CZ292482B6

CZ292482B6 - Způsob čištění trombinu podobných proteáz z hadího jedu

Info

Publication number: CZ292482B6
Application number: CZ19982697A
Authority: CZ
Inventors: Margarete Schwarz; Wolfgang Zahn
Original assignee: Abbott Gmbh & Co. Kg
Priority date: 1996-02-26
Filing date: 1997-02-18
Publication date: 2003-09-17
Also published as: MY130458A; JP3817269B2; JP2000505304A; NO983893D0; ES2233997T3; KR19990087247A; IL125395A; EP0883684A1; RU2186849C2; CN1188517C; PT883684E; DE19607210A1; AR005995A1; EP0883684B1; BG102663A; ZA971597B; CO4771158A1; SK113298A3; HUP9900505A2; AU711650B2

Abstract

Zp sob spo v v tom, e roztok obsahuj c prote zu se ist afinitn chromatografi , nebo na m ni i aniont , z roztoku elu tu z afinitn chromatografie, nebo m ni e aniont se eluuje prote za, roztok elu tu z p°edchoz ho stupn se ist v z sadit m roztoku p°i pH 7,5 a 9,0 na matrici ze sklen n²ch perel, p°i em tyto sklen n perly maj pr m r p r 25 a 35 nm a velikost stic 30 a 60 .mi.m, tak e sklen n perly adsorbuj trombinu podobn prote zy z had ho jedu, v roztoku elu tu z matrice ze sklen n²ch perel se eluuje prote za, roztok elu tu z p°edchoz ho stupn se v kysel m roztoku ist na gelu, nebo na matrici sklen n²ch perel, p°i em tyto sklen n perly maj pr m r p r 25 a 35 nm a velikost stic 30 a 60 .mi.m, na e se eluuje a regeneruje ist prote za.\

Description

Oblast techniky

Předložený vynález se týká způsobu čištění trombinu podobných proteáz z hadího jedu, vybraných ze skupiny zahrnující ankrod a silně zásaditou proteázu.

Dosavadní stav techniky

Příkladem takovýchto proteáz jsou batroxobin, krotalaze a zejména ankrod. Posledně uvedený je antikoagulant, který se izoluje z jedu hada Agkistrodon rhodostoma, viz. Merck-Index 1089, č. 664. Kjeho výrobě z hadího jedu bylo popsáno již více metod, viz. GB 1 094 301, GB 1 177 506, GB 1 293 793, US 3 743 722, US 3 879 369, DE-OS 2 428 955, DE-OS 2 734 427. Tyto způsoby spočítají v podstatě na chromatografických krocích a připravují ankrod v různých výtěžcích a čistotě.

Výroba velmi čistého ankrodu z hadího jedu se dosud nepodařilo, byla vždy izolována směs enzymů s ankrodem jako hlavní komponentou, který byl po výrobě více či méně znečištěn cizími proteiny.

Podstata vynálezu

Byla nalezena cesta vyrábět proteázy z hadích jedů ve velmi čisté podobě.

Předmětem vynálezu je způsob čištění trombinu proteáz z hadích jedů, který spočívá v tom, že

a) roztok obsahující proteázu se čistí afinitní chromatografií nebo na měniči aniontů,

b) z roztoku eluátu z afinitní chromatografie, nebo měniče aniontů se eluuje proteáza,

c) roztok eluátu ze stupně b) se čistí v zásaditém roztoku při pH 7,5 až 9,0 na matrici ze skleněných perel, přičemž tyto skleněné perly mají průměr pórů 25 až 35 nm a zrnitost 30 až 60 μιη, takže skleněné perly adsorbují trombinu podobné proteázy z hadího jedu,

d) v roztoku eluátu z matrice ze skleněných perel se eluuje proteáza,

e) roztok eluátu ze stupně d) se v kyselém roztoku čistí na gelu, nebo na matrici skleněných perel, přičemž tyto skleněné perly mají průměr pórů 25 až 35 nm a zrnitost 30 až 60 pm,

f) eluuje se a regeneruje se čistá proteáza.

