ES2268733T3 - Alimentos congelados con peptidos anticongelacion. - Google Patents

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Abstract

SE PRESENTA UN PROCESO PARA LA PRODUCCION DE UN PRODUCTO ALIMENTICIO CONGELADO QUE COMPRENDE AFP, EN EL QUE SE ESCOGEN LAS CONDICIONES DE FORMA QUE LOS CRISTALES DE HIELO EN EL PRODUCTO TENGA UNA RELACION DE ASPECTO DE ENTRE 1,9 Y 3.

Description

Alimentos congelados con péptidos anticongelación.
Campo técnico de la invención
La presente invención se refiere a un procedimiento para la preparación de un producto alimentario que contiene PAC y a productos alimentarios que contienen PAC.
Antecedentes del la invención
Se han sugerido los péptidos anticongelación (PAC) para mejorar la tolerancia de la congelación de los productos alimenticios.
Las proteínas anticongelación se han descrito en la literatura, véase, por ejemplo, Marilyn Griffith y K. Vanya Ewart en Biotechnology Advances, Vol. 13, Nº 3, pág. 375-402, 1995. En general, las proteínas anticongelación poseen uno o más de las siguientes proteínas: histéresis térmica, inhibición de la recristalización del hielo, control de la forma de los cristales de hielo e interacción con los nucleadores del hielo.
La histéresis térmica es la propiedad mejor conocida de los PAC y la propiedad normalmente se usa para analizar la presencia de PAC. LA histéresis térmica es el resultado de una disminución de la temperatura de congelación aparente de una solución que contiene un PAC activo en histéresis térmica sin que afecte a la temperatura de fusión. La identificación de las fuentes de PAC mediante análisis de histéresis térmica está ampliamente descrita en la literatura, véase, por ejemplo, John G Duman en Cryobiology 30, 322-328 (1993).
La inhibición de la recristalización del hielo es otra propiedad de los PAC. Esta actividad también se denomina supresión del crecimiento de los cristales de hielo. Esta propiedad se puede analizar mediante comparación en un punto de tiempo determinado el tamaño del cristal de hielo de los cristales en presencia de PAC y en ausencia de PAC. La aplicación de esté procedimiento en los análisis de PAC de pescado se describe en la patente de EE.UU. 5.118.792 (DNA Plant Technology Corporation).
Una tercera propiedad de los PAC es su capacidad para influir sobre la forma de los cristales de hielo. Esta propiedad proviene de la unión selectiva de los PAC a ciertas caras del cristal de hielo y, por tanto, limita el crecimiento del cristal en ciertas direcciones. La presencia de cristales de hielo con forma bipiramidal hexagonal se considera indicativa de la presencia de PAC. Este procedimiento se describe, por ejemplo, para analizar la actividad de PAC extracelular en el centeno de invierno en el documento WO 92/22581 (Universidad de Waterloo).
Una cuarta propiedad de los PAC es su capacidad para inhibir la actividad de las sustancias de nucleación de hielo. Esta interacción entre los PAC y un nucleador de hielo puede, por ejemplo, tener como resultado un incremento de la histéresis térmica. Esta propiedad se analiza, por ejemplo, en el documento WO 96/40973 (Universidad de Notre Dame du Lac).
Se han sugerido PAC para mejorar la tolerancia a la congelación de los productos. En este contexto se han sugerido muchas aplicaciones.
Por ejemplo, se han sugerido PAC para potenciar la crioconservación de los materiales biológicos (documentos WO 91/12718, Agouron Pharmaceuticals, WO 91/10361, The Regents of the University of California). Asimismo, se ha sugerido los PAC para impedir la fuga desde los liposomas, p. ej. En productos cosméticos o farmacéuticos (véase el documento WO 96/20695). Otra posible aplicación es incrementar la tolerancia a la congelación de las plantas mediante la inclusión en ellas (o la producción en ellas por vía transgenética) de un PAC (Véase J. Cell. Biochem. Suppl. Vol. 14e, 1990, página 303 XP002030248, Lee y col., resumen R228), Asimismo se han sugerido PAC de pescado para usar en productos alimentarios por ejemplo, en yogures o helados congelados (documento de EE.UU. 5.620.732 Pillsbury y documento WO 96/11586, HSC Research and development limited partnership).
