CZ295854B6 - Způsob stanovení cPSA a testovací kit pro použití při tomto způsobu - Google Patents

Abstract

Způsob stanovení komplexovaného prostatického specifického antigenu (cPSA) ve vzorku krve, spočívá (a) v ošetření celkového PSA (fPSA) ve vzorku krve protilátkou, která se váže na fPSA, ale neváže v podstatě na cPSA, k dosažení alespoň 90 % volného PSA (fPSA) nedetegovatelného imunotestem, a (b) určení PSA v ošetřeném vzorku krve imunotestem, kde je v uvedeném testu detegovatelný v podstatě jenom cPSA. Testovací kit pro použití při tomto způsobu obsahuje (1) první anti-PSA protilátku, která se váže na tPSA, (2) druhou anti-PSA protilátku, která se váže na tPSA, ale která je v podstatě neschopná vazby na PSA, když je PSA navázán na protilátku, která se váže na fPSA, ale nikoliv na cPSA, kde jedna z uvedené první a druhé protilátky je značena a druhá je imobilizována nebo schopná imobilizace za účelem separace z vodné kapalné testovací směsi, a (3) třetí anti-PSA protilátku, která se váže na fPSA, ale ne na cPSA.

Description

Způsob stanovení cPSA a testovací kit pro použití při tomto způsobu

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká způsobu stanovení komplexovaných forem imunologicky určitelného prostatického specifického antigenu (PSA) v krevním vzorku. Vynález se také týká testovacího kitu pro použití při tomto způsobu.

Dosavadní stav techniky

Lidský prostatický specifický antigen (PSA) je glykoprotein o molekulové hmotnosti přibližně 33 000 s vysokou homologií aminokyselin k lidské kalikreinové rodině (1,2) a bylo ukázáno, že to je serinová proteáza s trypsinu a chymoptrypsinu podobnou aktivitou (3,4,5). PSA je sekrenován epiteliálními buňkami prostatické žlázy a je jedním z hlavních proteinů nacházených v semenné tekutině (6). Po zjištění, že se koncentrace PSA zvyšuje v séru pacientů s karcinomem prostaty, stanovilo mnoho zpráv tento protein jako významný a klinicky užitečný biomarker pro sledování pacientů s karcinomem prostaty (7, 8, 9, 10). Poslední snahy byly zaměřeny na použití PSA testování pro časnou detekci karcinomu prostaty u asymptomatických mužů. Skutečně, Američan Cancer Society a Američan Urological Society nyní doporučují, aby všichni muži nad 50 let věku, byli ročně vyšetřování za použití sérového PSA spolu s manuálním rektálním vyšetřením (DRE) (11).

Klinická hodnota časné detekce karcinomu prostaty zůstává kontroverzní z několika důvodů. Za prvé, je nejasné, zda léčba karcinomu prostaty v časných stadiích zlepší použití u postižené populace. Nyní probíhají klinické pokusy zaměřené na tuto otázku. Za druhé, klinické pokusy nyní měří účinnost měření sérového PSA spolu s digitálním vyšetřením per rectum (DRE) pro časnou detekci karcinomu prostaty u lidí nad 50 let věku (12). Ze 1060 pacientů, kteří měli buď abnormální DRE, nebo elevovaný PSA test mělo pouze 22 % karcinom prostaty. Tato data ukazují, že 70 až 80 % všech biopsií prostaty je provedeno u mužů, kteří nemají karcinom. Protože 30 až 50 % mužů nad 50 let věku má důkazy karcinomu prostaty při autopsii, může být množství zbytečných biopsií provedených v důsledku zvýšeného PSA testu velmi vysoké. Toto má za následek zvýšení nákladů na zdravotní péči a zvýšení morbidity asociovanés procedurou biopsie.

Několik laboratoří nezávisle ukázalo, že PSA tvoří komplexy s inhibitory proteázjako je ai-antichymotrypsin (ACT), cq-makroglobulin a a,-antitrypsin (13-19). PSA v komplexu s ACT nebo s a.|-antitrypsinem nebo ve volné, nekomplexované formě, je detegovatelný v séru technikami imunotestů. Skutečně, hlavní část imunorektivního PSA v séru je komplexována s ACT a byla stanovena signifikantní korelace mezi částí PSA navázanou na ACT a celkovou sérovou koncentrací PSA (13). PSA navázaný na a₂-makroglobulin, nicméně, není měřitelný v séru díky sterickému bránění protilátky vázající PSA po vytvoření komplexu s touto proteázou. Ve dřívější práci byly hladiny PSA-ACT a poměr PSA-ACT k celkovému PSA považovány za užitečné v diagnose karcinomu prostaty (13, 15, 16, 17), nicméně, z mnoha důvodů (některé z nich jsou uvedeny níže) bylo obtížné vyvodit závěry pro klinickou použitelnost měření PSA-ACT v séru.

Lilja, Stenman a spolupracovnici publikovali v roce 1991, že sérová hladina PSA existuje ve volné formě a v komplexech s ACT a aj-antitrypsinem (13, 18). V další práci ukázali Stenman et al., že měření PSA-ACT v asociaci s měřením volného plus komplexovaného PSA (nazývaného celkový PSA, ačkoliv PSA komplexovaný s a₂-makroglobulinem není měřen běžnými PSA testy) může zlepšit rozlišení mezi muži s karcinomem prostaty a muži s benigními chorobami prostaty jako je benigní hypertrofie prostaty (BPH). Nicméně, přesné měření PSA-ACT komplexů nebylo dostupné vzhledem k technickým problémům při přesném měření komplexů. Stenman et al. zjistili, že korelace PSA-ACT hodnot s celkovým měřením PSA nebyla dobrá při

-1 CZ 295854 B6 nízkém konci a y zachycení bylo zvýšeno, což ukazuje na nadměrného získání PSA (13 a patent US 5 501 983). Skutečně zjistili, že pro většinu testovaných pacientů byla koncentrace PSA-ACT vyšší než koncentrace celkového PSA (US patent 5 501 983). Následné korelační analýzy pro komplexovaný a volný PSA ukázaly sklon 1,12, který ukazuje na nadměrné získání PSA-ACT komplexu (16). Pettersson et al. určili toto nadměrné získání, když nalezli zvýšené PSA-ACT hodnoty v séru žen (20). Zatímco přidání heparinu redukovalo incidenci falešně pozitivních hodnot v séru žen, pozdější pokusy měřit PSA-ACT komplexy u pacientů s karcinomem prostaty a BPH dále ukázaly signifikanční nadměrné získání komplexů (21).

Vzhledem k problémům při měření PSA-ACT komplexů se pozornost v literatuře zaměřila na měření volného, nekomplexovaného PSA spolu s měřením celkového PSA. Nyní je jasné, že zlepšená specificita je potřeba, pokud jsou hodnoty celkového PSA v rozsahu od 4 až 10 ng/ml. Pokud je celkový PSA v séru < 4,0 ng/ml, pak je riziko karcinomu prostaty nízké; podobně, pokud je celkové PSA v séru > 10 ng/ml, pak je riziko karcinomu prostaty > 50 % a je indikována biopsie prostaty. V diagnostické Šedé zóně (obecně mezi 2 až 20 ng/ml, běžněji mezi 4 až 10 ng/ml) je riziko karcinomu vysoké, ale stupeň falešně pozitivních výsledků je také vysoký. Retrospektivní aplikace poměru volný PSA/celkový PSA ukázala, že specificita celkového PSA v šedé zóně 4 až 10 ng/ml může být zlepšena z asi 50 až 60 % na 70 až 80 % (22 až 26). Tato vylepšená specificita může vést ve 20 až 30 % snížení zbytečných biopsií. PCT WO 96-26441 a WO 97-12245 podobně popisují použití poměru volný PSA/celkový PSA pro zlepšení odlišní mezi BPH a karcinom, v příslušném pořadí, u pacientů s hladinami celkového PSA mezi 2,5 a 20 ng/ml.

Měření volného PSA má nicméně své vlastní technické obtíže. Za prvé, v diagnostické šedé zóně, část volného PSA je typicky dosti nízká, v rozsahu 5 až 30 %. Uspokojivý test na volný PSA musí proto měřit přesně v rozsahu 0,2 až 3,0 ng/ml. Dále, koncentrace volného PSA se signifikantně neliší u pacientů s BPH a karcinomem, a poměr volný PSA/celkový PSA se snižuje díky zvýšení Části PSA komplexovaného na ACT. Kromě toho, volný PSA není stabilní v séru a hladiny volného PSA se s časem snižují, pravděpodobně díky komplexaci s cc₂-makroglobulinem.

