CZ294827B6 - Způsob čištění rekombinantního aktivátoru plazminogenu alfa1 ze slin Desmondus rotundus (rDSPA alfa1) z kondicionovaného média - Google Patents
Způsob čištění rekombinantního aktivátoru plazminogenu alfa1 ze slin Desmondus rotundus (rDSPA alfa1) z kondicionovaného média Download PDFInfo
- Publication number
- CZ294827B6 CZ294827B6 CZ19982455A CZ245598A CZ294827B6 CZ 294827 B6 CZ294827 B6 CZ 294827B6 CZ 19982455 A CZ19982455 A CZ 19982455A CZ 245598 A CZ245598 A CZ 245598A CZ 294827 B6 CZ294827 B6 CZ 294827B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- rdspa
- resin
- buffer
- cation exchange
- proteins
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 51
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 title claims abstract description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 title abstract description 14
- 101710201364 Salivary plasminogen activator alpha 1 Proteins 0.000 title 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims abstract description 73
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims abstract description 73
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims abstract description 41
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 claims abstract description 33
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 claims abstract description 32
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 31
- 239000012539 chromatography resin Substances 0.000 claims abstract description 31
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims abstract description 28
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims abstract description 23
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims abstract description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 90
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 63
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 61
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 56
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 claims description 36
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 32
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 28
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 26
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 26
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 239000008187 granular material Substances 0.000 claims description 20
- 239000012535 impurity Substances 0.000 claims description 20
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 17
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 15
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 13
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 13
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 13
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 12
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 claims description 12
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 claims description 12
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 claims description 10
- 102000013566 Plasminogen Human genes 0.000 claims description 9
- 108010051456 Plasminogen Proteins 0.000 claims description 9
- 229920000193 polymethacrylate Polymers 0.000 claims description 9
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 8
- -1 polyethylene Polymers 0.000 claims description 8
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 7
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 6
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims description 6
- 125000004181 carboxyalkyl group Chemical group 0.000 claims description 6
- 238000007334 copolymerization reaction Methods 0.000 claims description 6
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 claims description 6
- 239000011734 sodium Substances 0.000 claims description 6
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 claims description 6
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 6
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 6
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 claims description 5
- 102000034238 globular proteins Human genes 0.000 claims description 5
- 108091005896 globular proteins Proteins 0.000 claims description 5
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 claims description 4
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 4
- CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-M Methacrylate Chemical compound CC(=C)C([O-])=O CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- 101000969099 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) Mating-type protein ALPHA1 Proteins 0.000 claims description 3
- 101001047925 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) Silenced mating-type protein ALPHA1 Proteins 0.000 claims description 3
- STVZJERGLQHEKB-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol dimethacrylate Chemical group CC(=C)C(=O)OCCOC(=O)C(C)=C STVZJERGLQHEKB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 125000000008 (C1-C10) alkyl group Chemical group 0.000 claims description 2
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 125000003710 aryl alkyl group Chemical group 0.000 claims description 2
- ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N n,n'-methylenebisacrylamide Chemical compound C=CC(=O)NCNC(=O)C=C ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 claims 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 claims 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 abstract description 7
- 229940127126 plasminogen activator Drugs 0.000 abstract description 7
- 108010001014 Plasminogen Activators Proteins 0.000 abstract description 6
- 102000001938 Plasminogen Activators Human genes 0.000 abstract description 6
- 230000003993 interaction Effects 0.000 abstract description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 abstract description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 30
- 239000000047 product Substances 0.000 description 22
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 13
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 12
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 11
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 10
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 10
- ALPWRKFXEOAUDR-GKEJWYBXSA-M sodium;[(2r)-2,3-di(octadecanoyloxy)propyl] hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)([O-])=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC ALPWRKFXEOAUDR-GKEJWYBXSA-M 0.000 description 10
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 9
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 9
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 8
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 8
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 7
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 7
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 7
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 7
- 229910000077 silane Inorganic materials 0.000 description 6
- BLRPTPMANUNPDV-UHFFFAOYSA-N Silane Chemical compound [SiH4] BLRPTPMANUNPDV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 5
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 5
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 5
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 5
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 5
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 5
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 5
- 229940012957 plasmin Drugs 0.000 description 5
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 5
- 230000002537 thrombolytic effect Effects 0.000 description 5
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 4
- 206010047249 Venous thrombosis Diseases 0.000 description 4
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 4
- 208000034158 bleeding Diseases 0.000 description 4
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 4
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 4
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 4
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 4
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 3
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 3
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 3
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 3
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 3
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 3
- 102000010752 Plasminogen Inactivators Human genes 0.000 description 3
- 108010077971 Plasminogen Inactivators Proteins 0.000 description 3
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 3
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 3
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 3
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 3
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 3
- 244000309466 calf Species 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 3
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 3
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 3
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 3
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 3
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 3
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 3
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 3
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 3
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 3
- 239000002797 plasminogen activator inhibitor Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 241001460678 Napo <wasp> Species 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 208000010378 Pulmonary Embolism Diseases 0.000 description 2
- 206010038563 Reocclusion Diseases 0.000 description 2
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 2
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 2
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 2
- 239000002585 base Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 2
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 2
- 125000002057 carboxymethyl group Chemical group [H]OC(=O)C([H])([H])[*] 0.000 description 2
- 229940023913 cation exchange resins Drugs 0.000 description 2
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 2
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 2
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 239000012458 free base Substances 0.000 description 2
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 2
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 2
- 230000023597 hemostasis Effects 0.000 description 2
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 2
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 2
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 2
- 239000013587 production medium Substances 0.000 description 2
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 2
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical group 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L succinate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC([O-])=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 229960000103 thrombolytic agent Drugs 0.000 description 2
- CHRJZRDFSQHIFI-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.C=CC1=CC=CC=C1C=C CHRJZRDFSQHIFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010003178 Arterial thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 241000288900 Desmodus rotundus Species 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 102000010911 Enzyme Precursors Human genes 0.000 description 1
- 108010062466 Enzyme Precursors Proteins 0.000 description 1
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 1
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 101000917858 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Proteins 0.000 description 1
- 101000917839 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Proteins 0.000 description 1
- 102100029185 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Human genes 0.000 description 1
- 101000966481 Mus musculus Dihydrofolate reductase Proteins 0.000 description 1
- BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N Phenolsulfonephthalein Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1(C=2C=CC(O)=CC=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 1
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010023197 Streptokinase Proteins 0.000 description 1
- 108090000435 Urokinase-type plasminogen activator Proteins 0.000 description 1
- 102000003990 Urokinase-type plasminogen activator Human genes 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 206010000891 acute myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000001476 alcoholic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 1
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- 229920006037 cross link polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 1
- 239000003527 fibrinolytic agent Substances 0.000 description 1
- 230000003480 fibrinolytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 239000012537 formulation buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 239000001307 helium Substances 0.000 description 1
- 229910052734 helium Inorganic materials 0.000 description 1
- SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N helium atom Chemical compound [He] SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004051 hexyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000004435 hydrogen atom Chemical class [H]* 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000009413 insulation Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000013627 low molecular weight specie Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- 125000004108 n-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000000740 n-pentyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 125000002347 octyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 229920000620 organic polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000006213 oxygenation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 229960003531 phenolsulfonphthalein Drugs 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000006916 protein interaction Effects 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 210000003079 salivary gland Anatomy 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 150000004756 silanes Chemical class 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 229960005202 streptokinase Drugs 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 125000001174 sulfone group Chemical group 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 229960005356 urokinase Drugs 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012608 weak cation exchange resin Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6456—Plasminogen activators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Hematology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Obesity (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Paper (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Electric Propulsion And Braking For Vehicles (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
- Control Of Motors That Do Not Use Commutators (AREA)
Abstract
Způsob izolace a čištění rekombinantního aktivátoru plazminogenu .alfa.1 ze slin Desmondus rotundus (rDSPA .alfa.1) z kondicionovaného média, zahrnující řadu kroků, aplikaci tohoto média na kationtovou iontoměničovou pryskyřici, promývání, selektivní eluování vázaného rDSPA .alfa.1, aplikování eluentu obsahujícího rDSPA .alfa.1 na hydrofobní interaktivní pryskyřici, případně promývání této hydrofobní interaktivní pryskyřice, selektivní eluování vázaného rDSPA .alfa.1, aplikování eluentu obsahujícího rDSPA .alfa.1 na afinitní chromatografickou pryskyřici, případné promývání této afinitní chromatografické pryskyřice, selektivní eluování vázaného rDSPA .alfa.1 z afinitní chromatografické pryskyřice za získání v podstatě čistého rDSPA .alfa.1 ve vodném roztoku. Tento postup je možno provozovat v průmyslovém měřítku, přičemž čistota získaného produktu je adekvátní klinickým standardům.ŕ
Description
Vynález se týká způsobu čištění rekombinantního aktivátoru plazminogenu al ze slin Desmondus rotundus (rDSPA al), z kondicionovaného média.
Dosavadní stav techniky
Trombózy vznikají vytvořením krevní sraženiny v krevních cévách. Je možno rozlišovat mezi žilními trombózami, které zahrnují plicní embolii a tepennými trombózami, které zahrnují akutní infarkt myokardu. Plicní embolie a srdeční infarkt jsou lidský život ohrožující příhody, které vyžadují urychlenou lékařskou pomoc.
Obecně rozšířený způsob terapie takovýchto tepenných a žilních trombóz je použití aktivátorů plazminogenu za účelem provedení enzymatické trombolýzy (viz publikace Collen a kol., Ann., Rev. Med., (1988), 39, 405-423). Tyto látky, zvané trombolytika, přeměňují plazminogen, neaktivní proenzym fíbrinolytického systému v krvi, na plazmin, což je aktivní proteolytický enzym. Plazmin poté rozpouští vláknitou látku fibrin, která je základní složkou krevní sraženiny; to vede k opětovnému otevření ucpaných cév a k obnovení toku krve v těchto cévách. Nicméně, jelikož je plazmin relativně nespecifická proteáza, může také proteolýzou proteinů v krvi zničit složky, nepostradatelné pro intaktní hemostázu (jako například fibrinogen) a tudíž se zvyšuje riziko krvácení.
