CZ297682B6

CZ297682B6 - Vodný inzulinový prípravek a zpusob jeho prípravy

Info

Publication number: CZ297682B6
Application number: CZ0395798A
Authority: CZ
Inventors: Logstrup Kimer@Lone; Balschmidt@Per; Jensen@Steen
Original assignee: Novo Nordisk A/S
Priority date: 1996-06-20
Filing date: 1997-06-19
Publication date: 2007-03-07
Also published as: HUP9904156A3; PL330828A1; CA2258099A1; EP0910402B1; NO324276B1; NO985978L; PL188736B1; ES2292189T3; CN1222084A; CN1198643C; BR9709844A; DE69737995D1; NO985978D0; JP2000513343A; WO1997048413A1; CZ395798A3; IL127365A0; HUP9904156A2; AU3166597A; ATE369146T1

Abstract

Je popsán vodný inzulinový prípravek, obsahující vodný analog lidského inzulinu, kde se v pozici B28 nalézá, Asp, Lys, Leu, Val nebo Ala a v pozici B29 se nachází Lys nebo Pro, nebo lidský inzulin des(B28-B30), des(B27) nebo des(B30), a protamin, a b) 100 az 400 mM mannitol, pricemz je koncentrace analogu inzulinu 60 az 3000 nmol/ml. Dále je popsán zpusob prípravy inzulinového prípravku obsahujícího jak rozpustený, tak krystalický analog inzulinu, zahrnující kroky: a) prípravu kyselého roztoku obsahujícího analog lidského inzulinu, zinek a subisophanické mnozství protaminu; b) prípravu alkalického roztoku obsahujícího látku pusobící jako pufr pri fyziologickém pH; pricemz alespon jeden z výse uvedených roztoku dále obsahuje fenolickou slouceninu a alespon jeden z výse uvedených roztoku dále obsahuje mannitol; c) smísení kyselého a alkalického roztoku a poprípade upravení pH na hodnotu vrozmezí 6,5 az 8,0; a d) ponechání výsledné suspenze pro srázení.

Description

Vodný inzulínový přípravek a způsob jeho přípravy

Oblast techniky

Předložený vynález se týká vodného inzulínového přípravku, který obsahuje lidský inzulín nebo jeho analog, přičemž tento přípravek má lepši fyzikální stabilitu. Vynález se dále zabývá parenterálně aplikovanými prostředky, které tyto inzulínové přípravky obsahují a způsoby, jak zdokonalit fyzikální stabilitu inzulínových přípravků.

Dosavadní stav techniky

Diabetes je obecné označení pro poruchy u lidí, kteří mají nadměrné vylučování moči jako u úplavice cukrové (cukrovka, diabetes melitus) a úplavice močové (žíznivka, diabetes insipidus). Cukrovka je metabolická porucha, při níž je schopnost využívat glukózu více či méně zcela ztracena. Asi 2 % všech lidí trpí diabetem.

Od zavedení inzulínu v dvacátých letech minulého století byly udělány velké pokroky při zdokonalování léčení cukrovky. Aby se vyhnuli extrémním hladinám cukru v krvi, diabetičtí pacienti často praktikují injekční terapii, kdy je inzulín podáván s každým jídlem.

Při léčení cukrovky se doporučuje a používá velké množství inzulínových přípravků, jako je normální inzulín. Semilente® inzulín, Isophane inzulín, zink-inzulin, protamin zink-inzulin a Ultralente® inzulín. Diabetičtí pacienti se léčí inzulínem několik desetiletí, proto je velká potřeba inzulínových přípravků, které jsou bezpečné a zlepšují kvalitu života pacientů. Pro některé komerčně dostupné inzulínové přípravky je charakteristický rychlý nástup jejich účinku, jiné přípravky mají relativně pomalejší nástup účinku, ale vykazují více či méně prodloužené působení. Rychle působící inzulínové přípravky jsou obvykle roztoky inzulínu, zatímco zpomaleně působící inzulínové přípravky mohou být suspenze, obsahující inzulín v krystalické anebo amorfní formě, vysrážené přidáním buď samotných solí zinku, nebo přídavkem protaminu, nebo jejich kombinací. Navíc někteří pacienti užívají přípravky, které mají jak rychlý nástup účinku, tak prodloužené působení. Takový přípravek může být inzulínový roztok, kde jsou suspendovány krystaly inzulínu s protaminem. Někteří pacienti si sami zhotovují konečný přípravek smícháním inzulínového roztoku se suspenzním přípravkem v poměru požadovaném dotyčným pacientem.

Normálně jsou inzulínové přípravky podávány formou subkutánní injekce. Co je důležité pro pacienta, je průběh působení inzulínového přípravku, což je vliv inzulínu na metabolizmus glukózy, v závislosti na čase uplynulém od injekce. Na tomto průběhu jsou mimo jiné důležité čas začátku účinku, maximální úroveň a celková doba působení. Pacienty jsou vyžadovány rozmanité inzulínové přípravky s odlišným časovým průběhem působení. Tentýž pacient může v jednom dnu použít inzulínové přípravky s velmi odlišnými průběhy působení. Požadovaný časový průběh působení závisí např. na denní době a na množství a složení kteréhokoli pacientova jídla.

