ES2262153T3

ES2262153T3 - Metodo para determinar el estado hepatico de un receptor de transplante de higado.

Info

Publication number: ES2262153T3
Application number: ES96901946T
Authority: ES
Inventors: John Martin Doyle; Cormac Gerard Kilty; Fiona Mary Manning
Original assignee: Biotrin Intellectual Properties Ltd
Current assignee: Biotrin Intellectual Properties Ltd
Priority date: 1996-02-02
Filing date: 1996-02-02
Publication date: 2006-11-16
Anticipated expiration: 2016-02-02
Also published as: HUP9903578A2; CZ228898A3; EP0880700B1; EP0880700A1; CZ287488B6; CA2246072A1; BR9612475A; PL328518A1; DE69635979D1; ATE322013T1; DE69635979T2; WO1997028449A1; AU712180B2; US6183977B1; AU4632396A; JP2000505544A

Abstract

UN METODO PARA LA DETERMINACION DEL ESTADO HEPATICO DE UN INDIVIDUO COMPRENDE LA MEDICION DEL NIVEL DE LA ISOFORMA DE LA PI GLUTATION S - TRANSFERASA ( PI GST) EN UNA MUESTRA DE UN FLUIDO BIOLOGICO PROCEDENTE DEL INDIVIDUO MEDIANTE UN INMUNOENSAYO ESPECIFICO PARA LA ISOFORMA DE LA PI GST, COMPARANDO EL NIVEL DE PI GST MEDIDO CON EL INTERVALO NORMAL DE PI GST EN EL FLUIDO BIOLOGICO Y, CUANDO SE DETECTE UN INCREMENTO EN EL NIVEL DE PI GST EN COMPARACION CON EL INTERVALO NORMAL, LA DETERMINACION DEL ESTADO HEPATICO DEL INDIVIDUO EN BASE AL NIVEL DE PI GST EN EL FLUIDO BIOLOGICO. EL METODO TIENE UNA APLICACION PARTICULAR EN EL CASO DEL TRANSPLANTE DE HIGADO, QUE PERMITE LA DETERMINACION EN UN ESTADO MUY PRECOZ POSTIMPLANTACION DE LA POSIBILIDAD DE UN RECHAZO YA QUE PRINCIPALMENTE EL RECHAZO DEL TRANSPLANTE SE PRODUCE POR LO GENERAL EN EL ARBOL BILIAR.

Description

Método para determinar el estado hepático de un receptor de trasplante de hígado.

Campo técnico

La presente invención se refiere a un método para determinar el estado hepático de un sujeto, incluso un receptor de trasplante hepático y, así, decidir la terapéutica adecuada o acción correctiva, de ser necesario, según el estado hepático.

Antecedentes en el arte

La capacidad para diferenciar entre los distintos tipos de lesión hepática tiene gran importancia para el tratamiento de pacientes trasplantados y personas que padecen otras enfermedades hepáticas que pueden afectar el sistema biliar.

Las glutatión-S-transferasas (GST) comprenden una familia de genes múltiples de proteínas que consisten sobre todo en isoformas de clase alfa (\alphaGST), mu (\muGST), pi (\piGST) y theta (\thetaGST), definidas por el punto isoeléctrico y responsables de la detoxificación de un rango de xenobióticos, principalmente a través de la conjugación a glutatión (Beckett, G.J. y Hayes, J.D., Advances in Clinical Chemistry (1993); 30, 281.380). Por lo general, las proteínas tienen naturaleza dimérica, y consisten en dos subunidades de 25-27 kDa, y pueden existir en formas homodiméricas y heterodiméricas. La \pi glutatión-S-transferasa (\piGST) es un homodímero, y está localizado en el citoplasma de las células epiteliales del conducto biliar dentro del hígado (Beckett, G.J. y Hayes, J.D., (1993) supra). Se sabe que \alphaGST se encuentra en los hepatocitos, dentro del hígado, y existe en estados homodiméricos y heterodiméricos (Campbell, J.A.H., et al., Cancer (Filadelfia) (1991) 67, 1608-1613; Howie, A.F., et al., Clin Chem. Acta., (1988) 177, 65-76). Esta distribución heterogénea de \alphaGST y \piGST sugiere que las distintas isoenzimas tienen singulares funciones in vivo en distintas regiones hepáticas (Campbell, J.A.H., et al., (1991) supra).

