CZ232999A3

CZ232999A3 - Organokřemičité sloučeniny mající močovinové skupiny, způsob jejich výroby, jejich použití, organopolysiloxanové hmoty tyto látky obsahující a tvarová tělesa z těchto hmot

Info

Publication number: CZ232999A3
Application number: CZ992329A
Authority: CZ
Inventors: Stefan Dr. Oberneder; Wolfgang Dr. Hechtl; Erich Pilzweger; Doris Filusch; Michael Dr. Stepp
Original assignee: Wacker-Chemie Gmbh
Priority date: 1996-12-27
Filing date: 1997-12-18
Publication date: 1999-11-17
Also published as: ATE199156T1; ID19408A; CA2274030A1; AU727551B2; WO1998029418A1; KR100323308B1; PL334255A1; NO993179D0; JP3241391B2; TW406084B; NO993179L; BR9714437A; ES2154481T3; US6218498B1; HUP0000454A2; RU99115893A; DE59703005D1; RU2165426C1; SK87799A3; AU5759598A

Description

Použití neimunosupresivních derivátů kyseliny pipekolinové

Oblast techniky

Vynález se týká použití neimunosupresivních derivátů kyseliny pipekolinové (hexahydrogenpyridyn - 2- karboxylová kyselina), které vykazují afinitu k imunofilinům typu FKBP jako inhibitorům enzymatické aktivity příslušející proteinům na bázi imunofilinů, přesněji inhibitorům aktivity peptidyl - prolyl izomeráz nebo aktivity rotamáz, pro výrobu léčiva pro léčení neurologické poruchy u zvířete, zejména pro stimulaci růstu poškozených periferních nervů nebo pro podporu neuronální regenerace.

Dosavadní stav techniky

Tato přihláška je částečnou pokračovací přihláškou US patentové přihlášky č. 08/474 072 ze 7.6.1995.

Pojem imunofilin přísluší řadě proteinů, které se uplatní jako příjemci základních imunosupresivních léčiv, cyklosporinu A (CsA), FK506 a rampamycinu. Známými skupinami imunofilinů jsou cyklofiliny, zatímco FK506 a rampamycin na FKBP. Tyto komplexy imunofilin - léčivo vyvolávají zvláště v imunitním a nervovém systému řadu intracelulárních systematických odezev.

Imunofiliny jsou známy tím, že vykazují aktivitu peptidyl - propyl izomerázy nebo aktivitu rotamázy. Bylo zjištěno, že rotamázová aktivita hraje roli při katalitické vnitřní konverzi cis a trans izomeru imunofilinových proteinů.

Imunofiliny byly původně zjištěny a studovány v tkáni imunitního systému. Odborníci zpočátku předpokládali, že inhibice rotamázové aktivity imunofilinů vede k zastavení proliferace T buněk, což je příčinou imunosupresivního účinku, který mají imunosuopresivní léčiva czklosporin A, FK506 a rampamycin. Další studie ukázaly, že inhibice rotamázové aktivity sama o sobě nepostačuje k imunosupresivnímu účinku. Schreiber et. al., Science 1990, 250, 556 - 559. Zdá se, že zdrojem imunosupresivního účinkuje tvorba komplexu imunosupresivních léčiv a imunofilinů. Ukázalo se totiž, že komplexy imunofilin - léčivo interagují s temámími proteiny jako cílem svého působení. Schreiber et al., Cell 1991,66, 807-815. Komplexy imunofilinléčivo FKBP-FK506 a FKBP-CsA se váží na enzym kalcineurin, čímž inhibují selektivní receptor T-buněk, který je odpovědný za jejich proliferaci. Podobně komplex rapamycinu a FKBP interaguje s RAFT1/FRAP proteinem a inhibuje tak selektivní receptor IL-2.

Vysoké koncentrace imunofilinů byly zjištěny v centrálním nervovém systému. Jsou v nem obohaceny 10-50násobně ve srovnání s imunitním systémem. Zdá se, že imunofiliny v nervové tkáni uvlivňují tvorbu oxidu dusnatého, uvolňování nervového mediátoru a proces šíření neuronu.

Oxid dusnatý má v těle několik funkcí. Zdá se, že v mozku je nervovým mediátorem. Tvoří se z argininu působením syntetázy, která oxiduje guanidinové skupiny argininu za vzniku oxidu dusnatého a citrulinu. Stimulace N-methyl-d-aspartatu (NMDA) jako podtypu receptorů glutamátu rychle a významně aktivuje syntetázu oxidu dusnatého a stimuluje tvorbu cGMP. Inhibice syntetázy oxidu dusnatého deriváty argininu jako např. nitroargininem zastavuje glutamátem indukované zvýšení hladin cGMP. Syntetáza oxidu dusnatého vyžaduje přítomnost vápník-kalmodulinového enzymu a aktivace receptorů N-methyl-d-aspartatu stimuluje aktivitu syntetázy oxidu dusnatého, protože receptor N-methyl-d-aspartatu ovládá kanál pro vápník, který je při stimulaci glutamátem otevřen a který umožňuje vápníku vstupovat do buněk a aktivovat syntetázu oxidu dusnatého.

Glutamát je fyziologický nervový mediátor. Přesto, je-li ho uvolněn nadbytek, je neurotoxický ve vztahu k receptorům N-methyl-d-aspartatu. Vystavení kultury mozkových korových neuronů glutamátu nebo N-methyl-daspartatu usmrtí až 90 % neuronů, přičemž tyto účinky jsou blokovány antogonisty N-methyl-d-aspartátu. Existuje domněnka, že tato neurotoxicita Nmethyl-d-aspartátu nejvíce přispívá k poškození neuronů, následujícímu po cévní mrtvici. Tedy, ucpání mozkové cévy s následujícím masivním uvolněním glutamátu a četní antagonisté N-methyl-d-aspartatu, blokující poškození jako následek mrtvice. Fosforylace inhibuje katalytickou aktivitu syntetázy oxidu dusnatého. Posílením fosforylace syntetázy oxidu dusnatého FK506 možná funkčně inhibuje tvorbu oxidu dusičného a tím blokuje neurotoxicitu glutamátu. Nízké koncentrace jak FK506, tak cyklosporinu A skutečně blokují neurotoxicitu N-methyl-d-aspartatu v korových kulturách Zprostředkující role FKBP je zřejmá, protože rapamycin obrací terapeutický účinek FK506. FK506, který je již tržně využíván jako imunosupresivum, může být klinicky využit i k léčení pacientů po mrtvici.

FK506 také zmnožuje fosforylaci proteinu GAP43 (growth associated protein-43). GAP43 se zúčastňuje procesu rozšiřování a růstu neuronů a zdá se, že jeho fosfory láce tuto aktivitu zesiluje. Proto byl zkoumán vliv FK506, rapamycinu a cyklosporinu na růst neuronů za použití buněk PC 12. Tyto buňky jsou kontinuální linií neuronům podobných buněk, které pří stimulaci růstovým faktorem nervů (NGF) zmnožují neurity.

S překvapením bylo zjištěno, že pikomolární koncentrace tmunosupresiv jako např. FK506 a rapamycinu stimulují narůstání neuritů u buněk PC 12 a u senzorických nervů, jmenovitě u buněk dorsálního kořenového ganglionu (DRG). Lyons et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91, 3191 -3195. Při pokusech s živými zvířaty se ukázalo, že po zranění faciálního nervu FK506 stimuluje jeho následující regeneraci a určité výsledky přináší při obnově nervové funkce u zvířat s poškozením sciálních nervů.

Dále bylo zjištěno, že léčiva s vysokou afinitou k FKBP jsou potenciálními inhibitory rotamázové aktivity a vykazují vynikající neurotropní účinek. Snyder et al., Immunophilins and the Nervous System, Nature Medicine, Volume 1, No.l, January 1995, 32-37. Tato zjištění naznačují použití imunosupresiv pro léčení různých periferních neuropatií a pro podporu v centrálním nervovém systému (CNS). Studie ukázaly, že neurodegenerativní onemocnění jako je Alzheimerova nemoc, Parkinsonova nemoc a amyotropní laterální skleróza (ALS) může být způsobeno ztrátou nebo sníženou dosažitelností neurotropních látek, specifických pro určitou skupinu neuronů, postižených onemocněním.

V centrálním nervovém systému bylo identifikováno několik neurotropních faktorů, ovlivňujících specifické soubory neuronů. Například bylo hypoteticky předpokládáno, že Alzheimerova nemoc je výsledkem snížení nebo ztráty růstového faktoru nervů (NGF). Bylo tedy navrženo léčit pacienty s touto nemocí exogenním růstovým faktorem nervu nebo jinými neurotropními proteiny jako mozkovým růstovým faktorem mozkového původu, růstovým faktorem gliálního původu, ciliámím neurotropním faktorem a neurotropinem-3 pro zvýšení životaschopnosti degenerovaných skupin neuronů.

Klinická použití těchto proteinů v různých stádiích neurologických nemocí jsou omezena potížemi při podávání a biologické dostupnosti rozměrných molekul proteinů do tkáně nervového systému. Naopak, imunosupresivní léčiva s neurotropní aktivitou mají relativně malé molekuly, vynikající biologickou dostupnost a specifičnost. Avšak jsou-li podávány trvale, vykazují imunosupresiva velký počet potenciálně vážných vedlejších účinků včetně nefrotoxicity, jako např. narušení glomerulámí filtrace ledvin a ireverzibilní interstinální fibrózu (Kopp et al.. 1991, J. Am. Soc. Nephrol. 1:162), neurologické deficifience jako neovladatelný třes, nebo nespecifická mozková angina jako např.

nelokalizovaná bolest hlavy (De Groen et. al., 1987, N. Engl. J. Med. 317:861) a vaskulámí hypertenze s příslušnými následujícími komplikacemi (Kahan et. al., 1989 N.Engl. J. Med. 321:1725).

Vynález poskytuje neimunosupresivní deriváty kyseliny pipekolinové obsahující malé molekuly FKBP inhibitorů rotamázy, které mají výjmečnou schopnost zmnožovat růst neuronů a jejich regeneraci v různých neuropatologických situacích, kdy tuto regeneraci je možno usnadnit, tedy při poškození periferních nervů, fyzickém poškození centrální nervové soustavy (mícha a mozek), poškození mozku následkem mrtvice a pro léčení neurologických onemocnění spojených s degenerací nervů, včetně Parkinsonowy nemoci, Alzheimerovy nemoci a amyotropní laterámí sklerózy.

Podstata vynálezu

Tento vynález se zabývá použitím neimunosupresivních derivátů kyseliny pipekolinové, majících afinitu k imunofilinům typu FKBP jako inhibitorům enzymové aktivity spojené s imunofilinovými proteiny, přesněji k inhibitorům aktivity peptidyl-prolyl izomeráz nebo aktivity rotamáz. Podstata vynálezu spočívá v použití neimunosupresivních derivátů kyseliny pipekolinové, majících afinitu k imunofilinům typu FKBP, kde imunofilin typu FKBP vykazuje rotamázovou aktivitu a neimunosupresivní derivát kyseliny pipekolinové tuto rotamázovou aktivitu imunofilinu inhibuje, pro výrobu léčiva pro léčení neurologické poruchy u zvířete, zejména pro stimulaci růstu poškozených periferních nervů nebo pro podporu neuronální regenerace.

Neurologická porucha je vybrána ze skupiny, zahrnující periferní neuropatie způsobené fyzickým zraněním nebo chorobným stavem, fyzickým poškozením mozku a fyzickým poškozením míchy, poškození mozku následkem mrtvice a neurodegenerací podmíněné neurologické poruchy. Neurologická porucha může být vybrána ze skupiny, zahrnující

Alzheimerovu nemoc, Parkinsonovu nemoc a amyotropní laterální sklerózu.

Neimunosupresivním derivátem kyseliny pipekolinové může být s výhodou Way-124,466 nebo Rap-Pa, případně SLB-506. Neimunosupresivní derivát kyseliny pipekolinové může být alternativně vybrán ze skupiny, zahrnující sloučeniny 3-84 a 90-111.

Použití podle tohoto vynálezu zahrnuje nejméně 75% regeneraci ve smyslu počtu axonů a nejméně 35% obnovení myelinizace, případně nejméně 75% regeneraci ve smyslu počtu axonů a nejméně 50% obnovení myelinizace.

Inhibice rotamázové aktivity je dosaženo použitím koncentrace látky ne větší než 1800 nM, případně ne větší než 210 nM nebo ne větší než 103 nM.

Neurotropního ED₅₀ je dosaženo použitím koncentrace látky ne větší než 200 nM, případně ne větší než 35 nM nebo ne větší než 1 nM.

Dalším výhodným provedením vynálezu je použití neimunosupresivního derivátu kyseliny pipekolinové v kombinaci s účinným množstvím neurotropního faktoru, vybraného ze skupiny zahrnující neurotropní růstový faktor, růstový faktor mozkového původu, růstový faktor gliálního původu, ciliální neurotropní faktor a neurotropin-3 pro stimulaci růstu poškozených periferních nervů nebo k podpoře neuronální regenerace. Při tomto provedení vynálezu je výhodné, je-li neurologická porucha vybrána ze skupiny, zahrnující periferní neuropatie způsobené fyzickým zraněním nebo chorobným stavem, fyzickým poškozením mozku a fyzickým poškozením míchy, poškozením mozku následkem mrtvice a neurodegenerací podmíněné neurologické poruchy.

Pro použití podle vynálezu je výhodné, je-li neurologická porucha vybrána ze skupiny zahrnující Alzheimerovu nemoc, Parkinsonovu nemoc a amyotropní laterální sklerózu.

S výhodou může být neimunosupresivním derivátem kyseliny pipekolinové Way - 124,666, případně Rap-Pa nebo SLB-506.

