CZ25199A3

CZ25199A3 - Způsob výroby mraženého potravinářského produktu

Info

Publication number: CZ25199A3
Application number: CZ99251A
Authority: CZ
Inventors: Richard Anthony Fenn; David Needham; Keith Smallwood
Original assignee: Unilever N. V.
Priority date: 1996-07-26
Filing date: 1997-07-04
Publication date: 1999-07-14
Also published as: EP0924990B1; DK0924990T3; JP4338054B2; WO1998004146A1; CA2261315C; ATE331441T1; PL331483A1; JP2000515752A; EP0924990A1; NO990316D0; IL127488A; DE69736234T2; IL127488A0; ES2268733T3; KR20000029565A; AU720354B2; CN1226139A; BR9710519A; CN1081444C; CA2261315A1

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká způsobu výroby potravinářského produktu obsahujícího AFP a potravinářských produktů obsahujících AFP.

Dosavadní stav techniky

Nemrznoucí peptidy (AFP) byly navrženy pro zlepšení tolerance potravinářských produktů k zmrazování.

Nemrznoucí proteiny již byly popsány v literatuře, viz například Marilyn Griffith a K. Vanya Ewart v Biotechnology Advances, svazek 13, č. 3, strany 375 - 402, 1995. Nemrznoucí vlastnosti obecně naplňují jednu nebo vícě z následujících vlastností: termální hystereze, inhibice rekrystalizace ledu, řízení tvaru ledových krystalů a interakce s ledovými zárodky.

Termální hystereze je nejlépe známá vlastnost AFP, přičemž tato vlastnost je obvykle využívána pro testování přítomností AFP. Termální hystereze má za následek snižování zmrazovací teploty roztoku obsahující AFP s aktivní termální hysterezí, aniž by byla ovlivněna teplota tání. Identifikace zdrojů AFP prostřednictvím testů termální hystereze je široce popsána v literatuře, viz například John G. Dumán v Cryobilogy 30,. 322-328 (1993).

Inhibice rekrystalizace ledu je další vlastností AFP. Tato vlastnost je rovněž nazývána jako potlačení růstu ledových krystalů; Tato vlastnost může být testována prostřednictvím porovnání v určitém časovém okamžiku velikosti ledových-krystalů za přítomnosti AF a za.

• 4 4 4 4*· «4 • · 4 · 444 44«4 *4 44 4·4· · · 4 4 • 44 4 ? 4 444444 444 · 4 4

4444444 4 4

44 44 4 44 44 nepřítomnosti AFP. Aplikace tohoto postupu při testování rybích AFP je popsána v US patentu č. 5,118,792 (DNA Plant Technology Corporation).

Třetí vlastností AFP je jejich schopnost ovlivnit 5 tvar ledových krystalů. Tato vlastnost pramení ze selektivního vázání AFP k určitým stranám ledového krystalu, čímž je zároveň omezován růst krystalů v určitých směrech. Přítomnost ledových krystalů majících hexagonální dvoujehlanový tvar je potom považována za příznak přítomnosti AFP. Tento způsob je například popsán pro testování aktivity AFP extracelulárního ozimého žita v patentové přihlášce WO 92/22581 (University of Waterloo).

Čtvrtou vlastností AFP je jejich schopnost zamezit aktivitě ledových zárodečných substancí. Tato interakce mezí AFP a ledovými zárodky může mít například za následek zvýšenou termální hysterezi. Tato vlastnost je například testovány v patentové přihlášce WO 96/40973 (University of Notre Dáme du Lac).

2o AFP byly navrženy pro zlepšení tolerance produktu k zmrazování. V této souvislosti již bylo navrženo mnoho aplikací.

Například byly AFP navrženy pro zlepšení konzervace biologických materiálů mrazením (patentová přihláška WO

91/12718, Agouron Pharmaceuticals, patentová přihláška WO

91/10361, The Regents of University of California). AFP byly rovněž navrženy pro zamezení unikání lipozómů, například v kosmetických nebo farmaceutických prostředcích (viz patentová , přihláška WO 96/20695). Dalším možným použitím je zvýšení tolerance rostlin k zmrazování prostřednictvím začlenění AFP • · • ·« • * • · ·* 9

9 9 t • ♦ * 9 ♦ · « · ···· · • · · 9 ·· ·

• · «· ·· do těchto rostlin (nebo prostřednictvím transgenického vytvoření AFP v těchto rostlinách) (viz J. Cell, Biochem. Suppl., svazek 14e, 1990, strana 303 XP 002030248, Lee a kol, abstrakt R228) .. Rovněž byly navrženy rybí AFP pro použití v potravinářských produktech, například v mraženém jogurtu nebo smetanové zmrzlině, (patentový spis US č. 5,620,732, Pillsbury, a patentová přihláška WO 96/11586, HSC Research and Development Limited Partnership).

Až doposud ale nebylo použití AFP aplikováno v komerčním měřítku. Přihlašovatelé vynálezu jsou toho názoru, že jedním z důvodů pro neexistenci komerčního využití je to, že, ačkoliv již bylo popsáno mnoho AFP, v praxi realizace ve vlastním komerčním produktu s sebou vždy nese značné problémy.

