CZ299478B6

CZ299478B6 - Amino-terminálne zkrácený MCP-2, molekula DNA, expresní vektor, hostitelská bunka a farmaceutický prostredek

Info

Publication number: CZ299478B6
Application number: CZ20001146A
Authority: CZ
Inventors: Proost@Paul; Struyf@Sofie; Damme@Jo Van
Original assignee: Laboratoires Serono Sa
Priority date: 1997-09-29
Filing date: 1998-09-28
Publication date: 2008-08-06
Also published as: PT1439231E; ES2218860T3; US20030124677A1; KR100560275B1; DE69822856D1; HUP0003505A3; US20030119148A1; EP1019507B1; IL135352A; PL196427B1; HUP0003563A2; US6977071B2; DK1439231T3; SK286495B6; US20050201977A1; US6905676B2; BG104267A; HUP0003505A2; NZ503235A; KR20010024214A

Abstract

Rešení se týká amino-terminálne zkráceného MCP-2 (chemotaktický protein-2 monocytu), kterému chybí NH.sub.2.n.-terminální aminokyseliny odpovídající aminokyselinovým zbytkum 1-5 prirozeného MCP-2, který má antagonistickou aktivitu k chemokinu. Rešení se dále týká cDNA, kódující tento zkrácený chemokin, vektoru, obsahujícího tuto DNA, hostitelské bunky s obsahem tohoto vektoru a farmaceutického prostredku s obsahem uvedeného proteinu.

Description

Řešení se týká amino-terminálně zkráceného MCP-2 (chemotaktický protein-2 monocytů), kterému chybí NH₂terminální aminokyseliny odpovídající aminokyselinovým zbytkům 1-5 přirozeného MCP-2, který má antagonistickou aktivitu k chemokinu. Řešení se dále týká cDNA, kódující tento zkrácený chemokin, vektoru, obsahujícího tuto DNA, hostitelské buňky s obsahem tohoto vektoru a farmaceutického prostředku s obsahem uvedeného proteinu.

Amino-terminálně zkrácený MCP-2, molekula DNA, expresní vektor, hostitelská buňka a farmaceutický prostředek

Oblast techniky

Vynález se týká amino-terminálně zkráceného MCP-2 (chemotaktický protein-2 monocytů), kterému chybí NEf-terminální aminokyseliny odpovídající aminokyselinovým zbytkům 1-5 přirozeného MCP-2, který má antagonistickou aktivitu k chemokinu. Vynález se dále týká ío cDNA, kódující tento zkrácený chemokin, vektoru, obsahujícího tuto DNA, hostitelské buňky s obsahem tohoto vektoru a farmaceutického prostředku s obsahem uvedeného proteinu.

Dosavadní stav techniky 15

Chemokiny tvoří rodinu malých prozánětlivých cytokinů s chemotaktickými a aktivačními vlastnostmi pro leukocyty. Podle pozice prvních cysteinů může být rodina chemokinů dělena na C-C, C-X-C a C-X₃-C chemokiny (Baggiolini M. et al., 1994; Baggiolini M. et al., 1997; a Taub, D. etal., 1996).

Mnoho C-X-C chemokinů, jako je interleukin 8 (IL—8), jsou chemotaktické faktory pro neutrofily, zatímco C-C chemokiny, jako je monocytový chemotaktický protein 3 (MCP-3), jsou aktivní na různé leukocyty, včetně monocytů, lymfocytů, eosinofilů, bazofilů, NK buněk a dendritických buněk.

NH₂-koncová doména chemokinů se účastní vazby na receptor a zpracování NR₂ konce může buď aktivovat chemokiny, nebo může zcela inaktivovat chemokiny.

Z C-X-C chemokinu destičkového bazického proteinu se stává neutrofilový chemotaktický pep30 tid (NAP-2) pouze po odstranění 24 NH₂-koncových zbytků (Walz A. et al., 1989 a Van Damme

J. et al., 1990).

Delece až 8 NH₂-koncových zbytků z IL-8 vede k vyšší chemotaktické aktivitě, ale další štěpení

Glu-Leu-Arg motivu, který je umístěn před prvním Cys ve všech chemotaktických C-X-C 35 chemokinech, způsobuje kompletní inaktivaci (Clark-Lewis I. et al., 1991).

Podobně, NH₂-koncová proteolýza (až 8 aminokyselin) jiného C-X-C chemokinu, granulocytového chemotaktického proteinu 2 (GCP-2), nemá žádný vliv na chemotaktickou aktivitu neutrofilů (Proost, P. et al., 1993a).

Syntetické C-C chemokiny MCP-1, MCP-3 a RANTES bez 8-9 NH₂-koncových aminokyselin jsou inaktivní pro monocyty ajsou použitelné jako antagonisté receptorů (Gong J. et al., 1996; a Gong J. etal., 1995).

Prodloužení RANTES o jeden methionin vede ke kompletní inaktivaci molekuly a MetRANTES se chová jako antagonista vzhledem ke skutečnému RANTES (Proudfoot A. E. et al.,

1996).

Klon lidského MCP-2 (monocytámího chemoatraktantního proteinu-2) byl izolován diferenciál50 ním skríningem knihovny s cDNA sondami získanými od stimulovaných versus klidových lymfocytů periferní krve (PBL) (byl nejprve označen „HC14“, Chang H. C. et al., 1989). Proteinová sekvence získaná z cDNA byla identická se sekvencí přečištěného přirozeného MCP-2; nicméně, byla také izolována domnělá alelická varianta, ve které Gin 46 nahrazuje Lys 46 (Van Coillie et al., 1997).