První enzymatická trombolytika, streptokináza a urokináza, jsou sloučeniny, které, jakmile jsou vstříknuté do oběhu, soustavně přeměňují plazminogen na plazmin a indukují systematickou proteolýzu. Trombolytické způsoby léčení, které používají tyto sloučeniny, jsou tudíž doprovázené komplikacemi souvisejícími s krvácením. V poslední době byly sice vyvinuty novější způsoby trombolytické terapie, které jsou založené na použití aktivátorů plazminogenu tkáňového typu, obvykle nazývaných t-PA (tissue Plasminogen Activators), nicméně jsou omezeny řadou nevýhod, zahrnujících vážné komplikace spojené s krvácením, relativně častým výskytem reokluze, neschopnost být stejnoměrně účinné a náchylnost k inaktivaci inhibitory plazminogenového aktivátoru typu 1 (PAI-1) (viz publikace Loskutof, Seminars in Trombosis and hemostasis, Vol. 14, No. 1 (1988)).
Později byly purifikovány plazminogen aktivující proteiny ze slin a ze slinných žláz netopýra vampýra (Desmondus rotundus) (publikovaná evropská patentová přihláška 0 352 119 (Duong a kol.)). Tyto aktivátory plazminogenu (nazývané DSPA) jsou serinové proteázy, které katalyzují přeměnou plazminogenu na plazmin, které však jeví větší selektivitu na plazminogen vázaný na fibrin a z tohoto důvodu, jestliže jsou používány pro trombolickou terapii, mohou být spojovány se snižující se závažností a frekvencí krvácení. Kromě toho není DSPA snadno inaktivován plasmovými inhibitory, jako například PAI-1 a z tohoto důvodu mohou být spojovány s menší frekvencí reokluzí.
V netopýřích slinách mohou být nalezeny dvě formy DSPA s vysokou molekulovou hmotností (označované al a a2), obě z nich sestávají z několika domén, zahrnujících proteázovou doménu, přičemž obě z nich jsou schopné pevné vazby na plazminogen za přítomnosti fibrinu. Různé formy DSPA byly získány z kultur savčích buněk rekombinantní biotechnologií (viz publikace: Kratzschmer a kol., Gene (1991), 105: 229-237; publikovaná evropská patentová přihláška 0 352 119 (Duong a kol.)), přičemž bylo rovněž popsáno čištění rekombinantně vyrobeného DSPA (rDSPA) v malém měřítku (viz publikace: Witt a kol., Blood (1992), 79: 1213-1217).
-1 CZ 294827 B6
Izolace a čištění rDSPA v komerčním měřítku a do stupně čistoty, vhodné pro použití ve farmaceutických přípravcích, nebyly doposud objeveny.
Podstata vynálezu
Předmětný vynález se týká způsobu izolace a čištění rekombinantního DSPA al (rDSPA al) v komerčním měřítku. Vynález, tak jak je popsán, vede k dostatečně čistému a stabilnímu rDSPA al, aby mohl být komerčně prodejný a klinicky použitelný.
Podstata tohoto způsobu čištění rekombinantního aktivátoru plazminogenu al ze slin Desmondus rotundus (rDSPA al) zkondicionovaného média podle předmětného nároku spočívá vtom, že sestává z následujících kroků (a) aplikace tohoto média na kationtovou iontoměničovou pryskyřici při hodnotě pH v rozmezí od 4 do 7 a za podmínek vedoucích k selektivní vazbě rDSPA al na kationtovýměnnou pryskyřici, (b) promývání této kationtové iontoměničové pryskyřice za účelem odstranění proteinů, které nejsou rDSPA ala neproteinových nečistot, (c) selektivního eluování vázaného rDSPA al z kationtové iontoměničové pryskyřice, (d) aplikování eluovaného podílu obsahujícího rDSPA al, který byl získán v kroku (c), na hydrofobní interaktivní pryskyřici při hodnotě pH v rozmezí od 3 do 5 a za podmínek vedoucích k selektivní vazbě rDSPA al na tuto hydrofobní interaktivní pryskyřici, (e) promývání hydrofobní interaktivní pryskyřice za účelem odstranění proteinů, které nejsou rDSPA al a neproteinových nečistot, (f) selektivní eluování vázaného rDSPA al z hydrofobní interaktivní pryskyřice, (g) aplikování eluentu obsahujícího rDSPA al, který byl získán ve stupni (f), na afínitní chromatografickou pryskyřici při hodnotě pH v rozmezí od 1 do 4 vedoucí k selektivní vazbě rDSPA al na tuto afínitní chromatografíckou pryskyřici, (h) promývání afínitní chromatografícké pryskyřice za účelem odstranění proteinů, které nejsou rDSPA al a neproteinových nečistot, (i) selektivní eluování vázaného rDSPA al z afínitní chromatografícké pryskyřice za získání rDSPA al s čistotou rDSPA al přinejmenším 80% celkového podílu proteinů.
Kationtová iontoměničová pryskyřice z kroku (a) je výhodně zvolena ze souboru, zahrnujícího částice silikagelu, zesíťovanou agarózu nebo zesíťované polymethakrylátové polymery, modifikované karboxylovými nebo karboxyalkylovými skupinami. Konkrétně je možno uvést, že výhodně je kationtová iontoměničová pryskyřice tvořena matricí z částic silikagelu, kovalentně vázaných k polyethyleniminsilanu, přičemž aminové skupiny polyethyleniminsilanu jsou modifikovány karboxylovými skupinami.
Ve výhodném provedením tohoto postupu podle vynálezu podmínky aplikace v kroku (a) zahrnují aplikování média při pH v rozmezí od 4 do 7.
-2CZ 294827 B6
Podle dalšího výhodného provedení je eluování rDSPA al v kroku (c) prováděno za použití pufru obsahujícího 50 mM Na3PO4 a od 100 mM do 500 mM NaCl nebo za použití pufru ekvivalentní iontové síly.
Podle dalšího výhodného provedení je hydrofobní interaktivní pryskyřice z kroku (d) pryskyřice bez náboje, modifikovaná alkylovými skupinami obsahujícími 1 až 10 atomů uhlíku nebo aryl-alkylovými skupinami, přičemž tato pryskyřice bez náboje je výhodně zvolena ze souboru, zahrnujícího částice silikagelu, zesíťovanou agarózu nebo zesíťovaný polymethakrylátový polymer. Podle dalšího výhodného provedení je pryskyřice bez náboje tvořena semirigidními sférickými granulemi syntetizovanými kopolymerizací ethylenglykolu a polymerů methakrylátového typu, modifikované butylovými skupinami.
Podle dalšího výhodného provedení aplikační podmínky v kroku (d) zahrnují aplikaci látky, eluované v krou (c) při pH v rozmezí od 3 do 5. Konkrétně je možno uvést, že výhodně aplikační podmínky v kroku (d) zahrnují aplikaci látky, eluované v kroku (c), v 50 mM Na3PO4, 500 mM NaCl a při hodnotě pH upravené na hodnotu 4 kyselinou fosforečnou nebo za použití pufru ekvivalentní iontové síly.
Podle dalšího výhodného provedení se eluování v krou (f) provádí za použití pufru, který obsahuje 20 mM HC1 a který má koncentraci ethanolu v rozmezí od 25 % do 30 %, podle ještě výhodnějšího provedení v rozmezí od 28,5 % a 30 %, nejvhodněji 29 %.
Afínitní chromatografícká pryskyřice v kroku (g) je ve výhodném provedení podle vynálezu přestavována zesíťovaným kopolymerem allyldextranu a Ν,Ν'-methylenbisakrylamidu ve formě granulí o průměru, který je v rozmezí od 25 do 70 μηι, přičemž tyto granule jsou schopné frakcionovat globulární proteiny o velikosti od 20 000 do 8 000 000.
Podle dalšího výhodného provedení je eluování v kroku (i) prováděno s použitím pufru, obsahujícího 200 mM glycinu a při hodnotě pH v rozmezí od 3 do 6 nebo za použití pufru ekvivalentní iontové síly.
Postup podle předmětného vynálezu dále zahrnuje výhodně koncentrování vodného roztoku rDSPA al, přičemž je rovněž výhodné, jestliže tento postup dále zahrnuje lyofilizaci koncentrovaného roztoku rDSPA al.
Výhodně tento postup podle vynálezu zahrnuje koncentrování vodného roztoku rDSPA al a lyofilizaci tohoto koncentrovaného roztoku rDSPA al.
Podle vynálezu je tedy výhodný postup, který konkrétně zahrnuje následující kroky:
(a) aplikování média, které má pH v rozmezí od 4 do 7, na kationtovou iontoměničovou pryskyřici, zvolenou ze souboru zahrnujícího částice silikagelu, zesíťovanou agarózu nebo zesíťované polymethakrylátové polymery, modifikované karboxylovými nebo karboxyalkylovými skupinami vedoucí k selektivní vazbě rDSPA al na tuto kationtovýměnnou pryskyřici, (b) promývání této kationtové iontoměničové pryskyřice za účelem odstranění proteinů, které nejsou rDSPA al a neproteinových nečistot, (c) selektivní eluování vázaného rDSPA al z kationtové iontoměničové pryskyřice pufrem, který obsahuje 50 mM fosforečnanu sodného a od 100 mM do 500 mM chloridu sodného nebo pufrem ekvivalentní iontové síly, (d) přivedení eluentu z kroku (c), který obsahuje rDSPA al, při hodnotě pH v rozmezí od 3 do 5 na hydrofobní interaktivní pryskyřici, zvolenou ze souboru zahrnujícího částice silikagelu,
-3 CZ 294827 B6 zesíťovanou agarózu nebo zesíťované polymethakrylátové polymery vedoucí k selektivní vazbě rDSPA al na tuto hydrofobní interaktivní pryskyřici, (e) promývání této hydrofobní interaktivní pryskyřice za účelem odstranění proteinů, které nejsou rDSPA al a neproteinových nečistot, (f) selektivní eluování vázaného rDSPA al z hydrofobní interaktivní pryskyřice pufrem, který obsahuje 20 mM HC1 a který má koncentraci ethanolu větší než 25 %, (g) aplikování eluovaného podílu obsahujícího rDSPA al, z kroku (f) při hodnotě pH v rozmezí od 1 do 4 na afinitní chromatografíckou pryskyřici, představovanou zesíťovaným polymerem allyldextranu a Ν,Ν'-methylenbisakrylamidu ve tvaru granulí s průměrem v rozmezí od 25 do 75 pm vedoucí k selektivní vazbě rDSPA al na tuto afinitní chromatografíckou pryskyřici, (h) promývání této afinitní chromatografické pryskyřice k odstranění proteinů, které nejsou rDSPA al a neproteinových nečistot, (i) selektivní eluování vázaného rDSPA al z afinitní chromatografické pryskyřice za použití pufru, který obsahuje 200 mM glycinu, při hodnotě pH v rozmezí od 3 do 6 nebo pufru ekvivalentní iontové síly, za získání rDSPA al s čistotou rDSPA al přinejmenším 80 % celkového podílu proteinů.
