CZ287488B6 - Method of determining state of liver functions of individual including liver implant recipient - Google Patents
Method of determining state of liver functions of individual including liver implant recipient Download PDFInfo
- Publication number
- CZ287488B6 CZ287488B6 CZ19982288A CZ228898A CZ287488B6 CZ 287488 B6 CZ287488 B6 CZ 287488B6 CZ 19982288 A CZ19982288 A CZ 19982288A CZ 228898 A CZ228898 A CZ 228898A CZ 287488 B6 CZ287488 B6 CZ 287488B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- ngst
- levels
- liver
- kgst
- biological fluid
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 27
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 title claims abstract description 25
- 230000003908 liver function Effects 0.000 title claims abstract description 12
- 239000007943 implant Substances 0.000 title 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 claims abstract description 18
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 claims abstract description 10
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 claims abstract description 8
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 210000000941 bile Anatomy 0.000 claims description 18
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 claims description 15
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 claims description 12
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 11
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 11
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 10
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 9
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 9
- 206010052779 Transplant rejections Diseases 0.000 claims description 9
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 claims description 7
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 claims description 7
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 7
- 206010018910 Haemolysis Diseases 0.000 claims description 4
- 230000008588 hemolysis Effects 0.000 claims description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 claims description 4
- 238000003860 storage Methods 0.000 claims description 3
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 2
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 claims description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 claims 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 abstract 3
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 19
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 11
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 10
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 10
- 208000008439 Biliary Liver Cirrhosis Diseases 0.000 description 9
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 9
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 9
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 9
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 9
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 9
- 208000033222 Biliary cirrhosis primary Diseases 0.000 description 8
- 208000012654 Primary biliary cholangitis Diseases 0.000 description 8
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 8
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 8
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 description 8
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 6
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 5
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 5
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 5
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 5
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 5
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 5
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 5
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 5
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 5
- 208000035415 Reinfection Diseases 0.000 description 4
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 4
- 210000003445 biliary tract Anatomy 0.000 description 4
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010044467 Isoenzymes Proteins 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 240000007711 Peperomia pellucida Species 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 3
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 3
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 2
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 2
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 description 2
- 206010019837 Hepatocellular injury Diseases 0.000 description 2
- 206010067125 Liver injury Diseases 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 210000000013 bile duct Anatomy 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 231100000234 hepatic damage Toxicity 0.000 description 2
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 2
- 239000011539 homogenization buffer Substances 0.000 description 2
- 238000002650 immunosuppressive therapy Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000008818 liver damage Effects 0.000 description 2
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 2
- 230000003169 placental effect Effects 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 150000003568 thioethers Chemical class 0.000 description 2
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 2
- XINQFOMFQFGGCQ-UHFFFAOYSA-L (2-dodecoxy-2-oxoethyl)-[6-[(2-dodecoxy-2-oxoethyl)-dimethylazaniumyl]hexyl]-dimethylazanium;dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].CCCCCCCCCCCCOC(=O)C[N+](C)(C)CCCCCC[N+](C)(C)CC(=O)OCCCCCCCCCCCC XINQFOMFQFGGCQ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(dimethylamino)phenyl]-n,n-dimethylaniline Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1C1=CC=C(N(C)C)C=C1 YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- 241000946357 Atheta Species 0.000 description 1
- 206010004637 Bile duct stone Diseases 0.000 description 1
- 206010004659 Biliary cirrhosis Diseases 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 229930105110 Cyclosporin A Natural products 0.000 description 1
- PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N Cyclosporin A Chemical compound CC[C@@H]1NC(=O)[C@H]([C@H](O)[C@H](C)C\C=C\C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C1=O PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N 0.000 description 1
- 108010036949 Cyclosporine Proteins 0.000 description 1
- 206010048748 Graft loss Diseases 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000945318 Homo sapiens Calponin-1 Proteins 0.000 description 1
- 101000652736 Homo sapiens Transgelin Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N Leupeptin Natural products CC(C)CC(NC(C)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N Lithium Chemical compound [Li] WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010063837 Reperfusion injury Diseases 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 102000003929 Transaminases Human genes 0.000 description 1
- 108090000340 Transaminases Proteins 0.000 description 1
- 102100031013 Transgelin Human genes 0.000 description 1
- SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N [4-(4-hydrazinylphenyl)phenyl]hydrazine Chemical compound C1=CC(NN)=CC=C1C1=CC=C(NN)C=C1 SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000003409 anti-rejection Effects 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 238000005266 casting Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 208000006990 cholangiocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 229960001265 ciclosporin Drugs 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000012864 cross contamination Methods 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 208000020694 gallbladder disease Diseases 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 208000010710 hepatitis C virus infection Diseases 0.000 description 1
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000000710 homodimer Substances 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 1
- 229960003444 immunosuppressant agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N leupeptin Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(C)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- 108010052968 leupeptin Proteins 0.000 description 1
- 229910052744 lithium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000005923 long-lasting effect Effects 0.000 description 1
- 125000005439 maleimidyl group Chemical group C1(C=CC(N1*)=O)=O 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000011587 new zealand white rabbit Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 229950000964 pepstatin Drugs 0.000 description 1
- 108010091212 pepstatin Proteins 0.000 description 1
- FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N pepstatin A Chemical compound OC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CC(C)C FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N 0.000 description 1
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000106 platelet aggregation inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 230000002980 postoperative effect Effects 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000000246 remedial effect Effects 0.000 description 1
- 230000010410 reperfusion Effects 0.000 description 1
- 239000012898 sample dilution Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- -1 sodium citrate fluoroxylate Chemical compound 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000004575 stone Substances 0.000 description 1
- JJAHTWIKCUJRDK-UHFFFAOYSA-N succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate Chemical compound C1CC(CN2C(C=CC2=O)=O)CCC1C(=O)ON1C(=O)CCC1=O JJAHTWIKCUJRDK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 239000002676 xenobiotic agent Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/975—Kit
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Measuring And Recording Apparatus For Diagnosis (AREA)
Description
Oblast techniky
Vynález se týká způsobu určení stavu jaterních funkcí jedince, včetně příjemce jaterního štěpu, a v návaznosti na zjištěný stav se týká rozhodování o nápravném opatření, pokud je ho zapotřebí.