El documento EP-A0 640 145 describe un método que contribuye al diagnóstico temprano de rechazo en un receptor de trasplante hepático, que comprende medir un aumento de \alphaGST en plasma o suero del receptor, en ausencia o antes de cualquier cambio de las transaminasas plasmáticas o séricas. En consecuencia, se demostró en forma concluyente que la medición de la concentración plasmática de \alphaGST facilita el monitoreo del estado hepático posterior al trasplante, al actuar como marcador extremadamente sensible, aunque no del todo específico, del rechazo de trasplante.

Es notable que \piGST no haya sido objeto de atención como posible marcador de rechazo de injerto, posiblemente debido a las bajas concentraciones de enzima presentes en las células epiteliales biliares hepáticas. Sin embargo, existen ciertas evidencias de la presencia de \alphaGST y \piGST en bilis de individuos normales y de personas que padecen cánceres específicos (p. ej., colangiocarcinoma), medidas mediante radioinmunoensayo (Howie, A.F., et al., Clin. Chem. Acta. (1989) 184, 269-278). Además, algunos autores refieren que la medición de las concentraciones plasmáticas de \piGST puede facilitar el diagnóstico de tumores malignos, dado que \piGST parece expresarse específicamente en tejidos malignos (Niitsu, Y., et al., Cancer (1989) 63, 317-323; Howie, A.F., et al., Clin. Chem. Acta. (1990) 36(3), 453-456, e Hida, T., et al., Cancer (1994) 73(5), 1377-1382). Ninguno de los autores antes mencionados alude al hecho de que \piGST pueda tener un papel importante en la predicción de rechazo del hígado trasplantado u otros trastornos hepáticos/biliares.

Dado que es sabido que en general ocurre rechazo primario de injerto en el árbol biliar dentro del hígado (Ascher, N. (1993) en "Immunology of liver transplantation", Neuberger, J. y Adams, D. (eds.)), parecería que la determinación específica de las concentraciones biliares o plasmáticas de \piGST pudieran permitir el diagnóstico del rechazo temprano, o facilitar la discriminación entre el daño hepatocelular o biliar posterior al trasplante. La importancia de distinguir entre daño hepático no específico y rechazo de injerto no puede ser sobreestimada, dado que el tratamiento de cada condición patológica es totalmente diferente. Además, la iniciación del tratamiento incorrecto sería extremadamente nociva para la salud de una persona que ya padece una enfermedad severa. Por ejemplo, si el daño del injerto se debiera a una infección viral (p. ej., reinfección por virus C o citomegalovirus (CMV), es necesario monitorear con cuidado las concentraciones del tratamiento de inmunosupresión antirrechazo, dado que el exceso de agentes inmunosupresores (p. ej., ciclosporina A o FK506) deterioraría de manera significativa la capacidad para combatir la infección viral. Por otra parte, la incapacidad para reconocer el rechazo genuino de una lesión no específica del injerto podría causar retraso en el aumento del tratamiento inmunosupresor, y en última instancia conducir a la extirpación del injerto.

En consecuencia, existe la necesidad de métodos para determinar el estado hepático de un individuo en diversos estados patológicos o condiciones anormales del hígado.

Descripción de la invención

La invención provee un método para determinar el estado hepático de un receptor de trasplante hepático respecto del rechazo del injerto después del trasplante hepático, en donde el método comprende la determinación del nivel de la isoforma pi glutatión-S-transferasa (\piGST) en una muestra de fluido biológico proveniente de dicho sujeto, mediante un inmunoensayo específico para la isoforma \piGST, al comparar la concentración de \piGST medida con el rango normal de \piGST en dicho fluido biológico y, cuando se detecta un aumento de la concentración de \piGST respecto de dicho
rango normal, determinar el estado hepático del sujeto en base a la concentración de \piGST en dicho fluido biológico.

Al proveer otro método para determinar el estado hepático en base a un marcador específico para un sitio hepático particular, se facilita en gran medida el tratamiento de pacientes con diversos estados patológicos y otras condiciones anormales del hígado después del transplante, tal como se describe en la presente con mayor detalle.

La invención tiene particular aplicación en el caso de trasplante hepático, dado que permite determinar, en una etapa muy temprana posterior al trasplante, la probabilidad de rechazo, dado que el rechazo primario del injerto generalmente tiene lugar en el árbol biliar intrahepático, como se estableció con anterioridad. En consecuencia, con el método de acuerdo con la invención es posible una detección aun más temprana del rechazo de transplante hepático respecto del método descrito y reivindicado en el documento EP-A 0 640 145.

