UA46831C2 - Спосіб очищення тромбіноподібних протеаз, одержаних із зміїних отрут, анкрод природного походження - Google Patents
Спосіб очищення тромбіноподібних протеаз, одержаних із зміїних отрут, анкрод природного походження Download PDFInfo
- Publication number
- UA46831C2 UA46831C2 UA98094992A UA98094992A UA46831C2 UA 46831 C2 UA46831 C2 UA 46831C2 UA 98094992 A UA98094992 A UA 98094992A UA 98094992 A UA98094992 A UA 98094992A UA 46831 C2 UA46831 C2 UA 46831C2
- Authority
- UA
- Ukraine
- Prior art keywords
- chromatography
- purification
- glass
- thrombin
- stage
- Prior art date
Links
- 230000002345 thrombinlike Effects 0.000 title claims abstract description 16
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 13
- 238000000746 purification Methods 0.000 title claims description 15
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 13
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 239000003998 snake venom Substances 0.000 claims abstract description 8
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims abstract description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims description 18
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 17
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 9
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 claims description 7
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims description 6
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 claims description 5
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 claims description 3
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 claims description 3
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 claims description 3
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 claims description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 3
- 238000012876 topography Methods 0.000 claims 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 abstract 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 15
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 11
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 11
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 11
- JLEXUIVKURIPFI-UHFFFAOYSA-N tris phosphate Chemical compound OP(O)(O)=O.OCC(N)(CO)CO JLEXUIVKURIPFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 10
- 108010001779 Ancrod Proteins 0.000 description 8
- 229960004233 ancrod Drugs 0.000 description 8
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 6
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 5
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 5
- 229960003339 sodium phosphate Drugs 0.000 description 5
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 5
- 235000011008 sodium phosphates Nutrition 0.000 description 5
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 5
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 4
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 4
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 239000002435 venom Substances 0.000 description 3
- 231100000611 venom Toxicity 0.000 description 3
- 210000001048 venom Anatomy 0.000 description 3
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 239000000179 crotalid venom Substances 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 2
- 239000002574 poison Substances 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- QYPPJABKJHAVHS-UHFFFAOYSA-N Agmatine Natural products NCCCCNC(N)=N QYPPJABKJHAVHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 108091005658 Basic proteases Proteins 0.000 description 1
- 108010027612 Batroxobin Proteins 0.000 description 1
- 241000271532 Crotalus Species 0.000 description 1
- 244000019459 Cynara cardunculus Species 0.000 description 1
- 235000019106 Cynara scolymus Nutrition 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- 241000270295 Serpentes Species 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- QYPPJABKJHAVHS-UHFFFAOYSA-P agmatinium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCCC[NH3+] QYPPJABKJHAVHS-UHFFFAOYSA-P 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000016520 artichoke thistle Nutrition 0.000 description 1
- 229960002210 batroxobin Drugs 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 108010086755 crotalase Proteins 0.000 description 1
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6402—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from non-mammals
- C12N9/6418—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from non-mammals from snakes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/814—Enzyme separation or purification
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/814—Enzyme separation or purification
- Y10S435/815—Enzyme separation or purification by sorption
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Hematology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Описаний спосіб очищення тромбіноподібних протеаз, одержаних із зміїних отрут, який полягає в тому, що протеази звільняють від забруднень на трьох стадіях хроматографії.
Description
Опис винаходу
Даний винахід стосується способу для очищення тромбінподібних протеаз, одержаних із зміїних отрут. 2 Прикладами таких протеаз є батроксобін, кроталаза і, зокрема, анкрод. Останній є антикоагулянтом, що ізолюється із отрути змії АадкКівігодоп гподовіота (Мегск-Іпдех 1989, Мо. 664). Уже відома велика кількість способів його одержання із отрути змій (патенти Великобританії 1.094.301, 1.177.506, 1.293.793, патенти США 3.743.722, 3.879.369, описи винаходів до викладених заявок ФРН 2.428.955, 2.734.427). Ці способи базуються, в основному, на хроматографії і дають анкрод з різним виходом і ступенем чистоти. 70 Анкрод високої чистоти із зміїної отрути досі одержати не вдавалось. Завжди ізолювали суміш ферментів з анкродом в якості основної складової, яка в залежності від способу була в більшій або меншій мірі забруднена сторонніми протеїнами.
