CZ284616B6

CZ284616B6 - Očkovací látka, antigen, kódová rekombinantní DNA pro tento antigen, rekombinantní vektor a způsob výroby antigenu

Info

Publication number: CZ284616B6
Application number: CZ95970A
Authority: CZ
Inventors: Markus M. Dr. Simon; Ulrich E. Schaible; Klaus Prof.Dr. Eichmann; Michael Dr. Kramer; Wallich Dr. Reinhard
Original assignee: Max-Planck-Gesellschaft Zur Förderung; Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts
Priority date: 1989-09-19
Filing date: 1990-09-19
Publication date: 1999-01-13
Also published as: US5686267A; HU212716B; EP0643974B1; ES2129551T3; YU49370B; DE59010863D1; HU211228A9; DK0643974T3; EP0633028B1; JPH03209400A; FI102248B; NO315905B1; PT95349B; KR100202128B1; HU905816D0; SI9011773A; JP3205932B2; EP0633313B1; CZ456090A3; ATE186646T1

Abstract

Řešení se týká očkovací látky proti boreliose, která jako účinnou složku obsahuje antigen, imunologicky reagující s monoklovální protilátkou, specifickou pro B. burgdorferi. Řešení se týká rovněž antigenu, který je složkou, podmiňující účinek této očkovací látky, ko'dové DNA pro tento antigen a rovněž rekombinantního vektoru, který takouvou DNA obsahuje. Součástí řešení je také způsob výroby uvedeného antigenu.ŕ

Description

Očkovací látka, antigen, kódová rekombinantni DNA pro tento antigen, rekombinantni vektor a způsob výroby antigenu

Oblast techniky

Vynález se týká očkovací látky, antigenu, kódové rekombinantni DNA pro tento antigen, rekombinantního vektoru a způsobu výroby antigenu.

Dosavadní stav techniky

Borreliose-Lyme je v současné době nejčastějším infekčním onemocněním, které se přenáší klíšťaty. Toto onemocnění je vyvoláváno spirochetou Borrelia burgdorferi, tento mikroorganismus se přenáší na člověka především klíšťaty kmene Ixodes. Onemocnění je chronická progresivní infekce, napadající řadu orgánů, jako jsou kůže, centrální a periferní nervový systém, srdce, játra, ledviny a svalový a kostní systém. Vzhledem k tomu, že dostatečná léčba tohoto onemocnění antibiotiky je obtížná, je v současné době prováděna celá řada výzkumů změnit a zvýšit imunologickou odpověď na infekci uvedeným mikroorganismem. U lidí s tímto onemocněním byl zjištěn vysoký titr protilátek proti B. burgdorferi, tato skutečnost však nebyla žádným ukazatelem ochrany proti infekci. Je pravděpodobné, že původce infekce přechází velmi rychle z krevních cest do tkání, kde již není pro imunologický systém bezprostředně dosažitelný. To znamená, že ochrana protilátky je možná pouze bezprostředně po začátku infekce, kdy mikroorganismus se nachází ještě v krevních cestách.

Skutečnost, že přirozená infekce B. burgdorferi byla nalezena u řady živočišných druhů, vedla k pokusům vytvořit laboratorní modely pro uvedené onemocnění, až dosud s omezeným úspěchem. Při některých pokusech se specifickou odpovědí proti B. burgdorferi u myši bylo prokázáno, že infekce u inbredních myších kmenů, pěstovaných již delší dobu s izolátem B. burgdorferi, vedla k mírným, avšak významným patomorfologickým změnám různých orgánů, jako je mozek, srdce, plíce a ledviny, přičemž tyto změny byly srovnatelné se změnami u lidí s tímtéž onemocněním, jak bylo uvedeno v publikaci Schaible a další, 1988, Infect. Immun., 1, 41. Skutečnost, že se vytvořily pouze mírné změny, byla způsobena patrně poklesem schopnosti vyvolat protilátky a sníženou virulencí mikroorganismu, již dlouho pěstovaného in vitro, nebo schopnostmi myší vyvinout dostatečnou imunologickou odpověď, jak bylo popsáno v publikacích Johnson a další, 1984, J. Clin. Microbiol., 20, 747, Schwan a další, 1988, Infect. and Immun. 56, 1837.

Vynález si klade za úkol připravit účinnou očkovací látku proti uvedenému onemocnění. K tomuto účelu je zapotřebí nejprve získat vhodný laboratorní model. Bylo nyní navrženo užít kmen myší bez funkčních T- a B-buněk, tzv. kmen Scid—myší, popsaný v publikaci Bosma a další, 1983, Nátuře, 10, 52, protože tyto myši vyvinou po infekci B. burgdorferi ve formě izolátu vícesystémové onemocnění a převážně polyarthritis a karditis. Na tomto modelu je poprvé možno zkoušet účinnost očkovacích látek proti uvedenému onemocnění.

Podstata vynálezu

Podstatu vynálezu tvoří očkovací látka proti borelióze, která jako účinnou složku obsahuje alespoň jeden antigen, imunologicky reagující s monoklonální protilátkou, specifickou pro antigen OspA a/nebo Osp/B Borrelia burgdorferi.

