CZ245598A3

CZ245598A3 - Způsob výroby rDSPA alfa 1

Info

Publication number: CZ245598A3
Application number: CZ982455A
Authority: CZ
Inventors: Michael Mccaman; Erno Pungor; Carol Souders; Mei P. Tan
Original assignee: Schering Aktiengesellschaft
Priority date: 1996-02-05
Filing date: 1997-01-31
Publication date: 1999-01-13
Also published as: HUP9901029A2; DE69719382D1; HU223902B1; ES2193349T3; SK103298A3; HUP9901029A3; ZA97948B; TW385313B; KR19990082306A; PL186410B1; IL124952A; NO983579L; PL328146A1; JP3805378B2; CN1242059C; UA62925C2; CZ294827B6; IL124952A0; JP2000504565A; WO1997029188A1

Description

Předložený vynález se týká způsobu výroby rDSPA al. Vynález se zejména týká izolace a čistění rekombinovaného aktivátoru plazminogenu al (rDSPA al) ze slin Desmondus rotundus, rDSPA al, čištěného tímto způsobem, farmaceutických kompozic obsahujících takto čištěný rDSPA al a způsobů léčení pomocí rDSPA al.

Dosavadní stav techniky

Trombózy vznikají vytvořením krevní sraženiny v krevních cévách. Je možné rozlišovat mezi žilními trombózami, které zahrnují plicní embólii a tepennými trombózami, které zahrnují akutní infarkt myokardu. Plicní embólie a srdeční infarkt jsou lidský život ohrožující příhody, které vyžadují urychlenou lékařskou pomoc.

Obecně rozšířený způsob terapie takovýchto tepenných a žilních trombóz je použití aktivátorů plasminogenu za účelem provedení enzymatické trombolýzy (Collen a kol., Ann. Rev. Med., (1988), 39, 405-423). Tyto látky, zvané trombolytika, přeměňují plasminogen, neaktivní proenzym fibrinolytického systému v krvi, na plasmin, což je aktivní proteolytický • · enzym. Plasmin poté rozpouští vláknitou látku fibrin, která je základní složkou krevní sraženiny; to vede k opětovnému otevření ucpaných cév a k obnovení toku krve v těchto cévách. Nicméně, jelikož je plasmin relativně .nespecifická proteáza, může také lýzou proteinů v krvi zničit složky, nepostradatelné pro intaktní hemostázu (jako například fibrinogen) a tudíž se zvyšuje riziko krvácení.

První enzymatická trombolytika, streptokináza a urokináza, jsou sloučeniny, které, jakmile jsou vstříknuté do oběhu, soustavně přeměňují plasminogen na plasmin a indukují systemickou proteolýzu. Trombolytické způsoby léčení, které používají tyto sloučeniny, jsou tudíž doprovázené komplikacemi, které se vztahují ke krvácení. Byly sice vyvinuty novější způsoby trombolytické terapie, které jsou založené na použití aktivátorů plasminogenu tkáňového typu, obvykle nazývaných t-PA (tissue Plasminogen Activators), nicméně jsou omezeny množstvím nevýhod, zahrnujících vážné komplikace spojené s krvácením, relativně častý výskyt reokluze, neschopnost být stejnoměrně účinné a náchylnost k inaktivaci inhibitory plasminogenových aktivátorů, jako jsou například inhibitor plasminogenového aktivátoru typu 1 (PAI1) (Loskutoff, Seminars in Trombosis and Hemostasis, Vol. 14, No. 1 (1988) ) .

Později byly purifikovány plasminogen aktivující proteiny ze slin a ze slinných žláz netopýra vampýra (Desmondus rotundus} (publikovaná evropská patentová přihláška 0 383 417 (Baldus a kol.); publikovaná evropská patentová přihláška 0 352 119 (Duong a kol.)).

Tyto aktivátory plasminogenu (nazývané DSPA) jsou serinové proteázy, které katalyzují přeměnu plasminogenu na plasmin, které avšak jeví větší selektivitu na plasminogen vázaný na fibrin a z tohoto důvodu mohou být spojovány se .snižující se závažností a frekvencí krvácení, jestliže jsou používány pro trombolytickou terapii. Kromě toho není DSPA snadno inaktivován plasmovými inhibitory, jako například PAI-1 a z tohoto důvodu mohou být spojovány s menší frekvencí reokluzí.

V netopýřích slinách mohou být nalezeny dvě formy DSPA s vysokou molekulovou hmotností (označované al a a2) , obě z nich sestávají z několika domén, zahrnujících proteázovou doménu a obě z nich jsou schopné pevné vazby na plasminogen za přítomnosti fibrinu. Různé formy DSPA byly produkovány v kulturách savčích buněk rekombinantní biotechnologií (Krátzschmer a kol., Gene (1991), 105: 229-237; publikovaná evropská patentová přihláška 0 352 119 (Duong a kol.)) a bylo popsáno Čistění rekombinantně vyrobeného DSPA (rDSPA) v malém měřítku (Witt a kol., Blood (1992), 79: 1213-1217). Izolace a čistění rDSPA v komerčním měřítku a do čistoty, vhodné pro použití ve farmaceutických přípravcích, nebyly doposud objeveny.

Předložený vynález se týká izolace a čistění rekombinantního DSPA al (rDSPA al) v komerčním měřítku. Vynález, tak jak je popsán, vede k dostatečně čistému a stabilnímu rDSPA al, aby mohl být komerčně prodejný a klinicky použitelný.

• 0

0 · ·· · ·· 00 0 0 0 0 ·0 • 0000 0 0 00

0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0

000 0· * ·

Podstata vynálezu

Přehled vynálezu

Předložený vynález se týká způsobu izolace a čistění rDSPA al v komerčním měřítku a vede k produktu, který je vhodný pro klinické použití.

V souladu s tím se předmět vynálezu týká způsobu čistění rDSPA al z biologického prostředí, který zahrnuje následující kroky :

(a) přivedení prostředí na kationtovou iontoměničovou pryskyřici za aplikačních podmínek, které vedou k,selektivní vazbě rDSPA al na kationtovou iontoměničovou pryskyřici;

(b) popřípadě promývání kationtové iontoměničové pryskyřice za účelem odstranění proteinů, které nejsou rDSPA al, a neproteinových nečistot;

(c) selektivní vymývání vázaného rDSPA al z kationtové iontoměničové pryskyřice;

(d) přivedení vymyté látky, která obsahuje rDSPA al a která byla získána v kroku (c), na hydrofobní interaktivní pryskyřici za aplikačních podmínek, které vedou k selektivní vazbě rDSPA al na hydrofobní interaktivní pryskyřici;

(e) popřípadě promývání hydrofobní interaktivní pryskyřice za účelem odstranění proteinů, které nejsou rDSPA al, a • · • · · · ·· ·· ·· • ·

neproteinových nečistot;

(f) selektivní vymývání vázaného rDSPA al z hydrofobní interaktivní pryskyřice;

(g) přivedení vymyté látky, která obsahuje rDSPA al a která byla získána v kroku (f), na afinitní chromatografickou pryskyřici za aplikačních podmínek, které vedou k selektivní vazbě rDSPA al na afinitní chromatografickou pryskyřici:

(h) popřípadě promývání afinitní chromatografické pryskyřice za účelem odstranění proteinů, které nejsou rDSPA al, a neproteinových nečistot;

(i) selektivní vymývání vázaného rDSPA' al z afinitní chromatografické pryskyřice, za účelem produkce v podstatě čistého rDSPA al ve vodném roztoku.

Dalším předmětem vynálezu je protein rDSPA al, který byl izolován a čištěn způsobem podle předloženého vynálezu.

Další předmět vynálezu se týká farmaceutické kompozice obsahující rDSPA al, který byl izolován a čištěn způsobem podle předloženého vynálezu, a farmaceuticky přijatelný excipient.

Dalším předmětem vynálezu je způsob použití rDSPA al, izolovaného a čištěného způsobem podle předloženého vynálezu, pro léčení člověka s tepennými nebo s žilními trombózami.

• · · «φφφ φ · φ · φ φ φφφ · φ φφ ♦ · ·· • · φ φ φ φφ ·· φφφφ · φ φ φ φ φ φ φ φφφ • Φ φφφ φφ φφ ·· ··

Detailní popis vynálezu

Tak, jak jsou používány v popise předloženého vynálezu a přiložených nárocích, pokud není řečeno jinak, následující výrazy mají uvedený význam:

Výraz biologické prostředí se vztahuje na přesně určené složení solí a živin používaných za účelem rozmnožování buněk v kultuře.

Výraz ovlivněné prostředí se vztahuje na biologické prostředí, ve kterém buňky vyrostly. Prostředí bylo z tohoto důvodu ovlivněno růstem buněk a obsahuje produkty vyloučené do prostředí během buněčného růstu. Tyto produkty mohou být buď odpadní produkty vytvořené během růstu nebo proteiny, který byly produkovány a vylučované do prostředí buňkami během růstu.

Výraz „kationtové iontoměničová pryskyřice se vztahuje na přírodní nebo umělou látku, obvykle pevnou látku, která je schopná vyměňovat vázané ionty za ionty z okolního tekutého prostředí.

Kationtové iontoměničová pryskyřice má záporné funkční vázané ionty a vyměňuje odpovídající kladné ionty.

Aktivní složky ionto-ěničů v komerčně dostupných kationových měničích jsou obvykle -C₆H₅O-, -S0₃~, -C00”, -P0₃ nebo -AsO₃“. Slabší kationtové iontoměničové pryskyřice jsou ty, ve kterých vazebná síla kationtů není vysoká, jako například • · · · · · • · · · • · · · · · • · · · · • · · · ·· ··· ty, které obsahují karboxylové nebo karboxyalkylové funkční skupiny. Dále nejsou slabší kationtové iontoměničové pryskyřice obvykle úplně disociované při kyselém pH. Konkrétní slabá kationtová iontoměničová .pryskyřice, používaná ve způsobu podle předloženého vynálezu, sestává z matrice částic oxidu křemičitého, kovalentně vázaných na polyethylenimin silanu, ve kterém aminoskupiny polyethyleniminu byly modifikovány karboxylovými skupinami. Takováto pryskyřice je komerčně dostupná od společnosti J.T. Baker pod chráněným obchodním označením chromatografická pryskyřice Widepore CBX®.