Podle vynálezu je dále výhodný postup, který konkrétně zahrnuje následující kroky:
(a) aplikování tohoto média, které má pH 5, na kationtovou iontoměničovou pryskyřici, která sestává z matrice částic oxidu křemičitého kovalentně vázaných na polyethyleniminsilan, ve kterém byly aminoskupiny modifikovány karboxylovými skupinami vedoucí k selektivní vazbě rDSPA al na tuto kationtovou iontoměničovou pryskyřici, (b) promývání této kationtové iontoměničové pryskyřice při hodnotě pH 5 použitím 100 mM acetátu sodného a 50 mM Na3PO4 při pH 7,5, za účelem odstranění proteinů, které nejsou rDSPA al a neproteinových nečistot, (c) eluování vázaného rDSPA al z kationtové iontoměničové pryskyřice pufrem, který obsahuje 50 mM fosforečnanu sodného a 500 mM chloridu sodného při ph 7,5, (d) aplikování eluovaného podílu z kroku (c) obsahujícího rDSPA al při hodnotě pH 4 na hydrofobní interaktivní pryskyřici sestávající ze semirigidních sférických granulí syntetizovaných kopolymerací ethylenglykolu a polymerů typu methakrylátu, modifikovaných butylovými skupinami vedoucí k selektivní vazbě rDSPA al na tuto hydrofobní interaktivní pryskyřici, (e) promývání této hydrofobní interaktivní pryskyřice za použití 20 mM HC1 a potom za použití 20 mM HC1, která obsahuje 19 % ethanolu, za účelem odstranění proteinů, které nejsou rDSPA al a neproteinových nečistot, (f) eluování vázaného rDSPA al z hydrofobní interaktivní pryskyřice pufrem, který obsahuje 29 % ethanolu a 20 mM kyseliny chlorovodíkové při pH 2,5, (g) aplikování eluovaného podílu obsahujícího rDSPA al z kroku (f) při hodnotě pH 2,5 na afinitní chromatografíckou pryskyřici sestávající ze zesíťovaného kopolymeru allyldextranu a Ν,Ν'-methylenbisakrylamidu, která frakcionuje globulámí proteiny o hmotnosti mezi 20 000 a 8 000 000, vedoucí k selektivní vazbě rDSPA al na tuto afinitní chromatografíckou pryskyřici,
-4CZ 294827 B6 (h) promývání této afínitní chromatografícké pryskyřice za použití 20 mM HC1 k odstranění proteinů, které nejsou rDSPA al a neproteinových nečistot, (i) eluování vázaného rDSPA al z afínitní chromatografícké pryskyřice za použití pufru, který obsahuje 200 mM glycinu, při hodnotě pH mezi 4 a 5, za získání rDSPA al s čistotou rDSPA al přinejmenším 80 % celkového podílu proteinů.
Postup izolace a čistění rDSPA al z biologického média podle předmětného vynálezu je možno provozovat v komerčním měřítku a získat tak produkt, který je vhodný pro klinické použití.
Rekombinantní aktivátor plazminogenu al ze slin Desmondus rotundus (rDSPA al) je možno použít pro přípravu farmaceutického prostředku obsahujícího tento rDSPA al, který byl izolován a čištěn způsobem podle předloženého vynálezu, a farmaceuticky přijatelný excipient.
Takto získaný rDSPA al, izolovaný a čištěný způsobem podle předloženého vynálezu, je možno použít pro léčení člověka s tepennými nebo s žilními trombózami.
V popise předloženého vynálezu a přiložených nárocích jsou používány některé termíny, které pokud není uvedeno jinak, mají následující význam:
Výraz „biologické prostředí“ se vztahuje na přesně určené složení solí a živin používaných za účelem rozmnožování buněk v kultuře.
Výraz „kondicionované prostředí“ se vztahuje na biologické prostředí, ve kterém byly pěstovány buňky. Prostředí bylo z tohoto důvodu ovlivněno (kondicionováno) růstem buněk a obsahuje produkty vyloučené do prostředí buněk buněčného růstu. Tyto produkty mohou být buď odpadní produkty vytvořené během růstu, nebo proteiny, které byly produkovány a vyloučeny do prostředí buňkami během růstu.
Výraz „kationtová iontoměničová pryskyřice“ se vztahuje na přírodní nebo uměle vyrobenou látku, obvykle pevnou látku, která je schopná vyměňovat vázané ionty za ionty z okolního tekutého prostředí. Kationtová iontoměničová pryskyřice má vázané záporné funkční ionty a vyměňuje odpovídající kladné ionty.
Aktivní složky iontoměničů v komerčně dostupných kationtových měničích jsou obvykle -C6H5O“, -SO3', -COO“, -PO3 _, nebo -AsO3~. Mezi slabší kationtové iontoměničové pryskyřice patří katové pryskyřice, ve kterých vazebná síla kationtů není vysoká, jako například látky, které obsahují karboxylové nebo karboxyalkylové funkční skupiny. Dále je třeba uvést, že slabší kationtové iontoměničové pryskyřice nejsou obvykle úplně disociované při kyselém pH. Konkrétní slabá kationtová iontoměničová piyskyřice, používaná při provádění postupu podle předloženého vynálezu, sestává z matrice částic oxidu křemičitého (silikagel), kovalentně vázaných na polyethyleniminsilan, ve kterém aminoskupiny polyethyleniminu byly modifikovány karboxylovými skupinami. Takováto pryskyřice je komerčně dostupná od společnosti J. T. Baker pod chráněným obchodním označením chromatografícká pryskyřice Widepore CBXR.
Termín „hydrofobní interaktivní pryskyřice“ se vztahuje přírodní nebo uměle vyrobenou látku, obvykle pevnou látku, která obsahuje elektricky nenabité skupiny, jako například methylovou skupinu, ethylovou skupinu nebo další alkylové skupiny. Tyto skupiny vytvářejí hydrofobní vazby se skupinami na proteinových skupinách, které procházejí pryskyřicí a vedou k oddělení proteinů, založenému na síle interakce mezi proteinovými a pryskyřicovými skupinami. Konkrétně je možno uvést, že hydrofobní interaktivní pryskyřice je tvořena polopevnými sférickými granulemi, které se získají kopolymerizací ethylenglykolu a polymerů typu methakrylátu modifikovaných butylovými skupinami. Takováto pryskyřice je komerčně dostupná od společnosti Toso-Haas, pod chráněným obchodním označením Toyo-PearlR 650M C4.
-5CZ 294827 B6
Výraz „afínitní chromatografícká pryskyřice“ se vztahuje na přírodní nebo synteticky (uměle) vyrobenou látku, obvykle pevnou látku, která je používaná pro čistění proteinů. Tyto pryskyřice odděluje proteiny na základě afinity, která se vyskytuje mezi proteinovými skupinami a pryskyřicovými skupinami. V předloženém vynálezu je piyskyřice, používaná jako afínitní chromatografícká pryskyřice, obvykle používána jako pryskyřice pro vylučování separaci, při které se oddělí proteiny podle jejich velikosti. Jako konkrétní příklad této afínitní chromatografícká pryskyřice je možno uvést zesíťovaný kopolymer allyldextranu a N,N'-methylenbisakrylamidu ve formě granulí, která je schopna frakcionace globulámích proteinů o molekulové hmotnosti v rozmezí od 20 000 do 8 000 000. Takováto pryskyřice je komerčně dostupná od společnosti Pharmacia, pod chráněným obchodním označením SephyciylR S-400.
Výraz „alkyl“ se vztahuje na jednovazný zbytek s lineárním nebo rozvětveným řetězcem, který sestává výhradně z uhlíku a vodíku, neobsahuje nenasycené vazby a obsahuje jeden až osmnáct atomů uhlíku, výhodně jeden až šest atomů uhlíku, jako například methylová skupina, ethylová skupina, n-propylová skupina, isopropylová skupina (l-methylethyl)ová skupina, n-butylová skupina, t-butylová skupina, (1,1-dimethylethylová skupina), sek-butylová skupina (1-methylpropylová skupina), n-pentylová skupina, n-hexylová skupina a podobně.
Termíny vztahující se k čistotě získaného produktu, a termín, „v podstatě čistý“ používaný v popisu předmětného vynálezu v souvislosti s čistotou požadovaného rDSPA al (tedy podílem rDSPA al v konečném produktu představujícím směs všech proteinů) po provedení čisticího postupu podle předmětného vynálezu, detailně popsaného v tomto popisu, znamená, že více než 80 % celkového množství proteinů přítomných v konečném vyčištěném produktu je rDSPA al, výhodně více než 90 % celkového podílu proteinů je rDSPA al. Obsah a čistota proteinu jsou určovány metodou HPLC s reverzními fázemi (vysokoúčinná kapalinová chromatografíe) a gelovou analýzou SDS-PAGE (polyakrylová gelová elektroforéza s použitím dodecylsulfátu sodného).
Výraz „proteiny, které nejsou rDSPA al a neproteinové nečistoty“ se vztahuje na všechny materiály, jiné než rDSPA al, vyskytující se v biologickém nebo kondicionovaném prostředí, ze kterého byl rDSPA al čištěn.
Výraz „farmaceuticky přijatelný excipient“ se vztahuje na přijatelný nosič a kteroukoli farmaceuticky přijatelnou pomocnou látku, u nichž je požadována kompatibilita s fyziologickými podmínkami, které jsou netoxické a nepůsobí nepříznivě na biologickou účinnost farmaceutické kompozice v něm suspendované nebo obsažené. Vhodnými excipienty jsou takové sloučeniny jako například mannit, sukcinát (jantaran), glycin, nebo sérový albumin.
Výraz „terapeuticky účinné množství“ znamená takové množství rDSPA al, které, jestliže je podáváno potřebnému člověku, je dostatečné pro uskutečnění léčby chorobných stavů charakterizovaných trombózu, ve smyslu uvedeném níže. Množství sloučeniny, které tvoří „terapeuticky účinné množství“ se liší v závislosti na dané sloučenině, chorobném stavu a jeho závažnosti, přičemž může být určeno běžným způsobem odborníkem pracujícím v daném oboru, který je obeznámen s předmětným vynálezem.
