CZ283846B6

CZ283846B6 - Zelená porfyrinová sloučenina

Info

Publication number: CZ283846B6
Application number: CZ942918A
Authority: CZ
Inventors: Janice North
Original assignee: Quadra Logic Technologies, Inc.
Priority date: 1992-05-27
Filing date: 1993-05-27
Publication date: 1998-06-17
Also published as: EP0642342A1; AU687734B2; CZ291894A3; FI945586L; DK0642342T3; MX9303127A; EP0642342B1; NZ252085A; IL105815A0; NO944537D0; CA2136447C; US5776966A; HU9403385D0; ES2147754T3; CA2136447A1; JPH08501278A; HUT78021A; FI945586A7; NO944537L; NO308506B1

Abstract

Zelené porfyrinové sloučeniny za použití fotodynamické terapie jsou schopny selektivně snížit zvýšené hladiny leukocytů v leukocytové populaci. Při použití sloučenin s absorpčním maximem asi 670 nm nebo vyšším mohou být vybrány vlnové délky pro provedení ošetření tkáňových komplexů, jako je plná krev. Toto je zejména pomocí pro subjekty, obsahující zvýšené hladiny T-buněk, jako pacienti infikovaní HIV. ŕ

Description

Léčivý prostředek pro selektivní snížení populace aktivovaných leukocytů v tělesné tekutině a způsob tohoto selektivního snížení

Oblast techniky

Vynález se týká léčivého prostředku pro selektivní snížení populace aktivovaných leukocytů v tělesné tekutině, obsahující aktivované leukocyty. Vynález se dále týká způsobu selektivního snížení populace aktivovaných leukocytových buněk v leukocyty obsahující tělesné tekutině, která byla odebrána pacientovi.

Specifičtěji se vynález týká těchto prostředků pro použití v postupech selektivního snížení populace aktivovaných leukocytů v krvi nebo kostní dřeni subjektů s imunitními dysfunkčními poruchami, jako jsou pacienti s autoimunitními chorobami nebo pacienti, infikovaní HTV.

Dosavadní stav techniky

Neočekávané imunitní odezvy, jako jsou ty, které charakterizují autoimunitní choroby, rejekci transplantátů a jsou spojeny s chorobami, které ovlivňují přímo imunitní systém, jsou charakterizovány přítomností aktivovaných leukocytů, zejména aktivovaných T-buněk. Byly popsány různé metody řízení aktivovaných leukocytů. Například US patent 5 011 684 popisuje použití monoklonálních protilátek, řízených k IL-2 receptorům, charakteristických pro aktivované T-buňky pro kontrolu rejekce transplantátů a autoimunity. US patent 5 152 380 popisuje podobné materiály, jakož i toxinové konjugáty pro kontrolu alergických odezev. Je obecně známo, že znakem pro aktivované T-lymfocyty je přítomnost IL-2 receptoru vysoké afinity.

Byly sledovány poruchy imunity, vyvolané virem lidské immunonedostatečnosti (HTV), ale podstata postupu této choroby je neurčitá. Nicméně bylo zjištěno, že lidé, infikovaní HTV, mají cirkulující cytotoxické T-lymfocyty, které lyžují neinfikované CD4⁺ buňky (Zarling J. M. a kol.,

J. Imunol. (1990) 144:2992). Je také obecně známo, že infekce HTV při odstranění hladin CD4⁺buněk zvyšuje hladiny CD8⁺, DR⁺ a IL-2R⁺ leukocytů. Jak je uvedeno výše, je IL-2R⁺považován za aktivační markér a DR je HLA markér a tyto mohou být na buňkách přítomny s dalšími markéry, jako je CD4 a CD8.

Jedna možnost vyrovnání se s postupem této infekce a výsledným potlačením imunity využívá strategii změny složení krve s ohledem na různé složky imunitního systému. Jeden takový postup je uveden v US patentu 4 960 408, kde je popsán způsob ošetření subjektu, majícího komplex, vztažený k AIDS, systémově se psorálně účinnými sloučeninami a pak mimotělní ošetření Tlymfocytů ultrafialovým zářením o vlnové délce, absorbované psorálně účinnými sloučeninami. Ozářené T-buňky se pak vrátí. Toto ošetření zjevně zvyšuje hladiny CD3⁺ buněk, CD4⁺ buněk a CD8⁺ buněk, i když nejednotným způsobem.

US patent 5 095 030, vydaný 10. března 1992, kteiý je zde zahrnut celý jako odkaz, popisuje a nárokuje různá cytotoxická činidla o specifické vlnové délce, která jsou členy třídy sloučenin s absorpčním maximem dlouhé vlnové délky, které se genericky nazývají „zelené porfyriny“. Sloučeniny, popsané v patentu, jsou porfyrinové deriváty, které jsou modifikovány účinně Diels - Alderovou reakcí pro posunuti vlnové délky absorpce do delších vlnových délek. Toto vede k určitým zlepšeným vlastnostem ve srovnání s například hematoporfyrinovým derivátem, jsou-li tyto sloučeniny používány obecně ve fotodynamické terapii. Jak je v tomto patentu popsáno, tato cytotoxická činidla, jsou-li podávána systémově, se „zabydlují“ v nežádoucích buňkách nebo patogenních virech a následující ozáření světlem, absorbovaným těmito

- 1 CZ 283846 B6 sloučeninami, způsobí jejich přechod tak, že to ovlivní jejich cytotoxicitu. Neočekává se, že samy sloučeniny jsou v tomto procesu chemicky změněny.

Nyní byla nalezena možnost selektivního odstranění hladin aktivovaných leukocytů podskupin, 5 které jsou spojeny s HTV infekcí nebo jinou imunitní poruchou za použití zelených porfyrinových sloučenin, jako jsou ty, popsané výše. Tato deplece může být uskutečněna bez vedlejších účinků na normální funkce B buněčné, CD4⁺ buněčné, CD8⁺ buněčné nebo NK buněčné populace. Jak leukocyty po oddělení z červených krvinek mohou být ošetřeny použitím prostředku podle vynálezu, tak může být tomuto ošetření podrobena i plná krev.

