UA73080C2 - Amino-terminally truncated rantes as chemokine antagonists - Google Patents
Amino-terminally truncated rantes as chemokine antagonists Download PDFInfo
- Publication number
- UA73080C2 UA73080C2 UA2000042496A UA2000042496A UA73080C2 UA 73080 C2 UA73080 C2 UA 73080C2 UA 2000042496 A UA2000042496 A UA 2000042496A UA 2000042496 A UA2000042496 A UA 2000042496A UA 73080 C2 UA73080 C2 UA 73080C2
- Authority
- UA
- Ukraine
- Prior art keywords
- amino
- kamte5
- cells
- kamtez
- truncated
- Prior art date
Links
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 title claims abstract description 48
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 title claims abstract description 48
- 102000001327 Chemokine CCL5 Human genes 0.000 title abstract 3
- 108010055166 Chemokine CCL5 Proteins 0.000 title abstract 3
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 title description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 17
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims abstract description 14
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 12
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 12
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 claims abstract description 10
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims abstract description 6
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 5
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 4
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 claims abstract 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 36
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 28
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 17
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 11
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 8
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 claims description 5
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 claims description 5
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 4
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 3
- 208000037357 HIV infectious disease Diseases 0.000 claims description 3
- 208000033519 human immunodeficiency virus infectious disease Diseases 0.000 claims description 3
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 claims description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 claims description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 2
- 239000000945 filler Substances 0.000 claims description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 2
- 230000011132 hemopoiesis Effects 0.000 claims description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 2
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 claims 1
- 238000012876 topography Methods 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 66
- 230000003399 chemotactic effect Effects 0.000 description 30
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 29
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 26
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 24
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 17
- 238000000034 method Methods 0.000 description 16
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 13
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 12
- 230000035605 chemotaxis Effects 0.000 description 12
- 230000004044 response Effects 0.000 description 11
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 10
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 10
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 10
- 102000001902 CC Chemokines Human genes 0.000 description 8
- 108010040471 CC Chemokines Proteins 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- 238000000586 desensitisation Methods 0.000 description 8
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 7
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 7
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 6
- 230000009471 action Effects 0.000 description 6
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 6
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 210000003979 eosinophil Anatomy 0.000 description 5
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 5
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 5
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 5
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 5
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 5
- 102100032366 C-C motif chemokine 7 Human genes 0.000 description 4
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010055124 Chemokine CCL7 Proteins 0.000 description 4
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 4
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 4
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 4
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 4
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 4
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 4
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 4
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 4
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 4
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 4
- -1 3-fluorenylmethoxycaronyl Chemical group 0.000 description 3
- 108050006947 CXC Chemokine Proteins 0.000 description 3
- 102000019388 CXC chemokine Human genes 0.000 description 3
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 3
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 3
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 108091074848 miR-19 stem-loop Proteins 0.000 description 3
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 3
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 3
- NLKNQRATVPKPDG-UHFFFAOYSA-M potassium iodide Substances [K+].[I-] NLKNQRATVPKPDG-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 235000007715 potassium iodide Nutrition 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 3
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- 108091008927 CC chemokine receptors Proteins 0.000 description 2
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 2
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 2
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 description 2
- 101000984189 Homo sapiens Leukocyte immunoglobulin-like receptor subfamily B member 2 Proteins 0.000 description 2
- 102100025583 Leukocyte immunoglobulin-like receptor subfamily B member 2 Human genes 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- 150000001945 cysteines Chemical class 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- YFHXZQPUBCBNIP-UHFFFAOYSA-N fura-2 Chemical compound CC1=CC=C(N(CC(O)=O)CC(O)=O)C(OCCOC=2C(=CC=3OC(=CC=3C=2)C=2OC(=CN=2)C(O)=O)N(CC(O)=O)CC(O)=O)=C1 YFHXZQPUBCBNIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 2
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- XKTZWUACRZHVAN-VADRZIEHSA-N interleukin-8 Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@@H](NC(C)=O)CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N1[C@H](CCC1)C(=O)N1[C@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@H](CO)C(=O)N1[C@H](CCC1)C(N)=O)C1=CC=CC=C1 XKTZWUACRZHVAN-VADRZIEHSA-N 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000028550 monocyte chemotaxis Effects 0.000 description 2
- 201000008968 osteosarcoma Diseases 0.000 description 2
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 description 2
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 2
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 2
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 2
- 230000027425 release of sequestered calcium ion into cytosol Effects 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 230000008054 signal transmission Effects 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 2
- ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 1-Hydroxybenzotriazole Chemical compound C1=CC=C2N(O)N=NC2=C1 ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4,6-dichloropyrimidine-5-carbaldehyde Chemical group NC1=NC(Cl)=C(C=O)C(Cl)=N1 GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRGUSFBJBOKSML-UHFFFAOYSA-N 3',5'-di-O-methyltricetin Chemical compound COC1=C(O)C(OC)=CC(C=2OC3=CC(O)=CC(O)=C3C(=O)C=2)=C1 HRGUSFBJBOKSML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JEGMWWXJUXDNJN-UHFFFAOYSA-N 3-methylpiperidine Chemical compound CC1CCCNC1 JEGMWWXJUXDNJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710169336 5'-deoxyadenosine deaminase Proteins 0.000 description 1
- ODHCTXKNWHHXJC-VKHMYHEASA-N 5-oxo-L-proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCC(=O)N1 ODHCTXKNWHHXJC-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 1
- 102000055025 Adenosine deaminases Human genes 0.000 description 1
- HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N Ala-Gln Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 102000004400 Aminopeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108090000915 Aminopeptidases Proteins 0.000 description 1