Mezitím probíhalo další stadium problémů asociovaných s přesným měřením PSA-ACT v krvi, spojené s pokusy o překonání těchto problémů. V roce 1994 pracovníci vHybritech popsali vývoj sandwichového imunotestu pro PSA-ACT za použití anti-PSA a anti-ACT protilátek. Udělali závěr, že měřené hodnoty PSA-ACT selhaly při demonstraci zlepšené klinické specificky v diagnostice karcinomu prostaty (27). Později tato skupina spolu s pracovníky Johns Hopkins Medical Institutions popsali objev, že anti-PSA/antiACT metoda sandwichového imunotestu je narušena signifikanční nespecifickou vazbou a nadměrným získáním PSA-ACT. Bez vyřešení uzavřeli, že tyto problémy činí měření PSA-ACT klinicky významným (28). Dále tato skupina popsala, že překonala problém nespecifické vazby díky vývoji sandwichového imunotestu pro PSA-ACT založeného na monoklonální protilátce specifické pro PSA-ACT komplex (29, 30). Nicméně, jejich klinické studie selhaly v ukázání jakéhokoli vylepšení specificky pro karcinom prostaty měření PSA-ACT komplexů samotných ve srovnání směřením celkového PSA nebo s kalkulovaným poměrem PSA-ACT k celkovému PSA (29). Jiné přístupy pro překonání problémů asociovaných s měřením PSA-ACT byly navrženy, například použití blokujících agens.

Zůstává nejasné, proč se část PSA komplexovaného na ACT zvyšuje u pacientů s karcinomem prostaty, ale může to být ve vztahu k pozorování, že protilátky k ACT nebarví prostatický epitel od pacientů s BPH a mRNA transkripty nejsou nacházeny v takové tkáni. Oproti tomu, anti-ACT imunoreaktivita a mRNA syntéza jsou detekovány v prostatickém epitelu od pacientů s karcinomem prostaty (32). Tyto výsledky naznačují, že v tumorech prostaty může PSA tvořit komplex in sítu s ACT před uvolněním do séra. Alternativní mechanismy mohou obsahovat přístup aktivního PSA do krevního řečiště. Volný PSA nacházený v séru od zdravých mužů je proteolyticky štěpený a enzymaticky inaktivní. Tumory, nicméně, syntetizující angiogenní faktory,

-2 CZ 295854 B6 které vedou ke zvýšené vaskularizaci nádorové tkáně, je možné, že v tumoru dosáhne větší část enzymaticky aktivního PSA krevního řečiště. Tento aktivní PSA bude zřejmě tvořit komplexy s inhibitory proteáz jako je ACT což povede k vyššímu poměru PSA-ACT komplexů v séru pacientů s karcinomem prostaty.

V souladu s tím zde existuje potřeba pro přesnou metodu pro určení komplexovaného PSA a pro získání klinického významu krevních hladin komplexovaného PSA ve vztahu k vyšetřování mužských pacientů s karcinomem prostaty.

EP 635575 popisuje přípravu monoklonálních protilátek, které se vážou na volný PSA, ale nikoliv na PSA-ACT.

PCT WO 95/18381 se týká monoklonálního/polyklonálního imunometrického testu pro určení PSA, který je schopen poskytnou ekvimolární odpověď na volný a komplexovaný PSA přidáním protilátky, která se váže na volný PSA, ale ne na komplexovaný PSA.

Patentová US přihláška 08/595155 a Zhou Z., Ng P.C., Věry D.L., Allard W.J., Yeung K.K., J. Clin. Lab. Anal. (1996) 10: 155-159, popisují metodu pro přípravu monoklonální protilátky, která poskytuje ekvimolární odpověď na volný a komplexovaný PSA v monoklonálním/polyklonálním imunometrickém testu. Popsaná monoklonální protilátka má jedinečnou vlastnost vazby na PSA za učinění PSA v podstatě neschopným vazby s protilátkami, které se vážou na volný PSA, ale nikoliv na komplexovaný PSA.

Publikovaná japonská patentová přihláška 62-46263 popisuje metodu sandwichového imunotestu pro určení PSA v komplexu s inhibitorem proteáz.

Publikovaná německá patentová přihláška 4 322 342 popisuje metodu pro měření jak celkového PSA, tak PSA-ACT v jednom testu za účelem poskytnutí hodnot pro výpočet poměru PSA-ACT k celkovému PSA.

Chichibu et al., vJoumal of Medicine and Pharmacological Science (Japonsko, 1996) 36(3): 477-483 popisuje sanwichový imunotest pro PSA-ACT využívající anti-PSA vazby na korálky a enzymově značený anti-ACT. Data stanovující schopnost přesně měřit PSA-ACT v krevním vzorku chybí.

Podstata vynálezu

Předmětem tohoto vynálezu je způsob stanovení komplexovaného prostatického specifického antigenu (cPSA) ve vzorku krve, jehož podstata spočívá vtom, že obsahuje kroky:

a) ošetření celkového PSA (tPSA) ve vzorku krve protilátkou, která se váže na volný PSA (fPSA), ale neváže v podstatě na cPSA, k dosažení alespoň 90 % volného PSA (fPSA) nedetegovatelného imunotestem, a

b) určení PSA v ošetřeném vzorku krve imunotestem, kde je v uvedeném testu detegovatelný v podstatě jeden cPSA.

Předmětem tohoto vynálezu je také testovací kit pro použití při způsobu popsaném výše, jehož podstata spočívá v tom, že obsahuje:

1) první anti-PSA protilátku, která se váže na celkový PSA (tPSA),

2) druhou anti-PSA protilátku, která se váže na tPSA, ale která je v podstatě neschopná vazby na PSA, když je PSA navázán na protilátku, která se váže na volný PSA (fPSA), ale nikoliv na

-3 CZ 295854 B6 cPSA, kde jedna z uvedených první a druhé protilátky je značena a druhá je imobilizována nebo schopná imobilizace za účelem separace zvolné kapalné testovací směsi, a

3) třetí anti-PSA protilátku, která se váže na fPSA, ale nikoliv na cPSA.

Dále se uvádějí podrobnější a doplňující údaje k předmětném vynálezu.

Předkládaný vynález poskytuje způsob stanovení komplexovaného PSA (zde označeného jako cPSA) v krevním vzorku ošetřením krevního vzorku takovým způsobem, že nekomplexovaný, tj. volný, PSA (fPSA) je učiněn nedetegovatelným imunotestem, a potom určením PSA v ošetřeném krevním vzorku imunotestem, kde je detegován pouze cPSA. Imunotest může být proveden jakýmkoliv běžným způsobem, ale obvyklejší je kompletitivní imunotest nebo dvou-místný imunometrický test. Předkládaná metoda může být provedena mnohem způsoby, jak je podrobněji popsáno dále. Obecně, takové metody obsahují separační metody, ve kterých je fPSA typicky odstraněn nebo uchován v testovací směsi imunotestu, stejně jako metody, ve kterých jsou antigenní determinanta nebo determinanty fPSA modifikovány, například chemickou interakcí, takže se fPSA stává v podstatě neschopným vazby na protilátku použitou v metodě imunotestu, což účinně eliminuje fPSA z testu.

Byla vyvinuta zejména výhodná metoda dvou-místného imunometrického testu na základě reakčního systému tří protilátek:

a) první anti PSA protilátce (monoklonální nebo polyklonální), která se váže na tPSA a která participuje na imunometrickém testu,

b) druhé anti-PSA protilátce (preferovaně monoklonální), která se také váže na tPSA a která také participuje v imunometrickém testu, ale která je vybrána tak, aby byla v podstatě neschopná vazby na PSA, pokud je fPSA navázán na fPSA specifickou protilátku (tato druhá protilátka je zde nyní označována jako „MMI“), a

c) třetí anti PSA protilátce, která je fPSA specifická, a která je preferovaně monoklonální.

Vzhledem k účasti na imunometrickém testu je jedna z první a druhé anti-PSA protilátek značena za účelem detekce (a může být označena jako „značená“ nebo „detekční“ protilátka) a druhá je imobilizována nebo je schopná imobilizace za účelem separace z testovací směsi („záchytná“ protilátka“). V souladu s tím, mohou být stanoveny testovací podmínky, za kterých se bude fPSA ve vzorku krve vázat s fPSA specifickou (třetí) protilátkou, což činí fPSA ve vzorku neschopným vazby s výše uvedenou MMI (druhou) protilátkou. Protože dvoumístný imunometrický test je závislý na vazbě obou výše uvedených první a druhé protilátky („značené“ a „záchytné“ protilátky) na PSA, způsobí potom vazba fPSA specifické protilátky, že fPSA forma je neschopná detekce ve dvoumístném imunomerickém testu. Bude uvedeno, že i přes skutečnost, že tři protilátky použité v tomto jedinečném testovacím systému jsou všechny specifické pro jednu nebo více forem PSA (to znamená, že žádná z nich není zaměřena na jakýkoliv z inhibitorů proteáz obsažených v cPSA), určité vlastnosti protilátek umožňují specifické určení cPSA.

Bylo zjištěno, že měření hladin pPSA v krvi poskytuje vysoce senzitivní a specifickou metodu pro detekci karcinomu prostaty (CaP). cPSA testy také mají výhodu zvýšené analytické přesnosti ve srovnání s testy využívajícími měření fPSA, protože cPSA je predominantní formou PSA a analytické faktory a faktory prostředí (např. stáří vzorku) ovlivňující distribuci PSA mezi fPSA a cPSA formy mají o mnoho menší účinek na přesnost měření cPSA ve srovnání s měřením fPSA.

Protože cPSA je primárně obsažen v PSA komplexovaném na inhibitor proteáz ai-antichymotrypsin (ACT) dávají PSA-ACT specifické testy také výhodnou senzitivitu, specificitu a jiné vlastnosti cPSA testů.