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu je léčivý prostředek pro selektivní snížení populace aktivovaných 15 leukocytových buněk v tělesné tekutině, obsahující aktivované leukocyty, který obsahuje zelenou porfyrinovou (Gp) sloučeninu, kterou je sloučenina, vybraná ze skupiny sloučenin obecných vzorců 1 až 6

-2CZ 283846 B6

kde:

R¹ a R²jsou nezávisle vybrány ze skupiny, sestávající z karbalkoxy(C₂ až C₆), alkyl(Ci až C₆) sulfonyl, aryl(C₆ až Ci₀)sulfonyl, aryl(C₆ až Cio) a kyano;

R³ je nezávisle karboxyalkyl(C₂ až C₆) nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl, amid, ester nebo acylhydrazon, neboje alkyl(Ci až C₆); a

R⁴ je -CH=CH2, -CH2OR⁴', -CHO, -COOR⁴', NOC(R⁴')2, sůl -COOH, -CH(OR⁴’)CH3, -CH(OR^4,)CH2OR⁴’, -CH(SR⁴')CH3, -CH2S-SR⁴', -CH(NR⁴’2)CH₃, -CH(CN)CH₃,

-CH(COOR⁴')CH3, -CH(COOCR⁴')CH3, -CH(CONR⁴'2)CH3, sůl CH(COOH)CH3, -CH(NR⁴'COR⁴’)CH3, -CH(halo)CH₃ nebo -CH(halo)CH₂(halo), kde R⁴' je vodík, alky 1(^ až C₆), nebo R⁴' je skupina, obsahující 1 až 3 zelené porfyriny nebo monohydrobenzoporfyrinové zbytky.

Výhodným provedením léčivého prostředkuje, když Gp sloučenina má vzorec 3 nebo 4,

R¹ a R² jsou karbomethoxy nebo karboethoxy, každé R³ je -CH₂CH₂COOH skupina nebo její farmaceuticky přijatelná sůl, amid, ester acylhydrazon; a R⁴ je vinyl.

Alternativně má Gp sloučenina vzorec, vybraný ze skupiny, sestávající z

kde každý R¹ a R² je nezávisle buď karbomethoxy nebo karboethoxy skupina, R je methyl nebo ethyl a R je vinyl.

Uvedenou tělesnou tekutinou, obsahující leukocyty, je s výhodou plná krev, přičemž tato tělesná tekutina s výhodou pochází od pacienta, majícího imunitní poruchu.

Další podstatou vynálezu je způsob selektivního snížení populace aktivovaných leukocytových 15 buněk v leukocyty obsahující tělesné tekutině, která byla odebrána pacientovi, a který zahrnuje (a) přidání zelené porfyrinové (Gp) sloučeniny podle nároku 1 do alespoň části odebrané tělesné tekutiny za vytvoření kompozice, obsahující 0,05 až 5 pg/ml Gp sloučeniny, a (b) vystavení uvedené kompozice světlu o intenzitě 1 až 50 J/cm², absorbovanému uvedenou porfyrinovou (Gp) sloučeninou.

Uvedená kompozice má koncentraci Gp sloučeniny s výhodou 0,1 až 1 pg/ml.

Tělesnou tekutinou je s výhodou plná krev.

Rovněž je výhodné, když Gp sloučenina má vzorec 3 nebo 4, nebo má vzorec, vybraný ze skupiny, tvořené výše uvedenými vzorci BPD-DA, BPD-DB, BPD-MA a BPD-MB, kde každý R¹ a R² je nezávisle buď karbomethoxy nebo karboethoxy skupina, R je methyl nebo ethyl a R 30 je vinyl.

Používá se s výhodou tělesná tekutina od pacienta s imunitní poruchou, zejména je vhodné, když pacient je infikován HIV nebo má autoimunitní chorobu, nebo pacient je příjemcem transplantátu.

-4CZ 283846 B6

Postup podle vynálezu zahrnuje ošetření tělesné tekutiny, tj. kostní dřeně nebo krve, nebo jejich vhodné frakce, specifickým prostředkem podle vynálezu, s následujícím ozářením krve nebo frakce alespoň jednou vlnovou délkou, absorbovanou léčivem. Postup, na který se požaduje ochrana, se týká provedení pouze extrakorporálně. Je ovšem nutno uvést, že postup může být proveden také in vivo, nebo částečně in vivo a částečně ex vivo.

Přehled obrázků na připojených výkresech

Obr. 1A a IB představují účinek Gp a ozáření na různé podskupiny leukocytů, majících různé znaky, zahrnujících B-buňky, CD4⁺ buňky, CD8⁺ buňky, DR⁺ buňky a IL-2R⁺ buňky v krvi od dvou pacientů, infikovaných HIV.

Obr. 2 představuje relativní koncentrace podskupin leukocytů v krvi od normálního dárce a od dvou HIV infikovaných pacientů.

Obr. 3A a 3B představují relativní koncentrace podskupin leukocytů v krvi od normálního dárce a HIV dárce, před a po ošetření s BPD a ozáření v normálních a HTV-infikovaných subjektech.

Obr. 4 představuje inaktivaci buňky, spojené s HTV ošetřením s BPD a ozářením.

Obr. 5 představuje generické struktury různých zelených porfyrinů, použitelných ve vynálezu.

Obr. 6 představuje struktury zelených porfyrinů - specificky BPD-ΜΑ, MPD-MD, BPD-DA a BPD-DB.

