CZ395798A3

CZ395798A3 - Inzulínové přípravky obsahující lidský inzulín a sacharidy

Info

Publication number: CZ395798A3
Application number: CZ983957A
Authority: CZ
Inventors: Lone Logstrup Kimer; Per Balschmidt; Steen Jensen
Original assignee: Novo Nordisk A/S
Priority date: 1996-06-20
Filing date: 1997-06-19
Publication date: 1999-05-12
Also published as: DE69737995T2; NO985978D0; KR20000022030A; CA2258099A1; AU719361B2; ATE369146T1; JP2009242400A; IL127365A0; WO1997048413A1; NO985978L; CN1222084A; DE69737995D1; HUP9904156A3; HUP9904156A2; CN1198643C; JP4472027B2; CZ297682B6; PL330828A1; NO324276B1; AU3166597A

Description

Oblast techniky

Uváděný vynález se zabývá vodnými inzulínovými přípravky, které obsahují lidský inzulín nebo jeho analog či derivát, přičemž tento přípravek má lepší fyzikální stabilitu. Vynález se dále zabývá parenterálně aplikovanými prostředky, které tyto inzulínové přípravky obsahují a způsoby, jak zdokonalit fyzikální stabilitu inzulínových přípravků.

Dosavadní stav techniky

Diabetes je obecné označení pro poruchy u lidí, kteří mají nadměrné vylučování moči jako u úplavice cukrové (cukrovka, diabetes melitus) a úplavice močové (žíznivka, diabetes insipidus). Cukrovka je metabolické porucha, při níž je schopnost využívat glukózu, více či méně zcela ztracena. Asi 2 % všech lidí trpí diabetem.

Od zavedení inzulínu v dvacátých letech tohoto století byly udělány velké pokroky při zdokonalování léčení cukrovky. Aby se vyhnuli extrémním hladinám cukru v krvi, diabetičtí pacienti často praktikují injekční terapii, kdy je inzulín podáván s každým jídlem.

Při léčení cukrovky se doporučuje a používá velké množství inzulínových přípravků, jako je normální inzulín, Semilente® inzulín, Isophane inzulín, zink-inzulín, protamin zink-inzulín a Ultralente® inzulín. Diabetičtí pacienti se léčí inzulínem několik desetiletí, proto je velká potřeba inzulínových přípravků, které jsou bezpečné a zlepšují kvalitu života pacientů. Pro některé komerčně dostupné inzulínové přípravky je charakteristický rychlý nástup jejich účinku, jiné přípravky mají relativně pomalejší nástup účinku, ale vykazují více či méně prodloužené působení. Rychle působící inzulínové přípravky jsou obvykle roztoky inzulínu, zatímco zpomaleně působící inzulínové přípravky mohou být suspenze, obsahující inzulín v krystalické anebo amorfní formě, vysrážené přidáním buď samotných solí zinku, nebo přídavkem protaminu, nebo jejich kombinací. Navíc někteří pacienti užívají přípravky, které mají jak rychlý nástup účinku, tak prodloužené působení. Takový přípravek může být inzulínový roztok, kde jsou suspendovány krystaly inzulínu s protaminem. Někteří pacienti si sami zhotovují konečný přípravek smícháním inzulínového roztoku se suspenzním přípravkem v poměru požadovaném dotyčným pacientem.

• · · · ···· • · · · · · · · · · · ♦ · · · · • ·· ···· ·· ··

Normálně jsou inzulínové přípravky podávány formou subkutánní injekce. Co je důležité pro pacienta, je průběh působení inzulínového přípravku, což je vliv inzulínu na metabolizmus glukózy, v závislosti na čase uplynulém od injekce. Na tomto průběhu jsou mimo jiné důležité čas začátku účinku, maximální úroveň a celková doba působení. Pacienty jsou vyžadovány rozmanité inzulínové přípravky s odlišným časovým průběhem působení. Tentýž pacient může v jednom dnu použít inzulínové přípravky s velmi odlišnými průběhy působení. Požadovaný časový průběh působení závisí např. na denní době a na množství a složení kteréhokoli pacientova jídla.

Stejně důležitá je však fyzikální stabilita inzulínového přípravku, kvůli rozšířenému užívání injekčních zařízení - inzulínových per, což jsou zařízení obsahující zásobníky Penfill®, v nichž je inzulínový přípravek uložen do doby, dokud není zásobník vyprázdněn. To může u zařízení obsahujících zásobníky o obsahu 1,5 až 3,0 ml trvat přinejmenším 1 až 2 týdny.

První stabilní neutrální inzulínová suspenze byla vyvinuta Scottem a Fischerem (J. Pharmacol. Exp. Ther. 58 (1936), 78), kteří objevili, že v přítomnosti nadbytku protaminu a zinkových solí (2 μρ zinku na IU (mezinárodní jednotka - International unit) inzulínu) může stabilizovat protaminový inzulínový přípravek, popsaný v Hagedorn a kol., J. Am. Med. Assn. 106(1936), 177-180.

Protamin zink-inzulín, vyráběný podle lékopisů Spojených Států anebo lékopisů evropských, obsahují amorfní protamin zink-inzulín a rovněž krystalický protamin zinkinzulín. Čerstvě připravený protamin zink-inzulín obsahuje hlavně amorfní sraženinu, která se bude v průběhu skladování přeměňovat na krystalické částice, což vede k protrahovanému působení.

Zcela krystalická modifikace protamin zink-inzulínu, označovaná NPH inzulín nebo Isophane inzulín byla vyvinuta Krayenbůhlem a Rosenbergem (viz Rep. Stěno Mem. Hosp. Nord. Insulinlab. 1 (1946), 60; a dánský patent č. 64,708). Zjistili, že inzulín a protamin, pokud jsou smíchány v určitých poměrech při neutrálním pH a v přítomnosti malého množství zinku a fenolu, nebo fenolových derivátů, s výhodou mkrezolu, vytvoří amorfní sraženinu, která se v průběhu stání postupně, ale kompletně přemění na protáhlé tetragonální krystaly, ohraničené na koncích pyramidovými čelními stěnami. Inzulín a protamin z lososa společně krystalizují ve váhovém poměru, odpovídajícím 0,09 mg protaminsulfátu na mg inzulínu. Pro přípravu tetragonálních • ·· · · · · · « ··· * · · · · · ··· ·· ···· ·· ·· krystalů jsou nezbytné zinek v množství přinejmenším 0,15 pg na IU a látka typu fenolu v koncentraci vyšší než 0,01%.

Zpočátku byl tento druh krystalů připravován za použití vepřového a hovězího inzulínu z přírodních zdrojů, ale od 80 let se používá též lidský inzulín, připravený pomocí genového inženýrství, nebo částečnou syntézou.

Lidský inzulín sestává ze dvou polypeptidových řetězců, tzv. řetězců A a B, které obsahují 21 a 30 aminokyselin. A a B řetězce jsou vzájemně spojeny dvěma cysteinovými disulfidickými můstky. Inzulín od většiny ostatních druhů má podobnou stavbu, ale nemusí obsahovat stejné aminokyseliny na odpovídajících pozicích v řetězci, jako u lidského inzulínu.