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000701822 Bovine papillomavirus Species 0.000 description 1
- 102100021943 C-C motif chemokine 2 Human genes 0.000 description 1
- 101710155857 C-C motif chemokine 2 Proteins 0.000 description 1
- 102100034871 C-C motif chemokine 8 Human genes 0.000 description 1
- 101710155833 C-C motif chemokine 8 Proteins 0.000 description 1
- 102100036153 C-X-C motif chemokine 6 Human genes 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 108010014423 Chemokine CXCL6 Proteins 0.000 description 1
- 108050000299 Chemokine receptor Proteins 0.000 description 1
- 102000009410 Chemokine receptor Human genes 0.000 description 1
- 101710091342 Chemotactic peptide Proteins 0.000 description 1
- 229920002101 Chitin Polymers 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- QRLVDLBMBULFAL-UHFFFAOYSA-N Digitonin Natural products CC1CCC2(OC1)OC3C(O)C4C5CCC6CC(OC7OC(CO)C(OC8OC(CO)C(O)C(OC9OCC(O)C(O)C9OC%10OC(CO)C(O)C(OC%11OC(CO)C(O)C(O)C%11O)C%10O)C8O)C(O)C7O)C(O)CC6(C)C5CCC4(C)C3C2C QRLVDLBMBULFAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101000794228 Homo sapiens Mitotic checkpoint serine/threonine-protein kinase BUB1 beta Proteins 0.000 description 1
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 1
- 102000004890 Interleukin-8 Human genes 0.000 description 1
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 208000019693 Lung disease Diseases 0.000 description 1
- 102000009571 Macrophage Inflammatory Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010009474 Macrophage Inflammatory Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100030144 Mitotic checkpoint serine/threonine-protein kinase BUB1 beta Human genes 0.000 description 1
- 102000014962 Monocyte Chemoattractant Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010064136 Monocyte Chemoattractant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 206010028813 Nausea Diseases 0.000 description 1
- 101100123117 Nicotiana plumbaginifolia MSR-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- IDDMFNIRSJVBHE-UHFFFAOYSA-N Piscigenin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C=2C(C3=C(O)C=C(O)C=C3OC=2)=O)=C1 IDDMFNIRSJVBHE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 108010015078 Pregnancy-Associated alpha 2-Macroglobulins Proteins 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- ODHCTXKNWHHXJC-GSVOUGTGSA-N Pyroglutamic acid Natural products OC(=O)[C@H]1CCC(=O)N1 ODHCTXKNWHHXJC-GSVOUGTGSA-N 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 101100061516 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) csk1 gene Proteins 0.000 description 1
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 206010047700 Vomiting Diseases 0.000 description 1
- ODHCTXKNWHHXJC-UHFFFAOYSA-N acide pyroglutamique Natural products OC(=O)C1CCC(=O)N1 ODHCTXKNWHHXJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 210000003651 basophil Anatomy 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 239000003139 biocide Substances 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 1
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 235000019994 cava Nutrition 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000002975 chemoattractant Substances 0.000 description 1
- 239000002559 chemokine receptor antagonist Substances 0.000 description 1
- PRQROPMIIGLWRP-BZSNNMDCSA-N chemotactic peptide Chemical compound CSCC[C@H](NC=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 PRQROPMIIGLWRP-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 1
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 238000004042 decolorization Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 229910003460 diamond Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010432 diamond Substances 0.000 description 1
- UVYVLBIGDKGWPX-KUAJCENISA-N digitonin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H]([C@]2(CC[C@@H]3[C@@]4(C)C[C@@H](O)[C@H](O[C@H]5[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O[C@H]6[C@@H]([C@@H](O[C@H]7[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)CO7)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O6)O[C@H]6[C@@H]([C@@H](O[C@H]7[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O7)O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O6)O)[C@@H](CO)O5)O)C[C@@H]4CC[C@H]3[C@@H]2[C@@H]1O)C)[C@@H]1C)[C@]11CC[C@@H](C)CO1 UVYVLBIGDKGWPX-KUAJCENISA-N 0.000 description 1
- UVYVLBIGDKGWPX-UHFFFAOYSA-N digitonine Natural products CC1C(C2(CCC3C4(C)CC(O)C(OC5C(C(O)C(OC6C(C(OC7C(C(O)C(O)CO7)O)C(O)C(CO)O6)OC6C(C(OC7C(C(O)C(O)C(CO)O7)O)C(O)C(CO)O6)O)C(CO)O5)O)CC4CCC3C2C2O)C)C2OC11CCC(C)CO1 UVYVLBIGDKGWPX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N dihydrochrysin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2OC3=CC(O)=CC(O)=C3C(=O)C2)=C1 KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000531 effect on virus Effects 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000000222 eosinocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000004174 erythrosine Substances 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 239000003269 fluorescent indicator Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 1
- 235000012907 honey Nutrition 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 208000026278 immune system disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 229940096397 interleukin-8 Drugs 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- AEUKDPKXTPNBNY-XEYRWQBLSA-N mcp 2 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(C)C)C1=CC=CC=C1 AEUKDPKXTPNBNY-XEYRWQBLSA-N 0.000 description 1
- 235000019988 mead Nutrition 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 108091028606 miR-1 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 108091084079 miR-12 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 108091057645 miR-15 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 108091054642 miR-194 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 108091050864 miR-1a stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000001483 mobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000008693 nausea Effects 0.000 description 1
- 230000011242 neutrophil chemotaxis Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001983 poloxamer Polymers 0.000 description 1
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000734 protein sequencing Methods 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 1
- 239000002464 receptor antagonist Substances 0.000 description 1
- 229940044551 receptor antagonist Drugs 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000003578 releasing effect Effects 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 238000003567 signal transduction assay Methods 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 208000017520 skin disease Diseases 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- BMCJATLPEJCACU-UHFFFAOYSA-N tricin Natural products COc1cc(OC)c(O)c(c1)C2=CC(=O)c3c(O)cc(O)cc3O2 BMCJATLPEJCACU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 230000008673 vomiting Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
- A61K38/46—Hydrolases (3)
- A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- A61K38/4813—Exopeptidases (3.4.11. to 3.4.19)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/521—Chemokines
- C07K14/523—Beta-chemokines, e.g. RANTES, I-309/TCA-3, MIP-1alpha, MIP-1beta/ACT-2/LD78/SCIF, MCP-1/MCAF, MCP-2, MCP-3, LDCF-1, LDCF-2
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Virology (AREA)
- AIDS & HIV (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
Опис винаходу
Цей винахід стосується вкорочених на аміно-кінці КАМТЕЗ5, у яких відсутні МН »-кінцеві амінокислоти, що відповідають амінокислотним залишкам 1, 1-2, 1-3 або 1-4 природного КАМТЕ5, і які мають антагоністичну активність проти хемокінів; а також кДНК-послідовностей, що кодують такі КАМТЕ5, їх застосування для лікування і/або діагностики захворювань, при яких потрібна антагоністична активність проти дії хемокінів, і фармацевтичних композицій, що містять зазначені КАМТЕ5.
Передумови створення винаходу 70 Хемокіни - це родина малих про-запальних цитокінів, що мають властивості, які стимулюють хемотаксис і активацію лейкоцитів. В залежності від положення перших цистеїнів, ця родина хемокінів може бути розділена на
Сб-с6-, б-Х-С- і С-Х3-С-хемокіни ІВаддіоїїпі М. еї а!., 1994; Ваддіоїїпі М. еї аї., 1997 і Таць 0. еї аї., 1996).
Багато С-Х-С-хемокінів, таких, як інтерлейкін-8 (1-8), є чинниками, що викликають хемотаксис нейтрофілів, тоді, як С-С-хемокіни, такі, як моноцитарний хемотаксичний білок-3 (МСР-3), є активними стосовно 12 ряду лейкоцитів, включно з моноцитами, лімфоцитами, еозинофілами, базофілами, МК-клітинами і дендритними клітинами.
ИН»-кінцевий домен хемокінів, що бере участь у зв'язуванні з рецептором і МН о-кінцевому процесинзі, може або активувати хемокіни, знижувати активність хемокінів або робити хемокіни повністю неактивними.