Příklady provedení vynálezu

Metody podle vynálezu zahrnují ošetření tělesné tekutiny, jako je kostní dřeň nebo krev nebo jejich vhodné frakce, obsahující abnormálně zvýšené hladiny aktivovaných leukocytů, zelenou porfyrinovou sloučeninou s následujícím ozářením tělesné tekutiny nebo frakce zářením, absorbovaným zeleným porfyrinem. Metoda podle vynálezu může být provedena v různých protokolech - dva podstatné prvky jsou nutné, a to, že zelené porfyriny jsou spojeny s buňkami, jejichž populace jsou oslabovány a že zelený porfyrin, spojený s těmito buňkami, je ozářen vhodnou vlnovou délkou. Zde použitý výraz „tělesná tekutina“ označuje tělesné tekutiny, které obsahují zvýšené hladiny aktivovaných leukocytů nebo jiných buněk, jako jsou HTV-infikované buňky, které mají být odstraněny. Takovými tělesnými tekutinami jsou typicky kostní dřeň nebo krev nebo jejich frakce.

Zelené porfyriny, použité ve vynálezu, jsou sloučeniny na bázi porfyrinů, které byly chemicky modifikovány tak, že vykazují absorpční maximum při 670 nm nebo vyšší. Použitím zelených porfyrinů mohou být použity při ozáření vlnové délky takové, které jsou jen minimálně absorbovány základními buňkami a tkání, jako jsou červené krvinky. Toto umožňuje použití plné krve, oproti plazmě, v metodě podle vynálezu. Při použití jiných sloučenin, které jsou schopny absorpce světla, jako jsou psorale v leukoforesových postupech, zahrnujících ozáření, je použití plazmy v těchto postupech nutné při vyžadované absorpční vlnové délce. Možnost použití plné krve je důležitou výhodou, kterou přináší použití zelených porfyrinů podle vynálezu.

I když může také být použita kostní dřeň jako substrát pro metodu podle vynálezu, je často vhodnější použití pacientovy krve. V jednom protokolu se odebere plná krev ze subjektu a ošetří se vhodnou koncentrací zeleného porfyrinů po dobu dostačující, aby zelený porfyrin byl spojen

-5CZ 283846 B6 s požadovanými cílovými buňkami. Plná krev se pak ozáří v mimotělním kontejneru nebo zařízení vhodnou vlnovou délkou a ošetřená ozářená krev se vrátí pacientovi.

Alternativně se pacientovi podává zelený porfyrin nebo jejich směs ve vhodných přípravcích, typicky injekcí, ale také jinými způsoby podání, jako je orální podání nebo transmukosální podání. Zvláště vhodné jsou liposomální přípravky. Po dostatečně dlouhé době od podání, aby zelený porfyrin mohl vstoupit do krevního proudu, se na tělo pacienta aplikuje vhodný zdroj záření, například může být katetrizované optické vlákno zasunuto do vhodných poloh v krevním proudu, nebo může být použito vystavení vnějšímu transkutánnímu světlu. Krev je pak ozářena in vivo.

Alternativně může být krev, odebraná z pacienta, rozdělena na frakce, typicky na frakci červených krvinek a frakci plazmy, obohacenou leukocyty, a plazma, obohacená leukocyty být ošetřena zeleným porfyrinem a ozářena před navrácením plazmy (a červených krvinek, je-li to žádoucí) do pacienta. Samozřejmě dělení do frakcí může být provedeno v jakémkoliv bodě během mimotělního ošetření tak, že GP by mohl být přidán k plné krvi a krev přitom rozdělena na frakci červených krvinek a obohacenou leukocyty před ozářením leukocyty obohacené frakce.

Vhodné subjekty pro ošetření podle vynálezu zahrnují HIV infikované pacienty, u kterých byly zjištěny zvýšené hladiny aktivovaných leukocytů, jako je DR⁺, ale zejména IL-2R⁺ buněk v jejich krvi. Tyto hladiny mohou být selektivně sníženy metodou podle vynálezu. Další pacienti, u kterých se očekávají zvýšené hladiny těchto buněk, zahrnují pacienty, vykazující obecně nežádoucí imunoaktivaci, jako jsou ti, kteří jsou subjektem choroby transplantát-versus-hostitel nebo rejekce transplantovaných orgánů jako výsledku, například transplantace orgánu nebo kostní dřeně a kteří vykazují autoimunitní stavy, jako je rheumatoidní artritida, lupus erythematosus, svalová dystrofie nebo myasthenia gravis. Pro transplantaci mohou být ošetřeny tekutiny od dárce orgánu nebo tekutiny pacienta, který je příjemcem.

Typicky se zelené porfyriny podávají tak, že se dosáhne konečné koncentrace v tekutině nebo frakci tekutiny, která je ošetřována, asi 0,05 - 5 pg/ml, výhodně asi 0,1-1 pg/ml a nejvýhodněji asi 0,5 gg/ml. Ošetřená tekutina nebo frakce tekutiny se pak ozáří světlem zjakéhokoliv vhodného zdroje, jako je laserová dioda, dioda emitující světlo, optické vlákno vedoucí laserové světlo a podobně. Typicky jsou vlnové délky v rozsahu od asi 600 do 790 nm, výhodně 630-710 nm, nejvýhodněji 690-780 nm a typické intenzity jsou řádově 1-50 J/cm². Preferován je rozsah vlnových délek 685 - 695 nm u těchto intenzit. Ozařování se provádí po asi 2-180 minut, výhodně asi 15-120 minut v závislosti na charakteru a koncentraci zeleného porfyrinu, množství ošetřené tekutiny, citlivosti pacientových buněk, intenzitě a vlnové délce světla a metodě ozařování (in vivo nebo ex vivo). Vhodná optimalizace koncentrace Gp a parametrů ozařování je na rozhodnutí lékaře.

Bližší podrobnosti o zelených porfyrinech, vhodných podle vynálezu, představují obecné vzorce typických zelených porfyrinů, které jsou uvedeny na obr. 5. Zvláště preferované formy jsou uvedeny na obr. 6.