Výraz hydrofobní interaktivní pryskyřice se vztahuje přírodní nebo umělou látku, obvykle pevnou látku, která obsahuje elektricky nenabité skupiny, jako například methylovou skupinu, ethylovou skupinu nebo další alkylové skupiny. Tyto skupiny vytvářejí hydrofobní vazby se skupinami na proteinových složkách, které procházejí pryskyřicí a vedou k oddělení proteinů, založenému na síle interakce mezi proteiny a pryskyřicovými skupinami. Konkrétní hydrofobní interaktivní pryskyřice je složena ze semirigidních sférických granulí, které jsou syntetizované kopolymerizací ethylenglykolu a polymerů typu methakrylátu, modifikovaných butylovými skupinami. Takováto pryskyřice je komerčně dostupná od společnosti Toso-Haas, pod chráněným obchodním označením Toyo-Pearl® 650M C4.

Výraz afinitní chromatografická pryskyřice se vztahuje na přírodní nebo umělou látku, obvykle pevnou látku, která je používaná pro čistění proteinů. Pryskyřice oddělující proteiny je založená na afinitě, která nastává mezi • · • · ···· ·· · · • · · ···· ···· • · · · · · ··· · ··· • · · · · ·· ·· ♦·· · · ·· · ···· · · · ·· 9 · · · · · · * · · · skupinami proteinů a' skupinami pryskyřice. V předloženém vynálezu je pryskyřice, používaná jako afinitní chromatografická pryskyřice, obvykle používána jako velikostně vylučovací za účelem oddělení proteinů na základě jejich velikosti. Konkrétní afinitní chromatografická pryskyřice je zesíťovaný kopolymer allyl dextranu a N,N'~ methylen bisakrylamidu ve formě granulí, které jsou schopné frakcionace globularních proteinů mezi 20.000 a 8.000.000 kDa. Takováto pryskyřice je komerčně dostupná od společnosti Pharmacia, pod chráněným obchodním označením Sephacryl® S400.

Výraz alkyl se vztahuje na monovalentní radikál s lineárním nebo rozvětveným řetězcem, který sestává výhradně z uhlíku a vodíku, neobsahuje nenasycené vazby a obsahuje jeden až osmnáct atomů uhlíku, výhodně jeden až šest atomů uhlíku, jako například radikál methyl, radikál ethyl, radikál n-propyl, radikál isopropyl (1-methylethyl) , radikál n-butyl, radikál t-butyl (1,1-dimethylethyl), radikál sek.butyl (1-methylpropyl), radikál n-pentyl, radikál n-hexyl a podobně.

Výraz v podstatě čistý tak, jak je používán pokud se jedná o čistotu produktu rDSPA al po provedení schématu čistění, upřesněného v popise předloženého vynálezu, znamená, že více než 80 % celkového množství proteinu v konečném vyčištěném produktu je rDSPA al, výhodně více než 90 % celkového izolovaného proteinu je rDSPA al a nejvýhodněji 98 % celkového izolovaného proteinu je rDSPA al. Obsah a čistota proteinu jsou určovány reverzní fázovou HPLC (vysokoúčinná > · · · · • · • · ♦» ► · · « » · · <

·· ·· • ·· • ·

kapalinová chromatografie) a gelovou analýzou SDS-PAGE (polyakrylová gelová elektroforéza s použitím dodecylsulfátu sodného).

Výraz proteiny, které nejsou rDSPA al a neproteinové nečistoty se vztahuje na všechny materiály, jiné než rDPSA al, nalezené v biologickém prostředí, ze kterého byl rDSPA al čištěn.

Výraz farmaceuticky přijatelný excipient se vztahuje na přijatelný nosič a kteroukoli farmaceuticky přijatelnou pomocnou látku, u nichž je požadováno, aby byly slučitelné s fyziologickými podmínkami, které jsou netoxické a nepůsobí nepříznivě na biologickou účinnost farmaceutické kompozice v něm suspendované nebo obsažené. Vhodné excipienty by mohly být sloučeniny jako například mannit, sukcinát (jantaran), glycin nebo sérový albumin.

Výraz „terapeuticky účinné množství se vztahuje na takové množství rDSPA al, které, když je podáváno člověku majícímu jeho potřebu, je dostatečné, jak je níže uvedeno, pro uskutečnění léčby chorobných stavů charakterizovaných trombózou. Množství sloučeniny, které tvoří „terapeuticky účinné množství se mění v závislosti na sloučenině, chorobném stavu a jeho závažnosti, ale může být určeno běžným způsobem odborníkem, který má znalosti v daném oboru a je seznámen s vynálezem.

Výrazy „léčení nebo „léčba, jak jsou používány v tomto vynálezu, pokrývají léčbu chorobného stavu člověka, přičemž • ·

- 10 44 4444 • · 4 · · • 4 444 4 ·

4 4 4 · ·

4 4 4 4

444 44

44

4 4 ·

4 444

44 4444 4

4 4 4 4

44 44 chorobný stav je charakterizován trombózou a uvedené výrazy zahrnuj í:

(i) zabránění vzniku chorobného stavu u člověka, obzvláště pokud se jedná o člověka s predispozicí vzhledem k tomuto chorobnému stavu, u kterého ale ještě diagnóza neprokázala, že jej má;

(ii) inhibice chorobného stavu, to jest zastavení jeho vývinu; nebo (iii) ulehčení chorobného stavu, to jest způsobení ústupu chorobného stavu.

Výrazy případný nebo popřípadě znamenají, že následně popsaný výskyt okolností může nebo nemusí nastat a že popis předloženého vynálezu zahrnuje příklady, kde jmenovaná událost nebo okolnost nastane a příklady, ve kterých jmenovaná událost nebo okolnost nenastane.

Popis výhodných provedení

Předložený vynález se týká způsobu izolace a čistění rDSPA al v komerčním měřítku a ve formě, vhodné pro použití ve farmaceutických přípravcích. rDSPA al je produkovaný fermentací savčí buněčné linie, schopné sekrece produkovaného rDSPA al do kultivačního prostředí. Ovlivněné prostředí, jinými slovy takové prostředí, které se získá z bioreaktoru, obsahujícího savčí buňky, je odebráno a rDSPA al je oddělen od jiných proteinů a nečistot posloupností

- 11 • · · · · · • · • ···

99

9 9 9

9 99

9 9 9 9 9 9 · • · · 9 9 · · ·· ··· ·· ·· ·· ·· • 9 9 9

9 99

9 9 · • 9 9 chromatografických kroků, začínajících použitím kationtové iontoměničové pryskyřice, po kterém následuje selektivní vymývání rDSPA al z pryskyřice. Frakce rDSPA al, obdržená selektivním vymývání z kationtové iontoměničové pryskyřice, je potom aplikována na hydrofobní interaktivní pryskyřici, kde selektivní vymývání z matrice představuje druhý stupeň čistění. Vymytá frakce rDSPA al je potom aplikována na afinitní chromatografickou pryskyřici, kde selektivní vymývání poskytuje další stupeň čistění. Čištěný rDSPA al je dále koncentrován obvyklými technikami, jako například ultratitrací a potom je lyofilizován.

Konkrétně je vynález prováděn, jak je níže popsáno.

A. Izolace a čistění

1. Kultivační prostředí a buněčné linie

Kultivační prostředí zahrnuje základní prostředí vhodné pro růst savčích buněk, jako například DMEM nebo Hamovo prostředí F12. Prostředím je zvláště Williamovo E prostředí (Williams, G.M. and ' Gunn, J.M, Exp. Cell Res., (1974) 89:139). Ve fázi růstu naočkovaných buněk bude základní prostředí obvykle doplněno zdrojem séra, typicky hovězím sérem (BS) nebo sérem novorozeného telete (CS), přítomného v hmotnostní koncentraci v rozmezí od přibližně 0,1 % do přibližně 10 %, obvykle přítomného v hmotnostní koncentraci v rozmezí od přibližně 1 % do přibližně 5 %. Mohou být přidány další růstové faktory nebo pufry, jako například HEPES. Během perfúzní růstové fáze je koncentrace séra

4

4444

4 4

4 444

4 4

4· obvykle udržována na stejné koncentraci, která je typicky v rozmezí od přibližně 3 % do přibližně 8 %, obvykle okolo 5

Buněčné linie vhodné pro použití podle předloženého vynálezu zahrnují savčí buněčné linie schopné neadherentního růstu v suspenzní kultuře a/nebo adherentního růstu na mikronosičových granulích. Konkrétní buněčné linie, které vyhovují těmto požadavkům zahrnují buněčné linie vaječníků čínského křečka (CHO), BHK buňky, nebo buněčné linie HEK293 (Krátzschmer a kol., Gene, (1991) 116: 281-284; Petři, T., J. BioTechnology, (1995) 39: 75-83).

Zvláště výhodná CHO buněčná linie je DXB11,, která je popsaná v Urlaub, G. and Chasin, L.A., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, (1980) 77: 4216-4220. Tyto buňky byly kotransfektovány vektory exprese pSVPAIl a pUDHFRl, které zahrnují sekvence kódující DSPA cti respektive myší dihydrofolátovou reduktázu (Petři, T., ibid). Transformovaná CHO buněčná linie, používaná v předloženém vynálezu, je označovaná CD16 a byla deponována v American Type Culture Collectíon, Rockvílle, Maryland (ATCC) pod označením ATCC # CRL 12023.

2. Růst kultury a produkční fáze

Po naočkování buď sloučenými kulturami získanými centrifugací a nebo částí jiných kultur z bioreaktoru se buněčná kultura rozroste na produkční hustotu, typicky v rozmezí okolo l-40xl0⁶ buňek/ml.