Тому був знайдений шлях одержання тромбінподібних протеаз високої чистоти із зміїних отрут.
Предметом винаходу є спосіб очищення тромбінподібних протеаз, одержаних із зміїних отрут, який полягає в 19 тому, що: протеазний сировий продукт піддають попередньому очищенню за допомогою афінної хроматографії або хроматографії в основному іонообміннику; одержану таким чином фракцію з тромбінподібними ферментами піддають хроматографії в слабкому катіонному обміннику або відокремлюють шляхом адсорбції на склі в основному діапазоні; 20 основну складову із стадії 2 піддають гельпроникній хроматографії або очищують шляхом хроматографії на склі в кислому діапазоні, причому щонайменше одна із стадій 2 і З включає відокремлення шляхом адсорбції або хроматографії на склі.
Крім того, предметом винаходу є одержані із зміїних отрут тромбінподібні протеази, з чистотою від 95 до с 29 100 96, Го)
Рекомендується на стадії б очищення здійснювати шляхом адсорбції на склі, а на стадії в за допомогою гельпроникної хроматографії.
В особливо переважній формі втілення винаходу як на стадії б, так і на стадії Д очищення проводять за допомогою адсорбції або хроматографії. - 30 Для попереднього очищення шляхом афінної хроматографії особливо придатні агматинова, аргінінова або со гепаринова сефарози.
В якості основного іонообмінника для попереднього очищення придатні СЕАЕ-целюлози і ОЕАЕ-сефарози. со
Для іонообмінної хроматографії особливо придатні трис-фосфатні та натрій-фосфатні буферні розчини. (Се)
Іонообмінну хроматографію проводять при значенні рН від 5 до 9, переважно від 6 до 8,5.
Зо В ході попереднього очищення із сирового ферменту видаляють майже 70 - 8095 чужорідних білків та інших т складових.
Якщо другу стадію очищення проводять з використанням катіонного обмінника, то беруться до уваги такі слабкі кислі обмінники: СМ-ЗЕРНАКОЗЕ, значення рн 5 - 9, та АМВЕКИІТЕ СО50, рН 5 - 9. «
Вираз "хроматографія на склі" означає, що анкрод і споріднені тромбінподібні ферменти, а також сильно З7З 70 основні протеази зв'язують на скляній матриці при значеннях рН 7,5 - 9, переважно 8,0 - 8,5. Близько 6090 с передовсім кислих чужорідних білків не зв'язаними вимиваються із колонки врівноважувальним буферним "з розчином (переважно трис-фосфатним або натрій-фосфатним). Анкрод з чистотою понад 9095 пофракційно елююють зі скла шляхом підвищення іонної сили буферного розчину до 0,3 - 1,0М додаванням кухонної солі.
На другій стадії очищення фермент збагачується майже до 90905.
Для проведення гельпроникної хроматографії на стадії в очищення беруться до уваги: ЗЕРНАСКУІ 5-100НК, те ЗИРЕКОЕХ, ЗЕРНАОЕХ, ОГТРЕОСЕЇ і БОРЕКОЗ5Е. (Ге) Якщо для цієї стадії в очищення вибирають хроматографію на склі, то в кислому рН-діапазоні 4 - б основні чужорідні білки адсорбують із розчину анкроду на скляній поверхні, а сам анкрод чистотою 95956 може бути со елюйований із колонки безпосередньо у врівноважувальному буфері. Бажана іонна сила буфера може бути о 250 встановлена шляхом додавання солі, наприклад, кухонної солі. щк Новий спосіб особливо придатний для чистового одержання анкроду, який за цим способом має чистоту понад 9595.