-4CZ 295854 B6

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1A je grafem ukazujícím inhibici imunoreaktivity fPSA ve dvoumístném imunometrickém testu pro tPSA za přítomnosti tří různých monoklonálních protilátek k E. epitopů PSA. Vzorky obsahující fPSA v množství 50ng/ml byly preinkubovány s každou zanti-fPSA po 30 až 60 minut a podrobeny Bayer Immuno 1™ tPSA testu. Obr. IB ukazuje podobný pokus se dvěma anti-E protilátkami, PSA 20 a ME2, ukázané koncentrace závislé inhibice imunoreaktivity fPSA a v tPSA testu. Vzorky obsahující lOng/ml fPSA byly preinkubovány s buď PDA 20, nebo s ME2 MAb po 30 až 60 minut a byly podrobeny Bayer Immuno 1 tPSA testu.

Obrázek 2A je grafem, který ukazuje, že přídavek anti-E protilátky PSA 20 k tPSA testu poskytuje formát imunotestu pro měření sPSA. Vzorky obsahující asi 11 ng/ml celkového PSA s různými poměry volného a komplexovaného PSA byly měřeny za přítomnosti 300 pg/ml MAb PSA 20 za použití Bayer Immuno 1 analyzátoru. Obr. 2B je podobným grafem ukazujícím, že ME2 MAb může také být použita pro poskytnutí imunotestovacího formátu pro kvantitativní měření pPSA. Vzorky obsahující asi 11 ng/ml celkového PSA s různými poměry volného a komplexovaného PSA byly měřeny za přítomnosti 25 pg/ml MAb ME2 20 za použití Bayer Immuno 1 analyzátoru.

Obrázek 3 je tabulka, která ukazuje, že PSA 20 může být použita k automatizovanému c PSA testu na automatizovaném imunoanalyzátoru. Testovací formát 1 používal MAb PSA 20 přidaný kMMl-fluorescein konjugátu (R) s celkovou inkubační dobou 38 minut. Testovací formát 2 používal preinkubaci PSA 20 MAb se vzorky a celkovou inkubační dobu 78 minut. Všechny výsledky jsou presentovány jako stupeň tvorby barviva.

Obrázky 4A a 4B shrnují výsledky měření celkového, volného a komplexovaného PSA v séru mužů s karcinomem prostaty, BPH nebo zdravých kontrol odpovídajícího věku. Neselektovaná populace pacientů označená „ALL“ obsahuje vzorky pacientů získané od mužů s karcinomem prostaty, BPH nebo zdravých kontrol odpovídajícího věku bez ohledu na hodnoty tPSA. Pokud byly skupiny pacientů stratifíkovány podle hodnot tPSA, pak byly další vzorky pacientů obsaženy v analýze ukázané na obrázku 4A a v cPSA části analýzy ukázané na obrázku 4B, kde další vzorky byly vybrány podle tPSA hodnot pro započtení v diagnostické šedé zóně jak je popsáno dále v popise.

Obrázek 4C je graf regresní analýzy výsledků získaných za použití komerčních testů pro celkový PSA ve srovnání s výsledky získanými za použití preferovaného cPSA testu pro vzorky odebrané od mužů s karcinomem prostaty a s benigním onemocněním prostaty.

Obrázek 5A-5F jsou grafy ukazující korelaci mezi hodnotami cPSA testu a hodnotami PSA-ACT testu získaných při testování séra od mužů s karcinomem, BPH a v normální populaci.

Obrázek 6 je tabulka shrnující výsledky měření cPSA a PSA-Act v séru mužů s karcinomem prostaty, BPH nebo zdravých kontrol odpovídajícího věku. Neselektovaná populace (označená „AU“) a skupiny pacientů stratifíkovaných podle hladiny tPSA byly stejné jako ve studii shrnuté na obrázcích 4A a 4B.

Obrázek 7 je tabulka ukazující korelaci hraničních hodnot (tj. horních hranic normálu) a specificity při vybrané senzitivitě mezi hodnotami testu získanými komerčním tPSA testem, preferovaným cPSA testem a počítáním poměrů fPSA/tPSA.

Jak je zde použito, mají následující termíny tento význam:

PSA znamená prostatický specifický antigen.

-5CZ 295854 B6 tPSA nebo celkový PSA znamená celkové množství imunologicky detegovatelného PSA v krevním vzorku, to znamená, PSA v komplexo váných nebo ve volných formách, které jsou schopné odpovídat na měření běžnými imunotesty. Na základě nynějších znalostí je chápáno, že PSA v krvi, který je komplexován na jisté inhibitory proteáz (včetně ACT, ai-antitrypsinu a inter-α trypsinového inhibitoru) je imunologicky určitelný, zatímco PSA není určitelný, je-li komplexován s jinými inhibitory proteáz jako je a₂-makroglobulin.

fPSA nebo volný PSA znamená PSA v jeho volné, nekomplexované formě.

cPSA nebo komplexovaný PSA znamená tPSA, který není fPSA.

E-epitop znamená soubor epitopů na PSA, které jsou vazebnými místy pro protilátky, které se vážou na fPSA, ale nikoliv na cPSA.

Anti-E protilátky znamená protilátky, které se vážou na E-epitop a tak jsou specifické pro vazbu fPSA.

Protilátka znamená celý imaglobulin, např. IgG nebo IgM, nebo imunoglobulinový fragment obsahující vazebné místo protilátky, např. Fab, Fab' a F(ab')₂ fragmenty nebo jejich agregáty.

Předkládaný vynález poskytuje prostředky pro určení cPSA ve vzorku krve měřením tPSA imunotestem poté, co byl fPSA ve vzorku krve učiněn nedetekovatelným. Odborníkům v oboru je zřejmé, že mnoho imunotestovacích metod může být použito pro měření tPSA a že mnoho prostředků může být použito pro to, aby byl fPSA ve vzorku krve učiněn nedetekovatelným.

Obecně, tPSA imunotestovací metody jsou buď kompetitivní, nebo nekompetitivní. První metoda typicky využívá imobilizované nebo imobilizovatelné protilátky kPSA (anti-PSA) a značené formy PSA. PSA vzorku a značený PSA soutěží o vazbu na anti-PSA. Po separaci vzniklého značeného PSA, který se navázán na anti-PSA (navázaná frakce), od toho, který zůstal nenavázán/nenavázaná frakce), je množství značky buď v navázané, nebo v nenavázané frakci měřeno a může být uvedeno do vztahu s množstvím PSA v testovaném vzorku jakýmkoliv běžným způsobem, např. srovnáním se standardní křivkou.

Nekompetitivní metody jsou častěji používány pro určení tPSA, stím, že nejběžněji je používána dvoumístná imunometrická testovací metoda (někdy označovaná jako „sandwichová“ metoda).

V imunomerickém testu jsou využity dvě anti-PSA protilátky. Jedna anti-PSA protilátka je značená (někdy je označována jako „detekční protilátka“) a druhá je imobilizována neboje imobilizovatelná (někdy je označována jako „záchytná protilátka“). Jak je v oboru známo, záchytná a detekční protilátka mohou být uvedeny do kontaktu simultánně nebo sekvenčně v testovaném vzorku. Sekvenční metoda může být provedena inkubací záchytné protilátky se vzorkem a přidáním značené protilátky předem určenou dobu potom (někdy je toto označováno jako „forward“ metoda); nebo může být detekční protilátka inkubována nejprve se vzorkem a potom může být přidána značená protilátka (někdy je toto označováno jako „reversní“ metoda). Poté, co proběhne nezbytná inkubace, je proto dokončení testu záchytná protilátka separována z kapalné testované směsi a značka je měřena v alespoň části alespoň jedné separované fázi záchytné protilátky nebo ve zbytku kapalné testované směsi, normálně v první uvedené, protože ta obsahuje PSA vázaný („sandwichovaný“) mezi záchytnou a detekční protilátkou.

V typickém dvoumístném imunometrickém testu pro SPA jsou jedna nebo obě ze záchytné a detekční protilátky monoklonální protilátky. Značka použitá v detekční protilátce může být jakákoliv značka běžně používaná v oboru. Obyčejně je značkou enzym nebo chemiluminiscenční skupina, ale může to také být radioaktivní izotop, fluorofor, detekovatelný ligand (např. detekovatelný sekundární vazbou značeným vazebným partnerem pro ligand) a podobně. Významnou vlastností zachycovací protilátky je to, že poskytuje prostředek pro separaci od zbytku testované směsi. V souladu s tím, jak je v oboru známo, může být zachycovací protilátka

-6CZ 295854 B6 zavedena do testu v již imobilizované nebo nerozpustné formě, nebo může býtv imobilizovatelné formě, to znamená, ve formě, která umožňuje provedení imobilizace po zavedení záchytné protilátky do testu. Příklady imobilizované záchytné protilátky jsou protilátky kovalentně nebo nekovalentně připojené na pevnou fázi jako je magnetická částice, latexová částice, jamka mikrotitrační plotny, korálek, kyveta nebo jiná reakční nádoba. Příkladem imobilizovatelné záchytné protilátky je protilátka, která byla chemicky modifikována ligandovou skupinou, např. heptanem, biotinem a podobně, a která může být potom imobilizována kontaktem s imobilizovanou (jak je popsáno výše pro přímo imobilizovanou záchytnou protilátku) formou vazebného partnera pro ligand, např. protilátkou, avidinem a podobně.

