ES2233997T3 - Procedimiento para la purificacion de proteasas similares a la trombina procedentes de venenos de serpientes. - Google Patents
Procedimiento para la purificacion de proteasas similares a la trombina procedentes de venenos de serpientes.Info
- Publication number
- ES2233997T3 ES2233997T3 ES97903312T ES97903312T ES2233997T3 ES 2233997 T3 ES2233997 T3 ES 2233997T3 ES 97903312 T ES97903312 T ES 97903312T ES 97903312 T ES97903312 T ES 97903312T ES 2233997 T3 ES2233997 T3 ES 2233997T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- chromatography
- purification
- glass
- buffer
- column
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 238000000746 purification Methods 0.000 title claims abstract description 28
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 title claims abstract description 12
- 239000004365 Protease Substances 0.000 title claims abstract description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 10
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 title claims abstract description 9
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 title abstract description 4
- 239000002574 poison Substances 0.000 title abstract description 4
- 241000270295 Serpentes Species 0.000 title abstract description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims description 20
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 18
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 12
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 12
- 239000003998 snake venom Substances 0.000 claims description 10
- 230000002345 thrombinlike Effects 0.000 claims description 9
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims description 6
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 claims description 4
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 3
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 claims description 3
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 claims description 3
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 claims description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 3
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 abstract description 6
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 abstract description 6
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 abstract 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 abstract 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 20
- 108010001779 Ancrod Proteins 0.000 description 16
- 229960004233 ancrod Drugs 0.000 description 16
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 11
- JLEXUIVKURIPFI-UHFFFAOYSA-N tris phosphate Chemical compound OP(O)(O)=O.OCC(N)(CO)CO JLEXUIVKURIPFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 6
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 5
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 5
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 5
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 4
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 4
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920002271 DEAE-Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- 239000002435 venom Substances 0.000 description 2
- 231100000611 venom Toxicity 0.000 description 2
- 210000001048 venom Anatomy 0.000 description 2
- 101800000263 Acidic protein Proteins 0.000 description 1
- QYPPJABKJHAVHS-UHFFFAOYSA-N Agmatine Natural products NCCCCNC(N)=N QYPPJABKJHAVHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 108091005658 Basic proteases Proteins 0.000 description 1
- 241000271064 Calloselasma rhodostoma Species 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N DEAE-cellulose Chemical compound OC1C(O)C(O)C(CO)O[C@H]1O[C@@H]1C(CO)OC(O)C(O)C1O GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 240000004760 Pimpinella anisum Species 0.000 description 1
- 101710093543 Probable non-specific lipid-transfer protein Proteins 0.000 description 1
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 1
- QYPPJABKJHAVHS-UHFFFAOYSA-P agmatinium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCCC[NH3+] QYPPJABKJHAVHS-UHFFFAOYSA-P 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 229920001429 chelating resin Polymers 0.000 description 1
- 108010086755 crotalase Proteins 0.000 description 1
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000012475 sodium chloride buffer Substances 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6402—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from non-mammals
- C12N9/6418—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from non-mammals from snakes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/814—Enzyme separation or purification
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/814—Enzyme separation or purification
- Y10S435/815—Enzyme separation or purification by sorption
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Hematology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
SE DESCRIBE UN METODO DE PURIFICACION DE PROTEASAS SIMILARES A LA TROMBINA DE VENENOS DE SERPIENTE QUE CONSISTE EN QUE LAS PROTEASAS SE LIBERAN DE IMPUREZAS EN TRES PASOS CROMATOGRAFICOS.
Description
Procedimiento para la purificación de proteasas
similares a la trombina procedentes de venenos de serpientes.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para la purificación de proteasas similares a la
trombina procedentes de venenos de serpiente.