De preferencia, el receptor es un humano.

De preferencia, el inmunoensayo es un enzimoinmunoensayo, más especialmente un enzimoinmunoensayo en emparedado.

El método de acuerdo con la invención se puede usar para medir \piGST en diversos medios, pero especialmente en bilis, plasma y suero,

En la presente, se entiende por fluidos biológicos corporales, por ejemplo, los fluidos corporales tales como bilis, plasma, suero y orina, además de medios de soporte de tejidos y perfundidos. En la presente, también se hace referencia a los fluidos biológicos en general como matrices.

El método de acuerdo con la invención facilita, por primera vez, la detección de la concentración de isoenzima \piGST en bilis.

Cuando el fluido biológico es bilis, la concentración normal de \piGST es inferior a 15 \mug/l.

Cuando el fluido biológico es plasma, la concentración normal de \piGST es inferior a 100 \mug/l.

Tal como se demuestra más adelante en la presente, se debe tener cuidado cuando se realiza el método en plasma, que este plasma se obtenga y almacene antes de la determinación en presencia de un anticoagulante en condiciones que no permitan que ocurra sustancial hemólisis durante el periodo de almacenamiento.

Hemos hallado que el uso de tubos de fluorooxilato causa alto grado de hemólisis, por lo que se libera \piGST de los eritrocitos, lo cual produce concentraciones elevadas falsas de \piGST. Otras isoenzimas GST no se encuentran en sangre, o están presentes en concentraciones extremadamente bajas. Por ejemplo, \muGST se encuentra en leucocitos. Sin embargo, de la bibliografía no surge con claridad si se encuentra en eritrocitos. En todo caso, \muGST sólo está presente en el 50% de la población, \thetaGST se expresa con una variabilidad, entre individuos, similar a \muGST y, de estar presente en sangre, esto ocurre en concentraciones extremadamente bajas. \alphaGST no se encuentra en sangre en grado notable.

En una forma de realización de preferencia, la muestra se diluye con un diluyente que contiene una cantidad efectiva de una proteína que optimiza las reacciones de antígeno-anticuerpo.

Hemos hallado que si el diluyente incluye Tween 20, de uso convencional como reactivo estándar en dichos métodos inmunométricos, se detectan concentraciones incorrectas de \piGST. Hemos hallado que si se usa una cantidad efectiva de una proteína que optimice las reacciones antígeno-anticuerpo es posible obtener una titulación lineal como la que se muestra en el Ejemplo 6.

En forma adecuada, la proteína es una albúmina sérica, por ejemplo albúmina sérica bovina o albúmina sérica humana.

El método de inmunoensayo de acuerdo con la presente invención se puede completar dentro de 2,5 h, tal como se describe más adelante en los Ejemplos. Esto es considerablemente más rápido que cualquier ensayo disponible en el comercio para la cuantificación de \piGST.

En consecuencia, la invención provee, en una forma de realización, un inmunoensayo que puede ser completado en menos de 2,5 h, basado en el agregado en secuencia de la muestra, el conjugado de antígeno-anticuerpo y el sustrato a cavidades de microtitulación, u otra superficie recubierta por IgG anti-\piGST monoclonal. La intensidad del color obtenido es proporcional a la cantidad de \piGST presente en la muestra, y el ensayo tiene un rango de 0-100 \mug/l. El rango de ensayo se extiende con facilidad al aumentar la dilución de la muestra.

De acuerdo con otra forma de realización de la invención, además se mide la concentración de la isoforma alfa glutatión-S-transferasa (\alphaGST) en una muestra de fluido biológico proveniente de dicho receptor, a fin de facilitar la diferenciación entre rechazo de injerto y daño hepatocelular no específico en dicho receptor.

Breve descripción de los dibujos

En los dibujos adjuntos:

La Fig. 1 es un diagrama esquemático del enzimoinmunoensayo en emparedado del Ejemplo 1;

La Fig. 2 es un gráfico de la absorbancia a 450/630 nm en función de la concentración de log \piGST (\mug/l) de acuerdo con el enzimoinmunoensayo para \piGST humano descrito en el Ejemplo 1;

La Fig. 3 es un análisis por SDS-PAGE de \muGST, \alphaGST y \piGST;

La Fig. 4. es un análisis por inmunoblot de \piGST humano;

La Fig. 5 es un gráfico de \alphaGST y \piGST (ng/ml) en bilis en función del tiempo tras la repercusión (horas) para cierta cantidad de pacientes;

La Fig. 6 es un gráfico de la concentración de \piGST en función del tiempo (días) para cierta cantidad de pacientes; y

La Fig. 7 es un gráfico de AST/ALT (U/L) y \alphaGST y \piGST (ng/ml) en función de los días posteriores al trasplante para un único paciente.