- 13 ·· ···· ·· ·· ·· ·· • · · ···· · · · · • ···· · ··· · ··· • · · · · ·· ·· ·· · · · • · · · · · · ··· ·· ··· ·· ·· ·· ··

Po dosažení požadované hustoty buněk na mikronosičových granulích je zahájena perfúze čerstvého prostředí, doplněného sérem. Alternativně mohou buňky růst- v suspenzní kultuře. Typicky bude hmotnostní koncentrace séra v čerstvém prostředí v rozmezí od přibližně 2 % do přibližně 10 %, typičtěji bude hmotnostní koncentrace séra v rozmezí od přibližně 3 % do přibližně 8 %, a obvykle bude hmotnostní koncentrace séra v rozmezí okolo 5 %. Rychlost perfúze bude zpočátku v rozmezí od přibližně 0,25 do přibližně 0,75 násobku objemu kultury/den, typicky v rozmezí okolo 0,5 násobku objemu kultury/den. Se zvyšujícím se růstem buněk je zvyšována rychlost perfúze až ke konečné rychlosti v rozmezí od přibližně 1,5 do přibližně 2,5 násobku objemu kultury/den, typicky během doby od přibližně 2 do přibližně 10 dnů. Během expanze jsou sterilní, předem ekvilibrované granule mikronosiče přidávány do reaktoru aby se udržel poměr množství granulí mikronosiče k buněčné hustotě v rozmezí od přibližně 0,5 do přibližně 1,0 gramů mikronosičových granulí na 10⁹ buňek. Granule mikronosiče jsou výhodně přidávány do reaktoru použitím nasávacího zařízení vzorkovací trubicí.

Když hustota buněk dosáhne produkční úrovně, bude přidávání séra do čerstvého kultivačního prostředí omezeno, typicky na koncentraci v rozmezí od přibližně 0,1 do přibližně 2,0 hmotnostních procent, normálně 1 %.

Kultura v produkční fázi vyžaduje pozornost, týkající se mnohých parametrů fermentace: teplota, pH a stupeň rozpuštěného kyslíku jsou monitorovány denně. Dodatečné •« »99t

9 9 · · ♦ · · · · · • « ··· · · ·· · · ♦· • · 9 · · ·· · * ···· *

	- 14 -	• · • · • ·	• · · · ··« ·· ··	• · · * ·· ··
kultivační prostředí,	sérum a alkalické	látky je	třeba
dodávat, jakmile se	vyčerpáj í	zásobní	nádrže.	Vzorky
ovlivněného prostředí,	definovaného jako	prostředí,	které
obsahuje produkt, jsou	analyzovány	běžným	způsobem ,	alespoň

každé dva dny, aby se zajistilo, že produkce pokračuje bez kontaminace. '

Způsob odběru ovlivněného prostředí z bioreaktorů minimalizuje odebírání buňek použitím oddělovacích textilií s póry o průměru přibližně 100-150 mikronů. Suspenzní kultury používají vírový filtr za účelem udržení buňky v bioreaktorů. Odebrané prostředí je odebíráno do sterilních zásobníků a uchováváno po dobu až 38 dnů před dalším zpracováním. rDSPA al, který se nachází v látce shromážděné z bioreaktorů, byl vylučován z CHO buněk ve zpracované formě, která je plně biologicky aktivní a která je připravena k čistění.

3. Chromatografie kationtovou výměnou

Po nastavení pH na hodnotu v rozmezí od přibližně 4 do přibližně 6, výhodně okolo 5, je rDSPA al, který se nachází v ovlivněném prostředí, aplikován na kationtovou iontoměničovou matrici (obvykle plněnou ve formě kolony) za podmínek zvolených tak, aby byla zajištěna v zásadě úplná vazba rDSPA al na matrici. I když jiné proteiny budou také vázané, úvodní vazebná etapa poskytuje první stupeň separace, neboť množství nežádoucích nebo kontaminujících proteinů a jiných sloučenin, jako například fenolová červeň, v ovlivněném prostředí nebude schopno vazby na matrici a

4

4 4 4

4 44 tudíž proteče matricí. rDSPA al je dále čištěn selektivním vymýváním z matrice, kdy vymývání může být provedeno buď vymýváním po krocích nebo vymýváním lineárním gradientem zvyšující se iontové síly pufru. V obou případech je rDSPA al odebírán za účelem dalšího čistění, jak bude popsáno níže.

Vhodné kationtové iontoměničové matrice zahrnují množství různých pryskyřic, modifikovaných kationtovými funkčními skupinami, které jsou schopné vázat rDSPA al. Výhodné jsou umělé pryskyřice, jako například ty, které sestávají z částic silikagelu, zesíťované agarózy nebo zesíťovaných polymethakrylátových polymerů, modifikovaných katintovými funkčními skupinami, jako například karboxylová skupina, karboxymethylová skupina, sulfonylová skupina, fosforylová skupina a podobně. Zvláště použitelné jsou relativně slabé pryskyřice, jako například takové, které mají karboxylovou nebo karboxyalkylovou funkční skupinu, jako je například karboxymethylová skupina nebo karboxyethylová skupina. Zvláště výhodná pryskyřice sestává z matrice z částic oxidu křemičitého, kovalentně vázaných na polyethylenimin silan, s amino skupinami polyethylenimin silanu modifikovanými karboxylovými skupinami. Takováto pryskyřice je Baker Vadepore CBX® (velikost granulí 45mm), která je komerčně dodávaná společností J.T. Baker.

Vazebné podmínky a podmínky vymývání se mění v závislosti na síle vazby kationtové pryskyřice. Pro slabé kationtové pryskyřice, jako například Baker Vadepore CBX, může být vazba vytvořena při nízké iontové síle za mírně kyselých

- 16 ·· ····

999

99 99 99

9 9 9 · · · ·

9 99 9 9 99 • « · · · < 9 9 9 999 9 · ·· · 9 9 9 9 9 9 9

999 99 99 99 99 podmínek, typicky pH od 4 do 7, výhodně okolo pH 5. Po promývání matrice může být rDSPA al selektivně vymyt vystavením matrice mobilní fázi, mající zvýšenou iontovou sílu, používající buď lineární vymývání nebo vymývání po krocích. V případě pryskyřice Baker Videpore CBX bude rDSPA al vymyt při pH okolo 7,5, s koncentrací sole mezi přibližně lOOmM a přibližně 500mM NaCl. Kolona může potom být stripována a regenerována za účelem následného použití.

S matricí Baker Widepore CBX, bude pryskyřice zprvu výhodně ekvilibrovaná pufrem lOOmM octanu sodného s hodnotou pH 5. Pufr je aplikován na kolonu s rychlostí průtoku rovnou 0,2 násobku objemu až 2,0 násobku objemu kolony za minutu až do doby, než se pH vystupující tekutiny ustálí na 5. Ovlivněné prostředí, obsahující rDSPA al, je filtrováno 1,2 um filtrem a potom titrováno až na pH mezi 4 a 7, nej výhodně ji 5, za použití ledové kyseliny octové. Prostředí je potom přiváděno do kolony, typicky za použití zubového čerpadla, při rychlosti toku nepřesahující dvojnásobek objemu kolony za minutu. Za účelem odstranění částic, které by mohly ucpat matrici kolony, je použit filtr.

Matrice kolony je potom znovu ekvilibrována ekvilibračním octanovým pufrem až do doby, než se pH stabilizuje na 5, což typicky vyžaduje množství pufru od přibližně dvojnásobku do přibližně sedminásobku objemu kolony. Potom je na kolonu aplikován promývací pufr, obsahující 50mM fosforečnanu sodného, pH 7,5, rychlostí od přibližně 0,1 násobku do přibližně 0,2 násobku objemu kolony za minutu až do doby, než se pH vymyté látky stabilizuje na 7,5. rDSPA al je potom • 4

- 17 »4 4444

4 4 4 4 4 vymyt z kolony za použití vymývacího pufru obsahujícího 50mM fosforečnanu sodného, 500mM chloridu sodného, pH 7,5. Vymývací pufr je ponechán procházet kolonou až do doby, kdy už nedochází k vymývání proteinu z kolony. Stripovací pufr, obsahující 2,0 M octanu sodného, pH 8 je potom aplikován na kolonu, aby byla regenerována matrice. Zásobní pufr obsahuje 10 % kyseliny octové a 45 % ethanolu.

4. Hydrofobní interaktivní chromatografie

Frakce rDSPA cel, shromážděná z matrice kationtového iontoměniče je potom aplikovaná na hydrofobní interaktivní matrici (obvykle ve formě kolony) za podmínek, které umožní vazbu rDSPA al na matrici, typicky za vysoké iontové síly a nízkého pH. rDSPA al je potom selektivně vymyt zvýšením koncentrace organického rozpouštědla mobilní fáze aplikované na kolonu, za použití lineárního nebo krokového gradientu. Frakce rDSPA al je odebírána z kolony za účelem dalšího čistění. Tento krok sníží 100 až 1000 krát DNA kontaminaci a inaktivuje potenciální virové nečistoty.

zahrnují velké které obsahují jako například

Vhodné hydrofobní interaktivní matrice množství elektricky nenabitých pryskyřic, kovalentně připojené hydrofobní skupiny, propylová skupina, butylová skupina, oktylová skupina, fenylová skupina a podobně. Pryskyřice mohou být zesíťované organické polymery jako například styren-divinylbenzen, oxid křemičitý, agaróza, polymethakrylát, nebo kterýkoli z velkého množství jiných vhodných částicových nosičů. Zvláště výhodná pryskyřice sestává ze semirigidních sférických

- 18 • · · · · · ·· • · · · ···· • · · · · · · · • · ·· ·· · · · · · • · · · · · · • · · · ·· *· granulí, které jsou syntetizované kopolymerací ethylenglykolu a polymerů typu methakrylátu, modifikovaných butylovými skupinami. Takováto pryskyřice je Toyo-Pearl® 650M (granule 40-90 pm) , která je komerčně dostupná od společnosti Toso-Haas.

Vazba na hydrofobní interaktivní kolonu je provedena za podmínek vysoké iontové sily, obvykle při kyselém pH od 3 do 5, obvykleji okolo pH 4. V podstatě všechen protein obsažený ve frakci rDSPA al, která byla vymyta z kationtové iontoměničové pryskyřice, je vázán na hydrofobní interaktivní kolonu. Různé proteiny mohou být selektivně vymyty v závislosti na různých schopnostech hydrofobních interakcí s hydrofobními skupinami na matrici, to jest, v pořadí stoupající hydrofobicity proteinu. Vymývání kolony může být provedeno krokovým nebo lineárním gradientem, obvykle alkoholovým vymývacím rozpouštědlem jako například ethanol nebo isopropanol. Zvláště výhodný alkohol je ethylalkohol.