Ejemplos de tales proteasas son batroxobina,
crotalasa y especialmente ancrod. Esta última es un anticoagulante,
que se aísla a partir del veneno de la serpiente Agkistrodon
rhodostoma (Índice Merck, 1989, nº 664). Para su producción a
partir de veneno de serpientes, se han descrito ya una variedad de
métodos (patente de GB 1.094.301, patente de GB 1.177.506, patente
de GB 1.293.793, patente de los EE.UU. 3.743.722, patente de los
EE.UU. 3.879.369, publicación para información de solicitud de
patente alemana 2.428.955, publicación para información de solicitud
de patente alemana 2.734.427). Estos procedimientos se basan
esencialmente en etapas cromatográficas y proporcionan el ancrod con
diferentes rendimientos y pureza.
Hasta el momento no se ha conseguido la
producción de ancrod sumamente puro a partir de veneno de serpiente.
Siempre se ha aislado una mezcla de enzimas con ancrod como
componente principal, que estaba contaminado con más o menos
proteínas extrañas según la producción.
Ahora se ha encontrado una vía para producir
proteasas similares a la trombina a partir de venenos de serpiente
en forma sumamente pura.
Es objeto de la invención un procedimiento para
la purificación de proteasas similares a la trombina procedentes de
venenos de serpientes, que se basa en que
- a.
- se somete un producto bruto de proteasa a una purificación previa mediante cromatografía de afinidad o cromatografía con un intercambiador de iones básico,
- b.
- se somete la fracción con las enzimas similares a la trombina así obtenida a una cromatografía con un intercambiador de cationes débil o se separa mediante adsorción sobre vidrio en el intervalo básico y
- c.
- se somete el componente principal de la etapa b a una cromatografía en gel o se purifica mediante cromatografía en vidrio en el intervalo ácido,
en el que sin embargo al menos una
de las etapas b y c comprende una separación mediante adsorción o
cromatografía en
vidrio.
Para la etapa b, se aconseja llevar a cabo la
purificación mediante adsorción en vidrio y para la etapa c, con
ayuda de cromatografía en gel.
En una forma de realización especialmente
preferida de la invención, tanto en la etapa b como en la etapa c se
purifica mediante adsorción o cromatografía en vidrio.
Para la purificación previa mediante
cromatografía de afinidad, son adecuadas especialmente agmatina,
arginina o heparina-sefarosa.
Como intercambiadores de iones básicos son
adecuados para la purificación previa especialmente
DEAE-celulosa y DEAE-sefarosa.
Para la cromatografía de intercambio iónico,
deben mencionarse como tampón especialmente tampón
Tris-fosfato y fosfato de sodio.
La cromatografía de intercambio iónico se lleva a
cabo a un valor de pH de 5-9, preferiblemente de
6-8,5.
En la purificación previa, se separa
aproximadamente el 70-80% de proteínas extrañas y
otros componentes de la enzima bruta.
Si se lleva a cabo la segunda etapa (b) de la
purificación con un intercambiador de cationes, entonces se
consideran los siguientes intercambiadores débilmente ácidos:
CM-SEPHAROSE, valor de pH 5-9 y
AMBERLITE CG50, pH
5-9.
5-9.
Cromatografía en vidrio significa que se unen el
ancrod y las enzimas similares a la trombina emparentadas, así como
proteasas fuertemente básicas para valores de pH de
7,5-9,0, preferiblemente 8,0-8,5 a
la matriz de vidrio. Aproximadamente el 60% de proteínas extrañas,
sobre todo ácidas, salen de la columna no unidas mediante lavado con
el tampón de equilibrio (preferiblemente tampón
Tris-fosfato o fosfato de sodio). El ancrod se eluye
del vidrio de manera fraccionada en una pureza superior al 90%,
mientras se aumenta la fuerza iónica del tampón a
0,3-1,0 M mediante la adición de sal común.
En la segunda etapa de purificación (b) se
concentra la enzima hasta aproximadamente el 90%.
Para la cromatografía en gel, como etapa de
purificación c se consideran especialmente: SEPHACRYL
S-100HR, SUPERDEX, SEPHADEX,
ULTRO-GEL y SUPEROSE.