Přihlašovatelé vynálezu zjistili, že jedním z klíčových důvodů pro tyto problémy je to, že z tohoto velkého počtu AFP, které byly odsud popsány v literatuře, může být pouze omezená sada z AFP vhodně použita pro každou aplikaci. Přihlašovatelé vynálezu rovněž zjistili, že tento výběr vhodných AFP je závislý na požadovaném použitía/nebo vlastnostech produktu, kterých má být dosaženo.

Patentová přihláška WO 90/13571 popisuje nemrznoucí peptidy vyráběné chemicky nebo rekombinačními DNA technikami. AFP mohou být výhodně použity v potravinářských produktech, jako je smetanová zmrzlina. Příklad 3B popisuje modifikované tvary ledových krystalů, když je směs vody a ledu mražena na film v kombinaci s 0,01 % hmotnostním AFP.

Patentová přihláška WO 92/22581 popisuje AFP z * rostlin, které mohou být použity pro řízení růstu ledových ·· φ« φφ φ ·φ ·Φ • · φ · φ · φ φ * · « • ♦ φφ φ φ · » φφφφ • φφ φ φ φ φφφφφφ φφφ Φ·« •φφφφφφ φ * • φ φφ φφ φφ φφ krystalů ve smetanové zmrzlině. Tento dokument rovněž popisuje způsob extrakce směsi polypeptidů z extracelulárnich prostorů rostlin prostřednictvím infiltrace listů extrakčním médiem bez narušení rostlinných buněk.

Patentová přihláška WO 94/03617 popisuje výrobu AFP z kvasinek a jejich případné použití ve smetanové zmrzlině. Patentová přihláška WO 96/11586 popisuje rybí AFP vytvořené prostřednictvím mikrobů.

Předkládaný vynález si klade za cíl vytvoření mražených potravinářských produktů majících relativně tvrdou a křehkou texturu, přičemž tato textura bude zachována při prodlouženém skladování při nízkých teplotách.

Množství článků v literatuře již navrhlo, že AFP by ]_5 mohly být potenciálně použity jako vhodné ovlivnění texturálních vlastností mražených cukrářských.produktů, jako je smetanová zmrzlina. Ovšem většina těchto dokumentů neposkytuje žádný návod jak tyto výhodné vlastnosti je vlastně možné dosáhnout v praxi.

Patentová přihláška WO 19/11586 (není před-uveřejněna) popisuje aplikaci rybích nemrznoucích peptidů v mražených zakysaných potravinářských produktech. Nejsou zde zmiňovány tvrdé a křehké produkty.

Patentová přihláška WO 96/39878 (není před-uveřejněna) popisuje aplikaci AFP ve smetanové zmrzlině prostřednictvím použití specifického zmrazovacího procesu, Vhodné AFP pro tuto aplikaci mohou být odvozeny z krve a svalové tkáně antarktických ryb, arktických ryb, žížal a hmyzů. Opět nejsou zmiňovány tvrdé a křehké produkty.

• 0 40 • · * ♦ 0 00 • 0 « • 0 0 0

00 • 0 0 0 0 0 • 0 0 0 0 •0 0 0 0 0

00000 0 000 00 • 0. · •0 · ·· 00

Překvapivě bylo nyní zjištěno, že AFP mohou byt vhodně začleněny do mražených potravinářských produktů pro dosažení požadovaných vlastností těchto produktů, pokud jsou podmínky zpracování měněny tak, že tvar krystalů splňuje specifické požadavky.

Podstata vynálezu

Ve svém prvním aspektu se tedy předkládaný vynález týká způsobu výroby mraženého potravinářského produktu zahrnujícího AFP, přičemž podmínky jsou voleny tak, že ledové

- krystaly, v produktu maj í,.stranový_a poměr větší než 1,9, výhodně od 1,9 do 3,0.

Pokud jsou potravinářské produkty mraženy, jsou ledové krystaly vytvářeny v celém produktu. Pokud jsou do potravinářských produktů určených k zmrazování začleněny AFP, může to vést na změnu vlastností ledové rekrystalizace. ·- Spojování ledových krystalů produktů obsahujících AFP. může způsobit křehkost (drobivost) produktu.

Mnoho spotřebitelů má v oblibě relativně tvrdé a křehké potravinářské produkty nebo ingredience, jako je smetanová zmrzlina a ovocná zmrzlina. Například křupavá ovocná zmrzlina může být použita jako atraktivní ingredience mražených cukrářských produktů, a rovněž tak relativně tvrdá smetanová zmrzlina je oblíbena velkou skupinou spotřebitelů.