Je rovněž výhodné, je-li neimunosupresivní derivát kyseliny pipekolinové vybrán ze skupiny, zahrnující sloučeniny 3-84, 86-88 a 90-111.

Jiné výhodné provedení vynálezu se vyznačuje tím, že neimunosupresivní derivát kyseliny pipekolinové se použije pro výrobu léčiva pro stimulaci nebo pro podporu růstu poškozených periferních nervů.

Další výhodné provedení vynálezu se vyznačuje přidáním neurotropního faktoru pro stimulaci

FA ...........

nebo pro podporu růstu poškozených periferních nervů, přičemž neurotropní faktor je vybrán ze skupiny, zahrnující neurotropní růstový faktor, růstový faktor mozkového původu, růstový faktor gliálního původu, ciliální neurotropní faktor a neurotropin-3.

Neimunosupresivním derivátem je Way-124,666, případně jím může být Rap-Pa nebo SLB-506 nebo může být vybrán ze skupiny, zahrnující sloučeniny 3-84, 86-88 a 90-111.

Použití podle tohoto vynálezu zahrnuje nejméně 75% regeneraci ve smyslu počtu axonů a nejméně 35% obnovení myelinizace, případně nejméně 75% regeneraci ve smyslu počtu axonů a 50 % obnovení myelinizace.

Inhibice rotamázové aktivity je s výhodou dosaženo použitím koncentrace látky ne větší než 1800 nM, případně ne větší než 210 Nm nebo ne větší než 103 nM.

Neurotropního ED50 je s výhodou dosaženo použitím koncentrace látky ne větší než 200 nM nebo ne větší než 35 nM, případně ne větší než InM.

Je výhodné, je-li neimunosupresivních derivátů kyseliny pipekolinové použito pro výrobu léčiva pro stimulaci růstu poškozených periferních nervů, přičemž je dále zahrnuto přidání účinného množství neurotropního faktoru vybraného ze skupiny, zahrnující neurotropní růstový faktor, růstový faktor mozkového původu, růstový faktor gliálního původu, ciliámí neurotropní faktor a neurotropin-3 pro stimulaci růstu poškozených periferních nervů.

Neimunosupresivním derivátem kyseliny pipekolinové je s výhodou Way-124,666 nebo Rap-Pa, popřípadě jím může být SLB-506 nebo je neimunosupresivní derivát kyseliny pipekolinové vybrán ze skupiny zahrnující sloučeniny 3-84, 86-88 a 90-111.

S výhodou je neimunosupresivních derivátů kyseliny pipekolinové použito pro výrobu léčiva pro podporu neuronální regenerace a neuronálního růstu u zvířat.

Je výhodné, je li při použití neimunosupresivních derivátů kyseliny pipekolinové pro výrobu léčiva pro podporu neuronální regenerace a neuronálního růstu dále přidáno účinné množství neurotropního faktoru pro podporu neuronální regenerace, přičemž neurotropní faktor je vybrán ze skupiny zahrnující neurotropní růstový faktor, růstový faktor mozkového původu, růstový faktor gliálního původu a neurotropin-3.

Neimunosupresivním derivátem může být Way-124,666 nebo Rap-Pa, případně SLB-506 nebo může být vybrán ze skupiny, zahrnující sloučeniny 3-84, 86-88 a 90-111.

Použití neimunosupresivních derivátů pro výrobu léčiva pro podporu neuronální regenerace a

FS ...........

neuronálního růstu zahrnuje nejméně 75% regeneraci ve smyslu počtů axonů a nejméně 35% obnovení myelinizace nebo nejméně 75% regeneraci ve smyslu počtu axonů a nejméně 50% obnovení myelinizace.

Inhibice rotamázové aktivity je dosaženo použitím koncentrace látky ne větší než 1800 nM, případně ne větší než 210 nM, nebo ne větší než 103 nM.

Neurotropního ED50 je dosaženo použitím koncentrace látky ne větší než 200 nM nebo ne větší než 35 nM, případně ne větší než 1 nM.

Je výhodné, je-li neimunosupresivní derivát kyseliny pipekolinové použit pro výrobu léčiva pro prevenci neurodegenerace u zvířat.

Je rovněž výhodné, zahrnuje -li toto použití dále přidání účinného množství neurotropního faktoru za účelem prevence neurodegenerace, přičemž neurotropní faktor je vybrán ze skupiny zahrnující neurotropní růstový faktor, růstový faktor mozkového původu, růstový faktor gliálního původu, ciliální neurotropní faktor a neurotropin-3.

Neimunosupresivním derivátem kyseliny pipekolinové je s výhodou Way-124,666 nebo Rap-Pa, případně SLB-506, neboje vybrán ze skupiny, zahrnující sloučeniny 3-84, 86-88 a 90-111.

Použití neimunosupresivního derivátu kyseliny pipekolinové pro výrobu léčiva pro prevenci neurodegenerace u zvířat zahrnuje nejméně 75% regeneraci ve smyslu počtu axonů a 35% obnovení myelinizace, případně 75% regeneraci ve smyslu počtu axonů a nejméně 50% obnovení myelinizace.

Inhibice rotamázové aktivity je dosaženo použitím koncentrace látky s výhodou ne větší než 1800 nM, nebo ne větší než 210 nM, případně ne větší než 103 nM.

Neurotropního ED50 je s výhodou dosaženo použitím koncentrace látky ne větší než 200 Mn, nebo ne větší než 35 nM, případně ne větší než 1 nM.

ó

Popis obrázků na výkresech

Obrázek 1

Zobrazuje expresi FKBP-12 a GAP43 v nukieu faciálního nervu po poškození nervu. Při in sítu hybridizaci je srovnáván průběh časové závislosti exprese mRNA v nukieu faciálního nervu pro FKBP 12 (vlevo) a GAP-43 (vpravo). Vpravo je nukleus faciálního nervu po poškození, levá strana je kontrolní (fig. IB). In situ hybridizace s FKBP-12 neošetřené kontroly (vlevo) a s kalcineurinem 7 dní po poškození faciálního nervu (vpravo).

Experimenty byly opakovány nejméně třikrát s podobnými výsledky.

Obrázek 2

Zobrazuje následnou lokalizaci FKBP-12 ve faciálních motorických neuronech po poškození nervu. Světlé fotomikrografie in situ hybridizace FKBP-12 s motorickými neurony faciálního nuklea 7 dní po poškození (fig. 2A) a s motorickými neurony v kontrolním faciálním nukieu (fig. 2B).

Obrázek 3

Ustálení FKBP-12 mRNA v motorických neuronech lumbámí Části míchy po poškození sciálního nervu. In situ hybridizace s FKBP-12 sedm dní po poškození pravého sciálního nervu. Horní pole (fig. 3A) zobrazuje odezvu motorických neuronů ventrálního rohu dolní lumbámí části míchy (naznačeno šipkami). Světlé fotomikrografie odpovídajících skupin motorických neuronů jsou zobrazeny na spodních polích: (fig. 3B) levá strana přísluší poškozenému nervu, (fig. 3C) pravá strana nervu před poškozením. Tento experiment byl třikrát opakován s podobnými výsledky.

Obrázek 4

Indukce FKBP a FKBP-12 mRNA v dorsálním kořenovém ganglionu jeden a šest týdnů po poškození sciálního nervu. Tmavé fotomikrografie řezů L4 dorsálního kořenového ganglionu, příslušející poškozenému sciáínímu nervu zpracovanému hybridizaci in situ jsou v levých polích, autoradiografie nervu, hybridizovaného s (tritium)FK506 v pravých polích. Tyto výsledky byly pro každou uvedenou dobu opakovány třikrát.

Obrázek 5

Zobrazuje poškození pravého faciálního nervu ricinem. Nisslova skvrna (spodní pole, fig. 5A) ukazuje rozsáhlou degeneraci motorických neuronů nuklea pravého faciálního nervu, doprovázenou gliální proliferací a to 7 dní po vstříknuti nelnu do faciálního nervu. Výsledek in situ hybridizace FKBP mRNA 7 dní po poškození nervu ricinem je zobrazen na horním poli (fig. 5B). Experiment byl třikrát opakován s podobnými výsledkv.

Obrázek 6

Vazba (tritium)FK506 v segmentech sciálního nervu 7 dní po poškození. Diagram zobrazuje odebrané segmenty nervu o tloušťce 3 mm: zuzeni naznačují umístění pásek, aplikovaných sedmý den po dobu 6 hodin jak je popsáno v metodách. Umístění vzdálenějšího pásku je přibližně 10 mm od původního místa poškození nervu. Anterogenní přenos FKBP je 124 mm/den. Data leží v intervalu spolehlivosti ± S.E.M. pro n ⁼ 3.

Obrázek 7

Zobrazuje přenos FKBP ve sciálním nervu. Tmavé fotomikrografie zobrazují kontrolní neosetřené nervy a poškozená místa nervu hybridizovaného in situ 7 dní s FKBP-12 (fig. 7 A, 7B) a autoradiografie nervu, hybridizovaného s (tritium)FK-506 (fig. 7C, 7D). Šipky ukazují místo poškození nervu. Tento experiment byl opakován třikrát s podobnými výsledky.

Obrázek 8

Zobrazuje vazebné hladiny (tritium)FK506 v buňkách PC-12, udržovaných v přítomnosti nebo nepřítomnosti NGF (50 ng/ml). n = 3 pro každou uvedenou dobu. Svislé úsečky znázorňují interval spolehlivosti měření S.E.M.

Obrázek 9

Imunosupresivem modulovaná podpora růstu neuritů v buňkách PC-12. Hoffmanovo kontrastní fotomikrografie (64) kultur, pěstovaných 48 hodin v přítomnosti NGF s přídavkem nebo bez přídavku FK506 nebo rapamycinu. Fig. 9A: buňky PC-12 pěstované v 1,0 ng/ml NGF. Fig. 9B: 50 ng/ml NGF. Fig. 9C: 1,0 ng/ml NGF a lOOnM FK506. Fig. 9D: 1,0 ng/ml NGF a 100 nM rapamycin. Zvětšení 200násobné.

Obrázek 10

Účinky FK506 na růst neuritů v buňkách PC-12. Kultury byly ošetřeny odlišnými koncentracemi NGF v přítomnosti nebo v nepřítomnosti 100 nM FK506, tvorba a růst neuritů byl měřen po 48 hodinách. Růst byl kvantifikován tak, jak je popsáno v Metodách sčítáním buněk s rostoucími neurity většími než 5 mm. n - 4 samostatné experimenty pro každou měřenou hodnotu, svislé úsečky představují interval spolehlivosti SEM.

Obrázek 11

Zobrazuje zmohutnění růstu neuritů buněk PC-12 v závislosti na koncentraci FK506. Buňky byly ošetřovány po dobu 48 hodin 1 ng/ml NGF a odlišnými koncentracemi FK506. Odezva růstu neuritů byla měřena jak je uvedeno u obrázku 10 a v Metodách, n = 4 samostatné experimenty pro každou měřenou hodnotu, ^Ap<0.001 Studentova rozdělení spolehlivosti výsledků.

Obrázek 12

Autoradiografie (lrilium)FK-506 kultur explanlovaného dorsálního kořenového ganglionu. Po kultivaci 26 dní s 100 ng/ml NGF se objeví početná zrnka FKBP napojeného na stříbro. Autoradiografická zrna se rozruší 1 mM neoznačeného FK506. ⁶

Obrázek 13

Fázově-kontrastní mikrografie dorsálního kořenového ganglionu pěstovaného v různých mediích. Fig. 13A: NGF 10,0 ng/ml, fig. 13B: FK506 l^iM, fig. 13C: FK506 IjnM a anti-NGF protilátka, fig. 13D: bez přídavku růstového faktoru, fig 13E: FK506 IpM, fig. 13F: FK506 l^M a rapamycin l^mM. Úsečka měří 205 mm. NGF vede k hojnému růstu axonů (fig. 13A), podobně jako l^mM FK506 (fig. 13B). Účinky FK506 jsou podstatně zeslabeny snížením jeho koncentrace na 1 pM (fig. 13E). Přesto je růst neuritů při koncentraci FK506 1 pM větší než při růstu bez přídavku této látky. Účinky FK506 jsou také sníženy přídavkem anti-NGF protilátky za účelem eliminace účinků NGF, produkovaného neneuronálními buňkami v kultuře. Hojné neurity, které se objevují ve velkých svazcích jako odezva na přítomnost NGF (100 ng/ml) (fig. 13A) nebo FK506 (fig. 13B) se zdají být bílé, zatímco malé svazečky nebo jednotlivé neurity se zdají být černé. Neneuronální buňky, Schwannovy buňky a některé fibroblasty jsou s 1 pM FK506 (fig. 13E) nebo anti-NGF protilátkou (fig 13C) lépe zřetelné než s IjnM FK506 (fig. 13B). Výsledkem NGF, produkovaného v kulturách neneuronálními buňkami je omezený růst axonů, jak se ukazuje v kulturách bez přídavku růstových faktorů (fig. 13D). Velký počet světlolomných neneuronálních buněk, které se zdají bílé, zastiňují některé neurity (fig. 13D). Rapamycin v přítomnosti FK506 dokonale inhibuje růst axonů (fig. 13F). Mikrografie reprezentují 12 - 30 ganglionů pro kazde experimentální podmínky. Rozdíly mezi všemi experimentálními skupinami byly vysoce reprodukovatelné.