-1 CZ 299478 B6

MCP-2 byl také syntetizován technikou syntézy na pevné fázi (Proost P. et al., 1995).

Podstata vynálezu

Podstatu vynálezu tvoří amino-terminálně zkrácený MCP-2 (chemotaktický protein-2 monocytů), kterému chybí NH₂-terminální aminokyseliny odpovídající aminokyselinovým zbytkům 1-5 přirozeného MCP-2, který má antagonistickou aktivitu k chemokinu.

ío Přesněji je předmětem předkládaného vynálezu MCP-2(6-76), což je MCP-2, kterému chybí Ιό NH₂-terminální aminokyseliny, jak je uveden na obr. 1 a v SEQ ID NO: 3 nebo v SEQ ID NO: 4.

Takový amino-terminálně zkrácený MCP-2 podle předkládaného vynálezu může být v glykosylované nebo v neglykosylované formě.

Termín „antagonista chemokinu“ znamená „působící antagonisticky vzhledem k přirozenému kompletnímu chemokinu“.

Jiným předmětem předkládaného vynálezu je molekula DNA obsahující DNA sekvenci kódující amino-koncově zkrácený MCP-2 podle předkládaného vynálezu, včetně v podstatě stejných nukleotidových sekvencí.

Termín „v podstatě stejná nukleotidová sekvence“ zahrnuje všechny další nukleotidové sekvence, které - z důvodů degenerace genetického kódu - také kódují danou aminokyselinovou sekvenci.

Vynález také obsahuje expresní vektory obsahující výše uvedené DNA, hostitelské buňky transformované takovými vektory a způsob přípravy takových amino-terminálně zkrácených MCP-2 podle předkládaného vynálezu pomocí kultivace uvedených transformovaných buněk ve vhod30 něm kultivačním médiu.

DNA sekvence kódující proteiny podle předkládaného vynálezu může být insertována a ligována do vhodného plazmidu. Po přípravě je expresní vektor vložen do vhodné hostitelské buňky, která potom exprimuje vektor za zisku požadovaného proteinu.

Exprese jakéhokoliv rekombinantního proteinu podle předkládaného vynálezu, jak je zde popsána, může být provedena v eukaryotických buňkách (například v kvasinkách, hmyzích nebo v savčích buňkách), nebo v prokaryotických buňkách, za použití vhodných expresních vektorů. Může být použita jakákoliv v oboru známá technika.

Například, DNA molekuly kódující proteiny získané jakýmkoliv výše uvedeným způsobem jsou insertovány do vhodně konstruovaných expresních vektorů technikami známými v oboru (viz Sambrook et al., 1989). Dvouřetězcová cDNA je navázána na plazmidové vektory homopolymemím napojením nebo restrikční vazbou vyžadující použití syntetických DNA linkerů nebo technik ligace lepivých konců: DNA ligázy jsou použity pro ligaci DNA molekul a nežádoucí vazbě je zabráněno reakcí s alkalickou fosfatázou.

Pro umožnění exprese požadovaného proteinu by měl expresní vektor také obsahovat specifické nukleotidové sekvence obsahující transkripční a translační regulační sekvence navázané na DNA kódující požadovaný protein takovým způsobem, aby umožňovaly expresi genu a produkci proteinu. Za prvé, před genem, který má být transkribován, musí být umístěn promotor rozpoznávaný RNA polymerázou, na který se tato polymeráza naváže a tak iniciuje proces transkripce. Používá se mnoho takových promotorů, které pracují s různou účinností (silné a slabé promotory).

-2CZ 299478 B6

Pro eukaryotické hostitele mohou být použity různé transkripční a translační regulační sekvence, které jsou vybrané podle vlastností hostitele. Mohou být získány z virových zdrojů, jako jsou adenoviry, hovězí papiloma-viry, Simian virus a podobně, kde tyto regulační signály jsou asociovány s určitým genem, který má vysokou úroveň exprese. Příklady jsou TK promotor Her5 pes viru, SV40 časný promotor, kvasinkový gal4 promotor, atd. Transkripční iniciační regulační signály mohou být vybrány tak, že umožňují represi a aktivaci a tím modulování exprese genů.

DNA molekula obsahující nukleotidovou sekvenci pro protein podle předkládaného vynálezu je insertována do vektoru obsahujícího operativně navázané transkripční a translační regulační sig10 nály, který může integrovat vybranou genovou sekvenci do hostitelské buňky.

Buňky, které byly stabilně transformované vloženou DNA, mohou být selektovány tak, že je do nich zároveň vložen jeden nebo více markérů umožňujících selekci hostitelské buňky obsahující expresní vektor. Markér může také udělovat fototrofii auxotrofnímu hostiteli, může způsobovat bioresistenci na biocidy, například na antibiotika nebo těžké kovy jako je mědi, a podobně. Vybraný markerový gen může být navázán přímo na exprimovanou DNA sekvenci, nebo může být vložen do stejné buňky současnou transfekci. Pro optimální syntézu proteinů podle předkládaného vynálezu mohou být také nutné další elementy.