Výše popsané imunotestovací metody a formáty jsou zde uvedeny jako příklady a nejsou omezující, protože, obecně, je jasné, že jakákoliv imunotestovací metoda nebo formát mohou být použity v předkládaném vynálezu.

Bude také zřejmé, že prostředky použité pro to, aby se fPSA stal nedetekovatelný v určitém imunotestu se budou velmi lišit. V jednom aspektu mohou takové prostředky zahrnovat izolaci nebo separaci fPSA ve vzorku od zbytku krevního vzorku, ve kterém je imunotest prováděn. Taková separace může vést k fyzikální separaci fPSA frakce z kapalné testované směsi nebo může vést k izolaci nebo k sekvestraci fPSA in šitu v testované směsi. Například, fPSA může být separován a učiněn nedetegovatelným pasážováním testovaného vzorku přes kolonu nebo přes jinou matrici z materiálu, který selektivně odstraňuje fPSA, jako je iontová výměnná adsorpce, filtrace přes molekulární síto, afinitní vazba a podobně, nebo kontaktováním testovaného vzorku s imobilizovanou nebo s imobilizovatelnou formou fPSA-specifické protilátky, jako je anti-fPSA fixovaná na magnetické nebo latexové částice.

V jiném aspektu je fPSA učiněn nedetegovatelným imunotestem ošetřením testovaného vzorku fyzikálními, chemickými (včetně biochemických), nebo jinými prostředky, které konvertují nebo modifikují relevantní antigenní determinanty dostatečně pro učinění fPSA v podstatě neschopným vazby s protilátkou obsaženou v PSA imunotestu. PSA imunotest může potom být proveden přímo ve vzniklé testované směsi. Například, takové ošetření může obsahovat různou denaturaci fPSA a cPSA například zahřátím a ochlazením; adicí chemických denaturačních činidel, která denaturují fPSA antigenní determinanty (E-epitop), zatímco jsou neúčinné vůči cPSA determinantám, které jsou chráněny komplexováním, jako jsou proteázy specifické pro peptidy jedinečné pro region E-epitopu a podobně; adicí biochemických agens, které se váží na nebo jinak blokují region E-epitopu jako jsou proteinové nebo lipidové vazebné molekuly, falešné substráty (např. peptidy, které napodobují normální substrát rozpoznávaný enzymatickým místem v regionu Eepitopu, ale které se váží bez dalšího enzymatického štěpení nebo reakce); a podobně. Výše uvedené prostředky pro provedení požadované imunologické inaktivace fPSA nejsou vyčerpávající a jiné účinné metody budou odborníkům v oboru známé.

Konkrétní jedinečná metoda pro určení cPSA poskytnutá předkládaným vynálezem obsahuje důmyslnou modifikaci běžného dvoumístného imunometrického testu. V této nové metodě je jedna ze záchytných a detekčních protilátek vybrána tak, aby byla schopna vázat tPSA (to znamená, váže se na epitop, který je přítomen jak je fPSA, tak n cPSA), ale není v podstatě schopna vázat se na PSA, pokud je PSA navázán na fPSA specifickou protilátku (tj. anti-E protilátku). Tato jedinečná protilátka je zde označována jako MM1. Tak, přidáním anti-E jako třetí protilátky se fPSA naváže na anti-E a stane se v podstatě neschopný vazby na MM1 a tak v podstatě nedetegovatelným ve dvou-místném imunometrickém testu založeném na MM1.

V této konkrétní preferované metodě jsou druhá protilátka (MM1 protilátka) a třetí protilátka (anti-E protilátka) nezávisle na sobě preferovaně mono-specifické protilátky (např. monoklonální protilátky nebo polyklonální protilátky získané běžnou antisérovou metodou, které byly připraveny tak, že frakce protilátky skládající se v podstatě pouze z protilátky, která se váže na specifický požadovaný epitop), a nejlépe je to monoklonální protilátka. Kromě toho, anti-E protilátka může, pokud je to žádoucí, obsahovat více než jednu protilátku, např. než jednu monoklo

-7CZ 295854 B6 nální protilátku, pro získání požadované inhibice MM1. Bude dále pochopeno, že požadovaný stupeň inhibice vazby MM1 protilátky na fPSA způsobený vazbou anti-E protilátky (nebo protilátek) bude normálně vyšší než asi 90 %, obvykleji vyšší než asi 95 % a nejlépe vyšší než asi 99 %.

Určité preferované monoklonální MM1 protilátky mohou být připraveny mnoha způsoby. V zásadě bude monoklonální protilátka připravena za použití konvenčních technik hybridizace somatických buněk za použití vyšetřovacích metod pro selekci hybridomních buněčných linií, které vedou k izolaci hybridomů, které produkují monoklonální protilátku, mající definované vazebné vlastnosti MM1. Strategie pro takové vyšetřování je selekce protilátek, které blokují vazbu jiných protilátek namířených k epitopům dostupným na fPSA, ale ne na cPSA, např. E-epitopu, ale samy mají v podstatě ekvivalentní vazbu nafPSA a cPSA.

Hybridizace somatických buněk je nyní dobře známou metodou a může být aplikována na předkládaný vynález ve všech jejích variacích podle toho, jak je to vhodné a jak je to požadováno. Obecně, je připravena populace hybridomů fúzí myelomových buněk s lymfocyty odebranými od zvířete, které bylo imunizováno proti analytu. Imunizace hostitelského zvířete, jak je zde použito, znamená, že imunitní systém zvířete byl exponován pro produkci protilátek, které se budou vázat na jeden nebo na více epitopů na požadovaném analytu. Odborníkům v oboru bude jasné, že takový výsledek může být získán mnoha způsoby, včetně, bez omezení, podání nativního analytu, syntetického peptidového imunogenu, transfektantních buněk, které exprimují epitopy analytu na svém povrchu a podobně do krve hostitelského zvířete. Podobně, produkce a získávání monoklonálních protilátek od klonovaných hybridomních buněčných linií je v rozsahu znalostí oboru, a obecně může být při provádění předkládaného vynálezu použita jakákoliv metoda.

Jak je popsána výše, zásadní kriteria pro vyšetřování hybridomů na produkci monoklonální protilátky mající MM1 charakteristiky je, aby produkovaly monoklonální protilátku, která se (i) váže v podstatě ekvivalentně na fPSA a cPSA, ale (ii) je v podstatě schopná vazby na PSA, pokud je PSA vázán na fPSA specifickou protilátku (anti-E protilátku). Alternativně, ale méně preferovaně, mohou být vyšetřovací kriteria taková, aby produkovala monoklonální protilátku, která se (i) váže v podstatě ekvivalentně na fPSA a cPSA, ale (ii) po navázání na PSA činí PSA v podstatě neschopným vazby na protilátky, které jsou specifické pro fPSA, to znamená protilátky, které se vážou na fPSA, ale ne na cPSA. Mechanismus, kterým MM1 monoklonální protilátka podle předkládaného vynálezu účinkuje za dosažení výše uvedených výsledků není jasně znám; nicméně, spekuluje se, že vazba monoklonální protilátky na fPSA (tj. anti-E protilátky) blokuje, maskuje, zatajuje nebo alteruje epitop(y), které jsou dostupné jak je fPSA, tak na cPSA pro vazbu protilátky nebo protilátek namířených na takové epitop(y). Representanty MM1 monoklonální protilátky použité v předkládaném vynálezu jsou MM1 protilátka použitá v Bayer Immuno 1™ PSA testu (Bayer Corporation, Tarrytown, New York, USA); monoklonální protilátky produkované hybridomními buněčnými liniemi 346.7.4 a 346.7.26 deponovanými při podání předkládané přihlášky (Bayer Corporation) v Američan Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA, 10.5. 1997 a označených přírůstkovými čísly HB-12338 a HB-12337, v příslušném pořadí; a monoklonální protilátky, které se vážou na v podstatě stejný epitop jako kterákoliv z výše uvedených protilátek.

Reagens a jiné složky testu nezbytné pro provedení výše popsané jednotlivé preferované metody pro určení cPSA jsou výhodně poskytnuty ve formě testovacího kitu, to znamená, zabaleného souboru nebo kombinace vhodné pro potřeby uživatele a jakéhokoliv analytického vybavení. Minimálně bude testovací kit obsahovat jednotlivou charakterizovanou záchytnou a detekční protilátku a jednu nebo více anti-E protilátek.

Bylo zjištěno, že hodnoty cPSA v krvi mužských pacientů poskytují signifikantní klinický význam ve srovnání se dříve v oboru používanými hodnotami tPSA a hodnotami poměru fPSA/tPSA.