Ekvilibrace matrice Toyo-Pearl C4 může být výhodně provedena ekvilibračním pufrem, který obsahuje 50mM octanu sodného, 500mM chloridu sodného, pH 4. Poté, kdy je frakce rDSPA al z kolony iontoměniče titrována na pH 4, je aplikována na C4 matrici, matrice je potom znovu ekvilibrována ekvilibračním pufrem, který byl popsán výše. Kolona je následně promývána postupně za použití dvou pufrů, jak vyplývá z následujícího výkladu. První promývání (promývání 1) používá pufr, jehož objem činí alespoň dvojnásobek objemu kolony a který obsahuje 20mM HC1. Promývání je opakováno až do doby, než vystupující tekutina neobsahuje další protein, jak je patrno • · • · · ·

0 ·

- 19 0 0 0 · 0 00 00 0·0· · 00 0 0000 0 0 * • · 000 · 0 00 00 00 ze stálé UV absorbce. Matrice je potom promývána (promývání 2) za použití pufru, jehož objem činí nejméně desetinásobek objemu kolony a který obsahuje 19 % ethanolu, 20mM HC1 a v promývání se pokračuje pufrem obsahujícím 20,5.% ethanolu, 20 mM HC1 až do doby, dokud už není vymyt žádný další protein. Vymývání produktu rDSPA al je prováděno za použití pufru, který obsahuje 29 % ethanolu, 20mM HCl, pH 2,5. Po vymytí produktu je kolona stripována pufrem, jehož objem činí nejméně dvojnásobek objemu kolony a který obsahuje lOOmM NaOH. Matrice je uchovávána v pufru z promývání 1.

5. Afinitní chromatografie

Frakce rDSPA al odebraná z. hydrofobní interaktivní pryskyřice je dále aplikována na afinitní. matrici (obvykle ve formě kolony) za podmínek, které umožní vazbu rDSPA al na afinitní matrici. Zatímco rDSPA al zůstává vázaný na kolonu, nečistoty jsou vymyty promýváním kolony 20 mM HCl, jehož objem činí dvojnásobek až trojnásobek objemu kolony. Tento krok ulehčuje výměnu pufru, čímž napomáhá vytváření farmaceutického prostředku a zlepšuje rozpustnost a také pomáhá při inaktivaci/odstranění potenciální virové kontaminace. Výhodně je používán pufr, jehož objem činí 2,5 násobek objemu kolony. rDSPA al je potom selektivně vymyt za použití pufru, který obsahuje 200mM glycinu, volnou bázi o pH mezi 4 a 5. Frakce rDSPA al je odebírána, aby byla koncentrována.

V uvedeném vynálezu jsou pryskyřice používané jako afinitní pryskyřice ty, který jsou normálně používané jako molekulové • · · · • · • · · · * * · ···· • · · ·· · ··· · ··· « · · · · ·· ·« ···· · velikostně vylučovací pryskyřice. Vhodné afinitní matrice zahrnují pryskyřice sestávající ze zesíťovaného polymeru allyl dextranu a N,N'-methylen bisakrylamidu ve formě granulí o průměru mezi 25 a 75 μτη. Zvláště výhodná pryskyřice je Sephacryl 400®, která je komerčně dostupná od společnosti Pharmacia a je schopná frakcionace globulárních proteinů mezi 20.000 a 8.000.000 kDa.

Vazba rDSPA al na afinitní pryskyřici je dokončena za podmínek slabé iontové síly a nízkého pH. V podstatě všechen rDSPA al odebraný z hydrofobní interaktivní pryskyřice je vázán na kolonu. rDSPA al může být selektivně vymyt zvýšením pH a/nebo iontové síly. Vymývání může být provedeno krokovým nebo lineárním gradientem, obvykle vymývacím rozpouštědlem, které obsahuje 200mM glycinu, volné báze.

S matricí Sephacryl S-400 může být výhodně ekvilibrace provedena pufrem, který obsahuje 19 % ethanolu, 20mM HC1, až do doby, kdy již pH vystupující tekutiny zůstává neměněno. Na matrici je přiváděna frakce rDSPA al z hydrofobní interaktivní kolony a potom vymývána pufrem, který obsahuje 20mM HC1 až do doby, kdy je UV signál z vystupující tekutiny stálý. Vymývání vázaného rDSPA al je prováděno za použití pufru, který obsahuje 200mM glycinu. Po vymytí produktu je kolona stripována pufrem, jehož objem činí více než dvojnásobek objemu kolony, který obsahuje 100mM NaOH. Po provedení promývání matrice pufrem, jehož objem činí alespoň dvojnásobek objemu kolony (20mM HC1) , může být v tomto pufru matrice uchovávána.

• 4 « ·

- 21 • · · 4 • 4 4 4 4 · 4 • 4 φ · · 4 • 4 4 4 4

4 4 4 4 4 4

6. Koncentrace

Vyčištěný protein podle předloženého vynálezu může být potom koncentrován, typicky filtrací nebo podobným způsobem a může být po případě lyofilizován nebo jiným způsobem začleněn do obvyklého farmaceutického přípravku. Použitelné způsoby koncentrace a lyofilizace jsou dobře popsané v odborné literatuře.

B. Příprava farmaceutických forem

1. Farmaceutické kompozice

Tento vynález se týká činidla s významnou terapeutickou hodnotou, rDSPA al, čištěného popsanými způsoby, které může být použitelné při léčbě tepenných a žilních trombóz.

Rekombinantní DSPA al, čištěný jak je popsáno v tomto dokumentu, může být podáván pacientovi. Toto činidlo může být kombinováno za účelem terapeutického použití s jinými ingredienty, například s obvyklými farmaceuticky přijatelnými nosiči nebo ředidly a spolu s fyziologicky neškodnými stabilizátory a excipienty. Tyto kombinace mohou být sterilně filtrovány a zpracovány do dávkovačích forem, například lyofilizace v dávkovačích nádobkách nebo uchovávání ve stabilizovaných vodných přípravcích.

Množství činidla, které je nezbytné pro účinnou terapii budou záležet na mnoha různých faktorech, zahrnujících způsob podávání, fyziologický stav pacienta a jiné podávané

- 22 • · • · · · • ·

léky. Léčebné dávky by tudíž měly být titrovány, aby byla co nejvíce zvýšena bezpečnost a účinnost. Dávky použité in vitro mohou typicky vést k užitečné informaci o použitelných množstvích pro podávání těchto činidel in šitu. Pokusy na zvířatech, týkající se účinné dávky pro léčbu dále povedou k předběžným indikacím o dávkování člověku. Různé úvahy jsou popsané například v Gilman a kol. (editoři) (1990) Goodman and Gilman's: Pharmacological Bases of Therapeutics, 8th Ed., Pergamon Press; a Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed. (1990), Mack Publishing Co., Easton, Penn.

V uvedených publikacích a níže je pojednáno o různých způsobech podávání, například o orálním podávání, intravenózním podávání, intraperitoneálním podávání nebo o intramuskulárním podávání, o transdermální difúzi a jiných. Farmaceuticky přijatelné nosiče budou obsahovat vodu, fyziologický roztok, pufry a jiné složky, popsané například v The Merck Index, Merck & Co., Rahway, New Jersey. Vzhledem k tomu, že dávkování jiných aktivátorů plasminogenu se pohybuje mezi 80 a 110 mg, celková dávka v tomto rozmezí by měla být dostačující (Physicians'Desk Reference, 49th ed. (1995), Medical Economics Data Produkce Company, str. 10831085).

Terapeutický přípravek může být podáván v kterékoli obvyklé dávkovači formě. I když je možné podávat aktivní složku samotně, je výhodnější, aby byla podávána jakožto farmaceutický přípravek. Přípravky obsahují alespoň jednu aktivní složku, jak je výše uvedeno, spolu s jedním nebo

-22a• · · * • · ·· • · · · • · · · «« ·»

Um více přijatelnými nosiči aktivní složky. Každý nosič musí být jak farmaceuticky tak i fyziologicky přijatelný v tom

- 23 • · • · · « • · ♦ · ·· smyslu, že je slučitelný s jinými ingredienty a že neohrožuje pacienta. Kompozice zahrnuje ty přípravky, které jsou vhodné pro orální podávání nebo parenterální podávání (zahrnující subkutánní podávání, intramuskulární podávání, intravenózní podávání a intradermální podávání). Přípravky mohou být obvykle podávány v jednotkové dávkovači formě a

mohou být připravovány kterýmkoli	ze a	způsobů kol.,	známých v ibid, and
lékárnictví. Viz Remington ibid.	například Gilman
Závěrem je možno	souhrnně uvést,	že	výhodná	provedení
vynálezu tak, jak	jsou popsána v	předmětu vynálezu jsou
taková, jak vyplývá	z následujícího:

způsob izolace a čistění rDSPA al z biologického prostředí, zahrnující následující kroky:

(a) přivedení prostředí, které má pH 5, na kationtovou iontoměničovou pryskyřici, která sestává z matrice částic oxidu křemičitého kovalentně vázaných na polyethylenimin sílán, ve kterém amino skupiny byly modifikovány karboxylovými skupinami, což vede k selektivní vazbě rDSPA al na kationtovou iontoměničovou pryskyřici;

(b) promývání kationtové iontoměničové pryskyřice při pH 5 použitím lOOmM NaOAc a 50 mM NaPO₄ při pH 7.5, za účelem odstranění proteinů, které nejsou rDSPA al a neproteinových nečistot;

(c) vymývání vázaného rDSPA al z kationtové iontoměničové

- 24 • 9 ···· ·· ·· 99 9·

9*9 · · 9 · · · 9 9 • 9 9 9 9 · 9 9 9 9 9 9 9 • 9 9 9 9 9 9 9 · 9 9 9 * 9

9« 9 999* 9*9 • 9 9*9 99 99 «9 *9 pryskyřice pufrem, který obsahuje 50 mM fosforečnanu sodného a 500 mM chloridu sodného při pH 7,5;