Mezi významné faktory při výběru určitého plazmidů nebo virového vektoru patří: schopnost rozpoznání a selekce hostitelských buněk obsahujících vektor od hostitelských buněk neobsahujících vektor; počet kopií vektoru, které jsou nutné v určitém hostiteli; a to, zdaje požadováno, aby se jednalo o kyvadlový vektor pro hostitelské buňky různých druhů.

Po přípravě vektoru nebo DNA sekvence obsahující konstrukt pro expresi, může být DNA konstrukt vložen do vhodné hostitelské buňky jakoukoliv vhodnou technikou: transformací, transfekci, konjugací, protoplastovou fúsí, elektroporací, srážením fosforečnanem vápenatým, přímou mikroinjekcí, atd.

Hostitelské buňky mohou být prokaryotické nebo eukaryotické. Výhodné jsou eukaryotické buňky, například savčí buňky, jako jsou lidské, myší buňky a ovariální buňky čínského křečka (CHO), protože umožňují post-translační modifikace proteinových molekul, včetně správného skládání a nebo glykosylace ve správných pozicích. Také kvasinky mohou provádět post-translační modifikace peptidu včetně glykosylace. Existuje mnoho rekombinantních DNA strategií, které využívají sekvence silných promotorů a vysokého počtu kopií plazmidů, které mohou být použity pro produkci požadovaných proteinů ve kvasinkách. Kvasinka rozpoznává vedoucí sekvenci na klonovaném savčím genovém produktu a secemuje peptidy obsahující vedoucí sekvenci (tj. prepeptidy).

Po vložení vektoru jsou hostitelské buňky kultivovány v selektivním médiu, ve kterém selektivně rostou buňky obsahující vektor. Exprese sekvence klonovaného genu vede k produkci požadovaných proteinů.

Amino-koncově zkrácený MCP-2 podle předkládaného vynálezu může být připraven jakýmko45 liv jiným postupem známým v oboru, konkrétně dobře známými postupy chemické syntézy, využívajícími automatických syntezátorů na pevné fázi, po které následuje chromatografícké přečištění.

Chemokiny podle předkládaného vynálezu mohou být, například, syntetizovány Fmoc (9-fluor50 enylmethoxykarbonyl), tBoc (t-butoxykarbonyl) nebo jinou podobnou chemickou syntézou s nebo bez vhodných chránících skupin pro vedlejší řetězce na různých aminokyselinách. Aminokyseliny snebo bez vhodných chránících skupin pro vedlejší řetězce jsou preaktivovány například HBTU/HOBt (2-( 1 H-benzotriazol-1 —yl)— 1,1,3,3-tetramethyluromiumhexafluorfosfat/l-hydroxybenztriazolem) - a jsou navázány na rostoucí peptidový řetězec. Před adicí dalšího zbytku je z-amino skupiny odstraněna chránící skupina (například Fmoc). Po syntéze jsou

-3 CZ 299478 B6 všechny chránící skupiny odstraněny a intaktní kompletní peptidy jsou přečištěny a chemicky nebo enzymaticky skládány (včetně tvorby disulfidových můstků mezi cysteiny) na příslušné chemokiny podle předkládaného vynálezu.

Přečištění přirozených, syntetických nebo rekombinantních proteinů je provedeno jakoukoliv v oboru známou metodou, tj. konvenčními postupy obsahujícími extrakci, srážení, chromatografii, elektroforesu a podobně (viz například Proost P. et al., 1996). Dalším přečištěním, které může být použito pro přečištění proteinů podle předkládaného vynálezu, je afinitní chromatografie využívající monoklonálních protilátek nebo afinitity pro heparin, které se váží na cílový protein a ío které jsou připraveny a imobilizovány na gelové matrici obsažené v koloně. Surové přípravky obsahující proteiny jsou vneseny do kolony. Protein se naváže na kolonu prostřednictvím specifické protilátky, zatímco nečistoty procházejí kolonou. Po promytí se protein eluuje z gelu změnou pH nebo iontové síly.

Amino-terminálně zkrácený MCP-2 podle předkládaného vynálezu je užitečný pro terapii a/nebo diagnostiku onemocnění, při který je požadována antagonizace aktivity chemokinu. Příklady takových onemocnění jsou: zánětlivá onemocnění, onemocnění související s angiogenezí a hematopoesou, nádorová onemocnění, infekční onemocnění, včetně HIV, autoimunitní onemocnění, atherosklerosa, onemocnění plic a onemocnění kůže.

Proto předkládaný vynález v dalším aspektu obsahuje použití proteinu podle předkládaného vynálezu při výrobě léku pro léčbu výše uvedených onemocnění.

Lék je výhodně připraven ve formě farmaceutického prostředku obsahujícího protein podle před25 kládaného vynálezu spolu s jedním nebo více farmaceuticky přijatelnými nosiči a/nebo přísadami. Takové farmaceutické prostředky jsou ještě dalším aspektem předkládaného vynálezu.

Dalším aspektem předkládaného vynálezu je způsob léčby výše uvedených onemocnění obsahující podání farmakologicky aktivního množství amino-terminálně zkráceného MCP-2 podle předkládaného vynálezu jedinci, u kterého existuje riziko vzniku takového onemocnění nebo jedinci, u kterého již existuje takové onemocnění.

