CZ291499A3 - Prostředky pro léčbu ARDS nebo IRDS obsahující 3-(cyklopropylmethoxy)-N-(3,5-dichloro-4-pyridinyl)-4-(difluoromethoxy)benzamid a plicní surfaktant - Google Patents

Description

Proteinase K resistentní povrchový protein Neisseria meningitidis

Oblast techniky

Tento vynález se týká vysoce konzervovaného, imunologicky dostupného antigenu na povrchu organismů Neisseria meningitidis. Tento jedinečný antigen poskytuje základ pro nová imunoterapeutická, profylaktická a diagnostická agens použitelná při léčbě onemocnění způsobených Neisseria meningitidis. Přesněji se tento vynález týká na proteinasu K resistentního povrchového proteinu Neisseria meningitidis majícího zdánlivou molekulovou hmotnost 22 kDa, korespondujících nukleotidových a odvozených aminokyselinových sekvencí (SEQ ID NO: 1 až SEQ ID NO: 26), rekombinantních DNA metod pro produkci 22 kDa povrchového proteinu Neisseria meningitidis, protilátek, které se váží na 22 kDa povrchový protein Neisseria meningitidis a metod a kompozic pro diagnosu, léčbu a prevenci onemocnění způsobených Neisseria meningitidis.

Dosavadní stav techniky

Neisseria meningitidis je významnou příčinou smrti a morbidity ve světě. Neisseria meningitidis způsobuje jak endemické, tak epidemické choroby, hlavně meniningitidu a meningokokcemii (Gold, Evolution of meningococcal disease, str. 69, Vedros N. A., CRC Press (1987); Schwartz et al., Clin. Microbiol. Rev., 2, str. S118 (1989)). Tento organismus je ve skutečnosti jednou z nejběžnějších příčin, po Haemophilus influenzae typu b, bakteriální meningitidy ve Spojených Státech Amerických, kde způsobuje asi 20 % všech případů. Bylo dobře dokumentováno, že baktericidní aktivita séra je hlavním obranným mechanismem proti Neisseria meningitidis a že ochrana proti invasi bakterií koreluje s přítomností sérových anti-meningokokových protilátek (Goldschneider et al., J. Exp. Med., 129, str. 1307 (1969); Goldschneider et al., J. Exp. Med., 129, str. 1327 (1969).

Neisseria meningitidis jsou děleny do serologických skupin podle přítomnosti kapsulárních antigenů. Nyní je rozpoznáno 12 seroskupin, ale nej častěji jsou nacházeny seroskupiny A, B, C, Y a W-135. V seroskupinách mohou být identifikovány serotypy, subtypy a imunotypy na proteinech zevní membrány a lipopolysacharidech (Frasch et al., Rev. Infect. Dis., 7, str. 504 (1985) ) .

Nyní dostupné kapsulární polysacharidové vakciny nejsou účinné proti všem Neisseria meningitidis izolátům a neindukují účinně produkci ochranných protilátek u malých dětí (Frasch, Clin. Microbiol. Rev., 2, str. P134, (1989); Reingold et al., Lancet, str. 114, (1985); Zollinger, ve Woodrow and Levine, New generation vaccines, str. 325, Marcel Dekker Inc. N. Y. (1990)) . Kapsulární polysacharidy seroskupin A, C, Y a W-135 jsou nyní používány ve vakcinách proti tomuto organismu. Tyto polysacharidové vakciny jsou účinné v krátké době, nicméně, u vakcinovaných subjektů se nevyvíjí imunologická paměť., takže musí být revakcinováni během tříleté periody, aby si uchovali svou hladinu resistence.

Dále, tyto polysacharidové vakciny neindukují dostatečné hladiny bakteriálních protilátek pro získání požadované ochrany u dětí do dvou let věku, které jsou hlavními oběťmi tohoto onemocnění. Žádná účinná vakcina proti izolátům seroskupiny B není dosud dostupná, ačkoliv tento organismus je jednou z primárních příčin memingokokových onemocnění v rozvinutých zemích. Kromě toho, polysacharid seroskupiny B není dobrý imunogen a indukuje pouze slabou odpověď IgM s nízkou specifitou, která není protektivní (Gotschlich et al., J. Exp. Med., str. 129, 1349 (1969); Skevakis et al., J. Infect. Dis., 149, str. 387 (1984); Zollinger et al., J. Clin. Invest., 63, str. 836, (1979)). Kromě toho, přítomnost významně podobných, zkříženě reaktivních struktur mezi glykoproteiny lidské mozkové tkáně u novorozenců (Finneet al., Lancet, str 355 (1983)) může bránit pokusům o zlepšení imunogenicity polysacharidu seroskupiny B.

Pro získání účinější vakciny jsou zkoumány jiné povrchové antigeny Neisseria meningitidis jako je lipopolysacharid, pili proteiny a proteiny přítomné na zevním povrchu. Přítomnost lidské imunitní odpovědi a baktericidních protilátek proti jistým těmto proteinovým povrchovým antigenům v séru imunizovaných dobrovolníků a pacientů v rekonvalescenci byla demonstrována (Madrell and Zollinger, Infect. Immunol., 57, str. 1590, (1989); Poolman et al., Infect. Immunol., 40, str. 398, (1983); Rosenquist et al., J. Clin. Microbiol., 26, str. 1543, (1988); Wedege and Froholm, Infect. Immunol., 51, str. 571, (1986); Wedege and Michaelsen, J. Clin. Microbiol., 25, Str. 1349, (1987) ) .

Dále, monoklonální protilátky namířené proti proteinům zevní membrány, jako je třída 1, 2/3 a 5, byly také popsány jako baktericidní a jako ochranné proti pokusné infekci u zvířat (Brodeur et al., Infect. Immun., 50, str 510 (1985); Frasch et al., Clin. Invest. Med., 9, str. 261, (1987); Saukkonen et al., Microb. Pathogen., 3, str. 261, (1987); Saukkonen et al., Vaccine, 7, str. 325, (1989)).

U přípravků proteinů založených na proteinech zevního povrchu Neisseria meningitidis byly demonstrovány imunogenní účinky u zvířat a u lidí a některé z nich byly testovány v klinických zkoušeních (Bjune et al., Lancet, str. 1093, (1991); Costa et al., NIPH Annals, 14, str. 215, (1991); Frash et al., Med. Trop., 43, str. 177 (1982); Frasch et al., Eur. J. Clin. Microbiol., 4, str. 533 (1985); Frasch et al., v Robbins, Bacterial Vaccines, str. 262, Praeger Publications, N. Y. (1987); Frasch et al., J. Infect. Dis., 158, str. 710 (1988); Moreno et al., Infect Immun., 47, str 527 (1985); Rosenquist et al., J. Clin. Microbiol., 26, str. 1543, (1988); Sierra et al., NIPH Annals, 14, str. 195 (1991); Wedege and Froholm, Infect Immun., 51, str. 571, (1986); Wedege and Michaelsen, J. Clin. Microbiol., 25, str. 1349 (1987); Zollinger et al., J. Clin. Invest., 63, str. 836 (1979); Zollinger et al., NIPH Annals, 14, str. 211 (1991)). Nicméně, existence značné mezikmenové antigenni variability v proteinech zevní membrány limituje jejich použití ve vakcině (Frasch, Clin. Microb., Rev. 2, str. S134 (1989)). Kromě toho, většina z těchto přípravků indukovala bakteriální protilátky, které byly omezeny na stejný nebo příbuzný serotyp, ze kterého byl antigen extrahován (Zollinger, ve Woodrow and Levine, New generation vaccines, str. 325, Marcel Dekker Inc. N. Y. (1990)). Dále, ochrana udělená těmito vakcinami u malých dětí nebyla dosud jasně stanovena. Vysoce konzervované proteiny zevního povrchu Neisseria meningitidis jako je třída 4 (Munkley et al., Microb. Pathogen., 11, str. 447 (1991)) a lip protein (též zvaný H.8) (Woods et al., Infect

Immun., 55, str. 1927 (1987)) nejsou zajímavými kandidáty pro vakcinu, jelikož nezvyšují produkci baktericidních protilátek. Pro zlepšení těchto přípravků vakcin zde existuje potřeba vysoce konzervovaných protienů, které budou přítomny na povrchu všech kmenů Neisseria meningitidis a které budou schopné vyvolat baktericidní protilátky tak, aby bylo možné vyvinout širší spektrum vakcin.

Nyní používaná laboratorní diagnostika Neisseria meningitidis je obvykle prováděna technikami jako je Gramovo barvení natřených přípravků, latexová aglutinace nebo koaglutinace a kulitvace a izolace v obohaceném a selektivním mediu (Morello et al., v Balows, Manual of Clinical Microbiology, str. 258, American Society for Microbiology, Washington, (1991)). Testy degradace uhlovodanů jsou obvykle provedeny pro potvrzení identifikace izolátů Neisseria meningitidis. Většina z popsaných postupů jsou časově náročné procesy vyžadující školený personál. Komerční aglutinační nebo koaglutinační kity obsahující polyvalentní sérum namířené proti prevalentní seroskupinám jsou používány pro rychlou identifikaci Neisseria meningitidis. Nicméně, tato polyvalentní séra často nespecificky zkříženě reagují s jinými bakteriálními druhy a z tohoto důvodu by měly být použity v konjunkci s Gram barvením a kultivací. V souladu s tím zde existuje potřeba účinné alternativy pro tyto diagnostické testy pro zlepšení rychlosti a spolehlivosti diagnosy.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález řeší problem popsaný výše tím, že poskytuje vysoce konzervovaný, imunologicky dostupný antigen na povrchu Neisseria meningitidis organismu. Také jsou poskytnuty rekombinantní DNA molekula, která kóduje uvedený antigen, jednobuněční hostitelé transformovaní touto DNA molekulou a proces pro výrobu v podstatě čistého, rekombinantního antigenu. Také jsou poskytnuty protilátky specifické pro uvedený antigen Neisseria meningitidis. Antigen a protilátky podle předkládaného vynálezu poskytují základ pro jedinečné metody a farmaceutické kompozice pro detekci, prevenci a léčbu onemocnění Neisseria meningitidis.

Preferovaným antigenem je 22 kDa povrchový protein Neisseria meningitidis, včetně jeho fragmentů, analogů a derivátů. Preferované protilátky jsou Me-1 a Me-7 monoklonální protilátky specifické pro 22 kDa povrchový protein Neisseria meningitidis. Tyto protilátky jsou vysoce bakteriolytické proti Neisseria meningitidis a pasivně chrání myší před pokusnou infekcí.

Předkládaný vynález dále poskytuje metody pro izolaci nových povrchových antigenů Neisseria meningitidis a protilátek k nim specifických.

Přehled obrázků na výkresech

Obrázek 1 znázorňuje nukleotidovou a odvozenou aminokyselinovou sekvenci 22 kDa povrchového proteinu Neisseria meningitidis kmene 608B (SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2). Jsou použity běžné třípísmenné symboly pro aminokyselinové zbytky. Otevřený čtecí rámeček je v rozsahu od start kodonu base 143 do stop kodonu base 667. Rámečky ukazují putativní vazebná místa pro ribosomy, zatímco putativní -10 promotorové sekvence je podtržena. 19-aminokyselinový signální peptid je také podtržen.

Obrázek 2 je fotografie Coomasie modří barveného 14% SDS-PAGE gelu ukazujícího α-chymotrypsinem a trypsinem štěpené přípravky zevní membrány Neisseria meningitidis kmene 608B (B:2a:P1.2). Linie 1 obsahuje následující markéry molekulové hmotnosti: Fosforylasa b (97.400); hovězí sérový albumin (66200); ovalbumin (45000); carbonic anhydrasa (31000); inhibitor sojového trypsinu (21500); a lysozym (14400). Linie 2 obsahuje neštěpené kontrolní přípravky zevní membrány. Linie 3 obsahuje α-chymotrypsinem ošetřené přípravky (2 mg enzymu na mg proteinu; linie 4 obsahuje trypsinem ošetřené přípravky.

Obrázek 3 je fotografie Coomasie modří barveného 14% SDS-PAGE gelu ukazujícího proteinasou K štěpené přípravky zevní membrány Neisseria meningitidis kmene 608B (B:2a:P1.2). Linie 1, 3, 5 a 7 obsahují neštěpenou kontrolu. Linie 2, 4 6 a 8 obsahují přípravky zevní membrány štěpené proteinasou K (2 IU na mg proteinu). Linie 1-4 obsahují přípravky ošetřené při pH 7,2. Linie 5-8 obsahují přípravky ošetřené při pH 9,0. Linie 3, 4, 7, a 8 obsahují přípravky ošetřené za přítomnosti SDS. Molekulová hmotnost markérů je ukázána na levé straně (v kilodaltonech).

Obrázek 3b je fotografie Coomasie modří barveného 14% SDS-PAGE gelu ukazujícího migrační profily afinitně purifikovaného rekombinantního 22 kDa proteinu. Linie 1 obsahuje markéry molekulové hmotnosti: Fosforylasa b (97.400); hovězí sérový albumin (66200); ovalbumin (45000); carbonic anhydrasa (31000); inhibitor sojového trypsinu (21500); a lysozym (14400). Linie 2 obsahuje 5 μg afinitně purifikovaného rekombinantního 22 kDa proteinu zahřátého při 100 ®C na 10 minut. Linie 5 obsahuje 5 μg afinitně purifikovaného rekombinantního 22 kDa proteinu zahřátého při 100 °C na 15 minut.

Obrázek 4 je fotografie Coomasie modří barvených 14% SDS-PAGE gelů a jejich korespondujících Western Immunoblotů ukazujících reaktivitu monoklonálních protilátek specifických pro Neisseria meningitidis 22 kDa povrchový protein. Přípravky zevní membrány od Neisseria meningitidis kmene 608B (B:2a:P1.2) (A) neošetřený; (B) ošetřený Proteinasou K (2 IU na mg proteinu). Linie 1 obsahuje markéry molekulové hmotnosti a charakteristické migrační profily na 14% SDS-PAGE gelu přípravků zevní membrány. Linie 2 obsahuje Me-2; linie 3 obsahuje Me-3; linie 4 obsahuje Me-5, linie 5 obsahuje Me-7; a linie 6 obsahuje nepříbuznou kontrolní monoklonální protilátku. Markéry molekulové hmotnosti jsou fosforylasa b (97.400); hovězí sérový albumin (66200); ovalbumin (45000); carbonic anhydrasa (31000); inhibitor sojového trypsinu (21500); a lysozym (14400). Imunoblotové výsledky ukázané na obrázku 4 pro Me-2, Me-3, Me-5, Me-6 a Me-7 jsou v souladu s imunoblOtovými výsledky získanými pro Me-1.

Obrázek 5 je grafické znázornění vazebné aktivity monoklonálních protilátek k intaktní bakteriální buňce. Výsledky pro representativní monoklonální protilátky Me-5 a Me-7 jsou presentovány v počtu za minutu (CPM) na vertikální ose. Různé bakteriální kmeny použité v testu jsou ukázány na horizontální ose. Haemophilus influenzae porin specifická monoklonální protilátka byla použita jako negativní kontrola. Hodnoty pozadí pod 500 CPM byly zaznamenány a byly odečteny od hodnot vazby.

Obrázek 6 je fotografie barvených 14%

SDS-PAGE gelů a jejich korespondujících Western Immunoblotů ukazujících purifikaci 22 kDa Neisseria meningitidis povrchového proteinu z koncetrovaného supernatantu kultury Escherichia coli kmene BL21 (DE3). Obrázek 6(A) je fotografie Coomasie modří a stříbrem barveného SDS-PAGE gelu. Linie 1 obsahuje následující markéry molekulové hmotnosti: Fosforylasa b (97.400); hovězí sérový albumin (66200); ovalbumin (45000); carbonic anhydrasa (31000); inhibitor sojového trypsinu (21500); a lysozym (14400). Linie 2 obsahuje přípravek proteinu zevní membrány extrahovaný z Neisseria meningitidis kmene 608B (serotyp B:2a:pl.2) (10 mg). Linie 3 obsahuje koncentrovaný supernatant kultury Escherichia coli BL21 (DE3). Linie 4 obsahuje afinitně purifikovaný rekombinantní 22 kDa povrchový protein Neisseria meningitidis (1 mg). Obrázek 6(B) je fotografie Coomasie modří barveného 14% SDS-PAGE gelu α-chymotrypsinem, trypsinem a proteinasou K štěpeného afinitně purifikovaného rekombinantního 22 kDa povrchového proteinu Neisseria meningitidis. Linie 1 obsahuje následující markéry molekulové hmotnosti: Fosforylasa b (97.400); hovězí sérový albumin (66200); ovalbumin (45000); carbonic anhydrasa (31000); inhibitor sojového trypsinu (21500); a lysozym (14400). Linie 2 obsahuje purifikovaný rekombinantní 22 kDa povrchový protein Neisseria meningitidis (2 mg). Linie 7 až 10 obsahují hovězí sérový albumin (2 mg). Linie 2 a 7 obsahují a-chymotrypsinem (C) ošetřený protein (2 mg enzymu na mg proteinu). Linie 4 a 9 obsahují trypsinem (T) ošetřený protein (2 mg enzymu na mg proteinu). Linie 5 a 10 obsahují proteinasou K (K) ošetřený protein (2 IU na mg proteinu). Obrázek 6(C) je fotografie Western Immunoblotingu duplikátu gelu za použití monoklonální protilátky Me-5.

Obrázek 7 je grafické znázornění baktericidní aktivity monoklonálních protilátek proti proteinem A - purifikovanému 22 kDa povrchovému proteinu Neisseria meningitidis proti Neisseria meningitidis kmene 608B (B:2a:P1.2). Vertikální osa grafu ukazuje procento přežívání Neisseria meningitidis bakterií po vystavení různým koncentracím monoklonální protilátky (ukázáno na horizontální ose grafu).

Obrázek 8 ukazuje nukleotidovou a odvozenou aminokyselinovou sekvenci 22 kDa povrchového proteinu Neisseria meningitidis kmene MCH88 (SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 4). Jsou použity běžné třípísmenné symboly pro aminokyselinové zbytky. Otevřený čtecí rámeček je v rozsahu od start kodonu base 116 do stop kodonu base 643.

Obrázek 9 ukazuje nukleotidovou a odvozenou aminokyselinovou sekvenci 22 kDa povrchového proteinu Neisseria meningitidis kmene Z4063 (SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 6). Jsou použity běžné třípísmenné symboly pro aminokyselinové zbytky. Otevřený čtecí rámeček je v rozsahu od start kodonu base 208 do stop kodonu base 732.

Obrázek 10 ukazuje nukleotidovou a odvozenou aminokyselinovou sekvenci 22 kDa povrchového proteinu Neisseria meningitidis kmene b2,22 (SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 8). Jsou použity běžné třípísmenné symboly pro aminokyselinové zbytky. Otevřený čtecí rámeček je v rozsahu od start kodonu base 241 do stop kodonu base 765.

Obrázek 11 znázorňuje konsensuální sekvenci stanovenou z DNA sekvencí čtyř kmenů Neisseria a ukazující substituce nebo inserce nukleotidů specifické pro každý kmen.

Obrázek 12 znázorňuje konsensuální sekvenci stanovenou z proteinové sekvencí čtyř kmenů Neisseria a ukazující substituce nebo inserce aminokyselinových zbytků specifické pro každý kmen.

Obrázek 13 representuje časový průběh imunitní odpovědi na rekombinantní 22 kDa protein u králíků vyjádřený jako reciproční ELISA titr. Králíkům byly injikovány přípravky zevní membrány z E. coli kmene JM109 s plasmidem pN2202 nebo s kontrolním plasmidem pWKS30. Vývoj specifické humorální odpovědi byl analyzován ELISA za použití přípravků zevní membrány získaných od Neisseria meningitidis kmene 608B (B:2a:pl.2) jako potahovacího antigenu.

Obrázek 14 representuje časový průběh imunitní odpovědi na rekombinantní 22 kDa protein u Macaca fascicularis (cynomolgus) opic vyjádřený jako reciproční ELISA titr. Dvě opice byly v příslušném pořadí imunizovány 100 μ<3 (K28) a 200 ptg (1276) afinitně purifikovaného 22 kDa proteinu na injekci. Kontrolní opice (K65) byla imunizována 150 jzg nepříbuzného rekombinantního proteinu podle stejného postupu.

Vývoj specifické humorální odpovědi byl analyzován ELISA za použití přípravků zevní membrány získaných od Neisseria meningitidis kmene 608B (B:2a:pl.2) jako potahovacího antigenu.

Obrázek 15 je grafické znázornění syntetických peptidů podle předkládaného vynálezu stejně jako jejich příslušného umístění v kompletním 22 kDa proteinu Neisseria meningitidis kmene 608B (B:2a:pl.2).

Obrázek 16 je mapa plasmidu pNP2204 obsahujícího gen, který kóduje 22 kDa povrchový protein Neisseria meningitidis, gen pro 22 kDa povrchový protein Neisseria meningitidis; Ampi^r, kódující region pro resistenci na ampicilin; ColEl, zdroj replikace; cI857, bakteriofág lambda cI857 teplotně sensitivní represorový gen; lambdaPL, bakteriofág lambda transkripční promotor; TI transkripční terminátor. Směr transkripce je ukázán šipkami. BglII a BamHI jsou restrikční místa použitá pro inserci 22 kDa genu v p629 plasmidu.