Приклад 1. а. Попереднє очищення. 99 Зг висушеної отрути малайської гримучої змії розчиняли в 5БОмл трис-(гідроксиметил)-амінометан
ГФ) (трис)-фосфатному буферному розчині рН 8,5, нерозчинні клітинні залишки отрути віддентрифуговували і т прозорий, жовтий розчин подавали на хроматографічну колонку діаметром 1,бсм, до висоти ЗОсм наповнену
ОРЕАЕ-5БЕРНАКОБ5ЕБЕ-РЕЕ (фірма РНагтасіа). Тромбінподібні ферменти отрути, а також білки з кислим характером зв'язували на матриці. Хроматографію здійснювали зі швидкістю потоку 150-200 мл/год. Промиванням колонки 60 при кімнатній температурі приблизно 300 мілілітрами врівноважувального буфера (10ММ трис-фосфатний буфер, рН 8,5) до одержання елюату зі значенням Агоаонм 7 0,5 і подальшим промиванням 400 мілілітрами 35 мМ трис-фосфатного буфера рН 6,0 до одержання елюату зі значенням А овонм - 0,4 елюювали близько 70 - 8090 чужорідних білків (відносно оптичної густини вихідного розчину при 280нм). Основну фракцію з анкродом з в5 виходом 8595 елюювали в 150 - 200мл 150мМ трис-фосфатного буфера рН 6,0. б. Основне очищення.
Елюат, що містить анкрод, шляхом ультрафільтрації на мембрані з номінальною границею розділення 10000
Дальтон концентрували до 20мл і перебуферували 100мМ трис-фосфатним буфером рН 8,0. Цей розчин подавали на колонку діаметром 1,бсм, наповнену до висоти 15см склом ВІОКАМ-СРО (фірма Зспої:; діаметр пор 25 - ЗБнм, розмір часток 30 - бОмкм). Промиванням колонки при кімнатній температурі 300 мілілітрами 100ММ трис-фосфатного буфера рН 8,0 при швидкості потоку 250мл/год з колонки елюювали близько 6095 чужорідних білків (відносно оптичної густини закладки при 28Онм).
Для елюювання використовували 0,5МмМ розчин хлориду натрію, забуферений 100мММ трис-фосфатним буфером до значення рН 8,0. Елюат автоматично уловлювали фракціями близько 1Омл. Тромбінподібні 7/0 ферменти елюювали в пікові із розмитою (хвостовою) зоною, що прилягає до нього. Для одержання основної складової (відповідає анкроду) у формі, що містить щонайбільше 595 тромбінподібних побічних складових, при переході від основного піка до хвостової зони окремі фракції досліджувались за допомогою рідинної хроматографії зі зворотною фазою як щодо їх специфічної фібриногеназної активності, так і щодо складу. З основним піком поєднували лише фракції, що мали специфічну активність, більшу, ніж 1700 О/Об»овонм і вміст побічних складових, менший, ніж 1095 (близько 8Омл). З колонки ВІОКАМ одержували основну складову чистотою 9695 з виходом 72905. в. Тонке очищення.
Елюат з основною складовою - анкродом - шляхом ультрафільтрації на мембрані ММ 10 (фірма Атісоп) концентрували до 2мл і одержаний концентрат подавали на колонку діаметром 1,бсм, до висоти 85см заповнену 2о ЗЕРНАКМІ. 5-100 НК. Колонку попередньо врівноважували буферним розчином, що складався із 100мММ хлориду натрію та 100ММ фосфату натрію і мав рН 6,9. За допомогою цієї операції гельпроникної хроматографії від анкроду відокремлювали рештки протеаз, а також трис. На цій стадії вихід становив близько 90965.