Métodos para realizar la invención

La invención se ilustrará mejor con los siguientes Ejemplos.

Ejemplo de preparación A

Purificación de \piGST humano

La \piGST se purifica a partir de placenta humana por cromatografía de afinidad. Los detalles precisos del procedimiento de purificación son los siguientes:

: 325 g de placenta humana se homogeneizaron durante 2 minutos en buffer de homogeneización, en una relación de una parte de placenta por tres partes de buffer, en un mezclador Waring (Waring es una marca comercial). El buffer de homogeneización tenía la siguiente composición:

: 20 mM de Tris-HCl

: 250 mM de sacarosa

: 5 mM de EDTA pH 7,8

: 2 \mug/ml de leupeptina

: 2 \mug/ml de pepstatina

: El homogenado de placenta se centrifugó a 10000 g durante 60 minutos.

: El sobrenadante luego se cargó en una columna de afinidad con glutatión-(GSH)-sefarosa, previamente equilibrada en 20 mM de Tris-HCl con 200 mM de NaCl, pH 7,8. El buffer de equilibración se reaplicó para fluir la proteína no ligada. Por último, se usó 50 mM de Tris-HCl pH 9,5 que contiene 5 mM de GSH para fluir el GST ligado de la columna de afinidad.

: El material eluido luego se dializó contra 0,1 M de PBS.

Ejemplo de preparación B

Producción y purificación de anticuerpo

Se inyectó \piGST humana purificada en conejos New Zealand White por vía subcutánea (s.c.) de acuerdo con el esquema temporal proporcionado a continuación, y se evaluó en el suero la reactividad anti-\piGST. Una vez determinado que el título de IgG [\piGST antihumano] era suficiente, por análisis de dot blot semicuantitativo, se tomaron muestras de sangre y se obtuvo el suero. Se purificó el IgG total de suero de conejo mediante cromatografía de afinidad de proteína A, y se usó para la conjugación con peróxido de rábano (HRP). Se obtuvo IgG monoclonal [\piGST antihumano] como ascitis de The University Hospital, Nijmegen, Países Bajos, y no se purificó más, antes del uso.

Esquema de inmunización (general)

Día 1: Una muestra de sangre de 5 ml de presuero se obtuvo de la oreja del conejo. Se mezcló 0,5 ml de antígeno \piGST humano (100 \mug) con un volumen igual de coadyuvante completo de Freund. La mezcla de antígeno y coadyuvante se homogeneizó hasta asegurar una buena emulsión. Luego se inyectó esta mezcla por vía subcutánea en múltiples sitios del lomo del conejo, previamente afeitado.

Día 28: Una muestra de sangre de 5 ml de suero se obtuvo de la oreja del conejo. Se mezcló 0,5 ml de antígeno (100 \mug) con un volumen igual de coadyuvante completo de Freund. La mezcla antígeno/coadyuvante se homogeneizó hasta asegurar una buena emulsión. Luego se inyectó esta mezcla por vía subcutánea en múltiples sitios del lomo del conejo.

Día 42: Una muestra de sangre de 10 ml de sangre se obtuvo de la oreja del conejo.

Día 56: Se aplicó una segunda muestra al conejo, según se describió el Día 28.

Día 70: Se obtuvo una muestra de sangre de 10 ml de la oreja del conejo. Cuando se obtuvo un título suficientemente elevado se sacrificó el conejo y se juntó toda la sangre posible.

Ejemplo de preparación C

Inmunoblotting

En todas las IgG policlonales y monoclonales de uso en los siguientes Ejemplos se controló la reactividad de \piGST y la posible reactividad cruzada contra \alphaGST y \muGST humanas, respectivamente, a través de las siguientes combinaciones por inmunoblot:

a): Se usó IgG [\piGST antihumano] de conejo como sondas de membranas de nitrocelulosa que contienen \alphaGST, \piGST y \muGST humanas inmovilizadas.

b): Se usó IgG [\piGST antihumano] murino como sondas de membranas de nitrocelulosa que contienen \alphaGST, \piGST y \muGST humanas inmovilizadas.

