PL186410B1

PL186410B1 - Sposób wytwarzania rDSPA 1

Info

Publication number: PL186410B1
Application number: PL97328146A
Authority: PL
Inventors: Michael Mccaman; Erno Pungor; Carol Souders; Mei P. Tan
Original assignee: Schering Ag
Priority date: 1996-02-05
Filing date: 1997-01-31
Publication date: 2004-01-30
Also published as: NO983579D0; HUP9901029A2; CN1242059C; PT1015568E; ZA97948B; JP3805378B2; JP2000504565A; HK1018795A1; HUP9901029A3; AU1546297A; CZ245598A3; DE69719382T2; RU2223315C2; US5731186A; CZ294827B6; DK1015568T3; DE69719382D1; ATE233316T1; SK284179B6; EP1015568B1

Abstract

1. Sposób oczyszczania rekombinacyjnego aktywatora slinowego plazminogenu Desmondus rotundus (rDSPA a 1 ) z pozywki biologicznej, znamienny tym, ze sposób ten obejmuje nastepujace etapy (a) naniesienie pozywki na zywice kationowymienna przy pH od 4 do 7; (b) przemywanie zywicy kationowymiennej w celu usuniecia bialek nie-rDSPA a 1 i zanieczyszczen niebialkowych; (c) selektywna elucje zwiazanego rDSPA a 1 z zywicy kationowymiennej; (d) nanoszenie zawierajacego rDSPA a 1 eluentu z etapu (c) na zywice hydrofobowego oddzialywania przy pH od 3 do 5; (e) przemywanie zywicy hydrofobowego oddzialywania w celu usuniecia bialka nie-rDSPA a 1 i zanieczysz- czen niebialkowych; (f) selektywna elucje zwiazanego rDSPA a 1 z zywicy hydrofobowego oddzialywania; (g) nanoszenie zawierajacego rDSPA a 1 eluentu z etapu (f) na zywice chromatografii powinowactwa przy niskim pH 1 niskiej sile jonowej, h) przemywanie zywicy chromatografii powinowactwa w celu usuniecia bialka nie-rDSPA a 1 i zanie- czyszczn niebialkowych; (i) selektywna elucje zwiazanego rDSPA a 1 z zywicy chromatografii powinowactwa w celu wytwo- rzenia czystego rDSPA aa w roztworze wodnym. 23. Sposób izolacji i oczyszczania rDSPA a 1 z pozywki biologicznej, znamienny tym, ze sposób ten obejmuje nastepujace etapy: (a) naniesienie pozywki przy pH 5 na zywice kationowymienna zawierajaca matryce czastek krze- mionki zwiazanych kowalencyjnie z polietylenoiminosilanem, przy czym grupy aminowe zostaly derywaty- zowane grupami karboksylowymi; (b) przemywanie zywicy kationowymiennej przy pH 5 za pomoca 100 mM NaOAc i 50 mM NaP04 przy pH 7,5 w celu usuniecia bialka nie-rDSPA a 1 i zanieczyszczen niebialkowych; (c) elucje zwiazanego rDSPA a 1 z zywicy kationowymiennej za pomoca.............................................. PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób izolacji i oczyszczania rekombinacyjnego aktywatora α 1 ślinowego plazminogenu Desmondus rotundus (rDSPA α 1), rDSPA α 1 oczyszczony tym sposobem, kompozycje farmaceutyczne zawierające oczyszczony rDSPA α 1 i sposoby leczenia przy użyciu oczyszczonego rDSPA α 1.

Zakrzepice są powodowane przez wytworzenie się skrzepu krwi w naczyniach krwionośnych. Odróżnia się zakrzepice żylne, obejmujące zatory tętnicy płucnej i zakrzepice tętnicze, obejmujące ostry zawał mięśnia sercowego. Zator tętnicy płucnej i zawał mięśnia sercowego są przypadkami zagrażającymi życiu i wymagającymi natychmiastowej interwencji lekarskiej.

Popularną formą leczenia takich zakrzepie tętniczych i zylnych jest zastosowanie aktywatorów plazminogenu w celu przeprowadzenia enzymatycznego rozpuszczenia skrzepu (Collen i inni, Ann. Rev. Med., (1988), 39: 405-423). Substancje te, zwane substancjami trombolitycznymi, zamieniają plazminogen, nieaktywny proenzym układu fibrynolizy we krwi, w aktywny enzym proteolityczny, plazminę. Plazmina z kolei rozpuszcza włóknistą substancję, fibrynę, która jest zasadniczym składnikiem skrzepu krwi; powoduje to otwarcie zablokowanych naczyń i przywrócenie przepływu krwi. Jednak, ponieważ plazmina jest stosunkowo niespecyficzną proteazą, to może ona w wyniku proteolizy zniszczyć we krwi składniki (na przykład fibrynogen) nieodzowne dla przebiegu niezakłóconej hemostazy i w ten sposób zwiększyć niebezpieczeństwo wystąpienia krwotoku.

Pierwsze enzymatyczne substancje trombolityczne, streptokinaza i urokinaza, po wstrzyknięciu do obiegu, zamieniają plazminogen w plazminę i powodują układową proteolizę. Tak więc trombolitycznym sposobom leczenia stosującym te związki towarzyszą komplikacje spowodowane przez krwotok. Opracowano nowe trombolityczne sposoby leczenia opierające się na zastosowaniu aktywatorów plazminogenu typu tkankowego, zwykle określanych jako t-PA, lecz także mają one szereg wad, między innymi powodują poważne komplikacje spowodowane krwawieniami, stosunkowo częste występowanie reokluzji, niezdolność do równomiernej skuteczności działania i podatność na dezaktywację przez inhibitory aktywatora plazminogenu, takie jak inhibitor aktywatora plazminogenu typu 1 (PAI-1) (Loskuloff, Seminars in Thrombosis and Hemostasis, tom 14, nr 1 (1988)).

Ostatnio oczyszczono białka aktywatora plazminogenu ze śliny i gruczołów ślinowych nietoperza wampirowego (Desmondus rotundus) (Europejskie Opublikowane Zgłoszenie Patentowe 0 383 417 (Baldus i inni); Europejskie Opublikowane Zgłoszenie Patentowe 0 352 119 (Duong i inni)). Te aktywatory plazminogenu (określane jako DSPA) są proteazami serynowymi, które katalizują konwersję plazminogenu do plazminy, lecz wykazują większą selektywność w stosunku do plazminogenu związanego z fibryną i z tego powodu mogą powodować

186 410 zmniejszoną ciężkość i częstość krwawienia podczas ich stosowania w leczeniu trombolitycznym. Ponadto, DSPA nie jest łatwo dezaktywowany przez inhibitory plazmowe, takie jak

PAI-1 i dlatego towarzyszy mu mniejsza częstość reokluzji.

Dwie makrocząsteczkowe formy DSPA (oznaczone jako al i a2) można znaleźć w ślinie nietoperza, przy czym obie składają się z kilku obszarów, włącznie z obszarem proteazy, obie są zdolne do ścisłego wiązania się z plazminogenem w obecności fibryny. Różne formy DSPA wytworzono w hodowli komórek ssaków metodą rekombinacyjnej biotechnologii (Kratzschmer i inni, Gene (1991), 105: 229-237; Europejskie Opublikowane Zgłoszenie Patentowe 0 352 119 (Duong i inni)) i opisano (Witt i inni, Blood (1992), 79: 1213-1217) oczyszczanie na małą skalę wytwarzanego rekombinacyjnego DSPA (rDSPA). Jednak nie ujawniono izolacji i oczyszczania rDSPA na skalę przemysłową i o stanie czystości odpowiednim dla kompozycji farmaceutycznych.

Przedmiotem niniejszego zgłoszenia jest izolacja i oczyszczanie rekombinacyjnego DSPA α 1 (rDSPA α 1) na skalę przemysłową. Opisany wynalazek daje rDSPA α 1 dostatecznie czysty i trwały do produkcji przemysłowej i odpowiedni dla zastosowań klinicznych.