Během našeho studia ultrastruktury zevní membrány Neisseria meningitidis jsme identifikovali nový protein o nízké molekulární hmotnosti 22 kDa, který má velmi jedinečné vlastnosti. Tento protein zevní membrány je vysoce resistentní na extensivní ošetření proteolytickými enzymy, jako ke proteinasa K, serinová proteasa odvozená od plísně Tritirachium album limber. Toto je velmi překvapivé, protože proteiny resistentní na proteinasu K jsou v přírodě velmi vzácné vzhledem k potenciálu, širokému pH optimu a nízké peptidové vazebné specificitě tohoto enzymu (Barrett, A. J. a N. D. Rawlings, Biochem. Soc. Transactions (1991) 19: 707 - 715). Pouze několik zpráv popisovalo proteiny prokaryotního původu, které jsou resistentní na enzymatickou degradaci proteinasou K. Proteinasa K resistentní proteiny byly nalezeny v rodu Leptospira (Nicholson, V. M. a J. F. Prescott, Veterinary Microbiol., (1993), 36: 123 - 138), rodu Mycoplasma (Butler, G. H. et al., Infect Immun., (1991), 59: 1037 - 1042), Spiroplasma mirum (Bastian, F. 0. et al., J. Clin. Microbiol., (1987) 25: 2430 - 2431) a ve virech a prionech (Onodera, T. et al., Microbiol. Immunol. (1993) 37: 311 - 316; Prusiner, S. B. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90: 2793 - 2797). Zde popisujeme použití tohoto proteinu pro zlepšení prevence, léčby a diagnostiky infekcí Neisseria meningitidis.

Tak podle jednoho aspektu předkládaného vynálezu poskytujeme vysoce konzervovaný, imunologicky dostupný povrchový protein Neisseria meningitidis a jeho fragmenty, analogy a deriváty. Jak je zde použito znamená povrchový protein Neisseria meningitidis jakýkoliv povrchový protein Neisseria meningitidis kódovaný přirozeně se vyskytujícím genem Neisseria meningitidis. Protein Neisseria meningitidis podle předkládaného vynálezu může být přirozeného původu, nebo může být získán aplikací molekulární biologie pro produkci rekombinantního proteinu, nebo jeho fragmentu.

Jak je zde použito znamená vysoce konzervovaný to, že gen pro povrchový protein Neisseria meningitidis a protein sám existují ve více než 50% známých kmenů Neisseria meningitidis. Preferovaně existuje gen a jeho protein ve více než 99% známých kmenů Neisseria meningitidis. Příklady 2 a 4 dávají metodu, kterou může odborník testovat různé povrchové proteiny Neisseria meningitidis pro určení toho, zda jsou vysoce konzervované.

Jak je zde použito znamená termín imunologicky dostupný to, že povrchový protein Neisseria meningitidis je přítomen na povrchu organismu a je dostupný pro protilátky. Příklad 2 dává metodu, kterou může odborník testovat různé povrchové proteiny Neisseria meningitidis pro určení toho, zda jsou imunologicky dostupné. Imunologická dostupnost může být určena jinými metodami, včetně aglutinačního testu, ELISA, RIA, imunoblott testem, dot-enzym testem, testem povrchové dostupnosti, elektronovou mikroskopií nebo kombinací těchto testů.

Jak je zde použito zahrnuje termín fragmenty povrchového proteinu Neisseria meningitidis polypeptidy mající alespoň jeden peptidový epitop, nebo jeho analoga nebo deriváty. Peptidy tohoto typu mohou být získány za použití molekulární biologie nebo syntézou za použití technik běžné peptidové syntesy v kapalině nebo v pevné fázi.

Jak je zde použito zahrnují analoga povrchového proteinu Neisseria meningitidis ty proteiny, nebo jejich fragmenty, ve kterých je jeden nebo více aminokyselinových residuí přirozeně se vyskytujících v sekvenci nahrazeno jiným aminokyselinovým zbytkem, za zachování funkčních a protektivních vlastností tohoto proteinu. Taková analoga mohou být produkována synteticky, nebo rekombinantní DNA technologií, například, mutagenesí přirozeně se vyskytujícího povrchového proteinu Neisseria meningitidis. Takové postupy jsou v oboru dobře známé.

Například, jeden takový analog je vybrán z rekombinantního proteinu, který může být produkován z genu 22 kDa proteinu z Neisseria meningitidis kmene b2, jak je zobrazeno na obrázku 10. Další analog může být získán z izolace korespondujícího genu z Neisseria lactamica.

Jak je zde použito, derivát povrchového proteinu Neisseria meningitidis je protein nebo jeho fragment, který byl kovalentně modifikován, například, dinitrofenolem, tak, aby si zachoval imunogenicitu u lidí. Deriváty podle předkládaného vynálezu také zahrnují sderiváty aminokyselinových analogů podle předkládaného vynálezu.

Bude jasné, že podle následujících příkladů předkládaného vynálezu může odborník určit bez zbytečného experimentování, zda určitý fragment, analog nebo derivát bude použitelný v diagnostice, prevenci nebo léčbě onemocnění Neisseria meningitidis .

Tento vynález také zahrnuje polymerické formy povrchových proteinů Neisseria meningitidis, fragmentů, analogů a derivátů. Tyto polymerické formy zahrnují, například, jeden nebo více polypeptidů, které byly zkříženě navázány se zesíúovacími linkery jako je avidin/biotin, gluteraldehyd nebo dimethylsuberimidat. Takové polymerické formy také zahrnují polypeptidy obsahující dva nebo více tandemových nebo invertovaných sousedních sekvencí Neisseria meningitidis, produkovaných z multicistronových mRNA generovaných rekombinantní DNA technologií.

Tento vynález poskytuje v podstatě čisté povrchové proteiny Neisseria meningitidis. Termín v podstatě čisté znamená, že povrchový protein Neisseria meningitidis podle předkládaného vynálezu je prostý jiných proteinů Neisseria meningitidis původu. Přípravky v podstatě čistého povrchového proteinu Neisseria meningitidis mohou být získány různými běžnými postupy, například postupem popsaným v příkladech 3 a 11.

V dalším aspektu poskytuje vynález 22 kDa povrchový protein Neisseria meningitidis mající aminokyselinovou sekvenci podle obrázku 1 (SEQ ID NO: 2) nebo jeho fragment, analog nebo derivát.

V dalším aspektu poskytuje vynález 22 kDa povrchový protein Neisseria meningitidis mající aminokyselinovou sekvenci podle obrázku 8 (SEQ ID NO: 4), obrázku 9 (SEQ ID NO: 6) nebo jeho fragment, analog nebo derivát. Takové fragmenty mohou být vybrány z peptidů uvedených na obrázku 15 (SEQ ID NO: 9 až SEQ ID NO: 26).

V dalším aspektu poskytuje vynález 22 kDa povrchový protein Neisseria gonorrhoeae mající aminokyselinovou sekvenci podle obrázku 10 (SEQ ID NO: 8) nebo jeho fragment, analog nebo derivát. Jak je jasné z výše uvedeného, jakýkoliv odkaz na 22 kDa protein Neisseria meningitidis také zahrnuje 22 kDa proteiny izolované od, nebo vyrobené z genů izolovaných od jiných druhů Nesseriacae jako je Neisseria gonorhoeae nebo Neisseria lactamica.

kDa povrchový protein Neisseria meningitidis podle předkládaného vynálezu může být dále charakterizován jednou nebo více z následujících vlastností:

1) má přibližnou molekulovou hmotnost 22 kDa jak je zhodnoceno SDS-PAGE gelem;

2) jeho elektroforetická mobilita na SDS-PAGE gelu není modifikována ošetřením redukujícími agens;

3) má izoelektrický bod (pí) v rozmezí okolo pí 8 až pí 10;

4) je vysoce resistentní na degradaci proteolytickými enzymy jako je a-chymotrypsin, trypsin a proteinasa K;

5) periodická oxidace nebrání specifické vazbě protilátky namířené proti 22 kDa povrchovému proteinu Neisseria meningitidis;

6) je to vysoce konzervovaný antigen;

7) je dostupný pro protilátku na povrchu intaktního organismu Neisseria meningitidis;

8) může indukovat produkci baktericidních protilátek;

9) může indukovat produkci protilátek, které mohou chránit proti pokusné infekci;

10) může indukovat, pokud je injikován do zvířecího hostitele, vývoj imunitní odpovědi, které může chránit proti infekci Neisseria meningitidis.

Tento vynález také poskytuje, poprvé, DNA sekvenci kódující 22 kDa povrchový protein Neisseria meningitidis (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 a SEQ ID NO: 7) . Preferované DNA sekvence podle předkládaného vynálezu jsou vybrány ze skupiny skládající se z:

(a) DNA sekvence podle obrázku 1 (SEQ ID NO:1) ;

(b) DNA sekvence podle obrázku 8 (SEQ ID NO:3) ;

(c) DNA sekvence podle obrázku 9 (SEQ ID NO:5);

(d) DNA sekvence podle obrázku 10 (SEQ ID NO: 7);

(e) analogů nebo derivátů výše uvedených DNA sekvencí;

(f) DNA sekvence degenerované z jakékoliv z výše uvedených DNA sekvencí; a (g) fragmentů jakékoliv z -výše uvedených DNA sekvencí;

kde uvedené sekvence kódují produkt, který vykazuje imunologickou aktivitu 22 kDa povrchového proteinu Neisseria meningitidis .

Takovými fragmenty jsou preferovaně peptidy jak jsou zobrazeny na obrázku 15 (SEQ ID NO: 9 až SEQ ID NO: 26).

Tento vynález také poskytuje, poprvé, DNA sekvenci kódující 22 kDa povrchový protein Neisseria meningitidis (SEQ ID NO: 1). Více preferované DNA sekvence podle předkládaného vynálezu j sou vybrány ze skupiny skládaj ící se z:

(a) DNA sekvence podle obrázku 1 (SEQ ID NO: 1);

(b) analogů nebo derivátů výše uvedených DNA sekvencí;

(c) DNA sekvence degenerované z jakékoliv z výše uvedených DNA sekvencí; a (d) fragmentů jakékoliv z výše uvedených DNA sekvencí;

kde uvedené sekvence kódují produkt, který vykazuje imunologickou aktivitu 22 kDa povrchového proteinu Neisseria meningitidis .

Kódující gen pro analoga nebo deriváty 22 kDa povrchového proteinu Neisseria meningitidis budou hybridizovat na 22 kDa povrchový protein-kodující gen za podmínek popsaných v příkladu 4 .

Pro účely tohoto vynálezu, fragmenty, analoga nebo deriváty 22 kDa povrchového proteinu Neisseria meningitidis mají imunologickou aktivitu 22 kDa povrchového proteinu Neisseria meningitidis pokud mohou indukovat, když jsou injikovány do zvířecího hostitele, vývoj imunologické odpovědi, která může chránit proti infekci Neisseria meningitidis. Odborník v oboru může určit, zda určitá DNA sekvence kóduje produkt vykazující imunologickou aktivitu 22 kDa povrchového proteinu Neisseria meningitidis podle postupů daných zde v příkladu 6.

Povrchové proteiny Neisseria meningitidis podle předkládaného vynálezu mohou být izolovány metodou, která obsahuje následující kroky:

a) izolování a kultivaci bakterie Neisseria meningitidis, b) izolování zevní mebránové části z kultury bakterií; a c) izolování uvedeného antigenu ze zevní membránové části.

Jednotlivě, výše uvedený krok (c) může zahrnovat další kroky ošetření extraktů zevního membránového proteinu Neisseria meningitidis proteinasou K, po čemž následuje proteinová frakcionace za použití běžných separačních technik jako je iontová výměna a gelová chromatografie a elektroforesa.

Alternativně a preferovaně, povrchové proteiny Neisseria meningitidis podle předkládaného vynálezu mohou být produkovány za použití technik molekulární biologie, jak jsou podrobněji popsány v příkladu 3. Použití technik molekulární biologie se zejména hodí pro přípravu v podstatě čistého rekombinantního 22 kDa povrchového proteinu Neisseria meningitidis .

Tak podle dalšího aspektu vynálezu poskytujeme proces pro produkci rekombinantního 22 kDa povrchového proteinu Neisseria meningitidis, včetně jeho fragmentů, analogů a derivátu, který obsahuje kroky (1) kultivování jednobuněčného hostitelského organismu transformovaného rekombinantní DNA molekulou obsahující DNA sekvenci kódující uvedený protein, fragment, analog nebo derivát a jednu nebo více kontrolních sekvencí pro expresi operativně navázaných na DNA sekvenci, a (2) získání v podstatě čistého proteinu, fragmentu, analogu nebo derivátu.

Jak je dobře známo v oboru, aby se získaly vysoké expresní hladiny transfektovaného genu v hostiteli, musí být gen operativně navázán na transkripční a translační expresní kontrolní sekvence, které jsou funkční ve vybraném expresním hostiteli. Preferovaně, expresní kontrolní sekvence a požadovaný gen budou obsaženy v expresním vektoru, který dále obsahuje bakteriální selekční marker a zdroj replikace. Pokud je expresním hostitelem eukaryotická buňka, pak by měl expresní vektor dále obsahovat expresní marker použitelný v expresním hostiteli.

Široká škála kombinací expresní hostitel/vektor může být použita v expresi DNA sekvencí podle předkládaného vynálezu. Použitelné expresní vektory pro eukaryotické hostitele zahrnují například vektory obsahující expresní kontrolní sekvence z SV40, hovězího papiloma viru, adenoviru a cytomegaloviru. Použitelné expresní vektory pro bakteriální hostitele zahrnují známé bakteriální plasmidy, jako jsou plasmidy z E. coli, včetně col El, pCRl, pBR322, pMB9 a jejich deriváty, plasmidy pro širší rozsah hostitelů, jako je RP4, fágové DNA, např. množství derivátu fágu lambda, např. NM989, a jiné DNA fágy, jako jsou M13 a vláknité jednořetězcové DNA fágy. Použitelné expresní vektory pro kvasinky zahrnují 2 mu plasmid a jeho deriváty. Použitelné vektory pro hmyzí buňky zahrnují pVL 941.

Kromě toho, jakákoliv ze široké škály expresních kontrolních sekvencí může být použita v těchto vektorech pro expresi DNA sekvencí podle předkládaného vynálezu. Takové použitelné expresní kontrolní sekvence zahrnují expresní kontrolní sekvence asociované se srukturálními geny výše uvedených expresních vektorů. Příklady použitelných expresních kontrolních sekvencí zahrnují, například, časné a pozdní promotory SV40 nebo adenoviru, lac system, trp system, TAC nebo TRC system, hlavní operátor a promotorové regiony fágu lambda, kontrolní regiony fd obalového roteinu, promotor pro 3-fosfoglycerát kinasu nebo jiný glykolytický enzym, promotory kyselé fosfatasy, např. Pho5, promotory kvasinkového alfa-mating systému a jiné sekvence, o kterých je známo, že kontrolují expresi genů prokaryotických a eukaryotických buněk nebo jejich virů, a různé jejich kombinace. Expresní kontrolní sekvence 22 kDa povrchového proteinu Neisseria meningitidis je zejména užitečná při expresi 22 kDa povrchového proteinu Neisseria meningitidis v E. coli (příklad 3).

Hostitelské buňky transformované výše uvedenými vektory jsou dalším aspektem předkládaného vynálezu. Široká škála jednobuněčných hostitelských buněk je použitelná v expresi DNA sekvence podle předkládaného vynálezu. Tito hostitelé mohou zahrnovat dobře známé eukaryotní a prokaryotní hostitele jako jsou kmeny E. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, houby, kvasinky, hmyzí buňky jako je Spodoptera frugiperda (SF9), zvířecí buňky'jako je CHO a myší buňky, buňky africké zelené opice jako jsou COS 1, COS 7, BSC 1, BSC 40 a BMT 10 a lidské buňky a rostlině buňky v buněčné kultuře. Preferované hostitelské organismy zahrnují bakterie jako je E. coli a Bacillus subtilis a savčí buňky v tkáňové kultuře.

Mělo by samozřejmě být jasné, že ne všechny vektory a expresní kontrolní sekvence budou účinkovat stejně dobře pro expresi DNA sekvencí podle předkládaného vynálezu. Ani všichni hostitelé neúčinkují stejně dobře se stejným expresním systémem. Nicméně, odborník může vybrat mezi těmito vektory, expresními kontrolními sekvencemi a hostiteli bez experimentování a bez odchýlení se od rozsahu předkládaného vynálezu. Například, při selektování vektoru musí být brán do úvahy hostitel, protože vektor se v něm musí replikovat. Počet kopií vektoru, schopnost kontrolovat tento počet kopií a exprese jakýchkoliv jiných proteinů kódovaných vektorem musí být také vzata v úvahu.

Při selekci expresní kontrolní sekvence by měly také být vzaty do úvahy různé faktory. Tyto zahrnují, například, relativní sílu sekvence, její kontrolovatelnost a její kompatibilitu s DNA sekvencí podle předkládaného vynálezu, zejména s ohledem na potenciální sekundární struktury. Jednobuněční hostitelé by měly být vybráni po zvážení jejich kompatibility s vybraným vektorem, toxicity produktu kódovaného DNA sekvencí podle předkládaného vynálezu, jejich sekrečních charakteristik, jejich schopnosti správného složení proteinu, požadavků jejich fermentace nebo kultivace a snadnosti purifikace produktů kódovaných DNA sekvencí podle předkládaného vynálezu z těchto hostitelů.

V mezích těchto parametrů může odborník v oboru vybrat různé kombinace vektor/expresní sekvence/hostitel, které budou exprivovat DNA sekvence podle předkládaného vynálezu ve fermentačních nebo v různých zvířecích kulturách.

Polypeptid kódovaný DNA sekvencemi podle předkládaného vynálezu může být izolován z fermentační nebo buněčné kultury a může být purifikován za použití různých běžných metod. Odborník v oboru může vybrat nejvhodnější techniku izolace a purifikace bez odchýlení se od rozsahu předkládaného vynálezu.

Povrchové proteiny Neisseria meningitidis podle předkládaného vynálezu jsou použitelné v profylaktických, terapeutických a diagnostických kompozicích pro prevenci, léčbu a diagnostiku onemocnění způsobených infekcí Neisseria meningitidis .

Povrchové proteiny Neisseria meningitidis podle předkládaného vynálezu jsou použitelné v profylaktických, terapeutických a diagnostických kompozicích pro prevenci, léčbu a diagnostiku onemocnění způsobených infekcí Neisseria gonorhoeae nebo Neisseria lactamica.

Povrchové proteiny Neisseria meningitidis podle předkládaného vynálezu se zejména hodí pro generování protilátek a pro vývoj ochranné odpovědi proti onemocněním způsobeným Neisseria meningitidis .

Povrchové proteiny Neisseria meningitidis podle předkládaného vynálezu se zejména hodí pro generování protilátek a pro vývoj ochranné odpovědi proti onemocněním způsobeným Neisseria gonorhoeae a Neisseria lactamica.

Konkrétně, poskytujeme 22 kDa povrchový protein Neisseria meningitidis, který má aminokyselinovou sekvenci podle obrázku 1 (SEQ ID NO: 2) nebo jeho fragment, analog nebo derivát, pro použití jako imunogen a jako vakcina.

Konkrétně, poskytujeme 22 kDa povrchový protein Neisseria meningitidis, který má aminokyselinovou sekvenci podle obrázku 1 (SEQ ID NO: 2) , obrázku 8 (SEQ ID NO: 4), obrázku 9 (SEQ ID NO: 6) nebo obrázku 10 (SEQ ID NO: 8) nebo jeho fragment, analog nebo derivát, pro použití jako imunogen a jako vakcina.

Standartní imunologické techniky mohou být použity s povrchovými proteiny Neisseria meningitidis při jejich použiti jako imunogenů a vakcin. Jednotlivě, jakýkoliv vhodný hostitel může být injikován farmacuticky účinným množstvím 22 kDa povrchového proteinu Neisseria meningitidis pro generování monoklonálních nebo polyvalentních anti-Neisseria meningitidis protilátek nebo pro indukování vývoje ochranné imunitní odpovědi proti chorobám způsobeným Neisseria meningitidis. Před injikováním do hostitele mohou být povrchové proteiny Neisseria meningitidis formulovány ve vhodném vehikulu, a tak poskytujeme farmaceutickou kompozici obsahující jeden nebo více povrchových antigenů Neisseria meningitidis nebo jejich fragmentů. Preferovaně je antigenem 22 kDa povrchový protein Neisseria meningitidis nebo jeho fragment, derivát nebo analog spolu s jedním nebo více farmaceuticky akceptovatelnými excipienty. Jak je zde použito označuje farmaceuticky akceptovatelné množství množství jednoho nebo více povrchových antigenů Neisseria meningitidis nebo jejich fragmentů, které vyvolá dostatečný titr anti-Neisseria meningitidis protilátek pro léčbu nebo prevenci infekce Neisseria meningitidis.

Povrchové proteiny Neisseria meningitidis podle předkládaného vynálezu mohou také tvořit základ pro diagnostický test pro infekci Neisseria meningitidis. Několik diagnostických metod je možných. Například, tento vynález poskytuje metodu pro detekci antigenu Neisseria meningitidis v biologickém vzorku obsahujícím, nebo podezřelém z toho, že obsahuje, antigen Neisseria meningitidis, kde uvedená metoda obsahuje:

a) izolování biologického vzorku od pacienta;

b) Inkubaci protilátky proti 22 kDa povrchovému proteinu Neisseria meningitidis nebo jeho fragmentu s biologickým vzorkem za vytvoření směsý; a

c) detekování specificky navázané protilátky nebo navázaného fragmentu ve směsi, což ukazuje na přítomnost antigenů Neisseria meningitidis.

Preferovanými protilátkami výše uvedené diagnostické metody j sou Me-1 a Me-7.