Основний білок тромбоцитарного С-Х-С-хемокіну стає хемотаксичним пептидом для нейтрофілів (МАР-2) тільки після видалення 24 МН»о-кінцевих залишків (М/аїг А. еї а!., 1989 і Мап Сатте .. еї а!., 1990).
Делеція аж до 8 МН о-кінцевих залишків в ІЇ-8 приводить до збільшення хемотаксичної активності, але додаткове відщеплення мотиву (С1ІШ-Іец-Аг9, що розташований перед першим Суз у всіх нейтрофільних хемотаксичних С-Х-С-хемокінах, приводить до їх повної інактивації (Сіагк-І еміз І., еї аі., 19911.
Аналогічний МН»о-кінцевий протеоліз (аж до 8 амінокислот) іншого С-Х-С-хемокіну, гранулоцитарного с хемотаксичного протеїну-2 (ЗСР-2), не справляє впливу на хемотаксичну активність нейтрофілів |Ргосові Р. еї. (У аІ., 1993а).
КАМТЕБ5 (акронім "Кедшіаєєеа ицроп Асіїмайоп, Могтайу т Ехргеззей апа ргезитаріу Зесгеїгвей") - це
С-С-хемокін, кДНК-клон якого був виділений з кДНК-бібліотеки, збагаченої Т-клітинно-специфічними послідовностями (5снпаї! Т.. еї аї!., 1988). о
Синтетичні С-С-хемокіни МОСР-1, МСР-З і КАМТЕЗ, у яких відсутні 8-9 МН о-кінцевих амінокислот, є Фо неактивними стосовно моноцитів і можуть бути використані як антагоністи рецепторів (Сопад 4). еї аї., 1996; і
Сопо .. єї аї., 1995). о
Подовження КАМТЕ5 на один метионін приводить до повної інактивації молекули, і Ме-КАМТЕЗ починає со діяти як антагоніст для автентичного КАМТЕ5З (Ргоцоої А.Е. еї а!., 1996). 3о Головною метою цього винаходу є одержання вкорочених на аміно-кінці КАМТЕЗ, у яких відсутні в
МНе»-кінцеві амінокислоти, що відповідають амінокислотним залишкам 1, 1-2, 1-3 або 1-4 природного КАМТЕЗ і які мають антагоністичну активність проти хемокінів.
Конкретною метою цього винаходу є одержання КАМТЕЗ (3-68), у якого відсутні перші 2 амінокислоти, як « показано на Фіг.1 ів ЗЕО ІО Мо: 2. З 50 Такий вкорочений на аміно-кінцкі КАМТЕЗ цього винаходу може бути присутнім в глікозильованій або в с неглікозильованій формі.
Із» Термін "антагоніст хемокінів" означає "антагоніст, що справляє антагоністичну дію назрілі повнорозмірні природніхемокіни".
Іншою метою цього винаходу є одержання ДНК-молекул, що містять ДНК-послідовності, що кодують вкорочений на аміно-кінці КАМТЕ5З цього винаходу, включно з нуклеотидними послідовностями, що кодують в і основному той самий КАМТЕ5. кКДНК-послідовність інтактного КАМТЕЗ описана зснпаї! Т.. еї аІ. (1988), а КДНК оз вкороченого КАМТЕЗ може бути легко виведена.
Термін "нуклеотидні послідовності, що кодують в основному той самий КАМТЕЗ5" означає всі інші нуклеотидні ші послідовності, які, внаслідок виродженості генетичного коду, також кодують дані амінокислотні послідовності. о 20 Цей винахід також стосується експресуючих векторів, що містять вищевказані ДНК, клітин-хазяїв, трансформованих такими векторами, і способу одержання вказаних вкорочених на аміно-кінці КАМТЕ5 цього с винаходу шляхом культивування зазначених трансформованих клітин у відповідних культуральних середовищах.
ДНК-послідовність, що кодує білки цього винаходу, може бути вбудована і лігована у відповідну плазміду. 29 Після її продукування експресуючий вектор вводять до відповідної клітини-хазяїна, яка потім експресу є
ГФ) вектор(и) з одержанням потрібного білка. юю Експресія будь-якого рекомбінантного білка цього винаходу, що згадується в даному описі, може бути здійснена в еукаріотичних клітинах (наприклад, в клітинах дріжджів, комах або ссавців), або в прокаріотичних клітинах з використанням відповідних експресуючих векторів. В цих цілях може бути використаний будь-який бо метод, відомий фахівцям.
Наприклад, ДНК-молекули, кодуючі білки, отримані будь-яким з вищевказаних методів, вбудовують у відповідним чином сконструйовані експресуючі вектори, способами, добре відомими фахівцям (див. Затьгоок еї аІ., 1989). Дволанцюгову КДНК приєднують до плазмідних векторів шляхом гомополімерного нарощування або шляхом рестрикційного лігування, зокрема методами з використанням синтетичних ДНК-лінкерів або методами бо лігування на тупих кінцях, тобто для лігування ДНК-молекул використовують ДНК-лігази, а небажаному зв'язуванню запобігають шляхом обробки лужною фосфатазою.
Для експресії потрібного білка експресуючий вектор повинен також мати в своєму складі специфічні нуклеотидні послідовності, що містять транскрипційні і трансляційні регуляторні елементи, приєднані до ДНК, яка кодує потрібний білок таким чином, щоб забезпечувалась експресія гена і продукування білка. Спочатку, для того, щоб відбувалася транскрипція гена, необхідно, щоб йому передував промотор, який розпізнається
РНК-полімеразою і з яким зв'язуєть ся ця полімераза, що приводить тим самим до ініціації процесу транскрипції. Існує ряд придатних для використання промоторів, що діють з різною ефективністю (сильні і слабкі промотори). 70 Для еукаріотичних хазяїв можуть бути використані різні транскрипційні і трансляційні регуляторні послідовності, в залежності від виду хазяїна. Вони можуть бути отримані з вірусних джерел, таких, як аденовірус, вірус коров'ячої папіломи, мавп'ячий вірус або т.п., де вказані регуляторні сигнали асоційовані з конкретним геном, що має високий рівень експресії. В якості прикладів можуть служити промотор ТК вірусу герпеса, ранній промотор ЗМ40. промотор гена да! 4 дріжджів і т.п. Можуть бути обрані регуляторні сигнали 7/5 ініціації транскрипції, що забезпечують пригнічення й активацію так, щоб експресія генів могла бути модульована.
ДНК-молекулу, що містить нуклеотидну послідовність, яка кодує білок цього винаходу, вбудовують у вектор(и), що містить(ять) правильно приєднані сигнали регуляції транскрипції і трансляції, і здатнни(і) інтегрувати потрібні генні послідовності в клітину-хазяїна.
