PT642342E - Inactivacao selectiva de celulas de sangue - Google Patents

Description

84 792 ΕΡ Ο 642 342/ΡΤ

“Inactivação selectiva de células no sangue” Âmbito Técnico O invento refere-se a métodos fotodinâmicos para depleção selectiva de células CD8+, DR+ ou IL-2R+ do sangue ou da medula óssea importantes na evolução de certas doenças. Mais especificamente, refere-se à utilização de uma porfirina verde no fabrico de um medicamento para utilização no tratamento de desordens disfuncionais imunitárias, tais como doentes com doenças auto-imunes ou doentes infectados com HIV.

Arte Anterior

As respostas imunitárias não desejadas, tais como aquelas que caracterizam a doença auto-imune, a rejeição de aloenxertos, e as associadas com doenças que afectam directamente o sistema imunitário, caracterizam-se pela presença de leucócitos activados, em particular células T activadas. Foram descritos diversos métodos para controlo de linfócitos activados. Por exemplo, a Patente dos E.U.A. 5 011 684 descreve a utilização de anticorpos monoclonais dirigidos contra receptores de IL-2 característicos das células T activadas a fim de controlar a rejeição de aloenxertos e a auto-imunidade; a Patente dos E.U.A. 5 152 380 descreve materiais semelhantes bem como conjugados de toxinas a fim de controlar respostas alérgicas. É reconhecido de uma forma geral que um marcador para linfócitos T activados é a presença de um receptor de IL-2 de elevada afinidade.

As perturbações imunitárias causadas pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV) foram estudadas, mas a natureza da evolução da doença ainda é incerta. No entanto, foi demonstrado que humanos infectados com o HIV possuem linfócitos T citotóxicos circulantes que lisam células CD4+ não infectadas (Zarling, J.M. e colab., J. Immunol. (1990) 144:2992). É de igual forma geralmente compreendido que a infecção com o HIV, ao mesmo tempo que ocasiona a depleção dos níveis de células CD4+, aumenta os níveis de leucócitos CD8+, DR+, e IL-2R+. Tal como exposto acima, IL-2R+ é considerado um marcador de activação e DR é um marcador de HLA, e estes podem encontrar-se presentes nas células com marcadores adicionais tais como CD4 e CD8.

84 792 ΕΡ Ο 642 342/ΡΤ 2

Uma abordagem com ο fim de interferir com a evolução desta infecção e da imunossupressão resultante emprega estratégias para alterar a composição do sangue em relação a diversos componentes do sistema imunitário. Numa tentativa para alcançar isto, a patente dos E.U.A. 4 960 408 descreve um processo de tratamento de um sujeito que apresenta o complexo relacionado com a SIDA sistemicamente, com psoralen, e de seguida, extracorporeamente, tratamento dos linfócitos T com radiação ultravioleta de um comprimento de onda absorvido pelo composto psoralen. As células T irradiadas são de seguida devolvidas. Este tratamento aparentemente eleva os níveis de células CD3\ células CD4+, e células CD8\ embora não de uma forma uniforme. A patente dos E.U.A. 5 095 030, concedida em 10 de Março de 1992, a qual é aqui incorporada na sua totalidade por referência, descreve e reivindica diversos agentes citotóxicos específicos de comprimento de onda, os quais são membros de uma classe de compostos com máximos de absorção em comprimentos de onda longo que podem ser genericamente descritos como “porfirinas verdes”. Os compostos descritos na patente são derivados da porfirina os quais são modificados por uma reacção de Diels Alder efectivamente a fim de desviar o comprimento de onda de absorção para um comprimento de onda mais longo. Isto tem como resultado algumas propriedades favoráveis quando comparados, por exemplo, com derivados da hematoporfirina quando estes compostos são empregues em terapia fotodinâmica duma forma geral. Tal como descrito nesta patente, estes agentes citotóxicos, quando administrados sistemicamente, “alojam-se” em células não desejadas, em particular em células tumorais ou vírus patogénicos e a subsequente irradiação com luz absorvida por estes compostos faz com que sofram uma transição de uma tal forma que resulta em citotoxicidade. Não se pensa que os próprios compostos sejam quimicamente alterados neste processo. S. Gruner e colab. (Tissue Antigens, 1986, 27:147-154) utilizaram uma hematoporfirina a fim de tratar sangue normal e verificaram que no intervalo entre quatro e oito horas após o tratamento com UVB, PUVA, derivado da hematoporfirina e luz ou aquecimento até 45°C, as células HLA-DR positivo desapareciam de entre as células mononucleares. Os autores extrapolaram a partir disto a fim de concluir que a expressão de antigénios do MHC de classe II é reduzida pelos processos que eles levaram a cabo.