-8CZ 295854 B6

Přesněji, byla provedena počáteční studie za použití vzorků séra od 216 pacientů včetně 53 pacientů s CaP, 75 pacientů s BPH a 88 zdravých kontrol ve věku nad 50 let (infra, data jsou presentována na obr. 4A). V této počáteční studii byla stanovena horní hranice normálního cPSA testu pro poskytnutí ekvivalentní senzitivity pro detekci CaP ve srovnání s měřením tPSA (85 % v. 88 %, v příslušném pořadí). Pro všechny testované pacienty byla specifícita v normálním a BPH populacích také srovnatelná pro cPSA ve srovnání s poměrem fPSA/tPSA. Tato zjištění byla potvrzena v následující studií za použití vzorků séra od 300 bioptovaných pacientů z urologické referenční populace, kde tyto pacienti zahrnovali 75 pacientů s CaP a 225 pacientů bez CaP podle biopsie (data jsou presentovány na obr. 3B, níže). Zjištění, že senzitivita a specifícita tPSA testu použitého spolu s poměrem fPSA/tPSA je ekvivalentní cPSA samotnému byla také potvrzena, když byla populace pacientů stratifíkována do diagnostické šedé zóny. Přesný rozsah diagnostické šedé zóny nebyl definován, ale ve všech rozmezích srovnávaných v této studii byla senzitivita a specifícita cPSA testu srovnatelná se senzitivitou a specifícitou získanou za použití testování jak celkového, tak volného PSA. Tato data ukazují, že jeden test, cPSA, může detegovat karcinom prostaty stejně účinně jako celkový PSA a, kromě toho, má lepší specificitu než byla ukázána pro použití dvou testů, fPA a tPSA.

Ve studiích popsaných výše byl horní limit normálu (někdy označovaný jako hraniční hodnota) vybraný pro data cPSA testu 3,75 ng/ml (vyjádřeno jako ekvivalent koncentrace PSA). Tento horní limit normální hodnoty byl vybrán tak, aby bylo dosaženo v podstatě stejné senzitivity detekce CaP ve skupině mužů s histologicky potvrzeným karcinomem jako je ta, která je získána za použití hraniční hodnoty pro tPSA test 4,0 ng/ml (85 % proti 88 % v počáteční studii a 81 % proti 83 % v další studii). V oboru je samozřejmě známo, že pokud je testován větší vzorek populace, může se horní hranice normálních hodnot cPSA posunout o malý stupeň, nicméně, bylo předpokládáno, že takový horní limit bude za jakýchkoliv okolností spadat do rozmezí mezi až 4 ng/ml (ekvivalentní asi 9 až 12 ng/ml PSA-ACT). Selekce horní hranice normálu nad ng/ml obecně povede ke klinicky neakceptovatelné hladině senzitivity, zatímco selekce horního limitu normálu pod 3 ng/ml může být některými kliniky považována za pokus o zvýšení senzitivity s akceptovatelnou ztrátou specifícity. Nicméně, bude jasné, že pro jakoukoliv danou hladinu senzitivity bude cPSA metoda podle předkládaného vynálezu poskytovat, jako výsledek jednoho testu, signifikantně zlepšenou hladinu specifícity ve srovnání s konvenčními tPSA metodami, a ekvivalentní nebo zlepšenou hladinu specifícity ve srovnání s nedávno publikovanými metodami založenými na poměru výsledku dvou testů, např. fPSA/tPSA. Je také předkládáno, že detekce karcinomu prostaty u asymptomatických mužských pacientů bude signifikantně zlepšena sériovým měřením cPSA v průběhu času, jak to bylo ukázáno pro sériová měření tPSA (29).

Kromě výše uvedeného použití v detekci karcinomu prostaty bude měření cPSA užitečné v monitorování průběhu onemocnění u pacienta, u kterého byl diagnostikován karcinom prostaty, zejména po podání první linie terapie pro karcinom prostaty. Dlouhodobé monitorování takovým pacientů měřením tPSA se ukázalo jako užitečné včasné detekci rekurentního karcinomu prostoty. cPSA je chápán jako pro karcinom specifická forma PSA a je očekáváno, že se tato forma bude zvyšovat v séru spolu s tím, jak budou kryptické nádorové buňky vytvářet metastatická místa a růst. V souladu s tím budou změny v krevních hladinách cPSA v průběhu času korelovat se změnami ve stavu choroby a zejména, zvýšené hladiny cPSA po terapii budou ukazovat na recidivu onemocnění.

Kromě toho, protože je známo, že cPSA je obsaženo primárně v PSA-ACT, jsou klinická signifíkance a výhody měření cPSA rozšířeny i na měření PSA-ACT (jak bylo ukázáno ve studii, jejíž data jsou ukázána na obrázku 6). Principiálně, imunotestovací metody pro určení PSA-ACT, které budou nejvhodnější pro provedení na přístrojích, které jsou nyní dostupné jsou dvoumístné imunometrické testy za použití anti-PSA protilátky v kombinaci s anti-ACT protilátkou nebo protilátkou, která je specifická pro PSA-ACT komplex. Jednou metodou pro získání této druhé protilátky je monoklonální selekce protilátky, která je namířena k konformačnímu epitopu na PSA-ACT komplexu, např. v nebo poblíž bodu na povrchu komplexu, kde se stýkají

-9CZ 295854 B6

PSA a ACT složky. V současnosti, nicméně, nejsou takové metody dostatečně vyvinuty a/nebo mají problémy s analytickým provedením, a pokud nebudou k dispozici další vylepšení, budou techniky měření PSA-ACT vyžadovat těžkopádnější techniky. Například, jak ukázal Leinonem et al., PCA-ACT komplexy mohou být separovány gelovou filtrační (na molekulární m sítu) chromatografií a měřeny v testu, která detegují buď tPSA, nebo jsou specifické pro PSA-ACT (15)·

Předkládaný vynález bude nyní ilustrován, bez omezení, následujícími příklady.

Příklady provedení vynálezu

Materiály:

Anti-PSA protilátky použité v těchto studiích zahrnují MM1, monoklonální protilátku, která rozpoznává epitop exprivovaný na volném PSA a PSA komplexovaném s inhibitory proteáz. Protilátka byla produkována v myší ascitické tekutině a byla purifikována protein A afinitní chromatografií za použití standardních postupů. MP2 je polyklonální n anti-PSA protilátka, která byla produkována v kozách a která byla purifikována afinitní chromatografií na imobilizovaném PSA. PSA 19, PSA 20, PSA 30 (CanAg Diagnostic AB, Gothenburg, Swedden) a ME2 (Biospacific, Emeryville, CA, USA) jsou monoklonální protilátky, které rozpoznávají E-epitop PSA. ACT 53 CanAg Diagnostic) je ACT-specifická monoklonální protilátka. Volný prostatický specifický antigen (Scripps Laboratories, San Diego, CA, USA) byl purifikován z lidské seminální tekutiny di 98% čistoty za použití dodecylsulfát sodný-polyakrylamidové gelové elektroforézy a byl uskladněn v pufru obsahujícím 10 mM Tris, 0,1 % azid sodný, pH 8,0. PSA-ACT (Scripps Laboratories, San Diego, CA, USA) vykazoval > 96% čistotu za použití dodecylsulfát sodný-polyakrylamidové gelové elektroforézy a byl uskladněn v pufru obsahujícím 10 mM octanu sodného, 150 mM chloridu sodného a 0,1 % azidu sodného, pH 5,6.

Bayer Immuno 1™ PSA test

Bayer Immuno 1 test pro celkový PSA (tPSA) je sandwichový test, který využívá monoklonální protilátky pro zachycení a polyklonální protilátky pro detekci PSA. Monoklonální anti-PSA protilátka (MM1) je konjugována na fluorescein (Rl) a afinitně-Afinitně-purifikovaná polyklonální protilátka (MP2) je konjugována a alkalickou fosfatázu (R2). Protilátky jsou ředěny na 1,5 pg/ml pro Rl a na 6,15 pg/ml pro R2 v pufru obsahujícím 100 mM Tris-HCl, pH 7,4 a 5% teplem inaktivované normální kozí sérum (Bioceli Laboratories, Carson, CA, USA). 65 μΐ objem každé ze dvou protilátek je inkubován s 20 μΐ testovaného vzorku v reakční kyvetě po 20 minut při 37 °C a vzniklý imunokomplex (R1-PSA-R2) je zachycen přidáním magnetických částic potažených monoklonální anti-fluorescein protilátkou (20 μΐ). Po kroku promytí pro odstranění přebytku reagens a složek vzorkuje přidáno 300 μΐ a 23 mM p-nitrofenylfosfátu. Stupeň tvorby zabarvení je monitorován měřením absorbance při 405 nebo 450 nm a stupeň tvorby zabarvení je přímo úměrný koncentraci PSA v testovaném vzorku. Další podrobnosti jsou poskytnuty v J. Clin. Lab. Anal. (1996), 10: 155-159. Kalibrace Bayer Immuno 1 analyzátoru je provedena za použití Bayer Immuno 1 SET point^R PSA kalibrátorů, připravených z volného PSA v koncentracích 0, 2, 10, 25, 50 a lOOng/ml. „Cebic-through-zero-fitting“ algoritmus je použit pro generování standardní kalibrační křivky.

Bayer Immuno 1 test pro volný PSA

Protokol použitý pro Bayer Immuno 1 test pro celkový PSA popsaný výše byl adaptován pro měření volného PSA substitucí monoklonální protilátky specifické pro volný PSA (PSA 19, CanAg) konjugované na fluorescein jako R záchytné protilátky. Monoklonální anti-volný PSA Rl byla použita se stejným polyklonálním anti-PSA alkalická fosfatáza konjugátem (R2) jako

-10CZ 295854 B6 byl použit v testu na celkový PSA. R1 konjugát byl ředěn na 2,5 pg/ml a R2 byl použit v koncentraci 6,12 pg/ml. Ostatní podmínky bylo podobné těm, které byly použity v testu pro tPSA kromě toho, že objem vzorku byl 35 μΐ na test a objem přidaných magnetických částic byl 15 μΐ na test.