Клітини, що були стабільно трансформовані введеною ДНК, можуть бути відібрані за допомогою введення одного або кількох маркерів, що дозволяють проводити відбір клітин-хазяїв, які містять цей експресуючий вектор. Зазначений маркер може також наділяти ауксотрофного хазяїна фототрофією, резистентністю до біоцидів, наприклад, до антибіотиків, або до важких металів, таких, як мідь і т.п. Ген селективного маркера може бути безпосередньо приєднаний до ДНК-послідовності експресованого гена або введений у ту ж саму с об Клітину шляхом котрансфекції. Для оптимального синтезу білків цього винаходу можуть бути також використані о додаткові елементи.
Важливими чинниками при доборі конкретного плазмідного або вірусного вектора є легкість, з якою клітини-реципієнти, що містять зазначений вектор, можуть бути ідентифіковані і відділені від тих клітин-реципієнтів, що не містять зазначеного вектора; число копій вектора, що повинно бути присутнім в о зо даному хазяїні; і вимоги до здатності даного вектора реплікуватись в клітинах-хазяїнах різних видів.
Після одержання вектора(ів) або ДШе-послідовності, що містить конструкцію(ї), призначену(ї) для со експресії, ця(ї) ДНІС-конструкція(ї) може(уть) бути введена(ї) у відповідну клітину-хазяїна різними о відповідними методами, такими, як трансформація, трансфекція, кон'югування, злиття протопластів, електропорація, преципітація фосфатом кальцію, пряма мікроін'єкція і т.п. ме)
Клітини-хазяї можуть бути прокаріотичними або еукаріотичними. Перевагу слід надавати еукаріотичним ї- хазяям, наприклад, клітинам ссавців, таким, як клітини людини, мавпи, миші і клітини яєчника китайського хом'ячка (СНО), оскільки вони дозволяють вносити пост-трансляційні модифікації в молекули білка, включно з відповіднимм укладанням або глікозилуванням к потрібних сайтах. Дріжджові клітини також можуть вносити пост-трансляційні пептидні модифікації, включно з глікозилуванням. Існує ряд технологій рекомбінантних ДНК, « де використовуються послідовності сильних промоторів і висококопійне число плазмід, що можуть бути в с використані для продукування потрібних білків в дріжджах. Дріжджі розпізнають лідерні послідовності на . клонованих продуктах генів ссавців і секретують пептиди, що несуть лідерні послідовності (тобто, пре -пептиди). и?» Після введення зазначеного вектора(ів), клітини-хазяїни культивують в селективному середовищі, що забезпечує селективний ріст клітин, що містять вектори. Експресія клонованої(их) генної(их) послідовності (ей) приводить до продукування потрібних білків. -І Вкорочений на аміно-кінці КАМТЕЗ цього винаходу може бути отриманий будь-якими іншими добре відомими методами, і зокрема, добре розробленими методами хімічного синтезу з використанням автоматичних о синтезаторів для твердофазного пептидного синтезу з наступною хроматографічною очисткою. о Хемокіни цього винаходу можуть бути, наприклад, синтезовані з використанням груп Етос 5о /(З-флуоренілметоксикароонілу) і ЕВос (т-бутоксикар-бонілу), або будь-яким іншим аналогічним методом со хімічного синтезу з використанням або без використання відповідних бокових захисних груп на різних о амінокислотах. Амінокислоти з відповідними боковими захисними групами, або без них, попередньо активують, наприклад, групами нвтшшнОВві (2-(1Н-бензотриазол-1-іл)-1,1,3,3-тетраметилуронію гексафторфосфат/1-гідроксибензотриазол)), і приєднують до зростаючого пептидного ланцюга. Перед дв додаванням наступного залишку захисну групу (наприклад, Гтос) відщеплюють від а-аміно-групи. Після синтезу усі захисні групи видаляють, інтактні повнорозмірні пептиди очищають і хімічно або ферментативно укладають
Ф) (включно з утворенням дисульфідних містків між цистеїнами) з одержанням відповідних хемокінів цього ка винаходу.
Очистку природних, синтетичних або рекомбінантних білків здійснюють будь-яким з добре відомих методів, бо використовувані" для цих цілей, тобто будь-яким стандартним методом, зокрема методом екстракції, преципітації, хроматографії, електрофорезу і т.п. (див., наприклад, Ргоові еї аї., 1996). Додатковою процедурою очищення, якій варто надати переваїу для очищення білка цього винаходу, є афінна хроматографія з використаній м моноклональних антитіл або афінності до гепарину, де вказані антитіла або гепарин зв'язуються з цільовим білком, і де їх продукують і імобілізують на гелевій матриці, що знаходиться в 65 колонці. Препарати, що містять білки з домішками, пропускають через колонку. Цей білок зв'язується з колонкою за допомогою гепарину або за допомогою специфічного антитіла, а домішки проходять Через колонку. Після промивання білок елюють з гелю шляхом зміни рН або іонної сили.
Вкорочені на аміно-кінці КАМТЕЗ цього винаходу можуть бути використані для лікування і/або діагностики захворювань, при яких потрібна антагоністична активність проти дії хемокінів. Прикладами таких захворювань є: запальні захворювання; захворювання, асоційовані з ангіогенезом і гемопоезом; пухлини; інфекційні захворювання, зокрема ВІЛ-інфекція, аутоїмунні захворювання, атеросклероз, легеневі захворювання і шкірні хвороби. Перевагу слід надавати використанню для лікування ВІЛ-інфекцій.
Тому, в іншому своєму аспекті, цей винахід стосується застосування білка цього винаходу для виготовлення лікарського засобу для лікування вищезгаданих захворювань. 70 Перевагу слід надати виготовленню лікарського засобу в формі фармацевтичної композиції, що містить білки цього винаходу в поєднанні з одним або кількома фармацевтично прийнятними носіями і/або наповнювачами.
Такі фармацевтичні композиції входять в ще один аспект цього винаходу.
Іншим варіантом здійснення цього винаходу є спосіб лікування вищезгаданих захворювань, що передбачає введення фармакологічно активної кількості вкорочених на аміно-кінці КАМТЕ5 цього винаходу пацієнтам з 7/5 ризиком розвитку таких захворювань або пацієнтам, у котрих уже є зазначені патології.
Було також виявлено, що СО26/ЮОРР ІМ здатний генерувати вкорочений на Т"Нг-кінцеві КАМТЕ5З іп мійго.
КАМТЕЗ - це перший цитокін, про який повідомлялося, що його біологічна активність може бути модульована
СО26/ОРР М.
Тому, в іншому своєму аспекті, цей винахід стосується застосування СО26/ОРР ІМ для лікування і/або діагностики захворювань, при яких потрібна антагоністична активність проти дії хемокінів, спрямована, зокрема, проти запальних, імунних і інфекційних захворювань.