Sin embargo, hasta ahora el uso de PAC no se ha aplicado a escala comercial Los solicitantes son de la opinión de que uno de los motivos de la ausencia de la implementación comercial es que, aunque se han descrito muchos PAC, en la práctica la implementación de los productos comerciales reales se encuentra con serios problemas.
Los solicitantes han encontrado que uno de los motivos clave de estos problemas es que del gran número de PAC que se han descrito en la literatura, sólo un conjunto limitado de PAC puede aplicarse de forma adecuada a cada aplicación; asimismo los solicitantes han encontrado que esta selección de PAC adecuados depende de la aplicación deseada y/o de las características de producto que se desea conseguir.
El documento WO 90/13571 describe péptidos anticongelación producidos químicamente o mediante técnicas de ADN recombinante. Las PAC pueden usarse de forma adecuada en productos alimentarios tales como helados. El ejemplo 3B muestra formas de cristales de hielo modificadas si se congela una mezcla de agua-hielo en una película en combinación con 0,01% en peso de PAC.
El documento WO 92/22581 describe PAC procedentes de plantas. Este documento también describe un procedimiento para extraer una composición polipeptídica de espacios extracelulares de plantas mediante la infiltración en las hojas de un medio de extracción sin romper las células vegetales.
El documento WO 92/03617 describe la producción de PAC de levaduras y su posible uso en helados. El documento WO 92/11586 describe PAC de pescado producidos por microbios.
La presente invención está dirigida a proporcionar productos alimentarios congelados con una textura relativamente dura y frágil, manteniéndose dicha textura después de un almacenamiento prolongado a temperaturas bajas.
En una serie de referencias bibliográficas se han sugerido que las PAC pueden usarse potencialmente para influir de forma favorable sobre las propiedades de la textura de productos de confitería congelados tales como helados. No obstante, la mayoría de estos documentos no proporcionan instrucciones sobre cómo estas propiedades favorables pueden lograrse en realidad en la práctica.
El documento WO 96/11586 (no publicado previamente) enseña la aplicación de polipéptidos anticongelación de pescado en productos alimentarios fermentados congelados. No se mencionan los productos duros y frágiles.
El documento WO 96/39878 (no publicado previamente) describe la aplicación de PAC en helados mediante el uso de un procedimiento de congelación específico. Los PAC adecuados para esta aplicación pueden derivar de tejido sanguíneo y muscular de peces del antártico, peces del ártico, gusanos e insectos. De nuevo no se mencionan productos duros y frágiles.
Sorprendentemente, se ha encontrado que los PAC pueden incorporarse de forma conveniente en productos alimentarios congelados para dar como resultado las propiedades de producto deseadas siempre que el producto y las condiciones de procesamiento se varíen de modo que la forma de los cristales del hielo satisfaga los requerimientos específicos.
En consecuencia, en un primer aspecto, la invención se refiere a un procedimiento para la producción de un producto alimentario congelado que comprende PAC, en el que las condiciones se escogen de un modo tal que los cristales de hielo en el producto posean una relación entre dimensiones de más de 1,9, preferentemente de 1,9 a
3,0.
Si los productos alimentarios se congelan, se forman cristales de hielo por todo el producto. Por lo general, si se incluyen PAC en los productos alimentarios que se van a congelar se puede llegar a un cambio favorable en las propiedades de recristalización del hielo. La agregación de los cristales de hielo de los productos que contienen PAC puede dar lugar a la fragilidad del producto.
Muchos consumidores están a favor de productos alimentarios congelados, o ingredientes de los mismos, relativamente duros y frágiles, tales como helados o sorbetes. Por ejemplo, sorbete crujiente se puede usar como ingrediente atractivo en productos de confitería congelados, asimismo a un gran grupo de consumidores les gustan los helados relativamente duros.
Sorprendentemente hemos encontrado que las PAC ofrecen la oportunidad de formular productos alimenticios congelados que por un lado son relativamente duros y frágiles y por otro poseen propiedades mejoradas de inhibición de la recristalización del hielo. Los solicitantes han encontrado que, sorprendentemente, esta ventajosa combinación de propiedades puede lograrse sin la relación entre dimensiones de los cristales de hielo en el producto está por encima de 1,9, preferentemente entre 1,9 y 3.