Si para esta etapa de purificación c se elige la
cromatografía en vidrio, entonces se adsorben proteínas extrañas
básicas de la solución de ancrod en el intervalo de pH ácido de
4-6 en la superficie de vidrio, mientras que el
ancrod puede eluirse de la columna con una pureza muy superior al
95% directamente en el tampón de equilibrio. La fuerza iónica
deseada del tampón puede regularse mediante la adición de una sal,
tal como sal común.
El nuevo procedimiento es adecuado muy
especialmente para la obtención en estado puro de ancrod, que se
produce tras este procedimiento de purificación en una pureza
considerablemente superior al 95%.
Se disolvieron 3 g de veneno seco de serpiente
mocasín de Malasia en 50 ml de tampón
Tris-(hidroximetil)-aminometano
(TRIS)-fosfato, pH 8,5, se eliminaron mediante
centrifugación los componentes celulares insolubles del veneno y la
solución clara, amarilla se aplicó sobre una columna de
cromatografía que presentaba un diámetro de 1,6 cm y que se llenó
hasta una altura de 30 cm con
DEAE-SEPHAROSE-FF (empresa
Pharmacia). Las enzimas similares a la trombina del veneno, así como
las proteínas con carácter ácido se unieron a la matriz. Se llevó a
cabo la cromatografía con una velocidad de flujo de
150-200 ml/h. Mediante lavado de la columna a
temperatura ambiente con aproximadamente 300 ml de tampón de
equilibrio (tampón TRIS-fosfato 10 mM, pH 8,5) hasta
que el valor A_{280mm} del eluato descendió por debajo de 0,5 y
lavado adicional con 400 ml de tampón TRIS-fosfato
35 mM, pH 6,0 hasta que el valor A_{280mm} del eluato era <
0,4, se eluyó aproximadamente el 70-80% de las
proteínas extrañas (referido a la densidad óptica de la solución de
partida a 280 nm). La fracción principal con ancrod se eluyó con un
rendimiento del 85% en 150-200 ml de tampón
TRIS-fosfato 150 mM, pH 6,0.
El eluato que contenía el ancrod se concentró
hasta 20 ml mediante ultrafiltración en una membrana con un límite
de separación nominal de 10.000 Dalton y se tamponó con un tampón
TRIS-fosfato 100 mM, pH 8,0. Esta solución se aplicó
sobre una columna que tenía un diámetro de 1,6 cm y que se llenó
hasta una altura de 15 cm con vidrio BIORAN-CPG
(empresa Schott, diámetro de poro: 25-35 nm, tamaño
de grano: 30-60 \mum). Mediante lavado de la
columna a temperatura ambiente con 300 ml del tampón
TRIS-fosfato 100 mM, pH 8,0 y con una velocidad de
flujo de 250 ml por hora, se eluyó de la columna aproximadamente el
60% de las proteínas extrañas (referido a la densidad óptica de la
capa a 280 nm).
Para la elución, se utilizó una solución de
cloruro de sodio 0,5 M que se tamponó con
TRIS-fosfato 100 mM hasta un valor de pH de 8,0. El
eluato se recogió automáticamente en fracciones de aproximadamente
10 ml. Las enzimas similares a la trombina se eluyeron en un pico
con zona de colas adyacente. Para obtener el componente principal
(correspondiente a ancrod) en una forma que contenga como máximo el
5% de componentes secundarios similares a la trombina, se
investigaron las fracciones individuales para determinar tanto su
actividad fibrinogenasa específica como también su composición
mediante HPLC de fase invertida durante la transición del pico
principal a la zona de colas. Se unieron al pico principal sólo las
fracciones que poseían una actividad específica superior a 1700
U/DO_{280nm} y que presentaron menos del 10% de componentes
secundarios en la HPLC (aproximadamente 80 ml). Se obtuvo el
componente principal con una pureza del 96% y un rendimiento del 72%
de la columna de BIORAN.