Dosavadní stav techniky
Schopnost rozlišit různé typy poškození jater má velký význam pro léčbu jak pacientů po transplantaci, tak i jedinců, kteří trpí různými chorobami jater, jež mohou ovlivňovat systém žlučových cest.
Glutathion S-transferázy (GST) zahrnují multigenovou rodinu proteinů, kterou tvoří hlavně izoformy alfa (aGST), mí (pGST), pí (nGST) atheta (9GST), definované izoelektrickým bodem, jež se podílejí na detoxifikaci řady xenobiotik, hlavně prostřednictvím vazby na glutathion (Beckett. G.J., Hayes. J.D., Advances in Clinical Chemistry, 1993, Vol. 30, p. 281380). Obecně se jedná o dimerické proteiny, sestávající ze dvou podjednotek o velikosti 25 až 27 kDa, které mohou existovat v homodimerické nebo heterodimerické formě. Pí glutathion Stransferáza (nGST) je homodimer a vyskytuje se v cytoplazmě epitelových buněk žlučovodu v játrech (Beckett. G.J., Hayes. J.D., 1993, supra). O aGST je známo, že je přítomna v hepatocytech uvnitř jater a existuje v homodimerickém i heterodimerickém stavu (Campbell, J.A.H, et al., Cancer. Philadelphia, 1991, Vol. 67, p. 1608-1613; Howie. A.F., et al., Clin. Chem. Acta, 1988, Vol. 177, p. 65-76). Tato heterogenní distribuce izoforem aGST a nGST naznačuje, že různé izoenzymy plní in vivo jedinečné funkce v různých oblastech jater (Campbell, J.A.H., et, al., 1991, supra).
EP A 0 640 145 popisuje způsob časného stanovení diagnózy rejekce u příjemce jaterního štěpu, který je založen na měření zvýšení aGST v plazmě nebo v séru příjemce při nepřítomnosti změn (nebo před změnami) plazmatických nebo sérových hladin transamináz. Bylo jednoznačně prokázáno, že měření plazmatických hladin aGST usnadňuje monitorování stavu jater po transplantaci a že jde o nesmírně citlivý, i když ne úplně specifický, markér rejekce štěpu.
Je pozoruhodné, že nGST, jakožto potenciálnímu markéru rejekce štěpu, nebyla věnována žádná pozornost, zřejmě vzhledem k nízkým hladinám tohoto enzymu, přítomného v biliámích epitelových buňkách jater. Jsou však k dispozici jisté průkazy o tom, že a a nGST jsou přítomny ve žluči jak zdravých jedinců, tak i jedinců, trpících specifickými formami rakoviny (např. cholangiokarcinomem), což lze zjistit pomocí radioimunoeseje (Howie, A.F., et al., Clin. Chem. Acta, 1989, Vol. 184, p. 269-278). Kromě toho se někteří autoři zmínili o tom, že měření sérových a plazmatických hladin nGST může usnadnit stanovení diagnózy maligních nádorů, protože se zdá, že v maligních tkáních dochází ke specifické expresi nGST (Niitsu. Y., et al., Cancer, 1989, Vol. 63, p. 317-323; Howie, A.F., et al., Clin. Chem., 1990, Vol. 36 (3), p. 453456). Žádný z výše uvedených autorů neupozornil na skutečnost, že by se nGST mohla uplatnit v predikci rejekce jaterního štěpu nebo jiných poruch funkce jater či žlučníku.
Jak známo, k primární rejekci štěpu obvykle dochází v biliámím stromu uvnitř jater (Ascher. N., In: Immunology of liver transplantation. Ed. Neuberger. J., Adams. D., 1993), zdá se tedy, že by specifické měření hladin nGST ve žluči nebo v plazmě mohlo pomoci ke stanovení diagnózy časné rejekce, nebo usnadnit rozlišení mezi posttransplantačním hepatoceluámím poškozením a poškozením biliámím. Význam odlišení nespecifického poškození jater od rejekce štěpu nelze vůbec docenit, protože léčba obou stavů se naprosto liší. Kromě toho by zahájení nesprávné
-1 CZ 287488 B6 léčby mohlo mít nesmírně negativní důsledky na zdraví již těžce nemocného jedince. Pokud například dojde k postižení štěpu virovou infekcí (např. reinfekce hepatitidou typu C nebo infekce cytomegalovirem [CMV]), je třeba pečlivě monitorovat úroveň anti-rejekční imunosupresivní léčby, protože nadměrná aplikace imunosupresiv (např. cyklosporinu A nebo FK.506) by mohla podstatně zhoršit schopnost obrany proti virové infekci. Nerozlišení skutečné rejekce od nespecifického postižení štěpu by také obráceně mohlo vést k oddálení intenzifikace imunosupresivní terapie, a v konečných důsledcích ke ztrátě štěpu.
Je tedy silně pociťována potřeba metody, vhodné k určování stavu jatemích funkcí u jedinců s různými chorobami nebo s patologickým stavem jater.
Podstata vynálezu
Vynález poskytuje způsob určení stavu jatemích funkcí jedince, který spočívá v tom, že se měří hladiny izoformy pí glutathion S-transferázy (kGST) ve vzorku biologické tekutiny tohoto jedince pomocí imunoeseje, specifické pro izoformu nGST, naměřené hladiny kGST se porovnávají s normálním rozmezím pro kGST v dané biologické tekutině, s tím, že se na základě hladin nGST v dané biologické tekutině vyhodnotí stav jatemích funkcí jedince, pokud jsou zjištěny zvýšené hodnoty nGST ve srovnání s normálním rozmezím.
Tento další způsob určení stavu jatemích funkcí s použitím markem, specifického pro konkrétní oblast jater, významně usnadňuje léčbu pacientů s různými chorobnými stavy a dalšími patologickými stavy jater, jak je podrobněji popsáno dále.
Vhodným subjektem je příjemce jatemího štěpu a stav jatemích funkcí se určuje po transplantaci.