Předkládaný vynález bude nyní popsán v následujících příkladech, které nijak neomezují rozsah předkládaného vynálezu. V příkladech jsou uvedeny odkazy na obrázky uvedené dále.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1 ukazuje aminokyselinovou sekvenci MCP-2 a jeho známých variant. Signální sekvence jsou uvedeny kurzívou, zatímco C—zbytky jsou tučným písmem. Šipky ukazují první aminokyseliny amino-terminálně zkráceného MCP-2(6-76) podle předkládaného vynálezu.

Obr. 2. SDS-PAGE amino-terminálně zkráceného MCP-2(6-76):

dráha 1: přirozený MCP-2 (1-76), (100 ng/dráhu); dráha 2: přirozený MCP-2 (1-76), (30 ng/dráhu); dráha 3: přirozený MCP-2 (6-76), (30 ng/dráhu); a dráha 4: syntetický MCP-2 (1-76), (60 ng/dráhu).

Gely byly vyvíjeny za redukčních podmínek a proteiny byly barveny stříbrem.

Obr. 3 ukazuje srovnání chemotaktické účinnosti modifikovaných forem MCP-2. Intaktní přirozený (nat) a syntetický (syn) MCP-2(l-76), NH₂-terminálně zkrácený přirozený MCP-2(6-76) a COOH-terminálně zkrácený MCP-2(l-74) byly testovány na chemo-4CZ 299478 B6 taktickou aktivitu pro THP-1 buňky. Výsledky představují průměrný CI SEM pro čtyři nebo více nezávislé pokusy.

Obr. 4 Přirozený MCP-2 je slabší agonista než MCP-1 v mobilizaci vápníku v monocytech. 5 Intaktní MCP-2 (15, 50 a 150 ng/ml) zvyšuje v závislosti na dávce (Ca2⁺)i v THP1 buňkách. Jsou uvedeny výsledky jednoho reprezentativního pokusu ze dvou provedených.

ío Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Amino-terminálně zkrácený MCP-2

Materiál a metody

Chemokin a imunotest

MCP-2 byl syntetizován a přečištěn způsobem popsaným dříve (Proost P. et al., 1995).

Specifické Ab proti lidskému MCP-2 byly získány od myší a byly afinitně přečištěny na Sepharosové koloně, na kterou byl navázán syntetický MCP-2, podle návodu výrobce (CNBr activated Sepharose 4B, Pharmacia, Uppsala, Sweden).

ELISA plotny byly potaženy afinitně přečištěnou protilátkou proti lidskému MCP-2 a biotinylovaná anti-MCP-2 protilátka byla použita jako zachycovací protilátka. Detekce byla provedena peroxidasou značeným streptavidinem a TMB. Detekční limit pro MCP-2 ELISA byl přibližně 0,1 ng/ml.

Produkce a přečištění MCP-2

Monocytámí chemotaktické proteiny byly přečištěny z kondicionovaného média získaného z mononukleámích buněk periferní krve ze 132 krevních odběrů získaných od Blood Transfusion Centers of Antwerp and Leuven (Proost, P. et al., 1996).

Erytrocyty a granulocyty byly odstraněny sedimentací v hydroxyethylovém škrobu (Fresenius AG, Bad Homburg, Germany) a gradientní centrifugací v roztoku metrizoatu sodného (Lymphoprep; Nyegaard, Oslo, Norway).

Mononukleámí buňky (60 χ 10⁹ buněk) byly inkubovány (5 χ 10⁶ buněk/ml) s 10 g/ml ConA a 2 g/ml LPS. Po 48 až 120 hodinách bylo kondicionované médium odebráno a bylo do přečištění uchováváno při -20 °C.

Přirozený MCP-2 byl přečištěn čtyřstupňovým přečištovacím postupem, jak byl popsán dříve (Proost, P. et al., 1996).

Stručně, kondicionované médium bylo koncentrováno na skle s kontrolovanou velikostí pórů nebo na kyselině křemičité a bylo částečně přečištěno afinitní chromatografií na heparin-Sepharosové koloně (Pharmacia).

Frakce obsahující MCP-2 imunoreaktivitu byly dále přečištěny za použití Mono S (Pharmacia) kationtové iontoměničové chromatografie a byly eluovány v NaCl gradientu při pH 4,0.

-5CZ 299478 B6

Přirozený MCP-2 byl přečištěn do homogenity pomocí RP-HPLC na C-8 Aquapore RP300 koloně (Perkin Elmer, Norwalk, CT) uvedené do rovnováhy 0,1% kyselinou trifluoroctovou (TF)). Proteiny byly eluovány v acetonitrilovém gradientu.

Biochemická charakterizace MCP forem pomocí SDS-PAGE, analýzy aminokyselinové sekvence a hmotnostní spektrometrie.

Čistota frakcí získaných z kolony byla testována SDS-PAGE za redukčních podmínek na Tris/glycinových gelech (Proost, P. et al., 1996). Proteiny byly barveny stříbrem a byly použity ío následující markéry (Mr) relativní molekulové hmotnosti: OVA (Mr 45000), karboanhydráza (Mr 31000), sojový trypsinový inhibitor (Mr 21500), -laktoglobulin (Mr 18400), lysozym (Mr 14400) a aprotinin (Mr 6500).

NfE-terminální sekvence přečištěných chemokinů byla stanovena Edmanovou degradací na 15 pulzním kapalinovém 477A/120A proteinovém sekvenátoru (Perkin Elmer) s N-methylpiperidinem jako kopulaění baží. Blokované proteiny byly štěpeny mezi Asp a Pro v 75% kyselině mravenčí po dobu 50 hodin. Materiál trávený kyselinou mravenčí byl sekvenován bez dalšího přečištění.