El método usado para detectar inmunoblot era el siguiente:

1. También se incluyeron \alphaGST, \piGST y \muGST humanas inmovilizadas (0,5 \mug/carril) se sometieron a electroforesis en 15% de SDS-PAGE con marcadores de peso molecular.

2. Tras la electroforesis, se cortó el gel de poliacrilamida y la mitad se tiñó para detectar proteínas, mientras que el resto se usó para transferencia electroforética sobre nitrocelulosa.

3. Después de la transferencia electroforética, se bloquearon las membranas de nitrocelulosa durante 1 hora con 5% (p/v) de Marcel (Marcel es una marca comercial) en solución fisiológica con buffer fosfato que contiene 0,05% (p/v) de buffer bloqueante TWEEN-20 (PBST).

4. Luego se prepararon las siguientes soluciones:

i): IgG [\piGST antihumano] de conejo en 1% (p/v) de Marvel en PBST.

ii): IgG [\piGST antihumano] murino en 1% (p/v) de Marvel en PBST, y se agregaron a las membranas, una vez decantado el buffer bloqueante.

Se permitió la incubación con las soluciones de anticuerpo durante una hora.

5. Luego se lavaron las membranas de nitrocelulosa en PBST (2 \times 5 min cada uno).

6. Luego se preparó conjugado IgG-HRP anticonejo (1/1000 en 1% (p/v) de Marcel en PBST, y se agregó a 4 i) anterior.

También se preparó conjugado IgG-HRP antimurino (1/1000) y se agregó a 4 ii) anterior.

7. Tras una hora de incubación con conjugados antiespecie se descartaron los reactivos y las membranas se lavaron como en 5 anterior.

8. Luego se preparó sustrato de diaminobencidina y se agregó a la membrana.

Un precipitado marrón en la membrana de nitrocelulosa indica una reacción positiva.

Ejemplo de preparación D

Síntesis de conjugado de IgG anti-\piGST-peroxidasa de rábano (HRP)

Se sintetizaron conjugados de IgG anti-\piGST-HRP mediante la metodología de conjugación de tioéter (Duncan, R.J.S., et al., (1983); Anal. Biochem. 132, 68-73). Se introdujeron grupos maleimida reactivos en las moléculas de IgG con SMCC (1-carboxilato de succinimidil 4-(N-maleimidometil)ciclohexano) y los grupos sulfhidrilo enmascarados se ligaron a HRP. Después de una etapa de desenmascaramiento para obtener grupos sulfhidrilo reactivos, se mezclaron la IgG activada por maleimida y HRP-SH, y se dejaron reaccionar durante 4,5 horas. El conjugado IgG-HRP obtenido, formado por enlace tioéter covalente, se llevó al 50% (v/v) con glicerol y se guardó a -20ºC para ser usado en el EIA del Ejemplo 1.

Ejemplo 1 Enzimoinmunoensayo en emparedado

El formato del inmunoensayo para la detección cuantitativa de \piGST humano es un formato en emparedado convencional, tal como se describió esquemáticamente en la Fig. 1, y más adelante.

a. Una placa de microtitulación Nunc Maxisorp (Nunc Maxisorp es una marca comercial) se recubrió con IgG [\piGST antihumano] monoclonal (a que se hace referencia en el Ejemplo de preparación B) inmovilizado mediante fragmentos F(ab)_{2} de cabra [IgG antimurinos]. Este método de cubierta de anticuerpo sirve para orientar los sitios de fijación Mab y también mejora la sensibilidad del ensayo al minimizar la desnaturalización del anticuerpo de captura inducida por la adherencia.

b. La \piGST humana purificada de placenta tal como se describió en el Ejemplo de preparación A se usó como calibrador del ensayo.

c. Se usaron conjugados de IgG [\piGST anti-humano]-HRP asociados con sustrato de tetrametilbencidina (TMB) para facilitar la detección de \piGST capturada/inmovilizada.

d. La reacción enzimática se detuvo mediante la adición de IN H_{2}SO_{4}, y se midió la absorbancia a 450 nm, con 630 nm como longitud de onda de referencia. La intensidad de color fue proporcional a la concentración de \piGST, y después de generar un gráfico de A_{450/630 \ nm} en función de la concentración (\mug/l), se puede determinar la concentración de las muestras desconocidas (ver Fig. 2). El tiempo total del ensayo fue inferior a 2,5 horas.