Stejně důležitá je však fyzikální stabilita inzulínového přípravku, kvůli rozšířenému užívání injekčních zařízení - inzulínových per, což jsou zařízení obsahující zásobníky Penfill®, v nichž je inzulínový přípravek uložen do doby, dokud není zásobník vyprázdněn. To může u zařízení obsahujících zásobníky o obsahu 1,5 až 3,0 ml trvat přinejmenším 1 až 2 týdny.

První stabilní neutrální inzulínová suspenze byla vyvinuta Scottem a Fischerem (J. Pharmacol. Exp. Ther. 58 (1936), 78), kteří objevili, že přítomnost nadbytku protaminu a zinkových solí (2 pg zinku na IU (mezinárodní jednotka - intemational unit) inzulínu) může stabilizovat

- 1 CZ 297682 B6 protaminový inzulínový přípravek, popsaný v Hagedom a kol., J. Am. Med. Assn. 106(1936), 177-180.

Protamin zink-inzulin, vyráběný podle lékopisů Spojených Států anebo lékopisů evropských, obsahují amorfní protamin zink-inzulin a rovněž krystalický protamin zink-inzulin. Čerstvě připravený protamin zink-inzulin obsahuje hlavně amorfní sraženinu, která se bude v průběhu skladování přeměňovat na krystalické částice, což vede k protrahovanému působení.

Zcela krystalická modifikace protamin zink-inzulinu, označovaná NPH inzulín nebo Isophane inzulín byla vyvinuta Krayenbiihlem a Rosenbergem (viz Rep. Stěno Mem. Hosp. Nord. Insulinlab. 1 (1946), 60; a dánský patent č. 64 708). Zjistili, že inzulín a protamin, pokud jsou smíchány v určitých poměrech při neutrálním pH a v přítomnosti malého množství zinku a fenolu, nebo fenolových derivátů, s výhodou m-krezolu, vytvoří amorfní sraženinu, která se v průběhu stání postupně, ale kompletně přemění na protáhlé tetragonální krystaly, ohraničené na koncích pyramidovými čelními stěnami, inzulín a protamin z lososa společně krystalizují v hmotnostním poměru, odpovídajícím 0,09 mg protamin-sulfátu na mg inzulínu. Pro přípravu tetragonálních krystalů jsou nezbytné zinek v množství přinejmenším 0,15 pg na IU a látka typu fenolu v koncentraci vyšší než 0,01 %.

Zpočátku byl tento druh krystalů připravován za použití vepřového a hovězího inzulínu z přírodních zdrojů, ale od 80 let se používá též lidský inzulín, připravený pomocí genového inženýrství, nebo částečnou syntézou.

Lidský inzulín sestává ze dvou polypeptidových řetězců, tzv. řetězců A a B, které obsahují 21 a 30 aminokyselin. A a B řetězce jsou vzájemně spojeny dvěma cysteinovými disulfidickými můstky. Inzulín od většiny ostatních druhů má podobnou stavbu, ale nemusí obsahovat stejné aminokyseliny na odpovídajících pozicích v řetězci, jako u lidského inzulínu.

Rozvoj postupů, známých jako genové inženýrství, umožnil snadno připravit velké množství rozmanitých inzulínových sloučenin, analogických lidskému inzulínu. U těchto analogů inzulínu byla jedna nebo více aminokyselin nahrazena jinými aminokyselinami, které jsou kódovány nukleotidovými sekvencemi. Protože lidský inzulín, jak bylo vysvětleno výše, obsahuje 51 aminokyselinových zbytků, je zřejmé, že je možný veliký počet analogů inzulínu a skutečně bylo připraveno velké množství těchto analogů, často se zajímavými vlastnostmi. V roztocích lidského inzulínu o koncentracích v oblasti injekčních přípravků, je inzulínová molekula přítomna v asociované formě jako hexamer. (Brange a kol.: Diabetes Care 13, (1990), 923 - 954). Má se za to, že rychlost absorpce do krevního oběhu po subkutánní injekci závisí na velikosti molekuly a bylo zjištěno, že analogy inzulínu s takovými aminokyselinovými záměnami, které zabraňují nebo inhibují tvorbu těchto hexamerů, mají neobvykle rychlý nástup účinku (Brange a kol.: tamtéž). To má pro diabetického pacienta velkou terapeutickou hodnotu. V krystalech přípravku inzulínu s protaminem, které mají protahované působení, se inzulín také nachází ve formě hexamerů (Balschmidt a kol.: Acta Chryst. 847, (1991), 975 - 986).

