicotinyi);7.85 (d,1H,nicotinyl); 8.05 (d,1H,CH-5'); 8.20 (d,1H,nicotinyl); 7.85 (d.lH.nicotinyl);9.01 (d.lH.nicotinyl).

Spectre de masse : (FA8+) 349 (M-1)+ EXEMPLE VI!

Isomères du Cis 2-{hydroxyméthyI) -méhty!-1",4’’-dihydro-3"-pyndinyl ca.rbonyl) cytosine-1’-y!]-1,3-oxathiolane 7

Dans 3 m! d'une solution dégazée de rnétî ianol contenant 10% d'eau, on dissout 30mg (0,06 mM) de composé 6. A cette solution, on ajoute 15 mg de bicarbonate desodium et 60 mg de dithionite de sodium. Le mélange réactionnel est agité sousazote pendant 3 h. La solution devient orangée. On évapore le solvant puis onresuspend les sels dans un minimum de méthanol; on filtre. Le filtrat est purifié parchromatographie sur couche mince préparative (1 mm). (Eluant : Toiuène/méthanol1:1) pour donner 6 mg d'un solide blanc-jaune SM : (FAB4-) 349 (M4)+

EXEMPLE VIII

Isomères du Cis 2-hydroxyméthyl 5-[N^-3"-quinolinyicarbonyl) cytosin-1' -yl]1,3-oxathiolane 8 WO 95/3220(1 PCT/FR95/00683 01 0258 A 2 ml de diméthylformamide anhydre, on ajoute 74.4 mg (0,43 mmol) d'acide 3-quinolme carboxylique puis 96 mg (0.47 mmol) de 1,3-dicyclohexyl carbodiimide et 63.4 mg (0.47 mmol) d'hydrate d'hydroxybenzotriazole. Le mélange est agitépendant 1 h à température ambiante sous azote. Un précipité blanc des dicyclohexylurée apparaît et on ajoute alors 100 mg (0,43 mmol) de 2.3'-dideoxy 3'-thiacytidine. Le mélange est agité pendant une nuit. Ensuite, on évapore ledimèthylforrnamide sous pression réduite, et le résidu est hydrolysé par une solutionaqueuse saturée en NaCI (10 rnl). On extrait le résidu à deux reprises par del'acétate d'éthyle (2x10 ml). Les phases organiques sont combinées, séchées surio sulfate de magnésium puis filtrées. Le solvant est évaporé. Le produit est purifié par (flash) chromatographie. (Eluant : acétate d'éthyle/ méthanol 98:2) pour donner 78mg d'un solide blanc (0,2 mmol) soit un rendement de 46,5 % PF - 116-118°C - IR =1656 cm'"' (carbonyle de la fonction amtde) i5 pH] MMR (DMSO d6) δ = 11,75 (s,1M,NH); 9.40 (d,1H,CH-2"); 9,15 (d,1H.CH-4");

('!3C]MMR : (DMSO d6 ) δ = 37.14 (C-4); 61,95 (CH20-C2); 87,28 (C-2); 88,29 (C- 20

163,16 (C-2'); 164,51 (C-4')

Spectre de masse : (Fab+) 385 (Μ+1)+· 769 (2M*1)+

EXEMPLE IX 25 Isomères du Cis iodure de 2-hydroxyméthyl S-fN^-fV-méthyl 3"-quinolinylcarbonyl) cyÎosin-1*yî]-1,3-oxathiolane 9

On prépare une solution de composé 8 (78 mg soit 0,20 mmol) dans 4 mld'acétonitrile. On ajoute 112 μΙ (1,8 mmol) d'iodure de méthyle et le mélange est 30 chauffé à 40°C sous azote pendant 24 h. Le solvant est chassé et le résidu brut estalors dissout dans le minimum d'acétonitrile. On le reprécipite pur addition d'éther.On obtient ainsi un solide orangé (60 mg soit un rendement de 55%.