Produktem způsobu podle vynálezu jsou trombinu podobné proteázy z hadího jedu v čistotě mezi 95 až 100%.

K čištění afinitní chromatografií jsou vhodné zejména agmatínsepharóza, argininsepharóza nebo heparinsepharóza.

Jako měniče aniontů jsou pro čištění vhodné zejména DEAE-celulóza a DEAE-sepharóza.

Jako pufr se pro iontovou výměnu při chromatografíi uvádí zejména tris-fosforečnan a fosforečnan sodný.

Chromatografie iontovou výměnou se provádí při hodnotě pH 5 až 9, přednostně 6 až 8,5.

Při čištění se oddělí 70 až 80 % cizích proteinů a jiných složek ze surového enzymu.

Jestliže se čištění provádí iontovou výměnou, pak přichází do úvahy: CM-SEPHASE, pH 5 až 9 a AMBERLITE CG50, pH 5 až 9.

Chromatografie na skle znamená, že se ankrod a použité enzymy podobné trombinu a rovněž silně zásadité proteázy váží při hodnotě pH 7,5 až 9,0, přednostně 8,0 až 8,5 na skleněnou matrici. Cca 60 % ze sloupce, především kyselých cizích proteinů nespojených s pufrem, přednostně tris-fosforečnanem, případně fosforečnanem sodným se vypere. Ankrod se v čistotě přes 90 %, frakcionovaný sklem, eluuje, tím že se zvýší iontová síla pufru pomocí přídavku kuchyňské soli na 0,3 až 1,0 M.

Při dalším čištění se enzym upravuje až na 90 %.

Pro gelovou chromatografii přichází zejména do úvahy jako čisticí krok: SEPHACRYL S-100HR, SUPERDEX, SEPHADEX, UTRAGEL A SUPEROSE.

Jestliže se pro tento čisticí krok volí chromatografie na skle, tak se v kyselé pH oblasti 4 až 6 adsorbují zásadité cizí proteiny z akrodového roztoku na povrch skla, zatímco lze ankrod v čistotě přes 95 % eluovat přímo ze sloupce v Pufru. Požadovaná iontová síla pufru se reguluje přídavkem soli, jako je kuchyňská sůl.

Nový způsob je vhodný zvláště pro přípravu čistého ankrodu, který se po tomto způsobu čištění získává v čistotě zřetelně přes 95 %.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

a. Předčištění g sušeného jedu malajsijské zmije byly rozpuštěny v 50 ml pufru fosforečnanu tris-(hydroxymethylj-aminomethanu (TRIS fosforečnanu) s pH 8.5. nerozpuštěné buněčné části jedu byly odstraněny centrifugou, jasný, žlutý roztok se nanese na chromatografický sloupec, který má průměr 1,6 cm a byl naplněn až do výšky 30 cm DEAE-SEPHAROSE-FF, firma Pharmacia. Enzymy jedu, podobné trombinu, a rovněž proteiny s kyselým charakterem se vázaly na matrici. Chromatografie byla provedena s průtočnou rychlostí 150 až 200 ml/h. Praním sloupce při teplotě okolí 300 ml pufru (100 mM TRIS fosforečnanu, pH 8,5) byla hodnota A₂₈o mm eluátu snížena pod 0,5 a dalším praním ve 400 ml 35 mM TRIS fosforečnanového pufru, PH 6,0, až byla hodnota A_2go mm eluátu pod 0,4, se eluovalo 70 až 80 % cizích proteinů, vztaženo na optickou hustotu výchozího roztoku při 280 nm. Hlavní frakce s ankrodem byla eluována s 85% výtěžkem ve 150 až 200 ml 150 mM pufru TRIS fosforečnanu, pH 6,0.