Alternativně tento vynález poskytuje metodu pro detekci protilátek specifických pro antigen Neisseria meningitidis v biologickém vzorku obsahujícím, nebo podezřelém z toho, že obsahuje, uvedenou protilátku, kde uvedená metoda obsahuje:

a) izolování biologického vzorku od pacienta;

b) Inkubaci povrchového proteinu Neisseria meningitidis podle předkládaného vynálezu nebo jeho fragmentu s biologickým vzorkem za vytvoření směsi; a

c) detekování specificky navázaného antigenu nebo navázaného fragmentu ve směsi, což ukazuje na přítomnost protilátky specifické pro antigen Neisseria meningitidis.

Odborník v oboru pozná, že tento test může mít několik forem, včetně imunologických testů jako je enzymově vázaný imunosorbentní test (ELISA), radioimunotest nebo latexový aglutinační test, pro určení toho, zda jsou protilátky specifické pro protein přítomné v organismu.

DNA sekvence podle předkládaného vynálezu může být také použita pro projektování DNA prob pro použití při detekování přítomnosti patogeních Neisseria bakterií v biologických vzorcích podezřelých z toho, že obsahují takové bakterie. Metoda detekce podle předkládaného vynálezu obsahuje kroky:

a) izolování biologického vzorku od pacienta;

b) inkubaci DNA prob majících DNA sekvenci podle předkládaného vynálezu s biologickým vzorkem za vytvoření směsi; a

c) detekování specificky navázané DNA proby ve směsi, což ukazuje na přítomnost Neisseria bakterií.

Preferované DNA proby mají sekvenci párů baží podle obrázku 1 (SEQ ID NO: 1), obrázku 8 (SEQ ID NO: 3), obrázku 9 (SEQ ID NO: 5) nebo obrázku 10 (SEQ ID NO: 7) nebo konsensuální sekvence podle obrázku 11 (SEQ ID NO: 9).

Více preferovaná DNA proba má sekvenci o 525 párech baží podle obrázku 1 (SEQ ID NO: 1).

DNA proby podle předkládaného vynálezu mohou také být použity pro detekci cirkulující nukleové kyseliny Neisseria meningitidis ve vzorku, například za použití polymerasové řetězové reakce, jako metody pro diagnostiku infekcí Neisseria meningitidis. Proba může být syntetizována za použití běžných technik a může být imobilizována na pevné fázi nebo může být značena detekovatelnou značkou.

Preferovaná DNA proba pro tuto aplikaci je oligomer mající sekvenci komplementární k alespoň 6 sousedním oligonukleotidům genu 22 kDa povrchového proteinu Neisseria meningitidis podle obrázku 1 (SEQ ID NO: 1), obrázku 8 (SEQ ID NO: 3), obrázku 9 (SEQ ID NO: 5) nebo obrázku 10 (SEQ ID NO: 7) nebo konsensuální sekvence podle obrázku 11 (SEQ ID NO: 9).

Více preferovaná DNA proba pro tuto aplikaci je oligomer mající sekvenci komplementární k alespoň 6 sousedním oligonukleotidům genu 22 kDa povrchového proteinu Neisseria meningitidis podle obrázku 1 (SEQ ID NO: 1).

Jiná diagnostická metoda pro detekci Neisseria meningitidis u pacienta obsahuje kroky:

a) značení protilátky podle předkládaného vynálezu nebo jejího fragmentu detekovatelnou značkou;

b) podání značené protilátky nebo značeného fragmentu pacientovi; a

c) detekování specificky vázané značené protilátky nebo značeného fragmentu v pacientovi, což ukazuje na přítomnost Neisseria meningitidis.

Pro purifikaci jakékoliv protilátky proti povrchovému proteinu Neisseria meningitidis může být použita afinitní chromatografie používající povrchový protein Neisseria meningitidis jako afinitní medium.

Tak podle dalšího aspektu předkládaného vynálezu poskytujeme 22 kDa povrchový protein Neisseria meningitidis, který má aminokyselinovou sekvenci, která obsahuje sekvence podle obrázku 1 (SEQ ID NO: 2), obrázku 8 (SEQ ID NO: 4), obrázku 9 (SEQ ID NO: 6) nebo obrázku 10 (SEQ ID NO: 8) nebo jejich část nebo analog, která je kovalentně vázána na nerozpustný nosič.

Tak podle preferovaného aspektu předkládaného vynálezu poskytujeme 22 kDa povrchový protein Neisseria meningitidis, který má aminokyselinovou sekvenci, která obsahuje sekvenci podle obrázku 1 (SEQ ID NO: 2) nebo její část nebo analog, která je kovalentně vázána na nerozpustný nosič.

Dalším rysem vynálezu je použití povrchových proteinů Neisseria meningitidis podle předkládaného vynálezu jako imunogenů pro produkci specifických protilátek pro diagnosu a zejmena pro léčbu infekcí Neisseria meningitidis. Vhodné protilátky mohou být určeny za použití vhodných vyšetřovacích metod, například měřením schopnosti jednotlivých protilátek pasivně chránit před infekcí Neisseria meningitidis ve vhodném testovacím modelu. Jedním příkladem zvířecího modelu je model popsaný zde v příkladech. Protilátka může být celá protilátka nebo její antigen vazebný fragment a může obecně patřit k jakékoliv třídě imunoglobulinů. Protilátka nebo fragment může byt zvířecího původu, specificky savčího původu a přesněji myšího, krysího nebo lidského původu. Může to být přirozená protilátka nebo její fragment, nebo pokud je to žádoucí, rekombinantní protilátka nebo fragment protilátky. Termín rekombinantní protilátka nebo fragment protilátky znamená protilátku nebo fragment protilátky, která je produkována za použití technik molekulární biologie. Protilátka nebo fragment protilátky může být polyklonální, nebo preferovaně, monoklonální. Může být specifická pro mnoho epitopů asociovaných s povrchovými proteiny Neisseria meningitidis, ale preferovaně je specifická pro jeden. Preferovaně bude protilátka nebo její fragment specifická pro jeden nebo více epitopů asociovaných s 22 kDa povrchovým proteinem Neisseria meningitidis. Také jsou preferovány monoklonální protilátky Me-1 a Me-7 zde popsané.

Příklady provedení vynálezu

Pro lepší pochopení tohoto vynálezu jsou jsou dány následující příklady. Tyto příklady jsou pouze za účelem ilustrace a nejsou konstruovány tak, aby omezovaly rozsah vynálezu jakýmkoliv způsobem.

Příklad 1 popisuje ošetření přípravků zevní membrány Neisseria meningitidis proteolytickými enzymy a následnou identifikaci 22 kDa povrchového proteinu Neisseria meningitidis .

Příklad 2 popisuje přípravu monoklonálních protilátek specifických pro 22 kDa povrchový protein Neisseria meningitidis .

Příklad 3 popisuje přípravu rekombinantního 22 kDa povrchového proteinu Neisseria meningitidis.

Příklad 4 popisuje použití DNA prob pro identifikaci organismů exprivujících 22 kDa povrchový protein Neisseria meningitidis .

Příklad 5 popisuje použití monoklonální protilátky proti 22 kDa povrchovému proteinu Neisseria meningitidis pro ochranu myší před infekcí Neisseria meningitidis.

Příklad 6 popisuje použití purifikovaného rekombinantního 22 kDa povrchového proteinu pro indukci ochranné odpovědi proti infekci Neisseria meningitidis.

Příklad 7 popisuje identifikaci sekvence pro 22 kDa protein a protein kódující gen pro jiné kmeny Neisseria meningitidis (MCH88 a Z4063) a jeden kmen Neisseria gonorhoeae.

Příklad 8 popisuje imunitní odpověď králíků a opic na 22 kDa povrchový protein Neisseria meningitidis.

Příklad 9 popisuje postup použitý pro mapování různých imunologických epitopů 22 kDa povrchového proteinu Neisseria meningitidis.

Příklad 10 popisuje tepelnou indukci expresního vektoru pro produkci velkého rozsahu 22 kDa povrchového proteinu.

Příklad 11 popisuje proces purifikace pro 22 kDa povrchový protein, když je produkován rekombinantní technologií.

Příklad 12 popisuje použití 22 kDa povrchového proteinu jako lidské vakciny.

Příklad 1 Ošetření přípravků zevní membrány Neisseria meningitidis proteolytickými enzymy a následná identifikace jakéhokoliv 22 kDa povrchového proteinu Neisseria meningitidis resistentního na enzym

Několik antigenních přípravků odvozených od celých buněk, chlorid litný, nebo sarkosyl extraktů bylo použito pro studium ultrastruktury zevní membrány Neisseria meningitidis. Zevní membrána Gram negativní bakterie účinkuje jako rozhraní mezi prostředím a vnitřkem buňky a obsahuje většinu antigenů, které jsou volně vystaveny imunitní obraně hostitele. Hlavním cílem studie byla identifikace nových antigenů, které mohou indukovat ochrannou odpověď proti Neisseria meningitidis. Jedním přístupem použitým vynálezci pro identifikaci takových antigenů byla parciální disrupce antigenních přípravků uvedených výše proteolytickými enzymy. Antigení determinanty generované enzymatickým ošetřením mohly být identifikovány následnou analýzou imunologických přípravků. K našemu překvapení jsme pozorovali po elektroforetickém vyšetření extraktů chloridem lithným zevní membrány Neisseria meningitidis, že jeden proužek o nízké molekulové hmotnosti, který byl barven Coomasie Brilliant Blue R-250, nebyl rozrušen ošetřením proteolytickými enzymy. Coomasie Blue je použita pro barvení proteinů a peptidů a nemá žádnou nebo velmi malou afinitu k polysacharidům a lipidům, které jsou také hlavní složkou zevní membrány. Fakt, že tento antigen o nízké molekulové hmotnosti byl barven Coomasie Blue naznačuje, že alespoň jeho část je tvořena polypeptidy, které nejsou štěpeny proteolytickými enzymy, nebo že jsou chráněny proti účinku enzymů jinými povrchovými strukturami. Kromě toho, jak je demonstrováno níže, velmi účinný enzym proteinasa K neštěpí tento antigen o nízké molekulové hmotnosti ani po extensivním ošetření.

Extrakce chloridem lithným byla použita pro získání přípravků zevní membrány z různých kmenů Neisseria meningitidi a byla provedena způsobem dříve popsaným vynálezci (Brodeur et al., Infect. Immun., 50, str. 510 (1985)). Obsah proteinu v těchto přípravcích byl určen Lowryho metodou adaptovanou na membránové frakce (Lowry et al., J. Biol. Chem., 193, str. 265 (1951)). Přípravky zevní membrány odvozené od Neisseria meningitidis kmene 608B (B:2a:P1.2) byly ošetřeny po 24 hodin při 37 °C a stálém třepání buď a-chymotrypsinem z hovězího pankreasu (E.C. 3.4.21.1) (Sigma) nebo trypsinem typu 1 z hovězího pankreasu (E.C. 3.4.21.4) (Sigma). Koncentrace enzymu byla upravena na 2 mg na mg proteinu, který má být ošetřen. Stejné přípravky zevní membrány byly také ošetřeny různými koncentracemi (0,5 až 24 mg na mg proteinu) Proteinasy K od Tritirachium album limber (Sigma nebo Boehringer Mannheim, Laval, Canada) (E.C. 3.4.21.14). Pro navození štěpení proteinu proteinasou K byly použity různé experimentální podmínky.

Vzorky byly inkubovány po 1 hodinu, 2 hodiny, 24 hodin nebo 48 hodin při 37 °C nebo 56 °C s nebo bez třepání. pH směsi vzorků bylo upraveno na buď pH 7,2 nebo na pH 9,0. Jednoprocentní (objem/objem) dodecylsulfát sodný (SDS) byl také přidán k určitým vzorkům. Ihned po ošetření vzorků byla provedena SDS-PAGE gelová elektroforesa za použití MiniProteanII^R (Bio-Rad, Mississagua, Ontario, Canada) systému na 14% (hmotnost/objem) gelech podle návodu výrobce. Proteiny byly zahřátý na 100 °C na 5 minut s 2-merkaptoethanolem a SDS, separovány na 14% SDS gelech a barveny Coomassie Brilliant Blue R-250.

Obrázek 2 ukazuje migrační profil proteinů v přípravcích zevní membrány odvozených od Neisseria meningitidis kmene 608B (B:2a:P1.2) na 14% SDS-PAGE gelu po ošetření při 37 °C po 24 hodin α-chymotrypsinem a trypsinem. Extensivní proteolytické štěpení proteinů o vysoké molekulové hmotnosti a několika hlavních proteinů zevní membrány mohlo být pozorováno pro ošetřené vzorky (obrázek 2, linie 3 a 4) ve srovnání s neošetřenou kontrolou (obrázek 2, linie 2). Oproti tomu, proteinový proužek o zdánlivé molekulové hmotnosti 22 kDa nebyl ovlivněn ani po 24 hodinách kontaktu s proteolytickými enzymy.

Tento jedinečný protein byl dále studován za použití agresivnějšího ošetření proteinasou K (obrázek 3). Proteinasa K je jedním z nejsilnějších proteolytických enzymů, protože má nízkou specificitu peptidové vazby a široké pH optimum.

Překvapivě, 22 kDa protein byl resistentní na štěpení 2 mezinárodními jednotkami (IU) proteinasy K po 24 hodin při 56 (obrázek 3, linie 2). Toto ošetření je často používáno v naší laboratoři pro produkci lipopolysacharidů nebo DNA, která je téměř prostá proteinů. Kromě toho, pouze malé polypeptidy mohou být pozorovány po takovém agresivním proteolytickém ošetření přípravků zevní membrány. Ještě dále, delší ošetření, více než 48 hodin, nebo vyšší koncentrace enzymu (více než 24 IU) neměnila množství 22 kDa proteinu. Množství a migrace 22 kDa proteinu na SDS-PAGE gelu nebyla ovlivněna, pokud bylo pH reakční směsi zvýšeno na pH 9,0, nebo pokud byl přidán 1,0 % SDS, silný proteinový denaturant (obrázek 3, linie 4, 6 a 8). Kombinované použití těchto dvou denaturačních podmínek normálně vede ke kompletnímu štěpení protřenu přítomného v přípravcích zevní membrány za ponechání pouze aminokyselinových zbytků. Polypeptidy o nízké molekulární hmotnosti byly často pozorovány při štěpení a byly hodnoceny jako sensitivní proteiny, které nebyly účinně štěpeny během enzymatického ošetření. Tyto fragmenty byly nejpravděpodobněji chráněny před další degradací uhlovodany a lipidy přítomnými v zevní membráně. Proužky zdánlivé molekulové hmotnosti 28 kDa a 34 kDa, které jsou přítomné v ošetřených vzorcích náleží residuálnímu enzymu a kontaminujícím proteinům přítomným ve všech testovaných enzymových přípravcích.

Zajímavé je, že tato studie resistence 22 kDa proteinu na proteasy ukázala, že jiný protein o zdánlivé molekulové hmotnosti 18 kDa se zdá být také resistentní na enzymatickou degradaci (obrázek 3a). Stopy tohoto 18 kDa proteinového proužku byly získány, když byly analyzovány migrační profily afinitně purifikovaného 22 kDa proteinu na SDS-PAGE gelech (obrázek 3b). 18 kDa proužek byl zřetelný pouze tehdy, když byl afinitně purifikovaný 22 kDa protein zahřátý po prodlouženou dobu ve vzorkovém pufru obsahujícím detergentní SDS před tím, než byl aplikován na gel. Analýza N-terminálních aminokyselin za použití Edman degradace (příklad 3) jasně stanovila, že aminokyselinové zbytky (E-G-A-S-G-F-Y-V-Q) identifikované na 18 kDa proužku korespondují s aminokyselinami 1-9 (SEQ ID NO: 1). Tyto výsledky ukazují, že 18 kDa a 22 kDa proužek pozorovaný na SDS-PAGE je skutečně odvozený od stejného proteinu. Tento poslední výsledek také ukazuje, že leader sekvence je štěpena ze zralého 18 kDa proteinu. Další studie budou provedeny pro identifikaci molekulárních modifikací vysvětlujících tento posun ve zdánlivé molekulové hmotnosti a hodnocení jejich vlivu na antigenní a protektivní vlastnosti proteinu.

Závěrem, objev proteinu zevní membrány Neisseria meningitidis s velmi vzácnými vlastnostmi, t.j. že je resistentní na proteolytické štěpení vyžaduje další studium jeho molekuly a imunologických charakteristik. Purifikovaný rekombinantní 22 kDa povrchový protein produkovaný Escherichia coli v příkladu 3 je také vysoce resistentní na štěpení proteinasou K. Nyní se snažíme pochopit mechanismus, který uděluje 22 kDa povrchovému proteinu Neisseria meningitidis tuto neobvyklou resistenci na proteolytické enzymy.

Příklad 2 Generování monoklonálních protilátek specifických pro 22 kDa povrchový protein Neisseria meningitidis

Zde popsané monoklonální protilátky byly získány ze tří nezávislých fúsních experimentů. Samice Balb/c myší (Charles River Laboratory, St. Constant, Quebec, Canada) byly imunizovány přípravky zevní membrány získanými od Neisseria meningitidis kmenů 604A, 608B a 2241C seroskupin A, B a C, v příslušném pořadí. Extrakce chloridem lithným použitá pro získání pro získání těchto přípravků zevní membrány byla provedena způsobem popsaným dříve vynálezci (Brodeur et al., Infect. Immun., 50, str. 510 (1985)). Obsah proteinu v těchto přípravcích byl určen Lowryho metodou adaptovanou na membránové frakce (Lowry et al., J. Biol. Chem., 193, str. 265 (1951)). Skupiny myší byly injikovány intraperitoneálně nebo subkutánně dvakrát, v třítýdeních intervalech 10 mg různými kombinacemi přípravků zevní membrány uvedenými výše. V závislosti na skupině myší bylo adjuvans použité pro imunizaci bud' Freundovo kompletní nebo nekompletní adjuvans (Gibco Laboratories, Grand Island, N.Y.) nebo QuilA (CedarLane Laboratories, Hornby, Ont. Canada). Tři dny před fúsní procedurou obdržely myši konečnou injekci 10 mg jednoho z přípravků zevní membrány uvedených výše. Fúsní protokol použitý pro produkci hybridomních buněčných linií secernujících požadovanou monoklonální protilátku byl dříve popsán vynálezci (Hamel et al., J. Med. Microbiol., 25, str. 2434 (1987)). Třída, podtřída a typ lehkého řetězce monoklonální protilátky Me-1, Me-2, Me-3, Me-5, Me-6 a Me-7 byly určeny ELISA jak bylo popsáno dříve (Martin et al., J. Med. Microbiol., 28, str. 1720 (1990)) a jsou uvedeny v tabulce 1.

Specificita monoklonálních protilátek byla stanovena za použití Western imunoblotingu podle metody dříve popsané (Martin et al., Eur. J. Immunol., 1, str. 601 (1988)) s následujícími modifikacemi. Přípravky zevní membrány získané od různých kmenů Neisseria meningitidis byly vyšetřeny na 14% SDS-PAGE gelech. Proteiny byly transferovány z gelů na nitrocelulosové membrány za použití semi-suchého přístroje (Bio Rad). Byl aplikován proud 60 mA na gel (6x10 cm) po 10 minut v elektroblotačním pufru skládajícím se z 25 mM Tris-HCl, 192 mM glycinu a 20% (objem/objem) methanolu, pH 8,3. Western imunoblotové pokusy jasně ukázaly, že monoklonální protilátky Me-1, Me-2, Me-3, Me-5, Me-6 a Me-7 rozpoznávají svůj specifický epitop na 22 kDa proteinu Neisseria meningitidis (obrázek 4A). Analýzy SDS-PAGE gelů a korespondujících Western imunoblotů také ukázaly, že zdánlivá molekulová hmotnost tohoto proteinu se příliš neliší u různých kmenů. Nicméně, množství proteinu přítomného v přípravcích zevní membrány se liší u různých kmenů a není ve vztahu k seroskupině kmenu. Nicméně, tyto monoklonální protilátky stále rozpoznávají svůj epitop na 22 kDa povrchovém proteinu Neisseria meningitidis po ošetření přípravku zevní membrány 2 IU proteinasy K na mg proteinu (ošetření je popsáno v příkladu 1, výše) (obrázek 4B).Zajímavé je, že epitopy zůstávají intaktní po štěpení enzymem, což potvrzuje, že i když dostupné v membránových přípravcích pro protilátku, nejsou ničeny ošetřením enzymem. Tento poslední výsledek naznačuje, že mechanismus, který vysvětluje pozorovanou resistenci na proteinasu K není pravděpodobně ve vztahu k povrchovým strukturám blokujícím přístup enzymu k proteinu, nebo k ochraně dané membránou, do které je protein hluboce zanořen. Ačkoliv to není ukázáno na obrázku 4, výsledky imunoblotů pro Me-1 byly konsistentní s výsledky pro dalších 5 monoklonálních protilátek.

Serie pokusů byly provedeny pro částečnou charakterizaci 22 kDa povrchového proteinu Neisseria meningitidis a pro jeho odlišení od jiných známých meningokokových povrchových proteinů. Žádný posun ve zdánlivé molekulové hmotnosti 22 kDa povrchového proteinu Neisseria meningitidis nebyl zaznamenán na SDS-PAGE gelu, pokud byly přípravky zevní membrány zahřátý na 100 po 5 minut, nebo na 37 nebo 56 na 30 minut v elektroforetickém vzorkovém pufru s nebo bez 2-merkaptoethanolu. Toto ukazuje, že migrace 22 kDa povrchového proteinu, pokud je přítomen v zevní membráně, nebyla modifikovatelná teplem nebo 2-merkaptoethanolem.