Bayer Immuno 1 PSA-ACT metoda

Bayer Immuno 1 PSA-ACT testovací formát je stejný jako je Bayer Immuno 1 tPSA test kromě následujících změn: 1) monoklonální protilátka specifická pro ACT, ACT 53, je konjugována na alkalickou fosfatázu a je použita při 2 pg/ml;

2) PSA-ACT je použita jako kalibrační a kontrolní antigen s 50 mM MES pufru, 6% BSA, pH 5,8; a 3) protokol dvou promytí je použit tak, že antigen je nejprve inkubován se záchytnou protilátkou, vzniklý komplex je promyt pro odstranění nenavázaného antigenu nebo jiných složek séra a potom je přidána detekční protilátka.

Výsledky

Selekce a optimalizace specifických protilátek pro inhibici imunoreaktivity volného PSA v testu na celkový PSA

Předkládaný vynález je založen na pozorování, že test na celkový PSA může být upraven tak, že je specifický pro komplexy PSA-inhibitor proteáz přidáním protilátky k E-epiteíu PSA. Čtyři monoklonální protilátky, PSA 19, PSA 20, PSA 30 a ME2, specifické pro E-epitop na PSA molekule, byly testovány na svou schopnost snižovat reaktivitu volného PSA v testu na celkový PSA. Kalibrátory použité v testu na celkový PSA byly připraveny za použití 100% volného PSA purifikovaného ze seminální tekutiny. Anti-E protilátky, PSA 19, PSA 20 a PSA 30 byly přidány k 50 ng/ml PSA kalibrátoru v koncentracích 0, 10, 25, 100 a 200 pg/ml. Po inkubaci při pokojové teplotě po 30 až 60 minut byly tyto vzorky podrobeny jako neznámé vzorky testu na celkový PSA a byly určeny hodnoty PSA. Jak je ukázáno na obrázku 1A, každá ze tří monoklonálních protilátek, PSA 19, PSA 20 a PSA 30 vykazovala signifikantní inhibici reaktivity volného PSA v testu na celkový PSA. Tato snížena imunoreaktivita volného PSA byla závislá na koncentraci každé protilátky, ale pouze PSA 20 dosáhla saturace. Z těchto tří anti E protilátek dávala PSA 20 největší snížení v signálu pro volný PSA.

V odděleném pokusu byly PSA 20 a ME2 srovnávány z hlediska své schopnosti inhibovat vazbu volného PSA v tPSA testu. Monoklonální protilátky byly přidán k 10 ng/ml kalibrátoru v koncentracích od 0 do 400 ng/ml. Jak je vidět na obrázku 1B, ME2 MAb inhibuje vazbu volného PSA v testu na celkový PSA kvantitativně a dosahuje saturace při koncentraci menší než 6,125 pg/ml. Tato data ukazují, že několik protilátek proti E-epitopu má schopnost inhibovat vazbu MM1 protilátky na volný PSA. Nicméně, ME2 MAb inhibuje vazbu volného PSA v testu na celkový PSA při mnohem nižších koncentracích a větším rozsahem než jiné protilátky proti E-epitelu. Tato inhibice může být způsobena vyšší afinitou ME2 protilátky k E-epitopu. Alternativně, E-epitop může reprezentovat soubor epitopů s různými jemnými epitopovými specifitami.

Měření komplexovaného PSA na Bayer Immuno 1 analyzátoru

Přidání MAb PSA 20 a ME2 k testu na celkový PSA eliminuje většinu imunoreaktivity asociované s volným PSA byly připraveny směsi s různými poměry volného a s ACT komplexovaného PSA s celkovými koncentracemi PSA okolo 11 ng/ml. Směsi obsahovaly poměru volného: komplexovaného PSA 100:0, 80:20, 50:50, 20:80 a 0:100. Tyto směsi byly měřeny za použití tří formátů imunotestů na Bayer Immuno 1 analyzátoru: komerčním testu pro celkový PSA (tPSA), Bayer Immuno 1 testu pro volný PSA (fPSA) a Bayer Immuno 1 testu pro komplexovaný PSA

-11 CZ 295854 B6 (cPSA). Bayer Immuno 1 test pro komplexovaný PSA (cPSA) byl shodný jako tPSA test kromě toho, že pro výsledky ukázané na obrázku 2A byla PSA 20 MAb přidána do každého vzorku v konečné koncentraci 300 pg/ml a MMl-fluorescein konjugát byl redukován z 1,5 pg/ml na 0,5 pg/ml. Pro pokus ukázaný na obrázku 2B byla MAb ME2 přidána do každého vzorku v konečné koncentraci 25 pg/ml a MMl-fluorescein konjugát byl znovu použit při 0,5 pg/ml. Pro měření celkového PSA a volného PSA byl Bayer Immuno 1 analyzátor kalibrován Bayer Immuno 1 SET point PSA kalibrátorem, který je komerčně používán pro Bayer Immuno 1 test pro celkový PSA. Pro měření komplexovaného PSA (cPSA) byly připraveny kalibrátory v rozmezí 0 až 100 ng/ml za použití PSA komplexovaného na ACT v 50 mM MES, 6% BSA, pH 5,8.

Přidání MAb PSA 20 k testu pro celkový PSA poskytuje metodu s téměř kvantitativní reaktivitou s komplexovaným PSA (obr. 2A). Odpověď na různé směsi v cPSA testu byla lineární, a měření koncentrace celkového PSA a komplexovaného PSA dávaly souhlasné výsledky okolo asi 10 ng/ml pro všechny testované vzorky, jak bylo očekáváno. Podobně, MAb ME2 poskytuje metodu s kvantitativní reaktivitou s komplexovaným PSA v úplném rozsahu poměrů volného a komplexovaného PSA (obr. 2B). Kromě toho, test na komplexovaný PSA s MAb ME2 využívá signifikantně nižších koncentrací ME2 MAb (25 pg/ml). Tato data ukazují, že tři protilátky, které reagují s různými epitopy na molekule PSA (MM1, MP2 a buď PSA 20, nebo ME2) mohou být použity v kombinaci pro produkci metody, která přesně měří komplexovaný PSA.

Automatizace cPSA testu

Předošetření vzorků od pacienta MAb k E-epitopu není praktické pro aplikaci v prostředí klinických laboratoří. Přesné dávkování MAb do vzorku je obtížné a časově náročné a vede k neakceptovatelné pravděpodobnosti nepřesnosti ve výsledku. Proto byly vyvinuty metody pro úplnou automatizaci testu na cPSA.

Automatizované MAb PSA 20 metody

V testovacím formátu 1 byla MAb PSA 20 přidána kRl, MMl-fluorescein, reagens v koncentraci 500 pg/ml a test byl proveden jako pro tPSA metodu a použití PSA-ACT pro kalibraci. Tento test trvá 38 minut. V testovacím formátu 2 je vzorek předošetřen MAb PSA 20.

V tomto formátu byla PSA 20 protilátka přidána do reakční kyvety spolu se vzorkem od pacienta a byla inkubována po dobu 50 minut. Potom byl přidány MMl-fluorescein v koncentraci 0,5 pg/ml, MP2-ALT v koncentraci 6,15 pg/ml a magnetické částice potažené anti-fluorescein protilátkou a byly inkubovány po dalších 28 minut. Po vymytí přebytečných reagens a nezreagovaného séra byl přidán substrát a tvorba zabarvení byla monitorována stejným způsobem jako pro tPSA test. Vzorky obsahující volný PSA v koncentraci od 2 ng/ml do 25 ng/ml byly použity. Výsledky na obrázku 3 ukazují, že signál s volným PSA může být účinně redukován na velmi nízké hladiny za použití těchto přístupů. Tyto výsledky naznačují, že tato metoda může být plně automatizována na Bayer Immuno 1 analyzátoru.

Automatizovaná MAb ME2 metoda

MAb ME2 inhibuje vazbu MM1 MAb na fpSA v tetu na tPSA při signifikantně nižších koncentracích a ve větším stupni než PSA 20 MAb. Kromě toho, testovací formy 2 trvá dále a potřebuje dvě kazety reagens. Proto, ME2 MAb byla vybrána pro použití jako třetí protilátka pro automatizaci sPSA testu přidáním do tPSA testu dvěma způsoby — ME2 v koncentraci 50 a 100 ng/ml byla přidána buď k reagens 1 (R), nebo k reagens 2 (R2). Výsledky ukazují, že reaktivita fPSA byla inhibována z 97 % a 98 %, když byla ME2 přidána do R1 nebo R2, v příslušném pořadí. Na základě těchto dat bylo určeno, že cPSA test může být formulován za použití ME2 MAb v R2 reagens v konečné koncentraci 100 pg/ml.