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest izolacja i oczyszczanie rDSPA α 1 na skalę przemysłową. Wynalazek daje produkt odpowiedni dla zastosowań klinicznych.

Tak więc, jednym przedmiotem niniejszego wynalazku sposób oczyszczania rDSPA α1 z pożywki biologicznej, przy czym sposób ten obejmuje następujące etapy:

(a) naniesienie pożywki na żywicę kationowymienną w takich warunkach nanoszenia, które powodują selektywne związanie rDSPA α 1 z żywicą kationowymienną;

(b) ewentualne przemywanie żywicy kationowymiennej w celu usunięcia białek nie-rDSPA α 1 i zanieczyszczeń niebiałkowych;

(c) selektywną elucję związanego rDSPA α 1 z żywicy kationowymiennej;

(d) nanoszenie zawierającego rDSPA al eluentu z etapu (c) na żywicę hydrofobowego oddziaływania w takich warunkach nanoszenia, które powoduje selektywne związanie rDSPA α1 z żywicą hydrofobowego oddziaływania;

(e) ewentualne przemywanie żywicy hydrofobowego oddziaływania w celu usunięcia białka nie-rDSPA α1 i zanieczyszczeń niebiałkowych;

(f) selektywną elucję związanego rDSPA α 1 z żywicy hydrofobowego oddziaływania;

(g) nanoszenie zawierającego rDSPA α 1 eluentu z etapu (f) na żywicę chromatografii powinowactwa w takich warunkach nanoszenia, które powodują selektywne związanie rDSPA α 1 z żywicą chromatografii powinowactwa;

h) ewentualne przemywanie żywicy chromatografii powinowactwa w celu usunięcia białka nie-rDSPA α 1 i zanieczyszczeń niebiałkowych;

(i) selektywną elucję zwijęzanego rDgPA al z żywicy chromatografii powi nowaetwa w celu wytworzenia zasadniczo czystego rDSPA α 1 w roztworze wodnym.

Innym przedmiotem mniejszego wynalazku jest białko rDSPA α 1 izolowane i oczyszczone sposobem według niniejszego wynalazku.

Innym przedmiotem niniejszego wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna, zawierająca białko rDSPA α 1 izolowane i oczyszczone sposobem według niniejszego wynalazku i zaróbkę dopuszczalną farmaceutycznie.

Innym przedmiotem niniejszego wynalazku jest sposób zastosowania rDSPA α 1 izolowanego i oczyszczonego sposobem według niniejszego wynalazku w leczeniu ludzi z zakrzepicami tętniczymi lub żylnymi.

Określenia stosowane w opisie i w załączonych zastrzezeniach mają następujące znaczenia, o ile nie wskazano, że jest inaczej.

Określenie „pożywka biologiczna” dotyczy konkretnej receptury soli i składników odżywczych stosowanej do namnażama komórek w hodowli.

Określenie „pożywka kondecjocowaca” dotyczy pożywki biologicznej, w której hodowano komórki. Z tego powodu pożywka została kondeajongwaca przez wzrost komórek i zawiera produkty wydzielone do pożywki podczas wzrostu komórek. Mogą to być produkty odpadowe wytwarzane podczas wzrostu lub białka wytwarzane i wydzielane przez komórki do pożywki podczas ich wzrostu.

186 410

Określenie „żywica kationowymienna” dotyczy naturalnej lub syntetycznej, zwykle stałej substancji, która jest zdolna do wymiany związanych jonów na jony z otaczającej ciekłej pożywki. Żywica kationowymienną posiada związane ujemne jony funkcyjne i wymienia je na dodatnie przeciwjony.

Grupami sczepiąjącymi (składnikami aktywnymi podczas wymiany) w handlowych żywicach kationowymiennych są zwykle grupy -C6H5O', -SO3', -COO', -PO3' lub -AsO3'. Słabszymi żywicami kationowymiennymi są żywice, w których siła wiązania kationu nie jest duża, takie jak żywice z grupami karboksylowymi lub z karboksyalkilowymi grupami funkcyjnymi. Ponadto, słabsze żywice kationowymienne są zwykle nie w pełni zdysocjowane w kwaśnym pH. Słaba żywica kationowymienną stosowana według niniejszego wynalazku zawiera szczególnie matrycę cząstek krzemionki związanych kowalencyjnie z polietylenoiminosilanem, w którym grupy aminowe polietylenoiminosilanu derywatyzowano grupami karboksylowymi. Taką żywicę produkuje firma J.T. Baker pod nazwą handlową żywica chromatograficzna Widepore CBX®.

Określenie „żywica oddziaływania hydrofobowego” dotyczy naturalnej lub syntetycznej substancji, która zawiera grupy bez ładunków, takie jak grupy metylowe, etylowe lub inne grupy alkilowe. Grupy te tworzą wiązania hydrofobowe z grupami na ugrupowaniach białkowych, które przepuszcza się przez żywicę i powodują one rozdzielenie białek na zasadzie wielkości siły oddziaływania między białkiem a grupami żywicy. Specjalna żywica oddziaływania hydrofobowego składa się z półsztywnych kulistych ziaren zsyntetyzowanych w wyniku kopolimeryzacji glikolu etylenowego z polimerami typu metakrylanu derywatyzowanymi grupami butylowymi. Taką żywicę produkuje firma Toso-Haas pod nazwą handlową Toyo-Pearl® 650M C4.

Określenie „żywica chromatografii powinowactwa” dotyczy naturalnej lub syntetycznej substancji, zwykle substancji stałej, stosowanej do oczyszczania białek. Żywica rozdziela białka na podstawie wielkości powinowactwa między grupami na białku a grupami na żywicy. Żywica według niniejszego wynalazku stosowana jako żywica chromatografii powinowactwa jest zwykle żywicą wykluczania według wymiarów stosowaną do rozdzielania białek na podstawie wymiarów cząsteczek. Specjalną żywicą chromatografii powinowactwa jest usieciowany kopolimer allilodekstranu z N,N'-metylenobisakryloamidem w postaci ziaren, który może frakcjonować kuliste białka o ciężarze cząsteczkowym w zakresie od 20000 do 8000000 kDa. Taką żywicę produkuje firma Pharmacia pod nazwą handlową Sephacryl® S-400.

Określenie „grupa alkilowa” dotyczy jednowartościowej grupy o prostym lub rozgałęzionym łańcuchu, składającej się wyłącznie z węgla i wodoru, nie zawierającej nienasycenia i zawierającej od 1 do 18 atomów węgla, korzystnie od 1 do 6 atomów węgla, takiej jak na przykład grupa metylowa, etylowa, n-propylowa, izopropylo(1-metyloetylowa), n-butylowa, t-butylo(1,1-dimetylotylowa), sec-butylo(l-metylopropylowa), n-pentylową, n-heksylowa i tym podobne.

Określenie „zasadniczo czysty” dotyczące czystości produktu rDSPA α 1, otrzymanego po zastosowaniu schematu oczyszczania opisanego szczegółowo w niniejszym zgłoszeniu, oznacza, że powyżej 80% całkowitego białka w końcowym produkcie oczyszczania stanowi rDSPA α 1 i że najkorzystniej 98% całkowitego izolowanego białka ma postać rDSPA α 1. Zawartość białka i jego czystość oznacza się metodą HPLC z odwróconą fazą i metodą analizy żelowej SDS-page.

Określenie „białko nie-rDSPA α 1 i zanieczyszczenia niebiałkowe” dotyczy całości materiału różnego od rDSPA α 1 znajdującego się w pożywkach biologicznych, z których oczyszcza się rDSPA α 1.

Określenie „zaróbka dopuszczalna farmaceutycznie” dotyczy dopuszczalnego nośnika i dowolnej, dopuszczalnej farmaceutycznie substancji pomocniczej, od której wymaga się zgodności z wymaganiami fizjologicznymi i która jest nietoksyczna i nie ma niekorzystnego wpływu na biologiczną aktywność kompozycji farmaceutycznej zawieszonej lub umieszczonej w niej. Jako odpowiednie zaróbki można wymienić takie związki, jak mannit, bursztynian, glicyna lub albumina surowicy.