Obrázek 14

Účinky FK506 a rapamycinu na šíření neuritů v buňkách PCI2, způsobené NGF. Buňky PC 12 (pasáž 60) byly ošetřeny proměnlivými koncentracemi NGF samotného, nebo v přítomnosti 100 nM FK506,100 nM rapamycinu nebo 100 nM WAY-124,466. Růst neuritů byl měřen po 96 hodinách a to zaměřením buněk, jejichž délka byla větší než průměr z centového počtu ounČK. n = 3 pro každou měřenou hodnotu a svislé úsečky představují interval spolehlivosti S.E.M.

Obrázek 15

Pikomolární koncentrace (A) FK506 a (B) rapamycinu a WAY-124,466 zesilují růst a šíření neuritů, vyvolaný NGF (0,5 ng/ml) v buňkách PC 12. Málopasážované buňky PC 12 byly 4 dny ošetřovány 0,5 ng/ml NGF za přítomnosti odlišných koncentrací FK506 (□), rapamycinu (p) nebo WAY124,466 Exprese neuritů byla kvantifikována podobně jako u obrázku 14. Úroveň tvorby neuritů v přítomnosti 0,5 ng/ml NGF (označeno L) a 50 ng/ml NGF (označeno H) byla indikována za účelem srovnatelnosti.

Obrázek 16 hotomikrografie buněk PC 12, ošetřených imunofilinovými ligandy + 0,5 ng/ml NGF nebo 50 ng/ml NGF.

Obrázek 17

Imunofilinové ligandy snižují množství NGF, potřebné pro maximální růst kuřecích senzorických ganglionů. Z devíti až desetidenních kuřecích embryí byly vyňaty a izolovány celé dorsální kořenové gangliony a kultivovány v 12-otvorových nádobkách, pokrytých matrigelem a obsahujících medium LI5 a glukózu s 10 % fetálním telecím sérem, doplněným 10 mM Ara C (penicilín a streptomycin) při 37° C v prostředí 5 % oxidu uhličitého. Senzorické gangliony byly ošetřovány 1 ng/ml NGF, 1 ng/ml NGF plus 100 FK506 nebo 100 ng/ml NGF po dobu 48 hodin, neuronální procesy byly vyhodnocovány a fotografovány.

Obrázek 18

FK506, rapamycin a WAY-124,466 zesilují tvorbu neuritů, vyvolanou NGF v senzorických ganglionech. Explantáty kuřecích dorsálních kořenových ganglionů byly kultivovány tak, jak je popsáno u obrázku 17. Byl přidán FK506, rapamycin a WAY-124,466 (100 nM každý s nebo bez 0,1 ng/ml NGF). Po 48 hodinách byl růst neuritů kvantifikován a kultury byly vyfotografovány.

Obrázek 19

Fotomikrografie zesíleného růstu neuritů v kulturách kuřecích dorsálních kořenových ganglionů podle příkladu 111. Tři pole zobrazuií růst neuritů při koncentraci 1 pM (levé pole), 100 pM (střední pole) a 100 nM (pravé pole) z příkladu 111.

Obrázek 20

FotomÍKrografie zesíleného růstu neuritů v kulturách dorsálních kořenových ganglionů podle příkladu 17. Tři pole zobrazují růst neuritů při koncentraci 1 pM (levé pole), 100 pM (střední pole) a 100 nM (pravé pole) z příkladu 17.

Obrázek 21

Fotomikrografie zesíleného růstu neuritů v kulturách dorsálních kořenových ganglionů podle příkladu 102. Tři pole zobrazují růst neuritů při koncentraci 1 pM (levé pole), 100 pM (střední panel) a 100 nM (pravé pole) z příkladu 102.

Nové neurotropní deriváty kyseliny pipekolinové podle vynálezu mají afinitu k FK506 vázajícím proteinům jako je FKBP-12. Bylo shledáno, že je-li neurotropní sloučenina podle vynálezu navázána na FKBP, inhibuje prolylpeptidyl cis-trans izomerázovou nebo rotamázovou aktivitu u navázaného proteinu a neočekávaně stimuluje růst neuritů.

Sloučeniny podle vynálezu mohou být použity ve formě solí, odvozených od anorganických nebo organických kyselin nebo zásad. Mezi solemi odvozenými od kyselin jsou zahrnuly: acelály, adipály, alginály, aspartáty, benzoáty, benzensulfonáty, bisulfátbutyráty, citráty, kamphoráty, kamphorsulfonáty, cyldopentanpropionáty, diglukonáty, dodecylsulfáty, ethansulfonáty, fumaráty, glukoheptanoáty, glycerofosfáty, hemisulfátheptanoáty, hexanoáty, hydrogenchloridy, hydrogenbromidy, hydrogenjodidy, 2-hydroxyethansulfonáty, laktátv, maleátv, methansulfonátv. 2-naftalensulfonáty, níkotináty, oxaláty, pamoáty, pektínáty, propionáty, sukcináty, tartaráty, thiokyanáty, tosyláty a undekanoáty. Mezi solemi, odvozenými od zásad jsou zahrnuty: soli sodné a draselné, soli kovů alkalických zemin jako vápenaté a hořečnaté, soli organických zásad jako např. soli dicyklohexylaminu, N-methyl-D-glukamin, soli aminokyselin jako je arginin, lysin atd. Také zásadité, dusík obsahující skupiny mohou být kvarternizovány činidly jako jsou nižší aikylhalogenidy, např. methyl, ethyl, propyl a butylchlorid, bromidy a jodidy, dále dialkylsulfáty jako dimethyl, diethyl, dibutyl a diamylsulfát, halogenidy s dlouhým řetězcem jako je decyl, lauryl, myristyl a stearylchlorid, bromidy a jodidy, aralkylhalogenidy jako benzyl a fenetylbromid a další. Získají se tak disperzní nebo ve vodě nebo oleji rozpustné produkty.

Neurotropní sloučeniny podle vynálezu mohou být periodicky podávány pacientům, kteří se podrobili léčbě z důvodu neurologických poruch nebo jiných poruch, při jejichž léčení je žádoucí stimulovat regeneraci neuronů a jejich růst, např. při různých periferních neuropatiích a neurologických poruchách, způsobených neurodegenerací. Sloučeniny podle vynálezu mohou být také podávány savcům jiným než člověk při léčení různých savčích neurologických poruch.

Nové sloučeniny podle vynálezu jsou potenciálními inhibitory rotamázové aktivity a vykazují vynikající úroveň neurotropní aktivity. Tato aktivita je užitečná pro stimulaci poškozených neuronů, pro urychlování neuronální regenerace, při prevenci neurodegenerace a při léčení některých neurologických poruch o nichž je známo, že jsou spojeny s neuronální degenerací a s periferními neuropatiemi. Neurologické poruchy, které mohou být léčeny zahrnují mimo jiné: neuralgii trojklanného nervu a glosofaryngální neuralgii, Bellovu parézu, těžkou svalovou ochablost, svalovou dystrofii, amyotropickou laterální sklerózu, progresivní svalovou atrofii, dědičnou progresivní bulbámí svalovou atrofii, syndromy protržení, výhřezu nebo snížení obratlové ploténky, cervikální spondylózu, poruchy pletení, syndromy destrukce thorakálního vývodu, periferní neuropatie jako ty, které jsou způsobeny olovem, dapsonem, portyrií nebo klíšťového původu, syndrom Gullain-Barrého, Alzheimerovu nemoc a Parkinsonovu nemoc.

Pro tyto účely mohou být sloučeniny podle vynálezu podávány orálně, parenterálně, inhalací spraye, topicky, rektálně, nasálně, bukálně, poševně nebo cestou implantace rezervoáru, připraveného tak, aby obsahoval konvenční netoxická farmaceuticky přijatelné nosiče, pomocné látky a přenašeče. Pojem parenterálně, tak jak je zde použit, zahrnuje subkutánní, intravenózní, mtramuskulární, intraperitoneální, intratekální, intraventikulární, intrastenální a intrakraniální injekce nebo infuzní techniky.

Komplex imunofilin-Iéčivo, podávaný periferně a cílený svým teiupeutickyin účinkem do centrálního nervového systému, by měl snadno přecházet z lo ve do mozku. Sloučeniny podle vynálezu, které nemohou přecházet z krve do mozku mohou být účinně podávány intraventrikulámí cestou.

Farmaceutické kompozice mohou být v podobě sterilních injekčních přípravků, například jako sterilní injekční vodní nebo olejová suspenze. Tato suspenze muže mít složeni v souladu se složeními ze známého stavu techniky, kde se používají vhodná disperzní nebo smáčecí a suspendační činidla. Sterilní injekční prostředek může být také sterilní injekční roztok nebo suspenze v netoxickém parenterálně přijatelném rozpouštědle, například jako roztok v 1,3-butandíolu. Přijatelnými přenašeči a rozpouštědly mohou být voda, Ringerův roztok a izotonický roztok chloridu sodného. Dále mohou být jako rozpouštědlo nebo suspenzní medium použily sterilní, stabilní oleje. Pro tento účei může být použít jakýkoliv nedraždivý stabilní olej včetně mono- nebo diglyceridů. Použití při přípravě injekčních prostředků nacházejí mastné kyseliny jako je kyselina olejová a od ní odvozené glyceridy, olivový olej nebo ricínový olej potom zvláště v podobě jejich polyoxyethylovaných derivátů. Tyto olejové roztoky nebo suspenze mohou také obsahovat jako zředovadlo nebo dispergovadío alkohol s dlouhým řetězcem.

Sloučeniny mohou byt podávány orálně například v podobě tobolek nebo tablet, nebo jako vodní suspenze nebo roztok. V případě tablet pro orální aplikaci jsou běžně používány nosiče včetně laktózy a obilného škrobu. Také bývají přidávána lubrikační činidla jako je stearát hořečnatý. Použitelná zředovadla pro orální podávání v podobě tobolek zahrnují iaktózu a sušený obilný škrob. Jestliže jsou pro orální použití požadovány vodní suspenze, kombinují se aktivní složky s emulgačními a suspendačními činidly. Pokud je to žádoucí, mohou být přidávána také sladidla a/nebo ochucovadla a/nebo barviva.

Sloučeniny podle vynálezu mohou být také používány v podobě čípků pro rektální podávání léčiva. Takové Kompozice mohou být připraveny míšením léčiva s vhodným nedráždivým vehikulem, které je při pokojové tepiotě pevné, ale kapalné při teplotě konečníku, takže v konečníku taje, čímž se léčivo uvolňuje. Takové materiály zahrnují kakaové máslo, včelí vosk a polyethylenglykoly.

Sloučeniny podle vynálezu mohou být také podávány topicky, obzvláště když podmínky léčení jsou zaměřeny taK, že zahrnují oblasti nebo orgány, suaono přístupné topickou aplikaci. Takové oblasti zahrnuje léčení neurologických poruch zraku, louže nebo dolní části intestinálního traktu. Vhodné prostředky pro topické podávání jsou pro každou z těchto oblastí snadno připravitelné.

no oilalmické použití mohou být sloučeniny upraveny jako mikrosuspenze v izotonickém sterilním slaném roztoku s nastaveným pH, nebo přednostně jako izotonické roztoky s nastaveným pH se sterilním roztokem soli, ať už bez konzervovadla nebo s konzervovadlem jako je benzylalkoniumchlorid. Další možností oftalmického použití sloučenin může být vpravení do masti jako je petrolatum.

Pro topickou aplikaci na kůži mohou byt sloučeniny vpraveny do vhodné masti, litera obsahuje tyto sloučeniny bud suspendované nebo rozpuštěné, a to ve směsi s jednou nebo více z následujících složek: minerálním olejem, kapalným petrolatem, bílým petrolatem, propylenglykolem, polyoxyethylenem a polyoxypropylenem, emulgačním voskem a vodou. Sloučeniny mohou být také vpraveny do vhodné pleťové vody nebo krému, jež obsahují aktivní sloučeniny suspendované nebo lozpušlěné, napřůdau ve směsi s jednou nebo více z následujících složek: minerálním olejem, monostearátem sorbitolu, polysorbátem 60, cetylovýmí estery vosků, cetearylalkoholem, 2 oktyldodekanolem, benzylalkoholem a vodou.

Topická aplikace pro spodní Část intestinálního traktu může být účinná v podobě rektálního čípku (viz výše) nebo vhodného klystýru.

Vhodná velikost dávek při léčení za výše popsaných podmínek je odstupňována od asi 0,1 mg do asi 10 000 mg aktivní sloučeniny, s preferovanou dávkou od asi 0,1 mg do asi 1000 mg. Množství aktivní látky, která může být za účelem jednoduché dávkovači podoby kombinována s nosičovým materiálem, se bude měnit v závislosti na ošetřovaném hostiteli a konkrétním způsobu podání.

Je však zřejmé, že určitá velikost dávky u každého konkrétního pacienta bude záviset na řadě proměnlivých faktorů včetně aktivity použité sloučeniny, věku, tělesne vaze, celkovém zdravotním stavu, pohlaví, stravě, době podávání, vylučovacím poměru, kombinaci léků, závažnosti vlastního ošetřovaného onemocnění a způsobu podání

Sloučeniny mohou být podávány s dalšími neurotropními činidly jako je růstový faktor (NGF), růstový faktor gliálního původu, růstový faktor mozkového původů, ciliární neurotropní faktor a neurotropin-3. Velikost dáv.V dalších neurotropních léčiv bude záviset na předem definovaných faktorech a na neurotropní účinnosti kombinace léčiv.

Příklady provedení vynálezu

Poškození sciálního (ischiatíckého) nervu

Tento příklad demonstruje vysoké úrovně FKBP v periferním nervu a že tato zvýšení následují po poškození nervu.

Jestliže byl FKBP fyziologicky spojen s procesem šíření neuronů účinky GAP-43, je možno očekávat značné hladiny FKBP v periferním nervu. Proto jsme měřili vázaný (tritium)FK-506 ve sciálním nervu krysy a v růstových kuželech, izolovaných z dvoudenních krysích mláďat a srovnávali tyto hodnoty s hodnotami v cerebrálním kortexu a některých periferních tkáních.