Výrazy „léčení“ nebo „léčba“, používané v popisu předmětného vynálezu, znamenají léčbu chorobného stavu člověka, přičemž chorobný tento stav je charakterizován trombózou, a zahrnují:
(i) zabránění vzniku chorobného stavu u člověka, obzvláště pokud se jedná o člověka s predispozicí vzhledem k tomuto chorobnému stavu, u kterého ale ještě diagnóza neprokázala, že se u něj tento stav vyskytuje;
(ii) inhibice chorobného stavu, to jest zastavení jeho vývinu; nebo
-6CZ 294827 B6 (iii) ulehčení chorobného stavu, to jest způsobení ústupu chorobného stavu.
Výrazy „případný“ nebo „popřípadě“ znamenají, že následně popsaný výskyt okolností může nebo nemusí nastat, přičemž popis předloženého vynálezu zahrnuje jak případy, kdy jmenovaná událost nebo okolnost nastane, tak i případy, kdy jmenovaná událost nebo okolnost nenastane.
Předložený vynález se týká způsobu izolace a čistění rDSPA al v komerčním měřítku a ve formě, vhodné pro použití ve farmaceutických přípravcích. Tento rDSPA al je produkovaný fermentací savčí buněčné linie, schopné sekrece produkovaného rDSPA al do kultivačního prostředí. Kondicionované (ovlivněné) médium, to znamená médium získané zbioreaktoru a obsahujícího savčí buňky, se shromáždí a rDSPA al se oddělí od jiných proteinů a nečistot v řadě za sebou provedených chromatografíckých kroků začínajících použitím kationtové iontoměničové pryskyřice, načež následuje selektivní eluování rDSPA al z pryskyřice. Frakce rDSPA al, získaná selektivní elucí z kationtové iontoměničové pryskyřice, se potom aplikuje na hydrofobní interaktivní pryskyřici, kde selektivní eluování z matrice představuje druhý stupeň čistění. Eluování frakce rDSPA al se potom aplikuje na afínitní chromatografíckou pryskyřici, kde selektivní eluování poskytuje další stupeň čištění. Čištěný rDSPA al je dále koncentrován obvyklými technikami, jako například ultratitrací a potom lyofilizací.
Postup podle předmětného vynálezu se konkrétně provádí následujícím způsobem.
A. Izolace a čištění
1. Kultivační prostředí a buněčné linie
Kultivační prostředí obsahuje základní médium vhodné pro růst savčích buněk, jako například DMEM nebo Hamovo médium F12. Konkrétně je možno uvést, že tímto médiem je zejména Williamsovo E médium (viz publikace Williams, G. M., and Gunn, J. M., Exp. Cell Res., (1974) 89:139). Ve fázi růstu naočkovaných buněk se toto základní médium obvykle doplnění zdrojem séra, obvykle hovězím sérem (BS) nebo sérem novorozeného telete (CS), přítomného v koncentraci v rozmezí od přibližně 0,1% do přibližně 10% hmotnostních, obvykle přítomného v koncentraci v rozmezí od přibližně 1 % do přibližně 5 % hmotnostních. Kromě toho mohou být přidány další růstové faktory nebo pufry, jako například HEPES. Během perfuzní růstové fáze je koncentrace séra obvykle udržována na stejné koncentraci, která je obvykle v rozmezí od přibližně 3 % do přibližně 8 % hmotnostních, obvykle okolo 5 % hmotnostních.
Buněčné linie vhodné pro použití podle předloženého vynálezu zahrnují savčí buněčné linie schopné neadherentního růstu v suspenzní kultuře a/nebo adherentního růstu na mikronosičových granulích. Konkrétní buněčné linie, které vyhovují těmto požadavkům zahrnují buněčné linie vaječníků čínského křečka (CHO), BHK buňky, nebo buněčné linie HEK293 (viz publikace: Kraztschmer a kol., Gene, (1991) 116: 281-284; Petři, T., J. BioTechnology, (1995) 39:75-83).
Zvláště výhodná CHO buněčná linie je DXB11, která je popsaná v publikaci Urlaub, G., and Chasin, L. A., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, (1980) 77: 4216-4220. Tyto buňky byly kontransfektovány expresními vektory pSVPAIl a pUDHFRl, které zahrnují sekvence kódující DSPA al respektive myší dihydrofolátovou reduktázu (Petři, T., ibid). Transformovaná CHO buněčná linie, používaná v předloženém vynálezu, je označovaná CD 16 a byla deponována v Američan Type Culture Collection, Rockville, Maryland (ATCC) pod označením ATCC # CRL 12023.
-7 CZ 294827 B6
2. Růst kultury a produkční fáze
Po inokulaci buď sloučenými kulturami získanými centrifugací, a nebo částí jiných kultur z bioreaktoru se buněčná kultura rozroste na produkční hustotu, typicky v rozmezí okolo 1 až 40 x 106 buněk/ml.
Po dosažení požadované hustoty buněk na mikronosičových granulích je zahájena perfuze čerstvého média, doplněného sérem. Alternativně mohou buňky růst v suspenzní kultuře. Obvykle je koncentrace séra v čerstvém médiu v rozmezí od přibližně 2 % do přibližně 10 % hmotnostních, obvykleji je tato koncentrace séra v rozmezí od přibližně 3 % do přibližně 8 % hmotnostních, zejména je tato koncentrace séra v rozmezí okolo 5 % hmotnostních. Rychlost perfuze je zpočátku v rozmezí od přibližně 0,25 do přibližně 0,75 násobku objemu kultury/den, obvykle v rozmezí okolo 0,5 násobku objemu kultury/den. Se zvyšujícím se růstem buněk se zvyšuje rychlost perfuze až ke konečné rychlosti v rozmezí od přibližně 1,5 do přibližně 2,5 násobku objemu kultury/den, obvykle v průběhu přibližně 2 do přibližně 10 dnů. Během expanze jsou sterilní, předem ekvilibrované granule mikronosiče přidávány do reaktoru aby se udržel poměr množství granulí mikronosiče k buněčné hustotě v rozmezí od přibližně 0,5 do přibližně 1,0 gramu mikronosičových granulí na 109 buněk. Granule mikronosiče jsou výhodně přidávány do reaktoru použitím nasávacího zařízení vzorkovací trubicí.
V okamžiku kdy hustota buněk dosáhne produkční úrovně, se přidávání séra do čerstvého kultivačního prostředí omezí, obvykle na koncentraci v rozmezí od přibližně 0,1 % do přibližně 2,0 % hmotnostních procent, obvykle 1 % hmotnostní.
Kultura v produkční fázi vyžaduje pozornost týkající se několika parametrů fermentace: teplota, pH a stupeň rozpuštěného kyslíku jsou monitorovány denně. Dodatečné kultivační médium, sérum a alkalické látky je třeba dodávat, jakmile se vyčerpají zásobní nádrže. Vzorky kondicionovaného (ovlivněného) prostředí, definovaného jako prostředí, které obsahuje produkt, jsou analyzovány běžným způsobem alespoň každé dva dny, aby se zajistilo, zda produkce pokračuje bez kontaminace.
Způsob odběru kondicionovaného prostředí z bioreaktorů minimalizuje odebírání buněk použitím sít s póry o průměru přibližně 100 až 150 mikrometrů. Suspenzní kultury používají vírový filtr za účelem udržení buněk v bioreaktoru. Odebrané médium je odebíráno do sterilních zásobníků a uchováváno po dobu až 38 dnů při dalším zpracováním. rDSPA al, který se nachází v látce shromážděné z bioreaktoru, se sekretuje zCHO buněk ve zpracované formě, která je plně biologicky aktivní a která je připravena k čistění.
3. Chromatografie s kationtovou výměnou
Po nastavení pH na hodnotu v rozmezí od přibližně 4 do přibližně 6, výhodně okolo 5, je rDSPA al, který se nachází v ovlivněném prostředí, aplikován na kationtovou iontoměničovou matrici (obvykle plněnou ve formě kolony) za podmínek zvolených tak, aby byla zajištěna v zásadě úplná vazba rDSPA al na matrici. Ostatní proteiny se budou rovněž vázat, přesto úrovní vazebná etapa poskytuje první stupeň separace, neboť množství nežádoucích nebo kontaminujících proteinů a jiných sloučenin, jako například fenolová červeň v kondicionovaném prostředí nebude schopno vazby na matrici a tudíž proteče matricí. V dalším postupu je rDSPA al čištěn selektivním eluováním z matrice, přičemž toto eluování může být provedeno buď eluováním po krocích, nebo metodou eluování s lineárním gradientem, při které se zvyšuje iontová síla pufru.
V obou případech je rDSPA al odebírán za účelem dalšího čistění, jak bude popsáno níže.
Mezi vhodné kationtové iontoměničové matrice je možno zařadit velký počet různých pryskyřic modifikovaných kationtovými funkčními skupinami, které jsou schopné vázat rDSPA al. Výhodné jsou synteticky připraveny pryskyřice, jako například pryskyřice sestávající z částic
-8CZ 294827 B6 silikagelu, zesíťované agarózy nebo zesíťovaných polymethakrylátových polymerů, modifikovaných kationtovými funkčními skupinami, jako například karboxylová skupina, karboxymethylová skupina, sulfonová skupina, fosforylová skupina a podobně. Zvláště použitelné jsou relativně slabé pryskyřice, jako například takové pryskyřice, které mají karboxylovou nebo karboxyalkylovou funkční skupinu, jako je například karboxymethylová skupina nebo karboxyethylová skupina. Zvláště výhodná pryskyřice sestává z matrice z částic oxidu křemičitého, kovalentně vázaných na polyethyleniminsilan, s amino skupinami polyethyleniminsilanu modifikovanými karboxylovými skupinami. Takovouto pryskyřicí je produkt Baker Vadepore CBXR (velikost granulí 45 mm), která je komerčně dodávaná společností J. T. Baker.
Vazebné podmínky a podmínky eluování se liší v závislosti na síle vazby kationtové pryskyřice. Pro slabé kationtové pryskyřice, jako například Baker Vadepore CBX, může být vazba vytvořena při nízké iontové síle za mírně kyselých podmínek, obvykle při pH v rozmezí od 4 do 7, výhodně okolo pH 5. Po eluování matrice může být rDSPA al selektivně eluován vystavením matrice působení mobilní fáze se zvyšující se iontovou silou, přičemž se použije buď lineární eluování, nebo eluování po krocích. V případě pryskyřice Baker Videpore CBX bude rDSPA al eluován při pH okolo 7,5, s koncentrací soli mezi přibližně 100 mM a přibližně 500 mM NaCl. Kolonu je možno potom podrobit stripování a regenerovat za účelem následného použití.