Mr MCP-2 byla stanovena ionizací laserem za přítomnosti matrice v kombinaci s detektorem doby letu (MALDI/TOF-MS) (Micromass TofSpec,Manchester, UK). Kyselina -kyan-4-hydroxyskořicová a cytochrom C byly použity jako matrice a vnitřní standard, v příslušném pořadí.

Detekce chemotaktické aktivity

MCP-2 byl testován na svou chemotaktickou účinnost na čerstvě přečištěných monocytech (2 x 10⁶ buněk/ml) nebo monocytámích THP-1 buňkách (0,5 x 10⁶ buněk/ml; 2 dny po subkultivaci) v Boydenově mikrokomůrce za použití polyvinylpyrrolidonem zpracovaných polykarbonatových membrán s velikostí pórů 5 m.

Vzorky a buňky byly ředěny v HBSS (Life Technologies/Gibco BRL, Paisley, Scotland) doplněném 1 mg/ml lidským sérovým albuminem (Red Cross Belgium). Po 2 hodinové inkubaci při 37 °C byly buňky fixovány a barveny Diff-Quick barvícími roztoky (Harleco, Gibbstown, NJ) a buňky, které migrovaly skrz membrány byly počítány mikroskopicky v 10 olejových imersních polích při 500-násobném zvětšení.

Chemotaktický index (C.L) vzorku (trojí provedení pro každou komůrku) byl vypočítán jako počet buněk migrujících do testovaného vzorku dělený počtem buněk migrujících do kontrolního média.

V pokusech desensitizace byly buňky inkubovány s biologicky inaktivními variantami chemokinů po dobu 10 minut při 37 °C před tím, než byly vloženy do komůrky. Procento inhibice C.L bylo vypočítáno za použití C.l. pro HBSS-zpracované kontrolní buňky vzhledem k vzorku jako referenční hodnotě.

Detekce intracelulámích koncentrací Ca²⁺

Intracelulámí koncentrace Ca²⁺ ((Ca²⁺)j) byla měřena způsobem popsaným dříve (Wuyts A: et al., 1997). přečištěné THP-1 buňky (10⁷ buněk/ml) byly inkubovány v Eaglově minimálním esen50 ciálním médiu (EMEM, Gibco) + 0,5% FCS s fluorescentním indikátorem fura-2 (2,5 M fura2/AM, Molecular Probes Europe BV, Leiden, the Netherlands) a 0,01% Pluronic F-127 (sigma, St. Louis, MO).

Po 30 minutách při 37 °C byly buňky dvakrát promyty, byly resuspendovány v koncentraci

10⁶ buněk/ml v HBSS s 1 mM Ca²⁺ a 0,1% FCS (pufrovaným slOmM Hepes/NaOOH při

-6CZ 299478 B6 pH 7,4). - Před tím, než byla změřena fura-2 fluorescence LS50B luminiscentního spektrofotometru (Perkin Elmer) byly buňky uvedeny do rovnováhy při 37 °C po dobu 10 minut.

Po excitaci při 340 a 380 nm byla fluorescence detekována při 510 nm. (Ca²⁺)i byl stanoven z grynkiewiczovi rovnice (Grynkiewicz G. et al., 1985). Pro stanovení R_max byly buňky lyžovány za použití 50 M digitoninu. Potom bylo za použití 20 mM Tris upraveno pH na 8,5 a hodnota Rmin byla získána po adici 10 mM EGTA k lyžovaným buňkám. Použitá hodnota k byla 224 nM.

Pro desenzitizační pokusy byly monocyty nebo THP-1 buňky nejprve stimulovány pufrem, ío chemokinem nebo antagonistou chemokinu v různých koncentracích. Jako druhý stimul byl použit MCP-2 v koncentraci indukující významné zvýšení (Ca²⁺), po prestimulaci pufrem. Druhý stimul byl přidán 2 minuty po adici prvního stimulu. Procento inhibice zvýšení (Ca²⁺)i v reakci na druhý stimul bylo vypočítáno srovnáním signálu po prestimulaci chemokinem nebo antagonistou chemokinu se signálem po přidání pufru.

Výsledky

Izolace post-translačně zpracovaných forem MCP-2

Specifická a sensitivní ELISA byla použita pro získání různých forem MCP-2 produkovaných mitogenem a endotoxinem.

Kondicionované medium bylo přečištěno standardními technikami izolace (Proost, P. et al., 1996), včetně adsorpce na sklo s danou velikostí pórů a chromatografie na heparin-Sepharose.

Potom bylo provedeno přečištění FPLC mono s kationtovou iontoměničovou chromatografií a potom přečištění za použití C-8 RP HPLC. Molekulové hmotnosti byly měřeny SDS-PAGE a MALDI/TOF-MS.