(i ritium) FK-506 byla provedena tak, jak je popsáno s nefixovanými řezy, které byly před preinkubací 1 hodinu v pufru o pH 7,4 rozehřály a sušeny na vzduchu. Pufr obsahoval 50 mM Hepes, 2 mg/ml bovinního sérového albuminu, 5% ethanolu a 0,02% Tweenu 20. Potom byly řezy vystaveny působení 1 nM (tritium)FK-506 (86,5 Ci/mMol, DuPont-NEN, Boston, MA) po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě v pufru pro preinkubací. Nespecifické vázání bylo definováno přídavkem 1 FK-506. Po inkubaci byly desky s řezy propírány čtyřikrát po 5 minutách v ledově chladném preinkubačním pufru a sušeny na vzduchu. Radiooznačené řezy byly poté přiloženy k filmu, citlivému na tritium nebo byla krycí skla těchto řezů potažena emulzí Kodak NTB-2.

Tabulka 1 (Tritium)FK506 vázaný ve sciálním nervu a růstových kuželech (A) (lritium)FK506 vázaný ve sciálním (ischiatickém) nervu tkán

Bmax (pmol /mg proteinu) dospělá krysa sciální nerv cerebrální kortex thymus slezina novorozená krysa přední mozek růstové kužele

22,1

38,0

9,5 v o

25,5

10,2 (B) (Triuur?)FK506 vázaný po poškození sciálního nervu

Bmax Bmax fmol /5 mm segment pmol /mg protein neovlivněno 31,8 ± 2,1 21,2 ± 1,4 dní po poškození 136,5 ± 15,7* 40,1 ± 2,0*

Vázaný (tritium)FK506 byl stanovován tali, jak je popsáno v metodách. V tabulce 1A byly experimenty opakovány třikrát s rozptylem menším než 10%. V tabulce 1B mají hodnoty interval spolehlivosti měření ± S.E.M. (n = 3) * P< 0,05 Studentova t-testu nezávislosti.

všech zkoumaných tkáních sciálního (ischiatického) nervu jsou hladiny vázání nejvysší, poněkud vyssí než ty u cerebrálního kortexu a asi desetkrát vyšší než u thymu a sleziny, které obsahují FKBP navázaný na lymfocyty. Viz tabulku 1 A.

Jistota, že rKBP podporuje regeneraci nervů vychází z experimentů, při kterých byl poškozen sciální nerv dospělých krys a po 7 dnech byl měřen v 5 mm segmentech, získaných z bezprostřední blízkosti poškození nervu, vázaný (tritium) FK506.

Spraque-Dawley ovy krysy (175 - 200 g) byly anestézovány směsí Rompunu (12 mg/kg) a Ketammu (30 mg/kg). Pomocí pinzety za aseptických podmínek byl faciální nerv drcen dvakrát 30 sekund ve vzdálenosti 2 mm od vyústění nervového kanálku z výběžku spánkové kosti. Stejný způsob byl použit k rozdrcení sciálního nervu na úrovni střední Části stehna.

Celkové vázání v řezech, přiléhajících k místu rozdrcení bylo čtyřnásobně srovnáváno s kontrolními hodnotami. Protože celkové množství proteinů je podstatně zvýšeno v přilehlém segmentu nervu, množství vázaného (tritium)FK-506 na mg proteinu je pouze dvojnásobné.

Poškození faciálního nervu

Tento příklad demonstruje, že poškození faciálního nervu zvětšují překrývání exprese FKBP a GAP-43.

Následkem poškození faciálního nervu vzrůstá úroveň mRNA GAP-43 λ⁷ nuldeu faciálního nervu. Za použití in situ hybridizace jsme zkoumali mRNA hladiny FKBP, GAP-43 a kalcineurinu po poškození faciálního nervu.

Krysy byly perfundovány transkardiálně 150 - 200 ml ledově chladného, fosfátem pufrovaného roztoku sólu (PBS) (0,1 M pH 7,4). Tkáně byly vyjmuty a okamžitě zmrazený v izopentanu ( 80° C). Byly nařezány kryostatické řezy (tloušťky⁷ 18 mm) a rozehřáté uloženy na gelatinou pokrytá podložní skla.

Byla provedena in situ hybridizace výše popsaným postupem za použití oligonukleotidových sond, značených (^5KS)dATP. Pro FKBP byly použity tři samostatné nukleotidy, komplementární k následujícím oblastem klonované cDNA, které objevil Maki, et al. (1990) Proč. Nati. Acad.-Sci. USA 87,54405443 a Standaert, R.F., et al. (1990) Nature 346,671-674. Oblastmi podle odkazu jsou: 70-114,214-258 a 441-485. Pro GAP-43 byly použity tři samostatné oligonukleotidy, komplementární k nukleotidům 961-1008,10811128 a 1201-1248 klonované cDNA, které objevil Rosenthal, A., etal. (187) EMBO J. 6, 3641-3646. Pro kalcineurin A® byly použity oligonukleotidy, komplementární k nukleotidům 1363-1410 a 1711-1758, které objevil Ito et al. (1989) Biochem. Biophys. Res. Commun. 163,1492-1497, pro kalcineurin Α_βoligonukleotidy, komplementární k nukleotidům 1339 1386 a 1569-1616, které objevil Kuno, T., et al. (1989) Biochem. Biophys. Res. Commun. 165, 1352-1358. Řezy byly rozehřály, ponechány uschnout a potom fixovány v 4%, čerstvě depolymerizovaném paraformaldehyduv PBS. Po dvojnásobném opláchnutí PBS byly řezy acetyíovány 0,25% acetanhydridem s 0,1 M triethanolaminu v 0,5% roztoku NaCl (pH 8,0). Potom byly řezy dehydratovány v graduovaném alkoholu, odtučněny v chloroformu po dobu 5 minut, rehydratovány 95% alkoholem a ponechány na vzduchu uschnout Hybridizace byla prováděna přes noc při 37° C v pufru. obsahujícím 50 % deíonizovaného formamidu, 10 % dextransulfátu, 4 x SSC. 1 x Denhardtův roztok, 20 mM fosfátového pufru, 0,1 mg/mi DNA lososího sperma, 0,1 mg/ml kvasinkové transferové RNA, 10 mM diihiolhreilolu, 2,0 % betamerkaptoethanolu (BME), 1,0 mM EDTA a značenou sondu (2000 000 dpm/řez). Po hybridizaci byly řezy oplachovány 1 x SSC, 1,0 % BME 15 minut při pokojové teplotě, potom dvakrát sušeny na vzduchu 10 minut při 55° C a umístěny na film nebo ponořeny do emulze Kodak NTB-2.

Bylo pozorováno výrazné zvýšení exprese FKBP a GAP-43, zatímco v expresi kalcineurinu nebyly zaznamenány žádné změny. Již 24 hodin po poškození faciálního nervu se zvýší exprese FKBP se zřetelným maximem v době mezi 1-2 týdny po poškození, zatímco koncentrace mRNA se po třech týdnech podstatně snižuje. Pozorováním při vyšším zvětšení vyjde najevo, že zvýšené úrovně stříbrných zrn pro FKBP mRNA přináleží tělům neuronálních buněk (fig. 2). Vzestupná kapková analýza disektovaného nuklea faciálního nervu potvrdila zvýšené hladiny mRNA, specifické pro FKBP. Hladiny GAP43 mRNA vykazují podobnou časovou závislost. Naopak, v expresi kalcineurinu nebyly detekovány žádné změny v žádném sledovaném času.

Byla izolována celková buněčná RNA z disektovaného nuklea faciálního nervu. Vzorky celkové RNAv množství 10 nebo 20 ug byly podrobeny elektroforéze na 1 % agaróze, 2,0% formaidehydovém gelu a prostupu nylonovou membránou v lOnM NaOH. cDNA sondy pro FKBP, značenému (^SjdCTP metodou náhodného nástřiku o specifické aktivitě 1 x 10 cpm/ug byly hybridizovány přes noc při 42° C v pufru, obsahujícím 50 % formamidu, 2 x SSPE, 7 % SDS, 0,5 % Blotto a 100 ug/ml DNA lososího sperma. Příslušné skvrny byly promývány 20 minut při pokojové teplotě a dvakrát 15 minut při 65° Cv 0,15 x SSPE, 0,15% SDS a poté exponovány na film 48096 hodin.

Na nepoškozené straně bylo pozorováno mírné zvýšení zrnek stříbra ve srovnání s kontrolními řezy. To je ve shodě s poznatkem, že neurony, nacházející se na opačné straně také vykazují odezvu na odstranění axonů.

Následkem poškození faciálního nervu se u krys vyvine obrna tohoto nervu, která se projevuje nedostatkem pohybu vláken, přičemž k obnově funkce dochází po třech týdnech a to ve sHoóc s ukončením regenerace nervu U našich krys jsme také pozorovali ztrátu vláknového pohybu jako následek poškození nervu s obnovou funkce po třech týdnech. Časový průběh zvýšení exprese GAP-43 a FKBP je tedy v korelaci s procesem regenerace nervu.

Regenerace sciálního nervu

Tento příklad ukazuje změny FKBP a GAP-43,. spojené s regenerací sciálního nervu.

Následkem poškození sciálního nervu jsou zvýšeny hladiny GAP-43 mRNA jak v míšních motorických neuronech, tak v neuronálních buňkách dorsálního kořenového ganglionu. U krys, u nichž byl poškozen sciální nerv jsme pozorovali náhlý vzrůst hladin mRNA pro FKBP v motorických neuronech v L-4, 5 (fig. 3) a v neuronálních buňkách dorsálního kořenového ganglionu, což je v souladu s popsanou zvýšenou expresí GAP-43 (fig. 4). Při velkém zvětšení jsme pozorovali FKMB mRNS stříbrná zrnka, lokalizovaná do tei neuronamích buněk (fig. 3). Hladiny FKBP proteinu jsme monitorovali autoradiografií pomocí vázaného (tritium)FK-506 za podmínek, při kterých se selektivně váže na FKBP (fig. 4). Bylo zjištěno zvýšení FKBP v primárních senzorických neuronech dorsálního kořenového ganglionu, v motorických neuronálních buňkách však žádné zvýšení po poškození sciálního nervu zjištěno nebylo.

Vztah mezi zvýšením exprese FKBP a regenerací dále samostatně potvrzují experimenty s ricinem. Ricin je po vstříknutí do periferních nervů transportován zpět do těla buňky, která je zničena tak, že nedochází k následné regeneraci nervu. Vstříkli jsme 0,5 ug ricinu (RCA 60, Sigma, St. Luis, MO) v 0,5 uí PBS a 0,1 % Fast Greenu do faciálního nervu ve stejném místě, kde při jiných experimentech bylo provedeno jeho poškození metodou Streit a Kreutzbnerg. Streit et al., (1988) J. Comp. Neurol. 268,248-263.

Provedli jsme studium lokalizace FKBP mRNA in situ hybridizací po 2, 4 a 7 dnech od poškození ricinem (fig. 5). Následkem poškození nervu ricinem nebylo pozorováno žádné zvýšení FKBP mRNA. Jak po ošetření ricinem tak následkem mechanického poškození nervu se objevuje glióza. To, že po ošetření ricinem nedochází ke zvýšení FKBP je ve shodě se selektivní neuronální lokalizací FKBP mRNA v nukleu faciálního nervu.

Transport FKBP ve sciálním nervu

Tento příklad ukazuje, že FKBP je rychle transportován do sciálního nervu.

o, že následkem poškození sciálního nervu i přes zvýšení FKBP nmiNA neuochází Ke zvýšení rKBP proteinu v motorických neuronech ukazuje, že protein je rychle transportován z těla buňky do nervových vybezku. To souhlasí s dřívějším pozorováním, že FKBP mRNA je koncentrován v granulárních buňkách mozečku, ve kterém se nachází nízké hladiny FKBP proteinu, zatímco vysoké hladiny tohoto proteinu jsou koncentrovány v molekulových vrstvách na paralelních vláknech, vystupujících z granulárních buněk a připojených na mozeček. Za účelem zjištění případného transportu FKBP jsme poškodili sciální nerv a po 7 dnech podvázali ve vzdálenosti 10 a 20 mm od místa poškození. 6 hodin po poovazam jsme monitorovali vázaní (tritium)FK-506 v 3 mm řezech mezi oběma podvázáními (fig. 6).

V experimentech pro sledování transportu v axoněch byly použity klasické techniky pod važování metodou letzlaff et al. Týden po poškození sciálního nervu byly na nervu vytvořeny dva soubory podvázání (510 vpichů), vzdálené od sebe přibližně 10 mm, přičemž vzdálenost od místa poškození nervu byla 10 mm. Po šesti hodinách byly odebrány řezy nervu z proximální části, distální části a z části mezi oběma soubory podvázání, jak je ilustrováno obrázkem 5. Řezy nervu byly pro stanovení vázaného (tritium)FK-506 upraveny homogenizací v 10 objemech 50 mM Tris-HCl, pH 7,4. Homogenizáty byly centrifugovány 20 minut při g= 15 000 a teplotě 4° C, supernatant byl shromažďován pro stanovení celkové koncentrace proteinů za použití analytické metody vázaní Coomassieho modrého barviva (Pearce). Stanovení vázaného (tritium)FK-506 byly provedeno tak, jak je popsáno (4) s alikvótami, obsahujícími 2 ug dokonale rozpustných proteinů v celkovém objemu 0,4 ml pufru, tvořeného 50 mM Tris-HCl o hodnotě pH 7,4 a bovinním sérovým albuminem, 250 pM (tritium)FK-506 a proměnlivými koncentracemi neoznačeného FK-506. Po inkubaci 60 minut při 25° C bylo 0,35 ml převrstveno přes 0,8 ml sloupec LH-20 Sephadexu (Pharmacia LKB) a promyto 0,4 ml výše uvedeného pufru. Eluáty byly shromažďovány a impulzy aktivity měřeny ve scintilačním čítači.