La relación entre dimensiones de los cristales de hielo se define como la relación entre la longitud y la anchura de los cristales de hielo. Una relación entre dimensiones de por encima, preferentemente entre 1,9 y 3, corresponde a cristales de hielo alongados, que no tienen forma redonda. La relación entre dimensiones de los cristales se puede determinar a través de cualquier procedimiento adecuado. Un procedimiento preferido se ilustra en los ejemplos. Preferentemente, la relación se encuentra entre 2,0 y 2,9, más preferentemente entre 2,1 y 2,8.
Preferentemente, el producto congelado de la invención es frágil. Preferentemente el grosor mínimo de la capa al que se puede observar comportamiento a fractura es inferior a 10 mm, más preferentemente de 1 a 5 mm. El comportamiento a fractura se puede medir mediante la preparación de capas de grosores variables y la determinación de a qué grosor mínimo se produce el comportamiento a fractura o se puede calcular a partir del módulo de Young como se describe en los ejemplos.
Durante la formulación y posterior congelación de productos alimentarios, varios parámetros pueden influir sobre la relación entre dimensiones de los cristales de hielo que se van a formar. Más adelante se proporcionan ejemplos de factores que influyen sobre la relación entre dimensiones. Los solicitantes piensan que cabe dentro de la capacidad de la persona experta escoger las condiciones en las que la relación entre dimensiones de los cristales de hielo entra dentro del intervalo deseado.
\newpage
Un factor que influye sobre la relación entre dimensiones de los cristales de hielo es la velocidad de congelación del producto. En general, un incremento del la velocidad de congelación conduce a una disminución de la relación entre dimensiones para los cristales de hielo. En este contexto, la temperatura de congelación puede influir sobre la velocidad de congelación y, por tanto, sobre la relación entre dimensiones de los cristales de hielo. En este contexto, en ocasiones se prefieren procedimientos de congelación que incluyan una etapa de endurecimiento, por ejemplo a una temperatura inferior a -34,4ºC. La temperatura de almacenamiento y el tiempo de almacenamiento pueden influir igualmente sobre la relación entre dimensiones, donde temperaturas de almacenamiento mayores y/o tiempos de almacenamiento más prolongados tienden a favorecer la formación de relaciones entre dimensiones
altas.
Otro factor que influye sobre la relación entre dimensiones de los cristales de hielo es la movilidad del producto durante la congelación. Por ejemplo, si una mezcla de agua helada líquida o de helados se va a congelar, la congelación estable conducirá a una relación entre dimensiones más o menos alta para los cristales de hielo, mientras que la agitación conduce a una relación entre dimensiones más pequeña. El mezclado con alta cizalladura conducirá a relaciones entre dimensiones todavía menores.
Otro factor que influye sobre la relación entre dimensiones de los cristales de hielo es la presencia y las cantidades de los ingredientes. Por ejemplo, la presencia de ingredientes que tienen a formar una estructura de red en el producto (p. ej., gomas o grasas) puede conducir a una relación entre dimensiones menor que en los productos sin estos ingredientes. Asimismo, otros ingredientes pueden conducir a reducir la relación entre dimensiones, por ejemplo niveles elevados de sólidos, p. ej. niveles elevados de azúcar pueden producir relaciones entre dimensiones
menores.
Por último, la naturaleza y cantidad de los PAC presentes puede producir un cambio en las relaciones entre dimensiones. Algunos PAC parecen favorecer la formación de relaciones entre dimensiones bajas, mientras que otros PAC parecen inducir relaciones entre dimensiones superiores. Un análisis adecuado para seleccionar estos PAC se describen en los ejemplos. La variación en la cantidad de PAC también puede conducir a un cambio en la relación entre dimensiones.
De acuerdo con una segunda forma de realización, la invención se refiere a un procedimiento para la producción de un producto alimentario congelado, que comprende PAC, donde las condiciones de formulación, congelación y almacenamiento se escogen de forma que los cristales de hielo en el producto poseen una relación entre dimensiones de 1,9 a 3.
El procedimiento de la invención se puede aplicar a cualquier producto alimentario congelado que contenga PAC. Ejemplos de productos adecuados son salsas, comidas, etc. Los productos alimentarios preferidos son productos de confitería congelados tales como helados y agua heladas.