Oxidace jodistanem sodným byla použita pro určení toho, zda monoklonální protilátky reagují s uhlovodanovými epitopy přítomnými v přípravcích zevní membrány extrahovanými z organismů Neisseria meningitidis. Metoda použitá pro provedení tohoto pokusu byla dříve popsána (Martin et al., Infect. Immun., 60, str. 2718 - 2725 (1992)). Ošetření přípravků zevní membrány 100 mM jodistanu sodného po 1 hodinu při pokojové teplotě neovlivnilo reaktivitu monoklonálních protilátek proti 22 kDa povrchovému proteinu Neisseria meningitidis. Toto ošetření normálně odstraňuje vazbu protilátek, které jsou specifické pro uhlovodany.

Monoklonální protilátka 2-1-CA2 (poskytnutá Dr. A. Bhattacharjee, Walter Reed Army Institute of Research, Washington, D.C.) je specifická pro lip protein (také nazývaný H.8), povrchový antigen společný všem patogením druhům Neisseria. Reaktivita této monoklonální protilátky s přípravky zevní membrány byla srovnávána s reaktivitou monoklonální protilátky Me-5. Lip specifická monoklonální protilátka reagovala s proteinovým proužkem majícím zdánlivou molekulovou hmotnost 30 kDa, zatímco monoklonální protilátka Me-5 reagovala s proteinovým proužkem 22 kDa. Tento výsledek jasně ukazuje, že neexistuje žádný vztah mezi 22 kDa povrchovým proteinem Neisseria meningitidis a lip proteinem, jiným vysoce konzervovaným proteinem zevní membrány.

Pro potvrzení expozice 22 kDa proteinu na povrchu intaktních bakteriálních buněk Neisseria meningitidis byl proveden radioimunotest jak byl dříve popsán (Proulx et al., Infect. Immun., 59, str. 963 (1991)). 6-hodinové a 18 hodinové bakteriální kultury byly použity pro tento test. Šest monoklonálních protilátek reagovalo s 9 kmeny Neisseria meningitidis (seroskupina kmenu je ukázána v závorkách na obrázku 5), 2 kemny Neisseria gonorhoeae (NG), 2 kmeny Moraxella catarrhalis (MC) a 2 kmeny Neisseria lactamica (NL). Radioimunotest potvrdil, že epitopy rozpoznávané monoklonálními protilátkami jsou exponovány na povrchu intaktních izolátů Neisseria meningitidis různých seroskupin a serotypů a měly by být dostupné pro proteolytické enzymy (obrázek 5). Monoklonální protilátky se vázaly silně na jejich cílové epitopy na povrchu všech testovaných kmenů Neisseria meningitidis. Zaznamenané vazebné hodnoty (mezi 3000 a 35000 CPM) se lišily u různých kmenů a podle fyziologického stavu bakterií. Haemophilus influenzae porin-specifická monoklonální protilátka byla použita jako negativní kontrola pro každý bakteriální kmen. Počty pod 500 CPM byly získány a následně odečteny od každé hodnoty vazby. S ohledem na testované kmeny Neisseria meningitidis v tomto testu jsou výsledky ukázané na obrázku 5 pro monoklonální protilátky Me-5 a Me-7 representativní pro výsledky získané pro monoklonální protilátky Me-1, Me-2, Me-3 a Me-6. S ohledem na jiné testované bakteriální kmeny jsou vazebné aktivity ukázané pro Me-7 representativní pro vazebné aktivity získané pro jiné monoklonální protilátky, které rozpoznávají stejný bakteriální kmen.

Antigení konzervace epitopů rozpoznávaných monoklonálními protilátkami byla také hodnocena. Dot enzymový imunotest byl použit pro rychlé vyšetření monoklonálních protilátek proti velkému počtu bakteriálních kmenů. Tento test byl proveden jak bylo dříve popsáno (Lussier et al., J. Immunoassay, 10, str. 373 (1989)) . Soubor 71 kmenů Neisseria meningitidis byl použit v tomto testu. Vzorek obsahoval 19 izolátů seroskupiny A, 23 izolátů seroskupiny B, 13 izolátů seroskupiny C, 1 izolát seroskupiny 29E, 6 izolátů seroskupiny W-135, 1 izolát seroskupiny X, 2 izoláty seroskupiny Y, 2 izoláty seroskupiny Z a 4 izoláty, které nebyly zařazeny do seroskupiny (NS). Tyto izoláty byly získány z Carbbean Epidemiology Centre, Port of Spain, Trinidad; Children's Hospital of Eastern Ontario, Ottawa, Canada; Department of Saskatchewan Health, Regina, Canada; Laboratoire de Santé Publique du Quebec, Montreal, Canada; Max-Plane Institute fur Molekular Genetik, Berlin, FRG; Montreal Children Hospital, Montreal, Canada ;Victoria General Hospital, Halifax, Canada; a souboru našich vlastních kmenů.Následující bakteriální kmeny byly také testovány: 16 Neisseria gonorhoeae, 4 Neisseria cinerea, 5 Neisseria lactamica, 1 Neisseria flava, 1 Neisseria flavescens, 3 Neisseria mucosa, 4 Neisseria perflava/sicca, 4 Neisseria perflava, 1 Neisseria sicca, 1 Neisseria subflava a 5 Moraxella catarhalis, 1 Alcaligenes faecalis (ATCC 8750), 1 Citrobacter freundii (ATCC 2080), 1 Edwardsiella tarda (ATCC 15947), 1 Enterobacter cloaca (ATCC 23355), 1 Enterobacter aerogenes (Atcc 13048), 1 Escherichia coli, 1 Flavobacterium odoratum, 1 Haemophilus influenzae typ b (Eagan kmen), 1 Klebsiella pneumoniae (ATCC 13883), 1 Proteus rettgeri (ATCC 9027), 1 Proteus vulgaris (ATCC 13315), 1 Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027), 1 Salmonella typhimurium (ATCC 14028), 1 Serratia marcescens (ATCC 8100), 1 Shigella flexneri (ATCC 12022), 1 Shigella sonnei (ATCC 9290). Tyto byly získány od American Type Culture Collection nebo ze souboru uchovávaného v Laboratory Centre for Disease Control, Ottawa, Ontario, Canada. Reaktivity monoklonálních protilátek s většinou relevantních kmenů Neisseria jsou ukázány v tabulce 1. Jedna monoklonální protilátka, Me-7, rozpoznávala svůj specifický epitop na 100% ze 71 testovaných kmenů Neisseria meningitidis. Tato monoklonální protilátka, stejně jako Me-2, Me-3, Me-5 a Me-6 také reagovala s jistými kmeny náležícími k jiným druhům Neisseria, což ukazuje, že jejich specifické epitopy jsou také exprivovány na jiných blízce příbuzných Neisseriích. Kromě slabé reakce s jedním kmenem Neisseria lactamica reagovala monoklonální protilátka Me-1 pouze s izoláty Neisseria meningitidis. Me-1 byla dále testována s jinými vzorky 177 izolátů Neisseria meningitidis a byla schopna správně identifikovat více než 99% z celkových testovaných kmenů Neisseria meningitidis. Kromě kmenů Neisseria uvedených v tabulce 1 nereagovaly monoklonální protilátky s jakýmkoliv z výše uvedených bakteriálních druhů.

Závěrem, vynálezci bylo generováno šest monoklonálních protilátek, které specificky reagují s 22 kDa povrchovým proteinem Neisseria meningitidis. Za použití těchto monoklonálních protilátek jsme ukázali, že jejich specifické epitopy jsou 1) umístěny na proteinasa K resistentním 22 kDa proteinu přítomném v zevní membráně Neisseria meningitidis, 2) konzervovány mezi izoláty Neisseria meningitidis, 3) vystaveny na povrchu intaktních buněk Neisseria meningitidis a dostupné pro protilátku, a 4) že reaktivita těchto monoklonálních protilátek s 22 kDa povrchovým proteinem Neisseria meningitidis není modifikována ošetřením jodistanem sodným, což naznačuje, že jejich specifické epitopy nejsou umístěny na uhlovodanech.

Ačkoliv jsme zjistili, že migrace 22 kDa proteinu Neisseria meningitidis je posunuta na zdánlivou molekulovou hmotnost asi 18 kDa, pokud je zahřátý za přísných podmínek, pozorovali jsme, že migrace není modifikována ošetřením 2-merkaptoethanolem.

Také jsme ukázali, že 22 kDa povrchový protein nemá antigenní podobnost s lip proteinem, jiným vysoce konzervovaným proteinem o nízké molekulové hmotnosti přítomným v zevní membráně Neisseria meningitidis.

Jak bude ukázáno v příkladu 3, tyto monoklonální protilátky také reagují s purifikovaným, rekombinantním 22 kDa povrchovým proteinem produkovaným po transformaci Escherichia coli kmene BL21 (DE3) plasmidovým vektorem pNP2202 obsahujícím gen kódující 22 kDa povrchový protein Neisseria meningitidis.

Tabulka 1. Reaktivita monoklonálních protilátek s izoláty Neisseria

Počet izolátů Neisseriae rozpoznávaných monoklonální protilátkou

Seroskupina Neisseria meningitidis	NS (4)	Celkem (71)	Neisseria catarhalis (5)	Neisseria Neisseria gonorrhoea lactamica
A Jméno Izotyp (19)	B C 29E (23) (13) (1)	W135 (6)	X Z (1) (2)	Z (2)
(16)	(5)
Me-1 IgG2a(k) 19	22 13 1	6	1 2	2	3	69	0	0	1
Me-2 IgG2a(k) 19	20 13 1	6	0 2	2	4	67	0	2	0
Me-3 IgG3(k) 19	22 13 1	6	1 2	2	3	69	0	2	4
Me-5 IgG2a(k) 19	22 13 1	6	1 2	2	3	69	0	2	0
Me-6 IgGl (k) 19	23 13 1	6	1 1	2	3	70	0	2	4
Me-7 IgG2a(k) 19	23 13 1	6	1 2	2	4	71	5	2	4

izoláty nejsou serotypizovány

Příklad 3. Molekulární klonování, sekvencování genu, vysoce účinná exprese a purifikace 22 kDa povrchového proteinu Neisseria meningitidis

A. Molekulární klonování

LambdaGEM-11 genomová DNA knihovna z Neisseria meningitidis kmene 608B (B:2a:Pl.2) byla konstruována podle doporučení výrobce (Promega CO, Madison, WI). Stručně, genomová DNA kmene 608B byla částečně štěpena Sau 3AI a fragmenty ov rozsahu asi 9 a 23 kb byly purifikovány na agarosovém gelu před ligací do BamHI míst LambdaGEM-11 ramének. Vzniklé rekombinantní fágy byly použité pro infikování E. coli kmene LE392 (Promega), který byl potom umístěn na LB agarové plotny. Devatenáct pozitivních plaků bylo identifikováno po imunovyšetření knihovny s monoklonálními protilátkami specifickými pro 22 kDa povrchový protein Neisseria meningitidis podle příkladu 2 za použití následujícího protokolu. Plotny byly inkubovány po 15 minut při -20 °C pro zatvrdnutí vrchního agaru. Nitrocelulosové filtry byly šetrně aplikovány na povrch ploten na 30 minut při 4 °C pro absorpci proteinů produkovaných rekombinantními virovými klony. Filtry byly potom promyty v PBS-Tween 0,02% (objem/objem) a imunoblotovány jak bylo popsáno dříve (Lussier et al., J. Immunoassay, 10, str. 373 (1989)). Po amplifikaci a purifikaci DNA byl jeden virový klon, označený jako klon 8, který měl 13 kb insert, vybrán pro subklonovací pokusy. Po štěpení tohoto klonu Sací byly získány dva fragmenty 5 a 8 kb. Tyto fragmenty byly purifikovány na agarosovém gelu a ligovány do Sací restrikčního místa plasmidu pWKS30 s nízkým počtem kopií (Wang and Kushner, Gene, 100, str. 195 (1991)). Rekombinantní plasmidy byly použity pro transformaci Escherichia coli kmene JM109 (Promega) elektroporací (Bio-Rad, Mississauga, Ont. Canada) podle doporučení výrobce a vzniklé kolonie byly vyšetřovány s monoklonálními protilátkami specifickými pro 22 kDa povrchový protein Neisseria meningitidis podle příkladu 2. Pozitivní kolonie byly pozorovány pouze tehdy, pokud byla bakterie transformována plasmidem nesoucím 8 kb insert. Western blot analýza (metodologie byla popsána v příkladu 2) pozitivních klonů ukázala, že protein exprivovaný Escherichia coli byl kompletní a migroval na SDS-PAGE jako 22 kDa povrchový protein Neisseria meningitidis. Pro další redukci velikosti insertu byly klony obsahující 8 kb fragment štěpeny Clal a 2,75 kb fragment byl potom ligován do Clal místa pWKS30 plasmidu. Western blot analýza znovu jasně ukázala, že protein exprivovaný Escherichia coli byl kompletní a migroval na SDS-PAGE jako 22 kDa povrchový protein Neisseria meningitidis.

Po restrikční analýze vykazovaly dva klony, označené pNP2202 a pNP2203, 2,75 kb insert v opačné orientaci a byly vybrány pro provedení sekvencování genu kódujícího 22 kDa povrchový protein Neisseria meningitidis. Double Stranded Nested Deletion Kit od Pharmacia Biotech Inc. (Piscataway, NJ) byl použit podle návodu výrobce pro generování serie nested delecí z obou klonů. Vzniklé zkrácené inserty byly potom sekvencovány z M13 forward primeru přítomnému na pWKS30 vektoru s Tag Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing Kit za použití Applied Biosystems Inc. (Foster City, CA) automatizovaného sekvenátoru model 373A podle návodu výrobce.

B. Analýzy sekvence

Po sekvencování insertu v obou směrech odhalila nukleotidová sekvence otevřený čtecí rámeček skládající se z 525 nukleotidů (včetně stop kodonu) kódující protein složený z 174 aminokyselinových zbytků majících předpokládanou molekulovou hmotnost 18000 Daltonů a pí 9,93. Nukleotidová a odvozená aminokyselinová sekvence jsou ukázány na obrázku 1 (SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2).

Pro potvrzení správné exprese klonovaného genu byla určena N-terminální aminokyselinová sekvence nativního 22 kDa povrchového proteinu odvozeného od Neisseria meningitidis kmene 608B pro srovnání s aminokyselinovou sekvencí odvozenou z dat sekvence nukleotidů.

Přípravek zevní membrány odvozený od Neisseria meningitidis kmene 608B byl rozdělen elektroforesou na 14% SDS-PAGE gelu a byl transferován na polyvinylidin difluoridovou membránu (Millipore Products, Bedford, MA) podle dříve popsané metody (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)). 22 kDa proteinový proužek byl excidován z gelu a podroben Edmanově degradaci za použití Applied Biosystems Inc. (Foster City, CA) model 473A automatizovaného proteinového sekvenátoru podle doporučení výrobce. Aminokyselinová sekvence E-G-A-S-G-F-Y-V-Q-A korespondovala aminokyselinám 1-10 (SEQ ID NO: 2) otevřeného čtecího rámečku, což ukazuje, že Neisseria meningitidis kmen 608B, 22 kDa povrchový protein má 19 aminokyselinový leader peptid (aminokyselinové zbytky -19 až -1 SEQ ID NO: 2).

Průzkum v daných databázích potvrdil, že Neisseria meningitidis kmen 608B, 22 kDa povrchový protein (SEQ ID NO: 2) nebo jeho gen (SEQ ID NO: 1) nebyly doposud popsány.

C. Vysoce účinná exprese a purifikace rekombinantního 22 kDa povrchového proteinu Neisseria meningitidis

Následujíc proces byl vyvinut pro maximalizaci produkce a purifikace rekombinantního 22 kDa povrchového proteinu Neisseria meningitidis exprivovaného v E. coli. Tento proces je založen na pozorování, že rekombinantní 22 kDa povrchový protein produkovaný v Escherichia coli kmenu BL21 (DE3) (Studier and Moffat, J. Mol. biol., 189, str. 113 (1986)) nesoucí plasmid pNP2202 může být nalezen ve velkém množství v zevní membráně, ale může také být získán ze supernatantu kultury, ve kterém je nej hojnějším proteinem. Supernatant kultury je proto materiálem použitým pro purifikaci rekombinantního 22 kDa povrchového proteinu za použití afinitní chromatografie (obrázek 6A).

Pro generování matrix afinitní chromatografie byly monoklonální protilátky Me-2, Me-3 a Me-5 (popsané v příkladu 2) imobilizovány na CNBr-aktivované sepharose 4B (Pharmacia Biotech Inc., Piscataway, NJ) podle návodu výrobce.

Pro přípravu supernatantu kultury byla Escherichia coli kmen BL21(DE3) kultivovaná přes noc, nesoucí plasmid pNP2202 inokulována na LB bujón (Gibco Laboratories, Grand Island, N.Y.) obsahující 25 mg/ml ampicilinu a byl inkubován 4 hodiny při 37 °C s agitací. Bakteriální buňky byly odstraněny z kultivačního media dvěma centrifugacemi při 10000 x g po 10 minut při 4 °C. Supernatant kultury byl filtrován přes 0,22 mm membránu (Millipore, Bedfords, MA) a potom byl koncentrován asi 100 krát za použití ultrafiltrační membrány (Amicon Co., Beverly, MA) s molekulární hranicí 10000 Daltonů. Pro kompletní solubilizováni membránových vesikul byl přidán Empigen BB (Calbiochem Co., LaJolla, Ca) pro koncentrování supernatantu kultury na konečnou koncentraci 1% (objem/objem). Suspense byla inkubována při pokojové teplotě po jednu hodinu, dialyzována přes noc proti několika litrům 10 mM Tris-HCl pufru, pH 7,3 obsahujícím 00,05% Empigen BB (objem/objem) a centrifugována při 10000 x g po 20 minut při 4 °C. Přípravek antigenu byl přidán do afinitní matrix a inkubován přes noc při 4 °C s konstantní agitací. Kaše gelu byla nalita do chromatografické kolony a extensivně promyta 10 mM Tris-HCl pufru, pH 7,3, obsahujícím 0,05% Empigen BB (objem/objem). Rekombinantní 22 kDa protein byl potom eluován z kolony 1 M LiCl v 10 mM Tris-HCl pufru, pH 7,3. Roztok obsahujíc eluovaný protein byl extensivně dialyzován proti několika litrům 10 mM Tris-HCl pufru, pH 7,3 obsahujícím 00,05% Empigen BB. Coomassie Blue a stříbrem barvené SDS-PAGE gely (Tsai and Frasch, Analytical Biochem., 119, str. 19 (1982)) byly použity pro hodnocení čistoty rekombinantního 22 kDa povrchového proteinu v každém kroku purifikačního procesu a representativní výsledky jsou ukázány na obrázku 6A. Barvení gelů stříbrem jasně ukazuje, že proces purifikace poskytuje dosti čistý 22 kDa rekombinantní protein s pouze malým množstvím lipopolysacharidů Escherichia coli.

Resistence na proteolytické štěpení purifikovaného rekombinantního 22 kDa povrchového proteinu byla také potvrzena a výsledky jsou presentovány na obrázku 6B. Purifikovaný rekombinantní 22 kDa povrchový protein byl ošetřen jak je popsáno v příkladu 1 α-chymotrypsinem a trypsinem v množství 2 mg na mg proteinu a 2 IU proteinasy K na mg proteinu po 1 hodinu při 37 °C s konstantním třepáním. Žádná redukce množství proteinu nebyla pozorována po jakémkoliv z těchto ošetření. Pro srovnání, částečné nebo úplné štěpení v závislosti na vybraném enzymu bylo pozorováno pro kontrolní protein, kterým byl v tomto případě hovězí sérový albumin (BSA, Sigma). Kromě toho, delší periody ošetření nevedly k jakékoliv modifikaci proteinu. Poslední výsledek ukazuje, že transformované buňky Escherichia coli mohou exprivovat kompletní rekombinatní 22 kDa povrchový protein a že tento protein je také vysoce resistentní na účinek těchto tří proteolytických enzymů jako nativní protein nacházený u Neisseria meningitidis. Kromě toho, purifikovaný rekombinantní 22 kDa povrchový protein, který není zanořen v zevní membráně Escherichia coli je stále vysoce resistentní na účinek proteolytických enzymů.

Také jsme potvrdili účinek enzymatického ošetření na antigenní vlastnosti rekombinantního 22 kDa proteinu. Jak bylo určeno ELISA a Western imunoblotingem, monoklonální protilátky popsané v příkladu 2 snadno rozpoznávají 22 kDa povrchový protein, který byl purifikován podle procesu popsaného výše (obrázek 6C). Navíc, reaktivita monoklonální protilátky Me-5, stejně jako reaktivita jiných monoklonálních protilátek specifických pro 22 kDa protein, s purifikovaným 22 kDa povrchovým proteinem, nebyla ovlivněna jakýmkoliv enzymatickým ošetřením, což potvrzuje, že antigenní vlastnosti rekombinantního 22 kDa proteinu jsou podobné těm, které byly popsány pro nativní protein.