Rozvoj postupů, známých jako genové inženýrství, umožnil snadno připravit velké množství rozmanitých inzulínových sloučenin, analogických lidskému inzulínu. U těchto analogů inzulínu byla jedna nebo více aminokyselin nahrazena jinými aminokyselinami, které jsou kódovány nukleotidovými sekvencemi. Protože lidský inzulín, jak bylo vysvětleno výše, obsahuje 51 aminokyselinových zbytků, je zřejmé, že je možný veliký počet analogů inzulínu a skutečně bylo připraveno velké množství těchto analogů, často se zajímavými vlastnostmi. V roztocích lidského inzulínu o koncentracích v oblasti injekčních přípravků, je inzulínová molekula přítomna v asociované formě jako hexamer. (Brange a kol.: Diabetes Care 13, (1990), 923 954). Má za to, že rychlost absorbce do krevního oběhu po subkutánní injekci závisí na velikosti molekuly a bylo zjištěno, že analogy inzulínu se takovými aminokyselinovými záměnami, které zabraňují nebo inhibují tvorbu těchto hexamerů, mají neobvykle rychlý nástup účinku (Brange a kol.: tamtéž). To má pro diabetického pacienta velkou terapeutickou hodnotu. V krystalech přípravků inzulínu s protaminem, které mají protrahované působení, se inzulín také nachází ve formě hexamerů (Balschmidt a kol.: Acta Chryst. B47, (1991), 975-986).

Farmaceutické přípravky, které jsou založeny na analozích lidského inzulínu, jsou známy např. z následujících dokumentů: WO 95/00550 se týká farmaceutických přípravků založených na krystalech inzulínu, obsahujících Asp⁸²⁸ inzulín a protamin, který vykazuje rychlý nástup účinku a prodloužené působení, když je aplikován in vivo. Krystaly mohou dále obsahovat zinečnaté ionty a fenol nebo m-krezoi. Jako činidlo udržující izotonocitu je k přípravkům přidáván glycerol.

• ·

V US 5 461 031 jsou popsány rozličné farmaceutické přípravky, které obsahují rychle působící monomemí analog inzulínu, zinek, protamin a fenolové deriváty. Přípravky dále obsahují glycerol, který působí jako izotonické činidlo.

US 5 474 978 popisuje rychle působící, parenterálně podávané přípravky, které obsahují komplex analogu lidského inzulínu, skládajícího se z šesti monomerních analogů inzulínu, zinečnatých iontů a přinejmenším třech molekul derivátů fenolu. Výhodným izotonickým činidlem je glycerol.

Naneštěstí má inzulín tendenci vytvářet nekovalentní polymerizaci nerozpustné a biologicky neaktivní fibrily (viz např. Jens Brange, Galenics of Inzulín, SpringerVerlag, 1987 a odkazy tam uvedené). Tvorba fibril je podporována zvýšenými teplotami, např. nad 30 °C, zvláště pokud jsou doprovázeny pohybem roztoku. Tento fibrilační proces, kterému je velmi obtížné se vyhnout, tvoří horní mez pro období, po které mohou být inzulínové přípravky uloženy a tedy přímo ovlivňuje velikost objemu zásobníku inzulínových per.

Protože vytváření fibril obecně vyžaduje monomerizaci inzulínu, ty analogy inzulínu, které méně ochotně vytvářejí dimery a hexamery, vykazují menší fyzikální stabilitu, kvůli své snadnější fibrilaci.

Předmětem předkládaného vynálezu je tedy poskytnout inzulínové přípravky obsahující lidský inzulín nebo jeho analog či derivát, s vylepšenou fyzikální stabilitou.

Podle vynálezu je tohoto cíle dosaženo vodnými inzulínovými přípravky, obsahujícími rozpuštěný nebo vysrážený lidský inzulín nebo jeho analog či derivát, a ve vodě rozpustné redukované nebo neredukující cukry, které mají ve své základní struktuře nejméně 4 atomy uhlíku, nebo ve vodě rozpustné neredukující esterové anebo éterové deriváty cukrů, nebo redukovaných cukrů, které mají ve své základní struktuře nejméně 4 atomy uhlíku, anebo směs těchto látek.

Podstata vynálezu

Definice

Termínem „analog lidského inzulínu“ je zde míněn takový lidský inzulín, v němž jedna nebo více aminokyselin bylo odstraněno, nebo zaměněno jinými aminokyselinami, včetně nekódovaných aminokyselin, nebo lidský inzulín, obsahující další aminokyseliny, tj. více než 51 aminokyselin.

• ·· ·· ·· ·· ·· ··· · · ·· · · ·· ·

Termínem „derivát lidského inzulínu“ je zde míněn takový lidský inzulín nebo jeho analog, v němž je k jedné nebo více aminokyselinám vázán přinejmenším jeden organický substituent.

Ve zde používaném kontextu, termín „ve vodě rozpustný“ odpovídá rozpustnosti ve vodě přinejmenším 10 mmol/l, výhodněji přinejmenším 50 mmol/l, při teplotě 20 °C.

Termíny sacharid, redukovaný sacharid, monosacharid, disacharid, esterové a éterové deriváty těchto sloučenin jsou používány ve shodě se zásadami K. A. Jensena v „Grundrids af den organiske kemi, Almen Kemi III, Ed., Jul. Gjellerups forlag, 1969, str. 299-316.

Ve zde používaném kontextu, výraz „neredukující sacharid“ označuje sacharid, který je v podstatě neschopen reagovat s aminoskupinami inzulínu v přípravcích podle vynálezu, a tvořit tak inzulín s připojenými sacharidy. Tato definice zahrnuje sacharidy u nichž je karbonylová skupina (skupiny) inaktivována nebo blokována, např. tvorbou anhydridu nebo jiného derivátu.

Z jednoho hlediska se předkládaný vynález vztahuje k vodným inzulínovým přípravkům, obsahujícím: rozpuštěný nebo vysrážený lidský inzulín, jeho analog či derivát a 100 až 400 mM, výhodněji 150 až 250 mM, ještě výhodněji 180 až 230 mM ve vodě rozpustného redukovaného nebo neredukujícího sacharidu, který má nejméně 4 atomy uhlíku ve své základní struktuře, nebo ve vodě rozpustného neredukujícího esterového či éterového derivátu sacharidu nebo redukovaného sacharidu, který má nejméně 4 atomy uhlíku ve své základní struktuře, nebo směsi výše jmenovaných sloučenin.

Z jiného hlediska se předkládaný vynález vztahuje k vodným inzulínovým přípravkům, obsahujícím: rozpuštěný nebo vysrážený lidský inzulín, jeho analog či derivát a ve vodě rozpustný redukovaný nebo neredukující sacharid, který má nejméně 4 atomy uhlíku ve své základní struktuře, nebo ve vodě rozpustný neredukující esterový či éterový derivát sacharidu nebo redukovaného sacharidu, který má nejméně 4 atomy uhlíku ve své základní struktuře, nebo směsi výše jmenovaných sloučenin.

Z ještě jiného hlediska se předkládaný vynález vztahuje k vodným inzulínovým přípravkům, obsahujícím: rozpuštěný nebo vysrážený lidský inzulín a ve vodě rozpustný redukovaný nebo neredukující sacharid, který má nejméně 4 atomy uhlíku ve své základní struktuře, nebo ve vodě rozpustný neredukující esterový či éterový derivát • · • · • ·

6· · ·· · · · ······ * * · « f · · ······· ·· «··· · · ·· sacharidu nebo redukovaného sacharidu, který má nejméně 4 atomy uhlíku ve své základní struktuře, nebo směsi výše jmenovaných sloučenin.

Výhodná provedení

Je výhodné, když sacharid nebo derivát sacharidu použitý v inzulínovém přípravku podle tohoto vynálezu obsahuje 5 až 18 uhlíkových atomů ve své základní struktuře a je přednostně vybírán z následujících sloučenin:

i) monosacharidy vybírané ze skupiny neredukujících aldóz nebo ketóz, výhodně neredukujících aldotetróz, ketotetróz, aldopentóz, ketopentóz, aldohexóz a ketohexóz, ještě výhodněji neredukujících aldopentóz, ketopentóz, aldohexóz a ketohexóz;

ii) redukované monosacharidy, např. polyhydratované alkoholy jako jsou alditoly, přednostně vybírané ze skupiny, obsahující redukované formy aldotetróz, ketotetróz, aldopentóz, ketopentóz, aldohexóz a ketohexóz, ještě výhodněji redukované formy aldopentóz, ketopentóz, aldohexóz a ketohexóz (tj. pentitoly a hexitoly);

iii) neredukující disacharidy, přednostně vybírané ze skupiny neredukujících dihexóz. Typické příklady vhodných redukovaných nebo neredukujících sacharidů jsou: manitol, sorbitol, xylitol, inozitol, sacharóza a trehalóza.