Los solicitantes han encontrado que los PAC para usar en el procedimiento de la invención pueden proceder de una variedad de fuentes tales como plantas, peces, insectos y microorganismos. Se pueden usar especies tanto naturales como especies que se hayan obtenido mediante modificación genética. Por ejemplo, los microorganismos o las plantas pueden modificarse genéticamente para que expresen PAC y los PAC pueden usarse posteriormente de acuerdo con la presente invención.
Se pueden usar técnicas de manipulación genética para producir PAC del siguiente modo: Un organismo o célula huésped adecuado se transformaría mediante un constructo génico que contenga el polipéptido deseado. La secuencia nucleotídica que codifica el polipéptido se puede insertar en un vector de expresión adecuado que codifica los elementos necesarios para la transcripción y traducción de tal modo que se expresarán en las condiciones adecuadas (p- ej., en la orientación adecuada y el marco de lectura correcto y con la dirección y secuencias de expresión adecuadas). Los procedimientos requeridos para construir estos vectores de expresión son bien conocidos para los expertos en la técnica.
Se puede utilizar una serie de sistemas de expresión para expresar la secuencia codificadora del polipéptido. Estos incluyen, entre otros, bacterias, sistemas de células de insectos en levaduras, sistemas de cultivos de células vegetales y plantas, todos transformados con los vectores de expresión adecuados.
Una amplia variedad de plantas y sistemas de células vegetales se pueden transformar con los constructos de ácido nucleico de los polipéptidos deseados. Las formas de realización preferidas incluirían, entre otras, maíz, tomate, tabaco, zanahorias, fresas, semilla de colza y remolacha azucarera.
Para los fines de la invención, los PAC preferidos derivan de pescado (es decir se obtienen directamente del pescado o las proteínas de pescado son producidas transgenéticamente por otros organismos). Especialmente preferido es el uso de proteínas de pescado del tipo III, más preferidos HPLC 12 como se describe en nuestro caso no publicado previamente PCT/EP96/02936 (documento WO 97/2343).
Para algunas fuentes naturales, los PAC pueden consistir en una mezcla de dos o más PAC diferentes.
\newpage
Preferentemente, dichos PAC se escogen de modo que osean propiedades de inhibición de la recristalización del hielo significativas. Preferentemente, los PAC de acuerdo con la invención proporcionan un tamaño de partícula de hielo tras la recristalización, preferentemente medida de acuerdo con los ejemplos, de menos de 20 \mum, más preferido de 5 a 15 \mum. Se cree que el pequeño tamaño de los cristales de hielo combinado con la relación entre dimensiones específica es especialmente ventajosa para obtener las características estructurales deseables.
Una forma de realización muy ventajosa de la invención se refiere a formulaciones del producto que se escogen de modo que en la preparación del producto se puedan usar condiciones de congelación quiescentes, mientras que se sigue obteniendo la relación entre dimensiones como se ha definido anteriormente.
Ejemplos de tales productos alimentarios son: mezclas de confitería congelada tales como mezclas de helados y mezclas de sorbetes destinadas a almacenar a temperatura ambiente o de refrigeración. Las formas del producto adecuadas son, por ejemplo,: una mezcla en polvo que se empaqueta, por ejemplo, en una bolsa o en sellos. Siendo dicha mezcla capaz de formar la base del producto alimentario congelado, por ejemplo tras la adición de agua y, opcionalmente, otros ingredientes y aireación, opcional.
Otro ejemplo de una mezcla adecuada podría ser una mezcla adecuada podría ser una mezcla de líquidos (opcionalmente aireada) que, si es necesario tras la adición de otros componentes y posterior aireación opcional, se pueden congelar.
La clara ventaja de las mezclas mencionadas anteriormente es que la presencia del ingrediente PAC permite congelar las mezclas en condiciones de quiescencia, por ejemplo en un congelador de una tienda o de casa.
Muy convenientemente, estas mezclas se envasan en contenedores cerrados (por ejemplo cartones, bolsas, cajas, contenedores de plástico etc.). Para las porciones únicas, el tamaño del envase será, en general, de 10 a 1000 g. Para las porciones múltiples, pueden ser adecuados tamaños de envase de hasta 500 kg. En general, el tamaño del envase será de 10 g a 5000 g.