Byly izolovány různé formy MCP-2: kromě autentického 7,5 kDa MCP-2(l-76) byl do homogenity přečištěn za použití RP-HPLC NH₂-terminálně zkrácený 7 kDa MCP-2, který postrádá 5 zbytků (MCP-2(6-76) a byla provedena analýza jeho aminokyselinové sekvence (obr. 2). Za použití MALDI/TOF-MS (tabulka 1) byla stanovena molekulová hmotnost 8881 Da pro intaktní MCP-2 (teoretická Mr 8893 Da), zatímco pro MCP-2(6-76) byla stanovena molekulová hmot35 nost 8365 Da, což potvrzuje deleci pěti NH₂-terminálních aminokyselin (teoretická Mr 8384 Da). Funkční srovnání těchto přirozených forem MCP-2 v testu chemotaxe THP-1 buněk ukázalo, že MCP-2 je aktivní ještě při 5 ng/ml, zatímco zkrácený MCP-2(6-76) nemá chemotaktickou aktivitu při testování v koncentracích od 0,6 do 60 ng/ml (obr. 3). Byla také srovnávána účinnost intaktního přirozeného MCP-2 s účinností syntetického MCP-2( 1-76) a COOOH-terminálně zkrácenou syntetickou formou (Proost P. et al., 1995) bez dvou zbytků (MCP-2(l-74)).

Bylo zjištěno, že minimální účinné chemotaktické koncentrace těchto forem jsou také 5 ng/ml (obr. 3). Ačkoliv je v testech chemotaxe specifická aktivita přirozeného intaktního MCP-1 a MCP-2 srovnatelná (Van Damme J. et al., 1992), je mobilizační kapacita MCP-2 stále ještě předmětem debaty.

Nicméně, v pokusech mobilizace Ca₂₊ byly minimální účinné koncentrace jak pro přirozený, tak pro syntetický MCP-2( 1-76) 10-krát vyšší než minimální účinné koncentrace pro přirozený intaktní MCP-l(l-76) (obr. 4), zatímco MCP-2(6-76) byl inaktivní.

Nicméně, intaktní MCP-2 (50 ng/ml) byl schopen způsobit desensitizaci pro MCP-2 (15 ng/ml) a MCP-3 (10 ng/ml) za zisku 52% a 45% inhibice chemotaxe, v příslušném pořadí.

Z důvodů nízké specifické aktivity MCP-2 v testech mobilizace Ca²⁺ byla inhibice chemota55 xe MCP-2(6-76) provedena v Boydenově mikrokomůrce. Protože je popsáno, že MCP-2 zkříže-7CZ 299478 B6 ně inhibuje aktivní MCP-1, MCP-2 a MCP-3 v testu chemotaxe monocytů (Sozzani S. et al., 1994), provedli jsme testování toho, zda přirozený inaktivní MCP-2(6-76) může také inhibovat chemotaxi zprostředkovanou MCP-1, MCP-2, MCP-3 a RANTES (Tabulka 2). Pre-inkubace THP-1 se 100 ng/ml inaktivního MCP-2(6-76) může významně inhibovat chemotaxi induko5 vanou 10 ng/ml MCP-1 (63%), 5 ng/ml MCP-2 (75%), 30 ng/ml MCP-3 (62%) a

100 ng/ml RANTES (75%). Kromě toho, chemotaxe způsobená 3-násobně nižšími koncentracemi příslušných MCP byla zcela (91 až 100%) inhibována 100 ng/ml MCP-2(6-76). Dále, i koncentrace 10 ng/ml MCP-2(6-76) byla schopna významně inhibovat chemotaktickou aktivitu indukovanou MCP-1 (3 ng/ml), MCP-2( 1,5 ng/ml) nebo MCP-3 (10 ng/ml) a RANTES ío (30 ng/ml). Závěrem, MCP-2(6-76) je produkován za přirozených podmínek, je inaktivní jako chemoatraktant a antagonizuje několik C-C chemokinů, zejména MCP-3.

Tabulka 1: Biochemická charakterizace přirozených forem MCP-2. Analýza NH₂-terminální aminokyselinové sekvence a srovnání zjištěných (SDS-PAGE a MALDI/TOF-MS) a teoretických Mr přirozených MCP-izoforem přečištěných C-8 RP-HPLC

MCP-forma	NH -terminální sekvence	Mr (Da)
	teoretická neglykosylovaná	SDS-PAGE	MALDI/TOF- MS
MCP-2(1-76)	blokovaná	8893	7500	8881
MCP-2(6-76)	SIPITCC	8384	7000	8365

-8CZ 299478 B6

Tabulka 2: MCP-2(6-76) inhibuje chemotaktickou odpověď monocytů na MCP-1, MCP-2, MCP-3 a RANTES v mikrokomůrce

Chemokin	koncentrace A	ntagonizace chemotaktické reakce¹³-^c	% Inhibice chemotaxe
		Pufr	100 ng/ml MCP-2(6-76)
MCP-1	10	22.3 ±7.9	8.3 ±3.8	63 ±21
	3	15.0 ±8.0	1.3 ±0.3	99 ±1.0
MCP-2	5	36.0 ±12.6	10.8 ±6.1	75 ± 8.0
	1.5	6.7 ±1.4	1.5 ± 0.3	91 ±7.0
MCP-3	30	13.2 ±0.4	6.0 ±4.0	62 ±31
	10	3.0 ±1.5	<1	100 ± 0.0
RANTES	100	6.3 ±0.8	2.6 ±1.3	75 ± 19
	30	4.0 ±0.8	1.5 ± 0.3	77 ± 16
		pufr	10 ng/ml MCP-2 (6-76)
MCP-I	10	12.7 ±2.3	10.5 ±3.8	24 ±1.8
	3	7.5 ±0.0	3.0 ±0.3	69 ±4.0
MCP-2	5	38.0 ±5.3	27.2 ±4.9	30 ±6.0
	1.5	18.3 ±4.6	9.2 ±1.4	45 ±23
MCP-3	30	13.2 ±1.9	8.0 ±1.0	37 ±19
	10	7.7 ±1.4	1.7 ±0.3	90 ±6.0
RANTES	100	5.5 ±0.6	5.8 ±0.9	17 ±7.0
	30	3.2 ±0.7	2.5 ±0.5	39 ±18

^a) MCP-1, MCP-2, MCP-3 nebo RANTES byly přidány jako chemoatraktanty do spodních jamek mikrokomůrky.