S matricí Baker Widepore CBX je možno pryskyřici zprvu výhodně ekvilibrovat pufrem 100 mM octanu sodného s hodnotou pH 5. Tento pufr se aplikuje na kolonu s rychlostí průtoku rovnou 0,2 násobku objemu až 2,0 násobku objemu kolony za minutu až do doby, než se pH vystupující tekutiny ustálí na 5. Kondicionované médium obsahující rDSPA al se filtruje 1,2 pm filtrem a potom se titruje až na pH mezi 4 a 7, nejvýhodněji 5, za použití ledové kyseliny octové. Toto médium se potom přivede do kolony, obvykle za použití zubového čerpadla, při rychlosti toku nepřesahující dvojnásobek objemu kolony za minutu. Za účelem odstranění částic, které by mohly ucpat matrici kolony, je použit filtr.
Matrice kolony se potom znovu ekvilibruje ekvilibračním octanovým pufrem až do doby, než se pH stabilizuje na 5, což typicky vyžaduje množství pufru of přibližně dvojnásobku do přibližně sedminásobku objemu kolony. Potom je na kolonu aplikuje promývací pufr obsahující 50 mM fosforečnanu sodného, pH 7,5, rychlostí přibližně 0,1 násobku do přibližně 0,2 násobku objemu kolony za minutu až do doby, než se pH eluentu stabilizuje na 7,5. Potom se rDSPA al eluuje z kolony za použití elučního pufru obsahujícího 50 mM fosforečnanu sodného, 500 mM chloridu sodného, pH 7,5. Tento eluční pufr je ponechán procházet kolonou až do doby, kdy už nedochází k eluování proteinu z kolony. Na kolonu se potom aplikuje stripovací pufr obsahující 2,0 M octanu sodného, pH 8 za účelem regenerování matrice. Zásobní pufr obsahuje 10% kyseliny octové a 45 % ethanolu.
4. Hydrofobní interaktivní chromatografie
Frakce rDSPA al shromážděná z matrice kationtového iontoměniče je potom aplikována na hydrofobní interaktivní matrici (obvykle ve formě kolony) za podmínek, které umožní vazbu rDSPA al na matrici, obvykle za vysoké iontové síly a nízkého pH. V dalším postupu se potom rDSPA al selektivně eluuje zvýšením koncentrace organického rozpouštědla mobilní fáze aplikované na kolonu, za použití lineárního nebo krokového gradientu. Frakce rDSPA al je odebírána z kolony za účelem dalšího čistění. Tento krok sníží 100 až 1000 krát DNA kontaminaci a inaktivuje potenciální virové nečistoty.
Mezi vhodné hydrofobní interaktivní matrice je možno zařadit velké množství elektricky nenabitých pryskyřic, které obsahují kovalentně vázané hydrofobní skupiny, jako například propylovou skupinu, butylovou skupinu, oktylovou skupinu, fenylovou skupinu a podobně. Těmito pryskyřicemi mohou být zesíťované organické polymery, jako například styren-divinylbenzen, oxid křemičitý, agaróza, polymethakrylát, nebo kterýkoli z velkého množství jiných vhodných částico
-9CZ 294827 B6 vých nosičů. Zvláště výhodná pryskyřice sestává ze semirigidních sférických granulí, které se syntetizují kopolymerizací ethylenglykolu a polymerů methakrylátového typu modifikovaných butylovými skupinami. Takovouto pryskyřicí je Toyo-PearlR 650M (granule 40 až 90 pm), která je komerčně dostupná od společnosti Toso-Haas.
Vazba na hydrofobní interaktivní kolonu se uskuteční za podmínek vysoké iontové síly, obvykle při kyselém pH od 3 do 5, zejména okolo pH 4. V podstatě všechen protein obsažený ve frakci rDSPA al, která byla eluována zkationtové iontoměničové pryskyřice, je vázán na hydrofobní interaktivní kolonu. V závislosti na různých schopnostech hydrofobních interakcí s hydrofobními skupinami na matrici mohou být selektivně eluovány různé proteiny, to znamená v pořadí stoupající hydrofobicity proteinu. Eluování kolony může být provedeno za použití krokového nebo lineárního gradientu, obvykle za použití alkoholového eluentu, jako je například ethanol nebo isopropanol. Zvláště výhodný alkohol je ethylalkohol.
Ekvilibrace matrice Toyo-Pearl C4 může být výhodně provedena ekvilibračním pufrem, který obsahuje 50 mM octanu sodného, 500 mM chloridu sodného, o pH 4. Poté, co byla frakce rDSPA al z kolony iontoměniče titrována na pH 4, byla tato frakce aplikována na C4 matrici, tato matrice se potom znovu ekvilibruje ekvilibračním pufrem, který byl popsán výše. Tato kolona se potom následně promyje postupně za použití dvou pufrů, jak vyplývá z následujícího výkresu. Při prvním promývání (promývání 1) se používá pufr, jehož objem činí alespoň dvojnásobek objemu kolony a který obsahuje 20 mM HC1. Promývání je opakováno až do doby, než vystupující tekutina neobsahuje další protein, jak je patrno ze stálé UV absence. Matrice je potom promývána (promývání 2) za použití pufru, jehož objem činí nejméně desetinásobek objemu kolony a který obsahuje 19 % ethanolu, 20 mM HC1 a v promývání se pokračuje pufrem obsahujícím 20,5 % ethanolu, 20 mM HC1 až do doby, dokud už není vymyt žádný další protein. Vymývání produktu rDSPA al je prováděno za použití pufru, který obsahuje 29 % ethanolu, 20 mM HC1, pH 2,5. Po vymytí produktu je kolona stripována pufrem, jehož objem činí nejméně dvojnásobek objemu kolony a který obsahuje 100 mM NaOH. Matrice je uchovávána v pufru z promývání 1.
5. Afínitní chromatografíe
Frakce rDSPA al odebraná z hydrofobní interaktivní pryskyřice je dále aplikována na afínitní matrici (obvykle ve formě kolony) za podmínek, které umožní vazbu rDSPA al na afínitní matrici. Zatímco rDSPA al zůstává vázaný na kolonu, nečistoty jsou eluovány promýváním kolony 20 mM HC1, jehož objem činí dvojnásobek až trojnásobek objemu kolony. Tento krok ulehčuje výměnu pufru, čímž napomáhá vytváření farmaceutického prostředku a zlepšuje rozpustnost a také pomáhá při inaktivaci/odstranění potenciální virové kontaminace. Výhodně je používán pufru, jehož objem činí 2,5 násobek objemu kolony. V dalším postupuje potom rDSPA al selektivně eluován za použití pufru, který obsahuje 200 mM glycinu, volnou bází o pH mezi 4 a 5. Frakce rDSPA al je odebírána za účelem zkoncentrování.
V předmětném vynálezu jsou pryskyřice používané jako afínitní pryskyřice takové pryskyřice, které jsou normálně používané jako pryskyřice používané pro separaci podle velikosti molekul. Mezi vhodné afínitní matrice je možno zařadit pryskyřice sestávající ze zesíťovaného polymeru allyldextranu a Ν,Ν'-methylenbisakrylamidu ve formě granulí o průměru mezi 25 a 75 pm. Zvláště výhodná pryskyřice je Sephacryl 4005, která je komerčně dostupná od společnosti Pharmacia a je schopná frakcionace granulámích proteinů mezi 20 000 a 8 000 000 kDa.
Vazbu rDSPA al na afínitní pryskyřici je možno dosáhnout za podmínek slabé iontové síly a nízkého pH. V podstatě všechen rDSPA al odebraný z hydrofobní interaktivní pryskyřice se váže na kolonu. Tento rDSPA al může být selektivně eluován zvýšením pH a/nebo iontové síly. Toto eluování může být provedeno za použití krokového nebo lineárního gradientu, obvykle za použití eluentu obsahujícího 200 mM glycinu, ve formě volné báze.
-10CZ 294827 B6
Při použití matrice Sephacryl S-400 může být výhodně ekvilibrace provedena pufrem, který obsahuje 19% ethanolu, 20 mM HC1, až do doby, kdy pH vystupující tekutiny již zůstává neměněno. Na matrici se přivede frakce rDSPA al zhydrofobní interaktivní kolony a potom se provede vymývání pufrem, který obsahuje 20 mM HC1 až do doby, kdy je UV signál z vystupující tekutiny stálý. Eluování vázaného rDSPA al je prováděno za použití pufru, který obsahuje 200 mM glycinu. Po eluování produktu je kolona podrobena stripování pufrem, jehož objem činí více než dvojnásobek objemu kolony, který obsahuje 100 mM NaOH. Po promytí matrice pufrem, jehož objem činí alespoň dvojnásobek objemu kolony (200 mM HC1), může být v tomto pufru matrice uchovávána.
6. Koncentrace
Vyčištěný protein získaný postupem podle předmětného vynálezu může být potom zkoncentrován, obvykle filtrací nebo podobným způsobem, přičemž může být popřípadě lyofilizován nebo jiným způsobem vpraven do obvyklého farmaceutického prostředku. Použitelné postupy koncentrace a lyofilizace jsou v tomto oboru dobře známé a popsané v odborné literatuře.
B. Příprava farmaceutických forem
1. Farmaceutické prostředky
Rekombinantní DSPA al je možno použít pro přípravu prostředku s významnou terapeutickou hodnotou. Tento rDSPA al, čištěný postupem podle předmětného vynálezu, je možno použít pro léčení tepenných a žilních trombóz.
Rekombinantní DSPA al, čištěný postupem podle předmětného vynálezu dokumentu, může být podáván pacientovi. Toto činidlo může být kombinováno za účelem terapeutického použití s jinými látkami, například s obvyklými farmaceuticky přijatelnými nosiči nebo ředidly a současně s fyziologicky neškodnými stabilizátory a excipienty. Tyto kombinace mohou být sterilně filtrovány a zpracovány do dávkovačích forem, jako je například lyofilizace v dávkovačích nádobkách nebo uchovávání ve stabilizovaných vodných přípravcích.
Množství činidla, které je nezbytné pro účinnou terapii budou záležet na mnoha různých faktorech, zahrnujících způsob podávání, fyziologický stav pacienta a jiné podávané léky. Léčebné dávky by tudíž měly být titrovány, aby byla co nejvíce zvýšena bezpečnost a účinnost. Dávky použité in vitro mohou obvykle přestavovat užitečnou informaci o použitelných množstvích pro podávání těchto činidel in šitu. Pokusy na zvířatech, prováděné za účelem stanovení účinné dávky pro léčbu zvířat mohou poskytnout předběžné indikace o dávkování člověku. Různé teoretické úvahy na toto téma jsou popsané například v publikaci Gilman a kol., (eds) (1990) Goodman and Gilmaiťs: Pharmacological Bases of Therapeutics, 8th Ed., Pergamon Press; a Remingtonů Pharmaceuticals Sciences, 18th ed. (1990), Mack Publishing Co., Easton, Penn.