84 792 ΕΡ Ο 642 342/ΡΤ 3 J. North e colab. (Transfusion, 1992, 32(2): 121-128) utilizaram um modelo de vírus de leucemia felina a fim de investigar a eficácia de uma hematoporfirina (BPD-MA) no tratamento de sangue recolhido a partir de gatos infectados. Os autores concluem na página 127, parágrafo final, que “verifica-se que a BPD-MA será um fotossensibilizador promissor para a eliminação de HIV dos componentes para transfusão”. Também é afirmado que “deve ser dado ênfase a que os estudos constituem uma etapa preliminar na avaliação da exequibilidade da utilização de fotossensibilizadores na inactivação virai de componentes do sangue”. O trabalho relatado por North e colab. no resumo J. Cell Biochem., 1992, supl. 016 parte E, pág. 85, refere-se ao tratamento de sangue e de produtos do sangue e não existe qualquer sugestão de que a técnica possa ser utilizada no tratamento de um doente infectado com HIV. J. L. Matthews e colab., Transfusion, 1991, 31: 636-641, utilizaram uma hematoporfirina (DHE) e luz para tratar sangue normal ao qual foi adicionado HIV infeccioso. Isto foi efectuado para testar a eficácia do tratamento para tratar sangue destinado, por ex., a bancos de sangue. Isto é discutido na introdução na página 636. Na realidade, os autores não utilizam sangue infectado com HIV obtido de doentes com HIV. Mais exactamente, eles obtiveram sangue normal e adicionaram-lhe HIV de modo que os seus testes foram levados a cabo sobre HIV independente de células suspenso em sangue. Torna-se claro a partir da secção Discussão que o processo foi investigado tendo em vista o planeamento de processos para o tratamento de sangue destinado a bancos de sangue.

Verificou-se agora ser possível diminuir selectivamente os níveis de subconjuntos de leucócitos activados os quais se encontram associados com a infecção com o HIV ou outra disfunção imunitária utilizando os compostos de porfirina verde tais como aqueles descritos acima. Esta depleção pode ser realizada sem efeitos colaterais nas populações de células B, células CD4+, células CD8+ ou células NK funcionando normalmente. Quer os leucócitos após separação dos glóbulos vermelhos podem ser tratados utilizando o método do invento quer o sangue completo pode ser submetido a este tratamento.

84 792 ΕΡ Ο 642 342/ΡΤ

Descrição do Invento Ο invento proporciona um método para diminuir selectivamente a população de leucócitos activados num fluido corporal que apresenta níveis anormalmente elevados de marcadores da activação dos leucócitos. Um fluido corporal, isto é, medula óssea ou sangue ou uma sua fracção apropriada, é tratado com uma classe específica de agentes úteis em terapia fotodinâmica, seguido por irradiação do sangue ou fracção com pelo menos um comprimento de onda absorvido pelo fármaco. O tratamento pode ser conduzido in vivo, inteiramente extracorporeamente, ou parcialmente in vivo e parcialmente ex vivo.

Assim, num aspecto, o invento está orientado para um método de redução selectiva, in vitro, de níveis anormalmente elevados de leucócitos activados num fluido corporal, sendo os leucócitos cujos níveis são reduzidos células CD8+, células DR+ ou células IL-2R+, compreendendo o método: tratamento do referido fluido corporal ou de uma sua fracção contendo leucócitos activados com uma quantidade eficaz de um composto de porfirina verde (Gp); e irradiação do referido fluido tratado com luz compreendendo pelo menos um comprimento de onda absorvido pelo referido composto Gp.

Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6 em que o fluido contendo leucócitos activados é um fluido corporal, ou uma sua fracção, derivado de um doente infectado com o HIV.

Breve Descrição dos Desenhos

As Figuras 1A e 1B representam o efeito de Gp e da irradiação sobre diversos subconjuntos de leucócitos apresentando vários marcadores incluindo células B, células CD4+, células CD8+, células DR+ e células IL-2R+ no sangue de dois doentes infectados com HIV. A Figura 2 representa as concentrações relativas dos subconjuntos de leucócitos no sangue de um dador normal e de dois doentes infectados com HIV.

As Figuras 3A e 3B representam as concentrações relativas de subconjuntos de leucócitos no sangue de um dador normal e de um dador com HIV, respectivamente, antes e depois do tratamento com BPD e irradiação.

84 792 ΕΡ Ο 642 342/ΡΤ 5 A Figura 3C representa os níveis de células IL-2FT especificamente antes e depois do tratamento com BPD e irradiação em sujeitos normais e infectados com HIV. A Figura 5 representa as estruturas genéricas das várias porfirinas verdes úteis no invento. A Figura 6 representa as estruturas das porfirinas verdes preferidas -especificamente BPD-MA, MPD-MD, BPD-DA e BPD-DB.

Modos de levar a cabo o Invento

Um fluido corporal, tal como medula óssea ou sangue ou suas fracções apropriadas contendo níveis anormalmente elevados de leucócitos activados é tratado com um composto de porfirina verde, seguido por irradiação do fluido corporal ou sua fracção com radiação absorvida pela porfirina verde. O método do invento pode ser conduzido numa diversidade de protocolos - os dois elementos essenciais são assegurar que as porfirinas verdes se encontram associadas com as células cujas populações se destinam a ser reduzidas e que a porfirina verde associada com estas células é irradiada com o comprimento de onda apropriado. Tal como aqui utilizado, “fluido corporal” utilizado no método in vitro refere-se a fluidos corporais os quais contêm níveis anormalmente elevados de leucócitos activados a serem sujeitos a deplecção, os quais são células CD8\ células DR+ ou células IL-2R+. Os referidos fluidos corporais são tipicamente medula óssea ou sangue ou suas fracções.