PF = 156-159°C P H] MMR (CD3OD) δ = 3,32 (t,2H.CH2-4): 3.99 (dd,2H,C2-CH2); 4,80 (s.3H,+N- 3^ CH3), 5.38 (t.1H.CH-5); 6.0 (d.1H.CH-6'). 6.33 (L1H.CH-2); 8.13 (m. 1 H.CH-7"); 8.39 (rn.1H.CH-6"). 8.60 (m.2H,CH-8"); 8.72 (d.1 H.CH-5’); 9,79 (d.1 H.CH-4"). 9.95 (d.1H.CH-2")

Spectre de masse : (Fab+) 399 [M-ljL 799 {2(M-I)]+. WO 95/32200 ,θ PCT/FR95/00683 010258

EXEMPLE X

Isomères du Cis 2-hydroxymethyl 5-[N4-{1"-frjéthyl 1",4"-dihydro 3*'-quinolinylcarbonyl) cytosin-1'-yl]-1,3-oxathiolane 10

On ajoute à une solution de 30 mg (0,057 mmol) du composé 9 dans 3 ml deméthanol aqueux dégazé (3 ml contenant 10% d'eau), 15 mg de bicarbonate desodium et 60 mg de dithionite de sodium. Le mélange est agité pendant une heuresous azote. Le solvant est évaporé et le résidu brut est purifié par chromatographieίο préparative. (Eluant : acétate d'éîhyle/méthanol 1:1). On obtient finalement 10 mg d'un solide vitreux jaune soit un rendement de 46%.

[1H] NMR : (D2O) δ = 3,24 (m,3+2H,NCK3+CH2-4”); 3,43 (m,2H,CH2-4); 3.93 (m.2H,C2H2); 5.29 (t,1H,CH-5); 6.96 (d,1H,CH-6'): 7,13 (m,2H,CH-6"+CH-7"); 7.2715 (m,2H,CH-5"+CH-8"); 7.45 (d,1H,CH-2"); 8.23 (d.lH.CH-5’)

Spectre de masse : (Fab+) 399 (M-1)+

EXEMPLE XI

Isomères cis du 2~hydroxyméthyl-5-{N^-(2-(a(a,a-trjfiuoro-m-toluidjno)20 nicotinyl)-cytosine-ryl3-1,3-oxathiolane 11 / A une solution de 2’,3’-didéoxy-3'-îhiacytidiiie (50 mg. 0.2 mmol) dans 5 ml de DMFanhydre, on additionne 1 I eq. de BOP (93 mg, 0,23 mmol), 1 eq. d'acide niflumsque(acide 2-(a,a,a-tr'rfioro-m-îoluidino) nicotinique) et 4 eq. de DÎEA (146 μΙ, 0.84 mmol). 25 Le mélange est agité une nuit à température ambiante, lavé par une solution d’acidecitrique à 5% (10 ml), puis par une solution aqueuse de bicarbonate de sodium à 5%(10 ml). Le mélange résultant est extrait de l'acétate d'éthyle (3x10 mi), séché sursulfate de sodium, puis évaporé. Le résidu est purifié par chromatographie surcolonne de gel de silice (éluant : acétate d'éthyle/toluéne 1:9). On obtient un solide w blanc (49 mg, rendement 48%).

TEST D’EVALUATION DES PROPRIETES ANTIVIRALES TESTS ANTI-HIV - Protocole experimental > 5 / WO 95/32200 , , PCT/FR95/00683 010258 a) généralités