186 410

Określenie „ilość skuteczna terapeutycznie” dotyczy takiej ilości rDSPA α 1, która podawana potrzebującej tego osobie, wystarcza do leczenia, jak to określono poniżej, stanów chorobowych charakterystycznych dla zakrzepicy. Ilość związku, jaka stanowi „ilość skuteczną terapeutycznie”, zależy od rodzaju związku, stanu choroby i jej ciężkości, lecz może być rutynowo oznaczona przez przeciętnego fachowca na podstawie jego wiedzy i niniejszego opisu.

Określenie „leczenie” stosowane w niniejszym opisie dotyczy leczenia u ludzi stanu chorobowego charakterystycznego dla zakrzepicy i obejmuje:

(i) zapobieganie wystąpieniu stanu chorobowego u ludzi, zwłaszcza u ludzi z predyspozycją do tego stanu chorobowego, ale którym jeszcze nie postawiono diagnozy wystąpienia tej choroby;

(ii) hamowanie stanu chorobowego, to jest zatrzymanie jego rozwoju; lub (iii) złagodzenie stanu chorobowego, to jest spowodowanie cofnięcia się stanu chorobowego.

Określenie „ewentualny” lub „ewentualnie” oznacza, że opisane następnie zdarzenie lub okoliczności mogą lub nie mogą wystąpić i ze opis obejmuje przypadki, w których dane zdarzenie występuje i przypadki, w których nie występuje.

Przedmiotem wynalazku jest sposób izolacji i oczyszczania rDSPA α 1 na skalę przemysłową i w postaci odpowiedniej do zastosowania w kompozycjach farmaceutycznych. rDSPA α 1 wytwarza się w wyniku fermentowania linii komórek ssaka zdolnej do wydzielania produktu rDSPA α 1 do bakteryjnych pożywek hodowlanych. Kondycjonowane pożywki, to jest pożywki otrzymywane z bioreaktora zawierającego komórki ssaka, zbiera się i rDSPA α 1 oddziela się od innych białek i zanieczyszczeń za pomocą szeregu etapów chromatograficznych, rozpoczynając od zastosowania żywicy kationowymiennej i z następną selektywną elucją rDSPA α 1 z żywicy. Frakcję rDSPA α 1 otrzymaną przez selektywną elucję z żywicy kationowymiennej nanosi się następnie na żywicę oddziaływania hydrofobowego, gdzie selektywna elucja z matrycy stanowi drugi poziom oczyszczania. Eluowaną frakcję rDSPA α 1 nanosi się następnie na żywicę chromatografii powinowactwa, gdzie selektywna elucja z matrycy stanowi następny poziom oczyszczania. Następnie zatęża się oczyszczony rDSPA α 1 zwykłymi sposobami, takimi jak ultrafiltracja, i z kolei liofilizuje.

W szczególności wynalazek wykonuje się w następujący sposób:

A. Izolacja i oczyszczanie

1. Pożywki hodowlane i linie komórek

Pożywka hodowlana stanowi podstawową pożywkę odpowiednią do wzrostu komórek ssaka, taką jak DMEM lub Ham' s F12. Szczególną pożywkę stanowi pożywka William's E (Williams, G. M. i Gunn, J. M., Exp. Cell Res. (1974) 89:139). W fazie wzrostu uzupełnia się zwykle pożywkę podstawową za pomocą źródła surowicy, zwykle surowicy wołowej (BS) lub surowicy młodych cieląt (CS), stosowanej w stężeniu w zakresie od około 0,1 do 10% wagowych, zwykle w zakresie od około 1 do około 5% wagowych. Można także dodawać inne czynniki wzrostu lub bufory, takie jak HEPES. Podczas fazy wzrostu perfuzyjnego zwykle utrzymuje się takie samo stężenie surowicy, w zakresie od około 3 do 8%, najczęściej około 5%.

Liniami komórek odpowiednich według niniejszego wynalazku są linie komórek ssaka zdolne do nie przyrośniętego wzrostu w pożywce suspensyjnej i/lub do przyrośniętego wzrostu na ziarnach mikronośnika. Szczególnymi liniami komórek spełniającymi te wymagania są linie komórek jajnika chomika chińskiego (CHO), komórki BHK lub linia komórek HEK293 (Kratzschmer i inni, Gene, (1991) 116: 281-284; Petri T. J. BioTechnology, (1995) 39: 75-83).

Szczególnie korzystną linią komórek CHO jest linia DXB11, opisana przez Urlaub G. i Chasin L.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1980) 77: 4216-4220. Komórki poddano kotransfekcji wektorami ekspresji pSVPA11 ipUDHFR1, które zawierają, odpowiednio, sekwencje kodowania dla DSPA α 1 i dla mysiej reduktazy dihydrofolanowej (Petri T., ibid.). Stosowana według niniejszego wynalazku transformowana linia komórek CHO jest oznaczona jako CD 16, została złożona w American Type Culture Collection, Rockville, Maryland (ATCC) i nadano jej oznaczenie ATCC # CRL 12023.

2. Rozszerzenie fazy pożywki i wytwarzania

186 410

Po zaszczepieniu obiema zlewającymi się, odwirowanymi pożywkami lub częściami innych pożywek bioreaktorowych, pożywkę komórek rozszerza się do gęstości produkcyjnej, zwykle w zakresie od około 1x106 d₀ 40x10⁶ komórek/ml.

Po uzyskaniu pożądanej gęstości komórek na ziarnach mikronośnika rozpoczyna się perfuzję świeżych pożywek uzupełnionych surowicą. Stężenie surowicy w świeżych pożywkach jest zwykle w zakresie od około 2 do 10%o wagowych, częściej w zakresie od około 3 do 8% wagowych i najczęściej w zakresie około 5% wagowych. Początkowo szybkość perfuzji jest w zakresie od około 0,25 do 0,75 objętości pożywki/dzień, zwykle około 0,5 objętości pożywki/dzień. W miarę wzrostu komórek zwiększa się szybkość perfuzji do końcowej szybkości w zakresie od około 1,5 do 2,5 objętości pożywki/dzień, zwykle w ciągu od około 2 do 10 dni. Podczas rozszerzania wprowadza się do reaktora sterylne, wstępnie zrównoważone ziarna mikronośnika w celu zachowania stosunku gęstości ziaren mikronośnika do gęstości komórek w zakresie od około 0,5 do 1,0 g ziaren mikronośnika na 10⁹ komórek. Ziarna mikronośnika dogodnie wprowadza się do reaktora przez linię próbki przy użyciu aspiratora.

Gdy gęstość komórek osiągnęła już poziom produkcyjny, wtedy zmniejsza się dodawanie surowicy do świeżej pożywki hodowlanej, zwykle do stężenia w zakresie od około 0,1 do 2,0% wagowych, najczęściej około 1%.

Podczas fazy produkcyjnej należy zwracać uwagę na takie parametry fermentacji pożywki, jak: temperatura, pH i zawartość rozpuszczonego tlenu - są one sprawdzane codziennie. Należy uzupełniać ilości pożywek hodowlanych, surowicy i ługu w miarę wyczerpywania się zbiorników zasobowych. Próbki kondycjonowanych pożywek, czyli pożywek zawierających produkt, są analizowane rutynowo, co najmniej co 2 dni, aby mieć pewność, ze produkcja przebiega bez tworzenia się zanieczyszczeń.

Sposób postępowania podczas odbierania kondycjonowanych pożywek z bioreakoorów zmniejsza zbieranie komórek dzięki zastosowaniu sit o średnicy porów od 100 do 150 pm. W przypadku pożywek suspensyjnych stosuje się wirowe filtry przepływowe w celu zatrzymania komórek w bioreaktorze. Zebrane hodowle przechowuje się w sterylnych pojemnikach i przechowuje wciągu do 38 dni przed dalszym przerobem. rDSPA α 1 znajdujący się w zbiorach z bioreaktora został wydzielony z komórek CHO w formie przetworzonej, która ma pełną aktywność biologiczną, i jest gotowy do oczyszczania.