Tento soubor Gp je vybrán ze skupiny porfyrinových derivátů, získaných použitím DielsAlderových reakcí acetylenových derivátů s protoporfyrinem za podmínek, které umožní reakci na pouze jedné ze dvou dostupných konjugováných, nearomatických dienových struktur, přítomných v protoporfyrinovém - IX kruhovém systému (kruhy A a B). Vzorce, uvedené na obr. 5, představují typické zelené porfyriny podle vynálezu. Tyto sloučeniny jsou uvedeny na obrázku s dusíky vnitřních kruhů, obsazenými vodíkem. Nicméně mohou být použity i metalované formy, kde kationt nahradí jeden nebo dva z těchto vodíků. Tyto sloučeniny mohou být značeny buď nahrazením jednoho nebo více atomů ve vzorci jejich radioaktivními formami, nebo spojením s radioizotopem, jako je radioaktivní kov, nebo například radioizotop jodu.

-6CZ 283846 B6

Používá se zkratka výrazu hydromonobenzoporfyrinový derivát - „BPD“ - a obecně označuje sloučeniny vzorců 3 a 4 na obr. 5. Toto jsou výhodné formy Gp. Jak je uvedeno na obr. 5, jsou R¹, R², R³ a R⁴ neinterferující substituenty, které neovlivňují znatelně absorpční maximum, 5 vykazované sloučeninou. Nejtypičtěji jsou R¹ a R² karbalkoxyskupiny, typicky methyl nebo ethylkarboxyestery. Nejběžněji je R³ 2-karboxyethyl nebo jeho alkylester a R⁴ je vinyl. Tato preferovaná provedení vznikla z dostupnosti nativních porfyrinů a nejsou dána požadavky biologické účinnosti. „Neinterferujícími substituenty“ jsou míněny substituenty, které ani nesnižují maximum absorpce vlnové délky pod 670 nm, ani nenarušují schopnost zeleného 10 porfyrinů se zabydlet v aktivovaných leukocytech, ani neinterferují s účinkem aktivace sloučeniny světlem na biologickou tkáň.

Dimemí formy Gp mohou být také poskytnuty, čímž se zesílí schopnost Gp sloučeniny absorbovat světlo na mol základu. Mohou být také poskytnuty dimemí a multimemí formy 15 kombinací Gp/porfyrin, poskytující další absorpční vlnové délky.

Zelené porfyriny mohou být konjugovány ke specifickým ligandům reaktivním s cílem, jako jsou receptor - specifické ligandy nebo imunoglobuliny nebo imunospecifické podíly imunoglobulinů, což jim umožňuje, aby byly více koncentrovány v požadované cílové tkáni nebo 20 substancích. Tato konjugace dále umožní další snížení požadovaných dávkových hladin, protože materiál není v distribuci zanášen do jiných tkání jejichž destrukci, pokud to není žádoucí, musí být zabráněno.

Jestliže se Gp ozařuje in vitro použitím světla v rozsahu viditelné absorpce, vede fotoaktivace 25 k cytotoxicitě okolní tkáně. I když absorpční spektrum také obsahuje kratší vlnové délky, je zvláště vhodné absorpční maximum 670 - 780 nm.

„Zelený porfyrin“ označuje porfyrinové jádro modifikované tak, že dosahuje vlnové délky absorpčního maxima 670 nm nebo vyšší. Absorpční maximum je řízeno konjugovaným π 30 systémem porfyrinového jádra. V protoporfyrinu - IX dva z pyrrolů obsahují vinyl - substituce takže exocyklická π - vazba je konjugována k jedné ze dvou π - vazeb v kruhu. Diels-Alderova reakce, zahrnující jeden z těchto konjugovaných systémů s acetylenovým derivátem dienofilu, vede ke kondenzovanému cyklohexadienu - označovanému zde jako „hydrobenzo“ kondenzovanému ke kruhu A nebo B, jak je uvedeno ve vzorcích 1 a 2. Přeskupení π systému 35 v hexadienovém kruhu vede ke sloučeninám vzorců 3 a 4, redukce poskytne sloučeniny vzorců 5 a 6. Všechny tyto sloučeniny poskytují žádoucí batochromní posun v absorpčním maximu.

Specifická příprava třídy Gp sloučenin, vhodných ve vynálezu, je popsána podrobně ve výše zmíněném US patentu 5 095 030.

Ve sloučeninách, uvedených na obr. 5 a 6, jsou obecně R¹ a R² každý nezávisle substituenty, moderující odstoupení elektronů a jsou to, nejběžněji, karbalkoxy nebo alkyl nebo arylsulfonyl nebo jakékoliv jiné aktivující substituenty, které nejsou dostatečně elektron-odnímající, což vede k reakci s oběma A a B kruhy spíše než k reakci s pouze jedním, jako je kyano nebo 45 - CONR⁵CO -, kde R⁵ je aryl nebo alkyl. Jeden z R¹ a R² může být výhodně H, zatímco druhý je substituent, odnímající elektrony dostatečnou silou pro usnadnění Diels-Alderovy reakce.

Jak je zde použito je karboxy, jak je běžně definováno, - COOH a karbalkoxy je - COOR, kde R je alkyl, karboxyalkyl označuje substituent -R'-COOH, kde R' je alkylén, karbalkoxyalkyl 50 označuje - R' - COOR, kde R' a R jsou alkylen a alkyl. Alkyl je nasycený přímý nebo rozvětvený uhlíkatý řetězec s 1 - 6 atomy uhlíku, jako je methyl, n-hexyl, h-methylpentyl, terc.butyl, npropyl atd. Alkylen má význam jako alkyl s tím rozdílem, že to je dvojvazná skupina. Aryl nebo alkylsulfonylskupiny mají vzorec SO₂R, kde R je alkyl, jak je definován výše, nebo je to aryl,

-7CZ 283846 B6 kde aryl je fenyl popřípadě substituovaný 1 - 3 substituenty, nezávisle vybranými z halogenu (fluor, chlor, brom nebo jod), nižšího alkylu (1—4C). Dále jeden nebo oba R¹ a R² mohou samotné být aryl - tj. fenyl popřípadě substituovaný, jak je definováno výše.