Таким чином, був поданий перший прюслад ідентифікованого механізму ендогенно регульованої модифікації хемокіну з утворенням антагоніста, аналогічний фізіологічному процесингові, але опосередкований іншими чинниками (протеазами). Застосування таких чинників (протеаз) для лікування і/або діагностики вищевказаних сч г5 Захворювань також входить до обсягу цього винаходу.
Цей винахід описаний в нижченаведених прикладах, що не повинні розглядатися як обмеження цього і) винаходу. Нижче подано конкретний опис малюнків.
На Фіг. 1 показані амінокислотні послідовності КАМТЕ5. Сигнальні послідовності зазначені курсивом, а
С-залишки зазначені жирним шрифтом. Стрілками показані перші амінокислоти вкороченого на аміно-кінці су з0 КАМТЕЗ цього винаходу, які називають також КАМТЕ (3-68).
На Фіг. 2 проілюстровано порівняння хемотаксичної активності інтактної і вкороченої на МН о-кінці форм со природного або рекомбінантного КАМТЕ5 стосовно моноцитів ТНР-1 в аналізі з використанням мікрокамери о
Бойдена: природний КАМТЕ(І-68) (л); природний вкорочений РІ АМТЕ5(3-68) (гі); інтактний рекомбінантний
КАМТЕЗІ(І-68) (д); і рекомбінантний КАМТЕ5(3-68), розщеплений СО26/ОРР ІМ (щ). Результатами є середнє о значення хемотаксичного індексу 4 середньо-кв. похибка з чотирьох або більше незалежних експериментів. -
На Фіг.З проілюстровано дію природного КАМТЕ5(3-68) (р), природного КАМТЕЗ (1-68) (А), рекомбінантного
ЕАМТЕЗ5 (1-68) (д) і рекомбінантного ВАМТЕЗ (3-68), обробленого СО26/ОРР ІМ (юш), на (Са? в іслітинах
ТНР-1. Результатами є середнє значення збільшення (Са 2"); - середньо-кв. похибка з трьох або більше « дю незалежних експериментів. з с На Фіг.4 показана десенсибілізація Са 2"-мобілізуючої активності інтактного гесКАМТЕ(І-68) під дією
КАМТЕЗ (3-68). Клітини ТНР-1 спочатку стимулювали буфером або різними концентраціями рекомбінантного ;» ЕАМТЕЗ(І-68) або КРАМТЕЗ (3-68) . Результатами є середнє значення збільшення ІСа?"|;- середньо-кв. похибка (з трьох або більше незалежних експериментів) у відповідь на вплив ЗО нг/мл інтактного рекомбінантного РАМТЕЗ як другого стимулятора. -І На Фіг.5 наведено порівняння хемотаксичної здатності вкороченого КАМТЕ5(3-68) із здатністю інтактного
КАМТЕЗ(І-63). Еозинофільну гранулецитарну хемотаксичну активність природного (паї) і рекомбінантного (гес) о вкороченого КАМТЕ5, інтактного КАМТЕБЗ і синтетичного МСР-З3 визначали в аналізі з використанням ав! мікрокамери. Результатами є середнє значення хемотаксичного індексу (ХІ) ї- середньо-кв. похибка з двох або більше незалежних експериментів (кожен проводили в потрійному дублікаті).
Ме На Фіг.б показано десенсибілізацію мобілізації кальцію інтактним КАМТЕЗ в ССК-трансфектантах. 2 Експерименти з мобілізації кальцію проводили на клітинах НОБ, трансфікованих СО4 і рецепторами СС-хемокіну
ССКІ1 або ССК5. Спочатку клітини стимулювали різними концентраціями інтактного або вкороченого КАМТЕЗ5 з наступною стимуляцією 100 нг/мл інтактного КАМТЕ5. Показано відсоток інгібування збільшення Са 7); індукованого другим стимулятором. Цей відсоток обчислювали шляхом порівняння відповіді на 1ООнг/мл о інтактного КАМТЕ5 після додавання КАМТЕ5(І-68) або КАМТЕ5(3-68) з відповіддю після стимуляції буфером (10095). Результатами є середнє значення відсотка інгібування - середньо-кв. похибка з двох або більше де експериментів.
На Фіг.7 показана сильна інгібуюча дія КАМТЕ5 (3-68) на інфікування мононуклеарних клітин вірусом ВІЛ-1. 60 ФГА-активовані МКПК були інфіковані М-тропним штамом ВІЛ-1 Ва-Ї в присутності різних концентрацій КАМТЕЗ (1-66) або КАМТЕ5(3-68) (0-100Онг/мл додавали під час інфікування) . Через десять днів простежували вихід вірусу в клітинному супернатанті в умовах р-24-АЯа-ЕГ ІЗА (один репрезентативний експеримент з чотирьох проведених експериментів).
На Фіг.8 показано дію КАМТЕ5(І-68) і КАМТЕ5(3-68) на інфікування штамом 5Е162 вірусу ВІЛ-1 у б5 ФГА-активованих МКПК. Вихід вірусу простежували через десять днів після інфікування в клітинному супернатанті в умовах р-24-Ад-ЕГ ІЗА. Показано результати одного репрезентативного експерименту з трьох проведених експериментів." Внизу означає межу детекції р-24-А9а-ЕГІЗА («5 пг/мл).
На Фіг.9 показана експресія СО26 на клітинах НОБ5.СО4.ССтК5, Ш87.204.ССК5 і свіжовиділених ПКМК. В кожній гістограмі показано відсоток (90) СО26б-позитивних клітин.
На Фіг. 10 показано дію КАМТЕ5( 1-68), КАМТЕ5( 1-68) плюс 852026 (50од./л), і КАМТЕ (3-68) на інфікування клітин НОБ.СО4.ССТК5 штамом Ва! ВІЛ-1. Виходи вірусу простежували через 8 днів після інфікування в клітинному супернатанті в умовах р-24-Ад-ЕГ ІЗА. Показано результати одного репрезентативного експерименту з трьох проведених експериментів.
Приклади 70 Приклад 1: Вкорочений на аміно-кінці КАМТЕЗ
Матеріали і методи
Реагенти
Природний КАМТЕЗ людини опродукували в клітинах гепатосаркоми Малаву (Маїами), в клітинах остеосаркоми МО-63 або в лейкоцитах периферичної крові (Центри переливання крові в Антверпені і Льовені), і /5 бчищали методом, описаним раніше (Ргоові Р. еї аї., 1996 і Ргоові Р. еї аіЇ., 1993), МСР-2, МСР-З і ССР-2 синтезували методом хімічного синтезу з використанням Етос (Ргоові Р. еї аї., 1995 і МУцуїв А. еї аї., 1997), рекомбінантний КАМТЕЗ людини одержували від Рергоїеспй (КосКку НІіЇїЇ, МОУ), а рекомбінантний МСР-1 був люб'язно наданий Ог. У.3У. Орреппеїт (МСІ-МІН, Егедегіск, МО).