Приклад 2. а. Попереднє очищення. с 2,1г висушеної отрути малайської гримучої змії розчиняли в бХОмл З5ММ трис-фосфатного буфера рН 8,5, нерозчинні клітинні складові отрути віддентрифуговували і прозорий, жовтий розчин подавали на і) хроматографічну колонку діаметром 1,бсм, до висоти ЗОсм наповнену ОЕАЕ-ЗЕРНАКОЗЕБЕ-РЕ (фірма РІагтасіа) і врівноважену вказаним буфером. Промиванням колонки при кімнатній температурі ббОмл врівноважувального буфера до досягнення значення А 280х:0,2 вимивали майже 70905 чужорідних білків (відносно оптичної густини - п зо Закладки при 28Онм). Основну фракцію з виходом 90 - 10096 елюювали 200 - 250 мілілітрами 150мМ трис-фосфатного буфера рН 6,0. о б. Основне очищення. со
Аналогічно прикладу 1, елюат концентрували до 20мл і забуферювали 50мМ натрій-фосфатним буфером рн 8,5. Цей розчин подавали на колонку ВІОКАМ-СРО (діаметр 1,бсм, висота 15см, діаметр пор 25 - З5см, розмір ісе)
Зв часток 30-6бмкм). Промиванням колонки при кімнатній температурі З00 мілілітрами 5О0мММ натрій-фосфатного «Е буфера рН 8,5 зі швидкістю 250мл/год з колонки елюювали близько 6095 чужорідних білків (відносно оптичної густини закладки при 28Онм).
Для елюювання тромбінподібних ферментів використовували 1М розчин хлориду натрію, забуферений 5Х0ОММ розчином фосфату натрію до значення рН 8,0 150 мілілітрами буфера елюювали близько 8095 внесених « ферментів. з с в. Тонке очищення. . Елюат описаним вище чином концентрували до 20мл і перебуферували 50мММ натрій-фосфатним буфером, и?» що мав значення рН 5,0. Цей розчин подавали на колонку, що також мала діаметр 1,бсм і до висоти 15см була заповнена склом ВІОКАМ-СРО, що мало, одначе, діаметри пор 90 - 11Онм і розміри часток 30 - бОмкм. При рН 5,0 на склі ВІОКАМ були зв'язані лише основні білки, а також побічні складові, тоді як основна складова - їз анкрод - з чистотою близько 10095 і виходом 80 - 9095 (відносно внесеної кількості) елюювалась із колонки врівноважувальним буфером. ме) Приклад 3.
Го! а, 6. Попереднє і основне очищення. 2,1г висушеної отрути малайської гримучої змії попередньо фракціонували аналогічно прикладу 2 на о ОЕАЕ-ЗЕРНАКО5БЕ, елюат концентрували аналогічно прикладу 71 до 20Омл і перебуферували 40мММ як трис-фосфатним буфером рн 6,2. Цей розчин подавали на хроматографічну колонку діаметром 1,6бсм, до висоти 20см наповнену СМ-БЕРНАКОЗЕ-ЕЕ (фірма РНагтасіа), і врівноважену вказаним вище буфером. Шляхом промивання колонки при кімнатній температурі З00 мілілітрами врівноважувального буфера при швидкості в потоку 250мл/год з колонки елюювали близько 6095 чужорідних білків (відносно оптичної густини закладки при 280нм).
Ф) Для елюювання тромбінподібних ферментів аналогічно прикладові 2 використовували 1 М розчин хлориду ка натрію, забуференого 5ХОММ розчином фосфату натрію до значення рН 8,0. 150 мілілітрами буфера елюювали близько 8095 тромбінподібних ферментів. 60 в. Тонке очищення.