Překvapivě bylo nyní zjištěno, že AFP nabízejí příležitost pro vytvoření mražených potravinářských produktů, které jsou na jedné straně relativně tvrdé ale zároveň křehké a na druhé straně si uchovávají zlepšené vlastnosti inhibice rekrystalizace ledu. Přihlašovatelé vynálezu, zjistili, že • ft ftft • · · * ♦ ·· • * · · • ft · »· ·· ftft · ftft ftft • · ftftft» • · · ft · « · • ftftftft ft ftftft ··· • ftft ftft .·· · ·· ftft tato velmi výhodná kombinace vlastností může být překvapivě dosažena, pokud stranový poměr ledových krystalů v produktu je nad 1,9, výhodně mezi 1,9 a 3,0.

Stranový poměr ledových krystalů je definován jako poměr délky a šířky ledových krystalů. Stranový poměr nad 1,9, výhodně v rozsahu mezi 1,9 a 3,0, odpovídá podlouhlým ledovým krystalům, které nemají zaoblený tvar. Stranový poměr krystalů může být zjišťován jakýmkoliv vhodným postupem. Výhodný postup určování stranového poměru je ilustrován v příkladech v popisu níže. Výhodně je stranový poměr v rozsahu mezi 2,0 a 2,9, zvláště výhodně v rozsahu mezi 2,1 a 2,8.

Výhodně jsou mražené produkty podle předkládaného vynálezu křehké. Výhodně je minimální tloušťka vrstvy, při které může být sledováno lomivé chování, menší než 10 mm, zvláště výhodně od 1 do 5 mm. Lomivé chování může být buď změřeno (prostřednictvím vytvoření vrstev s různými tloušťkami a určováním, při které minimální tloušťce dochází k lomivému chování) nebo vypočítáno z modulu pružnosti v tahu (Youngův modul pružnosti), jak je popsáno v příkladech v popisu níže.

V průběhu vytváření a následného zmrazování potravinářských produktů může několik parametrů ovlivnit stranový poměr ledových krystalů, které mají být vytvořeny. Příklady faktorů ovlivňujících stranový poměr jsou uvedeny níže. Přihlašovatelé vynálezu předpokládají, že je zcela v rámci schopností osoby v oboru znalé zvolit tyto, podmínky tak, že stranový poměr ledových krystalů bude spadat do požadovaného rozsahu.

*» ·· «· · ·· ·· ··· » »» ♦ · · · ··*· « ·» · « · · * * · · · · ♦·· · ··· ··· *·····* · * »· *· ·« « «« ·*

Jedním z faktorů ovlivňujících stranový poměr ledových krystalů je rychlost zmrazování produktu. Obecně řečeno vede zvyšování rychlosti zmrazování na snižování stranového poměru ledových krystalů. V této souvislosti může teplota zmrazování ovlivnit rychlost zmrazování a tudíž stranový poměr ledových krystalů. Rovněž v této souvislosti ’ jsou tedy někdy výhodné zmrazovací procesy zahrnující ztužovací krok, například, při teplotě pod -30° Fahrenheita (-34,4°C). Skladovací teplota a doba skladování mohou stejně tak ovlivnit stranový poměr, přičemž vyšší skladovací teploty a/nebo delší doby skladování mají sklon- způsobovat velké, stranové poměry.

Dalším faktorem ovlivňujícím stranový poměr ledových krystalů je pohyblivost produktu v průběhu zmrazování.

Například, pokud má být zmrazená tekutá směs ovocné zmrzliny nebo smetanové zmrzliny, povede statické zmrazování na poměrně velký stranový poměr ledových krystalů, zatímco míchání povede na nižší stranový poměr těchto krystalů.

Míchání při vyšším střihu povede dokonce na ještě nižší .

stranové poměry krystalu.

Dalším faktorem, který ovlivňuje stranový poměr ledových krystalů, je přítomnost a množství ingrediencí.

Například přítomnost ingrediencí, které mají sklon tvořit sítovou strukturu v produktu (například gumy nebo tuky), může vést na nižší stranový poměr než je stranový poměr v produktech bez těchto ingrediencí. Rovněž další ingredience mohou vést na nižší stranové poměry, například vysoké úrovně tuhých látek, například vysoké úrovně cukru, mohou vést na nízké stranové poměry.

.

·· 00 ·« 0 ·· *0 0 0 0 0 00· 0000

00 0000 0 000

0 0 0 0 · 0 0000 0 000 000 0000000 0 0

00 ·· 0 0* 00

Nakonec také povaha a množství AFP přítomných v produktu mohou vést na změny stranových poměrů. Některé AFP pravděpodobně způsobují vytváření nízkých stranových poměrů, zatímco jiné AFP pravděpodobně způsobují vyšší stranové poměry. Vhodný test pro výběr těchto AFP je popsán v příkladech v popisu níže. Změny v množství AFP mohou vést na změny ve stranových poměrech.

Podle svého druhého provedení se předkládaný vynález týká způsobu výroby mraženého potravinářského produktu θ zahrnujícího AFP, přičemž složení, podmínky zmrazování a podmínky skladování jsou voleny tak, že ledové krystaly v produktu mají stranový poměr v rozsahu od 1,9 do 3,0.