Výhodné sloučeniny i) až iii) jsou manitol a sorbitol, přičemž nejvýhodnější je manitol.

Výhodné esterové a éterové deriváty jsou esterové deriváty Ci - C₄ mastných kyselin a Ci - C₄ alkylové éterové deriváty.

V detailním provedení podle vynálezu dále obsahují inzulínové přípravky halogenidy, přednostně chlorid, ještě výhodněji chlorid sodný. Bylo ukázáno, že následkem přítomnosti halogenidů má přípravek ještě vyšší fyzikální stabilitu.

Protože inzulínové přípravky, obsahující rychle působící analogy inzulínu obecně vykazují poněkud nízkou fyzikální stabilitu, předkládaný vynález je zvláště výhodný ve spojení s přípravky, obsahujícími takové analogy. Tedy, inzulínové přípravky připravené podle tohoto vynálezu s výhodou obsahují jeden nebo více rychle působících analogů lidského inzulínu, zvláště analogů, kde v poloze B28 je Asp, Lys, Leu, Val nebo Ala a v poloze B29 je Lys nebo Pro; nebo des(B28-B30), des(B27) nebo des(B30) lidský inzulín. Analog inzulínu je přednostně vybírán z analogů lidského • ·· · ···· • · · · · · ··· ··· • · » · · · • ·· ·· ···· · · ·· inzulínu, které mají v poloze B28 Asp nebo Lys a v poloze B29 je Lys nebo Pro.

Nejvýhodnější analogy jsou Asp^B28 lidský inzulín nebo Lys^B28Pro^B29 lidský inzulín.

V jiném provedení obsahuje inzulínový přípravek připravený podle tohoto vynálezu inzulínový derivát, který má protrahovaný průběh účinku, jako jsou inzulíny, které mají jeden nebo více lipofilních substituentů. Výhodné lipofilní inzulíny jsou acylované inzulíny včetně těch, které jsou popsány v WO 95/07931 (Novo Nordisk A/S), např. deriváty lidského inzulínu, u kterých ε-aminoskupina Lys⁶²⁹ obsahuje jako substituent acyl, který má přinejmenším 6 atomů uhlíku.

Výhodné deriváty inzulínu jsou následující:

B29-N^E-myristoyl-des(B30) lidský inzulín, B29-N^E-myristoyl lidský inzulín, B29-N^Epalmitoyl lidský inzulín, B28-N^E-myristoyl Lys^B28 Pro^B29 lidský inzulín, B28-N^E-palmitoyl Lys⁶²⁸ Pro⁶²⁹ lidský inzulín, BSO-N^myristoyl-Thr^Lys³⁰- lidský inzulín, B30-N^Epalmitoyl-Thr^B29Lys³⁰- lidský inzulín, B29-N^E-(N-palmitoyl-Y-glutamyl)-des(B30)-lidský inzulín, B29-N^E-(N-litochlyl-Y-glutamyl)-des(B30)-lidský inzulín a Β29-Ν^Ε-(ωkarboxyheptadekanoyl)-des(B30)-lidský inzulín, přičemž nejvýhodnější je B29-N^Emyristoyl-des(B30) lidský inzulín.

Ve výhodném provedení obsahuje inzulínový přípravek jak rozpuštěný, tak vysrážený, přednostně krystalický, inzulín nebo jeho derivát či analog, ve váhovém poměru 1:99 až 99:1, výhodněji 20:80 až 80:20, ještě výhodněji 30:70 až 70:30.

V takovémto provedení vynálezu je výhodné, když inzulínový přípravek obsahuje krystaly, které se skládají z inzulínu nebo analogu inzulínu, protaminu a případně zinku anebo fenolových sloučenin, jako je fenol, m-krezol nebo jejich směs. Je výhodné, když množství protaminu v krystalech odpovídá 0,20 až 0,40 mg protaminové báze na 100 IU inzulínu nebo analogu inzulínu. Je výhodnější, když poměr protaminu k inzulínu v krystalech odpovídá poměru v Isophan inzulínu. Zinek je přítomen přednostně v množství 10 až 40 pg Zn na 100 IU inzulínu, výhodněji v množství 15 až 35 pg Zn na 100 IU inzulínu. Je výhodné, když jsou fenol a m-krezol přítomny v množství, odpovídajícímu 0 až 4 mg/ml. Přesto jsou nejvýhodnější směsi 1,4 až 2,0 mg/ml mkrezolu a 0,6 až 2,0 mg/ml fenolu.

Výhodný inzulínový přípravek podle vynálezu obsahuje:

a) 60 až 3000 nmol/ml, výhodněji 240 až 1200 nmol/ml, lidského inzulínu nebo inzulínového analogu anebo inzulínového derivátu;

• · · ·

b) redukovaný nebo neredukující sacharid, s výhodou manitol, v koncentraci 100 až 400 mM, s výhodou 150 až 250 mM, ještě výhodněji 180 až 230 mM;

c) chlorid, s výhodou chlorid sodný, v koncentraci 0 až 100 mM, výhodněji 5 až 40 mM, ještě výhodněji 5 až 20 mM; a

d) fyziologicky tolerovaný pufr, s výhodou fosfátový pufr, jako je dihydrát monohydrofosforečnanu sodného v množství 1 až 4 mg/ml.

Přípravky podle vynálezu mohou dále obsahovat jednu nebo více sloučenin, běžně užívaných jako činidla udržující izotonicitu, např. glycerol. Je výhodné, když hodnota pH u inzulínových přípravků je v rozmezí 7,0 až 7,8.

Předložený vynález se dále týká způsobů přípravy inzulínových přípravků, obsahujících jak rozpuštěný, tak vysrážený analog inzulínu, vyznačujících se tím, že obsahují následující kroky:

a) příprava kyselého roztoku, obsahujícího analog lidského inzulínu, zinek a množství protaminu menší než v Isophane inzulínu;

b) příprava alkalického roztoku, obsahujícího sloučeninu, která působí jako pufr při fyziologickém pH;

přičemž přinejmenším jeden z výše uvedených roztoků obsahuje fenolické sloučeniny;

c) smíšení kyselého a alkalického roztoku a případně úprava pH na hodnotu v oblasti 6,5 až 8,0, s výhodou 7,0 až 7,8; a

d) ponechání výsledné suspenze srážet.

Touto metodou lze velmi jednoduchým způsobem získat inzulínové přípravky, obsahující jak rozpuštěný, tak vysrážený inzulín. Navíc, sraženina z výsledné suspenze se obyčejně skládá z krystalů tyčinkovitého tvaru, které jsou výhodné v tzv. PreMix inzulínových přípravcích.

Váhový poměr analogu inzulínu k protaminu v roztoku, uvedeném v kroku a) je s výhodou vybrán tak, aby byl v konečném produktu získán váhový poměr rozpustného kvysráženému inzulínovému analogu v rozmezí 1:99 až 99:1, výhodněji 20:80 až 80:20, ještě výhodněji 30:70 až 70:30. Řečeno přesněji, roztok uvedený v kroku a) s výhodou obsahuje 120 až 6000 nmol/ml analogu inzulínu a 0,01 až 5,0 mg/ml protaminu.