Významná data byla předložena v příkladu 3 a mohou být shrnuta následovně:

1) byla získána kompletní nukleotidová a aminokyselinová sekvence 22 kDa povrchového proteinu Neisseria meningitidis (SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2);

2) N-terminální sekvence nativního proteinu potvrdila, že 22 kDa gen Neisseria meningitidis byl opravdu klonován;

3) tento protein neby dříve popsán;

4) je možné transformovat hostitele jako je Escherichia coli a získat expresi rekombinantního 22 kDa povrchového proteinu Neisseria meningitidis ve vysokém výtěžku;

5) je možné získat rekombinantní protein prostý jiných molekul Neisseria meningitidis a téměř prostý složek produkovaných Escherichia coli;

6) purifikovaný rekombinantní 22 kDa povrchový protein je stále vysoce resistentní na účinek proteolytických enzymů jako je α-chymotrypsin, trypsin a proteinasa K; a

7) antigenní vlastnosti rekombinantního 22 kDa proteinu ve srovnání s vlastnostmi popsanými pro nativní 22 kDa povrchový protein Neisseria meningitidis jsou srovnatelné.

Příklad 4 Molekulární konzervace genu kódujícího 22 kDa povrchový protein Neisseria meningitidis

Pro potvrzení molekulární konzervace genu kódujícího 22 kDa povrchový protein Neisseria meningitidis mezi Neisseria izoláty byl použit DNA dot blot hybridizační test pro testování různých Neisseria druhů a jiných bakteriálních druhů. Nejprve, gen o 525 párech baží pro 22 kDa povrchový protein Neisseria meningitidis byl amplifikován PCR, purifikován na agarosovém gelu a značen náhodným primingem s non-radioaktivním DIG DNA značkovacím a detekčním systémem (Boehringer Mannheim, Laval, Canada) podle návodu výrobce.

DNA dot blot test byl proveden podle návodu výrobce (Boehringer Mannheim). Stručně, testované bakteriální kmeny byly umístěny na positivně nabitou nylonovou membránu (Boehringer Mannheim), sušeny a potom ošetřeny jak popisuje návod pro uživatele DIG systému pro snímání kolonií. Pre-hybridizace a hybridizace byly provedeny při 42 °C s roztokem obsahujícím 50% formamid (Sigma). Pre-hybridizační roztok také obsahoval 100 mg/ml denaturované sleďové spermatické DNA (Boehringer Mannheim) jako další blokující agens pro zabránění nespecifické hybridizace DNA proby. Přísnost promytí a kroky detekce za použití chemiluminiscenčního lumigen PPD substrátu byly také provedeny jak je popsáno v návodu pro uživatele DIG systému.

Pro 71 testovaných kmenů Neisseria meningitidis jsou výsledky získané s monoklonální protilátkou Me-7 a DNA probou o 525 párech baží v perfektním souhlasu. V souladu s výsledky, všechny testované kmeny Neisseria meningitidis mají gen pro 22 kDa povrchový protein Neisseria meningitidis a exprivují protein, protože byly všechny rozpoznány monoklonální protilátkou, což potvrzuje, že tento protein je vysoce konzervován mezi izoláty Neisseria meningitidis (tabulka 2).

DNA proba také detekovala gen kódující 22 kDa povrchový protein Neisseria meningitidis u všech testovaných kmenů Neisseria gonorhoeae.

Oproti tomu, monoklonální protilátka Me-7 reagovala pouze se 2 ze 16 testovaných kmenů Neisseria gonorhoeae, což ukazuje, že testovaný epitop je někdy nepřítomen, nedostupný nebo modifikovaný u kmenů Neisseria gonorhoeae, nebo že většina kmenů Neisseria gonorhoeae neexprivuje protein, ani když má kódující sekvenci ve svém genomu (tabulka 2).

Dobrá korelace mezi dvěma detekčními metodami byla také pozorována pro Neisseria lactamica, protože pouze jeden kmen Neisseria lactamica měl gen bez exprivování proteinu (tabulka 2). Tento výsledek může být také vysvětlen stejnými důvody jako v předešlém odstavci.

Toto může ukazovat že, ačkoliv 22 kDa není exprivován, nebo není dostupný na povrchu kmenů Neisseria gonorhoeae, kódující gen pro 22 kDa protein Neisseria gonorhoeae a Neisseria lactamica může být použit pro konstrukci rekombinantních plasmidů použitých pro produkci 22 kDa povrchového proteinu nebo analogů. Všechny takové proteiny nebo analogy mohou být použity pro prevenci, detekci nebo diagnostiku infekcí způsobených Neisseria. Přesněji, takové infekce mohou být vybrány z infekcí způsobených Neisseria meningitidis, Neisseria gonorhoeae a Neisseria lactamica. Proto, 22 kDa povrchový protein nebo analoga, může být použit pro výrobu vakciny proti takovým infekcím. Kromě toho, 22 kDa protein nebo analoga mohou být použita pro výrobu kitu pro detekci nebo diagnostiku takových infekcí.

Výsledky získané pro kmeny Moraxella catharalis ukazují, že z 5 testovaných kmenů 3 reagovaly s monoklonální protilátkou, ale žádný z nich nereagoval s DNA probou, což ukazuje, že gen kódující 22 kDa povrchový protein Neisseria meningitidis není přítomen v genomu těchto kmenů (tabulka 2).

Několi jiných druhů Neisseria stejně jako jiných bakteriálních druhů (viz poznámku, tabulka 2) bylo testováno a žádný z nich nebyl shledán pozitivním v kterémkoliv ze dvou testů. Tento poslední výsledek ukazuje, že gen pro 22 kDa povrchový protein je nesen pouze blízce příbuznými druhy Neisseriacae.

Tabulka 2 Reaktivita DNA proby o 525 párech baží a monoklonální protilátky Me-7 s různými druhy Neisseria

	Počet kmenů identifikovaných pomocí
(Neisseria species |(počet testovaných kmenů)1 2	monoklonální protilátky Me-7 DNA proby
(Neisseria meningitidis (71) (Moraxella catharalis (5) (Neisseria gonorhoeae (16) |Neisseria lactamica (5)	71 71 3 0 2 16 4 5

¹ - následující druhy Neisseria a jiné bakteriální druhy byly také testovány ve dvou testech a dávaly negativní výsledky: 1 Neisseria cinerea, 1 Neisseria flava, 1 Neisseria flavescens,

Neisseria mucosa, 4 Neisseria perflava/sicca, 1 Neisseria perflava, 1 Neisseria sicca, 1 Neisseria subflava, 1 Alcaligenes faecalis (ATCC 8750), 1 Bordetella pertussis (9340), 1 Bordetella bronchiseptica, 1 Citrobacter freundii (ATCC 2080), 1 Edwardsiella tarda (ATCC 15947), 1 Enterobacter cloaca (ATCC 23355), 1 Enterobacter aerogenes (Atcc 13048), 1 Escherichia coli, 1 Flavobacterium odoratum, 1 Haemophilus influenzae typ b (Eagan kmen), 1 Klebsiella pneumoniae (ATCC 13883), 1 Proteus rettgeri (ATCC 9027), 1 Proteus vulgaris (ATCC 13315), 1 Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027), 1 Salmonella typhimurium (ATCC 14028), 1 Serratia marcescens (ATCC 8100), 1 Shigella flexneri (ATCC 12022), 1 Shigella sonnei (ATCC 9290) a 1 Xanthomonas maltophila.

Závěrem, test DNA hybridizace jasně ukázal, že gen kódující 22 kDa povrchový protein Neisseria meningitidis je vysoce konzervován mezi pathogeními Neisseria. Dále získané výsledky jasně ukazují, že tato DNA proba se může stát hodnotným prostředkem pro rychlou a přímou detekci patogeních Neisseria bakterií v klinických vzorcích. Tato proba také může být vylepšena pro odlišení mezi Neisseria meningitidis a Neisseria gonorhoeae.

Příklad 5 Bakteriolytické a protektivní vlastnosti monoklonálních protilátek

Bakteriolytická aktivita specifických monoklonálních protilátek proti purifikovanému 22 kDa povrchovému proteinu Neisseria meningitidis byla hodnocena in vitro podle metody popsané dříve (Brodeur et al., Infect. Immun., 50, str. 510 (1985); Martin et al., Infect. Immun., 60, str. 2718 (1992)). V přítomnosti komplementu morčecího séra purifikované monoklonální protilátky Me-1 a Me-7 účině zabíjejí Neisseria meningitidis kmene 608B. relativně nízké hladiny každé z těchto monoklonálních protilátek redukují o více než 50% počet přežívajících bakterií. Využití vyšších koncentrací purifikovaných monoklonálních protilátek Me-1 a Me-7 vedlo k ostrému snížení (více než 99%) v počtu bakteriálních kolonie tvořících jednotek. Důležité je, že bakteriolytická aktivita těchto monoklonálních protilátek je závislá na komplementu, protože tepelná inaktivace morčecího séra po 30 minut při 56 °C kompletně rušila usmrcovací aktivitu. Jiné monoklonální protilátky nevykazují bakteriolytickou aktivitu proti stejnému kmenu. Kombinované, representativní výsledky několika pokusů jsou presentovány na obrázku 7, kde výsledky ukázané pro Me-7 jsou representativní a konsistentní s výsledky získanými pro Me-1. Výsledky ukázané pro Me-2 jsou representativní a konsistentní s výsledky získanými pro jiné monoklonální protilátky Me-3, Me-5 a Me-6.

Myší model infekce, který byl popsán dříve jedním z vynálezců (Brodeur et al., Infect. Immun., 50, str. 510 (1985); Brodeur et al., Can. J. Microbiol., 32, str. 33 (1986)) byl použit pro hodnocení protektivní aktivity každé monoklonální protilátky. Stručně, Balb/c myši byly injikovány intraperitoneálně 600 ml ascitické tekutiny obsahující monoklonální protilátky 18 hodin před expozicí bakteriím. Myši byly potom vystaveny 1 ml suspenze obsahující 1000 kolonie vytvářejících jednotek Neisseria meningitidis kmenu 608B, 4% mucin (Sigma) a 1,6% hemoglobin (Sigma). Kombinované výsledky několika pokusu jsou ukázány v tabulce 3. Je důležité, že pouze bakteriolyticke monoklonální protilátky Me-1 a Me-7 chránily myši před pokusnou infekcí Neisseria meningitidis. Opravdu, injekce ascitické tekutiny obsahující tyto dvě monoklonální protilátky před vystavením bakteriím signifikantně zvyšovala stupen přežívaní Balb/c myší na 70% nebo více ve srovnání s kontrolními skupinami, které dostaly buď 600 ml Sp2/0 indukované ascitické tekutiny nebo 600 ml ascitické tekutiny obsahující nepříbuznou protilátku. Výsledky také ukázaly, že 80% myší přežívá infekci, pokud jim byla předem podána injekce 400 μ<3 proteinem A purifikované Me-7 18 hodin před expozicí bakteriím. Následující pokusy byly provedeny pro určeníá minimální koncentrace protilátky nezbytné pro ochránění 50% myší. Nízký stupeň přežívání od 20 do 40% byl pozorován pro jiné monoklonální protilátky specifické pro 22 kDa povrchový protein Neisseria meningitidis.

Tabulka 3. Hodnocení imunoprotektivního potenciálu monoklonálních protilátek specifických pro 22 kDa povrchový protein Neisseria meningitidis kmene 608B (B:2a: PÍ.2).

1	Počet žijících myší	1 po infekci |
|monoklonální |protilátky	24 hodin	72 hodin	% přežívání |
|Me-l	29/30	23/30	76 |
|Me-2	17/20	3/20	25 |
|Me-3	5/10	2/10	20 |
|Me-5	11/20	8/20	40 |
|Me-7	10/10	7/10	70 |
|puri f ikovaná	Me-7 13/15	12/15	80 |
|kontrola 1	31/100	9/100	9 1 l

Závěrem, výsledky jasně ukazují, že protilátka specifická pro 22 kDa povrchový protein Neisseria meningitidis může účinně chránit myši před pokusnou letální infekcí. Indukce protektivních protilátek antigenem je nejvýznamnějším kriteriem pro zajištění dalšího výzkumu potenciálních kandidátů vakcin.

Příklad 6. Imunizace purifikovaným rekombinantním 22 kDa povrchovým proteinem uděluje ochranu před následující bakteriální infekcí

Purifikovaný rekombinantní 22 kDa povrchový protein byl připraven podle protokolu popsaného v příkladu 3, a byl použit pro imunizaci Balb/c myší pro určení jeho ochraného účinku proti infekci letální dávkou Neisseria meningitidis 608B (B:2a:Pl.2). Bylo rozhodnuto použít purifikovaný rekombinantní protein místo nativního meningokokového proteinu pro zajištění toho, že není ve vakcině během pokusu použit jiný meningokokový antigen. Myší model infekce použitý v těchto pokusech byl popsán dříve jedním z vynálezců (Brodeur et al., Infect. Immun., 50, str. 510 (1985); Brodeur et al., Can. J. Microbiol., 32, str. 33 (1986)). Myši byly každá injikována subkutánně třikrát ve třítýdením intervalu 100 ml přípravku antigenu obsahujícho 10 nebo 20 gg purifikovaného rekombinantního 22 kDa povrchového proteinu na myš. QuilA bylo adjuvans použité pro tyto pokusy v koncentraci 25 gg na injekci. Myši v kontrolní skupině byly injikovány podle stejného postupu bud 10 nebo 20 gg BSA, 20 gg koncentrovaného supernatantu kultury Escherichia coli kmene BL21 (DE3) nesoucího plasmid pWKS30 bez insertováného genu pro meningokokový protein jak je popsáno v příkladu 3 nebo fosfátem pufrovaným salinickým roztokem. Vzorky séra od každé myši byly získány před každou injekcí pro analýzu imunitních odpovědí proti rekombinantnímu proteinu. Dva týdny po třetí imunizaci bylo myším ve všech skupinách injikováno intraperitoneálně 1 ml suspenze obsahující 1000 kolonie vytvářejících jednotek Neisseria meningitidis kmenu 608B, 4% mucin (Sigma) a 1,6% hemoglobin (Sigma).

Výsledky těchto pokusů jsou presentovány v tabulce 4. Osmdesát procent (80%) myší imunizovaných purifikovaným rekombinantním 22 kDa povrchovým proteinem přežívalo bakteriální infekci oproti 0 až 42% myší v kontrolních skupinách. Významné je, že myši v kontrolní skupině, kterým byl injikován koncentrovaný supernatant kultury Escherichia coli nebyly chráněny před bakteriální infekcí. Tento poslední výsledek jasně ukazuje, že složky přítomné v kultivačním mediu a antigeny Escherichia coli, které mohou být v malém množství přítomné po purifikaci nezpůsobují pozorovanou ochranu proti Neisseria meningitidis.

Tabulka 4. Imunizace purifikovaným rekombinantním 22 kDa povrchovým proteinem uděluje ochranu před následnou bakteriální infekcí Neisseria meningitidis kmene 608B (B:2a:P1.2).

~------------	počet	1 žijících myší po infekci |
|Pokus Skupina I-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------	24 hod	48 hod	.. 72 hod.	% přežívání |
1 11 10/zg | purifikovaného | 22 kDa	20/20		16/20	80 |
| 10 μ<3 BSA	17/19		8/19	42 |
|2 20 μ | purifikovaného | 22 kDa proteinu	9/10	8/10	8/10	80 | 1 1
1 20 μg | koncentrovaného | E. coli | supernatantu	7/10	5/10	2/10	---------------------------------------------------------------------------------1 20 |
| 20 /zg BSA	6/10	4/10	2/10	20 |
| fosfátem | pufrovaný šalin. | roztok 1	8/10	0/10	0/10	--------------------------------------------------------------------------------1 o 1 1 1

Závěr

Injekce purifikovaného rekombinantního 22 kDa povrchového proteinu vysoce chrání imunizované myši před rozvojem letální infekce Neisseria meningitidis.

Protilátky podle předkládaného vynálezu jsou doloženy příkladem myší hybridomní buněčné linie produkující monoklonální protilátky Me-1 a Me-7 deponované v American Type Culture Collection v Rockville, Maryland, USA, 21.7.1995. Depozita byla označena přírůstkovými čísly HB 11959 (Me-1) a HB 11958 (Me-7).

Příklad 7. Analýza sekvence jiných kmenů Neisseria meningitidis a Neisseria gonorhoeae.

2,75 kb Clal štěpený DNA fragment obsahující gen kódující 22 kDa povrchový protein byl izolován z genomové DNA různých kmenů Neisseria meningitidis a Neisseria gonorrhoeae jak je popsáno v příkladu 3.

a) MCH88 kmen: nukleotidová sekvence kmene MCH88 (klinický izolát) je presentována na obrázku 8 (SEQ ID NO: 3). Z experimentálních důkazů získaných od kmene 608B (příklad 3) byla odvozena putativní leader sekvence korespondující aminokyselinám -19 až -1 (M-K-K-A-L-A-A-L-I-A-L-A-L-P-A-A-A-L-A). Průzkum stanovených databazí potvrdil, že 22 kDa povrchový protein Neisseria meningitidis kmene MCH188 (SEQ ID NO: 4) nebo jeho gen (SEQ ID NO: 3) nebyly doposud popsány.

b) Z4063 kmen: nukleotidová sekvence kmene Z4063 (Wang J.-F. et al. , Infect. Immun., 60, str. 5267 (1992)) je presentována na obrázku 9 (SEQ ID NO: 5). Z experimentálních důkazů získaných od kmene 608B (příklad 3) byla odvozena putativní leader sekvence korespondující aminokyselinám -19 až -1 (M-K-K-A-L-A-T-L-I-A-L-A-L-P-A-A-A-L-A). Průzkum stanovených databazí potvrdil, že 22 kDa povrchový protein Neisseria meningitidis kmene Z4063 (SEQ ID NO: 6) nebo jeho gen (SEQ ID NO: 5) nebyly doposud popsány.

c) Neisseria gonorrhoeae kmen b2: nukleotidová sekvence Neisseria gonorrhoeae kmene b2 (serotyp 1, Nat. Ref. Center for Neisseria, LCDC, Ottawa, Canada) je presentována na obrázku 10 (SEQ ID NO: 7). Z experimentálních důkazů získaných od kmene 608B (příklad 3) byla odvozena putativní leader sekvence korespondující aminokyselinám -19 až -1 (M-K-K-A-L-A-A-L-I-A-L-A-L-P-A-A-A-L-A). Průzkum stanovených databazí potvrdil, že 22 kDa povrchový protein Neisseria gonorrhoeae kmene b2 (SEQ ID NO: 8) nebo jeho gen (SEQ ID NO: 7) nebyly doposud popsány.

Obrázek 11 ukazuje konsensuální sekvenci stanovenou z DNA sekvence všech čtyř testovaných kmenů. MCH88 kmen ukazoval inserci jednoho kodonu (TCA) na nukleotidu 217, ale obecně vykazovaly čtyři kmeny přísnou homologii.

Obrázek 12 ukazuje homologii mezi odvozenou aminokyselinovou sekvencí získanou ze čtyř kmenů. Je zde více než 90% identita mezi všemi čtyřmi kmeny.

Příklad 8. Imunitní odpověď králíků a opic na 22 kDa povrchový protein Neisseria meningitidis

Králíci a opice byly imunizovány rekombinantním 22 kDa proteinem pro hodnocení protilátkové odpovědi v jiných druzích, než jsou myši.

a) Králíci

Samci novozélandských králíků byli imunizováni přípravky zevní membrány získanými od E. coli kmene JM109 s plasmidem PNP2202 nebo s kontrolním plasmidem pWKS30 (kmen a plasmidy jsou popsány v příkladu 3). Extrakce chloridem litnatým byla použitá pro získání přípravků zevní membrány byla provedena způsobem, který byl popsán dříve (Brodeur et al., Infect. Immun., 50, 510 (1985)). Obsah proteinu těchto přípravků byů určen Lowryho metodou adaptovanou na membránové frakce (Lowry et al., J. Biol. Chem., 193, str. 265 (1951)). Králíci byli injikováni subkutánně a intramuskulárně na několika místech dvakrát ve třítýdeních intervalech 150 |ig jednoho z přípravků zevní membrány popsaných výše. Quil A, v konečné koncentraci 20% (objem/objem) bylo adjuvans použité pro tyto imunizace. Vývoj specifické humorální odpovědi byl analyzován ELISA za použití přípravků zevní membrány od Neisseria meningitidis kmene 608B (B:2a:P1.2) jako potahovacího antigenu a Western blotingem podle metody již popsané (Brodeur et al., Infect. Immun., 50, str. 510 (1985); Martin et al., Eur. J. Immunol., 18, str. 601 (1988)). Alkalickou fosfatasou nebo peroxidasou značené Donkey anti-králičí imunoglobuliny (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) byly použity pro tyto testy.

Injekce přípravků zevní membrány E. coli obsahujících 22 kDa rekombinantní protein v kombinaci s QuilA adjuvans indukovala u králíků silnou specifickou protilátkovou odpověď 1/32000 jak je určeno ELISA (obrázek 13). Protilátky indukované po injekci rekombinantního 22 kDa proteinu reagovaly s purifikovaným rekombinantním 22 kDa proteinem, ale významnější je, že také rozpoznávaly nativní protein jak je exprivován, skládán a zanořen do zevní membrány Neisseria meningitidis. Western imunobloting pokusy jasně ukázaly, že protilátky přítomné po druhé injekci rozpoznávaly na nitrocelulosové membráně stejný proteinový proužek jako je ten, který je rozpoznávaný Mab Me-2 (popsanou v příkladu 2), který je specifický pro 22 kDa protein.

b) Opice

Dvě Macaca fascicularis (cynomolgous) opice byly příslušně imunizovány dvěma injekcemi 100 μ$ (K28) a 200 /zg (1276) afinitne purifikovaného rekombinantního 22 kDa proteinu na injekci. Metody použité pro produkci a čištění proteinu z E. coli kmene JM109 byly popsány v příkladu 3. Alhydrogel, v konečné koncentraci 20% (objem/objem) (CedarLane Laboratories, Hornby, Ont. Canada) bylo adjuvans použité pro tyto imunizace. Opice dostaly dvě intramuskulární injekce ve třítýdením intervalu. Kontrolní opice (K65) byla imunizována nepříbuzným rekombinantním proteinovým přípravkem jak bylo popsáno výše. Alkalickou fosfatasou nebo peroxidasou značené kozí anti-lidské imunoglobuliny (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) byly použity pro tyto testy.