Клітини остеосаркоми людини (НО), трансфіковані СО4 і одним з рецепторів СС-хемокіну ССКІ, ССКЗ або го ССнт5 (Оепу Н. еї аї., 1996), культивували в ОМЕМ з глутамаксом. В це середовище додавали пуроміцин (Імкг/мл) в якості селективного агента. Всі культуральні середовища (сСірсо ВЕ! ІЛ їе Тесппоіодіез, Раїзіеу,
ОК) збагачували 1095 ЕС5.
СО26/ЮОРР ІМ людини одержували з простасом, органел, що походять з передміхурової залози, які у вільному стані знаходяться в сім'яній плазмі. Цей фермент очищали до гомогенності, як описано раніше, з використанням сч іонообмінної хроматографії з наступною афінною хроматографією на аденозин-дезаміназі (Ое Меезіег І. еї аї., 1996). і)
Інкубування хемокінів з СО26/ОРР ІМ і детектування протеолітичного процесингу 100-1000 молярного надлишку хемокінів інкубували протягом ночі з СО26/ОРР ІМ в 100 мМ Тріс/НСІ рн 7,7.
Хемокіни відокремлювали від СЮО26/ОРР ІМ за допомогою електрофорезу в ПААГ з ДСН на тріс/тріцин-гельовій о
Зо бистемі, як описано раніше (Ргоові Р. еї аі., 1996).
Білки піддавали електроблотингу на ПВДФ-(полівініліденфторидних) мембранах (Ргобріо(ї, Регкіп ЕІтег, со
Еозіег Су, СА) і забарвлювали кумаси діамантовим блакитним К250. Після знебарвлення мембрани промивали о принаймні 5 разів надчистою водою (Міїї С); МіїПроге, Ведіога, МА).
Для одержання достатніх кількостей чистого вкороченого хемокіну для біологічних аналізів приблизно 5Омкг ме) рекомбінантного хемокіну обробляли СО26/ОРР ІМ і продукт розщеплення підкислювали 0,195 трифтороцтовою М кислотою (ТЕА). Для запобігання прилипанню хемокінів до пробірок додавали Твин 20 (0,0190).
Хемокіни відокремлювали від СО26/ОРР ІМ в градієнті ацетонітрилу на колонці Адоароге КР-З0О0 з С-8 (1х5Омм) (Регкіп ЕІтег). Фракції, що містять білки, аналізували за допомогою електрофорезу в ПААГ з ДСН, і забарвлювали сріблом, як було описано раніше. «
СО26/ОРР ІМ-оброблені хемокіни, очищені за допомогою ОФ-ВЕРХ або вирізані з ПВДФ-блотів, піддавали -птв) с ІЧНг-кінцевому секвенуванню за допомогою деградації за Едманом на імпульсному рідинно-фазному секвенаторі . 477А/120А для секвенування білків (Регкіп ЕІтег) з використанням М-метилпіперидину в якості зв'язуючої а основи.
Детекція хемотаксичної активності
Хемокіни тестували на їх хемотаксичну здатність стосовно свіжовиділених нейтрофільних гранулоцитів -І периферійної крові (1092 клітин/мл) або культивованих моноцитів ТНР-1 (0,5х109 клітин в мікрокамері Бойдена (Ргоозві Р. еї аії., 1996 5. Ргоові Р.ега!., 1993). о Після 45-хвилинного (гранулоцити) або 2-го динного (клітини ТНР-1) інкубування при 372 клітини фіксували (ав) й забарвлювали. Клітини, що мігрували через полікарбонатні мембрани з порами розміром 5 мкм, підраховували в десятьох полях об'єктиву мікроскопа з масляною імерсією.
Со Хемотаксичний індекс (Х.І.-)» зразка (потрійні дублікати в кожній камері) підраховували як кількість 2 клітин, що мігрували в зразок, поділену на кількість клітин, що мігрували в контрольне середовище. Для експериментів на десенсибілізацію клітини інкубували з біологічно інактивованими варіантами хемокінів протягом 10 хвилин при 372С, перед перенесенням до камери.
Для оцінки десенсибілізації хемотаксису обчислювали 95 інгібування Х.І., отриманого при десенсибілізації з о використанням НВ55-оброблених контрольних клітин.
Детекція внутрішньоклітинних концентрацій Са?" ю Внутрішньоклітинні концентрації кальцію (ІСа?"|) вимірювали, як описано раніше (МУцуїв А. еї аї., 1997).
Якщо коротко, то очищені клітини інкубували з флуоресцентним індикатором фура-2 (фура-2/АМ, 2,5 мкм; 60 молекулярні зонди, Моіесціаг Ргорез Ейгоре ВМ, І еідеп, Те МейПепапавз) і 0,0195 плюроніку Е-127 (Зідта,
З оціз МО).
Після витримування протягом 30 хвилин клітини двічі промивали, ресуспендували в НВУ5 з 1 мМ Са 7" і інкубували протягом 10 хвилин при 37 2С, а потім вимірювали фура-2-флуоресценцію в люмінесцентному спектрофотометрі І 5Б5ОВ (Регкіп ЕІтег). Після збудження при 340 і ЗвОнм флуоресценцію детектували при бо 51Онм. Рівень ІСа?"), обчислювали за рівнянням Гринкевича (Сгупкемісз е! а!., 1985).
Для визначення К дах клітини лізували 5Омкм дигітоніном. Потім доводили рН до 8,5 з використанням 20мм
Трісу, і величину Кліп одержували при додаванні їОмм ЕСТА до лізованих клітин. Величина Ку, що використовується для калібрування, складала 224нМ. Для експериментів на десенсибілізацію клітини спочатку Сстимулювали буфером або хемокіном в різних концентраціях. Хемокіни, в якості другого стимулятора, додавали в концентрації, що індукує значне збільшення |Са 27);. після попередньої стимуляції буфером. Обчислювали відсоток інгібування збільшення (Са 2"); у відповідь на попередню стимуляцію клітин другим стимулятором.
Інгібування ВІЛ-1-інфекції.
М-тропні штами ВІЛ-1, Ваї. і ЗЕ162 були отримані у відповідності до програми МКС вивчення СНІД-реагентів 70. (Негпів, ШК) Мононуклеарні клітини периферичної крові (МКПК), взяті від здорових донорів, виділяли шляхом центрифугування в градієнті щільності (5,23) і стимулювали ФГА при мкг/мл (Зідта, Вогпет, Веїдіит) протягом
З днів при 372С. Активовані клітини (ФГА-стимульовані бласти) тричі промивали РВ5 і інфікували вірусом, як описано раніше (ЗспоЇв ОЮ. еї аї., 1997). ВІЛ-1-інфіковані або псендо-інфіковані ФГА-стимульовані бласти культивували в присутності 25 од./мл 1І--2 і різних концентрацій КАМТЕ5(1-68) або КАМТЕ5(3-68). На 10-й день 75 збирали клітинні супернатанти, і коров'ячий антиген ВІЛ-1 в супернатанті аналізували за допомогою набору для р-24-Аа-ЕГІЗА (ЮиРоп/МЕМ І Те Зсіепсе Ргодисів, Вгиззеїв, Веїдійт).