Farmaceutické přípravky, které jsou založeny na analozích lidského inzulínu, jsou známy např. z následujících dokumentů: WO 95/00550 se týká farmaceutických přípravků založených na krystalech inzulínu, obsahujících Asp^B28 inzulín a protamin, který vykazuje rychlý nástup účinku a prodloužené působení, když je aplikován in vivo. Krystaly mohou dále obsahovat zinečnaté ionty a fenol nebo m-krezol. Jako činidlo udržující izotonocitu je k přípravkům přidáván glycerol.

V US 5 461 031 jsou popsány rozličné farmaceutické přípravky, které obsahují rychle působící monomemí analog inzulínu, zinek, protamin a fenolové deriváty. Přípravky dále obsahují glycerol, který působí jako izotonické činidlo.

-2CZ 297682 B6

US 5 474 978 popisuje rychle působící, parenterálně podávané přípravky, které obsahují komplex analogu lidského inzulínu, skládajícího se z šesti monomemích analogů inzulínu, zinečnatých iontů a přinejmenším třech molekul derivátů fenolu. Výhodným izotonickým činidlem je glycerol.

Naneštěstí má inzulín tendenci vytvářet nekovalentní polymerizací nerozpustné a biologicky neaktivní fibrily (viz např. Jens Brange. Galenics of Inzulín. Springer-Verlag, 1987 a odkazy tam uvedené). Tvorba fibril je podporována zvýšenými teplotami, např. nad 30 °C, zvláště pokud jsou doprovázeny pohybem roztoku. Tento fibrilační proces, kterému je velmi obtížné se vyhnout, tvoří horní mez pro období, po které mohou být inzulínové přípravky uloženy a tedy přímo ovlivňuje velikost objemu zásobníku inzulínových per.

Protože vytváření fibril obecně vyžaduje monomerizaci inzulínu, ty analogy inzulínu, které méně ochotně vytvářejí dimery a hexamery, vykazují menší fyzikální stabilitu, kvůli své snadnější fibrilaci.

Podstata vynálezu

Předmětem předkládaného vynálezu je tedy poskytnout inzulínové přípravky obsahující lidský inzulín nebo jeho analog či derivát, s vylepšenou fyzikální stabilitou.

Podle vynálezu je tohoto cíle dosaženo vodným inzulínovým přípravkem, který obsahuje: a) krystaly obsahující analog lidského inzulínu, kde se v pozici B28 nalézá Asp, Lys, Leu, Val nebo Ala a v pozici B29 se nachází Lys nebo Pro, nebo lidský inzulín des(B28-B30), des(B27) nebo des(B30) a protamin, a b) 100 až 400 mM mannitol, přičemž je koncentrace analogu inzulínu 60 až 3000 nmol/ml.

Definice

Termínem „analog lidského inzulínu“ je zde míněn takový lidský inzulín, v němž jedna nebo více aminokyselin bylo odstraněno, nebo zaměněno jinými aminokyselinami, včetně nekódovaných aminokyselin, nebo lidský inzulín, obsahující další aminokyseliny, tj. více než 51 aminokyselin.

Ve specifickém provedení vynálezu dále obsahují inzulínové přípravky chlorid, výhodněji chlorid sodný. Bylo ukázáno, že následkem přítomnosti halogenidu má přípravek ještě vyšší fyzikální stabilitu.

Protože inzulínové přípravky, obsahující rychle působící analogy inzulínu obecně vykazují poněkud nízkou fyzikální stabilitu, předkládaný vynález je zvláště výhodný v souvislosti s přípravky, obsahujícími takové analogy. Tedy, inzulínové přípravky připravené podle tohoto vynálezu obsahují rychle působící analog lidského inzulínu, kde v poloze B28 je Asp. Lys. Leu. Val nebo Ala a v poloze B29 je Lys nebo Pro nebo des(B28-B30), des(B27) nebo des(B30) lidský inzulín. Analog inzulínu je přednostně vybírán z analogů lidského inzulínu, které mají v poloze B28 Asp nebo Lys a v poloze B29 je Lys nebo Pro. Nej výhodnější analogy jsou Asp⁰²⁸ lidský inzulín nebo Lys^B28Pro⁰²⁹ lidský inzulín.

Ve výhodném provedení obsahuje inzulínový přípravek jak rozpuštěný, tak vysrážený, přednostně krystalický, inzulín nebo jeho derivát či analog, v hmotnostním poměru 1:99 až 99:1, výhodněji 20:80 až 80:20, ještě výhodněji 30:70 až 70:30.