Como se ha indicado anteriormente, los productos preferidos en los que se usan los PAC son productos de confitería congelados tales como helados o sorbetes. Preferentemente, el nivel de PAC es de 0,0001 a 0,5% en peso sobre la base del producto final. Si se usan mezclas secas o concentrados, la concentración puede ser superior con el fin de asegurar que el nivel del producto congelado final se encuentra dentro de los intervalos anteriores.
Sorprendentemente, se ha encontrado que las composiciones de la invención pueden contener cantidades muy bajas de PAC y seguir siendo de buena calidad.
Hasta ahora, la creencia general ha sido que se requieren niveles más o menos altos de PAC para obtener una mejora razonable de las propiedades de recristalización. La razón de esto es que normalmente se cree que los PAC actúan sobre partes significativas de la superficie de los cristales de hielo y, por tanto, necesitan estar presentes en niveles más o menos altos, por ejemplo 0,01% en peso o más para conseguir un efecto razonable.
Sorprendentemente se ha encontrado que el nivel de PAC puede ser tan bajo como de 0,1 a 50 ppm y seguir proporcionando propiedades de recristalización adecuadas y tolerancia a la temperatura en productos de confitería congelados. Aunque sin duda alguna los solicitantes no desean quedarse anclados a ninguna teoría, la razón de ello puede ser que la interacción entre los sólidos de la confitería congelada y los PAC proporciona un mecanismo excelente para inhibir el crecimiento de los cristales. Más convenientemente, el nivel de PAC en de 1 a 40 ppm, especialmente preferidos son los niveles de 2 a 10 ppm.
Para el propósito de la invención, el término producto de confitería congelado incluye leche que contiene conservas congeladas tales como helados, yogur congelado, polo, sorbete, leche helada y natillas heladas, sorbetes, granizados y purés de frutas congelados. Para algunas aplicaciones, el uso de PAC en productos alimentarios fermentados congelados es menos preferido.
Preferentemente, el nivel de sólidos en la conserva congelada (p. ej., azúcar, grasas, aromatizantes etc.) es más del 4% en peso, preferentemente más del 30%, más preferentemente del 40 al 70% en peso.
En una forma de realización preferida de la invención, las formulaciones de confitería congeladas duras y crujientes se usan para crear contraste de textura en conservas de hielo. Preferentemente, tales conservas de hielo contienen elementos diferenciados en su estructura del PAC que contienen la composición de acuerdo con la invención. Por ejemplo, un núcleo de helado relativamente blando puede recubrirse con una capa fina de la composición de la invención, por lo que proporciona una capa crujiente y relativamente dura alrededor del núcleo de helado. Otra forma de realización podría ser la incorporación de la formulación de la invención como inclusiones en las conservas de hielo. Una tercera forma de realización sería la alternancia de capas de helado con la formulación de la invención para crear capas finas crujientes alternando con las capas de helado.
Ejemplo I
Se hizo una pre-mezcla para preparar helado mezclando:
Ingrediente % en peso
Leche desnatada en polvo 10,00
Sacarosa 13,00
Maltodextrina (MD40) 4,00
Goma garrofin 0,14
Aceite de mantequilla 8,00
Monoglicérido (palmitato) 0,30
Vainillina 0,01
PAC (tipo III, HPLC-12, véase el documento 97/2343) 0,01 o nada (control)
Agua resto
Esta mezcla se puede almacenar convenientemente a temperatura ambiente, por ejemplo en un envase de plástico.
Las mezclas se pueden usar en la preparación de un helado mediante homogeneización a 13780 kPa y 65ºC seguido por envejecimiento durante la noche a 5ºC. La mezcla se congeló usando un congelador (MF50 SSHE Technology equipado con una batidora sólido rotando a 240 ppm). La temperatura de extrusión fue de -4,5ºC, el exceso fue de 110%. A continuación, el producto se congela a -35ºC y se almacena a -80ºC.
Tras dos meses de almacenamiento, la composición según la invención poseía una textura marcadamente mejor que la muestra control.
Ejemplo II
Se preparó un helado de la siguiente formulación:
Ingrediente % en peso
Leche desnatada en polvo 10,00
Sacarosa 13,00
Maltodextrina (MD40) 4,00
Goma garrofín 0,14
Aceite de mantequilla 8,00
Monoglicérido (palmitato) 0,30
Vainillina 0,01
PAC (tipo III, HPLC-12, véase el documento 97/2343) 0,01 o nada (control)
agua resto
El procedimiento de preparación fue como en el ejemplo I.