Appareillage l'ultracentrifugeuse utilisée est de type Beckman TL 100 Le comptagedes particules radioactives a été effectué sur un appareil Hewlett Packard Tri-CarbModèle 1600 Les syncitia sont observées d'un microscope inversé Labovert. 5 Composition du tampon de lyse NTE : Tris-hydroxyméthylaminométhane (10 mM);NaCI (100 mM). EDTA (1 mM) b) tests d'évaluation des propriétés antivirales en culture cellulaireL'évaluation de l'effet antiviral est basée sur l’étude de l'effet cytopathogène du virus io VIH-1 sur la lignée cellulaire MT4. La lignée MT4 a pour origine des cellules Tisolées à partir d'un patient, transformées par le virus VTLH-1. L'effet cytopathogènedu virus VIH-1 se traduit par la formation de cellules géantes rnultinuclées appelées"syncitia", visibles au microscope. Cet effet du VIH-1 est observé 4 à 5 jours aprèsl'infection; il est suivi par la mort des cellules. 15 L'effet cytopathogène est directement corrélé à l'infection des cellules par le virus, àsa réplication intracellulaire et à l'expression des antigènes viraux par les cellules.Une inhibition de cet effet correspond donc à une inhibition de la multiplication duvirus VIH-1.

Les cellules MT4 sont entretenues à 3.10^ cel!uîes/ml dans du milieu RPtVil 1640 : 20 10% de sérum de veau foetal décomplémenté pendant 30 rnn à 56°C {hormones, facteurs de croissance sériques ...), 1% glutamine, 1% pénicilline, .streptomycine et2 pg/ml de polyréne qui favorise l'adhésion du virus sur les cellules. L'action du traitement par l'antiviral est permanent. En effet, celui-ci est présentavant, pendant et après l'infection virale. Des dilutions successives sont effectuées 25 dans le sérum de veau foetal à 10%, afin de pouvoir cultiver les MT4 pendant δ jourset observer la formation des syncitia.

Test MT4 :

Avant l'infection ; 3.Ί0θ cellules/ΙΟΟμΙ sont distribuées dans une microplaque 96 30 puits et centrifugées 3 mn à 2000 tpm (tours par minutes). Le culot est alorspréincubé 1 h à 37°C avec 100 pl de différentes concentrations d'antiviral à tester.Infection : l'infection est réalisée en micropuits en rajoutant 100 TCiU (unitésinfectieuses) du virus VIH-1 (ce titre du virus VIH-1 est déterminé pour induire laformation de syncitia en 4 ou 5 jours). L'antiviral est toujours présent lors de 38 l'infection et la dilution du virus à 100 TCIU.

Après l'infection : après une incubation de 1 h à 37°C, les MT4 sont lavées 3 foisavec du RPMI 1640 et mises en culture à raison de 3.105 cellules par millilitre dechacune des concentrations des composés à tester en plaques de 24 puits. Lors du WO 95/32200 ,2 PCT/FR95/00683 010258 passage effectué au jour J3. les cellules MT4 sont diluées au 1/3 La concentrationde l’antiviral est maintenue. Chaque jour, l'apparition de syncitia est observée aumicroscope afin de détecter un éventuel retard par rapport au témoin VIH-1 A Jg. ledosage de la transcriptase inverse est effectué. Si les cellules ne sont pas infectées,c’est donc qu’il y a protection par l’antiviral testé.

Dosage de la transcriptase inverse :

La transcriptase inverse est une ADN polymérase ARN dépendante. Cet enzymepermet la réplication des rétrovirus. Grâce à celui-ci, l'ARN du virus, copié en ADN.s'intégre dans le génome cellulaire. L’ADN proviral est transcrit par les enzymes dela cellule en ARN viral. Pour le dosage de l'activité transcriptase inverse, onconcentre 100 fois 1 ml de surnageant de culture par ultracentrifugation pendant 5mn à 95000 tpm; le culot viral obtenu après ultracentrifugation est remis ensuspension dans 10 pl de tampon NTE + TRITON 0.1% (éther de polyoxyéthylène);celui-ci sert à lyser le virus et à libérer la transcriptase inverse, ’n vitro, c'est l’activitétranscriptase inverse qui est mise en évidence. Cet enzyme utilise une matricesynthétique poly A possédant une amorce oligo dT ayant de 12 à 18 résidus. Lesubstrat radioactif de cette réaction est le pHjdTTP (thymidine triphosphatesradioactive à 1mCi/ml); Iss macromolécules tritiées néoformées, sont précipitées parde l’acide trichloroacétique et séparées du pH]TTP libre par filtration. L’activitéenzymatique de la transcriptase inverse est mesurée par la radioactivité incorporéedans les complexes poly-rA/poly-dT. Cette radioactivité est déterminée dans uncompteur de particules, après addition du liquide scintillant tenant fonctiond’amplificateur. TEST ANTl-HBV- Protocole expérimentai