Výsledky jsou zobrazeny na obrázku 5. Hladiny vázání (tritium)FK-506 jsou nej vyšší v řezu, nejbližším k podvázání ve vzdálenosti 20 cm od poškozeni nervu, přičemž dosahují téměř čtyřnásobné výše ostatních řezů. Na základě hladin vázání (tritiu m)FK-506 v řezech A D jsme vypočítali poměr anterogenního transportu pro FKBP. Tento poměr 240 mm za den je v podstatě stejný jako transportní poměry GAP-43, představující nejrvchlejší transportní poměry neuronálních proteinů.

zxt účelem zviditelnění akumulace FKBP následkem poškození nervu jSiuv á označeni místa poškozeni scialníhc nervu aplikovali volné podvázání a provedli in silu hybridizaci pro FKBP mRNA a autoradiografii vázaného (tritium)FK-506 (fig. 7). Většina FKBP mRNA a vázaného (tritium)FK-506 byla akumulována v bezprostřední blízkosti Doškození. Hladinv zde bvlv významně vyšší než v kontrolním nepoškozeném scíálním nervu. Pozorování autoradiografických preparátů, hybridizovaných in situ při velkém zvětšení, ounaiilo stiíorná zrn «a spojená s viaxiiy neuronů. Také byla pozorována Stříbrná zruKa umístěná v buňkách, jejichž charakter nebylo možno jednoznačně určit, mohlo tedy jít o Schwannovy buňky, makrofágy nebo fibroblasty.

FKBP v buňkách PC 12

Tento příklad ukazuje, že buňky PC 12 obsahují FKBP a že hladiny FKBP jsou zvyšovány nervovým růstovým faktorem. Zkoumali jsme přítomnost FKBP v buňkách PC-12 monitorováním (tritium)FK-506, vázaného v buňkách při bazálních podmínkách a v buňkách po ošetření nervovým růstovým faktorem (NGF).

Hladiny FKBP v buňkách PC-12 byly získány Scatchardovou analýzou křivek vázaného (tritium)FK-506. Kultury byly vyškrábányz kultivačních nádobek a homogenizovány v 10 objemech 50 mM Tris-HCl o hodnotě pH 7,4 s 1 mM EDTA a 100^/mÍ fenylmethyl-suífonyífluoridu a centrifugovány 20 minut při g = 40 000 a při teplotě 4° C. Protein byl stanoven analytickou metodou vázání Coomassieho modrého barviva za použití bovinního sérového albuminu jako standardu. Vázání 250 pM (tritium)dihydrogenFK506 (86,5 Ci/mmol, DuPont/NEN) bylo odhadnuto u vzorků, obsahujících 5^ rozpustného proteinu v celkovém objemu 0,4 ml pufru, který obsahoval 50 mM Tris-HCl o hodnotě pH 7,4 s 2 mg/ml BSA a proměnlivé koncentrace neoznačeného FK506. Po 60 minutách inkubace při 25° C bylo 0,35 ml převrstveno přes 0,8 mí sloupec LH-20 Sephadexu (Pharmacia LKB) a předběžně doplněno výše popsaným pufrem. Sloupec byl dále promyt 0,4 mi pufru a eluáty shromažďovány, míchány s Formulou 963 (DuPont/NEN) a aktivita merena v Beckmanově scmtilačním čítači. Hodnota specifického vázání bylo stanovena odečtením hodnoty vázání v přítomnosti 0,1 M neoznačeného FK506 od celkové hodnoty vázání (tritium)FK506.

Výsledky jsou zobrazeny na obrázku 8. (Tritíum)FK506 se váže až do stavu nasycení k homogenizátům neošetřených buněk PC-12. Při vzorových experimentech bylo vázáno okolo 1 000 cpm, zatímco při nespecifickém vázání v přítomnosti l^M FK506 okolo 150 cpm. Padesátiprocentního inhibičního účinku vázaného (tritium)FK506 se dosáhne s 1-2 nM FK506, což naznačuje, že vazebná místa odpovídají autentickému FKBP. Vázaný (tritium)FK506 znatelně stoupá po ošetření NGF. K významným zvýšení dochází po 10 až 15 hodinách, ztrojnásobí se po 20 hodinách a další mírný vzrůst je zřetelný po 100 hodinách.

Zvýšený růst neuritů v buňkách PC 12.

Tento příklad ukazuje, že FK506 a rapamycin zvyšuje růst neuritů v buňkách PC-12.

Buňky PC-12 byly udržovány při 37° C, 5 % CO v Dulbecco modifikovaném Eagleově mediu (DMEM), doplněném 10% koňským sérem, inaktivovaným teplem a 5% fetáíním bovinním sérem, inaktivovaným teplem. Pro rozlišení v přídavku NGF byly buňky naočkovány v počtu 1 x 10$ do 35 mm kultivačních nádobek, pokrytých krysím ocasním kolagenem v množství 5 ^g/crn. Po přilnutí buněk ke kultivačním nádobkám bylo medium nahrazeno DMEM, doplněným 2% fetáíním koňským sérem, NGFa/nebo FK506 či rapamycinem. Pro kvantifikaci růstu a šíření neuronů byly zhotoveny randomizační fotografie (3-4 na každou nádobku) a počítán celkový počet neuronů a neurony, větší než 5 ^m. Fotograf a pracovník, který počítal buňky, nebyl seznámen s experimentálními podmínkami. Byly provedeny čtyři samostatné experimenty, dvojitě pro každou prezentovanou hodnotu. Neurity byly identifikovány a počítány z přibližně 100 buněk na každou fotografii, každá kvantifikovaná hodnota neuritů byla tedy získána z 1200 -1600 buněk.

Jak bylo zjištěno, NGF účinně stimuluje růst neuritů, přičemž poloviny maximální stimulace je dosažena při koncentraci 1 ng/ml a maximální stimulace při 50-100 ng/ml (fig. 9, 10). FK506 (100 nM) výrazně zesiluje účinek NGF tím, že zvyšuje citlivost buněk k NGF. FK506 tedy 20-50 násobně snižuje koncentraci NGF, potřebnou pro dosažení maximálního růstu. Poloviny maximálního růstu je dosaženo za absence FK506 při 5 ng/ml a v přítomnosti FK506 při 0,1 ng/ml. Při optimálních koncentracích NGF (10-100 ng/ml) přídavek FK506 nepřináší zvýšení růstu neuritů,

FK506 má extrémně silný neurotropický účinek. Za přítomnosti submaximálních koncentrací NGF (1 ng/ml) dosáhne FK506 při koncentraci 1 nM stejného maximálního růstu, jaký byl zjištěn s 50 ng/ml NGF (fig. 11). Polovičních maximálních účinků FK506 se dosáhne při přibližně 100 pM. Není-li NGF přítomen, nepřináší FK506 žádný růst neuritů (fig. 10).

Rapamycin je ucmne imunosupresivo, o kterém se předpokládá, že nepůsobí přes kalcineurin, který však může ovlivňovat jiné fosforylační stupně. Rapamycin silně blokuje aktivity FK506, které jsou zprostředkován^ FKBP a kalcineurinem pravděpodobně jako antagonista FK506 v rámci FKBP. Rapamycin (1_<aM) neblokuje neurotropní účinky FK506. Rapamycin je ovšem sám o sobě neurotropní za předpokladu většího růstu neuritů při 1 mvr. z-uá se, že účinky rapamycinu a FK506 mají odlišný mechanismus. Rapamycin zvyšuje počet a prodlužuje délku procesu růstu, zatímco FK506 primárně zvyšuje délku neuritů. Navíc se zdá, že účinky' FK506 a rapamycinu jsou vzájemně aditivní.

Dorsální kořenové gangliony

Tento příklad ukazuje, že FK506 je neurotropní pro senzorické gangliony. Zkoumali jsme účinek FK506 na primární kultury dorsálních kořenových gamglionů. krys v 16 dni embryonálního stadia.

Embrya ve stadiu E16 byla vyjmuta z březích Spraque-Dawleyových lays a byly disektovány dorsální kořenové gangliony. Celé ganglionové explantáty byly kultivovány v kolagenem pokrytých 35 mm nádobkách (Falcon) za použití media N2 (Dulbecco modifikované Eagleovo medium a Hamovo F12 medium v poměru 1:1, doplněné progesteronem. selenem. insulinem, putrescinem, glukosou a penicilin-streptomycínem) při 37° C v prostředí 15% oxidu uhličitého. Senzorické gangliony byly ošetřeny proměnlivými Koncentracemi NGF a/nebo FK506 nebo rapamycínem nebo anti-NGF protilátkou. Gangliony byly pozorovány každé 2-3 dny za fázově kontrastních podmínek pří použití inverzního mikroskopu Olympus IMT-2, přičemž byla měřena délka axonů. Axonální oblast každého ganglionů byla rozdělena na čtyři kvadranty a v každém kvadrantu byla okulárovým mikrometrem měřena velikost nejdelších axonů. Jako délka axonu ganglionů byl uvažován průměr všech měření.

Pro (tritium)FK506 autoradiografii byly kultury dorsálních kořenových ganglionů pěstovány v komůrce na destičkách, pokrytých kolagenem, 5 A g/cm . Kultury byly na destičku fixovány působením ledově chladného, čerstvě depolymerizovaného 4,0% paraformaldehydu v sodnofosfátovém pufru o koncentraci 0,1 M a hodnotě pH 7,4 po dobu 1 hodiny, potom dvakrát promyty fosfátem pufrovaným roztokem soli. Fixované kultury byly označeny (tritium)FK506 preinkubacf destiček v pufru, sestávajícím z 50 mM Hepes, 2 mg/ml bovinního sérového albuminu a 0,02% Tweenu-20, hodnota pH 7,4. Po preinkubaci následovala inkubace ve stejném pufru, obsahujícím navíc i nM (lriíium)FK506. Nespecifické vázání bylo stanoveno přídavkem 1 neoznačeného FK506. Destičky byly potom oplachovány čtyřikrát 5 minut, sušeny a přiloženy na 10 dnů k filmu, citlivému na tritium.

Autoradiografie míst vázání (tritium)FK506 odhalila značné hladiny FKBP, připojeného na stříbrná zrnka v těchto ganglionech (fig. 12). U vzorků s přídavkem i^ví neoznačeného FK506 autoradiografická zrnka nebyla naiezena, voz naznačuje specificitu vázání. Jak jiz bylo uvedeno, NGF (100 ng/ml) výrazně zvyšuje počet a délku neuritů v ganglionech (fig. 13). FK506 (l^M) sám vykazuje podobný neurotropní účinek, přičemž již přídavek 1 nM FK506 způsobuje znatelné zvýšení růstu. Rapamycin který je antagonistou FK506, úplně blokuje účinky FK506 (1_<λοΜ). Účinek FK506 ukazuje tedy na látkovou specificitu, charakteristickou pro FKBP.

Zatímco FK506 bez přídavku NGF nestimuluje v buňkách PC12 růst neuritů, v senzorických ganglionech je samotný FK506 neurotropní. Schwannovy buňky v ganglionech mohou vytvářet NGF a tato produkce NGF ve Schwannových buňkách je regulována fosforylací proteinu. Abychom zjistil i, zda působení samotného FK506 spočívá v zesílení účinku endogenního NGF, zkoumali jsme vliv protilátek k NGF (fig. 13). Protilátka anti-NGF výrazně snižuje neurotropní účinky FK506 (l^ví). Protilátka anti-NGF nepůsobí toxicky, protože jsme v buňkách, exponovaných anti-NGF protilátce nepozorovali žádný morfologický příznak, který by dokazoval její toxicitu, a to jak s přídavkem, tak bez přídavku NGF.

FK506 je extrémně účinný při stimulaci růstu neuritů. Již 1 pM FK506 vede ke znatelnému přírůstku. Výrazně větší růst se objevuje při 0,1 a 10 nM FK506 (výsledky nejsou zobrazeny), zatímco maximální růst vyžaduje koncentraci l^MFK506.

S postupem Času se rychlost růstu neuritů při všech koncentracích NGF a řK506 sbližuje. Někdy je růst dokazatelný po 1 dni, přičemž růstové plato začíná po okolo 5-6 dnech.

Za neurotropní účinky FK506 je spoluzodpovědný FKBP (FK506 vázající protein) v senzorických ganglionech, protože účinky FK506 je možno obrátit nízkými koncentracemi rapamycinu, známého antagonisty FK506, vázaného na FKBP. To. že rapamycin v buňkách PC-12 neblokuje účinky FK506 pravděpodobně odráží skutečnost, že stimulační účinky rapamycinu jsou oddělené. Mechanizmy, kterými rapamycin stimuluje růst neuritů v buřiKácn Pv_-12, nejsou doposud známy. Existují domněnky, že jeho imunosupresivní účinky zahrnují mechanizmy, které jsou odlišné od mechanizmu působení FK506. Rapamycin může inhibovat S6 kinázu, která fosforyluje ribozomální část S6. Rapamycin také inhibuje fosfatidylinositol-3kinázu.

Proces růstu pří neuronální regeneraci sebou nese fosforylaci, zprostředkovanou proteinovou ktnázou C (PKC). Jiný příznak navozuje představu inhibičních účinků PKC v procesu šíření neuronů.