b. Hlavní čištění

Eluát, který obsahuje ankrod, byl koncentrován pomocí ultrafiltrace na membráně s nominálním dělícím rozhraním 10000 na 20 ml a pufrován 100 mM pufru TRIS fosforečnanu, pH 8,0. Tento roztok byl nanesen na sloupec, který měl průměr 1,6 cm a byl naplněn až do výšky 15 cm BIORAN-CPG sklem (firma Schott, porézní průměr 25 až 35 nm, zrnitost 30 až 60 pm). Praní sloupce při teplotě okolí 300 ml 100 mM TRIS fosforečnanu, pH 8,0 a rychlostí protékání 250 ml za hodinu bylo ze sloupce eluováno cca 60 % cizích proteinů, vztaženo na optickou hustotu navážky.

-2CZ 292482 B6

K eluci byl použit 0,5 M roztok chloridu sodného, který byl pufrován 100 mM TRIS fosforečnanu na hodnotu pH 8,0. Eluát byl automaticky zachycen a cca 10 ml frakcích. Enzym podobný trombinu byl eluován v zóně s připojenou upravovači oblastí. K udržení hlavní komponenty, odpovídající ankrodu, která obsahuje nejvíce 5 % vedlejších komponent podobných trombinu, byly při přechodu hlavní zóny k upravovači oblasti vyšetřeny jednotlivé frakce z hlediska jejich specifické fibrogenozní aktivity, jakož také z hlediska jejich složení pomocí inverzní fáze HPLC. Hlavní zónou byly čištěny jen frakce (cca 80 ml), které mají specifickou aktivitu více než 1700 ot/OD₂80nm ^Ά mají v HPLC méně než 10 % vedlejších produktů. Hlavní komponenta byla získána s čistoto 96 % a výtěžkem 72 % z bioranového sloupce.

c. Jemné čištění

Eluát s hlavní komponentou ankrod byl koncentrován pomocí ultrafíltrace na membráně YM 10 (firma Amicon) na 2 ml a obdržený koncentrát byl nanesen na sloupec, který měl průměr 1,6 cm a byl naplněn až do výšky 58 cm SEPHARYLem S-100 HR. Sloupec byl předtím ekvilibrován pufrem 100 mM chloridu sodného a 100 mM fosforečnanu sodného, který má hodnotu pH 6,0. Touto gelovou chromatografií byly od ankrodu odděleny zbytkové proteázy a rovněž TRIS. Výtěžek činil při tomto kroku 90 %.

Příklad 2

a. Předčištění

2,1 g jedu malajsijské zmije bylo rozpuštěno v 50 ml 35 mM pufru TRIS fosforečnanu s pH 8,5, nerozpuštěné buněčné části jedu byly odstraněny centrifugou, jasný, žlutý roztok se nanese na chromatografický sloupec, který má průměr 1,6 cm a byl naplněn až do výšky 30 cm DEAESEPAHROSE-FF, firma Pharmacia. Praním sloupce při teplotě okolí 600 ml uvedeného pufru, až byla hodnota A₂₈₀ eluátu menší než 0,2, bylo eluováno 70 % cizích proteinů, vztaženo na optickou hustotu výchozího roztoku při 280 nm. Hlavní frakce byla eluována s 90 až 100% výtěžkem 200 až 250 ml 150 mM 150 mM pufru TRIS fosforečnanu, pH 6,0.

b. Hlavní čištění

Eluát byl jako v příkladu 1 koncentrován na 20 ml a pufrován 50 mM pufru fosforečnanu sodného, pH 8,5. Tento roztok byl nanesen na sloupec BIORAN-CPG-Glas, který měl průměr 1,6 cm a výšku 15 cm, porézní průměr 25 až 35 nm a zrnitost 30 až 60 pm. Praním sloupce při teplotě okolí 300 ml 50 mM pufru fosforečnanu sodného, pH 8,5 a rychlostí protéká 250 ml za hodinu bylo ze sloupce eluováno cca 60 % cizích proteinů, vztaženo na optickou hustotu navážky při 280 nm.