3. Chromatografia wymiany kationowej

Po nastawieniu pH na zakres od 4 do 6, korzystnie około 5, nanosi się rDSPA α 1 kondycjonowanej pożywki na matrycę kationowymienną (zwykle upakowaną w postaci kolumny) w takich warunkach, aby zapewnić zasadniczo całkowite związanie rDSPA α 1 z matrycą. Jakkolwiek inne białka są także związane, to ten początkowy etap wiązania stanowi juz pierwszy etap rozdzielania, ponieważ szereg niepożądanych lub zanieczyszczających białek i innych związków, takich jak czerwień fenolowa, nie mogą związać się z matrycą w kondycjonowanych pożywkach i z tego powodu przepływają przez matrycę. rDSPA α 1 jest dodatkowo oczyszczany w wyniku selektywnej elucji z matrycy, przy czym elucję można wykonać albo metodą elucji stopniowej lub elucji z liniowym gradientem przez zwiększanie siły jonowej buforu. W obu przypadkach odbiera się rDSPA α 1 do dalszego oczyszczania, jak opisano poniżej.

Odpowiednimi matrycami kationowymiennymi są różnorodne żywice derywatyzowane kationowymi grupami funkcyjnymi zdolnymi do wiązania rDSPA α 1. Korzystne są żywice syntetyczne, takie jak cząstki silikażelu, usieciowana agaroza lub usieciowane polimery polimetakrylanowe, derywatyzowane kationowymi grupami funkcyjnymi, takimi jak grupy karboksylowe, karboksymetylowe, sulfonylowe, fosforylowe i tym podobne. Szczególnie korzystne są stosunkowo słabe żywice, takie jak żywice z takimi grupami funkcyjnymi, jak grupy karboksymetylowe lub karboksyetylowe. Szczególnie korzystną żywicą jest matryca cząstek krzemionki związanych kowalencyjnie z polietylenoiminosilanem, z grupami aminowymi polietylenoiminosilanu derywatyzowanami grupami karboksylowymi. Taką żywicę produkuje firma J.T. Baker pod nazwą handlową Widepore CBX® (średnica ziaren 45 mm).

Warunki wiązania i elucji zmieniają się w zależności od siły wiązania żywicy kationowej. W przypadku słabych żywic kationowych, takich jak Baker Widepore CBX, wiązanie

186 410 można wykonać przy małej sile jonowej w słabo kwaśnych warunkach, zwykle przy pH od 4 do 7, korzystnie przy pH 5. Po przemyciu matrycy można selektywnie eluować rDSPA α1 działając na matrycę fazą ruchomą o zwiększonej sile jonowej, stosując przy tym elucję liniową albo stopniową. W przypadku żywicy Baker Widbezrb CBX elucja rDSPA α 1 odbywa się przy pH około 7,5 i przy stężeniu soli od około 100 mM do około 500 mM NaCl. Następnie można odpędzić kolumnę i regenerować do następnego użycia.

Korzystnie, przy użyciu matrycy Baker Widbeorb CBX, początkowo równoważy się żywicę przy użyciu buforu 100 mM octan sodu, pH 5. Bufor wprowadza się na kolumnę z szybkością przepływu od 0,2 do 2,0 objętości kolumny na minutę, aż do ustabilizowania się pH 5 wycieku. Kondycjonowaną pożywkę zawierającą rDSPA α 1 sączy się przez filtr 1,2 pm i następnie miareczkuje lodowatym kwasem octowym do wartości pH od 4 do 7, korzystnie do pH 5. Następnie nanosi się pożywkę na kolumnę, zwykle ergy użyciu pompy zębatej, z szybkością przepływu poniżej 2,0 objętości kolumny na minutę. Stosuje się filtr w celu usunięcia ziarnistego materiału, który mógłby zatkać matrycę kolumny.

Następnie ponownie równzważn się matrycę kolumny za pomocą równoważącego buforu octanowego aż do ustalenia się pH 5, co zwykle wymaga od 2 do 7 objętości kolumn. Następnie nanosi się na kolumnę bufor płuczący, zawierający 50 mM fosforan sodu, pH 7,5, z szybkością od około 0,1 do 0,2 objętości kolumn na minutę aż do ustalenia się wartości pH wycieku równej 7,5. Następnie eluuje się rDSPA α 1 z kolumny przy użyciu buforu elucyjnego zawierającego 50 mM fosforan sodu, 500 mM chlorek sodu, pH 7,5. Bufor eluujący przepuszcza się aż do stwierdzenia, że w eluacie nie znajduje się białko. Następnie przepuszcza się przez kolumnę bufor odpędzający zawierający 2,0 M octan sodu, pH 8, w celu regeneracji matrycy. Bufor zapasowy zawiera 10-procentowy kwas octowy i 45-procbnezwn etanol.

4. Chromatografia oddziaływania hydrofobowego

Frakcje rDSPA α 1 zebraną z matrycy kaeionowymibnbj nanosi się następnie na matrycę oddziaływania hydrofobowego (zwykle w postaci kolumny) w warunkach, które umożliwiają związanie rDSPA α 1 z matrycą, zwykle przy dużej sile jonowej i niskim pH. Następnie eluuje się selektywnie rDSPA α 1 przez zwiększanie stężenia rozpuszczalnika organicznego w fazie ruchomej naniesionej na kolumnę, przy użyciu gradientu liniowego lub stopniowego. Odbiera się frakcję rDSPA α 1 do dalszego oczyszczania. W tym etapie gmniejzga się od 100 do 1000 razy ilość zanlbcgyzgcgbń DNA i dezaktywuje się potencjalne zanieczyszczenia wirusowe.

Odpowiednimi matrycami oddziaływania hydrofobowego są różnorodne żywice bez ładunku, zawierające związane kowalencyjnie grupy hydrofobowe, takie jak grupy propylowe, butylowe, okenlzwb, fenylowe i tym podobne. Żywicami mogą być uzieciowane polimery organiczne, takie jak kopolimer zenren/diwinnlobbnzbn, krzemionka, agaroza, poli(metak!y-lan metylu) lub dowolny z wielu innych odpowiednich ziarnistych nośników. Szczególnie korzystna żywica składa się z półsztywnych kulistych ziaren gsyntbtyzowanych w wyniku kopolimbrygαcji glikolu etylenowego z polimerami typu metakrylanu derywatyzowanymi grupami butylowymi. Taką żywicę produkuje firma Toso-Raas pod nazwą handlową Toyo-Pearl® 650M (ziarna od 40 do 90 pm).

Wiązanie z kolumną oddziaływania hydrofobowego wykonuje się w warunkach dużej siły jonowej, zwykle w zakresie kwaśnego pH od 3 do 5, najczęściej przy pH około 4. Zasadniczo cała ilość białka zawarta we frakcji rDSPA α 1, która została eluowana z żywicy kationowymienneż, źest związana z kolumną oddziaływania hydrofobowego. Różne białka mogą być eluowane selektywnie na podstawie różnic sił oddziaływania hydrofobowego z grupami hydrofobowymi na matrycy, to jest w kolejności rosnącej hydrofobowości białka. Elucję można wykonać w gradiencie stopniowym lub liniowym, zwykle stosując eluant alkoholowy, taki jak etanol lub igoprzpanol. Szczególnie korzystnym alkoholem jest alkohol etylowy.

W przypadku matrycy Toyo-Pearl C4, jej równoważenie można wykonać za pomocą buforu równoważenia, zawierającego 50 mM octan sodu, 500 mM chlorek sodu, pH 4. Po miareczkowaniu do pH 4 frakcji rDSPA α 1 z kolumny katiznowymibnnej, nanosi się tę frakcję na matrycę C4, a następnie równoważy powtórnie za pomocą opisanego powyżej buforu równoważenia. Następnie przemywa się kolumnę kolejno dwoma buforami, jak następuje: do pierwszego przemywania (Mycie 1) stosuje co najmniej 2 objętości buforu zawierającego 20 mM HCl.