V uvedených publikacích a v dalším popisu bude pojednáno o různých způsobech podávání, například o perorálním podávání, intravenózním podávání, intraperitoneální podávání nebo o intramuskulárním podávání, o transdermální difúzi a jiných způsobech. Farmaceuticky přijatelné nosiče budou obsahovat vodu, fyziologický roztok, pufiy a jiné složky, popsané například v publikaci The Měrek Index, Měrek & Co., Rahway, New Jersey. Vzhledem k potřebnému dávkování jiných aktivátorů plazminogenu je možno očekávat celkové dávkované množství v rozmezí od 80 do 110 miligramů (viz Physicians' Decs Reference, 49th ed. (1995), Mecidal Economics Data Produkce Company, str. 1083-1085).
Terapeutický přípravek může být podáván v kterékoli obvyklé dávkovači formě. I když je možné podávat aktivní složku samotně, je výhodnější, aby byla podávána ve formě farmaceutického prostředku. Tyto prostředky obsahují alespoň jednu aktivní složku, definovanou výše, spolu
-11 CZ 294827 B6 sjedním nebo více přijatelnými nosičovými látkami pro tuto aktivní složku. Každá nosičová látka musí být jak farmaceuticky, tak i fyziologicky přijatelná v tomto smyslu, že je kompatibilní s jinými složkami a že neohrožuje pacienta. Tento prostředek obsahuje takové složky, které jsou vhodné pro perorální podávání nebo parenterální podávání (zahrnující subkutánní podávání, intramuskulární podávání, intravenózní podávání a intradermální podávání). Tyto prostředky jsou obvykle podávány v jednotkové dávkovači formě, přičemž mohou být připraveny ktefymkoli ze způsobů známých v oboru farmacie. Viz například Gilman a kol., ibid, and Remington ibid.
Příklady provedení vynálezu
Postup podle předmětného vynálezu bude v dalším blíže vysvětlen s pomocí konkrétních příkladů provedení, které jsou ovšem pouze ilustrativní a nijak neomezují rozsah předmětného vynálezu.
Příklad 1
Produkování rDSPA al z buněčné kultury.
Lahvička DSPA Working Cell Bank byla rozmražena a inokulována do válcové národy obsahující 5% telecí sérum v růstovém médiu (WEC 5.0 médium, modifikované médium Williams E). Během dvoutýdenní periody buňky expandovaly do čtyř válcových nádob, přičemž tyto buňky byly zpracovány trypsinem a inokulovány do čtyř jednolitrových odstřeďovacích baněk po 4x 108 buněk, každý sjedním litrem růstového média. Po čtyřech dnech byly tyto kultury ze čtyř baněk použity pro naočkování do desetilitrového bioreaktoru. Do kultury v tomto bioreaktoru byl dodatečně přidán 1 litr růstového média v den inokulace. Následující den byl tento bioreaktor naplněn 10 litry růstového prostředí. Kultivace jak s přidáváním, tak bez přidávání mikronosičových granulí se řídilo tímto protokolem. pH prostředí bylo regulováno na 7,0 až 7,4 a okysličení bylo udržováno po celou dobu rozptylovacím systémem. Tepla byla udržována na 34 až 39 °C.
Hustota buněk v den naočkování do bioreaktoru byla 8,1 x 105 buněk na ml a po dvou dnech se hustota buněk zvětšila na dvojnásobek, v době, ve které rychlost perfuze byla nastavena na 0,5 násobek objemu kultury za den. Rychlost perfuze byla zvyšována v závislosti na hustotě buněk, tak, aby po devíti dnech uplynulých od naočkování bioreaktoru hustota dosáhla 6,2 x 106 buňky/ml a perfuze se zvýšila na 2 násobky objemu kultury za den.
Bioreaktor byl potom převeden na produkční prostředí (1% telecí sérum ve WEC 5.0 prostředí) a o dva dny později začalo odebírání produkce a pokračovalo po dobu deseti týdnů. Během fáze produkce byl průměr hustoty buněk 15 x 106 buněk na ml s přibližně 75% životností. Průměr produkce rDSPA al byl 40 miligramů rDSPA al na litr a průměr specifické produkční rychlosti byl 6 pikogramů rDSPA al na buňku na den.
Expanze fermentačních objemů byla dosažena přesunem poloviny obsahu reaktoru do nové nádoby. Oba bioreaktory byly umístěny do produkčního prostředí, perfuzovány dvěma násobky objemu kultury za den a ihned začalo odebírání produkce.
- 12CZ 294827 B6
Příklad 2
Čištění rDSPA al
1. Chromatografie kationtovou výměnou (Kolona A).
Odběr zbioreaktoru je uchováván za teploty okolí (15 až 25 °C). Je potom filtrován přes 0,45 mikronový filtr před přivedením na kationtovou iontoměničovou kolonu. Čištění odebraného materiálu začíná krokem kolonové chromatografie za použití pryskyřice CBX, vyrobené společností J.T. Baker (Kolona A). Tento krok umožňuje významnou část čistění proteinu.
Pufry kolony A sestávají zPufru Al: ekvilibrační pufr (50 mM NaOAc, pH 5,0), zpufru A2: promývací pufr (50 mM NaPO4, pH 7,5), z Pufru A3: vymývací pufr (50 mM NaPO4, 500 mM NaCl, pH 7,5), z Pufru A4: stripovací pufr (2M NaAc, pH 8,0) a z Pufru A5: zásobní pufr (45 % EťOH, 10 % HoAc).
Následující operační parametry kolony jsou vhodné pro kolonu naplněnou 6 kg pryskyřice as objemem kolony 15 litrů. Nejvíce 4,5 gramů rDSPA al může být přivedeno na kolonu v jednom zpracování. Kolona je plněna při velikosti toku menší než 2 litry za minutu a při tlaku kolony nepřesahujícím 20 psi. Hodnoty kolony a monitoru jsou kontrolované před každým zpracováním. Plnicí materiál a chromatografické pufry jsou před použitím zbaveny plynů proplachováním heliem.
Odběr zbioreaktoru je filtrován 1,2 mm filtrem, potom titrován na pH 5,0 (± 0,10) za použití ledové kyseliny octové. Před plněním je kolona ekvilibrována nejméně 30 litry Pufru Al až do doby, než má vycházející tekutina pH 5.0 (± 0,20). Jakmile je kolona ekvilibrována, je na kolonu přiváděn odběr. Kolona je znovu ekvilibrována nejméně osmdesáti litry Pufru Al. Kolona je znovu správně ekvilibrována, když má vycházející tekutina pH 5,00 (± 0,20) a když je dosaženo stabilní základní linie UV spektra. Kolona je vymývána nejméně 145 litry Pufru A2. Kolona je správně vymyta, když má vycházející tekutina pH 7,50 (± 0,20) a když je dosaženo stabilní základní linie UV spektra.
Produkt je vymyt z kolony za použití nejméně 30 litrů Pufru A3 a odebírán do oddělené nádoby. Vymývání je považováno za dosažené, když je dosaženo stabilní základní linie UV spektra. Po vymytí produktu je kolona stripována až do doby, než je dosaženo stabilní základní linie UV spektra, za použití nejméně 30 litrů Pufru P4. Kolona je potom čištěna, aby mohla být znovu použita (aniž by byla překročena hranice 50 cyklů používání). Produkt kolony A (nebo eluát) je uchováván při teplotě 2 až 8 °C. Průměrný výtěžek byl 93 % a průměrná (proteinová) čistota vymytého materiálu byla 81%.
2. Hydrofobní interaktivní chromatografie (Kolona B).
Po provedené chromatografie na pryskyřici CBX je produkt rDSPA al chromatografován za použití C4 hydrofobní interaktivní pryskyřice (Toso-Haas) (Kolona B). Tento krok ulehčuje významně odstranění neproteinových nečistot a také pomáhá při inaktivaci/odstranění možných virových nečistot. Pufry kolony B sestávají zPufru Bl: ekvilibrační pufr (50 mM NaOAc, 500 mM NaCl, pH 4,0), zPufru B2: promývací a zásobní pufru (20 mM HC1), zPufru B3: promývací pufru (20 mM HC1, 19 % EtOH), z Pufru B4: promývací pufr (20 mM HC1, 20,5 % EtOH), zpufru B5: vymývací pufr 20 mM HC1, 29,5 % EtOH), a zPufru B6: stripovací pufru (0,lN NaOH). Následující operační parametry kolony jsou vhodné pro 15 litrový objem kolony. V jednom zpracování může být přivedeno na kolonu nejvíce 9 gramů DSPA al. Kolona je plněna při velikosti toku nejvíce 2 litry za minutu a při tlaku kolony nejvíce 15 psi. Hodnoty kolony a monitoru jsou kontrolované před každým zpracováním.
-13 CZ 294827 B6
Před plněním je kolona ekvilíbrována až do doby, než má vycházející tekutina pH 4,00 (± 0,20). Látka vymytá z kolony A je titrována na pH 4,00 (± 0,10) za použití ledové kyseliny octové, zbavena plynu, a přiváděna do kolony. Tato kolona je znovu ekvilíbrována nejméně 30 litry Pufru B1 až do doby, než má vycházející tekutina pH 4,00 (+ 0,20) a než je dosaženo stabilní základní linie UV spektra. Kolona je promývána třemi pufry. První promývání je nejméně 45 litry Pufru B2. Kolona je správně promyta, když má vycházející tekutina pH 1,90 (+ 0,20) a když je dosaženo stabilní základní linie UV spektra. Kolona je promývána po druhé nejméně 145 litry Pufru B3 až do doby, než je dosaženo stabilní základní linie UV spektra. Kolona je promývána po třetí nejméně 30 litry Pufru B4 a promývání je úplné, když je dosaženo stabilní základní linie UV spektra.
rDSPA al je vymyt z kolony za použití nejméně 30 litrů Pufru B5 a shromažďován do oddělené nádoby. Ve vymývání se pokračuje až do doby, než je dosaženo stabilní základní linie UV spektra. Kolona je potom čištěna, aby mohla být znovu použitelná (aniž by byla překročena hranice 50 cyklů používání). Produkt kolony B (neboli eluát) je uchováván při teplotě 2 až 8 °C během nejvíce 15 dnů před dalším zpracováním. Průměrný výtěžek byl 91 % a průměrná (proteinová) čistota vymytého materiálu byla 97 %.