Jak je znázorněno na obr. 5, aduktem, vytvořeným reakcí R’-C=C-R² s protoporfyrin - IX kruhovým systémem (R¹ je chráněná forma 2-karboxyethylu, jako je 2-karbomethoxyethyl nebo 2-karboethoxyethyl, R⁴ je CH=CH2), jsou sloučeniny vzorců 1 a 2, kde sloučenina vzorce 1 vzniká z adice k A kruhu a sloučenina vzorce 2 z adice k B kruhu. V těchto výsledných produktech vzorců 1 a 2 R⁴ zůstává CH=CH2, avšak tato vinylskupina je snadno derivatizována na jiné významy R⁴ adicí k nebo oxidací vinyl kruhového substituentu kruhu B ve vzorci 1 nebo kruhu A ve vzorci 2. Adiční nebo oxidační produkty mohou být dále substituovány, jestliže jsou přidané substituenty funkcí odštěpitelné skupiny - např. - Br může být nahrazen - OH, - OR (R je alkyl 1-6C jako výše), nebo - NH₂, - NHR, - HR₂ atd. Ve výhodných provedeních je jeden z adovaných substituentů vodík a druhý je vybrán ze skupiny, zahrnující halogen (fluor, chlor, brom nebo jod), hydroxy, nižší alkoxy, amino nebo amid, sulfhydryl nebo organosulfid, nebo sám může být vodík. Adice k vinylskupině neposkytuje významnou změnu absorpčního spektra výsledné sloučeniny. Produkt Markovnikovy adice vody poskytuje substituent strukturně analogický hematoporíyrinovému kruhovému systému na relevantním kruhu. Sloučeniny podle vynálezu obsahují různé skupiny jako R⁴, zahrnují substituenty, které poskytují další porfyrinové nebo od porfyrinu odvozené kruhové systémy, jak bylo popsáno dříve.

R³ v protoporfyrinu - IX je 2-karboxyethyl (-CH2 CH2 COOH). Nicméně charakter R³ (pokud neobsahuje π - vazbu konjugovanou ke kruhové π - vazbě), nemá obvykle vztah k průběhu Diels-Alderovy reakce nebo na účinnost a absorpční spektrum konečného produktu. R³ tak může být například nižší alkyl (1—4C) nebo 1-karboxyalkyl (2-6C), nebo jejich estery či amidy. R³substituent může být také substituován halogenem, jak je výše uvedeno, nebo jinými nereaktivními substituenty. Protože však obvyklými výchozími materiály pro Gp sloučeniny podle vynálezu jsou přirozeně se vyskytující porfyriny, jsou výhodnými substituenty R³CH2CH₂COOH nebo CH₂CHR₂COOR, kde R je alkyl (1-6C).

V BPD sloučeninách podle vynálezu bylo zjištěno, že je výhodné hydrolyzovat nebo částečně hydrolyzovat esterifikovanou karboxyskupinu v - CH₂CH₂COOR. Hydrolýza probíhá mnohem rychleji než u esterových skupin R¹, R² a rozpustnost a biodistribuční charakteristiky výsledných sloučenin jsou mnohem více žádoucí než u nehydrolyzované formy. Hydrolýza vede k dikyselinovým nebo monoky se línovým produktům (nebo jejich solím).

Hydro-monobenzoporfyriny, které přímo vznikají z Diels-Alderovy reakce, popsané v citovaných odkazech, mohou být také izomerovány na sloučeniny vzorců 3 a 4 na obr. 5.

Zobrazení sloučenin 3 a 4 na obr. 5 neznázorňuje relativní polohu exocyklické methylskupiny (kruh A vzorce 3 a kruh B vzorce 4) s ohledem na R² substituent. Dostupný je jakýkoliv isomer.

Navíc mohou být Diels-Alderovy produkty selektivně redukovány zpracováním s vodíkem za přítomnosti palladia na aktivním uhlí za vzniku nasycených kruhových analogů, znázorněných vzorci 5 a 6 na obr. 5, odpovídajících Diels-Alderovým produktům kruhů A a B. Tyto redukované produkty jsou méně výhodná provedení a méně vhodné v metodě podle vynálezu, než sloučeniny vzorců 1 — 4.

Popis uvedený výše ve vztahu ke sloučeninám vzorců 1 a 2, týkající se derivatizace konverzí zůstávajícího vinylsubstituentu (R⁴) a s ohledem na variabilitu - R³ se rovněž aplikuje na sloučeniny vzorců 3, 4, 5 a 6.

-8CZ 283846 B6

Sloučeniny vzorců 3 a 4 (BPD) a zejména ty, které mají hydrolyzované a částečně hydrolyzované karbalkoxyskupiny vR³, jsou nejvíce preferovány. Sloučeniny podle vynálezu, které obsahují

- COOH, mohou být připraveny jako volné kyseliny nebo ve formě solí s organickými nebo anorganickými bázemi.

Je nutno uvést, že mnoho sloučenin z obr. 5 obsahuje alespoň jedno chirální centrum a existuje proto jako optické isomery. Konjugáty a metody podle vynálezu zahrnují jak sloučeniny, mající obě konfigurace chirálních uhlíků, jsou-li sloučeniny dodávány jako izoláty jednotlivého stereoisomeru, nebo to jsou směsi enantiomerů a/nebo diastereomerů. Dělení směsí diastereomerů může být provedeno jakýmikoliv běžnými prostředky, směsi enantiomerů mohou být děleny obvyklými technikami jejich reakcí s opticky aktivními přípravky a dělením výsledných diastereomerů.