As porfirinas verdes empregues no invento são compostos baseados em porfirina os quais foram quimicamente modificados de modo a exibirem máximo de absorção a 670 nm ou mais elevado. Através da utilização de porfirinas verdes, podem ser utilizados comprimentos de onda da radiação os quais são apenas minimamente absorvidos pelos tecidos e células de fundo tais como os glóbulos vermelhos. Isto permite a utilização de sangue completo, em oposição ao plasma, no método do invento. Embora a utilização de outros compostos, os quais são capazes de absorver a luz, tal como psoralen, tenha sido utilizada em processos de leucoforese envolvendo irradiação, a utilização de plasma nestes processos é obrigatória dado o comprimento de onda de absorção requerido. A conveniência da utilização de sangue completo é uma vantagem importante oferecida pela utilização, no presente invento, de porfirinas verdes. 84 792 ΕΡ Ο 642 342/ΡΤ 6

Embora a medula óssea também possa ser utilizada como substrato, a utilização do sangue do doente é frequentemente mais conveniente. Assim, num protocolo, sangue completo é recolhido a partir do sujeito e tratado com uma concentração adequada da porfirina verde durante um período de tempo suficiente para permitir que a porfirina verde se associe com as células alvo desejadas. O sangue completo é de seguida irradiado no recipiente ou aparelho extracorporal com o comprimento de onda apropriado, e o sangue irradiado tratado é devolvido ao doente.

Alternativamente, é administrada ao doente a porfirina verde ou suas misturas em formulações adequadas, tipicamente por injecção mas também por outras vias de administração tais como administração oral ou administração transmucosa. As composições lipossómicas são particularmente úteis. Depois de ter sido concedido tempo suficiente à porfirina verde para entrar na circulação sanguínea, uma fonte de radiação adequada pode ser aplicada ao organismo do doente; por exemplo, uma fibra óptica cateterizada pode ser inserida em posições adequadas na corrente sanguínea, ou pode ser empregue exposição transcutânea a luz externa. O sangue é de seguida irradiado in vivo.

Alternativamente, o sangue recolhido do doente pode ser separado em fracções, tipicamente numa fracção de glóbulos vermelhos e numa fracção de plasma enriquecido em leucócitos, e o plasma enriquecido em leucócitos é tratado com porfirina verde e irradiado antes da devolução do plasma (e dos glóbulos vermelhos se desejado) para o doente. Naturalmente, a separação em fracções pode ser conduzida em qualquer ponto durante o tratamento extracorporal de modo que a Gp pode ser adicionada ao sangue completo e o sangue ser subsequentemente separado em fracções de glóbulos vermelhos e fracções enriquecidas em leucócitos antes da irradiação da fracção enriquecida em leucócitos.

Sujeitos adequados para este tratamento incluem doentes infectados com HIV os quais mostraram apresentar níveis elevados de leucócitos activados, tais como DR+, mas especialmente células IL-2FT no seu sangue. Estes níveis podem ser selectivamente reduzidos pelo método do invento. Outros doentes que se espera que apresentem níveis elevados destas células incluem doentes que apresentam imunoactivação não desejada duma forma geral, tais como aqueles

84 792 ΕΡ Ο 642 342/ΡΤ 7 que são submetidos a doença enxerto-contra-hospedeiro ou a rejeição de transplante de órgão em resultado, por exemplo, de transplante de órgão ou de medula óssea, e aqueles que apresentam condições auto-imunes tais como artrite reumatóide, lupus eritematoso, distrofia muscular, ou miastenia grave. No que diz respeito a transplantes, podem ser tratados fluidos do órgão dador ou fluidos do doente receptor.

Tipicamente, as porfirinas verdes são administradas de modo a resultar numa concentração final no fluido ou fracção de fluido a ser tratado de 0,05-5 pg/ml, preferencialmente 0,1-1 pg/ml e o mais preferencialmente 0,5 pg/ml. O fluido ou fracção de fluido tratado é de seguida irradiado com luz de qualquer fonte adequada tal como um díodo de laser, um díodo emissor de luz e uma luz laser conduzida por fibra óptica. Comprimentos de onda típicos situam-se na gama de 600-790 nm, preferencialmente 630-710 nm, o mais preferencialmente 690-780 nm, e intensidades típicas encontram-se na ordem de 1-50 J/cm2, preferencialmente 5-25 J/cm2 e o mais preferencialmente 8-15 J/cm2. É preferida uma gama de comprimento de onda de 685-695 nm para estas intensidades. A irradiação é mantida durante 2-180 minutos, preferencialmente 15-120 minutos dependendo da natureza e concentração da porfirina verde, da quantidade de fluido tratado, da susceptibilidade das células do doente, da intensidade e do comprimento de onda da luz, e do método de irradiação (in vivo ou ex vivo). A optimização adequada da concentração da Gp e dos parâmetros da irradiação situa-se bem dentro da arte usual.

Com detalhe adicional no que se refere às porfirinas verdes úteis no invento, as estruturas gerais das porfirinas verdes típicas encontram-se representadas na Figura 5. As formas particularmente preferidas encontram-se representadas na Figura 6.