3. Afinitní chromatografie (Kolona C).
Produkt kolony B podstupuje dále chromatografíi za použití Sephacryl S-400 (Pharmacia) (Kolona C). Tento krok ulehčuje výměnu pufru, čímž napomáhá vytváření přípravku a tedy pomáhá při inaktivaci/odstranění virových nečistot. Pufry kolony C sestávají zPufru Cl: ekvilibrační pufr (20 mM HCI, 9 % Et OH) z Pufru C2: promývací pufr (20 mM HCI), z Pufru C3: vymývací a zásobní pufr (200 mM glycinu, sterilně filtrovaného) a z Pufru C4: stripování pufru (0,lN NaOH). Následující operační parametry kolony jsou vhodné pro desetilitrový objem kolony. V jednom zpracování může být na kolonu přivedeno nejvíce 20 gramů rDSPA al. Kolona je plněna při rychlosti nejvíce 0,5 litru za minutu a při tlaku kolony nejvíce 15 psi. Eluáty z jednoho nebo více zpracování Kolony B jsou sloučeniny a potom jsou zředěny jedním dílem eluátu Pufru C2 a dvěma díly eluátu Pufru 5. Konečná koncentrace ethanolu bude přibližně 19 %.
Před plněním je kolona ekvilíbrována nejméně 15 litry Pufru Cl až do doby, než má vycházející tekutina pH 1,80 (± 0,20).
Po naplnění je kolona promývána nejméně 30 litry Pufru C2. Kolona je vhodně promývána dokud UV signál není stabilní. Produkt je vymyt z kolony použitím nejméně 20 litrů Pufru C3 a shromažďován do oddělené nádoby. Ve vymývání je pokračováno až do doby, než je dosaženo stálé základní linie UV spektra.
Po vymývání produktu je kolona stripována nejméně 12 litry Pufru C4 a uchovávána až do opětovného použití, které však nemá překročit 20 cyklů. Produkt kolony C (neboli eluát) je zředěn na koncentraci menší než 1 mg na mililitr Pufrem C3 a uchováván při teplotě 2 až 8 °C za účelem dalšího zpracování. Průměrný výtěžek byl 97 % a průměrná (proteinová) čistota vymytého materiálu byla 98 %.
Kroky koncentrace a přípravy farmaceutických kompozic následovaly po dokončení kroků čistění (popsaných výše) a byly prováděny s vymytým produktem afinitní kolony S-400, který byl uchováván nejdéle 70 dní. Eluáty kolony C byly sloučeny a koncentrovány by spirálově vinutou ultrafiltrační membránou, která odstraňuje látky nízké molekulové hmotnosti (propustnost do 30,000 daltonů). Produkt byl sebrán do kontejneru, který neobsahuje pyrogenní látky, v koncentraci vyšší než 8 mg/ml. Ke koncové 4% koncentraci byl přidán mannit.
- 14CZ 294827 B6
Nakonec byl přidán formulační pufr (200mM glycinu, 4 % mannitu (hmotnost/objem)), aby upravil koncentraci hromadně připraveného produktu na 7,5 mg/ml. Hromadně připravený produkt je potom sterilně filtrován, rozdělen do nádob a lyofílizován.
Claims (21)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Způsob čištění rekombinantního aktivátoru plazminogenu al ze slin Desmondus rotundus (rDSPA al) z kondicionovaného média, vyznačující se tím, že sestává z následujících kroků:(a) aplikace tohoto média na kationtovou iontoměničovou pryskyřici při hodnotě pH v rozmezí od 4 do 7;(b) promývání této kationtové iontoměničové pryskyřice za účelem odstranění proteinů, které nejsou rDSPA al a neproteinových nečistot;(c) selektivní eluování vázaného rDSPA al z kationtové iontoměničové pryskyřice;(d) aplikování eluovaného podílu obsahujícího rDSPA al, který byl získán v kroku (c), na hydrofobní interaktivní pryskyřici při hodnotě pH v rozmezí od 3 do 5;(e) promývání hydrofobní interaktivní pryskyřice za účelem odstranění proteinů, které nejsou rDSPA al a neproteinových nečistot;(f) selektivní eluování vázaného rDSPA al z hydrofobní interaktivní pryskyřice;(g) aplikování eluovaného podílu obsahujícího rDSPA al, který byl získán ve stupni (f), na afínitní chromatografíckou pryskyřici při hodnotě pH v rozmezí od 1 do 4;(h) promývání afínitní chromatografícké pryskyřice za účelem odstranění proteinů, které nejsou rDSPA al a neproteinových nečistot;(i) selektivní eluování vázaného rDSPA al z afínitní chromatografícké pryskyřice za získání rDSPA ais čistotou rDSPA al přinejmenším 80% celkového podílu proteinů.
- 2. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že kationtová iontoměničová pryskyřice z kroku (a) je zvolena ze souboru, zahrnujícího částice silikagelu, zesíťovanou agarózou nebo zesíťované polymethakrylátové polymery, modifikované karboxylovými nebo karboxyalkylovými skupinami.
- 3. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že kationtová iontoměničová pryskyřice je tvořena matricí z částic silikagelu, kovalentně vázaných z polyethyleniminsilanu, přičemž aminové skupiny polyethyleniminsilanu jsou modifikovány karboxylovými skupinami.
- 4. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že podmínky aplikace v kroku (a) zahrnují aplikování média při pH v rozmezí od 4 do 7.
- 5. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že eluování rDSPA al v kroku (c) je prováděno za použití pufru obsahujícího 50 mM Na3PO4 a od 100 mM do 500 mM NaCl nebo za použití pufru ekvivalentní iontové síly.- 15 CZ 294827 B6
- 6. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že hydrofobní interaktivní pryskyřice z kroku (d) je pryskyřice bez náboje, modifikovaná alkylovými skupinami obsahujícími 1 až 10 atomů uhlíku nebo aryl-alkylovými skupinami.
- 7. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že pryskyřice bez náboje je zvolena ze souboru, zahrnujícího částice silikagelu, zesíťovanou agarózou nebo zesíťovaný polymethakrylátový polymer.
- 8. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že pryskyřice bez náboje je tvořena semirigidními sférickými granulemi syntetizovanými kopolymerací ethylenglykolu a polymerů methakrylátového typu, modifikované butylovými skupinami.
- 9. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že aplikační podmínky v kroku (d) zahrnují aplikaci látky, eluované v kroku (c), při pH v rozmezí od 3 do 5.
- 10. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že aplikační podmínky v kroku (d) zahrnují aplikaci látky, eluované v kroku (c), v 50 mM Na3PO4, 500 mM NaCl a při hodnotě pH upravené na hodnotu 4 kyselinou fosforečnou nebo za použití pufru ekvivalentní iontové síly.
- 11. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že eluování v kroku (f) se provádí za použití pufru, který obsahuje 20 mM HC1 a který má koncentraci ethanolu v rozmezí od 25 % do 30 %.
- 12. Způsob podle nároku 11,vyznačující se tím, že koncentrace ethanolu je mezi 28,5 % a 30 %.
- 13. Způsob podle nároku 11,vyznačující se tím, že koncentrace ethanolu je 29 %.
- 14. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že afinitní chromatografícká pryskyřice v kroku (g) je představována zesíťovaným kopolymerem allyldextranu a N,N'-methylenbisakrylamidu ve formě granulí o průměru, který je v rozmezí od 25 do 70 pm.
- 15. Způsob podle nároku 14, vyznačující se tím, že granule jsou schopné frakcionovat globulární proteiny o molekulové hmotnosti od 20 000 do 8 000 000.
- 16. Způsob podle nároku 14, vyznačující se tím, že eluování v kroku (i) je prováděno s použitím pufru obsahujícího 200 mM glycinu a při teplotě pH v rozmezí od 3 do 6 nebo za použití pufru ekvivalentní iontové síly.
- 17. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že zahrnuje koncentrování vodného roztoku rDSPA al.
- 18. Způsob podle nároku 17, vyznačující se tím, že dále zahrnuje lyofílizaci koncentrovaného roztoku rDSPA al.
- 19. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že dále zahrnuje koncentrování vodného roztoku rDSPA al a lyofílizaci tohoto koncentrovaného roztoku rDSPA al.
- 20. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že sestává z následujících kroků (a) aplikování média, které má pH v rozmezí od 4 do 7, na kationtovou iontoměničovou pryskyřici, zvolenou ze souboru zahrnujícího částice silikagelu, zesíťovanou agarózu nebo zesíťované polymethakiylátové polymery, modifikované karboxylovými nebo karboxyalkylovými skupinami;-16CZ 294827 B6 (b) promývání této kationtové iontoměničové pryskyřice za účelem odstranění proteinů, které nejsou rDSPA al a neproteinových nečistot;(c) selektivní eluování vázaného rDSPA al z kationtové iontoměničové pryskyřice pufrem, který obsahuje 50 mM fosforečnanu sodného a od 100 mM do 500 mM chloridu sodného nebo pufrem ekvivalentní iontové síly;(d) přivedení eluovaného podílu z kroku (c) obsahujícího rDSPA al, při hodnotě pH v rozmezí od 3 do 5 na hydrofobní interaktivní pryskyřici, zvolenou ze souboru zahrnujícího částice silikagelu, zesíťovanou agarózu nebo zesíťované polymethakrylátové polymery;(e) promývání této hydrofobní interaktivní pryskyřice za účelem odstranění proteinů, které nejsou rDSPA al a neproteinových nečistot;(f) selektivní eluování vázaného rDSPA al z hydrofobní interaktivní pryskyřice pufrem, který obsahuje 20 mM HC1 a který má koncentraci ethanolu větší než 25 %;(g) aplikování eluovaného podílu obsahujícího rDSPA al z kroku (f) při hodnotě pH v rozmezí od 1 do 4 na afínitní chromatografíckou pryskyřici, představovanou zesíťovaným polymerem allyldextranu a Ν,Ν'-methylenbisakrylamidu ve tvaru granulí s průměrem v rozmezí od 25 do 75 pm;(h) promývání této afínitní chromatografícké pryskyřice k odstranění proteinů, které nejsou rDSPA al a neproteinových nečistot;(i) selektivní eluování vázaného rDSPA al afínitní chromatografícké pryskyřice za použití pufru, který obsahuje 200 mM glycinu, při hodnotě pH v rozmezí od 3 do 6 nebo pufru ekvivalentní iontové síly, za získání rDSPA ais čistotou rDSPA al přinejmenším 80 % celkového podílu proteinů.