Las muestras de ambos productos se equilibraron a -18ºC en una cámara ambiental Prolan durante aproximadamente 12 horas. Se prepararon láminas microscópicas extendiendo una capa fina de helado desde el centro de las placas de vidrio fino.
Cada lámina se transfirió a una etapa microscópica controlada por temperatura (a -18ºC) donde se recogieron imágenes de cristales de hielo (alrededor de 400 cristales de hielo individuales) y se proporcionó a través de una cámara de vídeo a un almacén de imágenes y un sistema de análisis.
Las imágenes de los cristales de hielo almacenados se destacaron manualmente mediante dibujos alrededor de su perímetro, que a su vez destaca todo el cristal. Las imágenes de los cristales destacados se midieron a continuación usando el software de análisis de imagen que cuenta el número de píxeles requeridos para completar la línea recta más larga (longitud), la línea recta más corta (anchura), la relación entre dimensiones (longitud/anchura).
Se calculó la relación entre dimensiones media para los cristales.
Para la muestra control la relación entre dimensiones fue 1,45.
Para la muestra que contenía PAC la relación entre dimensiones fue 2,24.
Ejemplo III
Se determinó la fragilidad del helado del ejemplo II mediante cálculos del comportamiento a fractura del helado. Usando una prueba de inclinación de 3 puntos se midió el módulo de Young.
El módulo de Young se midió mediante la preparación de tiras de helados, equilibrándolas durante 18 horas en un congelador y transfiriéndolas a una cámara de temperatura. Las tiras se colocaron en un banco de flexión de 3 puntos como se describe en Handbook of Plastics Test Methods (2ª edición), ed. R. P. Brown, George Godwin Ltd, 1981. Se realizaron análisis de las muestras inmediatamente a una velocidad de deformación de 50 mm/min. A partir de la curva fuerza-deformación, se midió la pendiente inicial y se usó para calcular el módulo de Young de acuerdo con la ecuación siguiente:
Módulo de Young (Pa) = \frac{Pendiente \cdot L}{4 \cdot B \cdot W}
donde L= distancia entre anclajes (110 mm), B= anchura de la muestra, W= altura de la muestra. Normalmente se analizaron ocho muestras para dar un valor medio del módulo de Young.
Usando los cálculos descritos por Williams & Cawood en Polymer Testing 9 15-26 (1990) se puede los tenacida a la fractura.
Los resultados fueron los siguientes: para la muestra control se calculó un grosor de 966 metros como necesario para obtener una capa frágil. Para la muestra que contiene PAC ya se encontró la fragilidad (comportamiento a fractura) a un grosor de 3 mm. Esto muestra claramente la fragilidad mejorada de los productos de la invención. Ambas muestras dieron productos relativamente blandos.
Ejemplo IV
Este ejemplo describe una metodología para seleccionar los PAC que favorecen la formación de formas de cristales de hielo como se prefieren en la invención.
El crecimiento de los cristales de hielo en condiciones normales se produce a lo largo del eje a del cristal. So hay PAC, el crecimiento cambia, Esta influencia selectiva de la forma del cristal se puede explicar por el hecho de que los PAC tienden a unirse a ciertas partes del cristal de hielo y, al hacer esto, inhiben el crecimiento de los cristales de hielo en ciertas direcciones. La unión puede tener lugar, por ejemplo, en los planos prisma (perpendicular al eje a) o en los planos piramidales (que se proyectan hacia fuera de los planos).
Los solicitantes han encontrado que los PAC que favorecen la formación de relaciones entre dimensiones de acuerdo con la presente invención pueden, por ejemplo, encontrase mediante la selección de los PAC que tienden a unirse al plano de prisma. La metodología para seleccionar estos PAC de unión específica puede ser cualquier metodología adecuada. Un análogos adecuado usa el experimento de crecimiento demonizado "Hemisferio de cristales de hielo SINGLE" sobre la case de la técnica descrita en Knight C.A., C.C. Cheng y A.L. DeVries, Biophys. J. 59 (1991) 409-418, Adsorption of \alpha-helical antifreeze peptides on specific ice cristal surface planes.