V takovémto provedení vynálezu je výhodné, když inzulínový přípravek obsahuje krystaly, které se skládají z inzulínu nebo analogu inzulínu, protaminu a případně zinku anebo fenolových

-3CZ 297682 B6 sloučenin, jako je fenol, m-krezol nebo jejich směs. Je výhodné, když množství protaminu v krystalech odpovídá 0,20 až 0,40 mg protaminové báze na 100 UJ inzulínu nebo analogu inzulínu. Je výhodnější, když poměr protaminu k inzulínu v krystalech odpovídá poměru v Isophan inzulínu. Zinek je přítomen výhodně v množství 10 až 40 pg Zn na 100 UJ inzulínu, výhodněji v množství 15 až 35 pg Zn na 100 IU inzulínu. Je výhodné, když jsou fenol a m-krezol přítomny v množství, odpovídajícímu 0 až 4 mg/ml. Nicméně jsou nejvýhodnější směsi 1,4 až 2,0 mg/ml m-krezolu a 0,6 až 2,0 mg/ml fenolu.

Výhodný inzulínový přípravek podle vynálezu obsahuje:

a) 60 až 3000 nmol/ml, výhodněji 240 až 1200 nmol/ml, lidského inzulínu nebo inzulínového analogu;

b) mannitol, v koncentraci 100 až 400 mM, s výhodou 150 až 250 mM, ještě výhodněji 180 až 230 mM;

c) chlorid, s výhodou chlorid sodný, v koncentraci 0 až 100 mM, výhodněji 5 až 40 mM, ještě výhodněji 5 až 20 mM; a

d) fyziologický tolerovaný pufr, s výhodou fosfátový pufr, jako je dihydrát hydrogenfosforečnanu sodného v množství 1 až 4 mg/ml.

Přípravky podle vynálezu mohou dále obsahovat jednu nebo více sloučenin, běžně užívaných jako činidla udržující izotonicitu, např. glycerol. Je výhodné, když hodnota pH u inzulínových přípravků je v rozmezí 7,0 až 7,8.

Předložený vynález se dále týká způsobů přípravy inzulínových přípravků, obsahujících jak rozpuštěný, tak vysrážený analog inzulínu, vyznačujících se tím, že obsahují následující kroky:

a) přípravu kyselého roztoku, obsahujícího analog lidského inzulínu, zinek a množství protaminu menší než v Isophane inzulínu;

b) přípravu alkalického roztoku, obsahujícího sloučeninu, která působí jako pufr při fyziologickém pH;

přičemž alespoň jeden z výše uvedených roztoků obsahuje fenolické sloučeniny;

c) smíšení kyselého a alkalického roztoku a popřípadě úpravu pH na hodnotu v rozmezí 6,5 až 8,0, s výhodou 7,0 až 7,8; a

d) ponechání výsledné suspenze pro vysrážení.

Touto metodou lze velmi jednoduchým způsobem získat inzulínové přípravky, obsahující jak rozpuštěný, tak vysrážený inzulín. Navíc, sraženina z výsledné suspenze se obyčejně skládá z krystalů tyčinkovitého tvaru, které jsou výhodné v tzv. PreMix inzulínových přípravcích.

Hmotnostní poměr analogu inzulínu k protaminu v roztoku, uvedeném v kroku a) je s výhodou vybrán tak, aby byl v konečném produktu získán hmotnostní poměr rozpustného k vysráženému inzulínovému analogu v rozmezí 1:99 až 99:1, výhodněji 20:80 až 80:20, ještě výhodněji 30:70 až 70:30. Řečeno přesněji, roztok uvedený v kroku a) s výhodou obsahuje 120 až 6000 nmol/ml analogu inzulínu a 0,01 až 5,0 mg/ml protaminu.

Roztok uvedený v kroku a) dále obsahuje zinek, a to přednostně v množství odpovídajícím 10 až 40 pg Zn na 100 IU inzulínu, výhodněji v množství 15 až 35 pg Zn na 100 IU inzulínu.

Ve výhodném provedení obsahuje ve výsledném produktu roztok uvedený v kroku a) nebo roztok uvedený v kroku b) chlorid, s výhodou chlorid sodný, v množství odpovídajícím 0 až 100 mM, výhodněji 5 až 40 mM, ještě výhodněji 5 až 20 mM ve výsledném produktu.

-4CZ 297682 B6

Je výhodné, když kyselý roztok uvedený v kroku a) má pH pod 5, ještě výhodněji v rozmezí 2 až 3,5.

Analog inzulínu je výhodně Asp⁰²⁸ lidský inzulín nebo Lys^B28Pro^B29 lidský inzulín a ještě výhodněji Asp^B28 lidský inzulín.

Fenolická sloučenina, použitá v roztoku uvedeném v kroku a) anebo v kroku b) je s výhodou fenol, m-krezol nebo jejich směs.

Ve výhodném provedení roztok uvedený v kroku a) anebo v kroku b) obsahuje mannitol.

Sloučenina použitá jako základ pufru v zásaditém roztoku uvedeném v kroku b) je výhodně fyziologicky tolerovaný pufr, výhodněji fosfátový pufr, ještě výhodněji dihydrát hydrogenfosforečnanu sodného.

Vysrážený analog inzulínu je s výhodou ve formě krystalů, obsahujících analog inzulínu a protamin.