K eluaci enzymů podobných trombinu byl použit 1 M roztok chloridu sodného, který byl pufrován 50 mM fosforečnanu sodného na hodnotu pH 8,0. 150 ml pufru bylo eluováno cca 80% vloženého množství enzymu.

c. Jemné čištění

Eluát byl koncentrován, jak je shora uvedeno, na 20 ml a pufrován 50 mM pufru fosforečnanu sodného, který má hodnotu pH 5,0. Tento roztok byl vnesen na sloupec, který měl průměr 1,6 mm a byl naplněn až do výšky 15 cm BIORAN-CPG-Glas, který měl porézní průměr 90 až 110 nm a zrnitost 30 až 60 pm. Při pH 5,0 byly na BIORAN-Glas vázány jen zásadité proteiny a rovněž vedlejší komponenty, zatímco hlavní komponenta ankrod byla eluována pufrem na čistotu 100 % a s výtěžkem cca 80 až 90 %, vztaženo na vložené množství.

-3CZ 292482 B6

Příklad 3

a. b. Předčištění a hlavní čištění

2,1 g sušeného jedu malajsijské zmije bylo analogicky s příkladem 2 předem rozděleno do frakcí na DEAE-SEPHAROSE, eluát byl analogicky s příkladem 1 koncentrován na 20 ml a pufrován pufrem 40 mM TRIS fosforečnanu. Tento roztok byl nanesen na sloupec chromatografu, který má průměr 1,6 cm a je naplněn až do výšky 20 cm CM-SEPHAROSE-FF, firma Pharmacia, a působilo se na něj shora uvedeným pufrem. Praním sloupce při teplotě okolí 300 ml pufru a rychlostí proudění 250 ml/h bylo ze

K eluaci enzymů podobných trombinu byl použit 1 M roztok chloridu sodného, který byl pufrován 50 mM fosforečnanu sodného na hodnotu pH 8,0. 150 ml pufru bylo eluováno cca 80% vloženého množství enzymu podobného trombinu.

c. Jemné čištění

Jemné čištění ankrodu bylo provedeno analogicky s příkladem 2 na BIORAN-CPG-Glas, porézní průměr cca 100 nm a zrnitost 30 až 60 pm, 50 mM fosforečného pufru, pH 5,0. Ankrod byl ze sloupce eluován s 95% čistotou a cca 85% výtěžkem, vztaženo na vložené množství.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob čištění trombinu podobných proteáz z hadích jedů, vybraných ze skupiny zahrnující ankrod a silně zásaditou proteázou, vyznačujícísetím, že

a) roztok obsahující proteázu se čistí afinitní chromatografií, nebo na měniči aniontů,

b) z roztoku eluátu z afinitní chromatografie, nebo měniče aniontů se eluuje proteáza,

c) roztok eluátu ze stupně b) se čistí v zásaditém roztoku při pH 7,5 až 9,0 na matrici ze skleněných perel, přičemž tyto skleněné perly mají průměr pórů 25 až 35 nm a zrnitost 30 až 60 pm, takže skleněné perly obsahují trombinu podobné proteázy z hadího jedu,

d) v roztoku eluátu z matrice ze skleněných perel se eluuje proteáza,

e) roztok eluátu ze stupně d) se v kyselém roztoku čistí na gelu, nebo na matrici skleněných perel, přičemž tyto skleněné perly mají průměr póru 25 až 35 nm a zrnitost 30 až 60 pm,

f) eluuje se a regeneruje se čistá proteáza.
2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že hadí jed je z hada rodu Agkistrodon.
3. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že hadí jed je z hada Agkistrodon rhodostoma.
4. Způsob podle jednoho z nároků 1 až 3, kde produktem je ankrod v čistotě přes 95 %.