GAP43 je vynikající kalcineurinový substrát, vysoce koncentrovaný v neuritech, jehož fosforylace je regulována FKBP. GAP43 nemůže být přímo odpovědný za růst neuritů, neboť buňky PC-12 s nízkými hladinami GAP43 vykazují normální růst neuritů. G AP43 a jeho fosforylace však může být jedním z cílů rostoucích neuritů, protože hladiny fosforylovaného GAP43 jsou v narostlých neuritech zvýšené. Fosforylace GA.P-43 může také ovlivňovat pohyblivost kationtů vápníku, který reguluje růst neuritů. Fosforylace GAP-43 inhibuje utváření fosfatidylinositol bis-fosfátu, který by měl snižovat úroveň inositol 1,4,5-trifosfátu a tím uvolňovat k němu připojené ionty vápníku. Navíc, fosforylace GAP-43 snižuje jeho afinitu ke kannodulinu s tím výsledkem, že je k dispozici jeho větší množství pro vázání iontů vápníku.

Imunofiliny se mohou zúčastnit regulace růstu neuritů v místech působení kalcineurinu, který ovlivňuje ionty vápníku. FKBP se váže na receptor ryanodinu, který slouží jako kanál, uvolňující ionty vápníku. V sarkoplasmalickém retikulu kosterního svalu FK506 odštěpuje FKBP z receptoru ryanodinu, čímž podporuje indukovaný mechanizmus, jehož výsledkem je uvolnění vápníkových iontů. FK506 navíc působí v dalších místech, včetně receptorů steroidu na FKBP25 a dalších neidentifikovaných cílových substrátů, například těch, které přísluší k FKBP13. Při růstu neuritů tedy mohou mít určitou potenciální úlohu další mechanizmy.

Neimunosupresivní a imunosupresivní ligandy imunofilinů, stimulujících růst neuritů v buňkách PC-12

V této Části jsme detailně zkoumali vliv počtu ligandů imunofilinů na růst neuritů v buňkách PC-12 a v intaktních kuřecích senzorických gangltonech. Předesíláme, že neimunosupresivní i imunosupresivní ligandy jsou extrémně účinné pro zesílení růstu neuritů jak v buňkách PC 12, tak v senzorických ganglionech.

V naší dřívější práci jsme zjistili, že imunosupresiva stimulují růst neurilu v buňkách PC-12 tím, že zvyšují účinnost nervového růstového faktoru (NGF) asi desetkrát (Lyons et. al., 1994). Bez přídavku NGF nelze pozorovat žádny neurotropní účinek. V současné práci jsme vyhodnotili účinky imunosupresivních látek FK506 a rapamycinu na růst neuritů v buňkách PC-12 za přítomnosti 0,1 - 100 ng/ml NGF,

Bez přiuavku NGr žáuná z íěchlo látek neslimuluje růsl neuritů. ixwnccntrace 0,1 ng/ml samotného NGF vede k mírnému zvýšení růstu neuritů, které dosahuje jen asi 15% maximálních účinků při koncentraci 50 ng/ml (fig. 14). Rapamycin stimuluje růst neuritů ve větším rozsahu než ostatní drogy, přičemž stimulace je 3-4 násobná při koncentraci NGF 0,1 - 0,5 ng/ml. Rozsah stimulace vyvolané rapamycinem se snižuje se zvyšující se koncentrací NGF a je statisticky nevýznamná při koncentraci 5-50 ng/ml NtiF. FK506 je také neurotropní s nejzřetelnějšími účinky při nižších koncentracích NGF a s maximálním 2,5 násobným zesílením růstu neuritů při 0,5 ng/ml NGF.

Existují tři odlišné strukturní třídy imunosupresivních látek, odvozené od cyklosporinu A, FK506 a rapamycinu. Ačkoliv se FK506 a cyklosporin A váží k odlišným imunofilinovým proteinům, spočívá imunosupresivní účinek obou těchto látek v inhibici kalcineurinu. Rapamycin se s mohutnou afinitou vážena FKBP-12, ale komplex látka-imunofilin se naopak neváže na kalcineurin. Imunosupresivní účinek je místo toho výsledkem vázání komplexu rapamycin-FKBP-12 na nedávno identifikovaný a klonovaný protein, označovaný buď jako RAFT-1 (rapamycin and FK506 tar^tY n^bo jako FRAP (Sabatini and Snyder 1994, Brown et. al. 1994, Chen et al. 1994). Protože rapamycin se silně váže na FKBP-12 ale neinhibuje kalcineurin, může být využit jako antagonista k FK506. Existují neimunosupresivní deriváty rapamycinu. jeden z nich, WAY-124,466, irienový derivát rapamycinu se váže & vatóu mmitou na FKBP-12 a tnhibuje rotamázovou aktivitu, je však bez imunosupresivních účinků. Cyklosporin A je velký cyklický undekapeptid. Pouhá adice methylové skupiny na alanin v poloze 6 vede k činidlu, které neinhibuje kalcineurin a postrádá imunosupresivní účinky, přesto inhibuje rotamázovou aktivitu cyklofilinu v podobném rozsahu jako cyklosporin A (Me CsA ref).

Abychom zjistili, zda imunosupresivní aktivita je nutná pro neurotropní účinek, srovnávali jsme neurotropní účinky FK506, rapamycinu a cyklosporinu A s neimunosupresivním WAY-124,466 na buňkách PC-12 v širokém rozsahu koncentrací za přítomnosti 0,5 ng/ml NGF (fig. 15,16). Jak již bylo pozorováno, FK506 velmi silně stimuluje růst neuritů s polovinou maximální stimulace při 0,5 nM a s maximální stimulací při 5-100 nM.

Rapamycin jako nejúčinnější zkoumaná látka dosahuje největšího maximálního růstu neuritů. Při opakovaných experimentech bylo 50 % maximálního růstu dosaženo při asi 0,2-0,4 nM a maximálních účinků při asi 10-100 nM. Maximální růst neuronů stimulovaný rapamycínem ie srovnatelný s maximálními účinky 50 ng/ml NGF. WAY-124,466 je také neurotropický ale méně účinný a dosahuje nižšího maximálního účinku než rapamycin. Poloviny maximální stimulace pomocí WAY-124,466 se dosáhne při koncentraci 1001000 nM. Rapamycin je tedy si 100 krát účinnější než WAY-124,466 při podobné, 40 násobně větší účinnosti pro vázání FKBP-12 (tabulka II).

Cyklosporin A je při stimulaci růstu neuritů výrazně méně účinný než FK506 nebo rapamycin, což odpovídá jeho podstatně nižší schopnosti inhíbovat rotamázovou aktivitu. Padesáti procent maximální stimulace růstu neuritů pomocí cyklosporinu A je dosaženo při jeho koncentraci 50 nM a maximálních účinků při 100 nM s tím, že při ještě vyšších koncentracích cyklosporinu A dochází k poklesu růstu. Maximální stimulace cyklosporinem A dosahuje asi 60% účinku 50 ng/ml NGF.

Obecný model šíření a růstu je u různých imunofilinových ligandů a u NGF podobný. Koncentrace NGF, které vyvolávají 50% maximálních účinků (1-5 ng/ml), vedou u 40-50% buněk k tvorbě výběžků, dlouhých nejméně jako je tělo buňky a u 15 % ke značně delším výběžkům, a to až 3-5 krát delším než je tělo buňky. Model šíření a růstu je pro různé zkoumané látky velmi podobný. Výsledkem působení rapamycinu a WAY-124,466 se zdá být spíše větší počet výběžku na jednu buňku než při působení FK506. Působení cyklosporinu A směřuje spíše k vyváženému růstu ve smyslu počtu a délky výběžků.

Prodlužovaní nervu v kuřecím dorsálním kořenovém ganglionu, vyvolané neimunosupresivními a imunosupresivními ligandy imunofilinů

V naší dřívější práci jsme sledovali účinky imunosupresivních látek v ex planá tech krysích dorsálních kořenových ganglionu s významným zmnožením nervového růstu, pozorovaném jíž při koncentracích FK506 1 píkomol. (Lyons et. al., 1994). V krysích ganglionech byly neurotropní účinky FK506 pozorovány dokonce i v nepřítomnosti NGF. Nyní jsme využili explanaty kuřecích dorsálních kořenových ganglionu, s nimiž se při sledování nervového růstu snáze pracuje. Bez přídavku NGF jsou účinky látek na bázi imunofilinových ligandů minimální. Kuřecí buň ky jsou na NGF citlivější než buňky PC-12, proto jsme k vyvolání minimálního růstu neuritů a k prokázání neuiolropních účinků imunolilinových ligandů použili 0,1 ng/ml NGF (fig. 17, 18).

Dorsální kořenové gangliony byly disektovány z kuřecích embrií desátý den gestace. Celé explantáty ganglionů byly kultivovány v tenké vrstvě na Matrigelem poKrytých, dvanáctinádobkových deskách s mediem Liebovitz L15 a vysokým obsahem glukózy, které bylo doplněno 2 mM glutaminu a 10% fetálního telecího séra, dále 10 ^ví cytosin beta-D arabinofuranosidu (Ara C) pri 37° C v prostředí, obsahujícím 5 % oxidu uhličitého. Po 24 hodinách byly dorsální kořenové gangliony ošetřeny proměnlivými koncentracemi nervového růstového faktoru, imunofilinovými ligandy nebo kombinací NGF a imunofilinových ligandů. Po 48 hodinách od ošetření byly cangliony vizualizovány metodou fázového kontrastu nebo Hoffmanovo modulovaného kontrastu pomocí Zeiss Axiovert inverzního mikroskopu. Byly zhotoveny fotomikrografie expanátů a nalezený nervový růst byl kvantifikován. Za kladný výsledek byly považovány neurity, delší než průměr dorsálního kořenového ganglionu, přičemž celkový počet neuritů byl kvantifikován pro každou experimentální hodnotu. V každé nádobce byly kultivovány 3 až 4 dorsální kořenové gangliony s tím, že každé experimentální stanovení bylo provedeno duplicitně.

ivclaůvni účinky různých imunofilinových ligandů při stimulaci nervového růstu v ganglionech jsou podobné jejich relativním účinkům v buňkách PC-12. Rapamycin je nejúčinnější látkou s hodnotou koncentrace EC 1 nM, tedy desetinásobně účinnější než WAY-124,466, FK506 wkaznie hodnotu koncentrace EC l-2nM.

Maximální zvýšeni poctu vybezků, jejich délky a četnosti větvení je dosti podobné jako při maximálně účinných koncentracích imunofilinových ligandu a NGF (100 ng/ml). S postupným zvyšováním koncentrací jednotlivých látek je možno pozorovat větší počet výběžků, hojnější větvení a větší délku jednotlivých výběžků.

Vyhodnotili jsme potenciální schopnost látek vázat se na FKBP-12 zkoumáním inhibice (tritium)FK506, vázajícího se na rekombinantní FKBP-12. Mezi afinitou látek k FKBP-12 a jejich účinností při stimulaci růstu neuritů a mezi jejich schopností inhibovat rotamázovou aktivitu existuie výrazná podobnost. Je zřejmé, že stimulace nervového růstu nemá vzájemnou souvislost s inhibicí kalcineurinu. Inhibice kalcineurinu má zřejmou souvislost s imunosupiesivními účinKy, waY-124,466 není imunosupresivní a ueiuhibujc kalcineurin. Rapamycin je účinné imunosupresivum ale komplex rapamycin FKBP-12 se váže na RAFT 1 za vzniku imunosupresivních reakcí (Sabatini a Snyder, 1994, Snyder a Sabatini, 1995). Výsledky jsou sesta veny v tabulce 2.

Tabulka 2

Paralely mezi neurotropismem imunofilinových ligandů a jejich schopností inhibovat rotamázovou aktivitu, ne kalcineurin

	(ti'itiuin)FK506	kalcin. rotamáz.	nervový růst
látka	FKBP12 (IC50)	inhibice	(Ki)	(ED50)
FK506	0,6 nM	ano 0,4 nM		0,5 nM
rapamycin	0,5 nM	žádná	0,2 nM	0,5 nM
WAY- 124,466	10,0 nM	žádná	12,0 nM	10 nM
cyklosp. A (CsA)	není	ano 20 nM		50 nM

Srovnávali jsme schopnost neimunosupresivních imunofilinových dg«ndů stimulovat rust neuritu v kulturách exploatovaných kuřecích dorsálních kořenových ganglionu (tabulka 3). Žádná z těchto látek nemá schopnost mhibování kalcineurinu, vzájemně však reagují s imunofilinem

FKBP 12, čímž dochází k inhibici jeho rotamázové aktivity a to s odlišnými inhibičními konstantami, jejichž přehled je uveden v tabulce 3. Schopnost těchto látek stimulovat růst neuritů v dorsálních kořenových ganolionech dobře koreluje s jejich schopností inhibovat rotamázovou aktivitu FKBP-12.

Tabulka 3

	(trit)FK50	kalcineur		růst neuritu
	6 FKBP-	rotamáz.	(K.)	(ED50)
	12 (IC50)	inhibice
vzorek 12	8^M	žádná	250 uM	300 nM
vzorek 13	4	žádná	25 nM	80 nM

Z velmi úzké korelace mezi schopností látek vázat se na imunofiliny za inhibování jejich rotamázové aktivity a schopností stimulovat růst neuritů vyplývá, že inhibice rotamázové aktivity je odpovědná za neurotropní účinky těchto látek. Mimořádně vysoká účinnost látek při stimulaci růstu neuritů a při vázaní na imunofiliny vede k závěru, že na neurotropních účincích se s největší pravděpodobností nepodílí žádný další faktor. Je myslitelné, že biologická aktivita imunofilinů, jiná než rotamázová, by mohla být ovlivňována látkami, které mají upravovat neurotropní děje. Doposud však taková biologická aktivita nebyla zjištěna.