• · ·

Roztok uvedený v kroku a) dále obsahuje zinek, a to přednostně v množství odpovídajícím 10 až 40 pg Zn na 100 IU inzulínu, výhodněji v množství 15 až 35 pg Zn na 100 IU inzulínu.

Ve výhodném provedení obsahuje ve výsledném produktu roztok uvedený v kroku a) nebo roztok uvedený v kroku b) chlorid, s výhodou chlorid sodný, v množství odpovídajícím 0 až 100 mM, výhodněji 5 až 40 mM, ještě výhodněji 5 až 20 mM ve výsledném produktu.

Je výhodné, když kyselý roztok uvedený v kroku a) má pH pod 5, ještě výhodněji v oblasti 2 až 3,5.

Analog inzulínu je výhodně lidský inzulín kde v poloze B28 je Asp, Lys, Leu, Val nebo Ala a v poloze B29 je Lys nebo Pro; nebo des(B28-B30), des(B27) nebo des(B30) lidský inzulín, výhodněji Asp⁸²⁸ lidský inzulín nebo Lys⁸²⁸Pro⁸²⁹ lidský inzulín a ještě výhodněji Asp⁸²⁸ lidský inzulín.

Fenolická sloučenina, použitá v roztoku uvedeném v kroku a) anebo v kroku b) je s výhodou fenol, m-krezol nebo jejich směs.

Je výhodné, když roztok uvedený v kroku a) anebo v kroku b) dále obsahuje ve vodě rozpustný redukovaný nebo neredukující sacharid, který má nejméně 4 atomy uhlíku ve své základní struktuře, nebo ve vodě rozpustný neredukující esterový či éterový derivát sacharidu nebo redukovaného sacharidu, který má nejméně 4 atomy uhlíku ve své základní struktuře, nebo směsi výše jmenovaných sloučenin.

Uvedený sacharid nebo analog sacharidu výhodně obsahuje 5 až 18 atomů uhlíku ve své základní struktuře.

Ve zvláště výhodném provedení roztok uvedený v kroku a) anebo v kroku b) obsahuje manitol, sorbitol, xylitol, inozitol, trehalózu, sacharózu nebo směsi výše jmenovaných sloučenin, výhodněji manitol anebo sorbitol, ještě výhodněji manitol.

Sloučenina použitá jako základ pufru v zásaditém roztoku uvedeném v kroku b) je výhodně fyziologicky tolerovaný pufr, výhodněji fosfátový pufr, ještě výhodněji dihydrát monohydrofosforečnanu sodného.

Vysrážený analog inzulínu je s výhodou ve formě krystalů, obsahujících analog inzulínu a protamin.

Suspenze, získaná v kroku b) je s výhodou ponechána pro srážení při teplotě v rozmezí 5-40 °C, výhodněji 20 - 36 °C, ještě výhodněji 30 - 34 °C.

• · · ·

Popis obrázků

Obr. 1 je mikrofotografie (1000-násobné zvětšení) přípravku podle vynálezu, obsahujícího krystaly lidského Asp⁸²⁸ protamin-inzulínu a manitol.

Obr. 1 je mikrofotografie (1000-násobné zvětšení) přípravku podle vynálezu, obsahujícího krystaly lidského protamin-inzulínu a manitol.

Na Obr. 3 je graficky znázorněn časový průběh působení přípravku podle vynálezu, obsahujícího jak rozpuštěný, tak krystalický lidský Asp⁶²⁸ inzulín spolu s časovým průběhem působení přípravku, obsahujícího jak rozpuštěný, tak krystalický lidský inzulín, oba přípravky dále obsahují manitol. Na grafu je znázorněna reakce hladiny krevní glukózy po injekci u vepřů. Obrázek ukazuje, že u vysoce stabilního lidského Asp⁸²⁸ inzulínu je zachován rychlý nástup působení.

Vynález je dále doložen následujícími příklady, které však nejsou míněny jako omezování oblasti uplatnění vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad I

Přípravek 1

Inzulínový přípravek, obsahující jak rozpuštěný, tak krystalický Asp⁸²⁸ lidský inzulín, byl připraven následujícím způsobem:

Roztok A:

Roztok Asp⁸²⁸ lidského inzulínu o koncentraci 200 lU/ml byl připraven rozpuštěním 76,5 mg Asp⁸²⁸ lidského inzulínu ve vodě za přidání 326 μΙ 0,2 N kyseliny chlorovodíkové a 163 μΙ roztoku chloridu zinečnatého (0,4 mg/ml). Poté bylo za míchání přidáno do roztoku inzulínu 6,35 mg protamin sulfátu a směs obsahující 17,2 mg m-krezolu, 15 mg fenolu a 455 mg manitolu. U výsledného čirého roztoku bylo změřeno pH 2,6 až 2,9, pak bylo přidáno 10 ml vody. Roztok byl vytemperován na 28 32 °C.

Roztok B:

Ve vodě pro injekce bylo rozpuštěno 25 mg dihydrátu monohydrofosforečnanu sodného. Za míchání bylo přidáno 17,2 mg m-krezolu, 15 mg fenolu a 455 mg manitolu. U výsledného čirého roztoku bylo změřeno pH 9, pak bylo přidáno 10 ml vody. Roztok byl vytemperován na 28 - 32 °C.

Smíchání roztoků A a B:

Roztok B byl přidán k roztoku A a pH bylo upraveno na 7,30. Výsledná suspenze byla ponechána krystalovat při 30 °C po dobu 6 dní. Ve výsledném přípravku byl váhový poměr vysráženého k rozpuštěnému inzulínu 70:30. Přípravek byl naplněn do zásobníků Penfill®.

Příklad II

Přípravek 2

Inzulínový přípravek, obsahující jak rozpuštěný, tak krystalický Asp⁶²⁸ lidský inzulín, byl připraven následujícím způsobem:

Roztok A:

Roztok Asp⁶²⁸ lidského inzulínu o koncentraci 200 IU/ml byl připraven rozpuštěním 190,3 mg Asp⁶²⁸ lidského inzulínu ve vodě za přidání 813 μΙ 0,2 N kyseliny chlorovodíkové a 410 μΙ roztoku chloridu zinečnatého (0,4 mg/ml). Poté bylo za míchání přidáno do roztoku inzulínu 16,1 mg protamin sulfátu a směs obsahující 43,0 mg m-krezolu, 37,5 mg fenolu, 909 mg manitolu a 14,6 mg chloridu sodného. U výsledného čirého roztoku bylo změřeno pH 2,6 až 2,9, pak bylo přidáno 22 ml vody. Roztok byl vytemperován na 32 °C.

Roztok B:

Ve vodě pro injekce bylo rozpuštěno 62,4 mg dihydrátu monohydrofosforečnanu sodného. Za míchání bylo přidáno 43,0 mg m-krezolu, 37,5 mg fenolu, 909 mg manitolu a 14,6 mg chloridu sodného. U výsledného čirého roztoku bylo změřeno pH 9, pak bylo přidáno 22 ml vody. Roztok byl vytemperován na 32 °C.

Smíchání roztoků A a B:

Roztok B byl přidán k roztoku A, pH bylo upraveno na 7,30 a pak bylo přidáno 50 ml vody. Výsledná suspenze byla ponechána krystalovat při 32 °C po dobu 4 dní. Ve výsledném přípravku byl váhový poměr vysráženého k rozpuštěnému inzulínu 70:30. Přípravek byl naplněn do zásobníků Penfill®.

Příklady III-VI

Přípravky 3 až 6 • ·

Inzulínové přípravky, obsahující jak rozpuštěný, tak krystalický Asp⁶²⁸ lidský inzulín, byly připraveny jak je popsáno v Příkladu II, kromě toho, že množství manitolu použitého v roztoku A a B bylo 818 mg, 1005 mg, 1047 mg a 1137 mg.