Parmi les différentes méthodologies employées pour évaluer l’activité de composéssur le virus de l’hépatite 8 (VH8). le modèle du virus de l’hépatite B du canard (DuckH8V) a été utilisé (J.Med. Virology 1990. 31, 82-89; Viral Hepatitis and LiverDisease, 1988, 508-509; Hepalology. 1939, 10, 186-191). Le matériel de culturepour tester "in vitro" l’activité anti-VHB de composés est constitué d’hépatocytes decanard, infectés par le virus de l’hépatite B du canard (DH8V). (Antimicrob. AgentsChemother. 1989, 33. 336-339; J. Med. Virology. 40, 59-64; Antivir. Res. 1993, 21,155-171. Antimicrob. Agents Chemother. 1993. 37, 1539-1542). En effet, le virus del’hépatite B du canard est reconnu comme étant très proche du virus de l’hépatite 8humain (Viral Hepatitis and Liver Disease. 1988. 526-529; Antiviral Research. 1987,8, 189-199). Dans des conditions standardisées (Virology, 1989, 171, 564-572), la / WO 95/32200 I , PCT/FR95/00683 010258 culture d'hépatocytes de canard permet la réplication complète du DHBV L'activitéantivirale des composés testés est mesurée en fonction de la quantité d'ADN viralproduit pendant 10 jours de culture des hépatocytes infectés.

Protocole expérimental

Un caneton de 3 semaines, atteint par le DHBV. est utilisé pour la préparation deshépatocytes. Le canard est tué sous anesthésie et l'isolement des hépatocytes esteffectué selon la méthodologie de Guillouzou (Resecrch in isolated and culturedhépatocytes, J. Libbey Eurotex Ltd/INSERM, 198S), Les cellules sont mises ensuspension dans le milieu de Leibowitz et 5 pg/ml d'insuline bovine, 7.10'5 moled’hémisuccinate d'hydrocortisone et 1.5% de DMSO sont ajoutés. La densité descellules est de 8.106 cellules, étalées dans des boîtes de culture de 100x20 mm.Les composés testés sont ajoutés à la culture après l'étalement des cellules. Lemilieu est changé tous les jours, pendant 10 jours, La production d'ADN viral duvirus de l'hépatite B de canard dans le surnageant des cellules est estimée par laméthode d'hybridation "Dot Blot", selon Fourel et al. (Viral Kepatitis and LiverDisease, 1988, 506-509; Hepatoiogy, 1989, JW, 186-191). L’inhibition est expriméeen pourcentage de la quantité d'ADN présent dans le surnageant des cellules, parrapport à une culture infectée par le DHBV non traitée avec un dérivé nuciéosidique.

RESULTATS VIROLOGIQUES

Tests HIV :

Les composés dont la synthèse est décrite dans la présente demande de brevet, etles structures données dans la description de l’art antérieur, ont un effet surl'inhibition de la réplication du virus HiV-1 BRU (BRU’.souche virale expérimentée)dans le cas où les cellules infectées sont du type MT4.

Dans le tableau I ont a décrit les résultats des tests. La colonne 1 donne le nom descomposés étudiés les plus représentatifs, et dans la colonne 2 sont reportées Sesvaleurs dites IC50 (concentration de composant donnant 50% d'inhibition de laréplication du virus HIV dans des cellules MT4 infectées, mesurée au jour J7 aprèsl'infection). Par observation et comptage du nombre de syncitia formés par rapport àcelui compté dans le cas de cellules FVlT-4 infectaes mais non traitées par le composéantiviral, la valeur du IC50 est déterminée. WO 95/32200 |4 PCT7FR9S/00683 Oî0258

Tests D8HV :

Les composés décrits les plus représentatifs, ont été testés pour leur effet sur laréplication du virus Duck HBV (DHBV) selon le protocole exposé dans la partieexpérimentale de ce document. 5 Dans le tableau 2 sont décrits les résultats des tests.