Předmětem vynálezu je rovněž antigen, reagující s monoklonálními protilátkami podle vynálezu. Jde o antigen, který obsahuje celý řetězec aminokyselin OspA nebo OspB nebo jeho imuno

-1 CZ 284616 B6 logicky účinnou část (immunogenní epitop). Potenciální imunogenní epitop může zjistit bez obtíží každý odborník strukturní analýzou OspA (například podle Chou-Fassmannovy metody), pak je možno tyto fragmenty zkoumat a zjišťovat jejich účinnost.

Předmětem vynálezu je rovněž rekombinantní antigen, reagující s protilátkou podle vynálezu, přičemž kódový řetězec DNA pro antigen je uložen v rekombinantním vektoru, s výhodou prokaryotického původu, vhodném pro expresi bílkovin.

Zvláštním předmětem vynálezu je antigen z B. burgdorferi ZS7, specificky reagující s protilátkou podle vynálezu, s řetězcem aminokyselin z obr. 1 nebo s imunogenním epitopem tohoto řetězce. Vynález se rovněž týká rekombinantní DNA, která obsahuje 1) řetězec na obr. 1, nebo 2) řetězec nukleových kyselin, získaných z tohoto řetězce degenerací genetického kódu, všechny tyto řetězce jsou kódem pro antigen 31 kD z B. burgdorferi ZS7 nebo jeho imunogenní epitop.

Zvláště výhodný je antigen podle vynálezu, který je rekombinantní bílkovinou s beta-galaktosidázovým genem, a to s fúzí nebo bez ní.

Vynález se rovněž týká rekombinantního vektoru s obsahem jedné nebo většího počtu kopií rekombinantní DNA podle vynálezu. Může jít o prokaryotický nebo/a eukaryotický vektor, s výhodou prokaryotický vektor. Rekombinantní vektor může být uložen v buňce mimo chromozomy, například plazmid, nebo může být integrován do genomu buňky, například bakteriofág lambda. S výhodou jde o plazmid a zejména o rekombinantní vektor pZS-7/31-2, DSM 5528.

Vynález se rovněž týká způsobu získávání uvedených antigenů sledováním genové banky B. burgdorferi při použití protilátek podle vynálezu s izolací klonů, poskytujících pozitivní imunologickou reakci s použitou protilátkou.

Protože antigen podle vynálezu je možno použít také jako takový k aktivní imunizaci, tj. k indukci tvorby protilátek v organismu, týká se vynález také aktivní očkovací látky, obsahující jako účinnou složku uvedený antigen a popřípadě běžné nosiče a pomocné látky. S výhodou se tento antigen získá cestou genetické technologie.

Bylo možno prokázat, že podání nativního nebo rekombinantního OspA normálním myším vyvolá tvorbu protilátek, které po pasivním přenosu na Sci-myši chrání tyto myši před onemocněním. Zvláště bylo prokázáno, že rekombinantní OspA, vyvolává imunologickou odpověď, srovnatelnou s odpovědí na nativní OspA, takže je možno tuto látku užít pro výrobu vakcíny proti uvedenému onemocnění u lidí.

Vynález bude dále osvětlen příkladovou částí v souvislosti s přiloženými výkresy.

Přehled obrázků na výkresech

Na obr. 1 je znázorněna DNA a řetězec aminokyselin antigenů 31 kD, OspA zB. burgdorferi ZS7.

Na obr. 2 je uvedena imunologická charakteristika rekombinantní bílkoviny rZS7/31-2.

-2CZ 284616 B6

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Indukce arthritis, karditis a hepatitis u Scid-myší infekcí kmenem B. burgdorferi ZS7

Infekce myší B. burgdorferi

Dospělé myši kmene C.B-17 Scid (homozygot pro Sci-mutaci) a C.B-17 se infikují podkožní injekcí 1 x 50⁵, 5 x 10⁵, 1 x 10⁶ nebo 1 x 10⁸ životaschopných nebo usmrcených (UV-světlo) B. burgdorferi do kořene ocasu.

Izolace B. burgdorferi z klíšťat a myší

Výzkumy byly prováděny sjiž dlouho pěstovaným kmenem B. burgdorferi B31, ATCC 35210 a s čerstvým izolátem ZS7, DSM 5527, který byl izolován z klíštěcí samice kmene Ixodes rizinus. Všechny kmeny B. burgdorferi byly pěstovány v modifikovaném Kellyho prostředí z publikace Barbour a další, 1983, Switzerland. Curr. Microbiol. 8, 123, Organismy, izolované ze středního střeva klíšťat, sterilizovaných ethanolem, nebo z krve infikovaných myší byly zpočátku pěstovány v Kellyho prostředí s přidáním 8 mikrogramů/ml kanamycinu a 230 mikrogramů/ml fluoruracilu podle publikace Johnson a další, 1984, J. Clin. Microbiol., 1, 81.

Sérologické testy

Zjištění specifických protilátek proti B. burgdorferi se provádí běžným testem ELISA podle publikace Justus a další, 1988, Wehrmed. Mschr., 32, 263. Standardní křivka pro obsah imunoglobulinu (Ig) byla získána převrstvením vyhloubení Ig myším (ředění 1 : 500 roztoku séra, Paesel, Frankfurt, SNR) a titrací obsahu celkového množství IgG nebo IgM proti myši (Calbiochem, LaJolla, USA). Obdobným způsobem byl měřen celkový obsah IgM a IgG v séru. Koncentrace těchto specifických protilátek se udává v mikrogramech/ml séra, vztaženo na Ig.