Přípravky byly naplněny do zásobníků Penfill®.

Příklad VII

Přípravek VII

Inzulínový přípravek, obsahující jak rozpuštěný, tak krystalický Lys⁶²⁸ Pro^B29lidský inzulín, byl připraven následujícím způsobem;

i) Krystalická frakce

Roztok A;

Roztok Lys⁸²⁸ Asp⁸²⁹ lidského inzulínu o koncentraci 200 lU/ml byl připraven suspendováním 69,7 mg Lys⁸²⁸ Asp⁸²⁹ lidského inzulínu ve vodě. Poté bylo za míchání přidána do tohoto roztoku směs, obsahující 16,0 mg m-krezolu, 6,5 mg fenolu, 364 mg manitolu a 25,1 mg dihydrátu monohydrofosforečnanu sodného. Poté bylo přidáno 50 μΙ roztoku chloridu zinečnatého (10 mg/ml). U výsledného čirého roztoku bylo pH upraveno na 7,4, pak bylo přidáno 10 ml vody. Roztok byl vytemperován na 15 °C. Roztok B:

Roztok protamin sulfátu byl připraven rozpuštěním 7,61 mg protamin sulfátu a 25,1 mg dihydrátu monohydrofosforečnanu sodného ve vodě. Za míchání bylo přidáno 16,0 mg m-krezolu, 6,5 mg fenolu a 364 mg manitolu. Tento roztok byl za míchání přidán k roztoku protamin sulfátu. U výsledného čirého roztoku bylo pH upraveno na 7,4, pak bylo přidáno 10 ml vody. Roztok byl vytemperován na 15 °C.

Smíchání roztoků A a B:

Roztok B byl přidán k roztoku A, pH bylo upraveno na 7,30. Výsledná suspenze byla ponechána krystalovat při 15 °C po dobu 3 dní.

ii) Rozpustná frakce

Roztok Lys⁸²⁸ Asp⁸²⁹ lidského inzulínu byl připraven rozpuštěním 34,9 mg Lys⁸²⁸

Asp⁸²⁹ lidského inzulínu ve vodě za přidání 33 μΙ 1 N kyseliny chlorovodíkové a 25 μΙ roztoku chloridu zinečnatého (10 mg/ml). Poté bylo za míchání přidána do roztoku inzulínu směs, obsahující 26,1 mg dihydrátu monohydrofosforečnanu sodného, 6,5 mg fenolu, 16,0 mg m-krezolu a 364 mg manitolu. U výsledného čirého roztoku bylo * ·»· ·«»»»-13 * : j ·** ···· *· «··« ♦* ·« změřeno ρΗ 7,3, pak bylo přidáno 10 ml vody. Šest ml rozpustné frakce bylo přidáno k 14 ml krystalické frakce a pH bylo upraveno na 7,30. Ve výsledném přípravku byl váhový poměr vysráženého k rozpuštěnému inzulínu 70:30. Přípravek byl naplněn do zásobníků Penfill®.

Příklad Vlil

Přípravek Vlil

Inzulínový přípravek, obsahující jak rozpuštěný, tak krystalický lidský inzulín, byl připraven následujícím způsobem:

i) Krystalická frakce

Roztok A:

Roztok lidského inzulínu byl připraven rozpuštěním 69,7 mg lidského inzulínu ve vodě za přidání 65 μ11 N kyseliny chlorovodíkové a 26 μΙ roztoku chloridu zinečnatého (10 mg/ml). Poté bylo za míchání přidáno k tomuto inzulínovému roztoku 6,0 mg protamin sulfátu v roztoku a směs, obsahující 15,0 mg fenolu a 17,2 mg m-krezolu. U výsledného čirého roztoku bylo změřeno pH 2,7 až 3,2, pak bylo přidáno 10 ml vody. Roztok B:

Ve vodě bylo rozpuštěno 24,9 mg dihydrátu monohydrofosforečnanu sodného. Za míchání bylo přidáno 15,0 mg fenolu, 17,2 mg m-krezolu, 728 mg manitolu a 11,7 mg chloridu sodného. U výsledného čirého roztoku bylo pH upraveno na 9, pak bylo přidáno 10 ml vody.

Roztok B byl přidán k roztoku A, pH bylo upraveno na 7,30. Výsledná suspenze byla ponechána při 22 - 24 °C do následujícího dne.

ii) Rozpustná frakce

Roztok lidského inzulínu byl připraven rozpuštěním 34,9 mg lidského inzulínu ve vodě za přidání 33 μ11 N kyseliny chlorovodíkové a 13 μΙ roztoku chloridu zinečnatého (10 mg/ml). Poté bylo za míchání přidána do roztoku inzulínu směs, obsahující 12,5 mg dihydrátu monohydrofosforečnanu sodného, 15 mg fenolu, 17,2 mg m-krezolu a 364 mg manitolu a 5,8 mg chloridu sodného. U výsledného čirého roztoku bylo změřeno pH 7,3, pak bylo přidáno 10 ml vody. Šest ml rozpustné frakce bylo přidáno k 14 ml krystalické frakce a pH bylo upraveno na 7,30. Ve výsledném přípravku byl váhový

poměr vysráženého k rozpuštěnému inzulínu 70:30. Přípravek byl naplněn do zásobníků Penfill®.

Příklad IX

Přípravek IX

Roztok A:

Roztok Asp⁸²⁸ lidského inzulínu o koncentraci 200 lU/ml byl připraven suspendováním 189,9 mg Asp⁸²⁸ lidského inzulínu ve vodě za přidání 163 μΙ 1 N kyseliny chlorovodíkové a 163,5 μΙ roztoku chloridu zinečnatého (10 mg/ml). Poté bylo za míchání přidáno do tohoto roztoku inzulínu 11,5 mg protamin sulfátu v roztoku a směs, obsahující 44,3 mg m-krezolu, 38,6 mg fenolu, 1048 mg manitolu a 7,3 mg chloridu sodného. U výsledného čirého roztoku bylo změřeno pH 2,6 až 2,9, pak bylo přidáno 25 ml vody. Roztok byl vytemperován na 22 - 24 °C.

Roztok B:

Ve vodě bylo rozpuštěno 62,3 mg dihydrátu monohydrofosforečnanu sodného. Za míchání bylo přidáno 44,3 mg m-krezolu, 38,6 mg fenolu, 1048 mg manitolu a 7,3 mg chloridu sodného. U výsledného čirého roztoku bylo změřeno pH 9, pak bylo přidáno 25 ml vody. Roztok byl vytemperován na 22 - 24 °C.

Smíchání roztoků A a B:

Roztok B byl přidán k roztoku A, pH bylo upraveno na 7,30. Výsledná suspenze byla ponechána krystalovat při 32 °C po dobu 2 dní.

. Ve výsledném přípravku byl váhový poměr vysráženého k rozpuštěnému inzulínu 70:30. Přípravek byl naplněn do zásobníků Penfill®.

Příklad X (srovnávací)

Přípravek X

Roztok A:

Roztok Asp⁸²⁸ lidského inzulínu o koncentraci 200 lU/ml byl připraven suspendováním 76,5 mg Asp⁸²⁸ lidského inzulínu ve vodě za přidání 326 μΙ 0,2 N kyseliny chlorovodíkové a 163 μΙ roztoku chloridu zinečnatého (0,4 mg/ml). Poté bylo za míchání přidáno do tohoto roztoku inzulínu 6,35 mg protamin sulfátu v roztoku a směs, obsahující 17,2 mg m-krezolu, 15,0 mg fenolu a 160 mg glycerolu. U výsledného čirého roztoku bylo změřeno pH 2,6 až 2,9, pak bylo přidáno 10 ml vody. Roztok byl vytemperován na 28 - 32 °C.