186 410

Przemywa się tak długo, aż wyciek nie zawiera białka, co wynika z ustalenia się wartości absorbancji UV. Następnie przemywa się matrycę (Mycie 2) za pomocą co najmniej 10 objętości buforu zawierającego 19-procentowy etanol, 20 mM HCl i przemywa się nadal buforem zawierającym 20,5-procentowy etanol, 20 mM HCl, aż wyciek nie zawiera białka. Elucję produktu rDSPA α 1 wykonuje się za pomocą buforu zawierającego 29-procentowy etanol, 20 mM HCl, pH 2,5. Po eluowaniu produktu odpędza się kolumnę za pomocą co najmniej 2 objętości buforu zawierającego 100 mM NaOH. Matrycę przechowuje się w buforze Mycie 1.

5. Chromatografia powinowactwa

Frakcję rDSPA α 1 zebraną z żywicy oddziaływania hydrofobowego nanosi się następnie na matrycę chromatografii powinowactwa (zwykle w postaci kolumny) w warunkach, które umożliwiają związanie rDSPA α 1 z matrycą powinowactwa. Podczas gdy rDSPA α 1 pozostaje związany z kolumną to zanieczyszczenia są eluowane w wyniku przemywania kolumny za pomocą 20 mM HCl w ilości od 2 do 3 objętości kolumny. Ten etap ułatwia wymianę buforu, poprawia kompozycję farmaceutyczną i rozpuszczalność, a także ułatwia dezaktywację/usuwanie potencjalnych zanieczyszczeń wirusowych. Korzystnie stosuje się bufor w ilości 2,5 objętości kolumn. Następnie eluuje się selektywnie rDSPA α 1 za pomocą buforu zawierającego 200 mM glicynę jako wolną zasadę, przy pH od 4 do 5. Frakcję rDSPA α 1 zbiera się w celu jej zatężenia.

Żywicami powinowactwa są żywice stosowane zwykle jako żywice do wykluczania według wymiarów. Odpowiednimi matrycami powinowactwa są żywice będące usieciowanym kopolimerem allilodekstranu z N,N'-metylenobisakryloamidem w postaci ziaren o średnicy od 25 do 75 pm. Szczególnie korzystną żywicą jest żywica Sephacryl 400®, produkowana przez firmę Pharmacia, która może frakcjonować kuliste białka o ciężarze cząsteczkowym w zakresie od 20000 do 8000000 kDa.

Wiązanie rDSPA α 1 z żywicą powinowactwa wykonuje się w warunkach małej siły jonowej i niskiego pH. Zasadniczo cała ilość rDSPA α 1 zebrana z żywicy oddziaływania hydrofobowego jest związana z kolumną. rDSPA α 1 można selektywnie eluować przez zwiększenie podwyższenie pH i/lub siły jonowej. Elucję można wykonać w gradiencie stopniowym lub liniowym, zwykle przy użyciu eluentu zawierającego 200 mM glicynę jako wolną zasadę.

Korzystnie, przy użyciu matrycy Sephacryl S-400, równoważenie wykonuje się za pomocą buforu zawierającego 19-procentowy etanol, 20 mM HCl aż do ustalenia się wartości pH wycieku. Na matrycę nanosi się frakcję rDSPA α 1 z kolumny oddziaływania hydrofobowego i następnie przemywa buforem zawierającym 20 mM HCl aż do ustalenia się sygnału UV z wycieku. Elucję związanego rDSPA α 1 wykonuje się przy użyciu buforu zawierającego 200 mM glicynę. Po eluowaniu produktu odpędza się kolumnę za pomocą co najmniej 2 objętości buforu zawierającego 100 mM NaOH. Po przemyciu matrycy za pomocą co najmniej 2 objętości kolumny buforu płukania (20 mM HCl), można przechowywać matrycę w tym buforze.

6. Zatężanie

Następnie można zatężać białko oczyszczone według niniejszego wynalazku, zwykle przez odsączenie lub podobnie i w końcu może być ono liofilizowane lub w inny sposób włączone do zwykłych preparatów farmaceutycznych. Odpowiednie sposoby zatężania i liofilizacji opisano dokładnie w literaturze naukowej.

B. Przygotowywanie kompozycji

1. Kompozycje farmaceutyczne

Przedmiotem wynalazku jest odczynnik o dużej wartości terapeutycznej. rDSPA α 1, oczyszczony opisanymi sposobami, który powinien być przydatny w leczeniu zakrzepie tętniczych i żylnych.

Rekombinacyjny DSPA α 1, oczyszczony sposobem podanym w opisie, może być podawany chorym. Odczynnik ten może być łączony do zastosowań terapeutycznych z innymi składnikami, na przykład w zwykłych farmaceutycznie dopuszczalnych nośnikach lub rozcieńczalnikach, razem z fizjologicznie nieszkodliwymi stabilizatorami lub zarobkami. Te mieszaniny można sterylnie przesączyć i umieścić w jednostkach dawkowania, na przykład przez liofilizację w ampułach dawkowania lub przechowawanie w stabilizowanych wodnych preparatach.

186 410

U

Ilości odczynnika potrzebne dla skutecznej terapii zależą od wielu różnych czynników, takich jak sposób podawania, fizjologiczny stan chorego oraz od innych podawanych leków. Tak więc podawane dawki powinny być miareczkowane w celu ustalenia najlepszego bezpieczeństwa, i skuteczności. Zwykle dawki stosowane in vitro mogą dawać wskazówki dotyczące ilości tych odczynników podawanych in situ. Dalszych informacji dotyczących skutecznych terapeutycznie dawek, dla ludzi magą dostarczyć próby na zwierzętach. Zagadnienia te opisano na przykład w Gilman i inni (wydawcy) (1990 Goodman and Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, wydanie 8, Pergamon Press; i Remingtons Pharmaceutical Sciences, wydanie 18 (1990), Mack Publishing Co., Easton, Penn.

Omówiono w nich poniżej sposoby podawania, na przykład podawanie doustne, dożylne, dootrzewnowe lub domięśniowe, dyfuzję przezskómą i inne. Jako dopuszczalne farmaceutycznie nośniki można wymienić wodę, solankę, bufory i inne związki, opisane na przykład w Merck Index, Merck & Co., Rahway, New Jersey. Na podstawie wymaganych dawek innych aktywatorów plazminogenowych można przewidywać konieczność stosowania całkowitych dawek od 80 do 110 mg (Physiciaris Desk Reference, wydanie 49 (1995), Medical Economics Data Production Company, strony 1083-1085).

Kompozycje terapeutyczne można podawać w dowolnych jednostkach dawkowania. Jakkolwiek można podawać aktywny składnik sam, to jest korzystne stosowanie go w postaci kompozycji farmaceutycznej. Kompozycje zawierają co najmniej jeden aktywny składnik, określony powyżej, razem z jednym lub kilkoma dopuszczalnymi jego nośnikami. Każdy nośnik powinien być zarówno farmaceutycznie jak i fizjologicznie dopuszczalny w takim sensie, że jest mieszalny z innymi składnikami i jest nieszkodliwy dla chorego. Kompozycje mogą być podawane doustnie lub pozajelitowo (włącznie z podawaniem podskórnym, domięśniowym, dożylnym lub śródskórnym). Kompozycje mogą występować dogodnie w postaci dawek jednostkowych i mogą być przygotowane dowolnym sposobem znanym w sztuce farmaceutycznej. Patrz na przykład Gilman i inni, ibid. i Remington ibid.