Způsob podle předkládaného vynálezu může být aplikován na jakýkoliv mražený potravinářský produkt obsahující AFP.· Příklady vhodných produktů jsou omáčky, hotová jídla a podobně. Výhodnými potravinářskými produkty jsou mražené cukrářské produkty, jako je smetanová zmrzlina a ovocná zmrzlina.

q Přihlašovatelé vynálezu zjistili, že AFP pro použití ve způsobu podle předkládaného vynálezu mohou pocházet z velkého množství různých zdrojů, jako jsou rostliny, ryby, hmyzy a mikroorganismy. Může být použito jak přírodně se vyskytujících druhů tak i druhů, které byly získány prostřednictvím genetické modifikace. Například tedy mohou být geneticky modifikovány mikroorganismy nebo rostliny pro vytvoření AFP a tyto AFP mohou být potom použity ve způsobu podle předkládaného vynálezu.

Pro vytvoření AFP může být použito například θ následující techniky genetické manipulace: Vhodná hostitelská ·· ·· • · · * · • 44 4 « • ♦ · · · · • * · · α ♦ * · · ·» ·· ·· • ♦ · • · · · ···♦ · ··♦ «4· • * « * ·· ·* buňka nebo hostitelský organismus by byl transformován genovou konstrukcí, která obsahuje požadovaný polypeptid. Kódová nukleotidové sekvence pro polypeptid může být uložena do vhodného vektoru pro expresi, obsahujícího nezbytné prvky pro transkripci a translaci, a tak, že dojde k její expresi za vhodných podmínek (například při správné orientaci a správném čtecím rámci a s vhodnou sekvencí pro cílení a expresi). Postupy požadované pro vytvoření těchto vektorů pro expresi jsou velmi dobře známé osobám v oboru znalým.

Množství různých systémů pro expresi může být využito pro expresí kódové sekvence pro tepelně stabilní polypeptid.' Tyto systémy zahrnují, ale nejsou omezeny na, bakterie, systémy kvasničných hmyzích buněk, živné systémy rostlinných buněk a rostliny, přičemž všechny tyto systémy jsou. transformovány vhodnými vektory pro expresi.

Široký výběr rostlin a rostlinných buněčných systémů může být transformován konstrukcemi nukleových kyselin pro ' požadované polypeptidy. Výhodná provedení by mohla zahrnovat, ale nejsou omezena na, kukuřici, rajčata, tabák, mrkev, jahody, řepkové semeno a cukrovou řepu.

Pro účely předkládaného vynálezu jsou AFP odvozeny z ryb (to jest jsou bud' přímo získány z ryb, nebo rybích proteinů a transgenicky vytvořeny jinými, organismy) .

Obzvláště výhodné je použití rybích proteinů typu III, zvláště výhodně HPLC 12, jak je popsáno v patentové přihlášce PCT/EP96/02936 (WO- 97/2343) stejného přihlašovatele, která není před-uveřejněna.

Pro některé přírodní zdroje mohou AFP sestávat ze směsi dvou nebo více různých AFP.

«4 4 ·· ·.

• 4 4 4 4 • 44 * 4 • 4 4 4 4 4 « 4 4 4 4 *4 44 44 • ♦ ♦ 4 · · · 4 4 *444 4 444 444 • · 4 * 44 44

Výhodně jsou vybrány ty AFP, které mají značně výrazné vlastnosti inhibice rekrystalizace ledu. Vhodný test pro určení rekrystalizačních vlastností je naznačen v příkladech v popisu níže. Výhodně zajišťují AFP podle předkládaného vynálezu velikost ledových částic při rekrystalizaci - výhodně měřeno podle postupů uvedených v příkladech - menší než 20 pm, zvláště výhodně od 5 do 15 pm. Lze předpokládat, že malá velikost ledových'krystalů kombinovaná s určitým stranovým poměrem je obzvláště výhodnápro dosažení požadovaných strukturálních vlastností.

Velmi výhodné provedení předkládaného vynálezu-se týká složení produktu, která jsou volena tak, že při výrobě produktu může být využito statických podmínek při zmrazování, zatímco je ještě dosaženo stranového poměru, který byl definován výše.

Příklady takovýchto potravinářských produktů jsou: mražené cukrářské směsi, jako jsou směsi pro smetanovou zmrzlinu a směsi pro ovocnou zmrzlinu, které jsou určeny pro skladování při teplotě okolí nebo při chladírenských teplotách. Vhodnými formami produktu jsou například: prášková směs, která je balena v pytli nebo v sáčcích. Uvedená směs je schopná vytvořit základ pro mražený potravinářský produkt, například po přidání vody a případně dalších ingrediencí a případě - po provzdušnění.

Dalším příkladem vhodné směsi by mohla být kapalná směs (případně provzdušněná) , která, pokud je to nezbytné, po přidání dalších komponentů a případném dalším provzdušnění může být mrazena.

«

• · I »· ·«<

» ♦·»· ·

Zjevnou výhodou shora zmiňovaných směsí je to, že přítomnost AFP ingredience umožňuje směsím, aby byly mrazeny za statických podmínek, například v domácím zmrazovači nebo ve zmrazovači v obchodě.