Se concentró hasta 2 ml el eluato con el
componente principal ancrod mediante ultrafiltración en una membrana
YM 10 (empresa Amicon) y el concentrado obtenido se aplicó sobre una
columna que tenía un diámetro de 1,6 cm y que se llenó hasta una
altura de 85 cm con SEPHARYL S-100 HR. La columna se
equilibró anteriormente con un tampón de cloruro de sodio 100 mM y
fosfato de sodio 100 mM, que presentaba un valor de pH de 6,9. Con
esta cromatografía en gel se separaron las proteasas restantes, así
como TRIS de ancrod. El rendimiento para esta etapa fue de
aproximadamente el 90%.
Se disolvieron 2,1 g de veneno seco de serpiente
mocasín de Malasia en 50 ml de tampón TRIS-fosfato
35 mM, pH 8,5, se eliminaron mediante centrifugación los componentes
celulares insolubles del veneno y la solución clara, amarilla se
aplicó sobre una columna de cromatografía que presentaba un diámetro
de 1,6 cm, que se llenó hasta una altura de 30 cm con
DEAE-SEPHAROSE-FF (empresa
Pharmacia) y se equilibró con el tampón anteriormente mencionado.
Mediante lavado de la columna a temperatura ambiente con 600 ml de
tampón de equilibrio hasta que el valor A_{280} del eluato era
< 0,2, se eluyó aproximadamente el 70% de las proteínas extrañas
(referido a la densidad óptica de la solución de partida a 280 nm).
La fracción principal se eluyó con un rendimiento del
90-100% con 200-250 ml de tampón
TRIS-fosfato 150 mM, pH 6,0.
El eluato se concentró como en el ejemplo 1 hasta
20 ml y se tamponó con un tampón fosfato de sodio 50 mM, pH 8,5.
Esta solución se aplicó sobre la columna de vidrio
BIORAN-CPG (diámetro: 1,6 cm, altura: 15 cm,
diámetro de poro: 25-35 nm, tamaño de grano:
30-60 \mum). Mediante lavado de la columna a
temperatura ambiente con 300 ml del tampón fosfato de sodio 50 mM,
pH 8,5 y con una velocidad de flujo de 250 ml por hora, se eluyó de
la columna aproximadamente el 60% de las proteínas extrañas
(referido a la densidad óptica de la capa a 280 nm).
Para la elución de las enzimas similares a la
trombina se utilizó una solución de cloruro de sodio 1 M que se
había tamponado con fosfato de sodio 50 mM hasta un valor de pH de
8,0. Se eluyó aproximadamente el 80% de las unidades de enzima
aplicadas con 150 ml de tampón.
El eluato se concentró como anteriormente hasta
20 ml y se tamponó con un tampón fosfato de sodio 50 mM que
presentaba un valor de pH de 5,0. Esta solución se aplicó sobre una
columna que también tenía un diámetro de 1,6 cm y que se llenó hasta
una altura de 15 cm con vidrio BIORAN-CPG, que
poseía sin embargo un diámetro de poro de 90-110 nm
y un tamaño de grano de 30-60 \mum. A pH 5,0, se
unieron sólo las proteínas básicas, así como los componentes
secundarios al vidrio BIORAN, mientras que se eluyó de la columna el
componente principal ancrod con el tampón de equilibrio en una
pureza de casi el 100% y con aproximadamente un rendimiento del
80-90% (referido a las unidades aplicadas).
Se fraccionaron previamente 2,1 g de veneno seco
de serpiente mocasín de Malasia de manera análoga al ejemplo 2 en
DEAE-SEPHAROSE, se concentró el eluato de manera
análoga al ejemplo 1 hasta 20 ml y se tamponó con un tampón
TRIS-fosfato 40 mM, pH 6,2. Esta solución se aplicó
sobre una columna de cromatografía, que presentaba un diámetro de
1,6 cm, que se llenó hasta una altura de 20 cm con
CM-SEPHAROSE-FF (empresa Pharmacia)
y que se equilibró con el tampón anteriormente mencionado. Mediante
lavado de la columna a temperatura ambiente con 300 ml del tampón de
equilibrio y con una velocidad de flujo de 250 ml/h, se eluyó de la
columna aproximadamente el 60% de las proteínas extrañas (referido a
la densidad óptica de la capa a 280 nm).