Roztok B:

Ve vodě pro injekce bylo rozpuštěno 25 mg dihydrátu monohydrofosforečnanu sodného. Za míchání bylo přidáno 17,2 mg m-krezolu, 15,0 mg fenolu a 160 mg glycerolu. U výsledného čirého roztoku bylo změřeno pH 9, pak bylo přidáno 10 ml vody. Roztok byl vytemperován na 28 - 32 °C.

Smíchání roztoků A a B:

Roztok B byl přidán k roztoku A, pH bylo upraveno na 7,30. Výsledná suspenze byla ponechána krystalovat při 28 - 32 °C po dobu 2 dní.

Ve výsledném přípravku byl váhový poměr vysráženého k rozpuštěnému inzulínu 70:30. Přípravek byl naplněn do zásobníků Penfill®.

Příklad XI

Testy fyzikální zátěže

Pět vzorků každého inzulínového přípravku bylo naplněno do zásobníků Penfill® a podrobeno následujícím testům fyzikální zátěže.

Zásobníky Penfill® byly upevněny na rotující zařízení, umístěné v inkubátoru, a rotovány o 360° po dobu 4 hodin denně, rychlostí 30 otáček za minutu, při konstantní teplotě 32 ± 2 °C. Zásobníky Penfill® byly v době mimo otáčení uloženy při konstantní teplotě 32 ± 2 °C.

Zásobníky Penfill® byly makroskopicky prohlédnuty pětkrát za týden a změny ve vzhledu přípravku byly zaznamenávány podle následujících zásad:

i) zásobníky, obsahující bílou suspenzi, která byla opět resuspendovatelná třepáním a bez chuchvalců a drobků, byly hodnoceny jako „nezfibrilovaný“.

ii) zásobníky, obsahující suspenzi s chuchvalci a drobky, která nebyla resuspendovatelná třepáním anebo suspenzi usazenou na stěnách zásobníku, byly

W. · · · · · · ····« • * · · * · ····(·· ·· «··· ·· ·« hodnoceny jako „zfibrilovaný“. Toto hodnocení bylo potvrzeno přidáním 6 μΙ 6N HCI do zásobníku. Zfibrilované zásobníky nebyly po přidání kyseliny vizuálně čiré.

Výsledky jsou shrnuty v následující Tabulce I

Přípravek č.	Složení	Průměrný počet dnů do fibrilace	První den I fibrilace \|
1	Asp⁸²⁸ inzulín 30/70 7 mM fosfát 250 mM manitol	20	20
2	Asp⁸²⁸ inzulín 30/70 7 mM fosfát 200 mM manitol 10 mM chlorid sodný	23	²³
3	Asp⁸²⁸ inzulín 30/70 7 mM fosfát 180 mM manitol 10 mM chlorid sodný	21	17
4	Asp⁸²⁸ inzulín 30/70 7 mM fosfát 220 mM manitol 10 mM chlorid sodný	19	17
⁵	Asp⁸²⁸ inzulín 30/70 7 mM fosfát 230 mM manitol 10 mM chlorid sodný	21	18
6	Asp⁸²⁸ inzulín 30/70 7 mM fosfát 250 mM manitol 10 mM chlorid sodný	22	22
•	Asp⁸²⁸ inzulín 50/50 7 mM fosfát 230 mM manitol 10 mM chlorid sodný	>30	>30
10 (srovnávací)	Asp⁸²⁸ inzulín 30/70 7 mM fosfát 174 mM glycerol	11	⁹ I

Průmyslová využitelnost

Inzulínové přípravky vyrobené podle vynálezu obsahují sacharidy, které značně zvyšují jejich fyzikální stabilitu a jsou s výhodou použitelné do zásobníků inzulínových per.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Vodný inzulínový přípravek vyznačující se tím, že obsahuje rozpuštěný anebo vysrážený lidský inzulín nebo jeho analog či derivát a 100 až 400 mM, výhodněji 150 až 250, ještě výhodněji 180 až 230 mM ve vodě rozpustného, redukovaného anebo neredukujícího sacharidu, který obsahuje nejméně 4 atomy uhlíku ve své základní struktuře, nebo ve vodě rozpustný, neredukující esterový či éterový derivát sacharidu nebo redukovaného sacharidu, který obsahuje nejméně 4 atomy uhlíku ve své základní struktuře, nebo směs výše jmenovaných sloučenin.
2. Inzulínový přípravek podle nároku 1, vyznačující se tím, že uvedený sacharid nebo sacharidový derivát obsahuje 5 až 18 atomů uhlíku ve své základní struktuře.
3. Inzulínový přípravek podle nároku 2, vyznačující se t í m, že obsahuje manitol, sorbitol, xylitol, inozitol, trehalózu sacharózu, nebo jakoukoli jejich směs, výhodně manitol nebo sorbitol, ještě výhodněji manitol.
4. Inzulínový přípravek podle kteréhokoli z předešlých nároků, který dále obsahuje halogenidy, výhodně chlorid, ještě výhodněji chlorid sodný.
5. Inzulínový přípravek podle kteréhokoli z předešlých nároků, vyznačující se tím, že obsahuje analog lidského inzulínu, kde se v poloze B28 nalézá Asp, Lys, Leu, Val nebo Ala a v poloze B29 se nachází Lys nebo Pro; nebo lidský inzulín des(B28-B30), des(B27) nebo des(B30).
6. Inzulínový přípravek podle nároku 5, vyznačující se tím, že obsahuje že obsahuje analog lidského inzulínu, kde se v poloze B28 nalézá Asp nebo Lys a v poloze B29 se nachází Lys nebo Pro, výhodně Asp⁶²⁸ lidský inzulín nebo Lys^B28Pro^B29 lidský inzulín.

• ·« ·· · · ·· ·· ··· · · ·· · ♦ » · • · · · · ·

19 ·*: ·*:

······· · · *··· ·· ··
7. Inzulínový přípravek podle kteréhokoli z předešlých nároků 1až4, vyznačujíc í se t í m, že obsahuje derivát lidského inzulínu, který má jeden nebo více lipofilních substituentů, výhodně acylovaný inzulín.
8. Inzulínový přípravek podle nároku 7, vyznačující se tím, že obsahuje derivát lidského inzulínu, patřící do následující skupiny: B29-N^E-myristoyl-des(B30) lidský inzulín, B29-N^E-myristoyl lidský inzulín, B29-N^e-palmitoyl lidský inzulín, B28N^£-myristoyl Lys^B28 Pro⁸²⁹ lidský inzulín, B28-N^E-palmitoyl Lys⁶²⁸ Pro^B29 lidský inzulín, B30-N^£-myristoyl-Thr^B29Lys³°- lidský inzulín, Β30-Ν^ε- palmitoyl-Thr^B29Lys³⁰lidský inzulín, B29-N^E-(N-palmitoyl-Y-glutamyl)-des(B3G)-lidský inzulín, Β29-Ν^ε-(Νlitochlyl-y-glutamyl)-des(B30)-lidský inzulín a B29-N^e-(u)-karboxyhepta-dekanoyl)des(B30)-lidský inzulín, výhodně B29-N^£-myristoyl-des(B30) lidský inzulín.
9. Inzulínový přípravek podle kteréhokoli z předešlých nároků, vyznačující se tím, že obsahuje krystaly lidského inzulínu nebo jeho analogu či derivátu a protamin.
10. Inzulínový přípravek podle nároku 9, vyznačující se tím, že krystaly dále obsahují zinek a případně fenolickou sloučeninu, výhodně fenol, m-kresol nebo jejich směs.
11. Inzulínový přípravek podle kteréhokoli z předešlých nároků, vyznačující se tím, že obsahuje rozpuštěný i vysrážený, s výhodou krystalický inzulín nebo jeho analog, ve váhovém poměru 1:99 až 99:1, výhodně 20:80 až 80:20, ještě výhodněji 30:70 až 70:30.
12. Inzulínový přípravek podle kteréhokoli z předešlých nároků, vyznačující se tím, že obsahuje 60 až 3000 nm/ml, výhodně 240 až 1200 nm/ml lidského inzulínu nebo jeho analogu či derivátu. ¹³
13. Inzulínový přípravek podle kteréhokoli z předešlých nároků, vyznačující se tím, že obsahuje 0 až 100 mM, výhodně 5 až 40 mM, výhodněji 5 až 20 mM chloridu, výhodně chloridu sodného.
14. Inzulínový přípravek podle kteréhokoli z předešlých nároků, vyznačující se tím, že dále obsahuje fyziologicky tolerovaný pufr, výhodně fosfátový pufr.
15. Vodný inzulínový přípravek, vyznačující se tím, že obsahuje rozpuštěný lidský inzulín nebo jeho analog či derivát, krystaly obsahující lidský inzulín nebo jeho analog či derivát a protamin a ve vodě rozpustný, redukovaný anebo neredukující sacharid, který obsahuje nejméně 4 atomy uhlíku ve své základní struktuře, nebo ve vodě rozpustný, neredukující esterový či éterový derivát sacharidu nebo redukovaného sacharidu, který obsahuje nejméně 4 atomy uhlíku ve své základní struktuře, nebo směs výše jmenovaných sloučenin.
16. Inzulínový přípravek podle nároku 15, vyznačující se tím, že uvedený sacharid nebo sacharidový derivát obsahuje 5 až 18 atomů uhlíku ve své základní struktuře.
17. Inzulínový přípravek podle nároku 16, vyznačující se tím, že obsahuje manitol, sorbitol, xylitol, inozitol, trehalózu sacharózu, nebo jakoukoli jejich směs, výhodně manitol nebo sorbitol, ještě výhodněji manitol.
18. Inzulínový přípravek podle kteréhokoli z předešlých nároků 15 až 17, který dále obsahuje halogenidy, výhodně chlorid, ještě výhodněji chlorid sodný.
19. Inzulínový přípravek podle kteréhokoli z předešlých nároků 15 až 18, vyznačuj ící se t í m, že obsahuje analog lidského inzulínu, kde se v poloze B28 nalézá Asp, Lys, Leu, Val nebo Ala a v poloze B29 se nachází Lys nebo Pro; nebo lidský inzulín des(B28-B30), des(B27) nebo des(B30).
20. Inzulínový přípravek podle nároku 19, vyznačující se tím, že obsahuje že obsahuje analog lidského inzulínu, kde se v poloze B28 nalézá Asp nebo Lys a v poloze B29 se nachází Lys nebo Pro, výhodně Asp⁵²⁸ lidský inzulín nebo Lys^B28Pro⁸²⁹ lidský inzulín.

• · · ·
21. Inzulínový přípravek podle kteréhokoli z předešlých nároků 15 až 18, vyznačuj ící se t í m, že obsahuje derivát lidského inzulínu, který má jeden nebo více lipofilních substituentů, výhodně acylovaný inzulín.
22. Inzulínový přípravek podle nároku 21, vyznačující se tím, že obsahuje derivát lidského inzulínu, patřící do následující skupiny: B29-N^E-myristoyl-des(B30) lidský inzulín, B29-N^E-myristoyl lidský inzulín, B29-N^E-palmitoyl lidský inzulín, B28N^E-myristoyl Lys®^{26 * 28} Pro®²⁹ lidský inzulín, B28-N^E-palmitoyl Lys®²⁸ Pro®²⁹ lidský inzulín, B30-N^E-myristoyl-Thr®²⁹Lys^3Q- lidský inzulín, B30-N^E- palmitoyl-Thr®²⁹Lys³⁰lidský inzulín, B29-N^E-(N-palmitoyl-y-glutamyl)-des(B30)-lidský inzulín, B29-N^E-(Nlitochlyl-y-glutamyl)-des(B30)-lidský inzulín a B29-N^E-(u)-karboxyhepta-dekanoyl)des(B30)-lidský inzulín, výhodně B29-N^E-myristoyl-des(B30) lidský inzulín.
23. Inzulínový přípravek podle kteréhokoli z předešlých nároků 15 až 22, vyznačuj ící se t í m, že krystaly dále obsahují zinek a případně fenolickou sloučeninu, výhodně fenol, m-kresol nebo jejich směs.
24. Inzulínový přípravek podle kteréhokoli z předešlých nároků 15 až 23, vyznačuj ící se t í m, že obsahuje rozpuštěný i vysrážený, s výhodou krystalický inzulín nebo jeho analog, ve váhovém poměru 1:99 až 99:1, výhodně 20:80 až 80:20, ještě výhodněji 30:70 až 70:30.
25. Inzulínový přípravek podle kteréhokoli z předešlých nároků 15 až 24, kde redukovaný nebo neredukující sacharid, výhodně manitol, je přítomen v množství, odpovídajícím 100 až 400 mM, výhodně 150 až 250 mM, ještě výhodněji 180 až 230 mM.
26. Inzulínový přípravek podle kteréhokoli z předešlých nároků 13 až 25, vyznačuj ící se t í m, že obsahuje 60 až 3000 nm/ml, výhodně 240 až 1200 nm/ml lidského inzulínu nebo jeho analogu či derivátu.
27. Inzulínový přípravek podle kteréhokoli z předešlých nároků 15 až 26, vyznačuj ící se t i m, že obsahuje 0 až 100 mM, výhodně 5 až 40 mM, výhodněji 5 až 20 mM chloridu, výhodně chloridu sodného.
28. Inzulínový přípravek podle kteréhokoli z předešlých nároků 15 až 27, vyznačuj ící se t i m, že dále obsahuje fyziologicky tolerovaný pufr, výhodně fosfátový pufr.
29. Vodný inzulínový přípravek, vyznačující se tím, že obsahuje rozpuštěný i vysrážený analog lidského inzulínu, kde se v poloze B28 nalézá Asp, Lys, Leu, Val nebo Ala a v poloze B29 se nachází Lys nebo Pro; nebo lidský inzulín des(B28B30), des(B27) nebo des(B30) a ve vodě rozpustný, redukovaný anebo neredukující sacharid, který obsahuje nejméně 4 atomy uhlíku ve své základní struktuře, nebo ve vodě rozpustný, neredukující esterový či éterový derivát sacharidu nebo redukovaného sacharidu, který obsahuje nejméně 4 atomy uhlíku ve své základní struktuře, nebo směs výše jmenovaných sloučenin.
30. Inzulínový přípravek podle nároku 29, kde uvedený sacharid nebo sacharidový derivát obsahuje 5 až 18 atomů uhlíku ve své základní struktuře.
31. Inzulínový přípravek podle nároku 30, vyznačující se t i m, že obsahuje manitol, sorbitol, xylitol, inozitol, trehalózu, sacharózu, nebo jakoukoli jejich směs, výhodně manitol nebo sorbitol, ještě výhodněji manitol.
32. Inzulínový přípravek podle kteréhokoli z předešlých nároků 29 až 31, který dále obsahuje halogenidy, výhodně chlorid, ještě výhodněji chlorid sodný.
33. Inzulínový přípravek podle nároku 32, kde analog lidského inzulínu je takový lidský inzulín, kde se v poloze B28 nalézá Asp nebo Lys a v poloze B29 se nachází Lys nebo Pro; výhodně Asp⁸²⁸ lidský inzulín nebo Lys⁸²⁸Pro⁸²⁹ lidský inzulín.
34. Inzulínový přípravek podle nároku 33, kde analog lidského inzulínu je Asp⁸²⁸ lidský inzulín.