Podsumowując, korzystne odmiany niniejszego wynalazku opisane w podsumowaniu wynalazku są następujące: przedmiotem niniejszego wynalazku jest sposób oczyszczania rDSPA α 1 z pożywki biologicznej, przy czym sposób ten obejmuje następujące etapy:

(a) naniesienie pożywki przy pH 5 na żywicę katianawymienna zawierającą matrycę cząstek krzemionki związanych kowalencyjnie z palietylenaiminosilanem, przy czym grupy aminowe zostały derywatyzowane grupami karboksylowymi w takich warunkach nanoszenia, które powodują selektywne związanie rDSPA α 1 z żywicą katianawymienna;

(b) przemywanie żywicy kationowymiennej przy pH 5 za pomocą 100 mM NaOAc i 50 mM NaPOą przy pH 7,5 w celu usunięcia białka nie-rDSPA α 1 i zanieczyszczeń niebiałkowych;

(c) elucję związanego rDSPA α 1 z żywicy katianawymiennej za pomocą buforu zawierającego 50 mM fosforan sodu i 500 mM chlorek sodu przy pH 7,5;

(d) nanoszenie zawierającego rDSPA α 1 eluentu z etapu (c) przy pH 4 na żywicę hydrofobowego oddziaływania z półsztywnych kulistych ziaren zsyntetyzowanych w wyniku ^polimeryzacji glikolu etylenowego z polimerami typu metakrylanu derywatyzowanymi grupami butylowymi w takich warunkach nanoszenia, które powodują selektywne związanie rDSPA α 1 z żywicą hydrofobowego oddziaływania;

(e) przemywanie żywicy hydrofobowego oddziaływania za pomocą 20 mM HCl i następnie 20 mM HCl zawierającym 19-procentowy EtOH w celu usunięcia białka nie-rDSPA α 1 i zanieczyszczeń niebiałkowych;

(f) elucję związanego rDSPA α 1 z żywicy hydrofobowego oddziaływania za pomocą buforu zawierającego 29-procentowy etanol i 20 mM kwas solny przy pH 2,5;

(g) nanoszenie zawierającego rDSPA α 1 eluentu z etapu (f) przy pH 2,5 na żywicę chromatografii powinowactwa będącą usieciowanym kopolimerem allilodekstranu zN,N'-metylenobisakryloamidem w postaci ziaren, który może frakcjonować kuliste białka o ciężarze cząsteczkowym w zakresie od 20000 do 8000000 kDa w takich warunkach nanoszenia, które powodują selektywne związanie rDSPA α 1 z żywicą chromatografii powinowactwa;

186 410

h) przemywanie żywicy chromatografii powinowactwa za pomocą 20 mM HCl w celu usunięcia białka nie-rDSPA α 1 i zanieczyszczeń niebiałkowych;

(i) elucję związanego rDSPA α 1 z żywicy chromatografii powinowactwa za pomocą buforu zawierającego 200 mM glicynę przy pH od 4 do 5 w celu wytworzenia zasadniczo czystego rDSPA α 1 w roztworze wodnym.

Następujące specyficzne preparaty i przykłady podano w celu ułatwienia wykonania niniejszego wynalazku i nie ograniczają one zakresu wynalazku.

Przykład I

Wytwarzanie hodowli komórek rDSPA α 1

Rozmrożono fiolkę z DSPA Working Cell Bank, zaszczepiono w obracanej butelce za pomocą 5-procentowej surowicy cielęcej w pożywce wzrostowej (pożywka WEC 5,0, modyfikowana Williams E), w ciągu dwóch tygodni rozmnażano komórki do 4 obracanych butelek, komórki trypsynowano z obracanych butelek i zaszczepiono do czterech 1 -litrowych obrotowych kolb przy użyciu 4 x 10^ komórek w każdej 1-litrowej pożywce wzrostowej. Po 4 dniach pożywki z czterech kolb obrotowych użyto do zaszczepienia 10-litrowego bioreaktora. Następnego dnia napełniono bioreaktor 10 litrami pożywki wzrostowej. Następnie hodowano zarówno z dodatkiem, jak również bez dodatku ziaren mikronośnika. Środowisko kontrolowano przy wartości pH od 7,0 do 7,4 i zachowywano natlenianie za pomocą bełkotki. Utrzymywano temperaturę od 34 do 39°C.

Gęstość komórek w dniu szczepienia bioreaktora wynosiła 8,1 x 10⁵ komórek/ml i po dwóch dniach gęstość komórek podwoiła się, przy czym szybkość perfuzji ustalono na 0,5 objętości hodowli na dzień (cv/dzień). Szybkość perfuzji zwiększano odpowiednio do gęstości komórek i po 9 dniach od szczepienia bioreaktora gęstość ta osiągnęła wartość 6,2 x 10⁶ komórek/ml i perfuzję zwiększono do 2 cv/dzień.

Następnie przełączono bioreaktor na pożywkę produkcyjną (1-procentowa surowica cielęca w pożywce WEC 5,0) i po dwóch dniach rozpoczęto zbieranie hodowli produkcyjnej i kontynuowano je wciągu 10 tygodni. Podczas fazy produkcyjnej średnia gęstość komórek wynosiła 15 x 106 komórek/ml o żywotności około 75%. Średnia produkcja rDSPA α 1 wynosiła 40 mg rDSPA α 1 na litr i średnia szybkość produkcji wynosiła 6 pikogramów rDSPA α1 na komórkę na 1 dzień.

Zwiększenie objętości fermentacji uzyskano przez przeniesienie połowy zawartości jednego reaktora do nowego naczynia. Oba bioreaktory umieszczono w pożywkach produkcyjnych, perfundowano przy 2 cv/dzień i natychmiast rozpoczynano zbieranie produkcji.

Przykład II

Oczyszczanie rDSPA α 1

1. Chromatografia kafionoacymienna ikolunrna Λ). Zbiory z bioreaktora krzeahovęcvono w temperaturze pokojowej (15-20°C). Następnie przesączono je przez filtr 0,45 pm przed przeniesieniem do kolumny kationowymiaooaj. Oczyszczanie zbiorów rozpoczyna się od etapu chromatografii kolumnowej przy użyciu żywicy CBX firmy J.T.Baker (kolumna A). Ten etap znacznie ułatwia oczyszczanie białka.

Bufory kolumny A są następujące: bufor Al: bufor rówoaważaoia (50 mM NaOAc, pH 5,0), bufor A2: bufor płukania (50 mM NaPO₄, pH 7,5), bufor A3: bufor elucji (50 mM NaPO₄, 500 mM NaCl, pH 7,5), bufor A4: bufor odpędzania (2 M NaAc, pH 8,0) i bufor A5: bufor zapasowy (45% EtOH, 10% HOAc).

Następujące parametry pracy kolumny są odpowiednie dla kolumny zawierającej 6 kg żywicy i dla objętości kolumny 15 l. Na jedną szarżę nie można wprowadzić do kolumny więcej niż 4,5 g rDSPA α 1. Kolumnę obciąża się przy szybkości przepływu poniżej 2 l/min i pod ciśnieniem na kolumnie poniżej 1,4 kg/cm². Specyfikacje kolumny i monitora są sprawdzane przed każdą szarżą. Materiał na kolumnie i bufory chromatograficzne są odgazowywane przez przedmuchiwanie helem przed użyciem.

Zbiór z bioreaklorf przesączono przez filtr 1,2 milimetra i następnie miareczkowano do pH 5,00 (±0,10) przy użyciu lodowatego kwasu octowego. Przed załadowaniem równoważono kolumnę przy użyciu co najmniej 30 l buforu Al do uzyskania pH wycieku 5,00 (± 0,20). Po zrównoważeniu kolumny przeniesiono zbiór do kolumny. Kolumnę równoważono ponow186 410 nie przy użyciu co najmniej 80 l buforu Al. Kolumna jest odpowiednio zrównoważona ponownie, gdy pH wycieku jest równe 5,00 (± 0,20) i gdy uzyskano stabiln^ą linię podstawową UV. Kolumnę przemyto przy użyciu co najmniej 145 l buforu A2. Kolumna jest odpowiednio przemyta, gdy pH wycieku jest równe 7,50 (± 0,20) i gdy uzyskano stabilną, linie podstawową UV.