^b) horní jamky mikrokomůrky byly naplněny THP-1 buňkami preinkubovanými s MCP-2(676) nebo s pufrem.

^c) průměrný Cl SEM pro 3 nezávislé pokusy.

Odkazy:

Baggiolini M. et al., Ann. Rev. Immunol., 55, 97-179, 1994.

Baggiolini M. etal.,yf««. Rev. Immunol., 15, 675-705, 1997.

Chang H. C. et al., InternationalImmunology, 1(4), 388-397, 1989.

Clark-Lewis L et al., J. BioL Chem., 266, 23128-23134, 1991.

De Meester I. et al., J. Immunol. Methods 189, 99-10526, 1996.

Deng H. et al., Nátuře., 381, 661-666, 1996.

-9CZ 299478 B6

Gong J. et al. J. Exp. Med, 181,631-640, 1995.

Gong J. et al, J. Biol. Chem. 271, 10 521-10 527, 1996.

Grynkiewicz G. et al., J. Biol. Chem., 260, 3 440, 1985.

Proost P.et al., Biochemistry, 32, 1 0170-1 0177, 1993a.

Proost P. et al., J. Immunol., 150, 1 000-1 010, 1993.

Proost P. et al., Cytokine, 7,97-104, 1995.

Proost P. et al, Methods: A companion to Methods in Enzymol., 10, 82, 1996. Proudfoot A.E. et al., J. Biol. Chem., 271, 2 599-2 603, 1996.

Sambrook et al, Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor ío Laboratory, Cold Spring Rarbor, NY, 1989.

Schols D. et al., J. Exp. Med., 186, 1 383-1 388, 1997.

Sozzani S. et al., J. Immunol., 152, 3 615, 1994.

Taub D. et al., Cytokine & Growth Factor Reviews, 7, 335-76, 1996.

Van Coillie E. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 231, 726-730, 1997.

Van Damme J. et al., Eur. J. Biochem., 181, 337-344, 1989.

Van Damme J. et al., Eur. J. Immunol., 20, 2 113-8, 1990.

Van Damme J. et al., J. Exp. Med., 176, 59, 1992.

Walz A et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 159, 969-75, 1989.

Wuyts A, et al., Biochemistry 36, 2 716-2 723,1997.

Seznam sekvencí (1) Obecné informace:

(i) přihlašovatel:

(A) Jméno: Applied Research Systems ARS Holding N.V.

(B) Ulice: 14 Joohn B. Gorsiraweg (C) Město: Curacao (E) Stát: Nizozemské Antily (F) Poštovní kod (ZIP): Ne (G) Telefon: 599-9-639300 (H) Telefax: 599-9-614129 (ii) Název vynálezu: Amino-terminálně zkrácený MCP-2 jako antagonista chemokinů (iii) Počet sekvencí: 4 (iv) počítačová čtecí forma:

(A) Typ média: Floppy disk (B) počítač: IBM PC kompatibilní (C) operační systém: PC-DOS/MS-DOS (D) Software: Patent In Release #1.00, verze # 1.30 (EPO) (2) Informace pro SEQ ID NO: 1:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 99 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec:

(D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (iii) Hypotetická: Ne

-10CZ 299478 B6 (ix) Vlastnosti:

(A) Jméno/klíč: protein (B) Umístění: 1..76 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 1

Met

Lya

Val

Ser -20

Ala

Leu

Cys -15

Leu

Met

Ala -10

Ala

Thr

Phe

Ser

Pro -5

Gin

Gly

Leu

Ala

Gin 1

Pro

Aap

Ser

Val 5

Ser

Ile

Pro

Ile

Thr 10

Cya

Cys

Phe

Aan

Val 15

Ile

Aan

Arg

Lys

Ile 20

Pro

Ile

Gin

Arg

Leu 25

Glu

Ser

Tyr

Thr

Arg

Ile

Thr

Aan

Ile

Gin

Cys

Pro

Lys

Glu

Ala

Val

35 40

Ile Phe tys Thr Lya Arg Gly Lya Slu Val Cya Ala Aap Pro Lys Glu 45 50 55

Arg Trp Val Arg Aap Ser Met Lya His Leu Aap Gin Ile Phe Gin Asn 60 65 70

Leu Lya Pro 75 (2) Informace pro SEQ ID NO: 2:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 99 aminokyselin 15 (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec:

(D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (iii) Hypotetická: Ne (ix) Vlastnosti:

(A) Jméno/klíč: protein (B) Umístění: 1..76 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 2