Je dále třeba uvést, že reakčními produkty mohou být nerozdělené směsi A a B kruhových systémů, např. směsi vzorců 1 a 2 nebo 3 a 4 nebo 5 a 6. Jak dělené formy - tj. vzorce 3 samotné nebo vzorce 4 samotné, nebo směsi v jakémkoliv poměru mohou být použity v metodách terapie a diagnózy, uvedených dříve.

Obr. 6 představuje čtyři zvláště výhodné sloučeniny podle vynálezu, které nebyly v oboru dříve popsány. Tyto sloučeniny jsou společně označeny jako benzoporfyrinové deriváty (BPD), protože to jsou formy Gp, mající vzorec 3 nebo 4. Jsou to hydrolyzované nebo částečně hydrolyzované formy přeskupených produktů vzorce 3 a 4, kde jsou jedna nebo obě chráněné karboxylové skupiny R³ hydrolyzovány. Esterové skupiny v R’ a R² hydrolyzují o tolik pomaleji, že se snadno uskuteční konverze na formy, uvedené na obr. 6.

Pro účely tohoto popisu je R³-CH₂CH₂COOR³'. Jak je uvedeno na obr. 6, je každý R³'H v preferované sloučenině BPD-DA, R^l a R² jsou karbalkoxy a derivatizace je na kruhu A, BPDDB je odpovídající sloučenina, kde derivatizace je na kruhu Β. BPH-MA představuje částečně hydrolyzovanou formu BPD-DA a BPD-MB částečně hydrolyzovanou formu BPD-DB. V posledně uvedených sloučeninách jsou R¹ a R² karbalkoxy, jeden R³'je H a druhý R³'je alkyl (1—6C). Sloučeniny vzorců BPD-ΜΑ a BPD-MB mohou být homogenní, je-li pouze C kruhový karbalkoxyethyl nebo pouze D kruhový karbalkoxyethyl hydrolyzován, nebo mohou být směsí hydrolyzátů substituentů C a D kruhu. Navíc mohou být v metodě podle vynálezu použity směsi jakýchkoliv dvou nebo více BPD-MA, - MB, - DA a - DB.

Určitá jiná provedení, kde R⁴ je jiný než vinyl nebo kde R³ je nenativní substituent, jsou také zahrnuty mezi Gp, použitelné ve vynálezu.

Obecně každý R¹ a R² je nezávisle vybrán ze skupiny, zahrnující karbalkoxy (2-6C), alkyl (1—6C) sulfanyl, aryl (6-10C) sulfanyl, aryl (6-10C), kyano, a - CONR⁵CO -, kde R⁵ je aryl (6-10C) nebo alkyl (1-6C).

Každý R³ je nezávisle karboxyalkyl (2-6C) nebo jeho sůl, amid, ester nebo acylhydrazon, nebo je alky 1(1-6C),

R⁴ je CHCH2, CHOŘ⁴', - CHO, - COOR⁴’, CH(OR^4,)CH3, CH(OR⁴)CH2OR⁴', - CH(SR⁴')CH3,

- CH(NR⁴'2)CH3, - CH(CN)CH3, - CH(COOR^4,)CH3, - CH(OOCR⁴')CH₃, - CH(halogen)CH₃, nebo - CH(halogen)CH₂ (halogen), kde R⁴'je H, alkyl (1—6C) popřípadě substituovaný hydrofilním substituentem, nebo

R⁴ je organická skupina <12C, vzniklá z přímé nebo nepřímé derivatizace vinylu, nebo

-9CZ 283846 B6

R⁴ je skupina, obsahující jádro 1-3- tetrapyrrolového typu vzorce - L-P, jak je zde definován.

Sloučeniny vzorců 3 a 4 ajejich směsi jsou zvláště preferovány. Preferovány jsou také ty, kde R¹a R² jsou stejné a jsou karbalkoxy, zejména karboethoxy, také jsou preferovány ty, kde R⁴ je - CHCH₂, CH(OH)CH3 nebo - CH(halogen)CH₃, nebo to je skupina, obsahující jádro typu 1-3 tetrapyrrolu vzorce -L-P (definovaného dále).

Výraz Jádro“ tetrapyrrolového typu“ představuje čtyřkruhový systém skeletu:

který je zkrácen

a jeho sůl, ester, amid nebo acylhydrazon, který je vysoce konjugován. Obsahuje porfyrinový systém, který je plně konjugovaným systémem, chlorový systém, který je dihydroformou porfyrinu a redukovaný chlorový systém, který je tetrahydroformou plně konjugovaného systému. Jestliže je „porfyrin“ specifikován, je označen plně konjugovaný systém, Gp je ve skutečnosti dihydroforma porfyrinového systému.

Jednu skupinu sloučenin tvoří ty, kde substituent R⁴ obsahuje alespoň jedno další jádro tetrapyrrolového typu. Výsledné sloučeniny podle vynálezu jsou dimery nebo oligomery, ve kterých alespoň jeden z kruhových systémů tetrapyrrolového kruhu je Gp. Spojení mezi skupinou Gp přes polohu R⁴ k dalšímu kruhovému systému tetrapyrrolového typu může být buď etherového, aminového nebo vinylového typu. Další derivatizace v případě porfyrinových kruhových systémů, které mají dvě dostupné polohy substituentů (v obou kruzích A a B), odpovídajících R⁴, může být také provedeno, jak je popsáno dále.

Jak je uvedeno výše, sloučeniny vzorců, uvedených na obr. 5, zahrnují ty, kde provedení R⁴ je vytvořeno adicí kvinylovým skupinám počátečních Gp produktů. R⁴ může být jakýkoliv substituent v souladu s tím, že je vytvořen snadnou adiční reakcí. Oba adované substituenty tak mohou být například OH nebo halogen a tyto substituenty mohou být dále substituovány, nebo adiční činidlo může být ve formě HX, kde H se přidá k atomu uhlíku, připojenému ke kruhu za vzniku R⁴ vzorce - CH2CH3.

x

Vinylová skupina může být takéu za vzniku R⁴ jako CH₂OH, - CHO nebo COOH ajejich solí a esterů.