Produkt eluowano z kolumny przy użyciu co najmniej 30 l buforu A3 i zebrano w oddzielnym naczyniu. Elucję uważano za zakończoną, gdy uzyskano stabilną linię podstawową UV. Po elucji produktu odpędzano kolumnę do uzyskania stabilnej linii podstawowej UV, przy użyciu co najmniej 30 l buforu A4. Następnie kolumnę oczyszczano do ponownego użycia (aby nie przekroczyć 50 cykli stosowania). Produkt z kolumny A (czyli eluat) przechowywano w temperaturze od 2 do 8°C. Średni odzysk wynosił 93% i średnia czystość (białka) w eluacie wynosiła 81%.

2. Chromatografia oddziaływania hydrofobowego (kolumna B). Po chromatografii na żywicy CBX chromatografowano produkt rDSPA a1 przy użyciu żywicy oddziaływania hydrofobowego C4 (Toso-Haas) (kolumna B). Ten etap znacznie ułatwia usuwanie niebiałkowych zanieczyszczeń i także ułatwia dezaktywację/usuwanie możliwych zanieczyszczeń wirusowych. Bufory kolumny B są następujące: bufor Bł - bufor równoważenia (50 mM NaOAc, 500 mM NaCl, pH 4,0), bufor B2: bufor płukania i przechowywania (mM HCl), bufor B3: bufor przemywania (20 mM HCl, 19% EtOH), bufor B4: bufor płukania (20 mM HCl, 20,5% EtOH), bufor B5: bufor elucji (20 mM HCl, 29,5% EtOH) i bufor Bó: bufor odpędzania (0,1 N NaOH). Następujące parametry pracy kolumny są odpowiednie dla objętości kolumny równej 15 1. Na jedną szarżę nie można wprowadzić do kolumny powyżej 9 g rDSPA α 1. Kolumnę obciąża się przy szybkości przepływu poniżej 2 l/min i pod ciśnieniem na kolumnie poniżej 1,05 kg/cm². Specyfikacje kolumny i monitora są sprawdzane przed każdą szarżą. Przed załadowaniem równoważono kolumnę do uzyskania pH wycieku 4,00 (± 0,20). Eluat z kolumny A miareczkowano do pH 4,00 (± 0,10) przy użyciu lodowatego kwasu octowego, odgazowano i wprowadzono na kolumnę. Kolumnę równoważono ponownie przy użyciu co najmniej 30 l buforu B1 tak długo, aż pH wycieku jest równe 4,00 (± 0,20) i gdy uzyskano stabilną linię podstawową UV. Kolumnę przemywa się za pomocą trzech buforów. Do pierwszego przemywania używa się co najmniej 45 l buforu B2. Kolumna jest odpowiednio przemyta, gdy pH wycieku jest równe 1,90 (± 0,20) i gdy uzyskano stabilną linię podstawową UV. Kolumnę przemywa się drugi raz przy użyciu co najmniej 145 l buforu B3, aż do uzyskania stabilnej linii podstawowej UV. Kolumnę przemywa się trzeci raz przy użyciu co najmniej 30 l buforu B4, aż do uzyskania stabilnej linii podstawowej UV.

rDSPA a1 eluuje się z kolumny przy użyciu co najmniej 30 l buforu B5 i zbiera w osobnym naczyniu. Eluuje się aż do uzyskania stabilnej linii podstawowej UV. Następnie kolumnę oczyszcza się do powtórnego użycia (aby nie przekroczyć 50 cykli stosowania). Produkt z kolumny B (czyli eluat) przechowuje się w temperaturze od 2 do 8°C w ciągu poniżej 15 dni przed dalszym przerobem. Średni odzysk wynosił 91% i średnia czystość (białka) w eluacie wynosiła 97%.

3. Chromatografia powinowactwa (kolumna C). Następnie chromatografowano produkt z kolumny B przy użyciu żywicy Sephacryl S-400 (Pharmacia) (kolumna C). Ten etap ułatwia wymianę buforu, otrzymywanie kompozycji, a także dezaktywację/usuwanie zanieczyszczeń wirusowych. Bufory kolumny C są następujące: bufor C1: bufor równoważenia (20 mM HCl, 19% EtOH), bufor C2: bufor przemywania (20 mM HCl), bufor C3: bufor elucji i zapasowy (200 mM glicyny, przesączony sterylnie) i bufor C4 - bufor odpędzania (0,1 N NaOH). Następujące warunki pracy kolumny są odpowiednie dla objętości kolumny 10 l. Poniżej 20 g rDSPA a1 można nanieść na kolumnę na l szarżę. Kolumnę obciąża się przy szybkości przepływu poniżej 0,5 l/min i pod ciśnieniem na kolumnie poniżej 1,05 kg/cm2. Zbiera się eluaty z jednej lub z kilku szarż kolumny B, następnie rozcieńcza eluat jedną częścią buforu C i dwiema częściami buforu 5. Końcowe stężenie etanolu wynosi około 19%.

Przed załadowaniem równoważy się kolumny przy użyciu co najmniej 15 l buforu C1, aż do uzyskania pH wycieku 1,80 (± 0,20). Po załadowaniu przemywa się kolumny przy użyciu co najmniej 30 l buforu C2. Kolumna jest odpowiednio przemyta, gdy sygnał UV jest sta14

186 410 bilny. Produkt eluuje się z kolumny przy użyciu co najmniej 20 l buforu C2 i zbiera w osobnym naczyniu. Eluuje się aż do uzyskania stabilnej linii podstawowej UV.

Po eluowaniu produktu odpędza się kolumnę przy użyciu co najmniej 12 l buforu C4 i przechowuje do powtórnego użycia, aby nie przekroczyć 20 cykli. Produkt z kolumny C (czyli eluat) rozcieńcza się do stężenia <1 mg/ml buforem C3 i przechowuje w temperaturze od 2 do 8°C do dalszego przerobu. Średnie odzyskanie rDSPA a1 wynosiło 97% i średnia czystość (białka) w eWcie wynosiła 98%.

Etapy zatężania i komponowania nastąpiły po zakończeniu oczyszczania i wykonano je na etacie z kolumny powinowactwa S-400, który przechowywano w ciągu poniżej 70 dni. Eluaty z kolumny C zebrano i zatężono przy użyciu spiralnej membrany do ultrafiltracji, która usuwa substancje małocząsteczkowe (odcięcie 30000 daltonów). Produkt zebrano w sterylnym pojemniku przy stężeniu powyżej 8 mg/ml. Dodano mannitu do końcowego stężenia 4%.

Wprowadzono bufor końcowy (200 mM glicyny, 4% mannitu) w celu uzyskania stężenia produktu końcowego równego 7,5 mg/ml. Ten końcowy produkt przesączono sterylnie, rozlano do fiolek i liofilizowano.

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 60 egz. Cena 4,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób oczyszczania rekombinacyjnego aktywatora ślinowego plazminogenu Desmondus rotundus (rDSPA α 1) z pożywki biologicznej, znamienny tym, że sposób ten obejmuje następujące etapy:

(a) naniesienie pożywki na żywicę kationowymienną przy pH od 4 do 7;

(b) przemywanie żywicy kationowymiennej w celu usunięcia białek nie-rDSPA α 1 i zanieczyszczeń niebiałkowych;

(c) selektywną elucję związanego rDSPA α 1 z żywicy kationowymiennej;

(d) nanoszenie zawierającego rDSPA α 1 eluentu z etapu (c) na żywicę hydrofobowego oddziaływania przy pH od 3 do 5;

(e) przemywanie żywicy hydrofobowego oddziaływania w celu usunięcia białka nie-rDSPA α 1 i zanieczyszczeń niebiałkowych;

(f) selektywną elucję związanego rDSPA α 1 z żywicy hydrofobowego oddziaływania;

(g) nanoszenie zawierającego rDSPA α 1 eluentu z etapu (f) na żywicę chromatografii powinowactwa przy niskim pH i niskiej sile jonowej;

h) przemywanie żywicy chromatografii powinowactwa w celu usunięcia białka nie-rDSPA α i zanieczyszczeń niebiałkowych;