Esta série de Gp é seleccionada a partir de um grupo de derivados da porfirina obtidos utilizando reacções de Diels-Alder de derivados de acetileno com protoporfirina sob condições as quais produzem uma reacção em apenas uma das duas estruturas dieno não aromáticas conjugadas disponíveis presentes no sistema em anel da protoporfirina IX (anéis A e B). As fórmulas mostradas na Figura 5 representam porfirinas verdes típicas utilizadas no invento. Estes compostos encontram-se representados na figura com o hidrogénio ocupando os azotos do anel interno; no entanto, entende-se que também podem ser empregues 84 792 ΕΡ Ο 642 342/ΡΤ 8

as formas metalizadas nas quais um catião substitui um ou ambos estes hidrogénios. Também se compreende que estes compostos podem ser marcados quer por substituição de um ou mais dos átomos na estrutura pela sua forma radioactiva, quer por acoplamento a um radio-isótopo tal como um metal radioactivo ou, por exemplo, um radio-isótopo de iodo.

Por comodidade, uma abreviatura do termo derivado de hidromonobenzoporfirina - “BPD” - é geralmente utilizada para designar compostos de fórmulas 3 e 4 da Figura 5. Estas são as formas preferidas de Gp. Tal como representado na Figura 5, R\ R2, R3 e R4 são substituintes não interferentes os quais não afectam, de forma apreciável, o máximo de absorção exibido pelo composto. Mais tipicamente, R1 e R2 são grupos carbalcoxi, tipicamente carboxi ésteres de metilo ou etilo. Mais comummente R3 é 2-carboxietilo ou o seu éster de alquilo e R4 é vinilo. Estas concretizações preferidas resultam da disponibilidade de porfirinas nativas e não são obrigadas por considerações de eficácia biológica. Por “substituintes não interferentes" são designados substituintes os quais nem reduzem o comprimento de onda do máximo de absorção abaixo de 670 nm nem destroem a capacidade da porfirina verde de se alojar em leucócitos activados, nem interferem com o efeito da activação do composto pela luz sobre tecido biológico.

Também podem ser fornecidas formas diméricas da Gp, deste modo amplificando a capacidade do composto da Gp para absorver a luz numa base por mole. Também podem ser empregues formas diméricas e multiméricas de combinações Gp/porfirina, proporcionando comprimentos de onda de absorção adicionais.

As porfirinas verdes podem ser conjugadas com ligandos específicos reactivos com um alvo, tais como ligandos específicos para receptores ou imunoglobulinas ou porções imuno-específicas de imunoglobulinas, permitindo que se apresentem mais concentradas num tecido ou substâncias alvo desejados. Esta conjugação permite redução adicional dos níveis de dose necessários dado que o material não é desperdiçado na distribuição para outros tecidos cuja destruição, longe de ser desejada, deve ser evitada.

Quando a Gp é irradiada in situ utilizando luz na gama de absorção visível, a foto-activação resulta em citotoxicidade para o tecido envolvente. Embora o

84 792 ΕΡ Ο 642 342/ΡΤ 9 espectro de absorção também inclua comprimentos de onda mais curtos, existe um máximo de absorção especialmente útil na gama de 670-780 nm.

Tal como aqui utilizada, “porfirina verde” refere-se a um núcleo de porfirina modificado de modo a alcançar um comprimento de onda do máximo de absorção de 670 nm ou mais elevado. O máximo de absorção é controlado pelo sistema π conjugado do núcleo de porfirina. Na protoporfirina-IX dois dos pirrolos contêm substituições vinilo de modo que a ligação π exocíclica se encontra conjugada com uma das duas ligações π no anel. Uma reacção de Diels-Alder envolvendo um destes sistemas conjugados com um derivado acetileno dienófilo tem como resultado um ciclo-hexadieno fundido - aqui designado como “hidrobenzeno” -fundido ao anel A ou B, tal como representado nas fórmulas 1 e 2. O rearranjo do sistema π no anel hexadieno tem como resultado os compostos de fórmulas 3 e 4; a redução origina os compostos de fórmulas 5 e 6. Todos estes compostos proporcionam o desvio batocrómico desejado no máximo de absorção. A preparação específica de uma classe de compostos da Gp úteis no invento encontra-se descrita detalhadamente na patente dos E.U.A. 5 095 030 referenciada acima.

Para os compostos representados nas Figuras 5 e 6, duma forma geral, R1 e R2 são cada um, independentemente, substituintes recaptadores de electrões moderados, e são, o mais comummente, carbalcoxi, ou alquil- ou aril- sulfonilo, ou quaisquer outros substituintes activadores, os quais não são suficientemente captadores de electrões para ter como resultado a reacção com ambos os anéis A e B em vez da reacção com apenas um, tal como ciano ou -CONR5CO- em que R5 é arilo ou alquilo. Um de R1 e R2 pode facultativamente ser H enquanto o outro é um substituinte captador de electrões de força suficiente para facilitar a reacção de Diels-Alder.

Tal como aqui utilizado, carboxi é, tal como convencionalmente definido, -COOH e carbalcoxi é -COOR, em que R é alquilo; carboxialquilo refere-se ao substituinte -R’-COOH em que R’ é alquileno; carbalcoxialquilo refere-se a -R’-COOR em que R’ e R são alquileno e alquilo respectivamente. Alquilo é um hidrocarbilo de 1-6 átomos de carbono de cadeia linear ou ramificada, saturada, tal como metilo, n-hexilo, 2-metilpentilo, t-butilo, n-propilo, e assim por diante. Alquileno é tal como alquilo excepto por o grupo ser divalente. As porções aril- ou

84 792 ΕΡ Ο 642 342/ΡΤ alquil- sulfonilo apresentam a fórmula S02R em que R é alquilo tal como definido acima, ou é arilo, em que arilo é fenilo facultativamente substituído com 1-3 substituintes independentemente seleccionados a partir de halogéneo (flúor, cloro, bromo ou iodo), alquilo inferior (1-4C) ou alcoxi inferior (1-4C). Além disso, um ou ambos R1 de R2 podem, eles próprios, ser arilo - isto é, fenilo facultativamente substituído tal como definido acima.