Vynález je použitelný zvláště v případě transplantace jater; umožňuje totiž ve velmi časném stádiu po transplantaci určit pravděpodobnost rejekce, protože k primární rejekci štěpu obvykle dochází v biliámím stromu uvnitř jater, jak bylo konstatováno výše. Způsob podle vynálezu umožňuje dokonce ještě časnější detekci rejekce jatemího štěpu, než metoda, popsaná a nárokovaná v EP A 0 640 145.
Ve výhodném provedení je příjemcem štěpu člověk.
Výhodnou imunoesejí je enzymoimunoesej, konkrétněji sendvičová enzymoimunoesej.
Způsobu podle vynálezu lze použít k měření hladin kGST v řadě médií, zvláště však ve žluči, plazmě a v séru.
Biologickou tekutinou jsou zde myšleny např. tělesné tekutiny, jako je žluč, plazma, sérum a moč, jakož i podpůrná tkáňová média a perfúzáty. Biologické tekutiny jsou obecně označovány jako matrix.
Způsob podle vynálezu je první, který usnadňuje detekci hladin izoenzymů kGST ve žluči.
Pokud je biologickou tekutinou žluč, dosahují normální hladiny kGST hodnoty nižší než 15 pg/l.
Pokud je biologickou tekutinou plazma, dosahují normální hladiny nGST hodnoty nižší než 100 pg/l.
-2CZ 287488 B6
Jak bude uvedeno dále, v případě, že biologickou tekutinou při použití způsobu podle vynálezu je plazma, je nutno dbát, aby byla odebrána a skladována v přítomnosti nějakého antikoagulačního přípravku za podmínek, které zabrání, aby během skladování došlo k hemolýze.
Zjistili jsme, že použití fluoroxylátových zkumavek vede k větší intenzitě hemolýzy, přičemž dochází k uvolňování nGST z erytrocytů, což má za následek falešně zvýšené hladiny kGST. Jiné izoenzymy GST buď nejsou v krvi vůbec zjištěny, nebo jsou přítomny v extrémně nízkých hodnotách. Například pGST je přítomna v leukocytech. Z literatury však není jasné zda se nachází i v erytrocytech. V každém případě je pGST přítomna pouze u 50 % populace. 0GST vykazuje podobnou interindividuální variabilitu jako pGST, a pokud je v krvi přítomna, jsou její hladiny extrémně nízké, aGST není v krvi ve větším měřítku přítomna.
Ve výhodném provedení se vzorek zředí pomocí ředidla, obsahujícího účinné množství proteinu, který optimalizuje reakce protilátka-antigen.
Zjistili jsme, že pokud ředidlo obsahuje Tween 20, látku, běžně používanou jako standardní reagencium v imunometrických metodách, jsou zjišťovány nesprávné koncentrace kGST. Zjistili jsme, že pokud se použije účinné množství proteinu, který optimalizuje reakce protilátkaantigen, může být dosaženo lineární titrace, jak je uvedeno v příkladu 6.
Výhodným proteinem je sérový albumin, jako je albumin kravského séra nebo lidský sérový albumin.
Doba trvání imunoeseje podle vynálezu je asi 2,5 hodiny jak dále uvedeno v příkladech. To je doba značně kratší, než u jiných komerčně dostupných analytických postupů, určených ke kvantifikaci nGST.
Vynález tedy poskytuje imunoesej, která trvá méně než 2,5 hodiny a která je založena na postupném přidávání vzorku, konjugátu protilátka-enzym a substrátu do mikrotitračních jamek nebo na jiný povrch, potažený monoklonálním anti-KGST IgG. Výsledná intenzita barvy je úměrná množství nGST, přítomného ve vzorku, a citlivost eseje je v rozmezí 0-100 pg/l. Rozmezí lze snadno rozšířit vyšším naředěním vzorku.
Vynález je dále možno aplikovat na měření hladin izoformy alfa glutathion S-transferázy (aGST) ve vzorku biologické tekutiny daného subjektu za účelem snadného rozlišení mezi rejekcí štěpu a nespecifickým hepatocelulámím poškozením.
Přehled obrázků
Obr. 1 je schematické znázornění sendvičové enzymoimunoeseje podle příkladu 1.
Na obr. 2 jsou vyneseny hodnoty absorbance při 450/630 nm versus logaritmus koncentrace kGST (p.g/1) podle výsledků enzymoimunoeseje pro lidskou kGST, která je popsána v příkladu 1.
Na obr. 3 je SDS-PAGE analýza lidských μ, a a nGST.
Na obr. 4 je analýza typu imunoblot lidské kGST.
Na obr. 5 jsou vynesené hodnoty aGST a kGST (ng/ml) ve žluči versus čas (hodiny) po reperfuzi u řady pacientů.
-3CZ 287488 B6
Na obr. 6 jsou vyneseny koncentrace kGST versus čas (dny) u řady pacientů.
Na obr. 7 jsou vyneseny hodnoty AST/ALT (jedn/1), a aGST a kGST (ng/ml) versus dny po transplantaci u jediného pacienta.
Příklady provedení vynálezu
Vynález bude dále vysvětlen v následujících příkladech.
Příprava A
Čištění lidské kGST kGST byla získána a vyčištěna z lidské placenty pomocí afínitní chromatografie. Přesné podrobnosti čisticí procedury jsou následující:
a. 325 g lidské placenty bylo homogenizováno po dobu 2 minut v homogenizačním pufru v poměru jeden díl placenty na tři díly pufru, s použitím Waringova (Waring je obchodní známka) blenderu. Homogenizační pufr měl toto složení:
mM tris-HCl
250 mM sukrózy mM EDTA 7,8 pH pg/ml leupeptinu pg/ml pepstatinu
b. Placentámí homogenát byl centrifugován při 10 000 g po dobu 60 minut.
c. Supematant byl poté separován pomocí afínitní kolony glutathion (GSH)-sepharose, předem ekvilibrované v 20 mM Tris-HCI s 200 mM NaCl, 7,8 pH. Ekvilibrační pufr byl znovu aplikován k eluci nenavázaného proteinu. Nakonec bylo 50 mM Tris-Hcl o pH 9,5 s obsahem 5 mM GSH použito k eluci navázaného GST z afínitní kolony.
d. Eluát byl poté dialyzován proti 0,1 M PBS.