Результати
Ідентифікація і біологічна характеризація природного вкороченого на МН»о-кінці КАМТЕ5
Були попередньо виділені різні вкорочені на МНо-кінці форми ОСР-2 людини (Ргоові Р. еї аї., 1993). 20 Найбільш вкорочену ЗСР-2-форму розщеплювали в сайті після Рго у передостанньому положенні |(ССР-2(3-75)).
З використанням аналогічної стандартної процедури очищення С-С-хемокін КАМТЕ5 виділяли з лейкоцитів периферичної крові або з клітин саркоми (Ргоозі Р. еї а!., 1995).
Зокрема, кондиціоновані середовища від клітин МО-63 або клітин саркоми Малаву, індукованих сумішшю цитокінів, фракціонували для виділення природних варіантів хемокінів. Ці хемокіни послідовно очищали за Ге 25 допомогою афінної хроматографії з використанням антитіла або гепарину, катіонообмінної хроматографії о (моно-5-РЕХБ) і ОФ-ВЕРХ, і імунореактивні форми детектували за допомогою хемокінспецифічного ЕГІБА. Було виявлено, що на катіонообмінній колонці ІЇ-8 елююється в безпосередній близькості від КАМТЕЗ (між 0,7 і 0,75
М масі). Проте обидва хемокіни відокремлювали один від одного за допомогою ОФ-ВЕРХ (КАМТЕЗ і 1-8 елюювались при 27,595 і 3095 ацетонітрилу відповідно). Аналіз амінокислотних послідовностей очищених білків С 30 підтвердив, що 1-8 зустрічається в різних вкорочених на МН»--кінці формах, що були раніше виділені, виходячи со з їх хемотаксичної активності (Мап Оатте .. еї аі!., 1989). Однак для КАМТЕЗ була виділена тільки одна форма, в якій, у порівнянні з інтактним КАМТЕЗ, були відсутні два МН о»-кінцеві залишки. Для перевірки його | «в) хемотаксичної активності стосовно моноцитів і еозинофілів, цей КАМТЕ5(3-68) був проаналізований ретельніше с на частоту його стрівальності. Зокрема, КАМТЕ5(3-68) був протестований на хемотаксичну активність і/або на 35 активність вивільнення внутрішньоклітинного Са?" і його біологічну ефективність у порівнянні з ефективністю в. відповідних інтактних хемокінів.
МН»е-кінцева делеція двох залишків КАМТЕЗ приводила до значного зниження моноцитарної хемотаксичної активності і активності, що вивільнює Са?". В порівнянні з інтактним природним КАМТЕЗ (мінімальна ефективна « доза 3-1Онг/мл), природний КАМТЕ5(3-68) виявився цілком неактивним при тестуванні в концентраціях аж до З
ЗООнг/мл в мікрокамері Бойдена (Фіг. 2). Крім того, для досягнення Са 2:-відповіді, аналогічної відповіді с ЕГАМТЕЗ (1-68), для природного КАМТЕЗ (3-68) знадобилися в 10 разів вищі концентрації (Фіг.3). з СО26/ОРРІМ сприяє видаленню МНа2 -кінцевих дипептидів хемокінів
Для того, щоб визначити, чи є амінопептидази СО26/ОРР ІМ відповідальною за МН о-кінцеве вкорочення
КАМТЕ5, інтактний хемокін інкубували протягом ночі з СО26/ОРР ІМ, блотували на ПВДФ-мембрани, забарвлювали кумаси синім і піддавали автоматичній деградації за Едманом. СО26/ЮОРР ІМ-обробка КАМТЕЗ призводила до видалення МН»о-кінцевих дипептидів. Паралельне інкубування хемокіну з буфером без СО26/ОРР (95) ЇМ не дало ефекту.
Оскільки інші хемокіни містили консенсусну послідовність для СО26/ЮОРР ІМ-розщеплення, і оскільки було показано, що МНо-кінець МОР відіграє вирішальну роль в біологічній активності (опа 4. еї аі., 1996 /бопад у. еї (ее) 20 аІ., 1995), то МСР-1, МСР-2 і МСР-3 були також інкубовані з СО26/ОРР М.
Після обробки МСР блотували на ПВДФ-мембранах і забарвлювали кумаси синім для підтвердження того, с що для деградації за Едманом було виділено достатню кількість білка.
Однак МН»-кінцева послідовність не могла бути виявлена, що вказує на те, що СО26/ОРР М не модифікує
МН»-кінець МУР, який блокується піроглутаміновою кислотою при деградації за Едманом. 59 Порівняння біологічної активності інтактного і СО26/ОРР ІМ-обробленого КАМТЕЗ
ГФ) Аналогічно природному КАМТЕ5(3-68), С-8-0Ф-ВЕРХ-очищений, СО26/ОРР ІМ-оброблений рекомбінантний
КАМТЕБЗ був неактивним в мікрокамері Бойдена в експериментах з хемотаксису з використанням в концентраціях аж до мкг/мл, тоді як при концентраціях інтактного рекомбінантного КАМТЕЗ від З0 до 100 і вище спостерігалась значна хемотаксична відповідь моноцитів (Фіг.2). бо При оцінці ефекту вкорочення, проведеній в аналізі на мобілізацію Са 27, ВАМТЕ5(3-68) при концентрації 100нг/мл індукував низьке, але значуще збільшення мобілізації Са?", однак інтактний ВАМТЕЗ ставав активним уже при ТОнг/мл (Фіг.3). І, нарешті, незважаючи на те, що були вилучені тільки два МНо-кінцевих залишки, моноцитарна хемотаксична і Са?" -мобілізуюча здатність ВАМТЕЗ при цьому знижувалася в 10-100 разів. 65 КАМТЕ5(3-68) є природним антагоністом хемотаксису в порівнянні з інтактним КАМТЕ5
Беручи до уваги відсутність активності КАМТЕ5(3-68) в експериментах з хемотаксису моноцитів, автори провели аналіз для того, щоб визначити, чи може цей вкорочений КАМТЕЗ діяти як антагоніст. КАМТЕ5(3-68) при концентрації мкг/мл майже цілком (8295) десенсибілізував хемотаксксчну дію 10Онг/мл інтактного КАМТЕЗ (Таблиця І).
При додаванні у верхню лунку З-кратного надлишку КАМТЕ5 (3-68) хемотаксис клітин ТНР-1 у напрямку інтактного КАМТЕ5З інгібувався приблизно на 50-7095. КАМТЕ5(3-63) при ЗООнг/мл ще був здатний інгібувати приблизно 309о хемотаксичної відповіді в напрямку однакової концентрації інтактного КАМТЕЗ.