Tal como representado na Figura 5, o aducto formado pela reacção de R1-C=C-R2 com o sistema em anel da protoporfirina IX (R3 é uma forma protegida de 2-carboxietilo tal como 2-carbometoxietilo ou 2-carboetoxietilo; R4 é CH=CH2) são compostos das fórmulas 1 e 2 em que o composto na fórmula 1 resulta da adição ao anel A e na fórmula 2 resulta da adição ao anel B. Nestes produtos resultantes de fórmulas 1 e 2, R4 permanece CH=CH2, embora este grupo vinilo seja prontamente derivado noutras concretizações de R4 pela adição ou oxidação do substituinte no anel vinilo do anel B na fórmula 1 ou do anel A na fórmula 2. Os produtos da adição ou da oxidação podem ser adicionalmente substituídos se os substituintes adicionados são grupos que se despedem funcionais - por exemplo, -Br pode ser substituído por -OH, -OR (R é alquilo 1-6C tal como acima), ou -NH2, -NHR, -NR2, etc. Em concretizações preferidas, um dos substituintes adicionados é hidrogénio, e o outro é seleccionado a partir do grupo constituído por halogéneo (flúor, cloro, bromo ou iodo), hidroxi, alcoxi inferior, amino ou uma amida, sulfidrilo ou um organossulfureto ou pode ser, ele próprio, hidrogénio. A adição ao grupo vinilo não modifica apreciavelmente o espectro de absorção do composto resultante. O produto da adição de água de Markonikov fornece uma estrutura substituinte análoga à do sistema em anel da hematoporfirina no anel relevante. Assim, os compostos do invento incluem diversos grupos como R4, incluindo substituintes e fornecem sistemas em anel da porfirina ou relacionados com a porfirina adicionais, tal como será adicionalmente descrito abaixo. R3 na protoporfirina-IX é 2-carboxietilo (-CH2CH2COOH). No entanto, a natureza de R3 (excepto se contém uma ligação π conjugada à ligação π do anel), é ordinariamente não relevante para o progresso da reacção de Diels-Alder ou para a eficácia e espectro de absorção do produto resultante. R3 pode por conseguinte ser, por exemplo, alquilo inferior (1-4C), ou 1-carboxialquilo (2-6C) ou os seus ésteres ou amidas. O substituinte R3 também pode ser substituído com halogéneo tal como definido acima, ou com outros substituintes não reactivos. Contudo, como os materiais de partida convenientes para os compostos da Gp do invento são 84 792 ΕΡ Ο 642 342/ΡΤ 11

porfirinas que ocorrem naturalmente, os substituintes preferidos para R3 são CH2CH2COOH ou -CH2CHR2COOR, em que R é alquilo (1-6C).

Nos compostos BPD do invento, verificou-se ser vantajoso hidrolizar ou hidrolizar parcialmente o grupo carboxi esterificado em -CH2CH2COOR. A hidrólise ocorre a uma velocidade muito mais rápida do que aquela dos grupos éster de R1, R2, e as características de solubilidade e de biodistribuição dos compostos resultantes são mais desejáveis do que aquelas da forma não hidrolizada. A hidrólise tem como resultado produtos di-ácido ou mono-ácido (ou seus sais).

As hidro-monobenzoporfirinas as quais resultam directamente da reacção de Diels-Alder descrita nas referências citadas também podem ser isomerizadas em compostos das fórmulas representadas como 3 e 4 da Figura 5.

As representações dos compostos 3 e 4 na Figura 5 não mostram a posição relativa do grupo metílo exocíclico (anel A da fórmula 3 e anel B da fórmula 4) em relação ao substituinte R2. Qualquer dos isómeros se encontra disponível.

Além disso, os produtos de Diels-Alder podem ser selectivamente reduzidos por tratamento com hidrogénio na presença de paládio sobre carbono a fim de originar os análogos do anel saturados, representados como as fórmulas 5 e 6 na Figura 5, correspondendo aos produtos de Diels-Alder respectivos dos anéis A e B. Estes produtos reduzidos são concretizações menos preferidas, e são menos úteis no método do invento do que os compostos de fórmulas 1-4. A descrição exposta acima com referência aos compostos de fórmulas 1 e 2 relativamente à derivação por conversão do substituinte vinilo restante (R4) e com referência à variabilidade de -R3 também se aplica aos compostos de fórmulas 3, 4, 5 e 6.

Os compostos de fórmulas 3 e 4 (BPD), e especialmente aqueles que hidrolizaram e hidrolizaram parcialmente grupos carbalcoxi em R3, são os mais preferidos. Compostos do invento os quais contêm -COOH podem ser preparados como o ácido livre ou sob a forma de sais com bases orgânicas ou inorgânicas.