(d) přivedení vymyté látky z kroku (c), která obsahuje rDSPA al, při pH 4 na hydrofobní interaktivní pryskyřici sestávající ze semirigidních sférických granulí syntetizovaných kopolymerací ethylenglykolu a polymerů_r typu methakrylátu, modifikovaných butylovými skupinami, což vede k selektivní vazbě rDSPA al na hydrofobní interaktivní pryskyřici;

(e) promývání hydrofobní interaktivní pryskyřice za použití 20 mM HC1 a potom za použití 20 mM HC1, která obsahuje 19 % EtOH za účelem odstranění proteinů, které nejsou rDSPA al a neproteinových nečistot;

(f) vymývání vázaného rDSPA al z hydrofobní interaktivní pryskyřice pufrem, který obsahuje 29 % ethanolu a 20 mM kyseliny chlorovodíkové při pH 2,5;

(g) přivedení vymyté látky, která obsahuje rDSPA al, z kroku (f) při· pH 2,5 na afinitní chromatografickou pryskyřici sestávající ze zesíťovaného kopolymeru allyl dextranu a Ν,N'-methylen bisakrylamidu ve formě granulí, která frakcionuje globulární proteiny o hmotnosti mezi 20.000 a 8.000.000 kDa, což způsobí selektivní vazbu rDSPA al na hydrofobní interaktivní pryskyřici;

(h) promývání afinitní chromatografické pryskyřice za použití 20mM HC1 za účelem odstranění proteinů, které nejsou • ·

- 25 0 9 0 · · · 0 9 9 9 ·

9 9 99 9 9 99 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 999 9 · • 0 · 0 · · · 9 9 9

000 00 00 90 09 rDSPA al a neproteinových nečistot;

(i) vymývání vázaného rDSPA al z afinitní chromatografické pryskyřice za použití pufru, který obsahuje 200‘mM glycinu, při pH mezi 4 a 5, což dává v podstatě čistý rDSPA ccl ve vodném roztoku.

Příklady provedení vynálezu

Následující specifické způsoby přípravy a příklady provedení vynálezu jsou podány, aby vedly ke snazšímu pochopení vynálezu, v jejich úmyslu avšak není jakkoli omezovat rozsah vynálezu.

PŘÍKLAD 1

Produkce rDSPA al buněčnou kulturou

Lahvička z pracovní DSPA banky buněčných kultur byla rozmražena a naočkována do válcové nádoby s 5 % telecího séra v růstovém prostředí (WEC 5.0 prostředí, pozměněné Williams E) . Během dvoutýdenní doby se buňky rozrostly a byly přeneseny do čtyř válcových nádob, buňky z válcových nádob byly zpracovány trypsinem a naočkovány do čtyř jednolitrových odstřeďovacích baněk po 4 x 10⁸ buňek, každá s jedním litrem růstového prostředí. Po čtyřech dnech byly kultury ze čtyř centrifugací použity pro naočkování do desetilitrového bioreaktoru. Dodatečný jeden litr růstového prostředí byl přidán do kultury bioreaktoru v den naočkování. Další den byl bioreaktor naplněn deseti litry

- 26 • · ··· · • · • · ·· • · · ·♦ ··

9 » « ·· růstového přidávání protokolem okysličení systémem.

prostředí. Kultivace jak s přidáváním tak bez mikronosičových granulí se řídilo tímto pH prostředí bylo regulováno na 7,0-7,4 a bylo udržováno po celou dobu rozptylovacím Teplota byla udržována na 34-39°C.

Hustota buněk v den naočkování do bioreaktoru byla 8,1 χ 10⁵buňek na ml a po dvou dnech se hustota buněk zvětšila na dvojnásobek, v době, ve které rychlost perfúze byla nastavena na 0,5 násobek objemu kultury za den. Rychlost perfúze byla zvyšována v závislosti na hustotě buněk, tak aby po devíti dnech uplynulých od naočkování bioreaktoru hustota dosáhla 6,2 χ 10⁶ buňky/ml a perfúze se zvýšila na 2 násobky objemu kultury za den.

Bioreaktor byl potom převeden na produkční prostředí (1 % telecí sérum ve WEC 5.0 prostředí) a o dva dny později začalo odebírání produkce a pokračovalo po dobu deseti týdnů. Během fáze produkce byl průměr hustoty buněk 15 χ 10⁶buněk na ml s přibližně 7 5 % životností. Průměr produkce rDSPA al byl 4 0 milligramů rDSPA al na litr a průměr specifické produkční rychlosti byl 6 pikogramů rDSPA al na buňku na den.

Expanze fermentačních objemů byla dosažena přesunem poloviny obsahu reaktoru do nové nádoby. Oba bioreaktory byly umístěny do produkčního prostředí, perfúzovány dvěma násobky objemu kultury za den a ihned začalo odebírání produkce.

- 27 •· 99 9 9 ·· ·· ·· ·· • · · · · · · · · · · • 9 9 99 9 999 9 999 • · 9 9 9 99 99 999 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 99 99 99 9 9 9 9

PŘÍKLAD 2

Čistění rDSPA al

1. Chromatografie kationtovou výměnou (Kolona A).

Odběr z bioreaktoru je.uchováván za teploty okolí (15-25°C). Je potom filtrován přes 0,45 mikronový filtr před přivedením na kationtovou iontoměničovou kolonu. Čistění odebraného materiálu začíná krokem kolonové chromatografie za použití pryskyřice CBX, vyrobené splečností J.T. Baker (Kolona A). Tento krok umožňuje významnou část čistění proteinu.

Pufry kolony A sestávají z Pufru Al: ekvilibrační pufr (50mM NaOAc, pH 5,0), z Pufru A2: promývací pufr (50mM NaPO₄, pH 7,5), z Pufru A3: vymývací pufr (50mM NaPO₄, 500 mM NaCl, pH 7,5), z Pufru A4: stripovací pufr (2M NaAc, pH 8,0) a z Pufru A5: zásobní pufr (45 % EtOH, 10 % HoAc).

Následující operační parametry kolony jsou vhodné pro kolonu naplněnou 6 kg pryskyřice a s objemem kolony 15 litrů. Nejvíce 4,5 gramů rDSPA al může být přivedeno na kolonu v jednom zpracování. Kolona je plněna při velikosti toku menším než 2 litry za minutu a při tlaku kolony nepřesahujícím 20 psi. Hodnoty kolony a monitoru jsou kontrolované před každým zpracováním. Plnící materiál a chromatografické pufry jsou před použitím zbaveny plynů proplachováním heliem.

Odběr z bioreaktoru je filtrován 1,2 mm filtrem, potom

- 28 ··· • 4

• 4

4 4 4

4 4 • 4 4 4 titrován na pH 5,00 (± 0,10) za použití ledové kyseliny octové. Před plněním je kolona ekvilibrována nejméně 30 litry Pufru Al až do doby, než má vycházející tekutina pH 5.00 (± 0,20). Jakmile je kolona ekvilibrována, je na kolonu přiváděn odběr. Kolona je znovu ekvilibrována nejméně osmdesáti litry Pufru Al. Kolona je znovu správně ekvilibrována, když má vycházející tekutina pH 5,00 (± 0,20) a když je dosaženo stabilní základní linie UV spektra. Kolona je vymývána nejméně 145 litry Pufru A2. Kolona je správně vymyta, když má vycházející tekutina pH 7,50 (± 0,20) a když je dosaženo stabilní základní linie UV spektra.

Produkt je vymyt z kolony za použití nejméně 30 litrů Pufru A3 a odebírán do oddělené nádoby. Vymývání je považováno za dosažené, když je dosaženo stabilní základní linie UV spektra. Po vymytí produktu je kolona stripována až do doby, než· je dosaženo stabilní základní linie UV spektra, za použití nejméně 30 litrů Pufru A4. Kolona je potom čištěna, aby mohla být znovu použita (aniž by byla překročena hranice 50 cyklů používání). Produkt kolony A (nebo eluát) je uchováván při teplotě 2-8°C. Průměrný výtěžek byl 93 % a průměrná (proteinová) čistota vymytého materiálu byla 81 %.

2. Hydrofobní interaktivní chromátografie (Kolona B).

Po provedené chromatografii na pryskyřici CBX je produkt rDSPA al chromatografován za použití C4· hydrofobní interaktivní pryskyřice (Toso-Haas) (Kolona B) . Tento krok ulehčuje významně odstranění neproteinových nečistot a také

- 29 ΦΦ φφ φφ φφ φφφ φ··· φφφφ φ φφφφ φ φφφ φ φφφ φ φ φ · · φφ φφ φφφ φ φ φφ φ φφφφ φφφ

ΦΦΦΦ· φφ φφ φφ φφ pomáhá při inaktivaci/odstranění možných virových nečistot. Pufry kolony B sestávají z Pufru Bl: ekvilibrační pufr (50mM NaOAc, 500mM NaCl, pH 4,0), z Pufru B2: promývací a zásobní pufr (20mM HCI), z Pufru B3: promývací pufr (20mM HCI, 19 % EtOH), z Pufru B4: promývací pufr (20mM HCI, 20,5 % EtOH), z Pufru B5: vymývací pufr 20mM HCI, 29,5 % EtOH), a z Pufru Ββ: stripovací pufr (O,1N NaOH). Následující operační parametry kolony jsou vhodné pro 15 litrový objem kolony. V jednom zpracování může být přivedeno na kolonu nejvíce 9 gramů DSPA al. Kolona je plněna při velikosti toku nejvíce 2 litry za minutu a při tlaku kolony nejvíce 15 psi. Hodnoty kolony a monitoru jsou kontrolované před každým zpracováním.