Příprava B
Produkce a čistění protilátek
Vyčištěná lidská nGST byla injikována subkutánně (s.c.) novozélandským bílým králíkům podle dále uvedeného harmonogramu a v séru byla zjišťována anti-nGST reaktivita. Jakmile bylo dosaženo (stanovením pomocí semikvantitativní dot blot analýzy) dostatečného titru IgG [protilátky proti lidské kGST] , byli králíci zahubeni vykrvácením a bylo shromážděno jejich sérum. Celkový IgG byl purifíkován z králičího séra technikou protein A afínitní chromatografie a byl použit k navázání na křenovou peroxidázu (horseradish peroxidase. HRP). Monoklonální IgG [protilátka proti lidské uGST] byla získána jako ascites z fakultní nemocnice (University Hospital) v nizozemském Nijmegenu a před dalším použitím již nebyla čištěna.
-4CZ 287488 B6
Imunizační harmonogram (obecně)
1. den:
Z ucha králíka bylo odebráno 5 ml preséra k vyšetření. 0,5 ml antigenu lidské nGST (100 pg) bylo smícháno se stejným objemem Freundova úplného adjuvans. Směs antigenu aadjuvans byla homogenizována k zajištění kvalitní emulze. Tato směs byla poté injikována subkutánně do několika míst na předem vyholených zádech králíka.
28. den:
Z ucha králíka bylo k vyšetření odebráno 5 ml séra. 0,5 ml antigenu lidské kGST (100 pg) bylo smícháno se stejným objemem Freundova úplného adjuvans. Směs antigenu aadjuvans byla homogenizována k zajištění kvalitní emulze. Tato směs byla poté injikována subkutánně do několika míst na zádech králíka.
42. den:
Z ucha králíka bylo odebráno 10 ml krve k vyšetření.
56. den:
Králíkovi byla podána druhá upomínací dávka, stejně jako ve 28. den.
70. den:
Z ucha králíka bylo odebráno 10 ml krve k vyšetření. Při dosažení dostatečně vysokého titru (IgG [protilátky proti lidské nGST], pozn. překl.) byl králík utracen a bylo shromážděno největší možné množství krve.
Příprava C
Analýza imunoblot
U všech polyklonálních a monoklonálních IgG, určených k použití v následujících příkladech, byla zkontrolována reaktivita vůči nGST a případná zkřížená reaktivita proti lidské a a pGST (v tomto pořadí), a při tom byly použity tyto imunoblot kombinace:
(a) králičí IgG [protilátka proti lidské nGSTI byla použita k prošetření nitrocelulózových membrán, obsahujících imobilizovanou lidskou α, π a pGST.
(b) myší IgG [protilátka proti lidské nGSTl byla použita k prošetření nitrocelulózových membrán, obsahujících imobilizovanou lidskou α, π a pGST.
Detekce imunoblotu byla provedena následujícím způsobem:
1. Na 15% SDS-PAGE se včleněnými markéry molekulární hmotnosti byla provedena elektroforéza lidské α, π a pGST (0,5 pg na proužek).
2. Po skončení elektroforézy byl polyakrylamidový gel odříznut, polovina byla obarvena ke stanovení proteinu, a zbytek byl použit k elektroforetickému přenosu na nitrocelulózu.
-5CZ 287488 B6
3. Po elektroforetickém transferu byly nitrocelulózové membrány blokovány po dobu 1 hodiny pomocí 5 % (w/v) Marvelu (Marvel je ochranná známka) ve fosfátovém pufru s obsahem 0,05 % (w/v) blokovacího pufru TWEEN-20 (PBST).
4. Poté byly připraveny následující roztoky:
(i) králičí IgG [protilátka proti lidské kGST] v 1 % (w/v) Marvelu v PBST, (ii) myší IgG [protilátka proti lidské nGST] v 1 % (w/v) Marvelu v PBST, a byly přidány na membrány ihned po odlití blokovacího pufru.
Inkubace membrán s roztoky protilátek probíhala po dobu jedné hodiny.
5. Pak byly nitrocelulózové membrány opláchnuty v PBST (2x vždy po dobu 5 minut).
6. Poté byl připraven konjugát anti-králičí IgG-HRP (1/1000) v 1 % (w/v) Marvelu v PBST a přidán do roztoku, uvedeného výše pod bodem 4 (i). Rovněž byl připraven konjugát anti-myší IgG-HRP (1/1000) a přidán do roztoku, uvedeného výše pod bodem 4 (ii).
7. Po jednohodinové inkubaci s konjugáty protilátek uvedených živočišných druhů byla činidla zlikvidována a membrány opláchnuty jako v bodu 5.
8. Pak byl na membrány přidán připravený diaminobenzidinový substrát.
Pozitivní reakce se projevila hnědým precipitátem na nitrocelulózové membráně.
Příprava D
Syntéza konjugátu anti nGST IgG-křenová peroxidáza (horseradishperoxidase. HRP)
Konjugáty anti-nGST IgG-HRP byly syntetizovány s použitím metodiky konjugace thioetheru (Duncan. R.J.S., et al., Anal. Biochem., 1993, Vol. 132, p. 68-73). Reaktivní maleinimidové skupiny byly do molekul IgG zavedeny pomocí SMCC [sukcinimidyl-4- (N-maleinimidomethyl]-cyklohexan-l-karboxylát] a maskované sulfhydrylové skupiny byly navázány na HRP. Poté, co byly odmaskovány s cílem generovat reaktivní sulfhydrylové skupiny, byly maleinimidem aktivované IgG aHRP-SH smíchány dohromady a nechaly se reagovat po 4,5 hodiny. Výsledný konjugát gG-HRP, vzniklý kovalentní vazbou thioetheru, byl přenesen do 50 % (v/v) glycerolu a skladován při teplotě -20 °C k použití v EIA podle příkladu 1.