Imunofluorescence a barvení podle Giemsy mikrolitrů krve se napipetuje do zkumavek hematokritu (Becton a Dickinson, Heidelberg, NSR) a pak se odstředí při 5000 g v odstředivce pro hematokrit (ECCO, NSR). Zkumavky se rozříznou ve fázi mezi sérem a erythrocyty a 5 mikrolitrů séra se nanese na nosič (Superior, Bad Mergentheim, NSR). Nosič se vzorkem séra se suší na vzduchu a pak se fixuje 100% ethanolem 1 minutu při -20 °C. Po inkubaci 1 hodinu s králičím hyperimunním sérem proti B. burgdorferi v ředění 1 : 100 při teplotě místnosti se nosič pětkrát promyje PBS a pak se jednu hodinu barví při použití kozího antiséra proti králíkům, konjugovaného s FITC (ředění 1 :20, Jackson Lab., West Grove, USA). Pak se nosič promyje, uloží do směsi glycerolu a želatiny (Měrek, Darmstadt, NSR) a okamžitě se sleduje ve fluorescenčním mikroskopu. Neošetřené kapky krve se usuší na vzduchu, fixují v methanolu, barví se podle Giemsy (0,1 %, Měrek, Darmstadt, NSR), odbarví v PBS a uloží do prostředku Entellan (Měrek, Darmstadt, NSR).

Histologické preparáty a postupy při barvení

Různé vnitřní orgány, jako mozek, srdce, plíce, játra, ledviny, slezina a klouby myší, infikovaných B. burgdorferi, se v různé době po infekci odstraní a uschovají buď v kapalném dusíku pro přípravu zmrazených řezů, nebo v 5% formaldehydu v PBS pro uložení do parafínu nebo methakrylátu. Pak se vytvářejí řezy o tloušťce 4 až 7 mikrometrů, které se barví HematoxylinemEosin a pak se ukládají do prostředku Entellan (Měrek AG, Darmstadt, NSR). Imunohistologické

-3 CZ 284616 B6 sledování se provádí při použití systému s obsahem streptavidinu, biotinu a peroxidázy podle publikace Kramer a další, 1989, Eur. J. Immunol, 19, 151.

Následující tabulka 1 ukazuje, že organismy B. burgdorferi, izoláty ZS7 a B31, bylo možno 5 zjistit v krvi Scid-myší, naočkovaných životaschopnými mikroorganismy, po celou dobu pokusu.

Jinak bylo možno rekultivovat pouze spirochety kmene ZS7, avšak nikoliv kmene B31 in vitro. Při srovnání rekultivovaných organismů s primárním izolátem ZS7 nebylo možno prokázat žádné změny v oblasti bílkovin nebo v profilu plazmidu. Po celou dobu pozorování bylo možno u Scidmyší, infikovaných B. burgdorferi, prokázat jen velmi malý nebo žádný titr irelevantních ío protilátek. Nebylo možno prokázat žádné protilátky typu IgM- nebo IgG, specifické proti uvedenému mikroorganismu. Naproti tomu docházelo u kontrolních myší C.B-17, rovněž infikovaných, k expresi velkého množství celkových protilátek Ig a současně bylo možno prokázat vysoký titr specifických protilátek IgM a IgC proti B. burgdorferi. Mezi 7 a 22 dnem po infekci izolátem ZS7 bylo možno pozorovat u Scid-myší první klinické příznaky zánětů kloubů, 15 a to zčervenání a otok obou tibioterálních kloubů, stav se zhoršoval. Nebylo však možno pozorovat žádné takové příznaky u Scud-myší, infikovaných izolátem ZS7 po jeho ozáření UVsvětlem, nebo izolátem B31, a to životaschopným, ani u kontrolních myší C.B-17, infikovaných životaschopným izolátem ZS7.

Také histopatologicky bylo možno prokázat kloubní změny u Scid-myší, infikovaných životaschopným izolátem ZS7, jak je zřejmé z tabulky 1. Bylo možno prokázat těžké poškození kloubů, které se projevovalo zánětlivou hyperplasií synoviální výstelky, spojenou s rozpuštěním chrupavky a/nebo kosti. Dále byl zjištěn zánět celého srdce s průnikem mononukleámích buněk do endokardu, myokardu a perikardu. Dále bylo možno pozorovat progresivní zánět jater, 25 přičemž bylo možno pozorovat vznik jatemí fíbrózy, infiltrace mononukleámích buněk byla omezena na oblast portální žíly a velkých žil. Mimoto bylo možno pozorovat menší poškození hlavy, plic, mozku a příčně pruhovaných svalů.