Před plněním je kolona ekvilibrována až do doby, než má vycházející tekutina pH 4,00 (± 0,20). Látka vymytá z kolony A je titrována na pH 4,00 (± 0,10) za použití ledové kyseliny octové, zbavena plynu, a přiváděna do kolony. Tato kolona je znovu ekvilibrována nejméně 30 litry Pufru Bl až do doby, než má vycházející tekutina pH 4,00 (± 0,20) a než je dosaženo stabilní základní linie UV spektra. Kolona je promývána třemi pufry. První promývání je nejméně 45 litry Pufru B2. Kolona je správně promyta, když má vycházející tekutina pH 1,90 (± 0,20) a když je dosaženo stabilní základní linie UV spektra. Kolona je promývána po druhé nejméně 145 litry Pufru B3 až do doby, než je dosaženo stabilní základní linie UV spektra. Kolona je promývána po třetí nejméně 30 litry Pufru B4 a promývání je úplné, když je dosaženo stabilní základní linie UV spektra.

rDSPA al je vymyt z kolony za použití nejméně 30 litrů Pufru

- 30 44 4444 4· 44 44 44

444 4 444 4444

4 444 4 4 44 4 4 44

4 444 44 44 444 4 4

4 4444 444

444 44 44 44 44

B5 a shromažďován do oddělené nádoby. Ve vymývání se pokračuje až do doby, než je dosaženo stabilní základní linie UV spektra. Kolona je potom čištěna, aby mohla být znovu použitelná (aniž by byla překročena hranice 50 cyklů používání). Produkt kolony B (neboli eluát) je uchováván při teplotě 2-8°C během nejvíce 15 dnů před dalším zpracováním. Průměrný výtěžek byl 91 % a průměrná (proteinová) čistota vymytého materiálu byla 97 %.

3. Afinitní chromátografie (Kolona C).

Produkt kolony B podstupuje dále chromatografii za použití Sephacryl S-400 (Pharmacia) (Kolona C) . Tento krok ulehčuje výměnu pufru, čímž napomáhá vytváření přípravku a tedy pomáhá při inaktivaci/odstranění virových nečistot. Pufry kolony C sestávají z Pufru Cl: ekvilibrační pufr (20mM HC1, % EtOH) z Pufru C2: promývací pufr (20mM HC1), z Pufru C3: vymývací a zásobní pufr (200mM glycinu, sterilně filtrovaného) a z Pufru C4: stripovací pufr (O,1N NaOH). Následující operační parametry kolony jsou vhodné pro desetilitrový objem kolony. V jednom zpracování může být na kolonu přivedeno nejvíce 20 gramů rDSPA al. Kolona je plněna při rychlosti nejvíce 0,5 litru za minutu a při tlaku kolony nejvíce 15 psi. Eluáty z jednoho nebo více zpracování Kolony B jsou sloučeny a potom jsou zředěny jedním dílem eluátu Pufru C2 a dvěma díly eluátu Pufru 5. Konečná koncentrace ethanolu bude přibližně 19 %.

Před plněním je kolona ekvilibrována nejméně 15 litry Pufru Cl až do doby, než má vycházející tekutina pH 1,80 (± 0.20).

- 31 ·· 0··· ·0 00 0· 00 000 0000 0000 • 0 000 0 0 00 0 0 00 0 0 000 00 00 000 0 0 00 0 0000 000

000 00 00 00 00

Po naplnění je kolona promývána nejméně 30 litry Pufru C2. Kolona je vhodně promývána dokud UV signál není stabilní. Produkt je vymyt z kolony použitím nejméně 20 litrů Pufru C3 a shromažďován do oddělené nádoby. Ve vymývání je pokračováno až do doby, než je dosaženo stálé základní linie UV spektra.

Po vymývání produktu je kolona stripována nejméně 12 litry Pufru C4 a uchovávána až do opětovného použití, které však nemá překročit 20 cyklů. Produkt kolony C (neboli eluát) je zředěn na koncentraci menší než 1 mg na mililitr Pufrem C3 a uchováván při teplotě 2-8°C za účelem dalšího zpracování. Průměrný výtěžek byl 97 % a průměrná (proteinová) čistota vymytého materiálu byla 98 %.

Kroky koncentrace a přípravy farmaceutických kompozic následovaly po dokončení kroků čistění (popsaných výše) a byly prováděny s vymytým produktem afinitní kolony S-400, který byl uchováván nejdéle 70 dní. Eluáty kolony C byly sloučeny a koncentrovány by spirálově vinutou ultrafiltrační membránou, která odstraňuje látky nízké molekulové hmotnosti (propustnost do 30,000 daltonů). Produkt byl sebrán do kontejneru, který neobsahuje pyrogenní látky, v koncentraci vyšší než 8 mg/ml. Ke koncové 4 % koncentraci byl přidán mannit.

Nakonec byl přidán formulační pufr (200mM glycinu, 4 % mannitu (hmotnost/objem)), aby upravil koncentraci hromadně připraveného produktu na 7,5 mg/ml. Hromadně připravený produkt je potom sterilně filtrován, rozdělen do nádob a lyofilizován.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob čistění rekombinantního aktivátoru plazminogenu al ze slin, Desmondus rotundus (rDSPA al), z biologického média, vyznačující se tím, že sestává z následujících kroků (a) aplikace tohoto média na kationtovou iontoměničovou pryskyřici při hodnotě pH v rozmezí od 4 do 7;

(b) promývání kationtové iontoměničové pryskyřice za účelem odstranění proteinů, které nejsou rDSPA al a neproteinových nečistot;

(c) selektivního eluování vázaného rDSPA al z kationtové iontoměničové pryskyřice;

(d) aplikování eluované látky, která obsahuje rDSPA al a která byla získáno v kroku (c), na hydrofobní interaktivní pryskyřici při hodnotě pH v rozmezí od 3 do 5;

(e) promývání hydrofobní interaktivní pryskyřice za účelem odstranění proteinů, které nejsou rDSPA al a neproteinových nečistot;

• · ·· ···· • · · • · · ··

75 /J · · ♦ »

- J4 - · · · hydrofobní rDSPA al a (f) selektivní eluování vázaného rDSPA cti z interaktivní pryskyřice;

(g) přivedení eluované látky, která obsahuje která byla získána ve stupni (f) , na afinitní chromatografickou pryskyřici při nízké hodnotě pH a nízké iontové síle:

(h) promývání afinitní chromatografické pryskyřice za účelem odstranění proteinů, které nejsou rDSPA cti a neproteinových nečistot;

(i) selektivní eluování vázaného rDSPA al z afinitní chromatografické pryskyřice a tím produkování čistého rDSPA al ve vodném roztoku.
2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že biologické médium je kondicionované médium.
3. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že kationtová iontoměničová pryskyřice z kroku (a) je zvolena ze souboru, zahrnujícího částice silikagelu, zesíťovanou agarózu nebo zesíťované polymethakrylátové polymery, modifikované karboxylovými nebo karboxyalkylovými skupinami.
4. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že kationtová iontoměničová pryskyřice je tvořena matricí z částic silikagelu, kovalentně vázaných k polyethyleniminsilanu, přičemž aminové skupiny polyethyleniminsilanu jsou ♦ · • 9 ·♦ ♦* ·· · · • 9 9 · • · ·· • ·♦ 9 · ·

9 9 * • 9 · · modifikovány karboxylovými skupinami.
5. Způsob podle nároku podmínky aplikace v kroku (a) pH v rozmezí od 4 do 7.

3, vyznačující se tím, že zahrnují přivádění média při
6. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že eluování rDSPA al v kroku v kroku (c) je prováděno za použití pufru obsahujícího 50 mM NaPhos a od 100 mM do 500 mM NaCl nebo za použití pufru ekvivalentní iontové síly.
7. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že hydrofobní interaktivní pryskyřice z kroku (d) je pryskyřice bez náboje, modifikovaná alkylovými skupinami obsahujícími 1 až 10 atomů uhlíku nebo aryl-alkylovými skupinami.
8. Způsob podle nároku 7, vyznačující se tím, že pryskyřice bez náboje je zvolena ze souboru, zahrnujícího částice silikagelu, zesíťovanou agarózu nebo zesíťovaný polymethakrylátový polymer.
9. Způsob podle nároku 7, vyznačující se tím, že pryskyřice bez náboje je tvořena semirigidními sférickými granulemi syntetizovanými kopolymerací ethylenglykolu a polymerů metakrylátového typu, modifikované butylovými skupinami.
10. Způsob podle nároku 9, vyznačující se tím, že • · · · • · · · « · ·· • · · · • · · · · * ♦ · · a · ··* t · · • · 4 β · · · · «

aplikační podmínky v kroku (d) zahrnují aplikaci látky, eluované v kroku (c), při pH v rozmezí od 3 do 5.
11. Způsob podle nároku 9, vyznačující se tím, že aplikační podmínky v kroku (d) zahrnují aplikaci látky, eluované v kroku (c), v 50 mM NaPhos, 500 ml NaCl a při hodnotě pH upravené na hodnotu 4 kyselinou fosforečnou nebo za použití pufru ekvivalentní iontové síly.
12. Způsob podle nároku 9, vyznačující se tím, že eluční krok (f) je prováděn za použití pufru, který obsahuje 20 mM HCl a který má koncentraci ethanolu vyšší než 25 %.
13. Způsob podle nároku 12, vyznačující se tím, že koncentrace ethanolu je mezi 28,5 % a 30 %.
14. Způsob podle nároku 12, vyznačující se tím, že koncentrace ethanolu je 29 %.
15. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že afinitní chromatografická pryskyřice v kroku (g) je představována zasíťovaným kopolymerem allyldextranu a N,N'~ methylenbisakrylamidu ve formě granulí o průměru, který je v

rozmezí od 25 do 75 gm. 16. Způsob podle nároku 15, vyznačující se tím, že granule jsou schopné frakcionovat globulární proteiny o velikosti od 20 000 do 8 000 000 kDa