• «· · · · · ·· ·» ··· * · · · · * r i · • · Λ * * * « p • « · · * · · · · - · « ► » * · · * « « ·*····« · · « · · « · · · ♦
35. Inzulínový přípravek podle kteréhokoli z předešlých nároků 29 až 34, vyznačuj ící se t í m, že se skládá z krystalů, které obsahují analog inzulínu a protamin.
36. Inzulínový přípravek podle nároku 35, v y z n a č u j í c í se t í m, že krystaly dále obsahují zinek a případně fenolickou sloučeninu, výhodně fenol, m-kresol nebo jejich směs.
37. Inzulínový přípravek podle kteréhokoli z předešlých nároků 29 až 36, vyznačuj ící se t í m, že obsahuje rozpuštěný a vysrážený, s výhodou krystalický analog inzulínu, ve váhovém poměru 1:99 až 99:1, výhodně 20:80 až 80:20, ještě výhodněji 30:70 až 70:30.
38. Inzulínový přípravek podle kteréhokoli z předešlých nároků 29 až 37, vyznačuj ící se t í m, že obsahuje 60 až 3000 nm/ml, výhodně 240 až 1200 nm/ml analogu lidského inzulínu.
39. Inzulínový přípravek podle kteréhokoli z předešlých nároků 29 až 39, vyznačuj ící se t í m, že obsahuje 0 až 100 mM, výhodně 5 až 40 mM, výhodněji 5 až 20 mM chloridu, výhodně chloridu sodného.
40. Inzulínový přípravek podle kteréhokoli z předešlých nároků 30 až 41, který dále obsahuje fyziologicky tolerovaný pufr, výhodně fosfátový pufr.
41. Parenterálně aplikovaný farmaceutický výrobek, obsahující inzulínový přípravek připravený podle kteréhokoli z předcházejících nároků.
42. Použití ve vodě rozpustného redukovaného anebo neredukujícího sacharidu, který obsahuje nejméně 4 atomy uhlíku ve své základní struktuře, nebo ve vodě rozpustného, neredukujícího esterového či éterového derivátu sacharidu nebo redukovaného sacharidu, který obsahuje nejméně 4 atomy uhlíku ve své základní struktuře, nebo směs výše jmenovaných sloučenin, pro zlepšení fyzikální stability inzulínových přípravků, obsahujících lidský inzulín nebo jeho analog či derivát.

• ·
43. Použití manitolu, sorbitolu, xylitolu, inozitolu, trehalózy, sacharózy, nebo jakékoli jejich směsi, výhodně manitolu nebo sorbitolu, ještě výhodněji manitolu, pro zlepšení fyzikální stability inzulínových přípravků, obsahujících lidský inzulín nebo jeho analog či derivát.
44. Způsob přípravy inzulínových přípravků, které obsahují jak rozpuštěný, tak vysrážený analog inzulínu, vyznačující se tím, že obsahuje kroky:

a) příprava kyselého roztoku, obsahujícího analog lidského inzulínu, zinek a subizofanické množství protaminu;

b) příprava zásaditého roztoku, obsahujícího látky, působící jako pufr při fyziologickém pH;

c) přičemž alespoň jeden z výše jmenovaných roztoků dále obsahuje fenolickou sloučeninu;

d) smísení kyselého a zásaditého roztoku a případné upravení pH na hodnotu v oblasti 6,5 až 8,0, výhodně 7,0 až 7,8; a

e) ponechání výsledné suspenze srážet se.
45. Způsob podle nároku 44, kde váhový poměr analogu inzulínu k protaminu v roztoku, uvedeném v kroku a) je vybrán tak, aby byl v konečném produktu získán váhový poměr rozpuštěného a vysráženého analogu inzulínu v oblasti 1:99 až 99:1, výhodně 20:80 až 80:20, ještě výhodněji 30:70 až 70:30.
46. Způsob podle nároku 45, kde roztok uvedený v kroku a) obsahuje 120 až 6000 nmol/ml analogu inzulínu a 0,01 až 5,0 mg/ml protaminu.
47. Způsob podle nároku 46, kde roztok uvedený v kroku a) dále obsahuje zinek, výhodně chlorid zinečnatý, v množství odpovídajícím 10 až 40 pg zinku/100 IU inzulínu, výhodně 15 až 35 pg zinku/100 IU inzulínu.
48. Způsob podle kteréhokoli z předešlých nároků 44 až 47, kde roztok uvedený v kroku a) anebo roztok uvedený v kroku b) obsahuje chlorid, výhodně chlorid

9 · » » * « sodný, v množství odpovídajícím v konečném produktu 0 až 100 mM, výhodně 5 až 40 mM a ještě výhodněji 5 až 20 mM.
49. Způsob podle kteréhokoli z předešlých nároků 44 až 48, kde pH kyselého roztoku uvedeného v kroku a) je nižší než 5, výhodně v oblasti 2 až 3,5.
50. Způsob podle kteréhokoli z předešlých nároků 44 až 49, kde analog lidského inzulínu je takový lidský inzulín, kde se v poloze B28 nalézá Asp, Lys, Leu, Val nebo Ala a v poloze B29 se nachází Lys nebo Pro; nebo lidský inzulín des(B28B30), des(B27) nebo des(B30).
51. Způsob podle nároku 50, kde analog lidského inzulínu je Asp⁸²⁸ lidský inzulín nebo Lys⁸²⁸Pro⁸²⁹ lidský inzulín, výhodně Asp⁸²⁸ lidský inzulín.
52. Způsob podle kteréhokoli z předešlých nároků 44 až 51, kde roztok uvedený v kroku a) anebo roztok uvedený v kroku b) dále obsahuje fenolickou sloučeninu, výhodně fenol, m-krezol nebo jejich směs.
53. Způsob podle kteréhokoli z předešlých nároků 44 až 51, kde roztok uvedený v kroku a) anebo roztok uvedený v kroku b) dále obsahuje ve vodě rozpustný, redukovaný anebo neredukující sacharid, který obsahuje nejméně 4 atomy uhlíku ve své základní struktuře, nebo ve vodě rozpustný, neredukující esterový či éterový derivát sacharidu nebo redukovaného sacharidu, který obsahuje nejméně 4 atomy uhlíku ve své základní struktuře, nebo směs výše jmenovaných sloučenin.
54. Způsob podle nároku 53, kde uvedený sacharid nebo sacharidový derivát obsahuje 5 až 18 atomů uhlíku ve své základní struktuře.
55. Způsob podle nároku 54, kde roztok uvedený v kroku a) anebo roztok uvedený v kroku b) obsahuje obsahuje manitol, sorbitol, xylitol, inozitol, trehalózu, sacharózu, nebo jakoukoli jejich směs, výhodně manitol nebo sorbitol, ještě výhodněji manitol.

• ·· ·· ·· ··· · · » · · • · « « · • · a · ♦ · ' ř · · *· ······· ·· ···· ·· ·* * <· * · ř

• « < : · ·> ř #

• · · fc
56. Způsob podle kteréhokoli z předešlých nároků 44 až 55, kde pufrující sloučenina, použitá v zásaditém roztoku uvedeném v kroku b) je fyziologicky tolerovaný pufr, výhodně fosfátový pufr, ještě výhodněji dihydrát monohydrofosforečnanu sodného.
57. Způsob podle kteréhokoli z předešlých nároků 44 až 56, kde vysrážený analog inzulínu je ve formě krystalů, obsahujících analog inzulínu a protamin.
58. Způsob podle kteréhokoli z předešlých nároků 44 až 57, kde suspenze získaná v kroku a) je ponechána srážet při teplotě v rozsahu 5-40 °C, výhodně 20 - 36 °C, ještě výhodněji 30 - 34 °C.