Suspenze, získaná v kroku b) je s výhodou ponechána pro srážení při teplotě v rozmezí 5 až 40 °C, výhodněji 20 až 36 °C, ještě výhodněji 30 až 34 °C.

Popis obrázků

Obr. 1 je mikrofotografie (1000-násobné zvětšení) přípravku podle vynálezu, obsahujícího krystaly lidského Asp⁰²⁸ protamin-inzulinu a mannitol.

Obr. 2 je mikrofotografie (1000-násobné zvětšení) přípravku podle vynálezu, obsahujícího krystaly lidského protamin-inzulinu a mannitol.

Na obr. 3 je graficky znázorněn časový průběh působení přípravku podle vynálezu, obsahujícího jak rozpuštěný, tak krystalický lidský Asp⁰²⁸ inzulín spolu s časovým průběhem působení přípravku, obsahujícího jak rozpuštěný, tak krystalický lidský inzulín. Oba přípravky dále obsahují mannitol. Na grafu je znázorněna reakce hladiny krevní glukózy po injekci u vepřů. Obrázek ukazuje, že u vysoce stabilního lidského Asp⁰²⁸ inzulínu je zachován rychlý nástup působení.

Vynález je dále doložen následujícími příklady, které však nejsou míněny jako omezování oblasti uplatnění vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad I

Přípravek 1

Inzulínový přípravek, obsahující jak rozpuštěný, tak krystalický Asp⁰²⁸ lidský inzulín, byl připraven následujícím způsobem:

Roztok A:

Roztok Asp⁰²⁸ lidského inzulínu o koncentraci 200 IU/ml byl připraven rozpuštěním 76,5 mg Asp⁰²⁸ lidského inzulínu ve vodě za přidání 326 μΐ 0,2 N kyseliny chlorovodíkové a 163 μΐ roztoku chloridu zinečnatého (0,4 mg/ml). Poté bylo za míchání přidáno do roztoku inzulínu

-5CZ 297682 B6

6,35 mg protamin-sulfátu a směs obsahující 17,2 mg m-krezolu, 15 mg fenolu a 455 mg mannitolu. U výsledného čirého roztoku bylo-změřeno pH 2,6 až 2,9, pak bylo přidáno 10 ml vody. Roztok byl vytemperován na 28 až 32 °C.

Roztok B:

Ve vodě pro injekce bylo rozpuštěno 25 mg dihydrátu hydrogenfosforečnanu sodného. Za míchání bylo přidáno 17,2 mg m-krezolu, 15 mg fenolu a 455 mg mannitolu. U výsledného čirého roztoku bylo změřeno pH 9, pak bylo přidáno 10 ml vody. Roztok byl vytemperován na 28 až 32 °C.

Smíchání roztoků A a B:

Roztok B byl přidán k roztoku A a pH bylo upraveno na 7, 30. Výsledná suspenze byla ponechána krystalovat při 30 °C po dobu 6 dní. Ve výsledném přípravku byl hmotnostní poměr vysráženého k rozpuštěnému inzulínu 70:30. Přípravek byl naplněn do zásobníků Penfill®.

Příklad II

Přípravek 2

Inzulínový přípravek, obsahující jak rozpuštěný, tak krystalický Asp⁸²⁸ lidský inzulín, byl připraven následujícím způsobem:

Roztok A:

Roztok Asp⁸²⁸ lidského inzulínu o koncentraci 200 lU/ml byl připraven rozpuštěním 190,3 mg Asp⁸²⁸ lidského inzulínu ve vodě za přidání 813 μΙ 0,2 N kyseliny chlorovodíkové a 410 μΐ roztoku chloridu zinečnatého (0,4 mg/ml). Poté bylo za míchání přidáno do roztoku inzulínu 16,1 mg protamin-sulfátu a směs obsahující 43,0 mg m-krezolu, 37,5 mg fenolu, 909 mg mannitolu a 14,6 mg chloridu sodného. U výsledného čirého roztoku bylo změřeno pH 2,6 až 2,9, pak bylo přidáno 22 ml vody. Roztok byl vytemperován na 32 °C.

Roztok B:

Ve vodě pro injekce bylo rozpuštěno 62,4 mg dihydrátu hydrogenfosforečnanu sodného. Za míchání bylo přidáno 43,0 mg m-krezolu, 37,5 mg fenolu, 909 mg mannitolu a 14,6 mg chloridu sodného. U výsledného čirého roztoku bylo změřeno pH 9, pak bylo přidáno 22 ml vody. Roztok byl vytemperován na 32 °C.

Smíchání roztoků A a B:

Roztok B byl přidán k roztoku A, pH bylo upraveno na 7, 30 a pak bylo přidáno 50 ml vody. Výsledná suspenze byla ponechána krystalovat při 32 °C po dobu 4 dní. Ve výsledném přípravku byl hmotnostní poměr vysráženého k rozpuštěnému inzulínu 70:30. Přípravek byl naplněn do zásobníků Penfill®.