-11 CZ 299478 B6

Met

Lys

Val

Ser -20

Ala

Leu Leu

Cys -15

Leu

Met

Ala -10

Ala

Thr

Phe

Ser

Pro -5

Gin

Gly

Leu

Ala Gin 1

Pro

Asp

Ser

Val 5

Ser

Ile

Pro

Ile

Thr 10

Cys

Phe

Asn

Val 15

Ile Asn

Arg

Lys

Ile 20

Pro

Ile

Gin

Arg

Leu 25

Glu

Ser

Tyr

Thr

Arg 30

Ile

Thr Asn

Ile

Gin 35

Cys

Pro

Lys

Glu

Ala 40

Val

Ile

Phe

Lys

Thr 45

Gin

Arg

Gly Lys

Glu 50

Val

Cys

Ala

Asp

Pro 55

Lys

Glu

Arg Leu

Trp Lys

Val 60 Pro

Arg Asp

Ser

Met Lys 65

His

Leu

Asp

Gin

Ile 70

Phe

Gin

Asn

(2) Informace pro SEQ ID NO: 3:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 71 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec:

(D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein iii) Hypotetická: Ne (xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 3:

Ser Ile Pro Ile Thr Cys Cys Phe Asn Val Ile Asn Arg Lys Ile Pro
1	5	10	15
Ile Gin Arg	Leu Glu Ser	Tyr Thr Arg Ile Thr	Asn Ile Gin Cys Pro
	20	25	30
Lys Glu Ala	Val Ile Phe	Lys Thr Lys Arg Gly	Lys Glu Val Cys Ala
35		40	45
Asp Pro Lys	Glu Arg Trp	Val Arg Asp Ser Met	Lys His Leu Asp Gin
50		55	60
Ile Phe Gin	Asn Leu Lys	Pro
65	70

(2) Informace pro SEQ ID NO: 4 (i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 71 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec:

(D) Topologie: lineární

- 12CZ 299478 B6 (ii) Typ molekuly: protein (iii) Hypotetická: Ne (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 4

Ser 1

Ile

Pro

Ile

Thr 5

Cys

Phe

Asn

Val 10

Ile Asn

Arg

Lys

Ile 15

Pro

Ile

Gin

Arg

Leu 20

Glu

Ser

Tyr

Thr

Arg 25

Ile

Thr Asn

Ile

Gin 30

Cys

Pro

Lya

Glu

Ala 35

Val

Ile

Phe

Lys

Thr 40

Gin

Arg Gly Lys

Glu 45

Val

Cys

Ala

Aap

Pro 50

Lya

Glu

Arg

Trp

Val 55

Arg Asp

Ser

Met Lys 60

His

Leu

Asp

Gin

Ile

Phe

Gin

Asn

Leu

Lys

Pro

70

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims

1. Amino-terminálně zkrácený MCP-2, chemotaktický protein-2 monocytů, kterému chybí NHj-terminální aminokyseliny odpovídající aminokyselinovým zbytkům 1-5 přirozeného MCP2, který má antagonistickou aktivitu k chemokinu.

2. Amino-terminálně zkrácený MCP-2 podle nároku 1, který má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 3 nebo SEQ ID NO: 4.

3. Amino-terminálně zkrácený MCP-2 podle nároku 1 nebo 2, v glykosylované formě.

4. DNA molekula obsahující DNA sekvenci kódující amino-terminálně zkrácený MCP-2 podle jakéhokoliv z předešlých nároků, včetně nukleotidových sekvencí, které v důsledku degenerace genetického kódu rovněž kódují uvedený protein.

30

5, Expresní vektor obsahující DNA molekulu podle nároku 4.

6. Hostitelská buňka obsahující expresní vektor podle nároku 5.

7. Rekombinantní způsob přípravy jakéhokoliv proteinu podle nároků 1 až 3, vyznaču35 jící se t í m , že se kultivují buňky podle nároku 6 ve vhodném kultivačním médiu.

8. Protein podle jakéhokoliv z nároků 1 až 3 pro použití jako lék.

9. Použití proteinu podle jakéhokoliv z nároků 1 až 3 pro výrobu prostředku pro terapii a/nebo 40 diagnostiku onemocnění, při kterých je žádoucí antagonizování účinků chemokinu.

- 13 CZ 299478 B6

10. Použití podle nároku 9 pro výrobu prostředku pro léčbu zánětlivých onemocnění, HIV infekce, onemocnění souvisejících s angiogenezí a hematopoesou a nádorových onemocnění.

11. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje protein podle 5 jakéhokoliv z nároků 1 až 3 spolu s jedním nebo více farmaceuticky přijatelnými nosiči a/nebo přísadami.

4 výkresy

-14CZ 299478 B6

MCP-2

-23 1 4

MKVSAALLCL LLMAATFSPQ GLAQPDSVSI PITCCFNVIN RKIPIQRLES YTRITNIQCP KEAVIFKTKR GKEVCADPKE RWVRDSMKHL DQIFQNLKP

Varianta MCP-2

-23 l 4

MKVSAALLCL LLMňATFSPQ GLAQPDSVSI PITCCFNVIN RKXPIQRLES YTRITNIQCP KEAVIFQTKR GKEVCADPKE RWVRDSMKHL DQIFQNLKP

OBR. I

- 15CZ 299478 B6 kOa «» 31

6.5

12 3 4

MCP-2

OBR.2

- 16CZ 299478 B6

Chemotaxe THP-l buněk (CI)

Koncentrace MCP-2 (ng/ml)

0.15

OBR. 3