Specifická protilátková odpověď opice K28,, která byla imunizována 100 purifikovaného proteinu na injekci se zdála být rychlejší a byla silnější než ta, která byla pozorována pro opici 1276, které bylo injikováno 200 ptg proteinu (obrázek 14) . Protilátky specifické pro nativní 22 kDa protein jak byly detekovány Western imunoblotingem byly již přítomné v séru imunizovaných opic dvacet jedna dní po první injekci, ale nebyly přítomné v déru kontrolní opice po dvou injekcích kontrolního antigenu.

Závěr

Data přítomná v příkladech 2 a 5 jasně ukazují, že injekce rekombinantního 22 kDa proteinu může indukovat protektivní protilátkovou odpověď u myší, která je namířena proti kmenům Neisseria meningitidis. Významnější je, že výsledky předkládané v tomto příkladu ukazují, že tato imunologická odpoved není omezena pouze na jeden druh, ale že rekombinantní povrchový protein muže take stimulovat imunitní system jiných druhů jako je králík nebo opice.

Příklad 9 Epitopove mapovaní 22 kDa proteinu Neisseria meningitidis kDa povrchový protein Neisseria meningitidis byl epitopově mapován za použití metody popsané jedním z vynálezců (Martin et al., Infect. Immun., (1991), 59: 1457 - 1464). Identifikace lineárních epitopů byla provedena za použití překrývajících se syntetických peptidů pokrývajících celou sekvenci 22 kDa proteinu Neisseria meningitidis odvozenou z kmene 608B (obrázek 15) a hyperimunitního séra získaného po imunizaci tímto proteinem. Identifikace imunodominantních částí 22 kDa proteinu může být nápomocná při vývoji nových účinných vakcin. Dále, lokalizace těchto epitopů B buněk také poskytuje hodnotnou informaci o strukturální konfiguraci proteinu v zevní membráně Neisseria meningitidis.

Všechny peptidy byly syntetizovány za použití BioTech Immunosystems Inc. /Montreal, Canada) s Applied Biosystems (Foster City, Calif.) automatizovaným peptidovým syntezátorem. Syntetické peptidy byly purifikovány reversní-fází vysokotlaké kapalinové chromatografie. Peptidy CS-845, CS-847, CS-848, CS-851, CS-852 a CS-856 (obrázek 15) byly solubilizovány v malém objemu 6M guanidin HC1 (J. T. Baker, Ontario, Canada) nebo dimethylsulfoxidu (J. T. Baker). Tyto peptidy byly potom upraveny na 1 mg/ml v destilované vodě. Všechny další peptidy byly snadno rozpustné v destilované vodě a byly také upraveny na 1 mg/ml.

Enzymově vázané imunosorbentní testy (ELISA) peptidu byly provedeny potažením syntetických peptidů na mikrotitrační plotny (Trnmulon 4, Dynatech Laboratories Inc., Chantilly, VA) v koncentraci 50 μg/ml v 50 mM uhličitanovém pufru, pH 9,6. Po inkubaci přes noc při pokojové teplotě byly plotny promyty fosfátem pufrovaným salinickým roztokem (PBS) obsahujícím 0,05% (hmotnost/objem) Tween 20 (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.) a byly blokovány PBS obsahujícím 0,5% (hmotnost/objem) hovězí sérový albumin (Sigma). Sérum získané od myší a opic imunizovaných afinitně purifikovaným rekombinantním 22 kDa povrchovým proteinem bylo ředěno a 100 μΐ na jamku každého ředění bylo přidáno do ELISA ploten a inkubováno po 1 hodinu při 37 °C. Plotny byly potom třikrát promyty a 100 μΐ alkalickou fosfatasou konjugovaných kozích anti-lidských imunoglobulinů (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) ředěných podle návodu výrobce bylo přidáno, po inkubaci po 1 hodinu při 37 byly plotny promyty a 100 μΐ diethanolaminu (10% (objem/objem)) obsahujícího p-nitro-fenylfosfát (Sigma) v 1 mg/ml bylo přidáno. Po 60 minutách byla reakce (lambda = 410 nm) čtena spektrofotometricky čtečkou mikroploten.

Myší a opičí antisera získaná po imunizaci afinitně purifikovaným rekombinantním 22 kDa proteinem (příklad 8) byla úspěšně použita v kombinaci s osmi překrývajícími se syntetickými peptidy pro lokalizaci epitopů B buněk na proteinu. Tyto epitopy jsou seskupeny ve třech antigenních doménách proteinu.

První region je umístěn mezi aminokyselinovými zbytky 51 a 86. Počítačová analýza za použití různých algoritmů naznačila, že tento region má nejvyšší pravděpodobnost toho, že je imunologicky významný, protože je hydrofilní a vystavený na povrchu. Dále, srovnání čtyř proteinových sekvencí, které je ukázáno na obrázku 12, ukazuje, že jedna z hlavních variací, kterou je inserce aminokyselinového zbytku v pozici 73, je také umístěna v tomto regionu.

Antisérum identifikovalo druhou antigenní doménu umístěnou mezi aminokyselinovými zbytky 110 a 140. Je zajímavé, že analýza sekvence ukázala, že sedm ze čtrnácti aminokyselinových zbytků, které nejsou konzervovány mezi čtyřmi proteinovými sekvencemi, jsou seskupeny v tomto regionu proteinu.

Třetí antigenní doména umístěná ve vysoce konzervované části proteinu, mezi aminokyselinovými zbytky 31 a 55, byla rozpoznána pouze opičím sérem.

Příklad 10 Teplem indukovatelný vektor pro produkci velkého rozsahu 22 kDa povrchového proteinu

Gen kódující 22 kDa povrchový protein Neisseria meningitidis byl insertován do plasmidu p629 (George et al., Bio/technology 5: 600 - 603 (1987))· Kazeta teplotně sensitivního represorového genu bakteriofágu lambda, ze které byl deletován funkční Pr promotor, je nesena plasmidem p629, který používá PL promotor pro kontrolu syntesy 22 kDa povrchového proteinu. Inaktivace cI857 represoru teplotním posunem z 30 °C na teplotu okolo 38 °C vede k produkci proteinu kódovaného plasmidem. Indukce genové exprese v buňkách E. coli teplotním posunem je výhodná pro fermentace velkého rozsahu, protože může být snadno dosažena moderními fermentátory. Jiné indukovatelné expresní vektory obvykle vyžadují přidání specifických molekul jako je laktosa nebo isopropylthio^-D-galaktosid (IPTG) do kultivačního media pro indukci exprese požadovaného genu.

540 nukleotidový fragment byl amplifikován PCR z genomové DNA Neisseria meningitidis kmene 608B za použití následujících oligonukleotidových primerů (OCRR8:

5'-TAATAGATCTATGAAAAAAGCACTTGCCAC-3' a 0CRR9: 3'CACGCGCAGTTTAAGACTTCTAGATTA-5'). Tyto primery korespondují nukleotidové sekvenci nacházané na obou koncích 22 kDa genu. Pro zjednodušení klonování PCR produktu bylo BglII (AGATCT) restrikční místo inkorporováno do nukleotidové sekvence těchto primerů. PCR produkt byl purifikován na agarosovém gelu před jeho štěpením BglII. Tento BglII fragment o přibližně 525 párech baží byl potom insertován do BglII a BamHI míst plasmidu p629. Plasmid obsahující insert PCR produktu označený pNP2204 byl použit pro transformaci E. coli kmene DH5aF'IQ. Částečná mapa plasmidu pNP2204 je ukázána na obrázku 16. Vzniklé kolonie byly vyšetřovány monoklonálními protilátkami specifickými pro 22 kDa povrchový protein Neisseria meningitidis jak je popsáno v příkladu 2. Western blot analýzy výsledných klonů jasně ukázaly, že protein syntetizovaný v E. coli byl kompletní a migroval na SDS-PAGE gelu jako nativní 22 kDa povrchový protein Neisseria meningitidis. Plasmidová DNA byla purifikována z vybraného klonu a potom sekvencována. Nukleotidová sekvence insertu přítomného v plasmidu přesně odpovídala nukleotidové sekvenci genu kódujícího 22 kDa protein Neisseria meningitidis presentované na obrázku 1.

Pro studium úrovně syntesy 22 kDa povrchového proteinu byl teplotně indukovatelný plasmid pNP2204 použit pro transformaci následujících kmenů E. coli: W3110, JM105, BL21, TOPP1, T0PP2 a T0PP3. Úroveň syntesy 22 kDa povrchového proteinu a lokalizace proteinu v různých buněčných frakcích byla určena pro každý kmen. Kultury v třepaných baňkách v LB bujónu (Gibco BRL, Life Technologies, Grand Island, NY) ukázaly, že teplotní posun z 30 °C na 39 °C účinně indukuje expresi genu. Hodnocení časového průběhu úrovně syntesy ukázalo, že protein se objeví, jak je určeno SDS-PAGE gelem, za 30 minut po indukci a že množství proteinu konstantně vzrůstá v průběhu indukční periody. Expresní hladiny mezi 8 a 10 mg 22 kDa proteinu na litr byly určeny pro E. coli kmen W3110 a TOPP1. Pro oba tyto kmeny je většina 22 kDa proteinu inkorporována v zevní membráně bakterie.

Příklad 11 Purifikace 22 kDa proteinu Neisseria meningitidis

Protože velká většina 22 kDa proteinu je nacházena zanořena do zevní membrány kmenů E. coli, je purifikační protokol předložený v tomto příkladu odlišný od již popsaného protokolu v příkladu 3, kde bylo velké množství proteinu přítomno v supernatantu kultury. Přes noc kultivovaná kultura inkubovaná při 30 °C buď E. coli kmene W3110 nebo TOPP1 nesoucí plasmid pNP2204 byla inokulována na LB bujón obsahující 50 μg/ml ampicilinu (Sigma) a byla kultivována při 30 °C s agitací (250 rpm) dokud nedosáhla buněčné density 0,6 (lambda = 600 nm), kdy byla inkubační teplota posunuta na 39 °C po dobu tří až pěti hodin pro indukci produkce proteinu. Bakteriální buňky byly získány centrifugací při 8000 x g po 15 minut při 4 °C a potom promyty dvakrát ve fosfátem pufrovaném salinickém roztoku (PBS), pH 7,3. Bakteriální buňky byly ultrazvukově rozrušeny (balistická desintegrace nebo mechanická desintegrace s French tlakem mohou být také použity). Neporušné buňky byly odstraněny centrifugací při 5000 x g po 5 minut a odloučeny. Zevní membrány byly separovány z cytoplasmatických složek centrifugací při 100000 x g po dobu 1 hodiny při 10 °C. Membrány obsahující pelety byly resuspendovány v malém objemu PBS, pH 7,3. Pro solubilizování 22 kDa povrchového proteinu z membrán byly použity detergenty jako je Empigen BB (Calbiochem Co., LaJolla, CA), zwittergent-3,14 (Calbiochem Co.,) nebo β-octylglukosid. Detergent byl přidán k membránové frakci v konečné koncentraci 3% a směs byla inkubována při 20 °C po 1 hodinu. Nerozpustný materiál byl odstraněn centrifugací při

100000 x g po 1 hodinu při 10 °C.

kDa protein byl účinně solubilizován každým ze tří detergentu, nicméně β-octylglukosid měl výhodu snadnějšího odstranění několika nežádoucích membránových proteinů, protože nebyl solubilizován a mohl být separován ze supernatantu centrifugací. Pro odstranění detergentu byl 22 kDa obsahující supernatant dialyzován extensivne proti několika změnám PBS pufru. Ošetření proteinasou K (jako v příkladu 1) může být použito pro další odstranění nechtěných proteinů z přípravku 22 kDa povrchového proteinu. Odlišné precipitace za použití síranu amonného nebo organických ředidel, a ultrafiltrace jsou další dva kroky, které mohou být použity pro odstranění nechtěné nukleové kyseliny a lipopolysacharidových kontaminantů z proteinu před průběhem v gelu a iontová výměnná chromatografie může být účinně použita pro získání purifikovaného 22 kDa proteinu. Afinitní chromatografie, jak je popsána v příkladu 3, muže být také použita pro purifikaci 22 kDa proteinu.

Příklad 12.

Použití 22 kDa povrchového proteinu jako lidské vakčiny

Pro formulování vakciny pro použití u lidí mohou být vhodné antigeny 22 kDa povrchového proteinu vybrány z polypeptidů zde popsaných. Například, odborník v oboru může vyrobit vakcinu s 22 kDa polypeptidem nebo jeho fragmentem obsahujícím imunogení epitop. Použiti technik molekulární biologie se zejména hodí pro přípravu v podstatě čistých rekombinantních antigenu. Kompozice vakciny mohou mít různé formy. Tyto zahrnují například, solidní, semi-solidní a kapalné dávkové formy, jako jsou prášky, kapalné roztoky nebo suspense a liposomy. Na základě naší víry, že 22 kDa povrchový protein podle předkládaného vynálezu může vyvolat protektivní imunitní odpověd, pokud je podán člověku, bude kompozice podle předkládaného vynálezu podobná těm, které jsou používány pro imunizaci lidí jinými proteiny a polypeptidy, např. tetanu a difterie. Proto bude kompozice podle předkládaného vynálezu preferovaně obsahovat farmaceuticky akceptovatelné adjuvans jako je nekompletní Freundovo adjuvans, hydroxid hlinitý, muramyl peptid, emulse voda v oleji, liposomy, ISCOM nebo CTB nebo netoxická B podjednotka cholera toxinu. Nejlépe, kompozice bude obshovat emulsi voda v oleji nebo hydroxid hlinitý jako adjuvans.

Kompozice bude podána pacientovi jakoukoliv z velkého počtu farmaceuticky akceptovatelných forem včetně intramuskulární, intradermální, subkutání nebo lokální. Preferovaně bude vakcina ‘podána intramuskulárně.

Obecně, dávka se bude skládat z počáteční injekce, nejpravděpodobněji s adjuvans, okolo 0,01 až 10 mg, a preferovaně 0,1 mg až 1,0 mg antigenu 22 kDa povrchového proteinu na pacienta, a potom bude následovat nejpravděpodobněji jedna nebo více dosycovacích injekcí. Preferovaně, dosycovací injekce budou podány asi 1 a 6 měsíců po počáteční injekci.

Úvahou týkající se vývoje vakciny je otázka slizniční imunity. Ideální slizniční vakcina bude bezpečně podávána orálně nebo intranasálně jako jedna nebo několik dávek a vyvolá tvorbu protektivních protilátek na vhodných površích spolu se systémovou imunitou. Kompozice slizniční vakciny může obsahovat adjuvans, inertní částice jako nosiče nebo rekombinantní živé vektory.

Protilátky proti 22 kDa povrchovému proteinu podle předkládaného vynálezu jsou použitelné pro pasivní imunoterapii a imunoprofylaxi lidí infikovaných Neisseria meningitidis nebo příbuznými bakteriemi jako je Neisseria gonorrhoeae nebo Neisseria lactamica. Dávkové formy a režimy pro pasivní imunizaci budou podobné jako pro jiné pasivní imunoterapie.

Protilátka podle předkládaného vynálezu je doložena příkladem hybridomu produkujícího monoklonální protilátky Me-1 nebo Me-7 deponované v American Type Culture Collection v Rockville, Maryland, USA, 21.7.1995 a identifikovaného jako myší hybridomní buněčné linie,Me-1 a Me-7, v příslušném pořadí. Depozita byla označena přírůstkovými čísly HB 11959 (Me-1) a HB 11958 (Me-7).

Ačkoliv jsme zde popsali množství provedení předkládaného vynálezu, je jasné, že naše základní provedení může být pozměněno za poskytnuti jiných provedení, která využívají kompozic a procesů tohoto vynálezu. Proto, rozsah tohoto vynálezu zahrnuje všechny alternativní provedení a variace, které jsou definovány v uvedené specifikaci a k nim připojených nároků; a vynález není omezen specifickými provedeními, které zde byly uvedeny jako příklad.

Seznam sekvencí (1) Obecné informace:

(i) Přihlašovatel: Brodeur, Bernard R.

Martin, Denis

Hamel, Josee

Rioux, Clement (ii) Název vynálezu: Proteinasa K resistentní povrchový protein Neisseria meningitidis (iii) Počet sekvencí: 26 (iv) Adresa pro korespondenci (A) Adresa: Goudreau Gage Dubuc and Martineau Walker (B) Ulice: 800 Place Victoria, Suite 3400, Tour de la

Bourse (C) Město: Montreal (D) Stát: Quebec (E) Země: Canada (F) ZIP: H4Z 1E9 (v) Počítačová čtecí forma:

(A) Typ media: Floppy disk (B) Počítač: IBM PC kompatibilní (C) Operační system: PC-DOS/MS-DOS (D) Software: Patentin Release #1.0, verse #1.25 (vi) Údaje o současné přihlášce:

(A) Číslo přihlášky:

(B) Datum podání:

(C) Klasifikace:

(vii) Údaje o dřívější přihlášce:

(A) Číslo přihlášky: US 08/406362 (B) Datum podání: 17.3.1995 (vii) Údaje o dřívější přihlášce:

(A) Číslo přihlášky: US (PROVIS) 60/001983 (B) Datum podání: 4.8.1995 (viii) Informace o zástupci/agentovi (A) Jméno: Leclerc/Dubuc/Prince, Alain/Jean/Geatan (C) Reference/číslo rejstříku: BIOVAC-1 PCT (ix) Telekomunikační informace:

(A) Telefon: 514-397-7400 (B) Telefax: 514-397-4382 (2) Informace pro SEQ ID NO: 1:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 830 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: dvojitý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomová) (iii) Hypotetická: ne (iv) Anti-sense: ne (vi) Zdroj původu:

(A) Organismus: Neisseria meningitidis (B) Kmen: 608B (ix) Vlastosti:

(A) Jméno/klíč: CDS (B) Umístění: 143...667 (ix) Vlastosti:

(A) Jméno/klíč: sig_peptid (B) Umístění: 143...199 (ix) Vlastosti:

(A) Jméno/klíč: mat_peptid (B) Umístění: 200...667 (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 1:

---Gj^AAAGC AGCCGGATAC CGCTACGTAT CTTGAAGTAT TGAAAATATT ACGATGCAAA 6C

AAAGAAAATT TAAGTA.TAAT ACAGCAGGAT TCTTTAACGG ATTCTTAACA ATTT^TCTAA 12 0

CTGACCATAA AGGAACCAAA AT ATG AAA AAA GCA CTT GCC ACA CTG ATT GCC 172 Met Lys Lys Ala Leu Ala Thr Leu Ile Ala -19 -15 -io

CTC GCT CTC	CCG GCC GCC GCA	CTG GCG GAA GGC GCA TCC GGC	Phe	TAC Tyr	220
Leu A.la Leu	Pro Ala Ala Ala	Leu Ala Glu Gly Ala Ser Gly
	-5	1 5
GTC CAA GCC	GAT GCC GCA CAC	GCA AAA GCC TCA AGC TCT TTA	GGT	<pQfn	268
Val Gin Ala 10	Asp Ala Ala His	Ala Lys Ala Ser Ser Ser Leu 15 20	Gly	Ser
GCC AAA GGC	TTC AGC CCG CGC	ATC TCC GCA GGC TAC CGC ATC	AAC	GAC	316
Ala Lys Gly 25	Phe Ser Pro Arg 30	Ile Ser Ala Gly Tyr Arg Ile 35	Asn	Asp
CTC CGC TTC	GCC GTC GAT TAC	ACG CGC TAC AAA AAC TAT AAA	GCC	CCA	364
Leu Arg Phe 40	Ala Val Asp Tyr 45	Thr Arg Tyr Lys Asn Tyr Lys 50	Ala	Pro 55
TCC ACC GAT	TTC AAA CTT TAC	AGC ATC GGC GCG TCC GCC ATT	TAC	GAC	412
Ser Thr Asp	Phe Lys Leu Tyr 60	Ser Ile Gly Ala Ser Ala Ile 65	Tyr 70	Asp
TTC GAC ACC	CAA TCG CCC GTC	AAA CCG TAT CTC GGC GCG CGC	TTG	AGC	460
Phe Asp Thr	Gin Ser Pro Val 75	Lys Pro Tyr Leu Gly Ala Arg 80 85	Leu	Ser
CTC AAC CGC	GCC TCC GTC GAC	TTG GGC GGC AGC GAC AGC TTC	AGC	CAA	508
Leu Asn Arg 90	Ala Ser Val Asp	Leu Gly Gly Ser Asp Ser Phe 95 100	Ser	Gin
ACC TCC ATC	GGC CTC GGC GTA	TTG ACG GGC GTA AGC TAT GCC	GTT	ACC	556
Thr Ser Ile 105	Gly Leu Gly Val 110	Leu Thr Gly Val Ser Tyr Ala 115	Val	Thr
CCG AAT GTC	GAT TTG_ GAT GCC	GGC TAC CGC TAC AAC TAC ATC	GGC	AAA	604
Pro Asn Val 120	Asp Leu’ Asp Ala 125	Gly Tyr Arg Tyr Asn Tyr Ile 130	Gly	Lys 135
GTC AAC ACT	GTC AAA AAC GTC	CGT TCC GGC GAA CTG TCC GTC	GGC	GTG	652
Val Asn Thr	Val Lys Asn Val 140	Arg Ser Gly Glu Leu Ser Val 145	Gly 150	Val
CGC GTC AAA ' krg Val Lys	TTC TGATATGCGC CTTATTCTGC AAACCGCCGA GCCTTCGGCG Phe 155		704