Příklady III - VI

Přípravky 3 až 6

Inzulínové přípravky, obsahující jak rozpuštěný, tak krystalický Asp⁸²⁸ lidský inzulín, byly připraveny jak je popsáno v příkladu II, kromě toho, že množství mannitolu použitého v roztoku A a B bylo 818 mg, 1005 mg, 1047 mg a 1137 mg. Přípravky byly naplněny do zásobníků Penfill®.

-6CZ 297682 B6

Příklad VII

Přípravek 7

Inzulínový přípravek, obsahující jak rozpuštěný, tak krystalický Lys Pro lidský inzulín, byl připraven následujícím způsobem:

i) Krystalická frakce

Roztok A:

B^8 B29

Roztok Lys “ Asp lidského inzulínu o koncentraci 200 IU/ml byl připraven suspendováním

69.7 mg Lys^B28Asp^B29 lidského inzulínu ve vodě. Poté byla za míchání přidána do tohoto roztoku směs, obsahující 16,0 mg m-krezolu, 6,5 mg fenolu, 364 mg mannitolu a 25,1 mg dihydrátu hydrogenfosforečnanu sodného. Poté bylo přidáno 50 μΐ roztoku chloridu zinečnatého (10 mg/ml). U výsledného čirého roztoku bylo pH upraveno na 7,4, pak bylo přidáno 10 ml vody. Roztok byl vytemperován na 15 °C.

Roztok B:

Roztok protamin-sulfátu byl připraven rozpuštěním 7,61 mg protamin-sulfátu a 25,1 mg dihydrátu hydrogenfosforečnanu sodného ve vodě. Za míchání bylo přidáno 16,0 mg m-krezolu, 6,5 mg fenolu a 364 mg mannitolu. Tento roztok byl za míchání přidán k roztoku protamin-sulfátu. U výsledného čirého roztoku bylo pH upraveno na 7,4, pak bylo přidáno 10 ml vody. Roztok byl vytemperován na 15 °C.

Smíchání roztoků A a B:

Roztok B byl přidán k roztoku A, pH bylo upraveno na 7,30. Výsledná suspenze byla ponechána krystalovat při 15 °C po dobu 3 dní.

ii) Rozpustná frakce

Roztok Lys⁸²⁸ Asp^B29 lidského inzulínu byl připraven rozpuštěním 34,9 mg Lys^B28 Asp^B29 lidského inzulínu ve vodě za přidání 33 μΐ 1 N kyseliny chlorovodíkové a 25 μΐ roztoku chloridu zinečnatého (10 mg/ml). Poté byla za míchání přidána do roztoku inzulínu směs, obsahující 26,1 mg dihydrátu hydrogenfosforečnanu sodného, 6,5 mg fenolu, 16,0 mg m-krezolu a 364 mg mannitolu. U výsledného čirého roztoku bylo změřeno pH 7,3, pak bylo přidáno 10 ml vody. Šest ml rozpustné frakce bylo přidáno k 14 ml krystalické frakce a pH bylo upraveno na 7,30. Ve výsledném přípravku byl hmotnostní poměr vysráženého k rozpuštěnému inzulínu 70:30. Přípravek byl naplněn do zásobníků Penfill®.

Příklad VIII

Přípravek 8

Inzulínový přípravek, obsahující jak rozpuštěný, tak krystalický lidský inzulín, byl připraven následujícím způsobem:

i) Krystalická frakce

Roztok A:

Roztok lidského inzulínu byl připraven rozpuštěním 69,7 mg lidského inzulínu ve vodě za přidání 65 μΐ 1 N kyseliny chlorovodíkové a 26 μΐ roztoku chloridu zinečnatého (10 mg/ml). Poté bylo za míchání přidáno k tomuto inzulínovému roztoku 6,0 mg protamin-sulfátu v roztoku a směs, obsahující 15,0 mg fenolu a 17,2 mg m-krezolu. U výsledného čirého roztoku bylo změřeno pH

2.7 až 3,2, pak bylo přidáno 10 ml vody.

-7CZ 297682 B6

Roztok B:

Ve vodě bylo rozpuštěno 24,9 mg dihydrátu hydrogenfosforečnanu sodného. Za míchání bylo přidáno 15,0 mg fenolu, 17,2 mg m-krezolu, 728 mg mannitolu a 11,7 mg chloridu sodného. U výsledného čirého roztoku bylo pH upraveno na 9, pak bylo přidáno 10 ml vody.