-4CZ 284616 B6

-A Ά c c

O Φ

E

Sb zi.

o

u. cu bů

=L oo MD

I I I I I m o I I eo o CM — MD CM CM

MD 00 O cn —

TT

I •A -A c c

CN

CN in

CN

Infekce Scid-myší C.B-17 a kontrolních myší C.B-17, reizolace spirochety, titr protilátek, arthritis

ώ o o

C3

Q. O

5Λ

c o Ξ

CQ OQ CQ + + +

I ₊ ^ffl + -A -A c c

JD

C

JĎ e

o cu

+ -A -A c c

Ό	Os	θ'-		CN	θ'	C- 1	Ό Ό (Ί	CS	CN	O	o
	’ςΤ		CN	CN	CN	00 ¹	¹ — CN	CN	CN	CN	— CN

4>

X-> o cu

o

Té rC/0

N r-~-r~~

CZ)(Z)

NN r—

CZ) >

cz>

N <<·>

OQ o

Té r~ co N ¹ — ca 12 II r O C UJ [Λ l f-T ffl II O S *: Giemsovo barvení nebo imunofluorescence,^xx: izolace z krve (B) nebo kloubů (G) °: + znamená zrudnutí a otok tibiotarsálních kloubů, °°: - znamená méně než 7,5 pg/ml séra n.b.: nebylo provedeno

Příklad 2

Klonování a exprese antigenu 31kD (OspA) z B. burgdorferi ZS7

Příprava DNA

Vysokomolekulámí DNA z kmene B. burgdorferi ZS7 byla čištěna po kultivaci v modifikovaném Kellyho prostředí. Spirochety byly peletovány odstředěním při 10 000 g a třikrát promyty PBS-pufrem. Usušená peleta byla znovu suspendována v 10 ml TE s obsahem 10 mmol/1 tris a 1 mmol/1 EDTA při pH 4, pak byl na 15 minut při teplotě 30 °C přidán lysozym v množství 5 mg/ml, načež byla DNA uvolněna přidáním 1 ml 20% SDS. Po přidání 1,5 ml roztoku NaCl s obsahem 5 mol/1 byl roztok extrahován stejným objemem fenolu a pak chloroformem. DNA pak byla vysrážena přidáním dvou objemů absolutního ethanolu s následnou inkubací přes noc při teplotě -20 °C. Po odstředění byl zbytek rozpuštěn v 0,5 ml TE, pak byl inkubován s DNA-ázou, prostou RNA-ázy A (20 mikrogramů/ml) po dobu 45 minut při teplotě 55 °C, načež byla na jednu hodinu při teplotě 37 °C přidána proteináza K v množství 0,1 mikrogramů/ml. Pak byl přidán NaOAc do koncentrace 0,3 mol/1 a směs byla jako svrchu extrahována fenolem a chloroformem. Po vysrážení ethanolem byla DNA znovu uvedena do roztoku v TE.

Příprava genové banky

Vysokomolekulámí DNA byla statisticky rozdělena na menší části působením ultrazvuku podobu 3 sekundy. Pak byla užita T4-DNA-polymeráza (30 minut při 37 °C) a Kenowův enzym (5 minut při 20 °C) k vyrovnání zakončení vzniklých fragmentů. Vzniklá DNA byla pak navázána do místa štěpení enzymu BamHI vektoru pro expresi pUEXl při použití strategie klonování použitím adaptéru podle publikace Bresan und Stanley, 1987, Nucl. Acid. Res., str. 1056. Po selekci podle velikosti při použití chromatografie s molekulárním sítem a prostředku Sephacryl S-1000 a po transformaci kompetentních buněk E. coli MC 1061 byl podíl rekombinantních jednotek pro tvorbu plaků (pfu) stanoven následujícím způsobem. Náhodně zvolené kolonie byly odebrány a pěstovány ve 2 ml selekčního prostředí LB s 25 mikroorganismy/ml ampicilinu až do nasycení. DNA plazmidu byla pak izolována běžným rozpuštěním za alkalických podmínek a pak byla rozštěpena enzymem BamHI. Více než 50 % analyzovaného plazmidu obsahovalo včleněné řetězce DNA se středním průměrem > 1,5 kb.

Pěstování na plotnách a screening genové banky B. burgdorferi SZ7

Buňky byly naneseny na desku s rozměrem 24 x 24 cm v množství 7000 pfu na jedné desce a byly inkubovány přes noc při teplotě 30 °C. Po přenosu kolonií na nitrocelulózový filtr (NC) byla indukována exprese složené bílkoviny s obsahem beta-galaktosidázy dvouhodinovou inkubací při teplotě 42 °C. Filtr byl přenesen na papír Whatman 3MM, předem zpracovaný 5% SDS a papír byl inkubován 25 minut při teplotě 95 °C. Pak byly bílkoviny podrobeny elektroblotu při použití běžného zařízení k provedení metody Western blot při použití částečně usušeného materiálu. Po zpracování NC-filtrů DNA-ázou byly imunoreaktivní klony identifikovány za použití monoklonálních protilátek. Nespecifická vazná místa na NC-filtrech byla vysycena čtyřhodinovou inkubací s PBS s obsahem 0,2 % hmotnostních želatiny a 3 mmol/1 MaN₃ při teplotě místnosti. Nakonec byly filtry inkubovány 18 hodin za stálého protřepávání se supematanty kultury anti-31 kD monoklonálního klonu LA-2. Po důkladném promytí (PBS + 1 % objemové Tritonu X-100), pak PBS + 0,5 mol/1 chloridu sodného a nakonec PBS + 1 mol/1 chloridu sodného, každý stupeň trvá 10 minut, byly filtry inkubovány 1,5 hodiny při teplotě místnosti za stálého protřepávání s králičí protilátkou proti myšímu IgG, značenou peroxidázou F(ab)₂ v ředění 1 : 10 000. Filtry byly znovu promyty jako svrchu a pak byly

-6CZ 284616 B6 inkubovány s diaminobenzidinem jako substrátem pro peroxidázu. Z 10⁴ rekombinantních pfu reagovalo 20 klonů s monoklonální protilátkou LA-2.