• · 4 ·

4 4 4 « 4 4 4 4

4 4 4

4 4 4

4 4 4 4 4 • · · 4

4 4 4 4

4 4 44 • 4 4 4 • 4 4 · • 4 4 4

4 4 4 <

44 4 4
17. Způsob podle nároku 15, vyznačující se tím, že aplikační podmínky v kroku (g) zahrnují aplikaci látky, eluované v kroku (f) při pH o hodnotě mezi 1 a 4.
18. Způsob podle nároku 15, vyznačující se tím, že eluování v kroku (i) je prováděno s použitím pufru, obsahujícího 200 mM glycinu a při hodnotě pH v rozmezí od 3 do 6 nebo za použití pufru ekvivalentní iontové síly.
19. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že dále zahrnuje koncentraci vodného roztoku rDSPA al.
20. Způsob podle nároku 19, vyznačující se tím, že dále zahrnuje lyofilizací koncentrovaného roztoku rDSPA al.
21. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že dále zahrnuje koncentrování vodného roztoku rDSPA al a lyofilizaci tohoto koncentrovaného roztoku rDSPA al.
22. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že sestává z následujících kroků (a) přivedení média, které má pH v rozmezí od 4 do 7, na kationtovou iontoměničovou pryskyřici, zvolenou ze souboru, zahrnujícího částice silikagelu, zesíťovanou agarózu nebo zesíťované polymethakrylátové polymery, modifikované karboxylovými nebo karboxyalkýlovými skupinami;

(b) promývání kationtové iontoměničové pryskyřice za účelem

0000 • 0 0 000

0 0 0 0

0 ·0 ·

0 0 00

0 0 0 ·

0 0 0 ·

00 0 0 • 0 00 • 0 0 ♦

0 0 00

000 0 ·

0 0 0

00 ·· odstranění proteinů, které nejsou rDSPA al a neproteinových nečistot;

(c) selektivní eluování vázaného rDSPA al z kationtové iontoměničové pryskyřice pufrem, který obsahuje 50 mM fosforečnanu sodného a od 100 mM do 500 mM chloridu sodného nebo pufrem ekvivalentní iontové síly;

(d) přivedení eluované látky z kroku (c), která obsahuje rDSPA al, při hodnotě pH v rozmezí od 3 do 5 na hydrofobní interaktivní pryskyřici, zvolenou ze souboru, zahrnujícího částice silikagelu, zesíťovanou agarózu nebo zesíťované polymethakrylátové polymery;

(e) promývání hydrofobní interaktivní pryskyřice za účelem odstranění proteinů, které nejsou rDSPA al a neproteinových nečistot;

(f) selektivní eluování vázaného rDSPA al z hydrofobní interaktivní pryskyřice pufrem, který obsahuje 20 mM HCl a který má koncentraci ethanolu větší než 25 %;

(g) přivedení eluované látky, která obsahuje rDSPA al, z kroku (f) při pH hodnotě v rozmezí od 1 do 4 na afinitní chromatografickou pryskyřici, představovanou zesíťovaným polymerem allyldextranu a N,N'-methylenbisakrylamidu ve tvaru granulí s průměrem v rozmezí od 25 do 75 μπι;

(h) promývání afinitní chromatografické pryskyřice za účelem odstranění proteinů, které nejsou rDSPA al a neproteinových nečistot;

(i) selektivní eluování vázaného rDSPA al z afinitní chromatografické pryskyřice za použití pufru, který obsahuje 200 mM glycinu, při hodnotě pH v rozmezí od 3 do 6 nebo pufru ekvivalentní iontové síly, za vzniku čistého rDSPA al ve vodném roztoku.
23. Způsob isolace a čistění rDSPA al z biologického média, vyznačující se tím, že sestává z následujících kroků (a) přivedení tohtóto média, které má pH iontoměničovou pryskyřici, která sestává oxidu křemičitého kovalentně polyethyleniminsilan, ve kterém byly modifikovány karboxylovými skupinami;

5, na kationtovou z matrice částic vázaných na amino skupiny (b) promývání kationtové iontoměničové pryskyřice při hodnotě pH 5 použitím lOOmM NaOAc a 50 mM NaPO₄ při pH 7,5, za účelem odstranění proteinů, které nejsou rDSPA al a neproteinových nečistot;

(c) eluování vázaného rDSPA al z kationtové iontoměničové pryskyřice pufrem, který obsahuje 50 mM fosforečnanu sodného a 500 mM chloridu sodného při pH 7,5;

(d) přivedení eluované látky z kroku (c) , která obsahuje rDSPA al, při hodnotě pH 4 na hydrofobní interaktivní pryskyřici sestávající ze semirigidních sférických granulí

ΦΦ ΦΦ φ φ φ Φ φ φ ΦΦ • φφφφ Φ φ φ « φφ φφ φφ φφφ· ·· Φ· • φ φ φφφφ — Λ Π — φ φ ··· · · ··

4 U ₉ · ······ • φ φ ® φ φ · φφ φφφ ·· ·* syntetizovaných kopolymerací ethylenglykolu a polymerů typu methakrylátu, modifikovaných butylovými skupinami;

(e) promývání hydrofobní interaktivní pryskyřice za použití

20 mM HC1 a potom za použití 20 mM HCl, která obsahuje 19 %

EtOH za účelem odstranění proteinů, které nejsou rDSPA al a neproteinových nečistot;

(f) eluování vázaného rDSPA al z hydrofobní interaktivní pryskyřice pufrem, který obsahuje 29 % ethanolu a 20 mM kyseliny chlorovodíkové při pH 2,5;

(g) přivedení eluované látky, která obsahuje rDSPA al, z kroku (f) při hodnotě pH 2,5 na afinitní chromatografickou pryskyřici sestávající ze zesíťovaného kopolymerů allyldextranu a Ν,N’-methylenbisakrylamidu ve formě granulí, která frakcionuje globularní proteiny o hmotnosti mezi 20000 a 8 000 000 kDa;

(h) promývání afinitní chromatografické pryskyřice za použití 20mM HCl za účelem odstranění proteinů, které nejsou rDSPA al a neproteinových nečistot;

(i) eluování vázaného rDSPA al z afinitní chromatografické pryskyřice za použití pufru, který obsahuje 200 mM glycinu, při hodnotě pH mezi 4 a 5, za vzniku čistého rDSPA al ve vodném roztoku.
24. Rekombinantní DSPA al, který byl čištěn způsobem, • ft ·· • · · · • · ·· • ··· · * • · · ·· ·» • ft ···· • · · • · ··· který sestává z následujících kroků (a) přivedení prostředí na kationtovou iontoměničovou pryskyřici při hodnotě pH v rozmezí od 4 do 7;

(b) promývání kationtové iontoměničové pryskyřice za účelem odstranění proteinů, které nejsou rDSPA al a neproteinových nečistot;

(c) selektivního eluování vázaného rDSPA al z kationtové iontoměničové pryskyřice;

(d) přivedení eluované látky, která obsahuje rDSPA al a která byla získána v kroku (c), na hydrofobní interaktivní pryskyřici při hodnotě pH v rozmezí od 3 do 5;

(e) promývání hydrofobní interaktivní pryskyřice za účelem odstranění proteinů, které nejsou rDSPA al a neproteinových nečistot;

(f) selektivní eluování vázaného rDSPA al z hydrofobní interaktivní pryskyřice;

(g) přivedení eluované látky, která obsahuje rDSPA al a která byla získána v kroku (f), na afinitní chromatografickou pryskyřici při nízké hodnotě pH a nízké iontové síle:

(h) promývání afinitní chromatografické pryskyřice za účelem • · • ···

9 · • · 4« ··· odstranění proteinů, které nejsou rDSPA al a neproteinových nečistot;

(i) selektivní eluování vázaného rDSPA al z afinitní chromatografické pryskyřice za získání čistého rDSPA al ve vodném roztoku.
25. Rekombinantní DSPA al podle nároku 24, přičemž rDSPA al byl čištěn způsobem, který sestává z následujících kroků (a) přivedení média, které má pH 5, na kationtovou iontoměničovou pryskyřici, která sestává z matrice částic oxidu křemičitého kovalentně vázaných na polyethyleniminsilan, ve kterém byly aminoskupiny modifikovány karboxylovými skupinami;

(b) promývání kationtové iontoměničové pryskyřice při hodnotě pH 5 za použití lOOmM NaOAc a 50 mM NaPO₄ při hodnotě pH 7,5, za účelem odstranění proteinů, které nejsou rDSPA al a neproteinových nečistot;

(c) eluování vázaného rDSPA al z kationtové iontoměničové pryskyřice pufrem, který obsahuje 50 mM fosforečnanu sodného a 500 mM chloridu sodného při pH 7,5;

(d) přivedení eluované látky z kroku (c) , která obsahuje rDSPA al, při hodnotě pH 4 na hydrofobní interaktivní ·· ···· • · ♦ • · ··· • * · • · · ·· ··· • 9 9 9

9 9 99

9 9 9 · • 9 9 9

99 99

99 99

9 9 9 ·

9 9 99

999 9 ·

9 9 9

99 99 pryskyřici sestávající ze semirigidních sférických granulí syntetizovaných kopolymerací ethylenglykolu a polymerů typu methakrylátu, modifikovaných butylovými skupinami;

(e) promývání hydrofobní interaktivní pryskyřice za použití 20 mM HC1 a potom za použití 20 mM HC1, která obsahuje 19 % EtOH za účelem odstranění proteinů, které nejsou rDSPA al a neproteinových nečistot;

(f) eluování vázaného rDSPA al z hydrofobní interaktivní pryskyřice pufrem, který obsahuje 29 % ethanolu a 20 mM kyseliny chlorovodíkové při pH 2,5;

(g) přivedení eluovanélátky, která obsahuje rDSPA al, z kroku (f) při hodnotě pH 2,5 na afinitní chromatografickou pryskyřici sestávající ze zesíťovaného kopolymeru allyldextranu a N,Ν'-methylenbisakrylamidu ve formě granulí, která frakcionuje globularní proteiny o hmotnosti mezi 20000 a 8 000 000 kDa;

(h) promývání afinitní chromatografické pryskyřice za použití 20mM HC1 za účelem odstranění proteinů, které nejsou rDSPA al a neproteinových nečistot;

(i) eluování vázaného rDSPA al z afinitní chromatografické pryskyřice za použití pufru, který obsahuje 200 mM glycinu, při hodnotě pH mezi 4 a 5, za vzniku čistého rDSPA al ve vodném roztoku.