Para la elución de las enzimas similares a la
trombina se utilizó, de manera análoga al ejemplo 2, una solución de
cloruro de sodio 1 M que se había tamponado con fosfato de sodio 50
mM hasta un valor de pH de 8,0. Se eluyó aproximadamente el 80% de
las unidades de las enzimas similares a la trombina aplicadas con
150 ml de tampón.
La purificación fina de ancrod se llevó a cabo de
manera análoga al ejemplo 2 en vidrio BIORAN-CPG
(diámetro de poro de aproximadamente 100 nm; tamaño de grano:
30-60 \mum) con un tampón fosfato 50 mM, pH 5,0.
Se eluyó el ancrod de la columna en una pureza superior al 95% y con
un rendimiento de aproximadamente el 85% (referido a las unidades
aplicadas).
Claims (3)
1. Procedimiento para la purificación de
proteasas similares a la trombina procedentes de venenos de
serpientes, caracterizado porque
- a.
- se somete un producto bruto de proteasa a una purificación previa mediante cromatografía de afinidad o cromatografía con un intercambiador de iones básico,
- b.
- se somete la fracción con las enzimas similares a la trombina así obtenida a una cromatografía con un intercambiador de cationes débil o se separa mediante adsorción en vidrio en el intervalo básico y
- c.
- se somete el componente principal de la etapa b a una cromatografía en gel o se purifica mediante cromatografía en vidrio en el intervalo ácido,
en el que sin embargo al menos una
de las etapas b y c comprende una separación mediante cromatografía
en
vidrio.
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque la purificación tiene lugar mediante
adsorción en vidrio en la etapa b y la etapa c se lleva a cabo
mediante cromatografía en gel.
3. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizada porque la purificación tiene lugar en las
etapas b y c mediante cromatografía en vidrio.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19607210 | 1996-02-26 | ||
| DE19607210A DE19607210A1 (de) | 1996-02-26 | 1996-02-26 | Verfahren zur Reinigung von thrombinähnlichen Proteasen aus Schlangengiften |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2233997T3 true ES2233997T3 (es) | 2005-06-16 |
Family
ID=7786490
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES97903312T Expired - Lifetime ES2233997T3 (es) | 1996-02-26 | 1997-02-18 | Procedimiento para la purificacion de proteasas similares a la trombina procedentes de venenos de serpientes. |
Country Status (31)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6200791B1 (es) |
| EP (1) | EP0883684B1 (es) |
| JP (1) | JP3817269B2 (es) |
| KR (1) | KR100493835B1 (es) |
| CN (1) | CN1188517C (es) |
| AR (1) | AR005995A1 (es) |
| AT (1) | ATE283350T1 (es) |
| AU (1) | AU711650B2 (es) |
| BG (1) | BG64875B1 (es) |
| BR (1) | BR9707738A (es) |
| CO (1) | CO4771158A1 (es) |
| CZ (1) | CZ292482B6 (es) |
| DE (2) | DE19607210A1 (es) |
| ES (1) | ES2233997T3 (es) |
| HR (1) | HRP970108B1 (es) |
| HU (1) | HU225489B1 (es) |
| ID (1) | ID16046A (es) |
| IL (1) | IL125395A (es) |
| MX (1) | MX9806304A (es) |
| MY (1) | MY130458A (es) |
| NO (1) | NO319561B1 (es) |
| NZ (1) | NZ331120A (es) |
| PL (1) | PL186211B1 (es) |
| PT (1) | PT883684E (es) |
| RU (1) | RU2186849C2 (es) |
| SK (1) | SK284874B6 (es) |
| TR (1) | TR199801668T2 (es) |
| TW (1) | TW505696B (es) |
| UA (1) | UA46831C2 (es) |
| WO (1) | WO1997032015A1 (es) |