Analýza řetězce antigenu 31 kD (OspA)

Běžným způsobem byla izolována včleněná DNA rekombinantního kmene E. coli, klonu s pozitivní reakcí s protilátkou LA-2. Včleněná DNA tohoto klonu obsahovala gen OspA, který je kódem pro antigen 31 kD B. burgdorferi v celé jeho délce. Plazmid, který obsahoval tento řetězec, byl označen pZS-7/31-2 a byl označen podle budapešťské úmluvy a uložen do veřejné sbírky pod číslem DSM 5528.

Rekombinantní bílkovina, produkovaná tímto pozitivním klonem, byla označena rZS7/31-2 a byl stanoven kódový řetězec DNA genu OspA. Tento řetězec je uveden na obr. 1 společně s odvozeným řetězcem aminokyselin pro bílkovinu OspA.

Z obr. 1 je rovněž zřejmé, že antigen 31 kD zB. burgdorferi je bílkovina, která obsahuje 273 aminokyselin.

Příprava nesložené bílkoviny

a) Klon, u nějž dochází k expresi imunoreaktivní bílkoviny rZS7/31-2, byl pěstován přes noc při 30 °C v 10 ml prostředí LB s ampicilinem. 1 ml kultury byl pak přidán ke 100 ml selekčního prostředí a materiál byl pěstován při 30 °C za provzdušňování až do hustoty 8 x 10⁷ buněk v 1 ml (Αβοο + 0,2). Exprese rekombinantních bílkovin bylo dosaženo přenesením buněk do teploty 42 °C. Po zchlazení a odstředění byly buňky promyty pufrem STE, který obsahoval 10 mmol/1 tris, 100 mmol/1 chloridu sodného a 1 mmol/1 EDTA při pH 8,0 a získaný materiál byl znovu uveden do suspenze v 0,6 ml pufru pro rozrušení buněk s obsahem 25 % sacharózy a 50 mmol/1 tris při pH 8,0. Po přidání 150 mikrolitrů roztoku s obsahem 10 mg/ml lysozymu byla směs inkubována 15 minut v ledu a pak ještě dalších 15 minut v ledu za přítomnosti 18 mikrolitrů roztoku s obsahem 10 mg/ml DNA-ázy 1 za přítomnosti 5 mikrolitrů 1 mol/1 chloridu hořečnatého. Pak bylo přidáno 250 mikrolitrů 4x směsi smáčedel (1 % Triton X-100, 0,5% Deoxycholátu, 0,1 mol/1 NaCl, 10 mmol/1 tris, o pH 7,4) a směs byla znovu inkubována 5 minut v ledu. Po odstředění byla usazenina dvakrát promyta pufrem A (50 mmol/1 tris, 50 mmol/1 NaCl, 1 mmol/1 EDTA o pH 8,0) a pak byl materiál znovu uveden do suspenze v devíti objemech pufru A s obsahem 8 M močoviny a směs byla jednu hodinu inkubována při teplotě místnosti. Pak byl vzorek zředěn devíti díly pufru B (50 mmol/1 dihydrogenofosforečnanu a hydrogenfosforečnanu draselného, 50 mol/1 NaCl, 1 mmol/1 EDTA o pH 10,7), směs se ještě 30 minut míchá při teplotě místnosti a pH se udržuje hydroxidem draselným na hodnotě 10,7. Pak se pH roztoku upraví na 7,0 přidáním kyseliny chlorovodíkové a vzorek se dialyzuje přes noc proti pufru A při teplotě 4 °C, pak 10 minut při teplotě 4 °C, načež se odstřeďuje 10 minut při teplotě 4 °C a 10 000 ot/min (rotor SS34). Supematant s obsahem rekombinantní bílkoviny se uchovává při -20 °C.

b) Vzhledem ktomu, že tento klon vylučuje imunoreaktivní bílkovinu rZS7/31-2 také do živného prostředí, je možné čištění afinitní chromatografíe přímo ze supematantu kultury.

Příprava rekombinantní nesložené bílkoviny OspA a čištění afinitní chromatografii

Rekombinantní bílkoviny pak byly čištěny afinitní chromatografii. K tomuto účelu byly na aktivovanou Sepharose CL 4B kovalentně vázány čištěné monoklonální protilátky LA-2. Dialyzovaný extrakt močoviny byl s rekombinantní bílkovinou navázán na Sepharose CL 4B s myším IgG a nakonec byla tato směs přidána do sloupce LA-2-Sepharosy CL 4B. Po intenzivním promytí byla vázaná rekombinantní bílkovina podrobena eluci směsí 0,1 mol/1 glycinhydrochloridu a 0,1 mol/1 NaCl o pH 2,5. Pak bylo pH této frakce neutralizováno

-7CZ 284616 B6 okamžitým přidáním 1/10 objemu 0,5 mol/1 K₂HPO₄. Frakce s obsahem bílkoviny byly koncentrovány a dialyzovány. Pomocí elektroforézy na SDS-polyakrylamidovém gelu byl stanoven stupeň čistoty.