Será anotado que muitos dos compostos da Figura 5 contêm pelo menos um centro quiral e consequentemente ocorrem como isómeros ópticos. Os

84 792 ΕΡ Ο 642 342/ΡΤ 12 conjugados e métodos do invento incluem compostos que possuem ambas as configurações dos carbonos quirais, quer os compostos sejam fornecidos como isolados de um único estereoisómero quer sejam misturas de enantiómeros e/ou diastereómeros. A separação de misturas de diastereómeros pode ser executada por qualquer meio convencional; as misturas de enantiómeros podem ser separadas por técnicas habituais da sua reacção com preparações opticamente activas e por separação dos diastereómeros resultantes.

Deve ser adicionalmente anotado que os produtos reaccionais podem ser misturas não separadas de adições ao anel A e B, por ex., misturas de fórmulas 1 e 2 ou 3 e 4 ou 5 e 6. Qualquer das formas separadas - isto é, fórmula 3 isolada ou 4 isolada, ou misturas em qualquer proporção podem ser empregues nos métodos de terapia e diagnóstico aqui expostos. A Figura 6 representa quatro compostos do invento particularmente preferidos os quais não foram previamente descritos na arte. Estes compostos são colectivamente designados por derivados benzoporfirina (BPD) dado que eles são formas de Gp que apresentam a fórmula 3 ou 4. Estas são formas hidrolizadas ou parcialmente hidrolizadas dos produtos rearranjados de fórmula 3 e 4, em que um ou ambos os grupos carboxilo protegidos de R3 se encontram hidrolizados. Os grupos éster em R1 e R2 hidrolizam relativamente tão lentamente que a conversão nas formas representadas na Figura 6 é facilmente efectuada.

Com o objectivo desta descrição, R3 é -CH2CH2COOR3. Tal como representado na Figura 6, cada R3 é H no composto preferido BPD-DA, R1 e R2 são carbalcoxi, e a derivação situa-se no anel A; BPD-DB é o composto correspondente em que a derivação se situa no anel B. BPD-MA representa a forma parcialmente hidrolizada de BPD-DA, e BPD-MB, a forma parcialmente hidrolizada de BPD-DB. Assim, nestes últimos compostos, R1 e R2 são carbalcoxi, um R3’ é H e o outro R3’ é alquilo (1-6C). Os compostos de fórmulas BPD-MA e BPD-MB podem ser homogéneos em que apenas o anel C carbalcoxietilo ou apenas o anel D carbalcoxietilo é hidrolizado, ou podem ser misturas dos hidrolizados do substituinte do anel C e D. Além disso, misturas de quaisquer dois ou mais de BPD-MA, -MB, -DA e -DB podem ser empregues no método do invento.

84 792 ΕΡ Ο 642 342/ΡΤ 13

Também se encontram incluídas nas Gp úteis no invento algumas outras concretizações em que R4 é outro que não vinilo ou em que R3 é um substituinte não nativo.

Duma forma geral, cada R1 e R2 é independentemente seleccionado a partir do grupo constituído por carbalcoxi (2-6C), alquilsulfonilo (1-6C), arilsulfonilo (6-10C), arilo (6-10C), ciano, e -CONR5CO- em que R5 é arilo (6-10C) ou alquilo (1-6C); cada R3 é independentemente carboxialquilo (2-6C) ou um seu sal, amida, éster ou acil-hidrazona, ou é alquilo (1-6C); e R4 é CHCH2, CHOR4, -CHO, -COOR4, CH(OR4')CH3, CH(OR4')CH2OR4', -CH(SR4')CH3i -CH(NR42)CH3, -CH(CN)CH3, -CH(COOR4)CH3, -CH(OOCR4')CH3, -CH(halogéneo)CH3, ou -CH(halogéneo)CH2(halogéneo), em que R4 é H, alquilo (1-6C) facultativamente substituído com um substituinte hidrofílico, ou em que R4 é um grupo orgânico de < 12C resultante da derivação directa ou indirecta de vinilo, ou em que R4 é um grupo contendo 1-3 núcleos do tipo tetrapirrolo da fórmula -L-P tal como aqui definida. São particularmente preferidos os compostos de fórmulas 3 e 4 e suas misturas. Também são preferidos aqueles em que R1 e R2 são iguais e são carbalcoxi, especialmente carboetoxi; também são preferidos aqueles em que R4 é -CHCH2, CH(OH)CH3 ou -CH(halogéneo)CH3, ou é um grupo contendo 1-3 núcleos do tipo tetrapirrol de fórmula -L-P (definida abaixo).

Tal como aqui utilizado, “núcleo do tipo tetrapirrolo” representa um sistema em quatro anéis com o esqueleto:

Me

o qual é '* abreviado

84 792 ΕΡ Ο 642 342/ΡΤ 14

e um seu sal, éster, amida ou acil-hidrazona, o qual é altamente conjugado. Inclui o sistema da porfirina, o qual é, na realidade, um sistema completamente conjugado, o sistema cloro, o qual é, na realidade, uma forma di-hidro da porfirina, e o sistema cloro reduzido, o qual é uma forma tetra-hidro do sistema completamente conjugado. Quando é especificado “porfirina”, é indicado o sistema completamente conjugado; Gp é efectivamente uma forma di-hidro do sistema porfirina.