Vzhledem k mimořádné účinnosti těchto látek a úzké korelaci mezi inhibici rotamázové aktivity a neurotropnimt účinky jsme došli k závěru, že inhibování rotamázové aktivity je pravděpodobně spoluodpovědné za neurotropní účinky. Do současné doby již byla řada proteinů označena jako substrát rotamázové aktivity imunofilinů včetně kolagenu (Steinmann et. al., 1991) a transferinu (Lodish a King, 1991). Nedávno bylo zjištěno, že ve velmi čistých preparátech receptoru ryanodinu a IP-3, které představují vynikající intracelulární kanály vápníku, se nacházejí komplexy s FKBP-12. Uvolnění FKBP-12z těchto komplexů způsobuje, že kanály vápníku jsou děravé (Cameron et al., 1995). Proudění vápníku se spoluzúčastní procesu růstu a ůjřcní neuritů, takže receptoi IP-3 a receptor ryanodinu se muže podílet na neurotropních účincích látek. Protože tvto Játkv «« plrpj o no stejném místě jako receptor IP-3 nebo receptor ryanodinu, bylo bv nutno předpokládat, ze látky odstíní kanaly vápníku na FKBP-12 a vyřadí je tím z činnosti. Mezi těmito kanály vápníku v cyklofilinu však nebyla zjištěna žádná interakce, takže tento model neobjasňuje neurotropní účinnost cvklosnorinii A.

Neurotropní projevy zde zkoumaných látek byly prováděny při takových extremne nízkých koncentracích, že indikační potenciování bylo srovnatelné s potenciováním, způsobené neurotropními protein^ ’ako je mozkový růstový faktor, neurotropin-3 a neurotropní růstový faktor.

Následující přiKiady ilustrují výhodná provedení vynálezu aniž by tento vynalez jakýmkoliv způsobem omezovaly. Všechny molekulové hmotnosti polymerů představují jejich průměrnou molekulovou hmotnost. Pokud není uvedeno jinak, jsou všechny procentní údaje založeny na hmotnostních procentech finálního systému nebo preparované látky a všechna celková množství rovna 100 % hmotnostních.

Ilustrativní deriváty kyseliny pipekolinové, které mohou být použity k účelům podle tohoto vynálezu zahrnují:

Příklad 1

Ό OMe

Way -124,466

Tento příkladný derivát kyseliny pipekolinové je popsán v práci Ocain et. al., Biochemical and Biophysical Research Communications, Vol. 192, No 3,1993. Sloučenina byla syntetizována ve Wyeth-Ayerst Dr. Philem Hughesem reakcí 4-fenyl-l ,2,4-triazolin-3,5-dionu s rapamycinem.

Příklad 2

RAP-Pa

Tento derivát kyseliny pipekolinové je popsán v práci Chakraborty et. aL, Chemistry and Biology, březen 1995, 2:157-161.

Příklady 3-5

Tyto příkladné deriváty kyseliny pipekolinové jsou popsány v práci Ikeda et a!., J. Am. Chem. Soc. 1994, 116,4143-4144.

Příklady 6-9

Příkladné deriváty kyseliny pipekolinové jsou popsány v práci Wang et al., Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, Vol. 4, No. 9, str. 11611166, 1994, obzvláště sloučeniny 2a-2b podle odkazované práce.

Příklad 10

MeO OMe

Tento příkladný derivát kyseliny pipekolinové, sloučenina 10 je popsán v práci Birkenshaw et al., Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, Vol. 4, No. 21, str. 2501-2506, 1994.

Příklady 11-21

Tyto příkladné deriváty kyseliny pipekolinové jsou popsány v práci Holt et al,, J. Am. Chem. Soc., 1993, 115, 9925-9938 a to zvláště sloučeniny 4-14 podle odkazované práce.

Příklady 22-30

Tyto příkladné deriváty kyseliny pipekolinové jsou popsány v práci caffery et aí., tííoorganic and Medicinal Chemistry Letters, Vol. 4, No. 21, str. 2507-2510, 1994.

Příklad 31

Tento příkladný derivát kyseliny pipekolinové, sloučenina 31, je popsán v práci Teague et al., Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, Vol. 3, No. 10, str. 1947-1950,1993.

Příklady 32-34

Příkladné deriváty kyseliny pipekolinové jsou popsány v práci Yamashita et ai., Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, Vol. 4, No. 2, str. ^25-328, 1994, a to zvláště sloučeniny 11, 12 a 19 podle odkazované práce.

Příklady 35-55

Příkladné deriváty kyseliny pipekolinové jsou popsány v práci Holt et aí., Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, Vol. 4, No. 2, str. 315-320, 1994 a to zvláště sloučeniny 3-21 a 23-24 podle odkazované práce.

Příklady 56-68

Tyto příkladné deriváty kyseliny pipekolinové jsou popsány v práci Holt et al., Bíoorganic and Medicinal Chemistry Letters, Vol. 3, No. 10, str. 19771980, 1993 a to zvláště sloučeniny 3-15 podle odkazované práce.

Příklady 69-83

Tyto příkladné sloučeniny podle tohoto vynálezu jsou popsány v Hauske et ai., J. Med. Chem. 1992, 35,4284-4296, obzvláště sloučenina 6.910, 21-24, 26, 28, 31-32 a 52-55 podle odkazované práce.

Příklad 84

SLB506

Tento příkladný derivát kyseliny pipekolinové je popsán v práci Teague et ai., Bíoorganic and Med. Chem. Letters, Vol. 4, No. 13. str. 1581-1584, 1994.

Příklady 85-89

Tyto příkladné deriváty kyseliny pipekolinové jsou popsány v práci Stock et al., Bíoorganic and Medical Chemistry Letters, Vol. 4, No. 12. str. 1457-1460, 1994, a to zvláště sloučenina 2 a 15-17 podle odkazované práce.

Příklady 90-111

Další příkladné deriváty kyseliny pipekolinové jsou popsány ve schématu 10 a tabulkách 1-5.

příklad/sloucenina struktura

X =

X = CH^

X = H, CH₃

X = 0

Schéma 2

příldad/sloucenina č.

Ί X /

Schema 3 příklad/sioučenina č.

struktura

20 21 Schema 4 Tabulka 1 |= θΑ příklad/sloucenina 24 23 24 Tabulím 2 «Ο °-í

°A ⁰ / A-°ý^ ° ΑΊ ϊ^ο ^ο*Αα° > 0 k/x-''''^⁰ 00 A ^>O^J0 c. struktura V = 1 y = 2 y = 3 ^XX^x-x^O v° A-^. ⁰ {Λ M Jn o a^J

příklad/sloučenina c. 25 26 27 Tabulím 3 1 · C NI UGO r/ 0¾ v příklad/sloučenina č. 28 29 30 Schema 5 í Ί 1 । Sr^y R příklad/sloučenina č. 32 33 34

OCX UivivilCl n = 10 n = 2 n = 3 ín struktura n = 1 n = 2 n = 3 struktura R = fenyl p = XT/oiUrn 1Ί v«xx J 1^2 'Th °~Sj

Schema 6

Tabulka 1

R příklad/sloucenina č.

38’ struktura R

labulka 2 příklad/sloučenina Č. 51 52 53 54 55

struktura I <pu« CXji/^x^^Acw<’ Áo° A ^0 A* OM« ál pTZM, C-S 0

Schema 7

Tabulka 1

x = OH x = OMe x = Oi Pr x = OBn x = OCH MePh x = OCH,CHCHPh x = OCH₂CH₂CH₂ (3,4-OMe₂) Ph x = ΝΉΒη x = NHCH₂CH,CH₂Ph

Tabulím 2

Tabulka 3 €7

Schema 8

Tabulka 1 příklad/sloučenina Č.

struktura

R, = Phe-o-terc-butyl

R; = Phe-o-terC-bucyl

Tabulka 2

R.em-OCHjPh; R^Val-o-terč-bucyl· R^m-OCHiPh; R^eLeu-c-terc-bucyl R^m-OCH-jPh; R₃ ^l=Ileu-o-terč - bucyl· R. =m-OCHjPh; R₃ ¹=hexahydro - Phe-o- terč bucyl·

Riem-OCHjPh; Really!alanine - o-cere bucyl

R_X=B -naphthyl; Rj^Val-o-terc -bucyl·

Tabuilia 3

příklad/sloučenina č. struktura

^Ri = CH₂ (CO) -m-OCH₃PH

R<- = CH₃Ph

R_s- = OCH₃ ⁼ (CO)-B-naphthyl

R? = CH₂Ph

R_s- = OCH₃

Tabulka 4

příldad/sloučenina č. 79 SO SI 82 83 Tabulka 1 85 MO... v o- yo-^r-

struktura R_x = m-OCH₃Ph X = trans-CH=CH Rd = H Y = OC(o)Ph R_x = m-OCH₃Ph X = trans-CH=CH Rd = H Y = OC(o)CF₃ R_x = m-OCH,Ph X = trans-CH=CHI Rd = - Y = - R_x = m-OCH₃Ph X = trans-CH=CH Rd = H Y = och₂ch=ch₂ R_l = m-OCH₃Ph X = C«0 Rd = H Y = Ph ₃ ⁰ -0 X ^x σ**· / K OM·

Tabulka 2

8 o	Rj=H,	R₂=OMeR₃=CH₂OMe
87	R^H,	R,=r₃=H
88	F_n=Me,	r₂=r₃=h

Schema 10

Tabulka 1

R =

3,4-dichlcro

3,4,5-trimethcxy

H

3-(2,5-Dimethoxy) phenylprcpyl

3-(3,4-Methylenedioxy) phenylpropyL

Tabulka 2

příklad

R =

4- (p-Methoxy) -butyl 3-Phenylpropyl

3-(3 - Pyridyl) propyl

Tabulka 3

příklad

100

101

102

103

104

R =

3-(3-Pyridyl)-propyl

1,7-Diphenyl-4-heptyl

4-(4-Methoxy)butvl

- Phenyl - 5 - (4 - methoxyphenyl )-4-hexyl

3-(2,5-Dimethoxy)nhenylpropyl

- (3,4-Methylenedioxy) phenylpropyl

1,5-Diphenylpentyl

Tabulka 4

příklad

105

107 ' R =

4-(4-Methoxy)butyl

3-Cyclohexylpropyl

3-Phenylprcpyl

Tabulka 5

příklad

108

105

110

111

R =

3-Cyclohexylpropyl

3-Phenylpropyl

4-(4-Methoxy)butyl

1,7-Diphenyl-4 heptyl

Neurotropní účinky inhibitoru rotamáz labulka I uvádí soubor řady příkladů podle vynálezu s jejich účinností vyvolávat neurotropní efekty v kulturách senzorických neuronů jak je popsáno výše. Obrázky 19 a 20 zobrazují fotomikrografie příkladu lila příkladu 17, ve kterých byl stimulován růst neuritů v kulturách dorsálních kořenových ganglionů.

Tabulka I In vitro účinnosti testovaných příkladů příklad inhibice rotamáz

Ki, nM

Neurotropní ED^, kuř. dors. koř. g. nM

100

101

102

103

104

105

106

107

108

109

110

111

140

170

250 >10,000

1300 >10,000

1800

165

740

725

130

120

103

760

210

0.030 χ

300 80 0.30 0.017 >10,000 5000 >10,000 2500

200

5-10 10-20

150

0.17

2.5 .016 χ

0.82

0.29

0.08 0.002

0.08

Aktivita příkladných sloučenin při modelování nervové regenerace in vivo

Axotomie sciálního nervu

Šest týdnů staří samci Spraque-Dawleyových krys byly anestheúzo váni, sciáíní nerv byl obnažen a poškozen pomocí svorky v úrovni stehna. Testované sloučeniny nebo vehikulum byly podávány subkutánné každý den těsně k iéz,i po QOuu 18 Cmu. Za účelem kvantifikace počtu axonů byly řezy sciálního nervu obarveny Holmesovým stříbrným barviven^ro kvantifikaci stupně myelinizace tezistentni modři Luxol. Osmnáct dnů po zranění nervu došlo u zvířat, ošetřených vehikulem, k výraznému snížení počtu axonů (50% snížení při srovnání s nepoškozeným kontrolním nervem) a k výraznému snížení stupně myelinizace (90% snížení ve srovnání s nepoškozeným kontrolním nervem).

Podávání sloučeniny podle vzorku 12 (30 mg/kg s.c.) nebo vzorku 13 (30 mg/kg s.c.) denně těsně k lézi po dobu 18 dnů se projevilo ve výrazné regeneraci jak počtu axonů (25 % popřípadě 5 % snížení při srovnání s nepoškozeným kontrolním nervem), tak stupně myelinizace (65% popřípadě 50% snížení při srovnání s kontrolním nervem), porovnáváno s vehikulem ošetřenými zvířaty. V ýrazná účinnost vzorku 12 a 13 je ve shodě s jejich silnou inhibicí rotamázové aktivity, účinnou stimulací růstu neuritů v kuřecích dorsálních kořenových ganglionech a projevem jejich paralelní, jak in vivo, tak také in vitro působivosti (tabulka I). Tyto výsledky jsou zobrazeny na obrázku 2L Imitovaná“ označuje kontrolní zvířata, která obdržela vehikulum, neměla však poškozený nerv, vehikulum“ označuje zvířata, jejichž nerv byl poškozen, obdržela však pouze vehikulum (to znamená žádné léčivo). Příklad 12 a příklad 13 ukazuje nápadnou podobnost výsledků ve srovnání s nezraněnými zvířaty, léčenými imitované pouze vehikulem, což demonstruje mocné neuroregenerativní účinky těchto sloučenin in vivo. Hodnoty jsou kvantifikovány v tabulce II.