Příklad 1
Sendvičová enzymoimunoesei
Imunoesej pro kvantitativní stanovení lidské nGST je klasickou eseji sendvičového typu, jak schematicky znázorňuje obr. 1, a jejíž popis následuje.
a. Mikrotitrační deska Nunc Maxisorp (Nunc Maxisorp je ochranná známka) byla potažena myší monoklonální IgG [protilátkou proti lidské kGST] (odvozenou z přípravy B), imobilizova-6CZ 287488 B6 nou pomocí fragmentů kozí F(ab)2 [anti-myší IgG]. Potažení protilátek slouží k orientování vazebných míst Mab a také zlepšuje citlivost eseje tím, že denaturalizace druhé protilátky (captured antibody), indukovaná adherencí, je omezena na minimum.
b. Jako kalibrátor eseje byla použita lidská kGST, získaná purifikací z placenty, jak popsáno v přípravě A.
c. Pro snazší detekci zachycené/imobilizované kGST byly použity konjugáty IgG [protilátky proti lidské kGST] a HRP spolu s tetramethylbenzidinovým substrátem (TMB).
d. Enzymová reakce byla ukončena přidáním 1 N H2SO4 a absorbance byla změřena při 450 nm, referenční vlnová délka byla 630 nm. Intenzita barev byla úměrná koncentraci nGST. Po vynesení hodnot A45Q/63Qnm versus koncentrace (pg/l) lze tedy určit koncentraci neznámých vzorků (viz obr. 2). Celková doba eseje byla kratší než 2,5 hodiny.
Bylo shledáno, že esej trvala celkem 2 hodiny 15 minut; v průběhu inkubace vzorku a konjugátu (v tomto pořadí) bylo zapotřebí třepat mikrotitrační deskou při stálé teplotě. Inkubace substrátu TMB vyžadovala pouze stálou teplotu.
Příklad 2
Sběr plazmy pro analýzu kGST
Byl zkoumán účinek řady běžně používaných antikoagulancií (kyseliny ethylendiaminotetraoctové [EDTA], lithiového heparinu, citrátu sodného, fluoroxylátu) a dalších inhibitorů destiček, které se používají ve zkumavkách, určených ke sběru plazmy, na plazmatické hladiny nGST. Vzorky byly odebrány venipunkcí do zkumavek, obsahujících konkrétní antikoagulancium. Plazma byla oddělena centrifugaci (6000 g po dobu 10 minut), areziduální destičky byly odstraněny další centrifugaci (10 000 g po dobu 10 minut). Po odstranění supematantu následovala analýza vzorků podle protokolu, popsaného v příkladu 1.
Plazma několika jedinců byla odebrána do řady zkumavek, určených k odběru plazmy. S každým vzorkem se zacházelo, jak je uvedeno výše, a uvolňování kGST do plazmy bylo monitorováno po dobu 24 hodin. Tabulka 1 ukazuje plazmatické hladiny nGST téhož jedince ve 4 různých zkumavkách, jejichž obsah byl analyzován v čase 0 a 24 (TO, T24). Z výsledků je zřejmé, že přítomnost kteréhokoli z výše uvedených antikoagulancií nezpůsobila významné rozdíly plazmatických koncentrací nGST. Nezdá se, že by skladování neseparované plazmy po dobu do 24 hodin vedlo k významnému zvyšování koncentrace nGST (v důsledku uvolňování nGST z erytrocytů nebo trombocytů). Výjimkou jsou fluoroxylátové zkumavky, při jejichž použití docházelo ve větší míře k hemolýze a k uvolňování kGST z eiytrocytů, takže hladiny proteinu byly falešně zvýšené, jak je uvedeno v tabulce 1.
-7CZ 287488 B6
Tabulka 1
Srovnání účinku antikoagulancií ve zkumavkách ke sběru plazmy pro analýzu kGTS v plazmě. Hodnoty jsou uvedeny v ug/1.
| Pacient | EDTA | Li/Hep. | citrát sodný | fluoroxylát | ||||
| TO | T24 | TO | T24 | TO | T24 | TO | T24 | |
| 1 | 171,9 | 220,2 | 199,4 | 194,7 | 167,5 | 220,3 | 170,0 | >500 |
| 2 | 65,6 | 70,5 | 62,8 | 88,4 | 53,2 | 65,4 | 55,4 | >500 |
| 3 | 59,6 | 78,6 | 65,4 | 88,6 | 53,7 | 68,4 | 59,9 | >500 |
| 4 | 81,7 | 92,8 | 90,2 | 119,5 | 74,9 | 122,1 | 81,2 | >500 |
| 5 | 46,7 | 67,5 | 44,6 | 73,3 | 28,9 | 68,6 | 60,9 | >500 |
Z tabulky 1 je patrné, že neexistuje významný rozdíl mezi koncentracemi nGST v plazmě, získané v přítomnosti kteréhokoli z výše uvedených antikoagulancií.
Příklad 3
Hodnocení čistoty reagencií pro imunoesei
Obr. 3 ilustruje čistotu lidské nGST, která byla získána přípravou A a poté použita k imunizaci králíků; je potvrzena absence jakýchkoli jiných lidských proteinů, které by mohly přispět ke snížené specificitě eseje.
Na obr. 3:
dráha 1 = pGST dráha 2 = aGST dráha 3 = kGST dráha 4 = markéry molekulární hmotnosti.
Imunoblot analýza reaktivity monoklonálních protilátek ukázala, že IgG [protilátka proti lidské nGST] byla vysoce specifická pro lidskou kGST a nevykazovala významnou zkříženou reaktivitu s lidskou a nebo pGST. Výsledky ukazuje obr. 4:
dráha 1 = nGST dráha 2 = markéry molekulární hmotnosti.
Tento nález je podpořen chybějící reaktivitou a nebo pGST v enzymoimunoeseji se specificitou na lidskou hGST, jejíž výsledky jsou uvedeny v tabulce 2.
-8CZ 287488 B6
Tabulka 2
Hodnocení reaktivity lidské aGST a uGST v enzymoimunoeseii pro detekci lidské kGST
| Koncentrace GST | ^450/630 nm | ||
| nGST | aGST | pGST | |
| 0,00 | 0,022 | 0,022 | 0,022 |
| 3,12 | 0,087 | 0,024 | 0,016 |
| 12,5 | 0,299 | 0,020 | 0,022 |
| 25,0 | 0,688 | 0,036 | 0,055 |
| 50,0 | 1,204 | 0,018 | 0,034 |
| 100 | 1,735 | 0,040 | 0,043 |
Z tabulky 2 je zřejmé, že v této eseji nebyla zjištěna žádná zkřížená reaktivita aGST ani pGST.