- 21. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že sestává z následujících kroků (a) aplikování tohoto média, které má pH 5, na kationtovou iontoměničovou pryskyřici, která sestává z matrice částic oxidu křemičitého kovalentně vázaných na polyethyleniminsilan, ve kterém byly amino skupiny modifikovány karboxylovými skupinami;(b) promývání této kationtové iontoměničové pryskyřice při hodnotě pH 5 použitím 100 mM acetátu sodného a 50 mM Na2PO4 při pH 7,5, za účelem odstranění proteinů, které nejsou rDSPA al a neproteinových nečistot;(c) eluování vázaného rDSPA al z kationtové iontoměničové pryskyřice pufrem, který obsahuje 50 mM fosforečnanu sodného a 500 mM chloridu sodného při pH 7,5;(d) aplikování eluovaného podílu z kroku (c) obsahujícího rDSPA al, při hodnotě pH 4 na hydrofobní interaktivní pryskyřici sestávající ze semirigidních sférických granulí syntetizovaných kopolymerací ethylenglykolu a polymerů typu methakrylátu, modifikovaných butylovými skupinami;(e) promývání této hydrofobní interaktivní pryskyřice za použití 20 mM HC1 a potom za použití 20 mM HC1, která obsahuje 19 % ethanolu, za účelem odstranění proteinů, které nejsou rDSPA al a neproteinových nečistot;- 17CZ 294827 B6 (f) eluování vázaného rDSPA al z hydrofobní interaktivní pryskyřice pufrem, který obsahuje 29 % ethanolu a 20 mM kyseliny chlorovodíkové při pH 2,5;(g) aplikování eluovaného podílu obsahujícího rDSPA al z kroku (f) při hodnotě pH 2,5 na afinitní chromatografickou pryskyřici sestávající ze zesíťovaného kopolymeru allyldextranu a Ν,Ν'-methylenbisakrylamidu, která frakcionuje globulámí proteiny o molekulové hmotnosti mezi 20 000 a 8 000 000;(h) promývání této afinitní chromatografické pryskyřice za použití 20 mM HC1 k odstranění proteinů, které nejsou rDSPA al a neproteinových nečistot;(i) eluování vázaného rDSPA al z afinitní chromatografické pryskyřice za použití pufru, který obsahuje 200 mM glycinu, při hodnotě pH mezi 4 a 5, za získání rDSPA al s čistotou rDSPA al přinejmenším 80 % celkového podílu proteinů.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/597,059 US5731186A (en) | 1996-02-05 | 1996-02-05 | Method for the production of rDSPA α1 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ245598A3 CZ245598A3 (cs) | 1999-01-13 |
| CZ294827B6 true CZ294827B6 (cs) | 2005-03-16 |
Family
ID=24389906
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ19982455A CZ294827B6 (cs) | 1996-02-05 | 1997-01-31 | Způsob čištění rekombinantního aktivátoru plazminogenu alfa1 ze slin Desmondus rotundus (rDSPA alfa1) z kondicionovaného média |
Country Status (22)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5731186A (cs) |
| EP (1) | EP1015568B1 (cs) |
| JP (1) | JP3805378B2 (cs) |
| KR (1) | KR100508043B1 (cs) |
| CN (1) | CN1242059C (cs) |
| AT (1) | ATE233316T1 (cs) |
| AU (1) | AU706286B2 (cs) |
| CZ (1) | CZ294827B6 (cs) |
| DE (1) | DE69719382T2 (cs) |
| DK (1) | DK1015568T3 (cs) |
| ES (1) | ES2193349T3 (cs) |
| HU (1) | HU223902B1 (cs) |
| IL (1) | IL124952A (cs) |
| NO (1) | NO322527B1 (cs) |
| PL (1) | PL186410B1 (cs) |
| PT (1) | PT1015568E (cs) |
| RU (1) | RU2223315C2 (cs) |
| SK (1) | SK284179B6 (cs) |
| TW (1) | TW385313B (cs) |
| UA (1) | UA62925C2 (cs) |
| WO (1) | WO1997029188A1 (cs) |
| ZA (1) | ZA97948B (cs) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100436655B1 (ko) * | 2001-07-25 | 2004-06-22 | (주)엘피스바이오텍 | 광범위한 단백질에 적용할 수 있는 단백질의 농축 및정제 방법 |
| DE10153601A1 (de) * | 2001-11-02 | 2003-05-22 | Paion Gmbh | DSPA zur Behandlung von Schlaganfall |
| WO2007134617A1 (en) * | 2006-05-19 | 2007-11-29 | Paion Deutschland Gmbh | Use of desmodus salivary plasminogen activator (dspa) for treating venous thromboembolism |
| AR068914A1 (es) * | 2007-10-18 | 2009-12-16 | Paion Deutschland Gmbh | Uso de un activador de plasminogeno para la preparacion de un medicamento para el tratamiento de apoplejia |
| WO2011107299A2 (en) * | 2010-04-16 | 2011-09-09 | Paion Deutschland Gmbh | Method for the manufacture of recombinant dspa alpha1 |
| US20120258519A1 (en) * | 2011-04-10 | 2012-10-11 | Therapeutic Proteins Inc. | Protein Harvesting |
| CN107921407B (zh) | 2015-06-05 | 2022-07-05 | 格雷斯公司 | 生物处理吸附澄清剂及其制备和使用方法 |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3512910A1 (de) * | 1985-04-11 | 1986-10-16 | Behringwerke Ag, 3550 Marburg | Verfahren zur reinigung von plasminogenaktivatoren |
| US4721572A (en) * | 1985-07-12 | 1988-01-26 | Miles Laboratories, Inc. | Purfication of blood clotting factors and other blood proteins on non-carbohydrate sulfated matrices |
| US4898825A (en) * | 1986-05-07 | 1990-02-06 | Mitsui Toatsu Chemicals, Incorporated | Methods for purification of single-chain and double-chain tissue plasminogen activator |
| JPS6463378A (en) * | 1986-08-11 | 1989-03-09 | Mitsui Toatsu Chemicals | Separation of single stranded tpa and double standard tpa |
| US4929560A (en) * | 1988-02-03 | 1990-05-29 | Damon Biotech, Inc. | Recovery of tissue plasminogen activator |
| DK176140B1 (da) * | 1988-07-20 | 2006-09-25 | Schering Ag Patentabteilung | Flagermusspyt-plasminogenaktivatorer |
| CA2046632C (en) * | 1989-02-13 | 1999-05-11 | Schering Aktiengesellschaft | Thrombolytic from vampire bat saliva |
| DE3943241A1 (de) * | 1989-12-22 | 1991-06-27 | Schering Ag | Thrombolytisch wirkendes kombinationspraeparat |
| US5141862A (en) * | 1990-04-17 | 1992-08-25 | Smithkline Beecham Corporation | Method of purifying tpa or plasminogen activator using a tripeptide of the formula: -X-Y-argininal wherein X and Y are selected from the group consisting of pro,phe,trp and tyr |
-
1996
- 1996-02-05 US US08/597,059 patent/US5731186A/en not_active Expired - Lifetime
-
1997
- 1997-01-31 UA UA98094695A patent/UA62925C2/uk unknown
- 1997-01-31 EP EP97901624A patent/EP1015568B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-01-31 HU HU9901029A patent/HU223902B1/hu active IP Right Grant
- 1997-01-31 RU RU98116622/12A patent/RU2223315C2/ru active
- 1997-01-31 ES ES97901624T patent/ES2193349T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-01-31 AU AU15462/97A patent/AU706286B2/en not_active Expired
- 1997-01-31 PT PT97901624T patent/PT1015568E/pt unknown
- 1997-01-31 DE DE69719382T patent/DE69719382T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-01-31 CZ CZ19982455A patent/CZ294827B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1997-01-31 SK SK1032-98A patent/SK284179B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1997-01-31 DK DK97901624T patent/DK1015568T3/da active
- 1997-01-31 KR KR10-1998-0706036A patent/KR100508043B1/ko not_active Expired - Lifetime
- 1997-01-31 CN CNB971920818A patent/CN1242059C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1997-01-31 PL PL97328146A patent/PL186410B1/pl unknown
- 1997-01-31 AT AT97901624T patent/ATE233316T1/de active
- 1997-01-31 WO PCT/EP1997/000441 patent/WO1997029188A1/en not_active Ceased
- 1997-01-31 JP JP52796297A patent/JP3805378B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1997-01-31 IL IL12495297A patent/IL124952A/en not_active IP Right Cessation
- 1997-02-05 ZA ZA9700948A patent/ZA97948B/xx unknown
- 1997-08-12 TW TW086111545A patent/TW385313B/zh not_active IP Right Cessation
-
1998
- 1998-08-04 NO NO19983579A patent/NO322527B1/no not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2631645B2 (ja) | 新規化合物、その製法及びそれを含む医薬組成物 | |
| JPH0378375B2 (cs) | ||
| JPH05170666A (ja) | プロテインｃを含有し血栓溶解活性を有する非経口投与が可能な薬剤 | |
| CZ294827B6 (cs) | Způsob čištění rekombinantního aktivátoru plazminogenu alfa1 ze slin Desmondus rotundus (rDSPA alfa1) z kondicionovaného média | |
| AU6336986A (en) | Methods for the recovery of tissue plasminogen activator | |
| AU611932B2 (en) | Novel complex | |
| EA026017B1 (ru) | Фармацевтические композиции тенектеплазы | |
| CA2245554C (en) | Method for the production of rdspa .alpha.1 | |
| KR900002345B1 (ko) | 정상인의 결장세포로 부터 플라스미노겐 활성인자의 대량 생산방법 | |
| JPS61267524A (ja) | フィブリン親和性ウロキナーゼ複合体含有血栓溶解剤 | |
| JPH0223158B2 (cs) | ||
| HK1018795B (en) | METHOD FOR THE PRODUCTION OF rDSPAα I | |
| US5234686A (en) | Human tissue plasminogen activator consisting essentially of t-PA residues to 160 to 527, pharmaceutical compositions and methods of treatment | |
| EP0275282A1 (en) | Process for purifying a plasminogen activator | |
| CA1338551C (en) | Medicament for thrombotic disorder containing t-pa | |
| JPS6336781A (ja) | 高純度組織性プラスミノ−ゲン活性化因子の製法 | |
| EP0281579A1 (en) | Cofactor of prourokinase |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MK4A | Patent expired |
Effective date: 20170131 |