Se halló que el tiempo total del ensayo era de 2 horas 15 minutos, y las condiciones de ensayo incluyeron la agitación de la placa de microtitulación a temperatura fija durante las etapas de incubación de la muestra y el conjugado, respectivamente. La incubación del sustrato TMB solo requirió condiciones de temperatura fija.

Ejemplo 2 Recolección de plasma para análisis de \piGST

Se analizó el efecto de diversos anticoagulantes (ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), heparina de litio, citrato de sodio y fluorooxilato) y otros tubos de recolección de plasma (que contienen inhibidores de plaquetas) de uso común sobre las concentraciones de \piGST en plasma. Las muestras se recolectaron por punción venosa en tubos que contenían el anticoagulante particular. Se separó el plasma por centrifugación (6000 durante 10 min). Se extrajo el sobrenadante y se analizaron las muestras según el protocolo descrito en el Ejemplo 1.

Se juntó plasma de cierta cantidad de individuos en un conjunto de tubos de recolección de plasma. Cada muestra se procesó como se describió con anterioridad, y se controló la liberación de \piGST al plasma durante un periodo de 24 horas. La Tabla 1 siguiente demuestra las concentraciones de \piGST en plasma proveniente del mismo individuo juntado en cuatro tubos de recolección de plasma diferentes, analizados a T0 y T24. Los resultados demuestran que no hay diferencias significativas en las concentraciones de \piGST en el plasma recolectado en presencia de cualquiera de los anticoagulantes anteriores. No parece haber aumentos significativos de las concentraciones de \piGST (causadas por la liberación de \piGST de eritrocitos o plaquetas) cuando el plasma no separado se almacena hasta 24 horas. La excepción está constituida por los tubos de fluorooxilato, en los que ocurrió alto grado de hemólisis, con liberación de \piGST provenientes de eritrocitos, lo cual da concentraciones falsamente elevadas de la proteína, tal como se muestra en la Tabla 1.

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TABLA 1

Comparación de la influencia de anticoagulantes en tubos de recolección de plasma para el análisis de \piGST en plasma

Los valores se dan en \mug/l
Paciente	EDTA	Li/Hep	Citrato de Na	Oxilato F1
	T0	724	T0	T24	T0	T24	T0	T24
1	171,9	22,2	199,4	194,7	167,5	220,3	170,0	>500
2	65,5	70,5	62,8	88,4	53,2	65,4	55,4	>500
3	59,6	78,6	65,4	88,6	53,7	68,4	59,9	>500
4	81,7	92,8	90,2	119,5	74,9	122,1	81,2	>500
5	46,7	67,5	44,6	73,3	28,9	68,6	60,9	>500

De la Tabla 1 se puede observar que no hay diferencia significativa entre las concentraciones de \piGST en plasma recolectada en presencia de cualquiera de los anticoagulantes anteriores.

Ejemplo 3 Evaluación de pureza de los reactivos del inmunoensayo

La Fig. 3 ilustra la pureza de \piGST humano obtenido por el procedimiento del Ejemplo A antes de la inmunización en conejos, y confirma la ausencia de cualquiera de las demás proteínas derivadas humanas que de otro modo podrían contribuir a la especificidad reducida del ensayo. En la Fig. 3:

Carril 1	=	\muGST
Carril 2	=	\alphaGST
Carril 3	=	\piGST
Carril 4	=	marcadores de peso molecular

El análisis por inmunoblot de la reactividad del anticuerpo monoclonal reveló que la IgG[\piGST antihumana] era altamente específica para la \piGST humana y no exhibió reactividad cruzada significativa con \alphaGST o \muGST humanas. Los resultados se muestran en la Figura 4.

	Carril 1	=	\piGST
	Carril 2	=	marcadores de peso molecular

Hallazgo avalado por la falta de reactividad de \alphaGST y \muGST en el enzimoinmunoensayo específico de \piGST, tal como se muestra en la Tabla 2.

TABLA 2 Evaluación de reactividad de \alphaGST y \muGST humanas en el enzimoinmunoensayo para la detección de \piGST humana

Conc. GST	A_{450/630 \ nm}
	\piGST	\alphaGST	\muGST
0,00	0,022	0,022	0,022
3,12	0,087	0,024	0,016
12,5	0,299	0,020	0,022
25,0	0,688	0,036	0,055
50,0	1,204	0,018	0,034
100	1,735	0,040	0,043

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De la Tabla 2 surge con claridad que no se evidencia reactividad cruzada para \alphaGST o \muGST en este ensayo.