Imunologická charakteristika rekombinantní bílkoviny rZS7/31-2

Rekombinantní bílkoviny tZS7/31-2 byla imunologicky zkoumána. Pro srovnání byla užita rekombinantní bílkovina rB31/41—9 (povrchový antigen 41 kD B. burgdorferi).

Mikrotitrační plotny s plochým dnem byly převrstveny extraktem rekombinantní bílkoviny rZS7/31-2 a rB31/41-9 s použitím extraktu močoviny, popřípadě extraktem kmene E. coli MC 1061, který byl použit k expresi genu. Nespecifická vazná místa byla blokována 0,2% želatinou v roztoku chloridu sodného s obsahem fosfátového pufru. Do vyhloubení takto připravených mikrotitračních ploten byly přidány monoklonální protilátky LA-2 (anti-31 kD, Osp-A), La-1 (anti-41 kD, Flagellin) a ACHT-2 (anti-alfai-Antichymotrypsin).

Vázané monoklonální protilátky byly uvedeny do reakce s imunoglobuliny, specifickými proti myším a značenými peroxidázou. Vázané protilátky, značené peroxidázou, byly kvantitativně stanoveny pomocí artofenylendiaminů jako substrátů pro peroxidázu. Absorpce při 492 nm (A₄9₂) byla stanovena přímo na mikrotitrační plotně pomocí automatizovaného fotometru. Velikost absorpce je přímo úměrná množství vázané monoklonální protilátky.

Monoklonální protilátka LA-2 specificky reaguje s bílkovinou rZS7/31-2, avšak nikoliv s MC 1061 nebo rB31/41-9. Kontrolní reakce monoklonální protilátky LA-1 je specifická pro rB31/41-9. Monoklonální protilátka ACHT-2 (negativní kontrola) se neváže na žádnou z uvedených bílkovin.

Na obr. 2 je znázorněno, že dochází k expresi antigenního epitopu na rekombinantní bílkoviny rZS7/31-2 po klonování zgenomu B. burgdorferi ZS7, přičemž tento antigenní epitop je specificky rozpoznáván monoklonální protilátkou LA-2.

Získání monoklonální protilátky

Při imunizaci myši s neporušeným imunologickým systémem dochází při infekci B. burgdorferi k expresi polyklonálních protilátek, specifických pro B. burgdorferi, jak je zřejmé z tabulky 1.

Myší samice imbredního kmene BALB/c ve stáří 10 týdnů byly imunizovány B. burgdorferi, kmenem B31, ATCC 35 210, kmen byl homogenizován ultrazvukem. Imunizace byla prováděna následujícím způsobem:

Den 0: 200 mikrogramů Borrelia v úplném Freundově pomocném prostředku podkožně.

Den 21, 35, 49, 63: dalších 100 mikrogramů antigenu intraperitoneálně ve fyziologickém roztoku chloridu sodného, obsahujícím fosfátový pufr.

Den 66: vyjmutí sleziny a získání suspenze jednotlivých buněk.

Imunní slezinné buňky byly podrobeny fůzí s myelomovou buněčnou linií Ag8-PAI standardním způsobem při použití polyethylenglykolu podle publikace J. H. Peters, H. Baumgarten, M. Schulze, Monoklonale Antikórper, Springer-Verlag, Heidelberg.

Produkty fúze byly naočkovány do desek s 96 vyhloubeními. Po osmi dnech byly supematanty kultury sledovány zkouškou ELISA v pevné fázi na přítomnost specifických monoklonálních protilátek proti B. burgdorferi podle svrchu uvedené publikace J. H. Peters a dalších.

-8CZ 284616 B6

Buňky hybridomu z kultur, produkujících protilátky, byly po zředění dále klonovány. Supematanty kultur jednotlivých klonů byly znovu vyšetřeny zkouškou ELISA v pevné fázi, analýzou Westem-Blot a immunifluorescencí. Monoklonální protilátky LA-2 podtřídy IgG2b byly produkovány monoklonální linií hybridomu a touto linií rovněž vylučovány a reagovaly při zkoušce Westem-Blot se strukturou 31 kDa (Osp-A) všech vyšetřovaných kmenů B. burgdorferi, mimo jiné také izoláty ZS7 a B31. Tyto protilátky byly děleny elektroforeticky na SDS-gelu a také zkouškou Westem-blot pomocí bílkoviny B. burgdorferi přeneseny na membránu. Monoklonální protilátky LA-26.1C (anti-OapA IgGl), LA 25.1 (anti-OspB, 34 kDa antigen, IgG2b) a La 27.1 (anti OspB, 34 kDa antigen, IgGl) je možno získat a charakterizovat analogickým způsobem.