Un vaso de precipitados de plástico 51 bien aislado se llenó con agua desionizada y se colocó en una cámara controlado por temperatura a -1ºC. A continuación se dejó congelar lentamente desde la parte superior. Tras dos días un único cristal de hielo de aproximadamente 4 cm de espesor cubrió el vaso de precipitados. La orientación cristalográfica de este cristal se determinó usando métodos de difracción de rayos X de cristal único. Del único cristal grande se cortaron cubos de hielo de una dimensión de aproximadamente 2 cm, de forma que una superficie era paralela al plano del prisma y otra era paralela al plano basal. Por tanto, se produjeron únicos cristales de hielo orientados.
Se usó un aparato compuesto por un tubo extensible frío de latón (diámetro de aproximadamente 1 cm) sobre el cual se congeló un cristal de semilla orientado. La semilla se ahuecó primero de forma que el cristal de la semilla se ajustara a su alrededor. A continuación se indujo la circulación de refrigerante a través del tubo extensible y la semilla se congeló rápidamente.
El tubo extensible, con el cristal semilla, se sumergió en un vaso de precipitados aislada de 100 ml que contiene una solución del material en investigación. La temperatura inicial de la solución fue la temperatura ambiente (-18ºC) y el único enfriamiento lo proporcionó el tubo extensible frío. Inicialmente, el cristal de la semilla se fundió parcialmente, aunque a continuación creció en un hemisferio de cristal único. Tras varias horas (6-8) se formó un hemisferio con un diámetro de 5-7 cm.
El experimento se llevó a cabo con varias soluciones de PAC. Las soluciones de PAC usadas tenían una concentración de PAC de 10^{-3} mg/ml.
A continuación se retiró el hemisferio del tubo extensible frío y se trasladó a una cámara controlada por temperatura a -15ºC. La superficie se raspó y se dejó en la cámara al menos durante la noche (16 horas o más). Se hizo circular aire a través de la cámara por medio de un ventilador integral. Durante este tiempo se produjo la evaporación de las capas superficiales del hielo. Por tanto, en la superficie del hemisferio de hielo se produjo una superficie especular suave. Sin embargo, para un hemisferio que contiene PAC se observan parches ásperos en la superficie. Estos corresponden a los parches donde los PAC se han unido a la superficie del hemisferio. Las moléculas grandes de PAC impiden la evaporación de las moléculas de hielo y, por tanto, se crea una alfombra áspera de moléculas de PAC en la superficie en las superficies donde se produce unión preferencial al hielo. Dado que se conoce la orientación del hemisferio, y la distancia angular entre estos parches ásperos y las direcciones basal y del prisma se pueden medir por medio de un goniómetro óptico, la naturaleza del plano de unión se puede determinar fácilmente.
Este análisis se puede usar para seleccionar los PAC que tienen a unirse a los planos de prisma primarios o secundarios. Por ejemplo, los PAC de tipo I de solla roja o de solla de Alaska tiende a unirse al sitio de unión (2 0- 2 1)^{1}, mientras que los AFGP del bacalao del antártico tienden a unirse al sitio de unión (1 0- 1 0)^{3\ ó\ 5}, y los PAC de tipo III de la faneca del antártico tienden a unirse al sitio de unión (1 0- 1 0)^{2\ ó\ 3}.
El uso del análisis anterior para determinar los PAC que tienden a favorecer la formación de relaciones entre dimensiones altas en los cristales de hielo está bien dentro de la capacidad de la persona experta. Para analizar su idoneidad en productos congelados de la invención, se puede hacer el producto real y se puede determinar la relación entre dimensiones de los cristales en el producto.
Ejemplo V Análisis para determinar el tamaño del cristal de hielo tras recristalización
Una muestra de una solución que contiene PAC en agua se ajusta a un nivel de sacarosa del 30% en peso (si el nivel de partida de la muestras es más del 30% esto se realizó mediante dilución, so el nivel de partida fue menor, se añadió sacarosa hasta el nivel del 30%).
En general, el análisis se puede aplicar a cualquier composición adecuada que comprenda PAC y agua. Generalmente, el nivel de PAC en tal composición de prueba no es muy crítico y puede ser, por ejemplo, de 0,0001 a 0,5% en peso, más preferido de 0,0005 a 0,1% en peso, más preferido de 0,001 a 0,05% en peso, por ejemplo 0,01% en peso.