-12 CZ 295854 B6

Měření komplexovaného PSA v séru

Předběžná studie

Vzorky séra od 53 pacientů s karcinomem prostaty, 75 pacientů s BPH a 88 vzorků od zdravých kontrolních subjektů odpovídajícího věku byly analyzovány za použití třech testů: tPSA, fPSA a cPSA. Vzorky testované cPSA testu byly předošetřeny 25 pg/ml ME2 protilátky a vzorky testované v fPSA a tPSA testech nebyly předošetřeny. Tyto testy byly kalibrovány za použití buď volného PSA, nebo PSA-ACT komplexů popsaných výše. Výsledky těchto testů jsou ukázány na obrázku 4A. Horní hranice normální hodnoty 3,75 ng/ml (vyjádřená jako ekvivalent koncentrace PSA) byla vybrána tak, aby byla dosažena senzitivita detekce CaP ve skupině mužů s histologicky potvrzeným karcinomem stejná, jako je ta, která je dosažena za použití hraniční hodnoty 4,0 ng/ml pro tPSA test (85 % ve srovnání 88 %). S tímto horním limitem normálu byla specificita v normálních a BPH populacích testovaných v této studii také srovnatelná pro cPSA ve srovnání s dvoukrokovým testem, ve kterém byly pozitivní tPSA výsledky následovány provedením fPSA testu a výpočtem poměru fPSA/tPSA. Zjištění, že senzitivita a specificita tPSA testu použitá spolu s poměrem fPSA/tPSA je stejná jako tytéž hodnoty pro cPSA samotný bylo také potvrzeno, pokud byla populace pacientů stratifikována do diagnostické šedé zóny. Přesný rozsah diagnostické šedé zóny nebyl stanoven, ale při všech rozmezích srovnávaných v této studii byla senzitivita a specificita cPSA testu srovnatelná se senzitivitou a specifícitou získanou za použití obou testů na celkový a volný PSA. Tato data ukazují, že jeden test, cPSA, může detegovat karcinom prostaty stejně účinně jako celkový PSA a, kromě toho, má lepší specifícitu než byla ukázána pro použití dvou testů, fPSA a tPSA.

Klinická studie

Vzorky séra od 300 bioptovaných pacientů (75 s potvrzeným karcinomem prostaty) byly analyzovány za použití třech testů: tPSA (pro použití Hybritech Tandem^R PSA testu, San Diego, California, USA), fPSA (za použití Hybritech Tandem^R volný PSA testu) a cPSA (za použití automatizované Mab ME2 metody opsané výše). Tyto testy byly kalibrovány za použití buď volného PSA, nebo PSA-ACT komplexů jak je popsáno výše. Výsledky těchto testů jsou ukázány v tabulce na obrázku 4B a jako regresní analýza na obrázku 4C. Horní hranice normální hodnoty 3,75 ng/ml (vyjádřená jako ekvivalent koncentrace PSA) byla znovu vybrána tak, aby byla dosažena senzitivita detekce CaP ve skupině mužů s histologicky potvrzeným karcinomem v podstatě stejná, jako je ta, která je dosažena za použití hraniční hodnoty 4,0 ng/ml pro tPSA test (81 % ve srovnání s 83 %). S tímto horním limitem normálu byla specificita v normálních a BPH populacích testovaných v této studii také srovnatelná pro cPSA ve srovnání s dvoukrokovým testem (výše, tPSA + fPSA/tPSA). Na obrázku 4C, data objevující se v dolním pravém kvadrantu grafu reprezentují ty nekarcinomové pacienty (34 ze 117, nebo 29 %), kteří se vyhnuli riziku, diskomforgitu a nákladnosti biopsie a jejichž hodnota cPSA, spíše než tPSA, byla použita jako základ pro toto lékařské rozhodnutí. Také, jako v pilotní studii, zjištění, že senzitivita a specificita tPSA testu použitá spolu s poměrem fPSA/tPSA je stejná jako tytéž hodnoty pro cPSA samotný bylo také potvrzeno, pokud byla populace pacientů stratifikována do diagnostické šedé zóny (výše).

Data z nezávislých pilotní a klinické studie ukazují, že jeden test, cpSA, může detekovat karcinom prostaty stejně účinně jako celkový PSA a, kromě toho, má lepší specifícitu, než byla ukázána pro použití dvou testů, fPSA a tPSA.

Korelace mezi cPSA a PSA-ACT

Pro určení toho, jaké druhy cPSA jsou měřeny v cPSA testu byl vyvinut test pro měření PSA komplexovaného s ACT. Tento druh komplexovaného PSA byl popsán jako predominantní forma komplexovaného PSA v séru. Dřívější pokusy o měření PSA-ACT za použití manuálních metod se setkávaly s technickými obtížemi jak bylo uvedeno výše. V souladu s tím, byl vyvinut

-13 CZ 295854 B6 automatizovaný imunotest pro měření PSA-ACT komplexů na Bayer Imuno 1™ systému. Stejná populace pacientů jako byla popsána výše v pilotní studii byla testována za použití automatizovaného testu pro PSA-ACT. Výsledky jsou ukázány na obrázcích 6A - 6F, kde jsou výsledky získané za použití automatizovaného PSA-ACT testu regredovány proti výsledkům získaným v automatizovaném cPSA testu. Pro každou populaci pacientů, tj. normální, s karcinomem prostaty a s benigním onemocněním prostaty (BPH) byla provedena regresní analýza pro všechny vzorky od pacientů, a v rozsahu obsahujícím většinu výsledků testu pacientů. Toto bylo provedeno pro eliminaci sklonu v regresní analýze způsobeného malým počtem vysokých hodnot. Za jakýchkoliv okolností byl sklon regresní křivky od 0,93 do 0,98. Tato data naznačují, že přibližně 93 až 98 % substancí měřených v cPSA testuje PSA-ACT. Biochemický charakter zbylých 2 až 7 % cPSA je dosud neznámý.

Specificita PSA testů a vybrané senzitivity

Horní limit normálně použitý pro cPSA test byl vybrán tak, aby dával stejnou senzitivitu jako tPSA test. Za použití této hraniční hodnoty bylo ukázáno, že cPSA test poskytuje lepší specifícitu než nyní v lékařské praxi používané metody, tj. tPSA. Specificita cPSA testu byla také měřena za použití různých hodnot pro horní limit normálu. Všechny výsledky odvozené z klinických studií popsaných výše byly použity v Receiver Operátor Characteristic (ROC) analýze. Specificita byla potom určena z ROC analýzy při různých hladinách senzitivity v rozsahu od 80 až 100%. Senzitivity menší než 80 % měly malou medicínskou hodnotu, protože nyní v praxi používané diagnostické metody dávají alespoň tuto hladinu senzitivity. Výsledky ukázané na obr. 7 ukazují, že při všech hladinách senzitivity poskytuje cPSA test lepší senzitivitu proti tPSA a přibližně stejnou nebo o něco lepší senzitivitu než pro použití dvou testů, fPSA a tPSA. Kromě toho, zlepšení specificky bylo potvrzeno i když byly vzorky od pacientů stratifikovány do diagnostické šedé zóny. Tyto výsledky dále ukazují, že horní hranice normálo pro cPSA test může být vybrána v širokém rozmezí, v závislosti na požadované hladině senzitivity a specificity, ale že při všech hodnotách pro horní hranici normálu v rozmezí okolo 3 až 4 ng/ml dává cPSA test zlepšenou specifícitu proti tPSA a přibližně stejnou specifícitu jako poměr fPSA/tPSA.

Předkládaný vynález byl výše popsán a doložen příklady. Je jasné, že může být provedeno mnoho variací a modifikací bez odchýlení se od duchu a rozsahu vynálezu.

Literatura

1. Wang MC, Valenzuela LA, Murphy GP, Chu TM. Purification of a human prostatě specifíc antigen. InvestUrol 1979; 17:1959-63.

2. Watt WK, Lee PJ, Timkulu TM, Chán WP, Loor R. Human prostate-specific antigen: structure and functional similarity with serine proteázes. Proč Nati Acad Sci USA 1986; 83:3166-70.

3. Akiyama K, Nakamura T, Iwanaga S, Hara M. The chymotrypsin-like activity of human prostate-specific antigen, r-seminoprotein. FEBS Letters 1987; 225:168-72.

4. Christensson A, Laurel CB, Lilja H. Enzymatic activity of prostatic-specific antigen and its reactions with extracellular serine proteinase inhibitors. Eur J Biochem 1990; 194:755-763.

5. Lilja H. A kallikrein-like serine proteáze in prostatic fluid cleaves the predominant seminal vesicle protein. J Clin Invest 1985; 76: 1899-903.

6. Lilja H, Abrahamsson PA. Three predominant proteins secreted by the human prostatě gland. Prostatě 1980; 12:29-38.

-14CZ 295854 B6

7. Papsidero LD, Wang MC, Valenzuela IA, Murphy GP, Chu Tm. A prostatě antigen in sera of prostatě cancer patients. Cancer Res 1980; 40:2428-2432.

8. Lange PH. Prostatě specific antigen in diagnosis and management of prostatě cancer. Supplement to Urology 1990; XXXVI.-25-29.

9. Oestarling JE. Prostatě specific antigen: a critical assessment of the most useful tumor markér for adenocarcinoma of the prostatě. J Urol 1991; 1945:907-923.

10. Armbruster DA. Prostate-secific antigen: biochemistry, analytical methods and clinical application. Clin Chem 1993; 39:181-195.