Abréviations :

AcOEt : acétate d’éthyle ADN : acide désoxyribonucléique 10 APTS : acide para-toluène sulfoniqueARN : acide ribonucSéique AZT : 3'-azido-2'-3’-didéoxy-t}ïyrfi!dine ou Zidovudine BOP : hexafluorophosphaîs de benzotriazolyioxytrisriiméthyl-aminophos phoniumCCM : chromatographie sur couche mince 15 DCC : N,N'-dicyclohexylcarbodiimideDCU : N,N'-dicyc!ûhexy!uféeDJEA : Ν,Ν-diisopropyl N-éîhylamineDMr : N,N-diméthylformaniideDHBV : Duck hepatitis 8 Virus 20 FAB+ : "P. ist positiv Atornic Bombardment" ^HdTTP : Thymidine trphosphatée radioactive à 1 mCL'ml ( HOBT : 1-hydroxybenzotriazole IR : infra-rougePF : point de fusion 25 RMN : résonnance magnétique nucléaire SIDA : syndrome de l'immunodéficience acquiseSM : spectrométrie de masse T8AF : fluorure de îéîrabutyiammoniumTBDPSCI : chlorure de îéîrabutyldiphénylsilyie 30 3 TC : (-)-(2R,3S)-2-hydroxyméthyl-5-(cytosine-1'-yl)-1,3-oxaîhio’ane ou Lamivudine TCIU : unités infectieusesTHF : tétrahydrofuranneTPM : tours par minuteTsCI : chlorure de tosyle 3 5 UV : ultra-violet VIH : Virus de l’immunodéficience humaineVHB : Virus de l’hépatite 8 VTLH : Virus des cellules T lymphotropiques humaines WO 95/32200 PCT/FR95/00683 010258

Tableau I s Effet des nuciéosides selon l'invention sur l'inhibition de la réplicationdu virus H1V-1, exprimés sous la somme de IC50

Composés N° COMPOSES 5^50 s >100 μΜ 10 1-10 μΜ 8 10 μΜ 6 WO 95/32200 16 PCT/FR95/00633 010258

Composés N° COMPOSES lcso i 7 2 0.1-1 jîM il < 100 μΜ BCH-189 (produit deréférence) 1 «jM WO 95/32200 ! ? PCT/FR95/00683 010258

Tableau il

Effet des nuciéosides selon l’invention sur l'inhibition de la réplicationdu virus DHBV

Composés N’ COMPOSES IC50 BCÎ-M89 (composé de référence) 1*0.5 jjM 2 2*0.5 îjM 8 2 pM 9 2 pM 1 WO 05/32200 'fWJ's· PCTZFR95/00683 010258 > 1

Composés N° COMPOSES •c50 10 2 JjM S J 1

Claims

VVO 95/3 2 200 REVENDICATIONS PCT/FR95/00683 010258 Les 5-(cytosinyl-1) 1,3-oxathiolanes de configuration cis (ou 2R5S ou 2S-5R)répondant à la formule générale I

dans laquelle R est un radical acyle ou aralcoyle, dérivés d'un hétérocyciemono- ou bicyclique azoté to et le groupe hydroxyméthyle en position 2 est en position cis par rapport au piandéterminé par les positions 2 et 5.
(2) I J ? i î I I

2. Les 5-(cytosinyl.1) 1,3-oxai'nio!anes selon la revendication 1°, de configuration2R-5S, de formule générale :

(I) ( I\.y

t ¥ w O 95/3;2(1(1 20 PCT7FR95,'00683 010258
3 Les 5-(cytosinyl-1 ) 1,3-oxathiolanes. selon la revendication 1e de configuration2S-5R . de formule generale F tï I 6 I i
4. Les composés nicotiniques, selon l’une des revendications 1° à 3°, dans laquelleR a la formule l : 20