Příklad 3

Vliv antiséra myší, imunizovaných OspA, na průběh onemocnění u Scid-myší

V tomto pokuse bylo prokazováno, že podání nativního OspA, izolovaného z B. burgdorferi ZS7, nebo rekombinantního OspA, izolovaného z bakterií E. coli, transformovaných rekombinantním plazmidem pZS-7/31-2, DSM 5528, vyvolává u normálních myší kmene C57BL/6 tvorbu ochranných polyklonálních protilátek. V případě, že tyto protilátky jsou podány Scidmyším, chrání proti onemocnění. Bylo tedy možno prokázat, že rekombinantní OspA vyvolává ochrannou imunologickou odpověď, srovnatelnou s odpovědí na nativní OspA. Výsledky a podrobnosti pokusu jsou uvedeny v tabulce 2.

Získání rekombinantního OspA je uvedeno v příkladu 2.

Získání nativního OspA a imunizace myší tímto materiálem bude dále popsána.

Získání nativního 3 lkDa OspA

3,2 x 10¹⁰ spirochet se míchá dvě hodiny při 4 °C v 5 ml PBS/7,5 ml n-butanolu za přítomnosti inhibitoru proteázy (5 mmol/1 EDTA, 5 mmol/1 benzamidinu a 0,5 mmol/1 PMSF) při použití magnetického míchadla. Pak se směs odstřeďuje 90 minut s 10 000 ot/min a 4 °C v odstředivce (Sorvall). Vodná fáze s obsahem povrchové bílkoviny se izoluje a třikrát promyje chloroformem. Obsah bílkoviny se zjistí extinkcí při 280 nm nebo testem BCA.

V gelu s obsahem stříbra nebo metodou Western blot s králičím sérem proti B. burgdorferi lze prokázat pro kmen ZS7 hlavní pás s molekulovou hmotností 31 kj a slabší pásy při 20, 34 a 65 až 68 kj. Ve směsi butanolu a vody poskytuje kmen B31 hlavní pás při 31 kj a slabší pásy 20 a 34 kj.

Imunizace myší nativním a rekombinantním OspA

Myši C57BL6 a myši C.B-17 byly očkovány třikrát v odstupu 7 až 10 dnů podáním 5 mikrogramů nativního OspA kmene B31 nebo 10 mg nativního OspA kmene ZS7 nebo rekombinantního OspA téhož kmene ve 100 mikrolitrech pomocného prostředku (ABM3, Fa. Sebak, Aidenbach, NSR) podkožně v oblasti kořene ocasu. Nejdříve 3 týdny po posledním podání bylo možno odebírat sérum 3 až 4 měsíce. Obsah specifických protilátek byl stanoven metodou ELISA.

-9CZ 284616 B6

Tabulka 2

Vliv specifických monoklonálních a polyklonálních protilátek proti B. burgdorferi na spirochetózu a vývoj zánětu kloubů u infikovaných Scid-myší.

Scid-myší ošetření vývoj zánětu kloubů průkaz

C.B-17 týdny B. burgdorferi

2 3

n = 6	PBS (negativní kontrola)	+	+	+	6/6
n = 6	LA-2	-	-	-	0/3
n = 2	anti OspA (nativní) IMS	-	-	-	0/2
n = 3	anti OspA (rekomb.) IMS	—	—	—	0/3

První dávka protilátky byla podána intraperitoneálně v objemu 100 μΐ ve dni 0, tj. současně s infekcí B. burgdorferi ZS-7,1 x 10⁸ organismů podkožně do oblasti kořene ocasu.

Další dávky protilátek byly podány ve dnech 4 (100 μΐ), 7 (200 μΐ), 11 (200 μΐ), 14 (300 μΐ), 18 (300 μΐ), vždy intraperitoneálně.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Očkovací látka proti borelióze, vyznačující se tím, že jako účinnou složku obsahuje alespoň jeden antigen, imunologicky reagující s monoklonální protilátkou, specifickou pro antigen OspA a/nebo OspB Borrelia burgdorferi.
2. Očkovací látka podle nároku 1, vyznačující se tím, že obsahuje antigen, imunologicky reagující s monoklonální protilátkou, specifickou pro OspA Borrelia burgdorferi.
3. Očkovací látka podle nároku 1, vyznačující se tím, že obsahuje antigen, imunologicky reagující s monoklonální protilátkou, specifickou pro OspA kmenů ZS7-DSM 5527 a/nebo B31-ATCC 35 210 Borrelia burgdorferi.
4. Očkovací látka podle nároku 1, vyznačující se tím, imunologicky reagující s monoklonální protilátkou, specifickou ZS7-DSM 5527 nebo/a B31-ATCC 35 210 Borrelia burgdorferi.

že obsahuje antigen, pro OspB kmenů
5. Očkovací látka podle nároku 3, vyznačující se tím, že obsahuje antigen, imunologicky reagující s monoklonální protilátkou, specifickou ze skupiny IgG, s výhodou podskupiny IgG2b nebo IgGl.
6. Očkovací látka podle nároku 4, vyznačující se tím, že obsahuje antigen, imunologicky reagující s monoklonální protilátkou, specifickou ze skupiny IgG, s výhodou podskupiny IgG2b nebo IgGl.
7. Očkovací látka podle nároků 3a 4, vyznačující se tím, že obsahuje rekombinantní antigen, získaný genetickou technologií.