En un cubreobjetos de 22 mm se puede colocar una gota de 3 \mul de la muestra. A continuación, un cubreobjetos de 16 mm de diámetro se coloca en la parte superior y se colocan 200 g de peso en la muestra para garantizar un espesor uniforme de la lámina. Los bordes del cubreobjetos se sellan con laca de uñas clara.
La lámina se coloca en una etapa de microscopio THM de Linkham 600 controlado por temperatura. La etapa se enfría rápidamente (50ºC por minuto) hasta -40ºC para producir una población grande de cristales pequeños. La temperatura de la etapa se eleva rápidamente (50ºC por minuto) hasta -6ºC y se mantiene a esta temperatura.
La fase de hielo se observa a -6ºC usando un microscopio Leica Aristoplan. Se usaron condiciones de luz polarizada junto con una placa lambda para potenciar el contraste de los cristales de hielo. El estado de la fase de hielo (tamaño de los cristales de hielo) se registra mediante microfotografía a T= 0 y T= 1 hora. A través, un tamaño medio de partícula (determinación visual, media numérica) inferior a 20 \mum, más preferido entre 5 y 15 \mum indica PAC preferido para usar en los productos según la invención.

Claims (20)

1. Un procedimiento para la producción de un producto alimentario congelado que comprende polipéptidos anticongelación, donde las condiciones se escogen de manera que los cristales de hielo del producto posean una relación entre dimensiones, definida como la longitud dividida por la anchura, mayor que 1,9.
2. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que la relación entre dimensiones se encuentra entre 2,0 y 2,9.
3. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que las condiciones para influir sobre la relación entre dimensiones se seleccionan del grupo de: velocidad de congelación, movilidad del producto durante la congelación, temperatura y tiempo de almacenamiento, formulación del producto y naturaleza y cantidad de polipéptidos anticongelación y combinaciones de los mismos.
4. Un procedimiento según la reivindicación 3, en el que las condiciones para influir sobre la relación entre dimensiones comprenden la adición de 0,0001 a 0,5% en peso de polipéptidos anticongelación.
5. Un procedimiento según la reivindicación 4, en el que los polipéptidos anticongelación comprenden una proteína de pescado anticongelación de tipo III.
6. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el producto alimentario congelado es un producto de confitería congelado.
7. Un procedimiento según la reivindicación 6, en el que el producto de confitería congelado se selecciona de un helado, un sorbete y una leche helada.
8. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el producto de confitería congelado se congela de forma estable.
9. Un producto de confitería congelado que comprende de 0,0001 a 0,5% en peso de polipéptidos anticongelación, teniendo dicho producto una relación entre dimensiones del cristal de hielo de más de 1,9.
10. Un producto de confitería congelado según la reivindicación 9, en el que la relación entre dimensiones es de entre 2,0 y 2,9.
11. Un producto de confitería congelado según la reivindicación 9, en el que los polipéptidos anticongelación se unen preferentemente a los planos de prisma primarios o secundarios de los cristales de hielo.
12. Un producto de confitería congelado según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, que es frágil.
13. Un producto de confitería congelado según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, que se selecciona de un helado, un sorbete y una leche helada.
14. Un producto de confitería congelado según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, en el que los polipéptidos anticongelación están producidos por manipulación genética.
15. Un producto de confitería congelado según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14, en el que las proteínas anticongelación comprenden una proteína anticongelación de pescado de tipo III.
16. Un producto de confitería congelado según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14, en el que las proteínas anticongelación comprenden una proteína anticongelación HPLC 12 de tipo III.
17. Un producto de confitería congelado que posee un contraste de textura, comprendiendo dicho producto elementos diferenciados de un producto de confitería congelado de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 16.
18. Un producto de confitería congelado según la reivindicación 17, que comprende capas finas de helado alternando con capas finas de sorbete, donde las capas de sorbete comprenden de 0,0001 a 0,5% en peso de polipéptidos anticongelación y poseen una relación entre dimensiones del cristal de hielo de 1,9 a 3,0.
19. Un producto de confitería congelado según la reivindicación 17, en el que los elementos diferenciados son inclusiones.
20. Un producto de confitería congelado según la reivindicación 19, en el que los elementos diferenciados son una capa fina que recubren un núcleo de helado.
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