( la ) dans laquelle X représente de l’hydrogène, un atome d’halogène, un groupeniîro, un alcoxy inférieur ou un radical trifluorométhyle 25 et n est un nombre entier variant de 1 à 3 et où le reste acyle est en position 2, 3 ou 4
5 Les composés dihydropyridiniques, selon l’une des revendications 1° à 3°, danslaquelle R a la formule

K (Ibl WO 95/3220(1 21 PCTZFR95/00683 0)0258 dans laquelle R-, est un radical alcoyle ayant de 1 à 10 atomes de carboneX et n sont définis comme précédemmentet le radical acyle est en position 2, 3 ou 4.
6. Les composés nicotimques quaternisés selon l'une des revendications 1° à 3°dans laquelle R a la formule générale le

dans laquelle A est un ar/on minéral ou organiqueR-μ X et n sont définis comme précédemmentet le radical acyle est en position 2, 3 ou 4.
7. Les composés quinoléiniques selon l’une des revendications 1" à 3°, dans laquelle R a la formule géi orale Id S 1 1 t

dans laquelle le radical carf myle est en position 2, 3 ou 4X représente de l'hydrogène un halogène, un radical trifluorométhyle, un alcoxyinférieur ou un groupe nitro et n‘ représente un nombre < itier variant de 1 à 6.
8 Les composés dihydroquinc '/iniques selon l’une des revendications 1° à 3°,dans laquelle R a la formule générale le 1 WO 95/32 200 PCTZFR95/00683 010258

dans laquelle R-, et X sont définis comme précédemmentet n’ est un nombre entier variant de 1 à 6
9. Les composés quinoléiniques quaternisées selon l'une des revendications Γ à3°, dans laquelle Râla formule générale If O

dans laquelle R-j, X et n' sont définis comme précédemmentίο le radical acyle se trouve en position 2, 3 ou 4 et A est un anion minéral ou organique
10. Les composés (dihydropyridyl alcoyle) selon l’une des revendications 1° à 3°,dans laquelle R a la formule Ig

dans laquelle RpXeln sont définis comme précédemmentet m est un nombre variant de 1 à 6
11. Les sels d'addition avec un acide minéral ou organique, des composés selon l'une des revendications 1 à 10°.
12, Les isomères optiques des composés selon l'une des revendications 1 à 11°. 23 010258
13. Un composé selon la revendication 1° ou la revendication 11° ou larevendication 12° à savoir le cis 2-hydroxyméthyl 5-[N4-(3"-pyridyl carbonyl)cytosine Γ-yl] 1,3-oxathiolane et ses sels d’addition avec un acide minéral ouorganique, sous forme racémique ou optiquement active .
14, Un procédé d’obtention des composés selon l'une des revendications 1 à 13°qui consiste à soumettre un 5-(cytosinyf-1) 1,3-oxathiolane cis à l'action d'undérivé fonctionnel d'acide carboxylique de formule ROH où R est un radicalacyle dérivé d’un hétérocycle aromatique ou dihydroaromatique, mono- ou io bicyclique, azoté ou à l’action d’un dérivé actif aralcoylé de formule R*2 où R’ est un radical aralcoylé dérivé d'un hétérocycle azoté, aromatique oudihydroaromatique, mono- ou bicyclique, et Z est un radical labile facilementclivable.
15. Les compositions pharmaceutiques à action antivirale, caractérisées en ce qu'elles renferment à titre de principe actif au moins un composé de formulegénérale I

dans laquelle R est un radical acyle ou aralcoylé. dérivés d'un hétérocyclemono- ou bicyclique azoté, aromatique ou dihydroaromatiqueet le groupe hydroxyméthyle en position 2 est en position cis par rapport au plandéterminé par les positions 2 et i ou un de ses sels d'addition avec un acide sous forme racémique ou optiquement active en mélange ou en association avec un excipient inerte, non toxique, pharmaceutiquement compatible..