Tato skutečnost je velmi významná; znamená to, že enzymoimunoesej pro kvantifikaci lidské kGST je pro detekci lidské kGST specifická. Veškerou přítomnost lidské nGST ve vzorcích lze tedy zjistit specificky, bez křížené kontaminace jinými druhy GST.
Příklad 4
Kvantifikace nGST ve žluči
Rada vzorků žluči, odebraných od pacientů se specifickým postižením funkce jater/žlučových cest, byla vyšetřena pomocí analýzy na přítomnost lidské nGST. Jak ukazuje tabulka 3, u pacientů s hepatocelulámím karcinomem (hepatocellular carcinoma. HCC) a s primární biliámí cirhózou (primary biliáry cirrhosis. PBC) byly zjištěny velmi vysoké hladiny kGST. U pacienta s kameny ve žlučovodu (bile duet stones. BDS) byly též zjištěny zvýšené hladiny nGST, ne však natolik, jako u pacientů s HCC a PBC.
Tabulka 3
Koncentrace kGST ve žluči-pacientů s hepatocelulámím karcinomem (HCC), primární, biliámí cirhózou(PBC) a kamenem ve žlučovodu (BDS)
| Typ postižení | Hladiny kGST (pg/lj |
| HCC | 5357 |
| PBC | 2432 |
| BDS | 506,6 |
Všechny tyto vzorky vykazují významně zvýšené hladiny kGST.
-9CZ 287488 B6
Příklad 5
Využitelnost kvantifikace kGST v klinické praxi
Od pacientů po transplantaci jater byly postupně odebírány vzorky žluči a plazmy a vyšetřovány na kGST (ve žluči) a aGST (v plazmě). Pooperační stav pacientů se značně různil, od bezproblémového zotavení po akutní rejekci areinfekci hepatitidou typu C, což jsou stavy, které se běžně při transplantaci vyskytují.
Při současném monitorování koncentrací nGST a aGST byla pozorována řada významných trendů. Hladiny aGST byly měřeny podle postupu, popsaného v EP A 0 640 145. Při bezproblémovém zotavování bylo možno zjistit hladiny nGST již za 2 hodiny po transplantaci, a tyto hladiny zůstaly na nízké úrovni (tzn. do 50 pg/l). Hladiny aGST byly v důsledku reperfuzního poškození zpočátku vysoké, během 2 dnů se však vrátily na výchozí úroveň, jak ukazuje obr. 5. Tento obrázek znázorňuje typický průběh hladin aGST a nGST během transplantace jater u člověka a bezprostředně po tomto výkonu. Hladiny kGST zůstávají na nízké úrovni. Rovněž bylo možno identifikovat komplikace s transplantací jater spojené. Jedním z hlavních možných problémů je akutní rejekce, nebo dokonce, což je ještě závažnější, rejekce rezistentní na steroidy. V těchto konkrétních případech bylo možno pozorovat významné zvýšení hladin nGST, které přetrvávalo po dobu několika dní, jak ukazuje obr. 6. Tento obrázek znázorňuje hladiny nGST během epizod rejekce, rezistentní vůči aplikaci steroidů (steroid resistant. SR), a během epizod akutní rejekce (AR). Hladiny jsou zvýšené a v tomto stavu zůstávají po dobu minimálně 20 dní. Hladiny aGST jsou též vysoké, vrátily se však na výchozí hodnoty během 5-8 dní.
Další závažné nebezpečí v souvislosti s transplantací představuje možnost infekce nebo reinfekce. Během epizod reinfekce HCV jsme dlouhodobě (tzn. minimálně 25 dní) pozorovali velmi vysoké hladiny aGST. Hladiny kGST však zůstávaly blízko normálních hodnot, jak ukazuje obr. 7. To je přesně opačná situace, než v předchozích případech při akutní rejekci. Současným provedením kvantifikace aGST a nGST lze tedy úspěšně rozlišit mezi akutní rejekci a reinfekcí HCV, což dosud bylo velmi obtížné a představovalo terapeutické dilema pro transplantační chirurgy.
Příklad 6
Linearita ředění vzorků žluče
Od pacientů se specifickým postižením funkce jater/žlučových cest (hepatocelulámí karcinom, HCC, a primární biliámí cirhóza, PBC) byla získána řada vzorků žluče, a stejně tak byly získány vzorky žluče od dárců a také od pacientů po transplantaci jater. Tyto vzorky byly vyšetřeny na přítomnost lidské kGST podle protokolu v příkladu 1.
K titraci vzorků žluči byla použita řada standardních ředidel. Tato ředidla se rutinně používají v mnoha analytických systémech, přičemž nejčastěji používanou látkou je Tween-20. Zjistili jsme však, že přítomnost tohoto konkrétního detergens v ředidle vzorku vedla k chybným výsledkům. Jak ukazuje tabulka 4, ve vzorcích, k jejichž ředění byla použita ředidla s obsahem Tween-20, byly pozorovány falešně vysoké koncentrace nGST, což bylo způsobeno nedostatečnou titraci. V nepřítomnosti Tween-20 probíhala titrace lineárně. Kritickým faktorem při tomto vyšetření je tedy přítomnost nebo nepřítomnost standardního reagencia Tween-20 v ředidle vzorků; při jeho použití by byly naměřeny falešně zvýšené hodnoty kGST.
-10CZ 287488 B6
Tabulka 4
Srovnání titrace vzorku žluči při PBC v ředidlech, obsahujících a neobsahujících-Tween-20.
Hodnoty jsou uvedeny v ug/1
| Ředění | - Tween-20 | + Tween-20 |
| 1/50 | 2344 | 3074 |
| 1/100 | 2374 | 5187 |
| 1/200 | 2410 | 7059 |
Lineární titrace byla pozorována pouze u ředidel, neobsahujících Tween-20.
Příklad 7
Srovnání polyklonálních a monoklonálních protilátek jako potahujících protilátek
Polyklonální a monoklonální IgG protilátky proti lidské kGST byly imobilizovány na deskách Nunc Maxisorp buď přímo, nebo pomocí vazebné látky [fragmenty F(ab)2 kozí IgG protilátky proti látkám jiných živočišných druhů]. Pak byly použity standardy pro známé koncentrace lidské tiGST, jak popsáno v příkladu 1, a při podobných koncentracích imobilizovaných IgG byly porovnány absorbance.