Roztok B byl přidán k roztoku A, pH bylo upraveno na 7,30. Výsledná suspenze byla ponechána při 22 až 24 °C do následujícího dne.

i i) Rozpustná frakce

Roztok lidského inzulínu byl připraven rozpuštěním 34,9 mg lidského inzulínu ve vodě za přidání 33 μΐ 1 N kyseliny chlorovodíkové a 13 μΐ roztoku chloridu zinečnatého (10 mg/ml). Poté byla za míchání přidána do roztoku inzulínu směs, obsahující 12,5 mg dihydrátu hydrogenfosforečnanu sodného, 15 mg fenolu, 17,2 mg m-krezolu a 364 mg mannitolu a 5,8 mg chloridu sodného. U výsledného čirého roztoku bylo změřeno pH 7,3, pak bylo přidáno 10 ml vody. Šest ml rozpustné frakce bylo přidáno k 14 ml krystalické frakce a pH bylo upraveno na 7,30. Ve výsledném přípravku byl hmotnostní poměr vysráženého k rozpuštěnému inzulínu 70:30. Přípravek byl naplněn do zásobníků Penfill®.

Příklad IX

Přípravek 9

Inzulínový přípravek, obsahující jak rozpuštěný, tak krystalický Asp^B28 lidský inzulín, byl připraven následujícím způsobem:

Roztok A:

Roztok Asp^B28 lidského inzulínu o koncentraci 200 lU/ml byl připraven suspendováním 189,9 mg Asp^B28 lidského inzulínu ve vodě za přidání 163 μΐ 1 N kyseliny chlorovodíkové a 163,5 μΐ roztoku chloridu zinečnatého (10 mg/ml). Poté bylo za míchání přidáno do tohoto roztoku inzulínu 11,5 mg protamin-sulfátu v roztoku a směs, obsahující 44,3 mg m-krezolu, 38,6 mg fenolu, 1048 mg mannitolu a 7,3 mg chloridu sodného. U výsledného čirého roztoku bylo změřeno pH 2,6 až 2,9, pak bylo přidáno 25 ml vody. Roztok byl vytemperován na 22 až 24 °C.

Roztok B:

Ve vodě bylo rozpuštěno 62,3 mg dihydrátu hydrogenfosforečnanu sodného. Za míchání bylo přidáno 44,3 mg m-krezolu, 38,6 mg fenolu, 1048 mg mannitolu a 7,3 mg chloridu sodného. U výsledného čirého roztoku bylo změřeno pH 9, pak bylo přidáno 25 ml vody. Roztok byl vytemperován na 22 až 24 °C.

Smíchání roztoků A a B:

Roztok B byl přidán k roztoku A, pH bylo upraveno na 7,30. Výsledná suspenze byla ponechána krystalovat při 32 °C po dobu 2 dní.

Ve výsledném přípravku byl hmotnostní poměr vysráženého k rozpuštěnému inzulínu 70:30. Přípravek byl naplněn do zásobníků Penfill®.

Příklad X (srovnávací)

Přípravek 10

-8CZ 297682 B6

Roztok A:

Roztok Asp^B28 lidského inzulínu o koncentraci 200 IU/ml byl připraven suspendováním 76,5 mg Asp^B28 lidského inzulínu ve vodě za přidání 326 μΐ 0,2 N kyseliny chlorovodíkové a 163 μΐ roztoku chloridu zinečnatého (0,4 mg/ml). Poté bylo za míchání přidáno do tohoto roztoku inzulínu 6,35 mg protamin-sulfátu v roztoku a směs, obsahující 17,2 mg m-krezolu, 15,0 mg fenolu a 160 mg glycerolu. U výsledného čirého roztoku bylo změřeno pH 2,6 až 2,9, pak bylo přidáno 10 ml vody. Roztok byl vytemperován na 28 až 32 °C.

Roztok B:

Ve vodě pro injekce bylo rozpuštěno 25 mg dihydrátu hydrogenfosforečnanu sodného. Za míchání bylo přidáno 17,2 mg m-krezolu, 15,0 mg fenolu a 160 mg glycerolu. U výsledného čirého roztoku bylo změřeno pH 9, pak bylo přidáno 10 ml vody. Roztok byl vytemperován na 28 až 32 °C.

Smíchání roztoků A a B:

Roztok B byl přidán k roztoku A, pH bylo upraveno na 7,30. Výsledná suspenze byla ponechána krystalovat při 28 až 32 °C po dobu 2 dní.

Příklad XI

Testy fyzikální zátěže

Pět vzorků každého inzulínového přípravku bylo naplněno do zásobníků Penfill® a podrobeno následujícím testům fyzikální zátěže.

Zásobníky Penfill® byly upevněny na rotující zařízení, umístěné v inkubátoru, a rotovány o 360° po dobu 4 hodin denně, rychlostí 30 otáček za minutu, při konstantní teplotě 32 ± 2 °C. Zásobníky Penfill® byly v době mimo otáčení uloženy při konstantní teplotě 32 ± 2 °C.