Velmi výhodně jsou tyto směsi baleny v uzavřených kontejnerech (například kartónech, pytlích, krabicích, plastových kontejnerech a podobně), Pro jednu dávku nebo porci bude velikost balení obecně od 10 do 1000 g. Pro více dávek mohou být vhodná balení o velikosti až 500 kg. Obecně se velikost balení bude pohybovat od 10 g do 5000g.

Jak je uvedeno výše, výhodnými produkty, ve kterých je použito AFP, jsou mražené cukrářské produkty, jako je ovocná zmrzlina nebo smetanová zmrzlina. Výhodné množství AFP je od 0,0001 do 0,5 % hmotnostního z hmotnosti finálního 15 ’ produktu. Pokud je použito suchých směsí nebo koncentrátů, může být koncentrace vyšší, aby se,zajistilo, že množství ve finálním mraženém produktu še bude pohybovat ve shora uvedených rozsazích.

2Q Překvapivě bylo zjištěno, že směsi podle předkládaného vynálezu mohou obsahovat velmi nízká množství AFP, zatímco stále zachovávají dobrou kvalitu.

Až doposud se obecně předpokládalo, že pro dosažení přijatelných zlepšení rekrystalizačních vlastností.jsou požadována poměrně vysoká množství AFP. Důvodem pro tato očekávání je to, že se obecně předpokládá, že AFP působí na značné podíly povrchu ledových krystalů a tudíž musí být

- přítomny v relativně velkých množstvích, například 0,01 % hmotnostního nebo více,, pro dosažení uspokojivého účinku.

4

44444 4 • · 4 • · 4 ·· 444 • 4 ··

Překvapivě bylo nyní zjištěno, že zlepšených rekrystalizačních vlastnosti mražených produktů a zvýšené teplotní tolerance může být dosaženo již tehdy, když je použito nízkých množství AFP.

Překvapivě bylo nyní zjištěno, že množství AFP může být nízké až od 0,1 do 50 ppm, přičemž jsou ještě zajištěny odpovídající rekrystalizační vlastnosti a teplotní tolerance mražených cukrářských produktů. Ačkoliv si přihlašovatelé vynálezu nepřejí být vázáni jakoukoliv teorií, může být důvodem pro tuto skutečnost to, že interakce mezi pevnými látkami v mraženém cukrářském produktu a AFP zajišťuje vynikající mechanismus pro inhibici růstu krystalů. Zvláště výhodně se množství AFP pohybuje od 1 do 40 ppm, obzvláště výhodně od 2 do 10 ppm.

Pro účely předkládaného vynálezu zahrnuje termín mražený cukrářský produkt mléko obsahující mražené'cukrářské výrobky, jako je smetanová zmrzlina, mražený jogurt, šerbet, ledové mléko a mražený pudink, ovocné zmrzliny, granity a mražené ovocné dřeně a podobně. Pro některé aplikace je použití AFP v mražených zakysaných potravinářských produktech méně výhodné.

Výhodně je množství pevných látek v mraženém cukrářském produktu (například cukr, tuk, příchutě a podobně) větší bnež 4 % hmotnostní, výhodně větší než 30 % hmotnostních, ozvláště výhodně od 40 do 70 % hmotnostních.·

Ve velmi výhodném provedení předkládaného vynálezu jsou použita tvrdá a křupavá (křehká) mražená cukrářská *

složení pro vytvoření kontrastu v textuře mraženého 30 cukrářského produktu. Výhodně takové mražené cukrářské produkty obsahují, jako diskrétní prvky v jejich struktuře, směsi obsahující AFP podle předkládaného vynálezu. Například relativně měkké jádro smetanové zmrzliny může být potaženo tenkou vrstvou směsi podle předkládaného vynálezu, čímž se zajistí relativně tvrdá, ale křehká (křupavá) vnější vrstva obklopující jádro ze smetanové zmrzliny. Dalším provedením by mohlo být začlenění směsi podle předkládaného vynálezu jako’ příměs do mražených cukrářských produktů. Třetím'provedením by mohlo být střídání vrstev smetanové zmrzliny se směsí podle předkládaného vynálezu pro vytvoření tenkých tvrdých, ale křehkých’vrstev- střídajících se-s-vrstvami smetanové zmrzliny.

Příklady provedení vynálezu

Příklad I . Mixováním byl vytvořen smetanové zmrzliny:

Ingredience sušené odstředěné mléko sacharóza maltodextrin (MD40) karubová guma mléčný tuk monoglycerid (palmitát) vanilín

AFP (typ III HPLC-12, viz WO 97/2343) kapalný premix pro výrobu % hmotnostní

0,14

0,3

0,01

0,01 nebo žádný (kontrolní) zbytek do 100 % voda ft* · · ftft ř · · · ► ftft ft • · · · · · * ft

Tato směs byla výhodně skladována při teplotě okolí, například v plastovém kontejneru.