| ZA (1) | ZA971597B (es) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1102173C (zh) * | 1999-03-26 | 2003-02-26 | 福建医科大学 | 蕲蛇酶及其生产工艺 |
| US20030219431A1 (en) * | 2002-05-24 | 2003-11-27 | Empire Pharmaceuticals, Inc. | Treatment of neuronal and neurological damage associated with spinal cord injury |
| CN100506983C (zh) * | 2006-05-25 | 2009-07-01 | 齐鲁制药有限公司 | 一种从矛头蝮蛇毒中提取单一成份巴曲酶的方法 |
| WO2008008872A2 (en) * | 2006-07-14 | 2008-01-17 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Adsorptive membranes for trapping viruses |
| CN103160486A (zh) * | 2013-04-02 | 2013-06-19 | 黑龙江迪龙制药有限公司 | 一种猪凝血酶的制备方法 |
| CN109929020A (zh) * | 2017-12-15 | 2019-06-25 | 浙江京新药业股份有限公司 | 一种眼镜蛇毒的纯化方法及其产品 |
| CN108559740B (zh) * | 2018-05-12 | 2021-05-18 | 吉林天衡康泰生物技术有限公司 | 重组安克洛酶及工业规模制备方法和治疗急性脑梗的应用 |
| CN109652398B (zh) * | 2018-12-29 | 2021-07-20 | 上海太阳生物技术有限公司 | 凝血因子ⅹ激活剂rvv-ⅹ的制备方法及制得的rvv-ⅹ |
| CN110016471B (zh) * | 2019-04-10 | 2020-10-02 | 北京博康宁生物医药科技有限公司 | 重组安克洛酶及工业规模制备和纯化方法及其组合物 |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB1094301A (en) * | 1964-02-21 | 1967-12-06 | Nat Res Dev | Improvements relating to anticoagulants |
| GB1177506A (en) | 1964-02-21 | 1970-01-14 | Nat Res Dev | Improvements relating to Anticoagulants. |
| GB1293793A (en) | 1969-04-28 | 1972-10-25 | Chrysler United Kingdom Ltd Fo | Improvements in or relating to valves |
| US3743722A (en) | 1971-07-14 | 1973-07-03 | Abbott Lab | Anti-coagulant isolation |
| US3879369A (en) * | 1972-05-12 | 1975-04-22 | Abbott Lab | Anti-coagulant isolation from malayan pit viper using affinity chromatography |
| SE420321B (sv) | 1973-09-03 | 1981-09-28 | Fargal Pharmasint Lab Biochim | Kromatografisk extraktion och isolering av enzymatisk komponent fran ormgift |
| NL7605805A (nl) * | 1976-05-28 | 1977-11-30 | Stichting Rega V Z W | Werkwijze voor het zuiveren van interferon. |
| CH626917A5 (es) | 1976-08-17 | 1981-12-15 | Pentapharm Ag | |
| JPS5569595A (en) * | 1978-11-20 | 1980-05-26 | Suguru Abe | Novel substance having fibrinolytic activity, remedy for thrombotic embolic disease comprising it, and its preparation |
| EP0328256A1 (en) * | 1988-01-21 | 1989-08-16 | Owens-Corning Fiberglas Corporation | Glass fibers coated with agarose for use as column packing or chromatographic media for bioseparations |
| US5712117A (en) * | 1995-02-08 | 1998-01-27 | Zymogenetics, Inc. | Cytoplasmic antiproteinase-2 and coding sequences |
-
1996
- 1996-02-26 DE DE19607210A patent/DE19607210A1/de not_active Withdrawn
-
1997
- 1997-02-18 ES ES97903312T patent/ES2233997T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-02-18 CN CNB971925852A patent/CN1188517C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1997-02-18 EP EP97903312A patent/EP0883684B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-02-18 RU RU98117870/13A patent/RU2186849C2/ru active
- 1997-02-18 TR TR1998/01668T patent/TR199801668T2/xx unknown
- 1997-02-18 PT PT97903312T patent/PT883684E/pt unknown
- 1997-02-18 CZ CZ19982697A patent/CZ292482B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1997-02-18 UA UA98094992A patent/UA46831C2/uk unknown
- 1997-02-18 AU AU17913/97A patent/AU711650B2/en not_active Ceased
- 1997-02-18 MX MX9806304A patent/MX9806304A/es unknown
- 1997-02-18 US US09/125,374 patent/US6200791B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-02-18 AT AT97903312T patent/ATE283350T1/de active
- 1997-02-18 IL IL12539597A patent/IL125395A/en not_active IP Right Cessation