Zásobníky Penfill® byly makroskopicky prohlédnuty pětkrát za týden a změny ve vzhledu přípravku byly zaznamenávány podle následujících zásad:

i) zásobníky, obsahující bílou suspenzi, která byla opět resuspendovatelná třepáním a bez chuchvalců a drobků, byly hodnoceny jako „nezfibrilovaný“.

ii) zásobníky, obsahující suspenzi s chuchvalci a drobky, která nebyla resuspendovatelná třepáním anebo suspenzi usazenou na stěnách zásobníku, byly hodnoceny jako „zfibrilovaný“. Toto hodnocení bylo potvrzeno přidáním 6 μΐ 6N HC1 do zásobníku. Zfibrilované zásobníky nebyly po přidání kyseliny vizuálně čiré.

-9CZ 297682 B6

Výsledky jsou shrnuty v následující tabulce I

Přípravek č.	Složení	Průměrný počet dnů do fibrilace	První den fibrilace
1	Asp⁰²⁸ inzulín 30/70 7 mM fosfát 250 mM mannitol	20	20
2	Asp⁰²⁸ inzulín 30/70 7 mM fosfát 200 mM mannitol 10 mM chlorid sodný	23	23
3	Asp⁰²⁸ inzulín 30/70 7 mM fosfát 180 mM mannitol 10 mM chlorid sodný	21	17
4	Asp⁰²⁸ inzulín 30/70 7 mM fosfát 220 mM mannitol 10 mM chlorid sodný	19	17
5	Asp⁰²⁸ inzulin 30/70 7 mM fosfát 230 mM mannitol 10 mM chlorid sodný	21	18
6	Asp⁰²⁸ inzulin 30/70 7 mM fosfát 250 mM mannitol 10 mM chlorid sodný	22	22
9	Asp⁰²⁸ inzulin 30/70 7 mM fosfát 230 mM mannitol 10 mM chlorid sodný	>30	>30
10 (srovnávací)	Asp⁰²⁸ inzulin 30/70 7 mM fosfát 174 mM glycerol	11	9

Průmyslová využitelnost

Inzulínové přípravky vyrobené podle vynálezu obsahují mannitol, který značně zvyšuje jejich fyzikální stabilitu a jsou s výhodou použitelné do zásobníků inzulínových per.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Vodný inzulínový přípravek, vyznačující se tím, že obsahuje: a) krystaly obsahující analog lidského inzulínu, kde se v pozici B28 nalézá Asp, Lys, Leu, Val nebo Ala a v pozici B29 se nachází Lys nebo Pro, nebo lidský inzulín des(B28-B30), des(B27) nebo des(B30), a protamin, a b) 100 až 400 mM mannitol, přičemž je koncentrace analogu inzulínu 60 až 3000 nmol/ml.
2. Inzulínový přípravek podle nároku 1, vyznačující se tím, že dále obsahuje chlorid.

- 10CZ 297682 B6
3. Inzulínový přípravek podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že analogem lidského inzulínu je Asp lidský inzulín nebo Lys Pro lidský inzulín.
4. Inzulínový přípravek podle kteréhokoliv z předcházejících nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že krystaly dále obsahují zinek a popřípadě fenolickou sloučeninu.
5. Inzulínový přípravek podle kteréhokoliv z předcházejících nároků laž4, vyznačující se tím, že obsahuje jak rozpuštěný, tak i krystalický analog inzulínu v hmotnostním poměru 20:80 až 80:20.
6. Způsob přípravy inzulínového přípravku obsahujícího jak rozpuštěný, tak krystalický analog inzulínu, vyznačující se tím, že zahrnuje kroky:

a) přípravu kyselého roztoku obsahujícího analog lidského inzulínu, zinek a subisophanické množství protaminu;

b) přípravu alkalického roztoku obsahujícího látku působící jako pufr při fyziologickém pH;

přičemž alespoň jeden z výše uvedených roztoků dále obsahuje fenolickou sloučeninu a alespoň jeden z výše uvedených roztoků dále obsahuje mannitol;

c) smísení kyselého a alkalického roztoku a popřípadě upravení pH na hodnotu v rozmezí 6,5 až 8,0; a

d) ponechání výsledné suspenze pro srážení.
7. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že hmotnostní poměr analogu inzulínu k protaminu v roztoku uvedeném v kroku a) je vybrán tak, aby byl v konečném produktu získán hmotnostní poměr rozpuštěného ku krystalickému analogu inzulínu v rozmezí 20:80 až 80:20.
8. Způsob podle nároku 7, vyznačující se tím, že roztok uvedený v kroku a) obsahuje 120 až 6000 nmol/ml analogu inzulínu a 0,01 až 5,0 mg/ml protaminu.
9. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že roztok uvedený v kroku a) dále obsahuje zinek v množství odpovídajícím 10 až 40 pg zinku/100 IU inzulínu.
10. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 6až9, vyznačující se tím, že roztok a) a/nebo roztok b) obsahuje chlorid v množství odpovídajícím v konečném produktu 5 až 40 mM.
11. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 6 až 10, vy z n a č uj í c í se t í m , že pH kyselého roztoku uvedeného v kroku a) je nižší než 5.