GTTTTGTTTT CTGCCACCGC AACTACACAA GCCGGCGGTT TTGTACGATA ATCCCGAATG 764

CTGCGGCTTC TGCCGCCCTA TTTTTTGAGG AATCCGAAAT GTCCAAAACC ATCATCCACA 824 (2) Informace pro SEQ ID NO: 2:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 174 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 2

Ser Ala lie Tyr Asp Phe Asp Thr Gin Ser Pro ⁷⁰75

Gly Ala Arg Leu Ser Leu Asn Arg Ala Ser Val ⁸⁵90

Asp ser Phe Ser Gin Thr Ser lie Gly Leu Gly 1UU

Ser Tyr Ala Val Thr'Pro Asn Val Asp Leu Asp ^{115 128}125

Asn Tyr lie Gly Lys Val Asn Thr Val Lys Asn ¹³⁵140

Leu Ser Val Gly Val Arg Val Lys Phe

Met _Lys Lys _Ala Leu Ala Thr Leu He Ala Leu Ala Leu Pro Ala Ala

Ala Leu Ala Glu Gly Ala Ser Gly Phe T^r Val Gin Ala Asp Ala Ala ⁵10

Hl. M. Lys Ala se. s„ _s„ _{cly s}„ _A1, _Ly, _My ²⁰25

He Ser Ala Gly Tyr Arg lie Asn Asp Leu Arg Phe Ala Val Asp ^{35 40}45

Tyr Thr Arg Tyr Lys Asn iyr Lys Ala Pro Ser Thr Asp Phe Lys Leu ⁵³60

Tyr Ser lie Gly Ala 65

Val Lys Pro Tyr Leu

Asp Leu Gly Gly Ser 95

Val Leu Thr Gly Val 110

Ala Gly Tyr Arg Tyr 130

Val Arg Ser Gly Glu 145 (2) Informace pro SEQ ID NO: 3:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 710 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: dvojitý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomová) (iii) Hypotetická: ne (iv) Anti-sense: ne (vi) Zdroj původu:

(A) Organismus: Neisseria meningitidis (B) Kmen: MCH88 (ix) Vlastosti:

(A) Jméno/klíč: CDS (B) Umístění: 116...643 (ix) Vlastosti:

(A) Jméno/klíč: sig_peptid (B) Umístění: 116...172 (ix) Vlastosti:

(A) Jméno/klíč: mat_peptid (B) Umístění: 173...643 (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 3:

GTATCTTGAG GCATTGAAAA

TATTACAATG CAAAAAGAAA ATTTCAGTAT AATACGGCAG

GATTCTTTA-A CGGATTCTTA A.CCA.TTTTTC TCCCTCACCA TAAAGGAATC AAGAT ATG 118

Met

AAA AAA GCA CTT GCC GCA CTG Lys Lys Ala Leu Ala Ala Leu -15

CTG GCG GAA GGC GCA TCC GGC Leu Ala Glu Gly Ala Ser Gly 1 5

ATT GCC CTC GCC CTC CCG GCC GCC GCA lie Ala Leu Ala Leu Pro Ala Ala Ala

-10-5

TTT TAC GTC CAA GCC GAT GCC GCACAC

Phe Tyr Val Gin Ala Asp Ala AlaHis

166

214

GCC AAA GCC TCA AGC TCT Ala Lys Ala Ser Ser Ser 15 20

ATC TCC GCA GGC TAC CGC lie Ser Ala Gly Tyr Arg 35

ACG CGC TAC AAA AAC TAT

Thr Arg Tyr Lys Asn Tyr 50

TAC AGC ATC GGC GCG TCC

Tyr Ser lie Gly Ala Ser 65

TTA GGT TCT GCC AAA Leu Gly Ser Ala Lys 25

ATC AAC GAC CTC CGC lie Asn Asp Leu Arg 40

AAA CAA GTC CCA TCC

Lys Gin Val Pro Ser 55

GCC ATT TAC GAC TTC

Ala lie Tyr Asp Phe 70

GGC TTC AGC CCG CGC262

Gly Phe Ser ProArg

TTC GCC GTC GAT TAC310

Phe Ala Val AspTyr

ACC GAT TTC AAA CTT358

Thr Asp Phe LysLeu

GAC ACC CAA TCC CCC406

Asp Thr Gin Ser Pro

GTC Val

AAA Lys 80

CCG Pro

TAT Tyr

CTC Leu

GGC Gly

GCG Ala 85

CGC Arg

TTG Leu

AGC Ser

CTC Leu

AAC Asn 90

CGC Arg

GCC Ala

TCC Ser

GTC Val

454

GAC Asp 95

TTT Phe

AAC Asn

GGC Gly

AGC Ser

GAC Asp 100

AGC Ser

TTC Phe

AGC Ser

CAA Gin

ACC Thr 105

TCC Ser

ACC Thr

GGC Gly

CTC Leu

GGC Gly 110

502

GTA Val

TTG Leu

GCG Ala

GGC Gly

GTA Val 115

AGC Ser

TAT Tyr

GCC Ala

GTT Val

ACC Thr 120

CCG Pro

AAT Asn

GTC Val

GAT Asp

TTG Leu 125

GAT Asp

550

GCC Ala

GGC Gly

TAC Tyr

CGC Arg 130

TAC Tyr

AAC Asn

TAC

ATC lie

GGC Gly 135

AAA Lys

GTC Val

AAC A.sn

ACT Thr

GTC Val 140

AAA Lys

AAT Asn

598

GTC CGT TCC Val Are Ser	GGC Gly	GAA Glu	CTG Leu	TCC Ser	GCC Ala	GG<_ Gly	GTA Val	CGC Arg	GTC Val	AAA Lys	TTC TGATATACGC 650 Phe
14 5					150					ICC

GTTATTCCGC AAACCGCCGA GCCTTTCGGC GGTTTTGTTT TCCGCCC-CCG CAACTACACA 71C (2) Informace pro SEQ ID NO: 4:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 175 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 4:

Met -19

Lys

Lys

Ala

Leu -15

Ala

Ala

Leu

lie

Ala -10

Leu

Ala

Leu

Pro

Aid -5

Ala

Ala

Leu

Ala

Glu 1

Gly

Ala

Ser

Gly 5

Phe

Tyr

Val

Gin

Ala 10

Asp

Ala

Ala

His

Ala 15

Lys

Ala

Ser

Ser

Ser 20

Leu

Gly

Ser

Ala

Lys 25

Gly

Phe

Ser

Pro

Arg 30

lie

Ser

Ala

Gly

Tyr 35

Arg

lie

Asn

Asp

Leu 40

Arg

Phe

Ala

Val

Asp 45

Tyr

Thr

Arg

Tyr

Lys 50

Asn

Tyr

Lys

Gin

Val 55

Pro

Ser

Thr

Asp

Phe 60

Lys

Leu

Tyr

Ser

lie 65

Gly

Ala

Ser

Ala

lie 70

Tyr

Asp

Phe

Asp

Thr 75

Gin

Ser

Pro

Val

Lys 80

Pro

Tyr

Leu

Gly

Ala 85

Arg

Leu

Ser

Leu

Asn 90

Arg

Ala

Ser

Val

Asp 95

Phe

Asn

Gly

Ser

Asp 100

Ser

Phe

Ser

Gin

Thr 105

Ser

Thr

Gly

Leu

Gly 110

Val

Leu

Ala

Gly

Val 115

Ser

Tyr

Ala

Val

Thr 120

Pro

Asn

Val

Asp

Leu 125

Asn Val Arg

Ser Gly Glu Leu Ser Ala Gly Val

145

150

Arg Val Lys

155

Phe (2) Informace pro SEQ ID NO: 5:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 850 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: dvojitý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomová) (iii) Hypotetická: ne (iv) Anti-sense: ne (vi) Zdroj původu:

(A) Organismus: Neisseria meningitidis (B) Kmen: Z4063 (ix) Vlastosti:

(A) Jméno/klíč: CDS (B) Umístění: 208...732 (ix) Vlastosti:

(A) Jméno/klíč: sig_peptid (B) Umístění: 208...264 (ix) Vlastosti:

(A) Jméno/klíč: mat_peptid (B) Umístění: 265...732 (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 5:

CACCCATCCG CCGCGTGATG CCGCCACCAC CATTTAAAGG CAACGCGCGG GTTAACGGCT 60

TTGCCGTCGG CAAAGCAGCC GGATACCGCT ACGTATCTTG AAGTATTAAA AATATTACGA 120

TGCAAAAAGA AAATTTAAGT ATAATAAAGC AGAATTCTTT AACGGATTCT TAACAATTTT 180

TCTAACTGAC CATAAAGGAA CCAAAAT A.TG AAA AAA GCA CTT GCC ACA CTG 231 Met Lys Lys Ala Leu Ala Thr Leu -19-15

ATT GCC CTC GCT CTC CCG GCC GCC GCA CTG GCG GAA GGC GCA TCC GGC279 lie Ala Leu Ala Leu Pro Ala Ala Ala Leu Ala Glu Gly Ala Ser Gly

-10 -5I

TTT TAC GTC CAA GCC GAT GCC GCA CAC GCA AAA GCC TCA AGC TCT TTA327 phe '^TVr Val Gin Ala Asp Ala A.la His Ala Lys Ala Ser Ser SerLeu

1520

GGT TCT GCC AAA GGC TTC AGC CCG CGC ATC TCC GCA GGC TAC CGC ATC375

Gly Ser Ala Lys Gly Phe Ser Pro Arg lie Ser Ala Gly Tyr Arglie

3035

AAC GAC

CTC CGC TTC

GCC GTC GAT

TAC ACG CGC TAC AAA

AAC Asn

TAT Tyr

AAA Lys

423

Asn

Asp

Leu Arg 40

Phe

Ala

Val

Asp 45

Tyr Thr

Arg Tyr Lys 50

GCC

CCA

TCC ACC

GAT

TTC

AAA

CTT

TAC AGC

ATC GGC GCG

TCC

GCC

ATT

471

Ala

Pro 55

Ser Thr

Asp

Phe

Lys 60

Leu

Tyr Ser

lie Gly Ala 65

Ser

Ala

lie

TAC

GAC

TTC GAC

ACC

CAA

TCG

CCC

GTC AAA

CCG TA.T CTC

GGC

GCG

CGC

519

70

A.sp

Phe Asp

Thr

Gin 75

Ser

Pro

Val Lys

Pro Tyr Leu 80

Gly

Ala

Arg 85

TTG

AGC

CTC AAC

CGC

GCC

TCC

GTC

GAC TTG

GGC GGC AGC

GAC

AGC

TTC

567

Leu

Ser

Leu Asn

Arg 90

Ala

Ser

Val

Asp Leu 95

Gly Gly Ser

Asp

Ser 100

Phe

AGC

CAA

ACC

GGC

CTC

GGC

C-ΤΑ TTG

GCG GGC GTA

---

TAT

GCC

615

Ser

Gin

Thr Ser 105

Thr

Gly

Leu

Gly

Val Leu 110

Ala Gly Val

Ala

GTT

ACC

CCG ΑΆΤ

C-TC

GAT

t-tg

GAT

GCC GGC

TAC CGC TAC

LI'

r-· -

ATC

663

Jčl

ΤΊ-,τ-

Pre Asn _ í. <-

Var

Asp

Leu

A.sp 125

z-, i a Gly

T'.’r .Arc Tvr 130

S D.

lie

GGC

AAA

GTC AAC

C-TC

AAA

AAC

GTC CGT

TCC GGC GAA

- —-

rr--

GCC

711

Gly

Lys 135

Vil Asn

Thr

Val

Lys 140

A.sn

Val Arg

Ser Gly Glu 145

ι- c LI

Ser

Ala

GGT Gly 150

GTG Val

CGC GTC Arg Val

AAA Lys

Phe 155

TGATATGCGC CTTATTCTGC AAACCi

3CCGJ

759

GCCTTCGGCC- C-TTTTGTTTT CTGCCACCGC AACTAfACAA GCCGGCGGTT TTGTACGATA 819

ATCCCGAATG CTGCGGCTTC TGCCGCCCTA T

850 (2) Informace pro SEQ ID NO: 6:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 174 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 6:

Met Lys Lys Ala Leu Ala Thr Leu He Ala Leu Ala Leu Pro Ala Ala -10_

Ala Leu Ala Glu Gly Ala Ser Gly Phe Tyr Val Gin Ala Asp Ala Ala ¹⁵10

His Ala Lys Ala Ser Ser Ser Leu Gly Ser Ala Lys Gly Phe Ser Pro ²⁰25

Arg He Ser Ala Gly Tyr Arg lie Asn Asp Leu Arg Phe Ala Val Asp 4045

Ty- Thr Arg Tyr Lys Asn Tyr Lys Ala Pro Ser Thr Asp Phe Lys Leu ⁵⁰ 55

Tyr Ser He Gly Ala Ser Ala lie Tyr Asp Phe Asp Thr Gin Ser Pro ⁶⁵ 7075

Val Lys Pro Tyr Leu Gly Ala Arg Leu Ser Leu Asn Arg Ala Ser Val ⁸⁰ 8590

Asp Leu Gly Gly Ser Asp Ser Phe Ser Gin Thr Ser Thr Gly Leu Gly 100105

Val Leu Ala Gly Val Ser Tyr Ala Val Thr Pro Asn Val Asp Leu Asp US 120

Ala Gly Tyr Arg Tyr Asn Tyr Ile Gly Lys Val Asn Thr Val Lys Asn ¹³⁰135

Val Arg Ser Gly Glu Leu Ser Ala Gly Val Arg Val Lys Phe 145 150' (2) Informace pro SEQ ID NO: 7:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 810 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: dvojitý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomová) (iii) Hypotetická: ne (iv) Anti-sense: ne (vi) Zdroj původu:

(A) Organismus: Neisseria meningitidis (B) Kmen: b2 (ix) Vlastosti:

(A) Jméno/klíč: CDS (B) Umístění: 241...765 (ix) Vlastosti:

(A) Jméno/klíč: sig_peptid (B) Umístění: 241...297 (ix) Vlastosti:

(A) Jméno/klíč: mat_peptid (B) Umístění: 268...765 (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 7:

CCCCGCCTTT GCGGTTTTTT CCAAACCGTT TGCAAGTTTC ACCCATCCGC CGCGTGATGC 60

CGCCGTTTAA GGGCAACGCG CGGGTTAACG GATTTGCCGT CGGCAAAGCA GCCGGATGCC 120

GCCGCGTATC TTGAGGCATT GAAAATATTA CGATGCAAAA AGAAAATTTC AGTATAATAC 180

GGCAGGATTC TTTAACGGAT TATTAACAAT TTTTCTCCCT GACCATAAAG GAACCAAAAT 240

ATG AAA AAA GCA CTT GCC GCA CTG ATT GCC CTC GCA CTC CCG GCC GCC288

Me_ Lys Lys Ala Leu Ala Ala Leu lie Ala Leu Ala Leu Pro AlaAla

-19 -15 -io-s

GCA CTG GCG GAA GGC GCA TCC GGC TTT TAC GTC CAA GCC GAT GCC GCA33 6

Ala Leu Ala Glu Gly Ala Ser Gly Phe Tyr Val Gin Ala Asp AlaAla ¹ 510

CAC GCC AAA GCC TCA AGC TCT TTA GGT TCT GCC AAA GGC TTC AGC CCG384

His Ala Lys Ala Ser Ser Ser Leu Gly Ser Ala Lys Gly Phe SerPro

2025

CGC ATC TCC GCA GGC TAC CGC ATC AAC GAC CTC CGC TTC GCC GTC GAT432

Arg lie Ser Ala Gly Tyr Arg Ile Ásn Asp Leu Arg Phe Ala ValAsp ³⁰ 35 40

TAC ACG CGC TAC AAA AAC TAT AAA GCC CCA TCC ACC GAT TTC AAA CTT480

Tyr Thr Arg Tyr Lys Asn Tyr Lys Ala Pro Ser Thr Asp Phe LysLeu ⁵⁰ 5560

TAC AGC ATC GGC GCG TCC GTC ATT TAC GAC TTC GAC ACC CAA TCG CCC528

IfT Ser Ile Gly Ala Ser Var He Tyr Asp Phe Asp Thr Gin Ser Pro

7075

GTC AAA CCG TAT TTC GGC GCC- CGC TTG AGC CTC AAC CGC GGT TCC GCC57 6

VAi Lys Pro Tyr Phe Gly A±a Arg Leu Ser Leu Asn Arg Ala Ser Ala

8590

CAC TTG GGC GGC AGC GAC AGC TTC AGC AAA ACC TCC GCC GGC CTC GGC62 4

His Leu Gly Gly Ser Asp Ser Phe Ser Lys Thr Ser Ala Gly Leu Glv ⁹⁵ 100105

GTA TTG GCG GGC GTA AGC TAT GCC GTT ACC CCG AAT GTC GAT TTG GAT672

Val Leu Ala Gly Val Ser Tyr Ala Val Thr Pro Asn Val Asp Leu Asp ¹¹⁰ 115 120125

GCC GGC TAC CGC TAC AAC TAC GTC GGC AAA GTC AAC ACT GTC AAA AAC72 0

Ala Gly Tyr Arg Tyr Asn Tyr Val Gly Lys Val Asn Thr Val Lys Asn ¹³⁰ 135140

GTC CGT TCC GGC GAA CTG TCC GCC GGC GTG CGC GTC AAA TTC TGATATACGC 772 Val Arg Ser Gly Glu Leu Ser Ala Gly Val Arg Val Lys Phe

145 150155

GTTATTCCGC AAACCGCCGA GCCTTCGGCG GTTTTTTC 810 (2) Informace pro SEQ ID NO: 8:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 174 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 8:

Met Lys Lys Ala Leu Ala Ala Leu lie Ala Leu Ala Leu Pro Ala Ala

-19 -15 -10-5

Ala Leu Ala Glu Gly Ala Ser Gly Phe Tyr Val Gin Ala Asp Ala Ala 1510

His Ala Lys Ala Ser Ser Ser Leu Gly Ser Ala Lys Gly Phe Ser Pro 15 2025

Arg lie Ser Ala Gly Tyr Arg lie 30 35

Tyr Thr Arg Tyr Lys Asn Tyr Lys 50

Tyr Ser lie Gly Ala Ser Val lie 65

Val Lys Pro Tyr Phe Gly Ala Arg Θ085

His Leu Gly Gly Ser Asp Ser Phe 95100

Val Leu Ala Gly Val Ser Tyr Ala 110115

Ala Gly Tyr Arg Tyr Asn Tyr Val 13 0

Val Arg Ser Gly Glu Leu Ser Ala 145

Asn Asp Leu Arg Phe Ala Val Asp 4045

Ala Pro Ser Thr Asp Phe Lys Leu 5560

Tyr Asp Phe Asp Thr Gin Ser Pro 7075

Leu Ser Leu Asn Arg Ala Ser Ala 90

Ser Lys Thr Ser Ala Gly Leu Gly 105

Val Thr Pro Asn Val Aso Leu Asp

120 ’125

Gly Lys Val Asn -Thr Val LysAsn

135140

Gly Val A.rc Val LvrPhe

150 ' '155 (2) Informace pro SEQ ID NO: 9:

(i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 16 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (vi) Zdroj původu: (A) Organismus: Neisseria meningitidis (B) Kmen: 608B (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 9:

Met Lys Lys Ala Leu Ala Thr Leu He Ala Leu Ala Leu Pro Ala Ala ¹ 5 10 15 (2) Informace pro SEQ ID NO: 10:

(i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 15 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (vi) Zdroj původu: (A) Organismus: Neisseria meningitidis (B) Kmen: 608B (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 10:

Leu Ala Leu Pro Ala Ala Ala Leu Ala Glu Gly Ala Ser Gly Phe ¹ 5 10 15 (2) Informace pro SEQ ID NO: 11:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 15 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (vi) Zdroj původu:

(A) Organismus: Neisseria meningitidis (B) Kmen: 608B (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 11:

Gly Ala Ser Gly Phe Tyr Val Gin Ala Asp Ala Ala His Ala Lys ¹ 5 10 15 ( 2) Informace pro SEQ ID NO: 12:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 15 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (vi) Zdroj původu:

(A) Organismus: Neisseria meningitidis (B) Kmen: 608B (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 12:

Ala Ala His Ala Lys Ala Ser Ser Ser Leu Gly Ser Ala Lys Gly ¹ 5 10 15 (2) Informace pro SEQ ID NO: 13:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 15 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (vi) Zdroj původu:

(A) Organismus: Neisseria meningitidis (B) Kmen: 608B (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 13:

Gly Ser Ala Lys Gly Phe Ser Pro Arg lie Ser Ala Gly Tyr Arg ¹⁵ 10 15 (2) Informace pro SEQ ID NO: 14:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 15 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (vi) Zdroj původu:

(A) Organismus: Neisseria meningitidis (B) Kmen: 608B (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 14:

Ser Ala Gly Tyr Arg He Asn Asp Leu Arg Phe Ala Val Asp Tyr ¹ 5 10 15 (2) Informace pro SEQ ID NO: 15:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 16 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (vi) Zdroj původu:

(A) Organismus: Neisseria meningitidis (B) Kmen: 608B (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 15:

Phe Ala Val Asp Tyr Thr Arg Tyr Lys Asn Tyr Lys Ala Pro Ser Thr ¹⁵ 10 15 (2) Informace pro SEQ ID NO: 16:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 15 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (vi) Zdroj původu:

(A) Organismus: Neisseria meningitidis (B) Kmen: 608B (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 16:

Tyr Lys Ala Pro Ser Thr Asp Phe Lys Leu Tyr Ser lie Gly Ala ^{1 5} 10 15 (2) Informace pro SEQ ID NO: 17:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 15 áminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (vi) Zdroj původu:

(A) Organismus: Neisseria meningitidis (B) Kmen: 608B (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 17:

Tyr Ser lie Gly Ala Ser Ala lie Tyr Asp Phe Asp Thr Gin Ser ¹⁵ 10 15 (2) Informace pro SEQ ID NO: 18:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 15 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (vi) Zdroj původu:

(A) Organismus: Neisseria meningitidis (B) Kmen: 608B (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 18:

Phe Asp Thr Gin Ser Pro Val Lys Pro Tyr Leu Gly Ala Arg Leu ¹⁵ 10 15 (2) Informace pro SEQ ID NO: 19:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 15 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (vi) Zdroj původu:

(A) Organismus: Neisseria meningitidis (B) Kmen: 608B (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 19:

Leu Gly Ala Arg Leu Ser Leu Asn Arg Ala Ser Val Asp Leu Gly ¹ 5 10 15 (2) Informace pro SEQ ID NO: 20:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 15 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (vi) Zdroj původu:

(A) Organismus: Neisseria meningitidis (B) Kmen: 608B (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 20:

Ser Val Asp Leu Gly Gly Ser Asp Ser Phe Ser Gin Thr Ser lie ¹⁵ 10 15 (2) Informace pro SEQ ID NO: 21:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 15 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (vi) Zdroj původu:

(A) Organismus: Neisseria meningitidis (B) Kmen: 608B (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 21:

Ser Gin Thr Ser lie Gly Leu Gly Val Leu Thr Gly Val Ser Tyr ¹⁵ 10 15 (2) Informace pro SEQ ID NO: 22:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 15 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (vi) Zdroj původu:

(A) Organismus: Neisseria meningitidis (B) Kmen: 608B (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 22:

Thr Gly Val Ser Tyr Ala Val thr Pro Asn Val Asp Leu Asp Ala ¹ 5 10 15 (2) Informace pro SEQ ID NO: 23:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 15 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (vi) Zdroj původu:

(A) Organismus: Neisseria meningitidis (B) Kmen: 608B (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 23:

Val Asp Leu Asp Ala Gly Tyr Arg Tyr Asn Tyr lie Gly Lys Val ¹ 5 10 15 (2) Informace pro SEQ ID NO: 24:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 15 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (vi) Zdroj původu:

(A) Organismus: Neisseria meningitidis (B) Kmen: 608B (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 24:

Tyr He Gly Lys Val Asn Thr Val Lys Asn Vai Arg Ser Gly Glu ¹ 5 10 15 (2) Informace pro SEQ ID NO: 25:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 14 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (vi) Zdroj původu:

(A) Organismus: Neisseria meningitidis (B) Kmen: 608B (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 25:

Val Arg Ser Gly Glu Leu Ser Val Gly Val Arg Val Lys Phe ¹ 5 10 (2) Informace pro SEQ ID NO: 26:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 25 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (vi) Zdroj původu: (A) Organismus: Neisseria meningitidis (B) Kmen: 608B (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 26:

Phe Ala Val Asp Tyr Thr Arg Tyr Lys Asn Tyr Lys Ala Pro Ser Thr 15 10 15

Asp Phe Lys Leu Tyr Ser lie Gly Ala

Claims (90)

1. Izolovaný antigen nebo jeho imunologicky dostupný na více než meningitidis.

fragment, který je

50 % známých kmenů Neisseria

2. Izolovaný antigen nebo jeho fragment podle nároku 1, který je imunologicky dostupný na asi 99 % známých kmenů Neisseria meningitidis.

3. Izolovaný antigen nebo jeho fragment podle nároku 1, jehož imunologická dostupnost je určena aglutinačním testem, ELISA, RIA, imunoblotting testem, dot-enzymovým testem, testem povrchové dostupnosti, nebo kombinací těchto testů.

4. Izolovaný antigen nebo jeho fragment podle nároku 1, který je protein.

5. Protein podle nároku 4, který má molekulovou hmotnost okolo 22 kilodaltonů.

6. Protein podle nároku 4, který má molekulovou hmotnost okolo 18 kilodaltonů.

7. Protein podle nároku 5, který má aminokyselinovou sekvenci vybranou ze sekvencí podle: obrázku 1 (SEQ ID NO: 2), obrázku 8 (SEQ ID NO: 4), obrázku 9 (SEQ ID NO: 6), a obrázku 10 (SEQ ID NO: 8).

8. Protein podle nároku 5, který má aminokyselinovou sekvenci podle obrázku 1 (SEQ ID NO: 2)

9. Protein podle nároku 5, který má v podstatě čistou formu.

10. Protein podle nároku 9, kde uvedená v podstatě čistá forma je získána kroky:

a) izolace kultury bakterie Neisseria meningitidis,

b) izolace zevní membránové části z kultury bakterie, a

c) izolace uvedeného antigenu ze zevní membránové části.

11. Protein podle nároku 10, kde krok (c) zahrnuje další krok ošetření zevní membránové části proteinasou K, po čemž následuje frakcionace proteinů.

12. DNA sekvence kódující alespoň část alespoň jednoho antigenu 22 kDa povrchového proteinu Neisseria meningitidis, kde uvedená sekvence je vybrána ze skupiny skládající se z:

a) DNA sekvence podle obrázku 1 (SEQ ID NO:1);

b) DNA sekvence podle obrázku 8 (SEQ ID NO:3);

c) DNA sekvence podle obrázku 9 (SEQ ID NO:5);

d) DNA sekvence podle obrázku 10 (SEQ ID NO: 7);

e) analogů nebo derivátů uvedených DNA sekvencí;

f) DNA sekvencí degenerovaných k jakékoliv uvedené DNA sekvenci; a

100

g) fragmentů jakýchkoliv z uvedených DNA sekvencí;

kde uvedené sekvence kódují produkt, který vykazuje imunologickou aktivitu 22 kDa povrchového proteinu Neisseria meningitidis .

13. DNA sekvence kódující alespoň část alespoň jednoho antigenů 22 kDa povrchového proteinu Neisseria meningitidis, kde uvedená sekvence je vybrána ze skupiny skládající se z:

a) DNA sekvence podle obrázku 1 (SEQ ID NO: 1);

b) analogů nebo derivátů uvedené DNA sekvence;

c) DNA sekvencí degenerovaných k jakékoliv uvedené DNA sekvenci; a

d) fragmentů jakýchkoliv z uvedených DNA sekvencí;

kde uvedené sekvence kódují produkt, který vykazuje imunologickou aktivitu 22 kDa povrchového proteinu Neisseria meningitidis .

14. DNA sekvence podle nároku 12, kde je uvedený analog vybrán z DNA Neisseria gonorrhoeae.

15. DNA sekvence podle nároku 12, kde je uvedený analog vybrán z DNA Neisseria lactamica.

16. DNA sekvence podle vzorce na obrázku 1 (SEQ ID NO: 1) od baze 143 do baze 667.

101

17. DNA sekvence podle vzorce na obrázku 1 (SEQ ID NO: 1) od baze 200 do baze 667.

18. DNA sekvence podle vzorce na obrázku 8 (SEQ ID NO: 3) od baze 116 do baze 643.

19. DNA sekvence podle vzorce na obrázku 8 (SEQ ID NO: 3) od baze 173 do baze 643.

20. DNA sekvence podle vzorce na obrázku 9 (SEQ ID NO: 5) od baze 208 do baze 732.

21. DNA sekvence podle vzorce na obrázku 9 (SEQ ID NO: 5) od baze 265 do baze 732.

22. DNA sekvence podle vzorce na obrázku 10 (SEQ ID NO: 7) od baze 241 do baze 765.

23. DNA sekvence podle vzorce na obrázku 10 (SEQ ID NO: 7) od baze 298 do baze 765.

24. Fragment DNA sekvence podle nároku 13, kde uvedený fragment je vybrán ze skupiny skládající se z: jednoho z polypeptidů ilustrovaných na obrázku 15 (SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO:

14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18,

SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ

ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 a SEQ ID NO: 26).

25. Fragment DNA sekvence obsahující aminokyselinu 31 až

102 aminokyselinu 55 podle obrázku 1 (SEQ ID NO: 1).

26. Fragment DNA sekvence obsahující aminokyselinu 51 až aminokyselinu 86 podle obrázku 1 (SEQ ID NO: 1)

27. Fragment DNA sekvence obsahující aminokyselinu 110 až aminokyselinu 140 podle obrázku 1 (SEQ ID NO: 1)

28. Rekombinantní DNA molekula obsahující DNA sekvenci vybranou ze skupiny skládající se z DNA sekvencí podle nároků 13, 16 nebo 17 a jednu nebo více expresních kontrolních sekvencí operativně navázaných na DNA sekvenci.

29. Rekombinantní DNA molekula obsahující DNA sekvenci vybranou ze skupiny skládající se z DNA sekvencí podle nároků 14, 15 nebo jakéhokoliv z nároků 18 až 27 a jednu nebo více expresních kontrolních sekvencí operativně navázaných na DNA sekvenci.

30. Rekombinantní DNA molekula podle nároku 28, kde uvedená expresní kontrolní sekvence je indukovatelný expresní vektor.

31. Rekombinantní DNA molekula podle nároku 29, kde uvedená expresní kontrolní sekvence je indukovatelný expresní vektor.

32. Rekombinantní DNA molekula podle nároků 30 nebo 31, kde uvedený vektor je indukován stimuly vybranými z: teploty, přítomnosti laktosy a přítomnosti IPTG.

33. Rekombinantní DNA molekula podle nároku 32, kde uvedený vektor je vybrán z: lambda PL, lambda PR, TAC, T7, T3,

103

LAC a TRP promotorů.

34. Plasmid vybraný ze skupiny skládající se z: pNP2202, PNP2203 a pNP2204.

35. Jednobuněčný hostitel molekulou podle nároku 28.

36. Jednobuněčný hostitel molekulou podle nároku 29.

transformovaný rekombinantní DNA transformovaný rekombinantní DNA

37. Jednobuněčný hostitel podle nároků 35 nebo 36, kde hostitel je vybrán se skupiny skládající se z: kmenů E. coli JM109, E. coli BL21(DE3), E. coli DH5aF'IQ, E. coli W3110, E. coli JM105, E. coli BL21, E. coli TOPP1, E. coli TOPP2 a E. coli TOPP3.

38. Jednobuněčný hostitel podle nároků 35 nebo 36, kde hostitel je vybrán se skupiny skládající se z kmenů E. coli JM109, E. coli BL21(DE3).

39. 22 kDa povrchový protein Neisseria meningitidis ve v podstatě čisté formě, který je získán kultivací jednobuněčného hostitele podle nároků 35 nebo 36 a izolací uvedeného proteinu.

40. Polypeptid kódovaný DNA sekvencí podle jakéhokoliv z nároků 13, 16 a 17.

41. Polypeptid kódovaný DNA sekvencí podle jakéhokoliv z nároků 14, 15 a 18 až 27.

104

42. Způsob produkce DNA sekvence vyznačující se tím, že obsahuje kroky kultivace jednobuněčného hostitele podle nároků 35 nebo 36 a izolace uvedené DNA sekvence.

43. Způsob produkce polypeptidu vyznačující se tím, že obsahuje kroky kultivace jednobuněčného hostitele podle nároků 35 nebo 36 a izolace uvedeného polypeptidu.

44. Polypeptid ve v podstatě čisté formě jak je získán metodou podle nároku 43.

45. Způsob pro izolování antigenu podle nároku 1 vyznačující se tím, že obsahuje:

a) izolaci kultury bakterie Neisseria meningitidis,

b) izolaci zevní membránové části z kultury bakterie, a

c) izolaci uvedeného antigenu ze zevní membránové části.

46. Způsob podle nároku 45vyznačující se tím, že krok (c) zahrnuje další krok ošetření zevní membránové části proteinasou K, po čemž následuje frakcionace proteinů.

47. Farmaceutická kompozice obsahující jeden nebo více antigenů nebo jejich fragmentů podle jakéhokoliv z nároků 1 až 5, 8, 13, 16 a 17.

48. Farmaceutická kompozice obsahující jeden nebo více antigenů nebo jejich fragmentů podle nároku 40.

105

49. Farmaceutická kompozice obsahující jeden nebo více antigenů nebo jejich fragmentů podle nároku 41.

50. Farmaceutická kompozice obsahující jeden nebo více antigenů nebo jejich fragmentů podle jakéhokoliv z nároků 6, 7, 9, 12, 14, 15 a 18 až 27.

51. Farmaceutická kompozice podle nároku 49, která je vakcina.

52. Farmaceutická kompozice podle nároku 50, která je vakcina.

53. Farmaceutická kompozice podle nároku 49, která dále obsahuje jeden nebo více farmaceuticky akceptovatelných excipiens.

54. Farmaceutická kompozice podle nároku 50, která dále obsahuje jeden nebo více farmaceuticky akceptovatelných excipiens.

55. Způsob pro zabránění infekce u pacienta způsobené Neisseria meningitidis vyznačující se tím, že zahrnuje podání farmaceuticky účinného množství vakciny podle nároků 51 nebo 52.

56. Použití farmaceuticky účinného množství 22 kDa povrchového proteinu Neisseria meningitidis nebo jeho fragmentu, analogu nebo derivátu pro prevenci infekce Neisseria meningitidis u lidí.

106

57. Použití 22 kDa povrchového proteinu Neisseria meningitidis nebo jeho fragmentu, analogu nebo derivátu pro prevenci infekce Neisseria gonorrhoeae u lidí.

58. Použití 22 kDa povrchového proteinu Neisseria meningitidis nebo jeho fragmentu, analogu nebo derivátu pro výrobu vakciny pro prevenci infekce Neisseria meningitidis u lidí.

59. Použití 22 kDa povrchového proteinu Neisseria meningitidis nebo jeho fragmentu, analogu nebo derivátu pro výrobu vakciny pro prevenci infekce Neisseria gonorrhoeae u lidí.

60. Protilátka nebo její fragment, která se specificky váže na protein s molekulovou hmotností asi 22 kilodaltonů přítomný na více než 50% známých kmenů Neisseria meningitidis.

61. Protilátka nebo její fragment podle nároku 60, která se specificky váže na asi 99 % známých kmenů Neisseria meningitidis.

62. Protilátka nebo její fragment podle nároku 60, která je monoklonální protilátka nebo její fragment.

63. Monoklonální protilátka nebo její fragment podle nároku 62, která je myšího původu.

64. Monoklonální protilátka nebo její fragment podle nároku 63, která je IgG izotypu.

65. Monoklonální protilátka nebo její fragment podle nároku

107

62, která je Me-1, Me-2, Me-3, Me-5, Me-6 nebo Me-7.

66. Monoklonální protilátka podle nároku 62, která je monoklonální protilátka Me-1 nebo Me-7.

67. Způsob pro izolaci protilátky podle nároku 60 vyznačující se tím, že zahrnuje:

a) zavedení přípravku Neisseria meningitidis do savce; a

b) izolaci séra od savce obsahujícího uvedenou protilátku.

68. Způsob pro izolaci monoklonální protilátky podle nároku 62 vyznačující se tím, že zahrnuje:

a) zavedení přípravku Neisseria meningitidis do protilátky produkujících buněk savce;

b) fúsování protilátky produkujících buněk s myelomovými buňkami za vzniku hybridomních buněk; a

c) izolování uvedené monoklonální protilátky z hybridomních buněk.

69. Farmaceutická kompozice vyznačující se tím, že obsahuje jednu nebo více protilátek nebo jejich fragmentů podle jakéhokoliv z nároků 60 až 66.

70. Farmaceutická kompozice podle nároku 69, kterou je vakcina.

108

71. Farmaceutická kompozice podle nároku 69, vyznačující se tím, že dále obsahuje farmaceuticky akceptovatelný excipiens.

72. Farmaceutická kompozice podle nároku 69, vyznačující se tím, že protilátkou je Me-1 nebo Me-7.

73. Způsob pro léčbu pacientů infikovaných nebo s podezřením na infekci Neisseria meningitidis vyznačující se tím, že zahrnuje podání farmaceuticky účinného množství vakciny podle nároku 70.

74. Způsob pro detekci antigenu Neisseria meningitidis v biologickém vzorku obsahujícím nebo podezřelém z toho, že obsahuje antigen Neisseria meningitidis vyznačuj ící se t í m, že zahrnuje:

a) izolování biologického vzorku od pacienta;

b) inkubaci protilátky nebo fragmentu podle nároku 60 s biologickým vzorkem za tvorby směsi; a

c) detekování specificky navázané protilátky nebo navázaného fragmentu ve směsi, což ukazuje na přítomnost antigenu Neisseria meningitidis.

75. Způsob podle nároku 72vyznačující se tím, že protilátkou je Me-1 nebo Me-7.

76. Způsob pro detekci protilátky specifické pro antigen

109

Neisseria meningitidis v biologickém vzorku obsahujícím nebo podezřelém z toho, že obsahuje uvedenou protilátku vyznačující se tím, že zahrnuje:

a) izolování biologického vzorku od pacienta;

b) inkubaci antigenu nebo fragmentu podle nároku 1 s biologickým vzorkem za tvorby směsi; a

c) detekování specificky navázaného antigenu nebo navázaného fragmentu ve směsi, což ukazuje na přítomnost protilátky specifické pro antigen Neisseria meningitidis.

77. Způsob podle nároku 76 vyznačující se tím, že antigen je 22 kDa povrchový protein Neisseria meningitidis.

78. Způsob pro detekci patogení bakterie Neisseria v biologickém vzorku obsahujícím nebo podezřelém z toho, že obsahuje takové bakterie vyznačující se tím, že zahrnuje:

a) izolování biologického vzorku od pacienta;

b) inkubaci DNA proby mající DNA sekvenci podle nároku 13 s biologickým vzorkem za tvorby směsi; a

c) detekování specificky navázané DNA proby ve směsi, což ukazuje na přítomnost bakterie Neisseria.

79. Způsob pro detekci patogení bakterie Neisseria v biologickém vzorku obsahujícím nebo podezřelém z toho, že obsahuje takové

110 bakterie vyznačující se tím, že zahrnuje:

a) izolování biologického vzorku od pacienta;

b) inkubaci DNA proby mající DNA sekvenci podle nároku 12 biologickým vzorkem za tvorby směsi; a

c) detekování specificky navázané DNA proby ve směsi, což ukazuje na přítomnost bakterie Neisseria.

80. Způsob podle nároku 78 vyznačující se tím, že DNA proba má sekvenci o 525 párech baží podle obrázku 1 (SEQ ID NO: 1).

81. Způsob podle nároku 78 vyznačující se tím, že DNA proba má část sekvence o 525 párech baží podle obrázku 1 (SEQ ID NO: 1).

82. Způsob podle nároku 79vyznačující se tím, že DNA proba má celou nebo část sekvence o 528 párech baží podle obrázku 8 (SEQ ID NO: 3).

83. Způsob podle nároku 79vyznačující se tím, že DNA proba má celou nebo část sekvence o 525 párech baží podle obrázku 9 (SEQ ID NO: 5).

84. Způsob podle nároku 79 vyznačující se tím, že DNA proba má celou nebo část sekvence o 525 párech baží podle obrázku 10 (SEQ ID NO: 7).

85. Způsob podle nároku 78 vyznačující se tím,

Ill že DNA proba je oligomer mající sekvenci komplementární k alespoň asi 6 sousedícím nukleotidům 22 kDa povrchového proteinu Neisseria meningitidis podle obrázku 1 (SEQ ID NO: 1).

86. Způsob podle nároku 79vyznačující se tím, že DNA proba je oligomer mající sekvenci komplementární k alespoň asi 6 sousedícím nukleotidům sekvencí 22 kDa povrchového proteinu Neisseria meningitidis vybraných z: obrázku 8 (SEQ ID NO: 3), obrázku 9 (SEQ ID NO: 5) a obrázku 10 (SEQ ID NO: 7).

87. Způsob podle nároku 85 nebo 86 vyznačuj ící se t í m, že dále zahrnuje:

a) poskytnutí sady oligomerů, které jsou primery pro metodu polymerasové řetězové reakce a které obklopují cílový region; a

b) amplifikaci cílového regionu pomocí metody polymerasové řetězové reakce.

88. Způsob pro detekci Neisseria meningitidis u pacienta vyznačující se tím, že zahrnuje:

a) značení protilátky nebo fragmentu podle nároku 60 detekovatelnou značkou;

b) podání značené protilátky nebo značeného fragmentu pacientovi; a

c) detekování specificky značené protilátky nebo značeného fragmentu u pacienta, což ukazuje na přítomnost Neisseria

112 meningitidis.

89. Použití farmaceuticky účinného množství protilátky specifické pro 22 kDa povrchový protein Neisseria meningitidis pro prevenci infekce Neisseria meningitidis u lidí.

90. Použití 22 kDa povrchového proteinu Neisseria meningitidis nebo jeho fragmentu, analogu nebo derivátu pro výrobu kitu pro detekci nebo diagnosu infekce Neisseria meningitidis u lidí.