Obecně R⁴ představuje jakékoliv substituenty, na které se vinylová skupina - CH=CH₂ snadno převede při štěpení nebo adici a další výsledky reakce odštěpitelných skupin s dalšími skupinami. Typické R⁴ substituenty zahrnují:

- 10CZ 283846 B6

-CH(NH₂)Me, -CH(NHC

NO₂)Me,

- CH(imidazol)Me,

CH(OH)Me, - CHBrMe, - CH(OMe)Me, - CH(pyridinumbromid)Me, - CH(SH)Me a jejich disulfíd, - CHOHCH₂OH, - CHO, a - COOH nebo - COOMe.

Jestliže R⁴ je - L - P, substituent vzorce L - P“ představuje substituent, kde - L - je vybrán ze skupiny, zahrnující

-CH-O-CH-, 1 1	-CHNHCH-, 1 1	-CH=CH-CH-,
1 1 Me Me	1 1 Me Me	1 Me
(a)	(b)	(c)
-CH-CH=CH-	=CH- C-CH-,	a -CH-C-CH=
1	II 1	1 II
Me	OMe	Me O
(d)	(e)	(0

a P je vybrán ze skupiny, zahrnující Gp, kde Gp má vzorec 1-6, uvedený na obr. 5, ale postrádající R⁴ a konjugovaný přes polohu, uvedenou na obr. 5 jako obsazenou R⁴ k L a porfyrin vzorce

kde R³ a R⁴ mají výše definovaný význam a neobsazená vazba je pak připojena k L.

Zkratka

představuje porfyrin vzorce

-11 CZ 283846 B6

kde každý R je nezávisle H nebo nižší alkyl (1—4C).

(Má-li - L - vzorec e) nebo f), bude mít kruhový systém, ke kterému je dvojná vazba připojena, rezonanční systém, odpovídající

v kruhu, ke kterému je dvojná vazba připojena, jak je znázorněno).

Příprava dimerů a oligomerů

Dimery a oligomery sloučenin podle vynálezu mohou být připraveny za použití reakcí analogických reakcím pro dimerizaci a oligomeraci porfyrinů per se. Spojení zelených porfyrinů nebo zelený porfyrin/porfyrin může být provedeno přímo nebo mohou být porfyriny kopulovány s následující Diels-Alderovou reakcí jednoho nebo obou terminálních porfyrinů pro převedení na odpovídající zelený porfyrin.

Obecně se zelené porfyriny připraví jakýmkoliv souborem reakcí, které mění π - vazbu konjugačního systému porfyrinového jádra tak, že se posunuje maximum vlnové délky za požadovanou hodnotu. Metody pro chemickou modifikaci porfyrinů pro dosažení tohoto posunu v maximu vlnové délky jsou obecně v oboru známé.

Následující příklady jsou míněny jako ilustrativní a vynález nikterak neomezující.

Příklady provedení

Příklad I

Odezva různých leukocytů na BPD a ozáření

Krev byla odebrána dvěma pacientům, kteří byli infikováni HIV. Plná krev každého pacienta byla zpracována různými koncentracemi BPD-MA a pak ozářena světlem o 10,8 J/cm za použití 690 nm světla, emitovaného z LED během 4 minut. Populace různých podskupin T - buněk byly hodnoceny průtokovou cytometrií v porovnání s neošetřenými kontrolami a procenta buněk jsou vyjádřena jako procenta kontroly, vyjádřená jako funkce koncentrace BPD-MA.

- 12CZ 283846 B6

Výsledky jsou uvedeny na obr. IA a 1B. Jak je znázorněno, většina buněčných populací zůstává relativně konstantní, včetně B - buněk a CD4 buněk. Mírné snížení se ukázalo u CD8⁺ buněk a DR⁺ buněk. IL —2R⁺ buňky vykazují značné snížení v pacientových výsledcích, uvedených na obr. IA, které je závislé na dávce BPD-MA.

Jak je uvedeno na obr. IA, i když IL-2R⁺ buňky jsou významně sníženy, je také významné snížení u DR⁺ a CD8⁺ buněk. Vliv na DR⁺ buňky se významně projevil u druhého pacienta, jak je znázorněno na obr. 1B.

Podobné studie byly provedeny s konstantní koncentrací BPD-MA (0,5 gg/ml) za použití normálního subjektu a dvou HIV pacientů. Obr. 2 představuje subpopulaci leukocytů v neošetřené krvi těchto tří dárců. Jak je znázorněno na obr. 2, B-buňky a přirozené zabíječské buňky se objevují v přibližně stejných hladinách u normálních i HIV pacientů, nicméně ARC pacienti shodně vykazují snížené hladiny CD4⁺ a zvýšené hladiny CD8⁺, DR⁺ a IL-2R⁺.

Obr. 3 A, 3B a 3C znázorňují účinky ošetření podle vynálezu. Jak je uvedeno na obr. 3A, ošetření leukocytových subpopulaci v normální krvi má malý účinek na jakoukoliv z uvedených populací. Obr. 3B ukazuje, že když se HTV-infíkovaná krev podrobí tomuto ošetření, dochází ke slabému poklesu u DR⁺ a významnému zvýšení u IL-2R⁺ buněk. Obr. 3C představuje tyto výsledky specificky pro IL-2R⁺ buňky, jak u normálního jedince, tak u HTV-infikovaných pacientů. Opět je znázorněno dramatické snížení.

Po ošetření s 0,5 gg/ml BPD po 4 minuty za přítomnosti 10,8 J/cm² světla, centrovaného při 690 nanometrech, buněčné populace všech buněčných typů v normálním subjektu a všech buněčných typů mimo IL-2R⁺ u HIV pacientů zůstávají relativně konstantní. DR⁺ a CD8⁺ buňky jsou slabě sníženy. Ošetření BPD/světlo se jeví jako mající malý nebo žádný účinek na většinu podtříd leukocytů, nicméně se zvýšené hladiny IL-2R⁺ buněk vrátily k normálu.