Тонке очищення анкроду здійснювати аналогічно прикладові 2 на склі ВІОКАМ-СРО (діаметр пор близько 10Онм; розміри часток 30-бЄбмкм) фосфатним буфером рН 5,0. Анкрод елюювали із колонки з чистотою понад 9595 і виходом близько 8595 (відносно внесеної кількості). бо
Claims (4)
1. Спосіб очищення тромбіноподібних протеаз, одержаних із зміїних отрут, який полягає в тому, що а) протеазний сировинний продукт піддають попередньому очищенню за допомогою афінної хроматографії або хроматографії в основному іонообміннику, б) одержану таким чином фракцію з тромбіноподібними ферментами піддають хроматографії в слабкому катіонному обміннику або відокремлюють шляхом адсорбції на склі в основному діапазоні і в) основну складову із стадії "б" піддають гельпроникній хроматографії або очищують шляхом хроматографії на склі в кислому діапазоні, причому щонайменше одна із стадій "б" і "в" включає відокремлення шляхом хроматографії на склі.
2. Спосіб згідно з п. 1, який відрізняється тим, що очищення шляхом адсорбції в стадії "б" здійснюють на склі, а стадію "в" здійснюють шляхом гельпроникної хроматографії.
З. Спосіб згідно з п. 1, який відрізняється тим, що очищення шляхом хроматографії в стадіях "б" і "в" здійснюють на склі.
4. Очищений анкрод природного походження, одержаний способом за п. 1 з чистотою понад 95 95. Офіційний бюлетень "Промислоава власність". Книга 1 "Винаходи, корисні моделі, топографії інтегральних мікросхем", 2002, М 6, 15.06.2002. Державний департамент інтелектуальної власності Міністерства освіти і науки України. с щі 6) «- (зе) (ее) (Се) «
- . и? щ» (о) (ее) (95) - іме) 60 б5
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19607210A DE19607210A1 (de) | 1996-02-26 | 1996-02-26 | Verfahren zur Reinigung von thrombinähnlichen Proteasen aus Schlangengiften |
| PCT/EP1997/000755 WO1997032015A1 (de) | 1996-02-26 | 1997-02-18 | Verfahren zur reinigung von thrombinähnlichen proteasen aus schlangengiften |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| UA46831C2 true UA46831C2 (uk) | 2002-06-17 |
Family
ID=7786490
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| UA98094992A UA46831C2 (uk) | 1996-02-26 | 1997-02-18 | Спосіб очищення тромбіноподібних протеаз, одержаних із зміїних отрут, анкрод природного походження |
Country Status (31)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6200791B1 (uk) |
| EP (1) | EP0883684B1 (uk) |
| JP (1) | JP3817269B2 (uk) |
| KR (1) | KR100493835B1 (uk) |
| CN (1) | CN1188517C (uk) |
| AR (1) | AR005995A1 (uk) |
| AT (1) | ATE283350T1 (uk) |
| AU (1) | AU711650B2 (uk) |
| BG (1) | BG64875B1 (uk) |
| BR (1) | BR9707738A (uk) |
| CO (1) | CO4771158A1 (uk) |
| CZ (1) | CZ292482B6 (uk) |
| DE (2) | DE19607210A1 (uk) |
| ES (1) | ES2233997T3 (uk) |
| HR (1) | HRP970108B1 (uk) |
| HU (1) | HU225489B1 (uk) |
| ID (1) | ID16046A (uk) |
| IL (1) | IL125395A (uk) |
| MX (1) | MX9806304A (uk) |
| MY (1) | MY130458A (uk) |
| NO (1) | NO319561B1 (uk) |
| NZ (1) | NZ331120A (uk) |
| PL (1) | PL186211B1 (uk) |
| PT (1) | PT883684E (uk) |
| RU (1) | RU2186849C2 (uk) |
| SK (1) | SK284874B6 (uk) |
| TR (1) | TR199801668T2 (uk) |
| TW (1) | TW505696B (uk) |
| UA (1) | UA46831C2 (uk) |
| WO (1) | WO1997032015A1 (uk) |