La significancia de este hecho tiene fundamental importancia, dado que implica que el enzimoinmunoensayo para la cuantificación de \piGST humana es específica para la detección de \piGST humana. En consecuencia, toda la \piGST humana presente en las muestras se puede detectar específicamente, sin contaminación cruzada por otras GST.

Ejemplo 4 Cuantificación de \piGST en bilis

Se analizó cierta cantidad de muestras de bilis provenientes de pacientes con daño específico hepático/biliar en la muestra para \piGST humana. Se halló que los pacientes con carcinoma hepatocelular (HCC) y cirrosis biliar primaria (PBC) contenían concentraciones muy elevadas de \piGST. También se halló un paciente con cálculos en el conducto biliar (BDS) que tenía concentración elevada de \piGST, pero no tan elevada como las de HCC y PBC, tal como se muestra en la Tabla 3.

TABLA 3 Concentraciones de \piGST en bilis de pacientes con carcinoma hepatocelular (HCC), cirrosis biliar primaria (PBC) y cálculos del conducto biliar (BDS)

Condición	[\piGST] (\mug/l)
HCC	5357
PBC	2432
BDS	506,6

Todos estos ejemplos muestran concentraciones significativamente elevadas de \piGST.

Ejemplo 5 Utilidad clínica de la cuantificación de \piGST

Se obtuvieron muestras seriadas de bilis y plasma de pacientes después de cirugías de trasplante hepático, y se analizaron para determinar \piGST y \alphaGST, respectivamente. Los pacientes exhibieron un rango de condiciones posoperatorias, desde la recuperación sin inconvenientes, hasta el rechazo agudo y la reinfección por hepatitis C, que normalmente se asocian con el trasplante.

Se observó cierta cantidad de tendencias significativas cuando se monitorearon simultáneamente las concentraciones de \piGST y \alphaGST en bilis. Se midió \alphaGST de acuerdo con el procedimiento descrito en el documento EP-A 0 640 145. En una recuperación sin inconvenientes se detectó \piGST apenas 2 horas después del trasplante, y las concentraciones permanecieron bajas (es decir, por debajo de 50 \mug/l). Los niveles de \alphaGST eran elevados inicialmente debido a daño por repercusión, pero retornaron a los niveles basales dentro de los 2 días, como se muestra en la Fig. 5. Esta figura muestra el típico curso de una \alphaGST y \piGST durante y después del trasplante hepático humano. Las concentraciones de \piGST permanecieron bajas. También se pudieron identificar complicaciones asociadas con el trasplante de hígado. Uno de los principales riesgos es el rechazo agudo, o el aún más severo rechazo resistente a esteroides. Hemos hallado que en estos casos particulares hubo un significativo aumento de la concentración de \piGST sostenida durante días, tal como se muestra en la Fig. 6. Esta figura muestra las concentraciones de \piGST durante episodios de rechazo resistente a esteroides (SR) y de rechazo agudo (AR). Las concentraciones son elevadas y permanecen altas durante al menos 20 días. Las concentraciones de \alphaGST también estaban elevadas, pero retornaron a niveles basales dentro de 5-8 días.

La posibilidad de infección o de reinfección es otro riesgo grave relacionado con el trasplante. Hemos visto que en episodios de reinfección por HCV se observan concentraciones muy elevadas de \alphaGST durante un periodo prolongado (es decir, al menos 25 días). Sin embargo, las concentraciones de \piGST permanecieron cercanas a la normalidad, tal como se muestra en la Fig. 7. Esto contrasta en forma aguda con los casos previos de rechazo agudo, donde se daba la inversa. En consecuencia, mediante la cuantificación simultánea de \alphaGST y \piGST era posible diferenciar con éxito entre el rechazo agudo y la reinfección por HCV, lo cual previamente era muy difícil, y representaba un dilema terapéutico para los cirujanos de trasplantes.

Ejemplo 6 Linealidad de la dilución de las muestras de bilis

Se obtuvo cierta cantidad de muestras de bilis de pacientes con daño específico hepático/biliar (carcinoma hepatocelular y cirrosis biliar primaria), además de muestras provenientes de bilis de donante, y después del trasplante hepático. En estas muestras se analizó \piGST humana, según el protocolo del Ejemplo 1.