·· ···· 9 · · • · ···

9 9 9

9 9
26. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje rDSPA al, přičemž tento rDSPA al byl čištěn způsobem, který sestává z následujících kroků (a) přivedení média na kationtovou iontoměničovou pryskyřici při hodnotě pH v rozmezí od 4 do 7;

(b) promývání kationtové iontoměničové pryskyřice za účelem odstranění proteinů, které nejsou rDSPA al a neproteinových nečistot;

(c) selektivní eluování vázaného rDSPA al z kationtové iontoměničové pryskyřice;

(d) přivedení eluované látky, která obsahuje rDSPA al a která byla získána v kroku (c) , na hydrofobní interaktivní pryskyřici při hodnotě pH v rozmezí od 3 do 5;

(e) promývání hydrofobní interaktivní pryskyřice za účelem odstranění proteinů, které nejsou rDSPA al a neproteinových nečistot;

(f) selektivní eluování vázaného rDSPA al z hydrofobní interaktivní pryskyřice;

(g) přivedení eluované látky, která obsahuje rDSPA al a která byla získána v kroku (f), na afinitní chromatografickou pryskyřici při nízké hodnotě pH a při nízké iontové síle, ·· ·· • · ♦

9 9 99 • · · • ♦ · • · ·· ··♦· • · • ··· • · · • · ··· • · · • 99 ·«· · t 9 9 9

99 99 (h) promývání afinitní chromatografické pryskyřice za účelem odstranění proteinů, které nejsou rDSPA al a neproteinových nečistot;

(i) selektivní eluování vázaného rDSPA al z afinitní chromatografické pryskyřice za vzniku čistého rDSPA al ve vodném roztoku.
27. Farmaceutický prostředek podle nároku 26, vyznačující se tím, že byl do něho přidán farmaceuticky přijatelný excipient.
28. Farmaceutický prostředek podle nároku 27, vyznačující se tím, že uvedeným excipientem je mannitol.
29. Farmaceutický prostředek podle nároku 26, vyznačující se tím, že rDSPA al byl čištěn způsobem, který sestává z následujících kroků (a) přivedení média, které má pH 5, na kationtovou iontoměničovou pryskyřici, která sestává z matrice částic oxidu křemičitého kovalentně vázaných na polyethyleniminsilan, ve kterém byly aminoskupiny modifikovány karboxylovými skupinami;

(b) promývání kationtové iontoměničové pryskyřice při hodnotě pH 5 za použití lOOmM NaOAc a 50 mM NaPO₄ při hodnotě pH 7,5, za účelem odstranění proteinů, které nejsou rDSPA al

99 99

9 9 9 ·

0 9 99

999 9 9

9 9 9

99 ·9

99 ····

0 0 · • 9 9 99

9 9 9 9

9 9 ·

0··

0· «0

9 9 9 *

9 9 *·

9 9 9 · ♦

9 9 9 9

99 99 a neproteinových nečistot;

(c) eluování vázaného rDSPA al z kationtové iontoměničové pryskyřice pufrem, který obsahuje 50 mM fosforečnanu sodného a 500 mM chloridu sodného při pH 7,5;

(d) přivedení eluované látky z kroku (c), která obsahuje rDSPA al, při pH 4 na hydrofobní interaktivní pryskyřici sestávající ze semirigidních sférických granulí syntetizovaných kopolymerací ethylenglykolu a polymerů typu methakrylátu, modifikovaných butylovými skupinami;

(e) promývání hydrofobní interaktivní pryskyřice za použití 20 mM HCI a potom za použití 20 mM HCI, která obsahuje 19 % EtOH za účelem odstranění proteinů, které nejsou rDSPA al a neproteinových nečistot;

(f) eluování vázaného rDSPA al z hydrofobní interaktivní pryskyřice pufrem, který obsahuje 29 % ethanolu a 20 mM kyseliny chlorovodíkové při pH 2,5;

(g) přivedení eluované látky, která obsahuje rDSPA al, z kroku (f) při pH hodnotě 2,5 na afinitní chromatografickou pryskyřici sestávající ze zesíťovaného kopolymeru allyldextranu a Ν,Ν'-methylenbisakrylamidu ve formě granulí, která frakcionuje globularní proteiny o hmotnosti mezi 20000 a 8 000 000 kDa;

(h) promývání afinitní chromatografické pryskyřice za • · • 0 • 0 0000 • · 0 • 0 ··· • 00 použití 20mM HC1 za účelem odstranění proteinů, které nejsou rDSPA al a neproteinových nečistot;

(i) eluování vázaného rDSPA al z afinitní chromatografické pryskyřice za použití pufru, který obsahuje 200 mM glycinu,

při hodnotě pH mezi 4 a vodném roztoku. 5, za vzniku čistého rDSPA al ve 30. Farmaceutický prostředek podle nároku 29, vyznačující se tím, že do něho byl přidán farmaceuticky přijatelný excipient. 31. Farmaceutický prostředek podle nároku 30,

vyznačující se tím, že uvedeným excipientem je mannitol.
32. Použití rDSPA al, který byl čištěn způsobem, který sestává z následujících kroků (a) přivedení prostředí na kationtovou iontoměničovou pryskyřici při hodnotě pH v rozmezí od 4 do 7;

(b) promývání kationtové iontoměničové pryskyřice za účelem odstranění proteinů, které nejsou rDSPA al a neproteinových nečistot;

(c) selektivního eluování vázaného rDSPA al z kationtové iontoměničové pryskyřice;

(d) přivedení eluované látky, která obsahuje rDSPA al a která byla získána v kroku (c), na hydrofobní interaktivní

44 ···· ♦ · • 4 · · · • ···· 1 ·

4 4 4 4 4 4 • · · · 4 • 4 44 4 ··

44 4· ··

4 4 4 4 4 4

44 4 4 44

4 4 · 4444 ·

4 4 4 4 · ·· 44 44 pryskyřici při hodnotě pH v rozmezí od 3 do 5;

(e) promývání hydrofobní interaktivní pryskyřice za účelem odstranění proteinů, které nejsou rDSPA al a neproteinových nečistot;

(f) selektivní eluování vázaného rDSPA al z hydrofobní interaktivní pryskyřice;

(g) přivedení eluované látky, která obsahuje rDSPA al a která byla získána v kroku (f), na afinitní chromatografickou pryskyřici při nízké hodnotě pH a při nízké iontové síle, (h) promývání afinitní chromatografické pryskyřice za účelem odstranění proteinů, které nejsou rDSPA al a neproteinových nečistot;

(i) selektivní eluování vázaného rDSPA al z afinitní chromatografické pryskyřice za vzniku čistého rDSPA al ve vodném roztoku pro přípravu léčiva pro léčení lidí trpících arteriální nebo venózní trombózy.
33. Použití podle nároku 32, při kterém byl přidán farmaceuticky přijatelný excipient.
34. Použití podle nároku 33, při kterém je uvedeným excipientem je mannitol.

• 4 4444 • ·

4 444 • 4 » 1

44 44

4 4 4 4

4 4 44

44 4 4 ·

4 4 4

44 44
35. Použití podle nároku 32, při kterém byl rDSPA al čištěn způsobem, který sestává z následujících kroků (a) přivedení prostředí, které má pH 5, na kationtovou iontoměničovou pryskyřici, která sestává z matrice částic oxidu křemičitého kovalentně vázaných na polyethyleniminsilan, ve kterém aminoskupiny byly modifikovány karboxylovými skupinami, za vzniku selektivní vazby rDSPA al na kationtovou iontoměničovou pryskyřici;

(b) promývání kationtové iontoměničové pryskyřice při pH 5 za použití lOOmM NaOAc a 50 mM NaPO₄ při hodnotě pH 7,5, za účelem odstranění proteinů, které nejsou rDSPA al a neproteinových nečistot;

(c) eluování vázaného rDSPA al z kationtové iontoměničové pryskyřice pufrem, který obsahuje 50 mM fosforečnanu sodného a 500 mM chloridu sodného při pH 7,5;

(d) přivedení eluované látky z kroku (c) , která obsahuje rDSPA al, při pH hodnotě 4 na hydrofobní interaktivní pryskyřici sestávající ze semirigidních sférických granulí syntetizovaných kopolymerací ethylenglykolu a polymerů typu methakrylátu, modifikovaných butylovými skupinami, za vzniku selektivní vazby rDSPA al na hydrofobní interaktivní pryskyřici;

(e) promývání hydrofobní interaktivní pryskyřice za použití 20 mM HCl a potom za použití 20 mM HCl, která obsahuje 19 %

44 44

4 4 4 «

4 4 44 •4 4444 • · »4 4* • 44 »44

4 4

EtOH za účelem odstranění proteinů, které nejsou rDSPA al a neproteinových nečistot;

(f) eluování vázaného rDSPA al z hydrofobní interaktivní pryskyřice pufrem, který obsahuje 29 % ethanolu a 20 mM kyseliny chlorovodíkové při pH 2,5;

(g) přivedení eluované látky, která obsahuje rDSPA al, z kroku (f) při hodnotě pH 2,5 na afinitní chromatografickou pryskyřici sestávající ze zesíťovaného kopolymeru allyldextranu a N,N*-methylenbisakrylamidu ve formě granulí, která frakcionuje globularní proteiny o hmotnosti mezi 20000 a 8 000 000 kDa, za vzniku selektivní vazby rDSPA al na hydrofobní interaktivní pryskyřici;

(h) promývání afinitní chromatografické pryskyřice za použití 20mM HCI za účelem odstranění proteinů, které nejsou rDSPA al a neproteinových nečistot;

(i) eluování vázaného rDSPA al z afinitní chromatografické pryskyřice za použití pufru, který obsahuje 200 mM glycinu, při hodnotě pH mezi 4 a 5, za vzniku v podstatě čistého rDSPA al ve vodném roztoku.
36. Použití podle nároku 35, při kterém byl přidán farmaceuticky přijatelný excipient.

·· ·· ···· • · · • · «·* • · · • · · ·· ··· ·· ·· • · · · • · ··

9 9 9 9 9

9 9 9 9

99 99

9 9 9 9

9 9 99

999 9 · • 9 9

99 99
37. Použití podle nároku 36, při kterém excipientem je mannitol.