- 10CZ 284616 B6
8. Očkovací látka podle nároku 4, vyznačující se tím, že obsahuje rekombinantní antigen, získaný genetickou technologií.
9. Antigen, imulogicky reagující s monoklonální protilátkou, specifickou pro OspA Borrelia burgdorferi.
10. Antigen podle nároku 9, imunologicky reagující s monoklonální protilátkou, specifickou pro OspA kmenů ZS7 nebo/a B13 Borrelia burgdorferi.
11. Antigen podle nároku 9 nebo 10, imunologicky reagující s monoklonální protilátkou ze skupiny IgG, s výhodou IgG2b nebo IgGl.
12. Antigen, specificky reagující s monoklonální protilátkou, specifickou pro OspB Borrelia burgdorferi.
13. Antigen podle nároku 12, imunologicky reagující s monoklonální protilátkou, specifickou pro OspA kmenů ZS7 nebo/a B13 Borrelia burgdorferi.
14. Antigen podle nároku 12 nebo 13, imunologicky reagující s monoklonální protilátkou ze skupiny IgG, s výhodou IgG2b nebo IgGl.
15. Antigen podle nároku 9, jehož kódový řetězec DNA je uložen ve vektoru, s výhodou prokaryotickém vektoru, vhodném pro expresi bílkoviny.
16. Antigen podle nároku 12, jehož kódový řetězec DNA je uložen ve vektoru, s výhodou prokaryotickém vektoru, vhodném pro expresi bílkoviny.

17. Antigen podle nároků 9 až 11 nebo 15, obsahující následující řetězec aminokyselin nebo imunogenní epitop, který je částí tohoto řetězce:

M K K Y L L G I G L I L A L I A C K Q N V S s L D E K N S V s V D L P G E M N V L V s K E K N K D G K Y D L I A T V D K L E L K G T S D K N N G S G v L E G V K A D K S K V K L T I s D D L G Q T T L E V F K E D G K T L V s K K. V T s K D K S S T E E K F N E K G E V s E K I I T R A D G T R L E Y T E I K s D G s G K A K E V L K S Y V L E G T L T A E K T T L V V K E G T V T L S K N I s K S G E v S V E L N D T D S S A A T K K T A A W N S G T S T L T I T V N S K K T K D L V F T K E N T I T V Q Q Y D s N G T K L E G S A V E I T K L D E I K N A L K *

18. Antigen podle některého z nároků 9 až 17 ve formě složené bílkoviny, jejíž část tvoří betagalaktosidáza, nebo ve formě nesložené bílkoviny.
19. Rekombinantní DNA, obsahující dále uvedený řetězec nukleových kyselin, který je kódem pro některý zantigenů, uvedených v nárocích 9 až 11, 15, 17 nebo 19, nebo řetězec, vzniklý z tohoto řetězce v rámci degenerace genetického kódu:

- 11 CZ 284616 B6 atgaaaaaatatttattgggaataggtctaatattagccttaatagcatgtaagcaaaat gttagcagccttqacqagaaaaacagcgtttcagtagatttgcctggtgaaatgaacgtt cttgtaagcaaagaaaaaaacaaagacggcaagtacgatctaattgcaacagtagacaag cttgagcttaaaggaacttctgataaaaacaatggatctggagtacttgaaggcgtaaaa gctgacaaaagtaaagtaaaattaacaatttctgacgatctaggtcaaaccacacttgaa cttttcaaagaagatggcaaaacactagtatcaaaaaaagtaacttccaaagacaagtca tcaacagaagaaaaattcaatgaaaaaggtgaagtatctgaaaaaataataacaagagca gacggaaccagacttgaatacacagaaattaaaagcgatggatctggaaaagctaaagag gttttaaaaagctatgttcttgaaggaactttaactgctgaaaaaacaacattggtggtt aaagaaggaactgttactttaagcaaaaatatttcaaaatctggggaagtttcagttgaa cttaatgacactgacagtagttgctgctactaaaaaaactgcagcttggaattcaggcact tcaactttaacaattactgtaaacagtaaaaaaactaaagaccttgtgtttacaaaagaa aacacaattacagtacaacaatacgactcaaatggcaccaaattagaggggtcagcagtt gaaattacaaaacttgatgaaattaaaaacgctttaaaataa
20. Rekombinantní vektor s obsahem alespoň jedné kopie rekombinantní DNA podle nároku 19.
21. Rekombinantní vektor podle nároku 20 ve formě prokaryotického vektoru.
22. Rekombinantní vektor podle nároku 21 ve formě plazmidu.
23. Rekombinantní vektor podle nároku 20, pZS-7/31-2, DSM 5528.
24. Způsob výroby antigenu podle nároků 9 až 11, 15, 17 a 18, vyznačující se tím, že se genová banka B. burgdorferi zkoumá pomocí alespoň jedné monoklonální protilátky, specifické pro OspA nebo OspB B. burgdorferi a izolují se klony, poskytující s protilátkou nebo protilátkami pozitivní imunologickou reakci.
25. Způsob výroby antigenu podle nároků 12, 13, 14 a 15, v y z n a č uj í c í se tím, že se genová banka B. burgdorferi zkoumá pomocí alespoň jedné monoklonální protilátky, specifické pro OspA nebo OspB B. burgdorferi a izolují se klony, poskytující s protilátkou nebo protilátkami pozitivní imunologickou reakci.