Směsi podle příkladu I byly použity při výrobě smetanové zmrzliny prostřednictvím homogenizace při tlaku 2000 psi (přibližně 13,8 MPa) a teplotě 65°C, po které následovalo zrání přes noc při teplotě 5°C. Směs byla zmrazená s použitím zmrazovače (přístroj MF50 SSHE Technohoy osazený pevným tloukem otáčejícím se 240 otáčkami za minuu). Teplota při vytlačování byla -4,5°C, přeběh (zvětšení objemu) byl 110%. Produkt byl potom mrazen při teplotě -35°C a skladován při teplotě -80^aC.

Po dvou měsíčním skladování měla směs podle předkládaného vynálezu znatelně lepší texturu než kontrolní vzorek.

Příklad II

Byla vyrobena smetanová zmrzlina s následujícím složením:

Ingredience sušené odstředěné mléko sacharóza maltodextrin (MD40) karubová guma mléčný tuk monoglycerid (palmitát) vanilín % hmotnostní

0,14

0,3

0, 01 ·*

0,01 nebo žádný (kontrolní) * · · · • · ··«!*«

AFP (typ III HPLC-12, viz WO 97/2343) voda zbytek, do 100 %

Způsob výroby byl stejný jako je popsáno v příkladu I.

Vzorky obou produktů byly vyváženy při teplotě -18°C ve skříni Prolan s řízeným prostředím po dobu přibližně 12 hodin. Byla připravena mikroskopická sklíčka rozetřením tenké vrstvy smetanové zmrzliny ze středu tenkých skleněných destiček·. - - - .... .....

Každé sklíčko bylo přeneseno do mikroskopického bloku s řízenou teplotou (při teplotě -18°C), kde byly shromážděny obrazy ledových krystalů (kolem 400 ledových monokrystalů) a přenášeny prostřednictvím video kamery do systému pro uchovávání a analýzu obrazů.

Uložené obrazy ledových krystalů byly ručně vyznačeny prostřednictvím obtažení obvodu, což potom vyznačilo celý 20 krystal. Obrazy vyznačených krystalů byly potom měřeny s použitím softwarového vybavení pro obrazovou analýzu, které vypočítalo počet obrazových bočů nutných pro dokončené nejdelší přímky (délka), nejkratší přímky (šířka), a stranového poměru (délka/šířce).

Byl vypočítán průměrný stranový poměr pro krystaly.

Pro kontrolní vzorek byl stranový poměr 1,45.

Pro vzorek obsahující AFP byl stranový poměr 2,24.

4 ·

• 44 « ·

Příklad III

Křehkost smetanové zmrzliny podle přikladu IV byla zjišťována prostřednictvím výpočtů lomivého chování smetanové zmrzliny. Byl změřen modul pružnosti v tahu (Youngův modul pružnosti) s využitím 3-bodového ohybového testu.

Modul pružnosti v tahu byl změřen připravením pásů smetanové zmrzliny, jejich vyvážením po dobu 18 hodin ve skříni zmrazovače a přenesením do skříně s řízenou teplotou. Pásy byly uloženy na 3-bodové ohybové zařízení, jak je popsáno v Handbook of Plastics Test Methods (druhé vydání), vydavatel R.P. Brown, George Godwin Ltd, 1981'. Testování vzorků bylo prováděno bezprostředně s rychlostí deformace 50 mm/min. Ze silové deformační křivky, byl změřen počáteční sklon a ten byl použit pro výpočet modulu pružnosti v tahu podle následujícího vztahu:

modul.pružnosti v tahu (pa) = sklon . L/4 . B. W kde l = rozpětí ramena (110 mm), B = šířka vzorku, W = výška vzorku.

Obvykle bylo testováno osm vzorků pro zjištění průměrné hodnoty modulu pružnosti v tahu.

S použitím výpočtů popisovaných v Williams & Cawood, 2 5

Polymer Testing 9., 15-26 (1990) mohla být vypočítána houževnatost při lomu.

Výsledky byly následující: Pro kontrolní vzorek byla vypočítána tloušťka 966 m jako nezbytná pro dosažení křehké vrstvy, pro vzorek obsahující AFP byla křehkost (lomivé fefe · ·· fefe • · * · · · • · · · · fe · · fe fefefe*· · fefefe fefefe fefefe « · ·· · fefe fefe chování) zjištěna již při 3 mm. To zcela zjevně ukazuje na zlepšenou křehkost produktu podle předkládaného vynálezu. Oba vzorky poskytovaly relativně měkké produkty.

Příklad IV

Tento příklad popisuje metodologii pro výběr těch AFP, které ovlivňují tvorbu tvarů ledových krystalů, jak je výhodné podle předkládaného vynálezu.

Růst ledových krystalů za obvyklých okolností probíhá podél a-osy-krystalu. Pokud jsou přítomny AFPje-růst změněn. Toto selektivní ovlivňování tvaru krystalu může být vysvětleno skutečností, že AFP mají sklon se vázat k určitým částem· ledového krystalu, přičemž, když se toto děje, brání tak růstu ledového krystalu v určitých směrech. Vázání může například probíhat v hranolových rovinách (kolmých k a-ose) nebo v jehlanových rovinách (vystupujících z těchto rovin).