Um grupo de compostos é aquele em que o substituinte R4 inclui pelo menos um núcleo do tipo tetrapirrolo adicional. Os compostos do invento resultantes são dímeros ou oligómeros nos quais pelo menos um dos sistemas em anel do tipo tetrapirrolo é Gp. A ligação entre a porção Gp através da posição de R4 a um sistema em anel do tipo tetrapirrolo adicional pode ser através de uma ligação éter, amina ou vinilo. Também pode ser formada a derivação adicional no caso de sistemas em anel da porfirina os quais apresentam duas posições de substituinte disponíveis (em ambos os anéis A e B) correspondendo a R4, tal como adicionalmente descrita abaixo.

Tal como exposto acima, os compostos de fórmulas representadas na Figura 5 incluem aqueles em que a concretização de R4 é formada pela adição aos grupos vinilo de produtos da Gp iniciais. Assim, R4 pode ser qualquer substituinte consistente com aquele formado por uma reacção de adição fácil. Assim, ambos os substituintes adicionados podem ser, por exemplo, OH ou halogéneo, e estes substituintes podem ser adicionalmente substituídos, ou o reagente de adição pode encontrar-se sob a forma HX em que H é adicionado ao carbono adjacente do anel a fim de providenciar R4 sob a forma -CH2CH3

I X. O grupo vinilo também pode ser oxidado a fim de obter R4 como CH2OH, -CHO, ou COOH e seus sais e ésteres.

Assim, em geral R4 representa quaisquer substituintes nos quais o grupo vinilo -CH=CH2 é prontamente convertido por clivagem ou adição, e resultantes adicionais da reacção de grupos que se despedem com porções adicionais. Substituintes R4 típicos incluem: 84 792 ΕΡ Ο 642 342/ΡΤ 15

-CH(HH2)M«, -CHCNHCO--CH (iaidaao L'eO Me,

-NO,)«e. CH(OH)Me, -CHBrMe, -CH(OMe)Me, -CH(brometo de piridínio)Me, -CH(SH)Me e o seu dissulfureto, -CHOHCH2OH, -CHO, e -COOH ou -COOMe.

Quando R4 é -L-P, a fórmula substituinte “-L-P” representa um substituinte em que -L- é seleccionado a partir do grupo constituído por -CH-O-CK-, -CHNHCH-, -CH=CH-CH-,

Me (c) -CH-C-CH» I II Me O (f)

Me MS Me Me (a) (b) -CH-CH»CH-, =CK-C-CH-,

I ' II I

Me O Me (d) (e) e P é seleccionado a partir do grupo constituído por Gp em que Gp tem a fórmula 1-6 representada na Figura 5, mas desprovida de R4 e conjugada através da posição representada na Figura 5 como ocupada por R4 até L, e uma porfirina da fórmula

©-© k3 t 84 792 ΕΡ Ο 642 342/ΡΤ 16

(Ã)-© OU

I I ©~® I s Ι3 em que R3 e R4 são tal como definidos acima, e a ligação não ocupada é de seguida conjugada a L. Entenda-se que a abreviatura

representa uma porfirina de fórmula:

em que cada R é independentemente H ou alquilo inferior (1-4C). (Também se compreende que quando -L- tem a fórmula (e) ou (f), o sistema em anel ao qual a ligação dupla está fixada apresentará um sistema de ressonância correspondendo a 84 792 ΕΡ Ο 642 342/ΡΤ 17

7

no anel ao qual a ligação dupla se encontra fixada, tal como representado.)

Preparação dos Dímeros e Oliaómeros

Os dímeros e compostos oligoméricos do invento podem ser preparados utilizando reacções análogas àquelas para a dimerização e a oligomerização de porfirinas per se. As ligações de porfirinas verdes ou de porfirina verde/porfirina podem ser feitas directamente, ou as porfirinas podem ser acopladas, seguindo-se uma reacção de Diels-Alder de qualquer uma ou de ambas as porfirinas terminais a fim de obter a conversão na porfirina verde correspondente.

Duma forma geral, as porfirinas verdes são preparadas por qualquer série de reacções as quais alteram o sistema de conjugação da ligação π do núcleo de porfirina de modo a desviar o máximo do comprimento de onda para o nível requerido. Os métodos para modificar quimicamente a porfirina a fim de alcançar este desvio no máximo do comprimento de onda são geralmente conhecidos na arte.

Os exemplos seguintes destinam-se a ilustrar mas não a limitar o invento. Exemplo 1

Resposta de Diversos Leucócitos a BPD e Irradiação

Foi recolhido sangue de dois doentes que se verificou estarem infectados com HIV. O sangue completo de cada um dos doentes foi levado até concentrações variáveis com BPD-MA e de seguida foi irradiado com luz a 10,8 J/cm2 utilizando luz de 690 nm emitida a partir de LED ao longo de 4 minutos. As populações de diversos subconjuntos de células T foram avaliadas por citometria de fluxo em comparação com controlos não tratados e a percentagem de células presentes como uma percentagem do controlo foram marcadas em gráfico como uma função da concentração de BPD-MA.

84 792 ΕΡ Ο 642 342/ΡΤ

Os resultados encontram-se representados nas Figuras 1A e 1B. Tal como indicado, a maioria das populações de células permaneceram relativamente constantes, incluindo as células B e as células CD4\ Foram observadas ligeiras reduções nas células CD8+ e nas células DR+. As células IL-2R+ mostraram uma redução drástica nos resultados do doente representado na Figura 1A a qual é dependente da dose em BPD-MA.