Jamky byly potaženy jak polyklonální, tak i monoklonální protilátkou, jakožto druhou (capture) protilátkou. Přímé použití polyklonálních i monoklonálních protilátek k potažení jamek mělo za následek velmi nízké hodnoty absorbance na standardní křivce (viz tab. 5). Pokud k imobilizaci byla použita vazebná protilátka (kozí IgG protilátka proti myší/králičí protilátce), byly v testu s monoklonální protilátkou získány významně zvýšené hodnoty optické hustoty (pozn. překl. v textu O.D., optical density). U polyklonální protilátky však takové zvýšení nebylo pozorováno.
Tabulka 5
Srovnání metod potahování k detekci lidské kGST
| nGST | přímé potahování | POTAHOVÁNÍ pomocí VAZEBNÉ PROTILÁTKY | ||
| polyklonální | monoklonální | polyklonální | monoklonální | |
| 100 | 0,625 | 0,421 | 0,352 | 1,557 |
| 0 | 0,044 | 0,038 | 0,235 | 0,095 |
Přímé potahování jamek protilátkou (2 pg/ml) bylo srovnáváno s potahováním pomocí vazebné protilátky (kozí protilátky proti protilátkám jiných živočišných druhů, 2 pg/ml) při daných koncentracích protilátky proti kGST.
Claims (11)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Způsob určení stavu jatemích funkcí jedince, vyznačující se tím, že se měří hladiny izoformy pí glutathion S-transferázy (kGST) ve vzorku biologické tekutiny tohoto jedince pomocí imunoeseje, specifické pro izoformu nGST, naměřené hladiny nGST se porovnávají s normálním rozmezím pro nGST v dané biologické tekutině a na základě změřených hladin nGST v dané biologické tekutině se vyhodnotí stav jatemích funkcí jedince, pokud jsou zjištěny zvýšené hodnoty nGST ve srovnání s normálním rozmezím.
- 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že jedincem je příjemce jatemího štěpu a stav jatemích funkcí je určován po transplantaci.
- 3. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že jedincem je člověk.
- 4. Způsob podle některého předchozího nároku 1 až 3, vyznačující se tím, že imunoesejí je enzymoimunoesej.
- 5. Způsob podle některého předchozího nároku 1 až 4, vyznačující se tím, že biologickou tekutinou je žluč a normální hladiny nGST jsou nižší než 15 pg/l.
- 6. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že biologickou tekutinou je plazma a normální hladiny nGST jsou nižší než 100 pg/l.
- 7. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že před měřením je plazma jímána a skladována v přítomnosti antikoagulancia za podmínek, při nichž nedochází k významné hemolýze v průběhu skladování.
- 8. Způsob podle některého předchozího nároku laž7, vyznačující se tím, že vzorek je zředěn ředidlem, obsahujícím účinné množství proteinu, které optimalizuje reakce protilátka-antigen.
- 9. Způsob podle nároku 8, vyznačující se t í m , že proteinem je sérový albumin.
- 10. Způsob podle některého předchozího nároku laž9, vyznačující se tím, že kompletní imunoesej proběhne za 2,5 hodiny.
- 11. Způsob podle některého nároku 2až 10, vyznačující se tím, že ve vzorku biologické tekutiny daného jedince se navíc měří hladina izoformy alfa glutathion S-transferázy (aGST), aby bylo usnadněno rozlišení mezi rejekcí štěpu a nespecifickým hepatocelulámím postižením daného jedince.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CA002246072A CA2246072A1 (en) | 1996-02-02 | 1996-02-02 | Method of determining the hepatic status of an individual, including a liver transplant recipient |
| PCT/IE1996/000003 WO1997028449A1 (en) | 1996-02-02 | 1996-02-02 | Method of determining the hepatic status of an individual, including a liver transplant recipient |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ228898A3 CZ228898A3 (cs) | 1999-03-17 |
| CZ287488B6 true CZ287488B6 (en) | 2000-12-13 |
Family
ID=25680448
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ19982288A CZ287488B6 (en) | 1996-02-02 | 1996-02-02 | Method of determining state of liver functions of individual including liver implant recipient |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6183977B1 (cs) |
| EP (1) | EP0880700B1 (cs) |
| JP (1) | JP2000505544A (cs) |
| AT (1) | ATE322013T1 (cs) |
| AU (1) | AU712180B2 (cs) |
| BR (1) | BR9612475A (cs) |
| CA (1) | CA2246072A1 (cs) |
| CZ (1) | CZ287488B6 (cs) |
| DE (1) | DE69635979T2 (cs) |
| ES (1) | ES2262153T3 (cs) |
| HU (1) | HUP9903578A2 (cs) |
| PL (1) | PL328518A1 (cs) |
| WO (1) | WO1997028449A1 (cs) |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6977140B1 (en) | 1998-09-29 | 2005-12-20 | Organ Recovery Systems, Inc. | Method for maintaining and/or restoring viability of organs |
| US6492103B1 (en) | 2000-01-31 | 2002-12-10 | Organ Recovery Systems, Inc. | System for organ and tissue preservation and hypothermic blood substitution |
| US20030022909A1 (en) * | 2001-06-05 | 2003-01-30 | University Of Chicago | Use of methylnaltrexone to treat immune suppression |
| US20040219600A1 (en) * | 2002-12-13 | 2004-11-04 | Williams Robert Wood | Method for determining sensitivity to environmental toxins and susceptibility to parkinson's disease |
| US8048638B2 (en) * | 2005-04-01 | 2011-11-01 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | Biomarkers of liver injury |
| ES2732071T3 (es) * | 2005-04-01 | 2019-11-20 | Univ Florida | Biomarcadores de lesiones hepáticas |