- 1997-02-18 SK SK1132-98A patent/SK284874B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1997-02-18 BR BR9707738A patent/BR9707738A/pt not_active Application Discontinuation
- 1997-02-18 PL PL97328568A patent/PL186211B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1997-02-18 DE DE59712093T patent/DE59712093D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-02-18 JP JP53055397A patent/JP3817269B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1997-02-18 NZ NZ331120A patent/NZ331120A/xx not_active IP Right Cessation
- 1997-02-18 WO PCT/EP1997/000755 patent/WO1997032015A1/de not_active Ceased
- 1997-02-18 KR KR10-1998-0706648A patent/KR100493835B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 1997-02-18 HU HU9900505A patent/HU225489B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1997-02-21 TW TW086102111A patent/TW505696B/zh not_active IP Right Cessation
- 1997-02-24 MY MYPI97000700A patent/MY130458A/en unknown
- 1997-02-24 ID IDP970561A patent/ID16046A/id unknown
- 1997-02-25 CO CO97010013A patent/CO4771158A1/es unknown
- 1997-02-25 ZA ZA971597A patent/ZA971597B/xx unknown
- 1997-02-25 AR ARP970100755A patent/AR005995A1/es active IP Right Grant
- 1997-02-26 HR HR970108A patent/HRP970108B1/xx not_active IP Right Cessation
-
1998
- 1998-07-31 BG BG102663A patent/BG64875B1/bg unknown
- 1998-08-25 NO NO19983893A patent/NO319561B1/no not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2233997T3 (es) | Procedimiento para la purificacion de proteasas similares a la trombina procedentes de venenos de serpientes. | |
| US4748156A (en) | Thrombin-binding substance and process for preparing the same | |
| EP0317376A1 (fr) | Préparation de concentré de facteur IX humain de haute pureté et d'autres protéines plasmatiques | |
| CA1078732A (en) | Process for the preparation of thrombinlike enzymes from snake venoms | |
| Seegers et al. | Purification of prothrombin and thrombin by chromatography on cellulose | |
| US5319072A (en) | Human antithrombin-III preparation | |
| SK22695A3 (en) | Isolation and purification method of proteins dependent from vitamin k | |
| US5071961A (en) | Method of enrichment of coagulation factors ii, vii, ix and x | |
| JPS60199819A (ja) | トロンビン結合性物質およびその製法 | |
| US6582603B1 (en) | Method for purifying thrombin substrate and/or inhibitors or method for eliminating the same | |
| Pastore et al. | [23] Pteroyllysine-agarose in the purification of dihydrofolate reductase | |
| CA2247016C (en) | Purification of thrombin-like proteases from snake venoms | |
| JPS61162184A (ja) | 新規な線溶酵素およびその取得法 | |
| Velander et al. | TECHNOLOGICAL CHALLENGES FOR THE LARGE-SCALE PURIFICATION OF PROTEIN C | |
| Takaoka et al. | Purification to apparent homogeneity of inactive kallikrein from rat urine | |
| SU1495377A1 (ru) | Способ получени рибонуклеазы Н из ЕSснеRIснIасоLI | |
| JPH03505531A (ja) | 活性型プロテインｃの調製方法及びそれによって得られた活性型プロテインｃ溶液 | |
| RU2136749C1 (ru) | Способ получения эндонуклеазы рестрикции hinf i | |
| US4172763A (en) | Preparation of high purity xanthine oxidase from bovine milk | |
| RU2221578C1 (ru) | Способ получения очищенного активированного фактора x свертывания крови | |
| JPH05192167A (ja) | ホスホリパーゼａ２ をコードするｄｎａ並びにホスホリパーゼａ２ の製造法及びその精製法 | |
| UA53146C2 (en) | A process for separation of a high-purity a2 antiplasmine from the human blood plasma |