Tabulím II lecba	počet axonů
(% kontrol.)	úroveň myelinizac
imitovaná	100	100
léze + vehikul. (s.c.)	50	i n 1 M
+ příklad 12 (30 mg/kg s.c.)	75	35
+ příklad 13 (30 mg/kg s.c.)	100	50

Je zřejmé, že zde popsaný vynález může být jakýmkoliv způsobem v mnoha směrech pozměňován. Takové změny neunikají z obsahu myšlenky a rozsahu ochrany vynálezu, neboť všechny tyto změny jsou zahrnuty do následujících patentových nároků.

Claims

1. Použití neimunosupresivních derivátů kyseliny pipekolinové, majících afinitu k imunofilinům typu FKBP, kde imunofilin typu FKBP vykazuje rotamázovou aktivitu a derivát kyseliny pipekolinové tuto rotamázovou aktivitu imunofilinu inhibuje, pro výrobu léčiva pro léčení neurologické poruchy u zvířete, zejména pro stimulaci růstu poškozených periferních nervů nebo pro podporu neuronálm regenerace.

2. Použití podle nároku 1, kde neurologická porucha je vybrána ze skupiny, zahrnující periferní neuropatie způsobené fyzickým zraněním nebo chorobným stavem, fyzickým poškozením mozku a fyzickým poškozením míchy, poškození mozku jako následek mrtvice a neurodegenerací podmíněné neurologické poruchy.

3. Použití podle nároku 2, ve kterém je neurologická porucha vybrána ze skupiny, zahrnující Alzheimerovu nemoc, Parkinsonovu nemoc a amyotropní laterální sklerózu.

4. Použití podle nároku 1, ve kterém je derivátem kyseliny pipekolinové Way-124,466.

5. Použití podle nároku 1, ve kterém je derivátem kyseliny pipekolinové Rap-Pa.

6. Použití podle nároku 1, ve kterém je derivátem kyseliny pipekolinové SLB-506.

7. Použití podle nároku 1, ve kterém je derivát kyseliny pipekolinové vybrán ze skupiny, zahrnující sloučeniny 3-84 a 90-111.

8. Použití podle nároku 1, které zahrnuje nejméně 75% regeneraci ve smyslu počtu axonů a nejméně 35% obnovení myelinizace.

9. Použití podle nároku 1, které zahrnuje nejméně 75% regeneraci ve smyslu počtu axonů a nejméně 50% obnovení myelinizace.

10. Použití podle nároku 1, ve kterém je inhibice rotamázové aktivity dosaženo použitím koncentrace látky ne větší než 1800 nM.

11. Použití podle nároku 1, ve kterém je inhibice rotamázové aktivity dosaženo použitím koncentrace látky ne větší než 210 nM.

12. Použití podle nároku 1, ve kterém je inhibice rotamázové aktivity dosaženo použitím koncentrace látky ne větším než 103 nM.

13. Použití podle nároku 1, ve kterém je neurotropního ED₅₀ dosaženo použitím koncentrace látky ne větší než 200 nM.

14. Použití podle nároku 1, ve kterém je neurotropního ED₅₀ dosaženo použitím koncentrace látky ne větší než 35 nM.

15. Použití podle nároku 1, ve kterém je neurotropního ED₅₀ dosaženo použitím koncentrace látky ne větší než 1 nM.

16. Použití neimunosupresivních derivátů kyseliny pipekolinové podle nároku 1, v kombinaci s účinným množstvím neurotropního faktoru vybraného ze skupiny zahrnující neurotropní růstový faktor, růstový faktor mozkového původu, růstový faktor gliálního původu, ciliální neurotropní faktor a neurotropin-3 pro stimulaci růstu poškozených periferních nervů nebo k podpoře neuronální regenerace.

17. Použití podle nároku 16, ve kterém je neurologická porucha vybrána ze skupiny, zahrnující periferní neuropatie způsobené fyzickým zraněním nebo chorobným stavem, fyzickým poškozením mozku a fyzickým poškozením míchy, poškozením mozku jako následek mrtvice a neurodegenerací podmíněné neurologické poruchy.

18. Použití podle nároku 16, ve kterém je neurologická porucha vybrána ze skupiny, zahrnující Alzheimerovu nemoc, Parkinsonovu nemoc a amyotropní laterální sklerózu.

19. Použití podle nároku 16, ve kterém je neimunosupresivním derivátem kyseliny pipekolinové Way-124,666.

20. Použití podle nároku 16, ve kterém je neimunosupresivním derivátem kyseliny pipekolinové Rap-Pa.

21. Použití podle nároku 16, ve kterém je neimunosupresivním derivátem kyseliny pipekolinové SLB-506.

22. Použití podle nároku 16, ve kterém je neimunosupresivní derivát kyseliny pipekolinové vybrán ze skupiny, zahrnující sloučeniny 3-84, 86-88 a 90-111.

23. Použití neimunosupresivních derivátů kyseliny pipekolinové podle nároku 1, pro výrobu léčiva pro stimulaci nebo podporu růstu poškozených periferních nervů, kde neimunosupresivní deriváty kyseliny pipekolinové mají afinitu k imunofilinům typu FKBP, kde imunofilin typu FKBP vykazuje rotamázovou aktivitu a neimunosupresivní derivát kyseliny pipekolinové tuto rotamázovou aktivitu imunofilinu inhibuje.

24. Použití podle nároku 23, zahrnující dále přidání neurotropního faktoru pro stimulaci nebo podporu růstu poškozených periferních nervů, přičemž neurotropní faktor je vybrán ze skupiny, zahrnující neurotropní růstový faktor, růstový faktor mozkového původu, růstový faktor gliálního původu, ciliální neurotropní faktor a neurotropin-3.

25. Použití podle nároku 23, ve kterém je neimunosupresivním derivátem kyseliny pipekolinové Way-124,666.

26. Použití podle nároku 23, ve kterém je neimunosupresivním derivátem kyseliny pipekolinové Rap-Pa.

27. Použití podle nároku 23,ve kterém je neimunosupresivním derivátem kyseliny pipekolinové SLB-506.

28. Použití podle nároku 23, ve kterém je neimunosupresivní derivát kyseliny pipekolinové vybrán ze skupiny, zahrnující sloučeniny 3-84, 86-88 a 90-111.

29. Použití podle nároku 23, který zahrnuje nejméně 75% regeneraci ve smyslu počtu axonů a nejméně 35% obnovení myelinizace.

30. Použití podle nároku 23, který zahrnuje nejméně 75% regeneraci ve smyslu počtu axonů a 50% obnovení myelinizace.

31. Použití podle nároku 23, ve kterém je inhibice rotamázové aktivity dosaženo použitím koncentrace látky ne větší než 1800 nM.

32. Použití podle nároku 23, ve kterém je inhibice rotamázové aktivity dosaženo použitím koncentrace látky ne větší než 210 nM.

33. Použití podle nároku 23, ve kterém je inhibice rotamázové aktivity dosaženo použitím koncentrace látky ne větší než 103 nM.

34. Použití podle nároku 23, ve kterém je neurotropní ED50 dosaženo použitím koncentrace látky ne větší než 200 nM.

35. Použití podle nároku 23, ve kterém je neurotropní ED₅₀ dosaženo použitím koncentrace látky ne větší než 35 nM.

36. Použití podle nároku 23, ve kterém je neurotropního ED50 dosaženo použitím koncentrace látky ne větší než 1 nM.

37. Použití neimunosupresivních derivátů kyseliny pipekolinové podle nároku 1 pro výrobu léčiva pro přímou stimulaci růstu poškozených periferních nervů, kde neimunosupresivní deriváty kyseliny pipekolinové mají afinitu k imunofilinům typu FKBP, kde imunofilin typu FKBP vykazuje rotamázovou aktivitu a neimunosupresivní derivát kyseliny pipekolinové tuto rotamázovou aktivitu imunofilinu inhibuje.

38. Použití podle nároku 37, zahrnující dále přidání účinného množství neurotropního faktoru vybraného ze skupiny, zahrnující neurotropní růstový faktor, růstový faktor mozkového původu, růstový faktor gliálního původu, ciliámí neurotropní faktor a neurotropin-3 pro stimulaci růstu poškozených periferních nervů.

39. Použití podle nároku 37, ve kterém je neimunosupresivním derivátem kyseliny pipekolinové Way-124,666.

40. Použití podle nároku 37, ve kterém je neimunosupresivním derivátem kyseliny pipekolinové Rap-Pa.

41. Použití podle nároku 37, ve kterém je neimunosupresivním derivátem kyseliny pipekolinové SLB-506.

42. Použití podle nároku 37, ve kterém je neimunosupresivní derivát kyseliny pipekolinové vybrán ze skupiny, zahrnující sloučeniny 3-84, 86-88 a 90-111.

43. Použití neimunosupresivních derivátů kyseliny pipekolinové podle nároku 1, pro výrobu léčiva pro podporu neuronální regenerace a neuronálního růstu u zvířat, kde neimunosupresivní deriváty kyseliny pipekolinové mají afinitu k imunofilinům typu FKBP, kde imunofilin typu FKBP vykazuje rotamázovou aktivitu a neimunosupresivní derivát kyseliny pipekolinové tuto rotamázovou aktivitu imunofilinu inhibuje.

44. Použití podle nároku 43, zahrnující dále přidání účinného množství neurotropního faktoru pro podporu neuronální regenerace, přičemž neurotropní faktor je vybrán ze skupiny, zahrnující neurotropní růstový faktor, růstový faktor mozkového původu, růstový faktor gliálního původu a neurotropin-3.

45. Použití podle nároku 43, ve kterém je neimunosupresivním derivátem kyseliny pipekolinové Way-124,666.

46. Použití podle nároku 43, ve kterém je neimunosupresivním derivátem kyseliny pipekolinové Rap-Pa.

47. Použití podle nároku 43, ve kterém je neimunosupresivním derivátem kyseliny pipekolinové

SLB-506.

48. Použití podle nároku 43, ve kterém je neimunosupresivní derivát kyseliny pipekolinové vybrán ze skupiny, zahrnující sloučeniny 3-84, 86-88 a 90-111.

49. Použití podle nároku 43, který zahrnuje nejméně 75% regeneraci ve smyslu počtu axonů a nejméně 35% obnovení myelinizace.

50. Použití podle nároku 43, který zahrnuje nejméně 75% regeneraci ve smyslu počtu axonů a nejméně 50% obnovení myelinizace.

51. Použití podle nároku 43, ve kterém je inhibice rotamázové aktivity dosaženo použitím koncentrace látky ne větší než 1800 nM.

52. Použití podle nároku 43, ve kterém je inhibice rotamázové aktivity dosaženo použitím koncentrace látky ne větší než 210 nM.

53. Použití podle nároku 43, ve kterém je inhibice rotamázové aktivity dosaženo použitím koncentrace látky ne větší než 103 nM.

54. Použití podle nároku 43, ve kterém je neurotropního ED50 dosaženo použitím koncentrace látky ne větší než 200 nM.

55. Použití podle nároku 43, ve kterém je neurotropního ED₅₀ dosaženo použitím koncentrace látky ne větší než 35 nM.

56. Použití podle nároku 43, ve kterém je neurotropního ED50 dosaženo použitím koncentrace látky ne větší než 1 nM.

57. Použití neimunosupresivních derivátů kyseliny pipekolinové podle nároku 1, pro výrobu léčiva pro prevenci neurodegenerace u zvířat, kde neimunosupresivní deriváty kyseliny pipekolinové mají afinitu k imunofilinům typu FKBP, kde imunofilin typu FKBP vykazuje rotamázovou aktivitu a neimunosupresivní derivát kyseliny pipekolinové tuto rotamázovou aktivitu imunofilinu inhibuje.

58. Použití podle nároku 57, zahrnující dále přidání účinného množství neurotropního faktoru za účelem prevence neurodegenerace, přičemž neurotropní faktor je vybrán ze skupiny, zahrnující neurotropní růstový faktor, růstový faktor mozkového původu, růstový faktor gliálního původu, ciliální neurotropní faktor a neurotropin-3.

59. Použití podle nároku 57, ve kterém je neimunosupresivním derivátem kyseliny pipekolinové Way-124,666.

60. Použití podle nároku 57, ve kterém je neimunosupresivním derivátem kyseliny pipekolinové Rap-Pa.

61. Použití podle nároku 57, ve kterém je neimunosupresivním derivátem kyseliny pipekolinové SLB-506.

62. Použití podle nároku 57, ve kterém je neimunosupresivní derivát kyseliny pipekolinové vybrán ze skupiny, zahrnující sloučeniny 3-84, 86-88 a 90-111.

63. Použití podle nároku 57, zahrnující nejméně 75% regeneraci ve smyslu počtu axonů a nejméně 35% obnovení myelinizace.

64. Použití podle nároku 57, zahrnující nejméně 75% regeneraci ve smyslu počtu axonů a nejméně 50% obnovení myelinizace.

65. Použití podle nároku 57, ve kterém je inhibice rotamázové aktivity dosaženo použitím koncentrace látky ne větší než 1800 nM.

66. Použití podle nároku 57, ve kterém je inhibice rotamázové aktivity dosaženo použitím koncentrace látky ne větší než 210 nM.

67. Použití podle nároku 57, ve kterém je inhibice rotamázové aktivity dosaženo použitím koncentrace látky ne větší než 103 nM.

68. Použití podle nároku 57, ve kterém je neurotropního ED₅₀ dosaženo použitím koncentrace látky ne větší než 200 nM.

69. Použití podle nároku 57, ve kterém je neurotropního ED50 dosaženo použitím koncentrace látky ne větší než 35 nM.

70. Použití podle nároku 57, ve kterém je neurotropního ED₅₀ dosaženo použitím koncentrace látky ne větší než 1 nM.