Přihlašovatelé vynálezu zjistili, že AFP, které '

ovlivňují vytváření stranových poměrů podle předkládaného vynálezu, mohou být nalezeny prostřednictvím výběru těch AFP, • které mají sklon se vázat na.hranolovou rovinu. Metodologií pro výběr těchto specificky se vázajících AFP může být jakákoliv vhodná metodologie. Vhodný test využívá tak zvaný experiment růstu hemisféry monokrystalu ledu, který je založen na technice popsané v Knight C.A., C.C. Cheng a A.L. DeVries, Biophys. J. 59 (1991, 409-418, Adsorption of a-helical antifreeze peptides on specific ice crystal surface planeš.

·· ·♦ * · · · ·' · ·

• · ·

• « ·» · • r » · • lil » 9 1 · · • · · ··

Dobře izolovaná 5 litrová plastová kádinka byla naplněna deionizovanou vodou a uložena do skříně s řízenou teplotou při teplotě 1°C. Potom byla pomalu zmrazováno ze shora. Po dvou dnech pokryl kádinku monokrystal ledu přibližně 4 cm silný. Krystalografická orientace tohoto monokrystalu byla určena prostřednictvím rentgenové rozkladové metody pro monokrystal. Kostky ledu, s rozměrem přibližně 2 cm, byly řezány z tohoto velkého monokrystalu tak, že jeden povrch byl paralelní s hranolovou rovinou a druhý povrch byl paralelní se základní rovinou. Byly tudíž

·. vytvářeny orientované monokrystaly .ledu. , _...... .

Bylo použito přístroje sestávajícího z mosazného chladícího prstu (průměr přibližně 1 cm), na který byl namrazen orientovaný zárodečný krystal. Zárodečný krystal byl 15 nejprve vybrán tak, aby mohl být nasazen kolem chladícího prstu. Potom bylo cirkulováno skrz chladící'prst chladící' médium a zárodečný krystal se velmi rychle k chladícímu prstu přimrazil. »

Chladící prst se zárodečným krystalem byl potom ponořen do izolované 100 mililitrové kádinky obsahující roztok testovaného materiálu. Počáteční teplotou roztoku byla teplota místnosti (-18°C) a jediné chlazení bylo zajišťováno chladícím prstem. Zpočátku se zárodečný krystal částečně roztavil, ale potom narostl do hemisféry monokrystalu. Po několika hodinách (6 až 8) byla vytvořena hemisféra s průměrem 5 až 7 cm. ' .

Tento experiment byl proveden s různými roztoky AFP.

I

Použité roztoky AFP přitom měly koncentraci AFP 10*' mg/ml.

·* ·· • · · « ¹ · ·· ·· ·· • · · · • · · · *·· ··· • · ·· ··

Hemisféra byla potom sejmuta z chladícího prstu a přesunuta do skříně s řízenou teplotou při teplotě -15°C. Povrch byl oškrábán a hemisféra byla ponechána ve skříni alespoň přes noc (16 hodin nebo více). V celé komoře byl cirkulován vzduch prostřednictvím integrálního větráku. V průběhu této doby docházelo k odpařování povrchových vrstev ledu. Povrch ledové hemisféry se tudíž stával takovým, že měl hladký zrcadlový povrch. Ovšem pro hemisféru obsahující AFP byly na povrchu patrné drsné skvrny, tyto skvrny odpovídaly skvrnám, kde AFP byly vázány na povrch hemisféry. Velké . molekuly AFP bránily odpařování. ledových molekul a. tak se,.

vytvořila drsná síť molekul AFP na povrchu v oblastech povrchu, kde docházelo k preferenčnímu vázání k ledu. Protože orientace hemisféry je známá a úhlová vzdálenost mezi těmito drsnými skvrnami a směry základní a hranolové roviny může být změřena prostřednictvím optického- goniometru, může být určena povaha vazební roviny.

Uvedený test může být použit pro výběr těch AFP, které mají sklon se vázat k primární nebo sekundární hranolové rovině. Například AFP typu I z platýse Wínter nebo z aljašského platýse mají sklon se vázat na vazné body (202 l)¹, přičemž AFP z antarktické tresky mají sklon se vázat k vazným bodům (10-1 O)^{3 neb0 5}, zatímco AFP typu II z antarktické slimule mají sklon se vázat k vazným bodům (10—

j. Q \ 2 nebo 3

Mělo by být zcela v rozsahu znalostí a schopností osoby v oboru znalé, aby použila výše popsaný test pro zjištění těch AFP, které mají sklon způsobovat, vytváření velkých stranových poměrů ledových krystalů. Pro testování jejich vhodnosti v mražených produktech podle předkládaného * 4 4

94

4 » 9 4 • 4 4 9 » ·«*·Ι · ♦ ·

·« ·· ► ·· · » · · 4 ·♦· ♦·· vynálezu může být vyroben vlastni produkt a může být určen stranový poměr krystalů v tomto produktu.