11. Američan Cancer Society: Cander facts & figures-1995. Američan Cancer Society, lne., Atlanta, GA. Page 11.

12. Catalana WJ. Richie JP, Ahmann FR, Hudson MA, Scardino PT, Flanigan RC, deKamion JB, Ratliff TL, Kavoussi LR, Dalkin BL, Waters, WB, Mc Farlane MT a Southwick PC. Comparison of digital rectal examination and sérum prostatě specific antigen in the early detection of prostatě cancer: results of a multicenter clinical trial of 6,630 men. J Urol 1994; 151:1283-1290.

13. Stenman UH, Leinonen J, Alfthan H, Rannikoo S, Tuhkanen K, Alfthan O. A complex between prostate-specific antigen and al21-antichymotrypsin is the major form of prostatespecific antigen in sérum of patients with prostatic cancer: assay of the complex improves clinical senzitivity for cancer. Cancer Res 19912; 51: 222-266.

14. Zhou AM, Tewari PC, Bluestein BL, Caldwell, GW, Larsen FL. Multiple forms of prostatespecific antigen in sérum: differences in immunorecognition by monoclonal and polyclonal assays. Clin Chem 1993; 39:2483-91.

15. Leinonen J. Lovgren T. Vomanen T, Stenman UH. Doublelabe time-resolved immunofluorometric of prostate-specific antigen and its complex with αι-antichymotrypsin. Clin Chem 1993: 39:2098-2103.

16. Christensson A, Bjork T, Nilsson O, Dahlen U, Matikainen MT, Cockett AT, Abrahamssion PA. Sérum prostatě specific antigen complexed with cq-antichymotrypsin as an indicator of prostatě cancer. J Urol 1993; 150:100-105.

17. Lilja H, Significance of different molecular forms of sérum PSA. The free, noncomplexed forms of PSA versus that complexed to cq-antichymotrypsin. Urol Clin North Am 1993; 20(4):681-686.

18. Lilja H, Christensson A. Dahlen U, Matikainen M-T, Nilsson O, Pettersson K and Lovgreen T: Prostatě specific antigen in humanserum occurs predominantly in complex with alpha-antichymotrypsin Clin Chem 1991; 37:1618-1625.

19. Bjork T. Hulkko S. Bjartell A, Santagnese AD, Abrahamsson P-A, Lilja H. Alphajantichymotrypsin production an PSA-producing cell is common in prostatě cancer but rare in benign prostatic hyperplasia. Urology 1994; 43:427-434.

20. Pettersson K, Piironen T, Seppala M, Liukkonen L, Christensson A, Matikainen M-T, Suonpaa M, Lovgren T, Lilja H. Free and complexed prostate-specific antigen (PSA): in vitro stability, epitope map, and development of immunofluorometric assays for specific and senzitive detection of fee PSA and PSA-a₂-antichymotrypsin complex. Clin Chem. 1995; 41:1480-1488.

-15 CZ 295854 B6

21. Wu JT, Wilson L, Zhang P, Meikle SW, Stephenson R. Correlation of sérum concentrations of PSA-ACT complex with total PSA in random and seriál specimens from patients with BPH and prostatě cancer. J Clin Lab Anal 1995 9:15-24.

22. Mitrunen K, Pettersson K, Piironen T, Bjork T, Lilja H, Lovgren T. (1995) Duál label one-sterp immunoassay for simultaneous measurement of free and total prostatě specific antigen concentrations and ratios in sérum. Clin Chem 1995 41 (8): 1115-1120.

23. Catalona WJ, Smith DS, Wokfert RL, Wang TJ, Rittenhouse HG, Ratliff TL, Nadler RB. Evaluation of percentage of free sérum prostatespecific antigen to improve specifícity of prostatě cancer screening. JAMA 1995 274(15): 1214-1220.

24. Prostigiacomo AF, Stamey TA. Clinical usefulness of free and complexed PSA. Scan J Clin Lab Invest 1995 55Supple221:32-34:

25. Wang TJ, Hill TM, Sokoloff RL, Frankenne F. Rittenhouse HG, Wolfert RL, Duál monoclonal antibody immunoassay for free prostatespecific antigen. Prostatě 1996 28:10-16.

26. Jung K, Stephan C, Lein M, Henkne W, Schnorr D, Brux B, Schurenkamper P, Loening SA. Analytical performance and clinical validity of two free prostate-specific antigen assays compared. Clin Chem 1996 42(7):1026-1033.

27. Wang TJ, Hill T, Sokoloff R, Frankenne F, Wolfert R, a Rittenhouse H. Monoclonal antibody sandwich immunoassay to quantitate fee PSA in bening hyperplasia and prostatě cancer. Poster presentation at 1994 ISOBM meeting.

28. Chán D, Kelley CA, Partin AW, Linton J, Wang TJ, Sokoloff RL, Rittenhouse HG, a wolfert RL, Clin Chem (1996) 42(6):S255.

29. Wang TJ. Linton J. Payne J, Rittenhouse HG, Wolfert RL, Chán DW, Kelley CA and Partin AW. Clinical utility of a complexed PSA immunoassay with a specific monoclonal antibody to PSA-ACT. J Urology (1997) 157 (4) Suppl: 147:

30. Wang TJ, Linton HJ, Payne J, Liu R-S, Kuus-Raichen K, Rittenhouse HG, Kelley C, Cox J, Chán DW, and Wolfert RL. Development of monoclonal antibodies specific for the PSA-ACT complex ant thier incorporation into an immunoassay. Clin Chem (1997) 43 (6): S225.

31. Zhang P and Wu, JT. Development of an immunassay for the PSA-ACT complex in sérum without interference of non-specific adsorption. Clin Chem (1997) 43 (6): S236.

32. Bjork T, Bjartell A, Abrahamsson P-A, Hulkko S, Di Sanťagnese A, Lijla H, Alphai-antichymotrypsin production in PSA-producing cell is common in prostatě cancer but rate in bening prostatic hyperplasia. Urol 1994 43 (4): 427-434.

33. Carter HB, pearson JD, Metter J, Brant LJ, Chán DW, Andres R, Fozart JL and Walsh PC. Longitudinal evaluation of prostatespecific antigen levels in men with and without prostatě disease. JAMA 1992 267(16):2215.

Claims (3)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Způsob stanovení komplexovaného prostatického specifického antigenu (cPSA) ve vzorku krve, vyznačující se tím, že obsahuje kroky:

   a) ošetření celkového PSA (tPSA) ve vzorku krve protilátkou, která se váže na volný PSA (fPSA), ale neváže v podstatě na cPSA, k dosažení alespoň 90 % volného PSA (fPSA) nedetekovatelného imunotestem, a

   b) určení PSA v ošetřeném vzorku krve imunotestem, kde je v uvedeném testu detekovatelný v podstatě jenom cPSA.

   2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že imunotestem je dvoumístný imunometrický test.

   3. Způsob podle nároku 2, vy znač u j í cí se tí m , že obě ze dvou protilátek použitých ve dvoumístném imunometrickém testu jsou monoklonální.

   4. Způsob podle nároku 1, vy z n a č uj í c í se t í m , že obsahuje kroky:

   a) kontaktování vzorku krve se třemi anti-PSA protilátkami za vytvoření kapalné testovací směsi:

   i) první anti-PSA protilátkou, která se váže na celkový PSA (tPSA), ii) druhou anti-PSA protilátkou, která se váže na fPSA, ale neváže na cPSA, přičemž vázání uvedené protilátky na fPSA poskytuje alespoň 90 % fPSA neschopného detekce při tomto způsobu, iii) třetí anti-PSA protilátkou, která se váže na tPSA, ale která je v podstatě neschopná vázání na PSA, když PSA je vázán protilátkou, která se váže na volnou PSA (fPSA), ale nikoliv na cPSA, kde jedna z uvedené první a druhé protilátky je značena („značená protilátka“) a druhá je imobilizována nebo schopná imobilizace za účelem separace z kapalné testovací směsi („záchytná protilátka“),

   b) separování uvedené záchytné protilátky z kapalné testovací směsi, a

   c) měření značky v separované fázi záchytné protilátky nebo ve zbytku kapalné testovací směsi.

   5. Testovací kit pro použití při způsobu podle nároku 1,vyznačující se tím, že obsahuje:

   1) první anti-PSA protilátku, která se váže na celkový PSA (tPSA),
2. 2) druhou anti-PSA protilátku, která se váže na tPSA, ale která je v podstatě neschopná vazby na PSA, když je PSA navázán na protilátku, která se váže na volný PSA (fPSA), ale nikoliv na cPSA, kde jedna z uvedené první a druhé protilátky je značena a druhá je imobilizována nebo schopná imobilizace za účelem separace z vodné kapalné testovací směsi, a
3. 3) třetí anti-PSA protilátku, která se váže na fPSA, ale nikoliv na cPSA.

   -17CZ 295854 B6

   6. Testovací kit podle nároku 5, vy z n a č uj í c í se t í m , že druhou anti-PSA protilátkou je monoklonální protilátka.

   7. Testovací kit podle nároku 5 nebo 6, vy z n a č uj í c í se t í m , že třetí anti-PSA proti5 látkou je monoklonální protilátka.

   8. Testovací kit podle některého z nároků 5 až 7, vyznačující se tím, že první anti-PSA protilátkou je monoklonální protilátka.