| ZA (1) | ZA971597B (uk) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1102173C (zh) * | 1999-03-26 | 2003-02-26 | 福建医科大学 | 蕲蛇酶及其生产工艺 |
| US20030219431A1 (en) * | 2002-05-24 | 2003-11-27 | Empire Pharmaceuticals, Inc. | Treatment of neuronal and neurological damage associated with spinal cord injury |
| CN100506983C (zh) * | 2006-05-25 | 2009-07-01 | 齐鲁制药有限公司 | 一种从矛头蝮蛇毒中提取单一成份巴曲酶的方法 |
| CA2655873C (en) | 2006-07-14 | 2017-10-17 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Adsorptive membranes for trapping viruses |
| CN103160486A (zh) * | 2013-04-02 | 2013-06-19 | 黑龙江迪龙制药有限公司 | 一种猪凝血酶的制备方法 |
| CN109929020A (zh) * | 2017-12-15 | 2019-06-25 | 浙江京新药业股份有限公司 | 一种眼镜蛇毒的纯化方法及其产品 |
| CN108559740B (zh) * | 2018-05-12 | 2021-05-18 | 吉林天衡康泰生物技术有限公司 | 重组安克洛酶及工业规模制备方法和治疗急性脑梗的应用 |
| CN109652398B (zh) * | 2018-12-29 | 2021-07-20 | 上海太阳生物技术有限公司 | 凝血因子ⅹ激活剂rvv-ⅹ的制备方法及制得的rvv-ⅹ |
| CN110016471B (zh) * | 2019-04-10 | 2020-10-02 | 北京博康宁生物医药科技有限公司 | 重组安克洛酶及工业规模制备和纯化方法及其组合物 |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB1094301A (en) * | 1964-02-21 | 1967-12-06 | Nat Res Dev | Improvements relating to anticoagulants |
| GB1177506A (en) * | 1964-02-21 | 1970-01-14 | Nat Res Dev | Improvements relating to Anticoagulants. |
| GB1293793A (en) | 1969-04-28 | 1972-10-25 | Chrysler United Kingdom Ltd Fo | Improvements in or relating to valves |
| US3743722A (en) | 1971-07-14 | 1973-07-03 | Abbott Lab | Anti-coagulant isolation |
| US3879369A (en) * | 1972-05-12 | 1975-04-22 | Abbott Lab | Anti-coagulant isolation from malayan pit viper using affinity chromatography |
| SE420321B (sv) * | 1973-09-03 | 1981-09-28 | Fargal Pharmasint Lab Biochim | Kromatografisk extraktion och isolering av enzymatisk komponent fran ormgift |
| NL7605805A (nl) * | 1976-05-28 | 1977-11-30 | Stichting Rega V Z W | Werkwijze voor het zuiveren van interferon. |
| CH626917A5 (uk) * | 1976-08-17 | 1981-12-15 | Pentapharm Ag | |
| JPS5569595A (en) * | 1978-11-20 | 1980-05-26 | Suguru Abe | Novel substance having fibrinolytic activity, remedy for thrombotic embolic disease comprising it, and its preparation |
| EP0328256A1 (en) * | 1988-01-21 | 1989-08-16 | Owens-Corning Fiberglas Corporation | Glass fibers coated with agarose for use as column packing or chromatographic media for bioseparations |
| US5712117A (en) * | 1995-02-08 | 1998-01-27 | Zymogenetics, Inc. | Cytoplasmic antiproteinase-2 and coding sequences |
-
1996
- 1996-02-26 DE DE19607210A patent/DE19607210A1/de not_active Withdrawn
-
1997
- 1997-02-18 US US09/125,374 patent/US6200791B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-02-18 JP JP53055397A patent/JP3817269B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1997-02-18 RU RU98117870/13A patent/RU2186849C2/ru active
- 1997-02-18 AU AU17913/97A patent/AU711650B2/en not_active Ceased
- 1997-02-18 KR KR10-1998-0706648A patent/KR100493835B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 1997-02-18 AT AT97903312T patent/ATE283350T1/de active
- 1997-02-18 EP EP97903312A patent/EP0883684B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-02-18 UA UA98094992A patent/UA46831C2/uk unknown