Tal como representado na Figura 1A, embora as células IL-2R* se apresentem drasticamente reduzidas, também são mostradas diminuições significativas para as células DR+ e CD8+. O efeito sobre as células DR+ encontra-se mais drasticamente representado para o segundo doente na Figura 1B.

Foram conduzidos estudos semelhantes com uma concentração constante de BPD-MA (0,5 pg/ml) utilizando como sujeitos um sujeito normal e dois doentes com HIV. A Figura 2 representa as subpopulações de leucócitos no sangue não tratado destes três dadores. Tal como representado na Figura 2, as células B e as células assassinas naturais ocorrem em níveis grosseiramente semelhantes em indivíduos normais e doentes com HIV; no entanto, doentes com ARC mostram consistentemente níveis diminuídos de CD4+ e níveis elevados de CD8+, DR+ e IL-2R+.

As Figuras 3A, 3B, e 3C mostram os efeitos do tratamento do invento. Tal como representado na Figura 3A, o tratamento de subpopulações de leucócitos no sangue normal apresenta pouco efeito sobre qualquer das populações representadas. A Figura 3B mostra que quando o sangue infectado com HIV é submetido a este tratamento, existe uma ligeira diminuição em CD8+, uma ligeira diminuição em DR+, e uma redução significativa nas células IL-2R+. A Figura 3C representa estes resultados especificamente para as células IL-2R+ quer para sujeitos normais quer para os dois doentes infectados com HIV. Novamente, é observada a redução drástica.

Assim, após tratamento com 0,5 pg/ml de BPD durante 4 minutos na presença de 10,8 J/cm2 de luz centrada a 690 nanómetros, as populações de células de todos os tipos celulares no sujeito normal, e todos os tipos celulares excepto IL-2R+ nos doentes com HIV permanecem relativamente constantes. As células DR+ e CD8+ apresentam-se ligeiramente diminuídas. O tratamento com BPD/luz parece apresentar pequeno ou nenhum efeito sobre a maioria das 19 84 792 ΕΡ Ο 642 342/ΡΤ subclasses de leucócitos; no entanto, os níveis elevados de células IL-2FT são restituídos ao normal.

Lisboa, -5. m. 20QI

Por QLT PHOTOTHERAPEUTICS, INC. e THE UNIVERSITY OF BRITISH COLUMBIA -O AGENTE OFICIAL-

Claims (8)

1. 84 792 ΕΡ Ο 642 342/ΡΤ 1/4

   REIVINDICAÇÕES 1. Método de redução selectiva, in vitro, de níveis anormalmente elevados de leucócitos activados num fluido corporal, sendo os leucócitos activados cujos níveis são reduzidos células CD8+, células DR+ ou células IL-2R+, compreendendo o método tratamento do fluido ou de uma sua fracção contendo leucócitos activados com uma quantidade eficaz de um composto de porfirina verde (Gp); e irradiação do fluido ou fracção tratado com luz compreendendo pelo menos um comprimento de onda absorvido pelo referido composto da Gp.
2. 2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que os leucócitos activados cujos níveis estão a ser reduzidos são células DR+.
3. 3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que o tratamento resulta numa concentração de Gp desde 0,05 até 5 pg/ml e/ou o fluido é sangue completo.
4. 4. Método de acordo com qualquer reivindicação precedente, em que a Gp apresenta uma das fórmulas:

   ch3 y ch3 2 >3 1 84 792 ΕΡ Ο 642 342/ΡΤ 2/4

   3 RÍ CH3 CH

   5 84 792 ΕΡ Ο 642 342/ΡΤ 3/4

   em que R1, R2; R3 e R4, representam todos substituintes não interferentes.
5. 5. Método de acordo com a reivindicação 4, em que o composto da Gp apresenta a fórmula 3 ou 4 e R1 e R2 representam carbometoxi ou carboetoxi, cada R3 representa -CH2CH2COOH- ou um seu sal, amida, éster ou acil-hidrazona; e R4 representa vinilo.
6. 6. Método de acordo com a reivindicação 5, em que o composto de Gp apresenta uma das fórmulas:

   COOH BPD-DA

   COOH BPD-DB

   BPD-MA 84 792 ΕΡ Ο 642 342/ΡΤ 4/4

   CH3 CH2 C00R BPD-MB em que cada um de R1 e R2; independentemente, representa carbometoxi ou carboetoxi e R representa metilo ou etilo.
7. 7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em que o fluido contendo leucócitos activados é um fluido corporal ou sua fracção derivada de um doente infectado com HIV.
8. 8. Utilização de um composto de porfirina verde (Gp) capaz de reduzir selectivamente a população de leucócitos activados num fluido corporal, compreendendo níveis anormalmente elevados de leucócitos activados ou fracção do referido fluido no fabrico de um medicamento para o tratamento de doença enxerto-contra-hospedeiro, rejeição de transplante de órgãos, HIV ou uma condição auto-imune outra que não psoríase num doente com as referidas doença enxerto-contra-hospedeiro, rejeição de transplante de órgãos, HIV ou condição auto-imune.

   Por QLT PHOTOTHERAPEUTICS, INC. e THE UNIVERSITY OF BRITISH COLUMBIA - O AGENTE OFICIAL -

   ENS.e ANTOMIO J ©A CUNHA FERREI RA' Ag. Of. Pr. Ind. βωο dos Flores, 74 · 4.' j 1200 LISBOA