Příklad 2

Plná krev o HTV pacienta byla také podrobena ošetření různými koncentracemi BPD a různými světelnými intenzitami v protokolu, podobném jako v příkladu 1, a byl testován vliv na inaktivaci buněk, spojených s HIV. Výsledky jsou uvedeny na obr. 4. Jak je uvedeno, intenzity 13 J/cm²poskytují významnou inaktivaci víru v koncentracích BPD asi 0,5 gg/ml nebo menších. Nižší intenzity ozařování vyžadují vyšší koncentrace BPD pro úplnou inaktivaci viru.

Příklad 3

Inaktivace volného HTV (LAV-1 kmen) ve tkáňové kultuře CEM buněk byla také testována. Ve zkoušce byl LAV-1 zásobní roztok zředěn v médiu pro tkáňovou kulturu a byl přidán BPD buď 0,25 gg/ml nebo 0,5 gg/ml. Média byla inkubována 1 hodinu a pak vystavena na 3 minuty ozařování, centrovanému 690 nm při intenzitě 10,8 J/cm². Média pak byla přidána kCEM buňkám a buňky byly zkoumány po 6 dnech kultivace za použití standardní zkoušky p 24. Výsledky jsou uváděny v pg/ml.

Výsledky jsou uvedeny v tabulce 1. Jak je uvedeno, při ředěních LAV, která poskytují vysoké hladiny p 24, bylo ošetření BPD buď při 0,25 gg/ml nebo 0,5 gg/ml schopno podstatně snížit hladinu stanového p 24.

- 13CZ 283846 B6

Tabulka 1 x pg/ml (p 24)

LAV-1 ředění	ošetření bez léčiva bez světla	ošetření 25 pg BPD 3 min	ošetření 5 pg BPD 3 min
10'²	>616	23,2	14,2
3 x 10’²	>616	18,2	14,5
5 x 10²	>616	15,1	11,4
7 x ΚΓ²	>616	8,9	7,6
9x ΚΓ²	>616	7,6	5,4
10~³	>616	4,5	7,0
3 x 1(T³	>616	5,1	3,2
5 x 10'³	>616	4,5	3,9
7 x 10’³	>616	3,9	2,0
9 x 10’³	>616	5,4	2,3
1(T*	>616	2,0	4,2
3xl(T⁴	>616	3,6	2,0
5 x 1(L⁴	>616	2,9	2,3
7 x 10⁴	>616	3,2	—
9x 10⁴	2,6	2,6	-

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims

1. Léčivý prostředek pro selektivní snížení populace aktivovaných v tělesné tekutině, obsahující aktivované leukocyty vyznačující obsahuje zelenou porfyrinovou Gp sloučeninu, kterou je sloučenina, sloučenin obecných vzorců 1 až 6 leukocytových buněk se tím, že vybraná ze skupiny

- 14CZ 283846 B6 kde:

R¹ a R² jsou nezávisle vybrány ze skupiny, sestávající z karbalkoxy(C₂ až C₆), alkyl(C] až C₆) sulfonyl, aryl(C₆ až Cio)sulfonyl, aryl(C₆ až Ci₀) a kyano;

R⁴ je -CH=CH2, -CH2OR⁴’, -CHO, -COOR⁴', NOC(R^4,)2, sůl -COOH, -CH(OR^4,)CH3, -CH(OR^4,)CH2OR⁴', -CH(SR⁴')CH3, -CH2S-SR⁴’, -CH(NR⁴'2)CH₃, -CH(CN)CH₃,

-CH(COOR^4,)CH3, -CH(COOCR^4,)CH3, -CH(CONR⁴'2)CH3, sůl CH(COOH)CH3, -CH(NR^4,COR⁴')CH3, -CH(halo)CH₃ nebo -CH(halo)CH₂(halo), kde R⁴' je vodík, alky 1((^ až C₆), nebo R⁴' je skupina, obsahující 1 až 3 zelené porfyriny nebo monohydrobenzoporfyrinové zbytky.

2. Léčivý prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že obsahuje Gp sloučeninu vzorce 3 nebo 4;

- 15 CZ 283846 B6

R¹ a R² jsou karbomethoxy nebo karboethoxy;

každé R³ je -CH2CH2COOH skupina nebo její farmaceuticky přijatelná sůl, amid, ester nebo acylhydrazon; a R⁴ je vinyl.

3. Léčivý prostředek podle nároku 2, má vzorec, vybraný ze skupiny, sestávající z vy značující se tím, žeGp sloučenina

BPD-MA BPD-MB

- 16CZ 283846 B6 kde každý R¹ a R² je nezávisle buď karbomethoxy nebo karboethoxy skupina, R je methyl nebo ethyl a R je vinyl.

4. Způsob selektivního snížení populace aktivovaných leukocytových buněk v leukocyty obsahující tělesné tekutině, která byla odebrána pacientovi, vyznačující se tím, že zahrnuje (a) přidání zelené porfyrinové Gp sloučeniny podle nároku 1 do alespoň části odebrané tělesné tekutiny za vytvoření kompozice, obsahující 0,05 až 5 gg/ml Gp sloučeniny, a (b) vystavení uvedené kompozice světlu o intenzitě 1 až 50J/cm², absorbovanému uvedenou porfyrinovou Gp sloučeninou.

5. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že uvedená kompozice má koncentraci Gp sloučeniny 0,1 až 1 pg/ml.

6. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, krev.

7. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, nebo 4.

8. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, vybraný ze skupiny, tvořené že tělesnou tekutinou je plná že Gp sloučenina má vzorec 3 že Gp sloučenina má vzorec,