Příklad V 5

Test pro zjišťování velikosti ledových krystalů po rekrystalizací.

Vzorek roztoku obsahujícího AFP ve vodě je nastaven na úroveň sacharózy 30 % hmotnostních (Pokud je počáteční množství sacharózy ve vzorku větší než 30 % hmotnostních, je - to-provedeno -zředěním,. pokud je .počáteční množství sacharózy ve vzorku menší než 30 % hmotnostních, je to provedeno přidáním sacharózy na požadovanou úroveň·.)

Obecně tento test může být aplikován na jakoukoliv 15- vhodnou směs zahrnující AFP a vodu·. Obecně není množství AFP v těchto testovaných směsích nějak zvlášť kritické a může být například od 0,0001 .do 0,5 % hmotnostního, výhodně od 0,0005 do 0,1 % hmotnostního, zvláště výhodně od 0,001 do 0,05 % hmotnostního, například 0,01 % hmotnostního.

Kapička vzorku o velikosti 3 nL je položena na krycí sklíčko o průměru 22 mm.' Potom je na vršek položeno krycí sklíčko o průměru 16 mm a na tento vzorek je poloze 200 gramové závaží pro¹ zajištění jednotné tloušťky vzorku. Hrany krycího sklíčka jsou utěsněny bezbarvým lakem na nehty.

Sklíčko je uloženo na blok mikroskopu Linkham THM 600 s řízenou teplotou. Blok je potom rychle ochlazen (50°C za minutu) na teplotu -40°C pro vytvoření velké populace malých krystalů. Teplota bloku, je potom rychle zvýšena (50°C za minutu) na -6°C a je udržována na této teplotě.

tl · ·*·* · · · · · » t • · ·· · · · · · « · • · * · · * · tm · til ·*( ······ * I ·· ·· ·· · ·· ··

Ledová fáze je sledována pří teplotě -6°C s použitím mikroskopu Leica Aristoplan. Polarizované světelné podmínky ve spojení s lambda destičkou byly použity pro zvýšení kontrastu ledových krystalů.· Stav ledové fáze (velikost ledových krystalů) je zaznamenán prostřednictvím 35 mm míkrofotografie při T=0 a T=1 hodina. Průměrná velikost částic (vizuální určení, číselný průměr) pod 20 pm, zvláště výhodně mezi 5 a 15 pm indikuje výhodné AFP pro použití v produktech podle předkládaného vynálezu.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY φ · φ φ • φ · • φ φ φ φ φφφφ • φ φφ ♦ · φ • φ φ φ φφ φφ φφ

1. Způsob výroby mraženého potravinářského produktu zahrnujícího nemrznoucí polypeptidy, vyznačuj ící se t í m, , že podmínky se zvolí tak, že ledové krystaly v produktu mají stranový poměr, definovaný jako délka dělená šířkou, věttší než 1,9.
2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že stranový poměr je v rozmezí od 1,9 do 3,0.
3. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že podmínky pro ovlivnění- stranového poměru se zvolí ze skupiny sestávající z rychlosti zmrazování, pohyblivosti produktu v průběhu zmrazování, .skladovací teploty a skladovací doby, složení produktu a povahy a množství nemrznoucích polypeptidů a kombinací těchto podmínek.
4. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že mraženým potravinářským produktem je mražený cukrářský produkt.

20
5, Mražený cukrářský produkt zahrnující od 0,0001 do 0,5 % hmotnostního nemrznoucích polypeptidů, vyznačuj ící se t í m , že má stranový poměr ledových krystalů věttší než 1,9.
6. Mražený cukrářský produkt podle nároku 5, vyznačující se tím, že stranový poměr je v rozmezí od 1,9 do 3,0.

·· ·· · • · · φ · φ φ • * ·» ΦΦΦΦ • · · φφφ φ ΦΦΦΦ φ • · · · · φ

0* *· ΦΦ ·

Φ· ΦΦ • · « « · · Φ φφφ ·*« • «

ΦΦ ··
7. · Mražený cukrářský produkt podle nároku 5, vyznačující se tím, že nemrznoucí polypeptidy jsou přednostně vázány k primárním a sekundárním hranolovým rovinám ledových krystalů.
8. Mražený cukrářský produkt mající kontrast textury, vyznačující se tím, že zahrnuje diskrétní prvky cukrářského produktu definovaného v nároku 5.
9. Mražený cukrářský produkt podle nároku
10 8, vyznačující se tím, že zahrnuje tenké vrstvy smetanové zmrzliny střídající se s tenkými vrstvami ovocné zmrzliny, přičemž vrstvy ovocné zmrzliny zahrnují od 0,0001 do 0,5 % hmotnostního nemrznoucích polypeptidů a mají. stranový poměr ledových krystalů od 1,9 do 3,0.

1 8

10. Zmrzlinová směs pro použití při výrobě mraženého cukrářského produktu definovaného v nároku 5.