(i) selektywną elucję związanego rDSPA α 1 z żywicy chromatografii powinowactwa w celu wytworzenia czystego rDSPA aα w roztworze wodnym.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że pożywką biologiczną jest pożywka kondycj onowana.
3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że żywicą kationowymienną w etapie (a) są cząstki silikażelu, usieciowana agaroza lub usieciowane polimery polimetakrylanowe, derywatyzowane grupami karboksylowymi lub karboksyalkilowymi.
4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że żywicą kationowymienną jest matryca cząstek krzemionki związanych kowalencyjnie z polietylenoiminosilanem, w którym grupy aminowe polietylenoiminosilanu derywatyzowano grupami karboksylowymi.
5. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że warunki nanoszenia w etapie (a) obejmują nanoszenie pożywki przy pH od 4 do 7.
6. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że elucję rDSPA α 1 w etapie (c) wykonuje się przy użyciu buforu zawierającego 50 mM NaPhos i od 100 mM do 500 mM NaCl lub buforu o równoważnej sile jonowej.
7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że żywicą oddziaływania hydrofobowego w etapie (d) jest żywica bez ładunku, derywatyzowana łańcuchami alkilowymi zawierającymi od 1 do 10 atomów węgla lub grupami aiylowo-alkilowymi.
8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że żywicą bez ładunku są cząstki silikażelu, usieciowana agaroza lub usieciowany polimer polimetakrylanowy.
9. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że żywicą bez ładunku są półsztywne kuliste ziarna zsyntetyzowane w wyniku kopolimeryzacji glikolu etylenowego i polimerów typu metakrylanowego, derywatyzowanych grupami butylowymi.
10. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że warunki nanoszenia w etapie (d) obejmują nanoszenie eluentu z etapu (c) przy pH od 3 do 5.
11. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, ze warunki nanoszenia w etapie (d) obejmują nanoszenie eluentu z etapu (c) w 50 mM NaPhos, 500 mM NaCl, o pH 4 nastawionym kwasem fosforowym lub w buforze o równoważnej sile jonowej.
12. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, ze elucję w etapie (f) wykonuje się przy użyciu buforu zawierającego 20 mM HCl i o stężeniu etanolu powyżej 25%.
13. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że stężenie etanolu jest w zakresie od 28,5% do 30%.

186 410
14. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że stężenie etanolu wynosi 29%.
15. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że żywica oddziaływania hydrofobowego z etapu (g) zawiera usieciowany kopolimer allilodekstranu z N,N'-metylenobisakryloamidem w postaci ziaren o średnicy od 25 do 75 pm.
16. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że ziarna mogą frakcjonować kuliste białka o ciężarze cząsteczkowym od 20000 do 8000000 kDa.
17. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że warunki nanoszenia w etapie (g) obejmują nanoszenie eluentu z etapu (f) przy pH od 1 do 4.
18. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że elucję w etapie (i) wykonuje się przy użyciu buforu zawierającego 200 mM glicyny przy pH od 3 do 6 lub buforu równoważnej sile jonowej.
19. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że dodatkowo obejmuje zatężanie wodnego roztworu rDSPA α 1.
20. Sposób według zastrz. 19, znamienny tym, ze dodatkowo obejmuje liofilizację stężonego roztworu rDSPA α 1.
21. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że dodatkowo obejmuje zatężanie wodnego roztworu rDSPA α 1 i liofilizację stężonego roztworu rDSPA α 1.
22. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że sposób ten obejmuje następujące etapy:

(a) naniesienie pożywki przy pH od 4 do 7 na żywicę kationowymienną zawierającą matrycę cząstek krzemionki związanych kowalencyjnie z polietylenoiminosilanem, przy czym grupy aminowe zostały derywatyzowane grupami karboksylowymi;

(b) przemywanie żywicy kationowymiennej w celu usunięcia białka nie-rDSPA α 1 i zanieczyszczeń niebiałkowych;

(c) selektywną elucję związanego rDSPA α 1 z żywicy kationowymiennej za pomocą buforu zawierającego 50 mM fosforan sodu i 500 mM chlorek sodu przy pH 7,5; lub buforu równoważnej sile jonowej;

(d) nanoszenie zawierającego rDSPA α 1 eluentu z etapu (c) przy pH od 3 do 5 na żywicę hydrofobowego oddziaływania zawierającą cząstki silikażelu, usieciowaną agarozę lub usieciowane polimery polimetakrylanowe;

(e) przemywanie żywicy hydrofobowego oddziaływania w celu usunięcia białka nie-rDSPA α 1 i zanieczyszczeń niebiałkowych;

(f) selektywną elucję związanego rDSPA α 1 z żywicy hydrofobowego oddziaływania za pomocą buforu zawierającego 20 mM HCl i zawierającego dodatkowo etanol o stężeniu powyżej 25%;

(g) nanoszenie zawierającego rDSPA α 1 eluentu z etapu (f) przy pH od 1 do 4 na żywicę chromatografii powinowactwa będącą usieciowanym kopolimerem allilodekstranu z N,N'-metylenobisakryloamidem w postaci ziaren o średnicy od 25 do 75 pm;

h) przemywanie żywicy chromatografii powinowactwa w celu usunięcia białka nie-rDSPA α 1 i zanieczyszczeń niebiałkowych;

(i) selektywną elucję związanego rDSPA α 1 z żywicy chromatografii powinowactwa za pomocą buforu zawierającego 200 mM glicynę przy pH od 3 do 6 lub buforu o równoważnej sile jonowej w celu wytworzenia czystego rDSPA α 1 w roztworze wodnym.
23. Sposób izolacji i oczyszczania rDSPA α 1 z pożywki biologicznej, znamienny tym, że sposób ten obejmuje następujące etapy:

(a) naniesienie pożywki przy pH 5 na żywicę kationowymienną zawierającą matrycę cząstek krzemionki związanych kowalencyjnie z polietylenoiminosilanem, przy czym grupy aminowe zostały derywatyzowane grupami karboksylowymi;

(b) przemywanie żywicy kationowymiennej przy pH 5 za pomocą 100 mM NaOAc i 50 mM NaPO4 przy pH 7,5 w celu usunięcia białka nie-rDSPA α 1 i zanieczyszczeń niebiałkowych;

(c) elucję związanego rDSPA α 1 z żywicy kationowymiennej za pomocą buforu zawierającego 50 mM fosforan sodu i 500 mM chlorek sodu przy pH 7,5;

(d) nanoszenie zawierającego rDSPA α 1 eluentu z etapu (c) przy pH 4 na żywicę hydrofobowego oddziaływania z półsztywnych kulistych ziaren zsyntetyzowanych w wyniku kopo4

186 410 limeryzacji glikolu etylenowego z polimerami typu metakrylanu derywatyzowanymi grupami butylowymi;

(e) przemywanie żywicy hydrofobowego oddziaływania za pomocą 20 mM HCl i następnie 20 mM HCl zawierającym 19-procentowy EtOH w celu usunięcia białka nie-rDSPA α 1 i zanieczyszczeń niebiałkowych;

(f) elucję związanego rDSPA α 1 z żywicy hydrofobowego oddziaływania za pomocą buforu zawierającego 29-procentowy etanol i 20 mM kwas solny przy pH 2,5;

(g) nanoszenie zawierającego rDSPA α 1 eluentu z etapu (f) przy pH 2,5 na żywicę chromatografii powinowactwa będącą usieciowanym kopolimerem allilodekstranu z N,N'-metylenobisakryloamidem w postaci ziaren, który może frakcjonować kuliste białka o ciężarze cząsteczkowym w zakresie od 20000 do 8000000 kDa;

h) przemywanie żywicy chromatografii powinowactwa za pomocą 20 mM HCl w celu usunięcia białka nie-rDSPA α 1 i zanieczyszczeń niebiałkowych;

(i) elucję związanego rDSPA α 1 z żywicy chromatografii powinowactwa za pomocą buforu zawierającego 200 mM glicynę przy pH od 4 do 5 w celu wytworzenia czystego rDSPA α 1 w roztworze wodnym.