- 1997-02-18 SK SK1132-98A patent/SK284874B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1997-02-18 WO PCT/EP1997/000755 patent/WO1997032015A1/de not_active Ceased
- 1997-02-18 IL IL12539597A patent/IL125395A/en not_active IP Right Cessation
- 1997-02-18 DE DE59712093T patent/DE59712093D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-02-18 TR TR1998/01668T patent/TR199801668T2/xx unknown
- 1997-02-18 ES ES97903312T patent/ES2233997T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-02-18 CZ CZ19982697A patent/CZ292482B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1997-02-18 NZ NZ331120A patent/NZ331120A/xx not_active IP Right Cessation
- 1997-02-18 CN CNB971925852A patent/CN1188517C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1997-02-18 PL PL97328568A patent/PL186211B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1997-02-18 MX MX9806304A patent/MX9806304A/es unknown
- 1997-02-18 HU HU9900505A patent/HU225489B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1997-02-18 PT PT97903312T patent/PT883684E/pt unknown
- 1997-02-18 BR BR9707738A patent/BR9707738A/pt not_active Application Discontinuation
- 1997-02-21 TW TW086102111A patent/TW505696B/zh not_active IP Right Cessation
- 1997-02-24 ID IDP970561A patent/ID16046A/id unknown
- 1997-02-24 MY MYPI97000700A patent/MY130458A/en unknown
- 1997-02-25 CO CO97010013A patent/CO4771158A1/es unknown
- 1997-02-25 AR ARP970100755A patent/AR005995A1/es active IP Right Grant
- 1997-02-25 ZA ZA971597A patent/ZA971597B/xx unknown
- 1997-02-26 HR HR970108A patent/HRP970108B1/xx not_active IP Right Cessation
-
1998
- 1998-07-31 BG BG102663A patent/BG64875B1/bg unknown
- 1998-08-25 NO NO19983893A patent/NO319561B1/no not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA2143510C (en) | Method for the isolation and purification of vitamin k-dependent proteins | |
| UA46831C2 (uk) | Спосіб очищення тромбіноподібних протеаз, одержаних із зміїних отрут, анкрод природного походження | |
| US4137127A (en) | Process for the preparation of thrombin-like enzymes from snake venoms | |
| AU682560B2 (en) | Purification of vitamin-K dependent proteins by membrane chromatography | |
| Uchida | A simplified method for the purification of ribonuclease T1 | |
| JPS6034916A (ja) | 第１ｘ因子および他のビタミンｋ依存性タンパク質の高純度精製 | |
| JPS59231097A (ja) | 均質ヒト免疫インターフェロンサブタイプ２１ｋおよびその製造法 | |
| Pastore et al. | [23] Pteroyllysine-agarose in the purification of dihydrofolate reductase | |
| CA2247016C (en) | Purification of thrombin-like proteases from snake venoms | |
| SU1175965A1 (ru) | Способ выделени урокиназы из биологических источников | |
| JPH084503B2 (ja) | ウロキナーゼの回収方法及びそれにより得られるウロキナーゼ含有画分 | |
| JPS597694B2 (ja) | 不活化トロンビンゲルによるアンチトロンビン３の精製法 | |
| JPS61224996A (ja) | マウスインタ−フエロンの精製法 | |
| SU697522A1 (ru) | Способ выделени неорганической пирофосфатазы из пекарских дрожжей | |
| JP2537074B2 (ja) | 酸性プロテア―ゼの精製法 | |
| PL133652B1 (en) | Method of obtaining peroxidaze from aqueous horse-radish extract | |
| Wang et al. | High performance liquid chromatography of integral glycoproteins of peripheral nerve myelin | |
| JPS6176419A (ja) | 精製された組織性プラスミノ−ゲンアクチベ−タの製造法 | |
| JPS61181395A (ja) | マウスインタ−フエロンの精製法 | |
| KR970021092A (ko) | 트롬보모둘린의 정제 방법 | |
| JPH10265499A (ja) | ヒト成長ホルモンの精製方法 |