| US12601749B2 (en) | 2008-08-11 | 2026-04-14 | Banyan Biomarkers, Inc. | Biomarker detection process and assay of neurological condition |
| JP5781436B2 (ja) | 2008-08-11 | 2015-09-24 | バンヤン・バイオマーカーズ・インコーポレーテッド | 神経学的状態のバイオマーカー検出方法およびアッセイ |
| EP2531224B1 (en) | 2010-01-26 | 2019-06-05 | Bioregency, Inc. | Compositions and methods relating to argininosuccinate synthetase |
| US11078298B2 (en) | 2016-10-28 | 2021-08-03 | Banyan Biomarkers, Inc. | Antibodies to ubiquitin C-terminal hydrolase L1 (UCH-L1) and glial fibrillary acidic protein (GFAP) and related methods |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1990012088A1 (en) * | 1989-04-13 | 1990-10-18 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, U.S. Department Of Commerce | MONOCLONAL ANTIBODIES TO HUMAN GLUTATHIONE S TRANSFERASE Pi |
| JPH0425763A (ja) | 1990-05-21 | 1992-01-29 | Maruko Seiyaku Kk | グルタチオンＳ―トランスフェラーゼπの定量方法および診断のための試薬 |
| US5217868A (en) * | 1992-05-01 | 1993-06-08 | Syncor Limited | Measurement of an enzyme marker as an aid to diagnosis of liver transplant rejection |
| USRE35419E (en) * | 1992-05-01 | 1997-01-07 | Cormac G. Kilty | Measurement of an enzyme marker as an aid to diagnosis of liver transplant rejection |
-
1996
- 1996-02-02 PL PL96328518A patent/PL328518A1/xx unknown
- 1996-02-02 DE DE69635979T patent/DE69635979T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-02-02 US US09/117,476 patent/US6183977B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1996-02-02 JP JP09527453A patent/JP2000505544A/ja active Pending
- 1996-02-02 AU AU46323/96A patent/AU712180B2/en not_active Ceased
- 1996-02-02 HU HU9903578A patent/HUP9903578A2/hu unknown
- 1996-02-02 CA CA002246072A patent/CA2246072A1/en not_active Abandoned
- 1996-02-02 ES ES96901946T patent/ES2262153T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-02-02 EP EP96901946A patent/EP0880700B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-02-02 AT AT96901946T patent/ATE322013T1/de not_active IP Right Cessation
- 1996-02-02 BR BR9612475A patent/BR9612475A/pt not_active Application Discontinuation
- 1996-02-02 CZ CZ19982288A patent/CZ287488B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1996-02-02 WO PCT/IE1996/000003 patent/WO1997028449A1/en not_active Ceased
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ATE322013T1 (de) | 2006-04-15 |
| JP2000505544A (ja) | 2000-05-09 |
| CA2246072A1 (en) | 1997-08-07 |
| WO1997028449A1 (en) | 1997-08-07 |
| AU4632396A (en) | 1997-08-22 |
| EP0880700B1 (en) | 2006-03-29 |
| DE69635979T2 (de) | 2006-11-16 |
| DE69635979D1 (de) | 2006-05-18 |
| EP0880700A1 (en) | 1998-12-02 |
| AU712180B2 (en) | 1999-10-28 |
| HUP9903578A2 (hu) | 2000-02-28 |
| PL328518A1 (en) | 1999-02-01 |
| ES2262153T3 (es) | 2006-11-16 |
| US6183977B1 (en) | 2001-02-06 |
| BR9612475A (pt) | 1999-07-13 |
| CZ228898A3 (cs) | 1999-03-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ287488B6 (en) | Method of determining state of liver functions of individual including liver implant recipient | |
| KR19980703302A (ko) | 글루타치온 s-트랜스퍼라제의 하나 또는 그 이상의 아이소엔자임 검출에 기초한 장기 상태 평가를 위한 쾌속 검정법 | |
| Chang et al. | Detection, quantitation, and localization of bovine angiogenin by immunological assays | |
| CA2366651C (en) | A method for detecting megsin protein and use thereof | |
| JPH03500087A (ja) | 抗体結合性血小板の免疫検定 | |
| EP2092342B1 (en) | A method for measuring plasma levels of pentraxin ptx3 | |
| US20080293161A1 (en) | Detection of Carbohydrate Biomarkers | |
| WO1986005591A1 (fr) | Procede de determination immunologique d'une substance biologique dans un echantillon | |
| RU2164027C2 (ru) | Способ определения состояния печени | |
| Katsunuma et al. | Kininogen domain 3 contains regions recognized by antiphosphatidylethanolamine antibodies | |
| AU710668B2 (en) | Method of determining or detecting donor organ damage following xenotransplantation based on donor-organ derived analytes | |
| JP2004026805A (ja) | 酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ５ｂに特異的なモノクローナル抗体およびその用途 | |
| RU2157540C2 (ru) | Способ определения или обнаружения повреждения органа-донора после ксенотрансплантации на основе анализа веществ, полученных из органа-донора | |
| US20050130241A1 (en) | Immunological detection of prostate diseases and prostasome-related conditions | |
| Miller et al. | Characterization of a chick embryonic erythrocyte antigen using immunochemical electron microscopy | |
| JP4681175B2 (ja) | 播種性血管内凝固症候群及びその発症前段階を検出する方法 | |
| JP3159744B2 (ja) | 抗腎抗体、それを含有する腎疾患診断薬、腎疾患診断キットおよび腎疾患由来抗原の測定法 | |
| JP2868841B2 (ja) | Ｇｍｐ異常症の検出方法及びキット | |
| WO2004003020A1 (ja) | 外リンパ瘻の検出方法 | |
| JPWO2003091733A1 (ja) | 動脈硬化症および動脈硬化性合併症発症の危険度の判定方法 | |
| JPH0892297A (ja) | μ−カルパイン８０ＫサブユニットのＮ末端ペプチドに対する抗体及びこれを用いる免疫測定方法及び測定試薬 | |
| HK1018508A (en) | Method of determining the hepatic status of an individual, including a liver transplant recipient | |
| EP1071953A1 (en) | Detection and diagnosis of conditions associated with lung injury | |
| JP2000065838A (ja) | 臓器移植後の慢性拒絶反応の検査法 | |
| JPH06249852A (ja) | Ｄ−アミノ酸酸化酵素ポリクローナル抗体ならびに該抗体を使用するｄ−アミノ酸酸化酵素の測定方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20020202 |