Se usó cierta cantidad de diluyentes estándar como diluyentes de muestra para la titulación de las muestras de bilis. Estos diluyentes se usan de rutina en muchos sistemas de ensayo, en donde Tween-20 es el detergente más comúnmente usado. Son embargo, hallamos que la presencia de este detergente particular en el diluyente de la muestra causa resultados erróneos. Se observaron falsas concentraciones elevadas de \piGST en las muestras diluidas con diluyentes que contenía Tween-20, causadas por titulación insuficiente, tal como se muestra en la Tabla 4. En ausencia de Tween-20, se observó titulación lineal de Tween-20. En consecuencia, un factor esencial de este ensayo es la ausencia de Tween-20 (un reactivo estándar) en el diluyente de la muestra, dado que se pueden observar falsas concentraciones elevadas de \piGST en el caso de usarlo.

TABLA 4 Comparación de una muestra de bilis en PBC con diluyentes con Tween-20 y sin él

Los valores se dan en \mug/l
Dilución	- Tween-20	+ Tween-20
1/50	2344	3074
1/100	2374	5187
1/200	2410	7059

La titulación lineal se observó solamente con el diluyente sin Tween-20.

Ejemplo 7 Comparación de anticuerpos policlonales y monoclonales como anticuerpos de cobertura

Las IgG anti-\piGST humano policlonales y monoclonales se inmovilizaron sobre placas Nunc Maxisorp en forma directa o a través de un ligador (fragmentos F(ab)_{2} de IgG antiespecie de cabra). Luego se corrieron estándares de concentraciones conocidas de \piGST humana, tal como se describe en el Ejemplo 1, y se compararon las absorbancias de concentraciones de IgG inmovilizadas similares.

Los anticuerpos policlonales y monoclonales se recubrieron sobre la fase sólida para su uso como anticuerpo de captura. El recubrimiento directo de los anticuerpos policlonal y monoclonal dio por resultado lecturas de muy baja absorbancia para la curva estándar (véase Tabla 5). Cuando se logró la inmovilización mediante un anticuerpo ligador (IgG antimurino/anticonejo de cabra) se obtuvo un significativo aumento de los valores de D.O. para el anticuerpo monoclonal. No obstante, no se observó dicho aumento para el anticuerpo policlonal.

TABLA 5 Comparación de métodos de recubrimiento para la detección de \piGST humana

[\piGST]	Cubierta directa	Cubierta a través de anticuerpo ligador
	Policlonal	Monoclonal	Policlonal	Monoclonal
100	0,625	0,421	0,352	1,557
0	0,044	0,038	0,235	0,095

El recubrimiento directo del anticuerpo sobre la fase sólida (2 \mug/ml) se comparó con la cubierta a través de un anticuerpo ligador (antiespecie de cabra de 2 \mug/ml), con el anticuerpo anti-\piGST en una concentración fija.

Claims

1. Un método para determinar el estado hepático de un receptor de trasplante hepático respecto del rechazo de injerto después de un trasplante de hígado, en donde el método comprende medir la concentración de la isoforma pi glutatión-S-transferasa (\piGST) en una muestra de un fluido biológico de dicho sujeto mediante un inmunoensayo específico de la isoforma \piGST, comparar la concentración de \piGST medida con el rango normal de \piGST en dicho fluido biológico y, cuando se detecta un incremento de la concentración de \piGST respecto de dicho rango normal, determinar el estado hepático del sujeto en base a la concentración de \piGST en dicho fluido biológico.

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el sujeto es un humano.

3. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en donde el inmunoensayo es un enzimoinmunoensayo.

4. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el fluido biológico es bilis y la concentración normal de \piGST es inferior a 15 \mug/l.

5. Un método de acuerdo con la reivindicación 3, en donde el fluido biológico es plasma y la concentración normal de \piGST es inferior a 100 \mug/l.

6. Un método de acuerdo con la reivindicación 5, en donde el plasma se junta y se almacena antes de la determinación en presencia de un anticoagulante en condiciones que no permitan que ocurra sustancialmente hemólisis durante dicho período de almacenamiento.

7. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la muestra se diluye con un diluyente que contiene una cantidad efectiva de una proteína que optimiza las reacciones antígeno-anticuerpo.

8. Un método de acuerdo con la reivindicación 7, en donde la proteína es una albúmina sérica.

9. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la totalidad del inmunoensayo se completa en menos de 2,5 horas.

10. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde, además, se mide la concentración de la isoforma alfa glutatión-S-transferasa (\alphaGST) en una muestra de un fluido biológico proveniente de dicho receptor, a fin de facilitar la diferenciación entre el rechazo del injerto y el daño hepatocelular no específico en dicho receptor.