В експериментах на мобілізацію Са?" в клітинах ТНР-1 (Фіг.4) інтактний ВАМТЕЗ при Зонг/мл здатний десенсибілізувати дію ЗОнг/мл інтактного КАМТЕЗ на 39-595. Для досягнення того ж самого рівня 70 десенсибілізації необхідно використовувати приблизно в 10 разів більші концентрації КАМТЕ5(3-68). Однак при
ЗООнг/мл КАМТЕБЗ (3-68) сам дає значущу Са?" -відповідь. Ця Са 2:-відповідь співставна з відповіддю, отриманою з використанням Зонг/мл інтактного КАМТЕ5. їв
Хемобннтмт 00100000 Хек вдедя о 0100
Нижялуне Вена 00000000 жінбуваня мів рення (1-68) (3-68) о юю рвотювтвюв 00060005
ПО ПОС СЕ СС с НН Ус тИня НОО ня вютв тової 00009100 сч з мою 00600001 о 1 Результатами є хемотаксичний індекс (Х.І.) з чотирьох (А-Ю0) незалежних експериментів (зокрема середнє о значення - середньо-кв. похибка) і відсоток (95) інгібування (середнє значення - середньо-кв. похибка 90 інгібування з чотирьох експериментів) хемотаксичної відповіді на КАМТЕЗ(І-68) після попереднього інкубування со клітин ТНР-1 з неактивним КАМТЕ5(3-68) або з буфером. о
Знижена хемотаксична активність КАМТЕ5(3-68) для моноцитів і еозинофілів людини
В Таблиці Ії хемотаксичну здатність природного КАМТЕ5 (3-68) порівнюють із здатністю моноцитарного «9
З5 Хемотаксичного білка МСР-З3 і інтактного КАМТЕ5(І-686). Як можна бачити, МСР-3З і КАМТЕ5(І-68) при чн концентраціях Знг/мл і ЗОнг/мл/ відповідно, ще мають хемотаксичну активність, для свіжовиділених моноцитів периферичної крові, тоді як природний КАМТЕ5(3-68) залишається неактивним при 10Онг/мол.
Знижена хемотаксична здатність цього природного варіанта була підтверджена з використанням рекомбінантного КАМТЕ5(3-686). Хоча очищений рекомбінантний КАМТЕ5(3-68) мав слабку хемотаксичну « 20 активність для моноцитів (при Тмкг/мл), однак він виявляв специфічну активність, що була в 10 разів нижчою, з ніж активність інтактного рекомбінантного КАМТЕ5. с І, нарешті, хемотаксична активність КАМТЕ5(3-68) була підтверджена на еозинофілах людини, які були ще :з» сприйнятливими до 1О0Онг/мл інтактного КАМТЕЗ і ЗОнг/мл МСР-З (Фіг.5). Аналогічно, як у випадку моноцитів, міграція еозинофілів стимулювалася лише КАМТЕ5(3-68) при 1мкг/мол. щи
Фо о б бю ввоя 00033 юр 0000013 о 100001 1 бюро ло 01 11011 лвтовву 1 летодву 100 зв лятяяї1110001171110117771
Ф) о а) середнє значення хемотаксичного індексу (ХІ) - середньо-кв. похибка (п) для свіжовиділених моноцитів периферичної крові. бо В) не визначали.
КАМТЕЗ5(3-68) передають сигнали і десенсибілізують КАМТЕБ5(І-68) за допомогою ССК5, але не за допомогою ССК1 і ССЗ
Для пояснення зниженої хемотаксичної активності КАМТЕ5(3-68) була перевірена здатність цього варіанта в5 хемокіну зв'язуватися і передавати сигнал за допомогою відомих рецепторів, "використовуваних" КАМТЕ5.
В аналізі на передачу сигналу, в якому вимірювали підвищення внутрішньоклітинної концентрації кальцію,
були використані клітини НОБ, трансфіковані хемокіновими рецепторами ССКІ, ССЗ або ССК5. При концентраціях аж до З0Онг/мл КАМТЕЗ (3-68) не дає збільшення Са 7"); в клітинах НОБ5, трансфікованих ССК1 (Таблиця ІІ) або ССКЗ (дані не наводяться), тоді як концентрації ЗОнг/мл і 1ООнг/мл інтактного КАМТЕЗ виявились достатніми для індукування збільшення Іса?"|; і в ССК1- і ССК5-трансфектантах, відповідно.
Однак як інтактний, так і вкорочений КАМТЕЗ були здатні індукувати значуще збільшення Са 7"; в
ССк5-трансфектантах при ЗОнг/мол. Крім того, при попередньому інкубуванні ССК5-трансфікованих киїтин з 3-10-кратним надлишком або КАМТЕ5(3-68), або інтактного КАМТЕ5, спостерігалося однакове інгібування (біля 7595) збільшення Са? за наступної стимуляції інтактним КАМТЕЗ5 (10Онг/мл) (Фіг.б).
На противагу цьому, ЗООнг/мл КАМТЕ5(3-68) давав лише незначну десенсибілізацію кальцієвої реакції ССК1- і ССКЗ-трансфікованих клітин у відповідь на 1ООнг/мл інтактного КАМТЕЗ, тоді як З-кратний надлишок інтактного
РАМТЕЗ, використовуваний в якості першого стимулятора, майже цілком інгібував підвищення (Са 2"); в цих клітинах при наступній стимуляції КАМТЕ5(І-68). Виходячи з цього, можна зробити висновок, що видалення двох
МН» - кінцевих залишків в КАМТЕЗ справляє істотний вплив на передачу сигналу, в результаті чого хемокінові 19 рецептори ССКІ і ССЗ більше не можуть функціонально розпізнаватися. Тому знижена хемотаксична активність КАМТЕЗ(3-68) може бути пояснена його нездатністю функціонувати за посередництвом ССКІ1 і ССКЗ.
На противагу цьому, КАМТЕБ5(3-68) цілком зберігає здатність до ССК5-опосередковансі передачі сигналу, характерної для інтактного КАМТЕ5. КАМТЕ5(3-68) може справляти протизапальну дію шляхом конкуренції з інтактним КАМТЕЗ5, але він може діяти ще як інгібітор ВІЛ завдяки збереженню своєї здатності до зв'язування з ссср,
Хемокін Конц. (нг/мл) с й -ще и 9 ссвІ нн ЕЕ С юн о зо вав со о лю дмвяов)твяя юдеї о
ОО 1ю1177111111111днвсо | ї- а) середнє збільшення |Са 2"Її в нМ я середньо-кв. похибка, отримане з двох або більше незалежних « експериментів.
Інгібування КАМТЕЗ(3-68) - формою хемотаксису, індукованого СС-хемокіном в клітинах моноцитів людини - с Для того, щоб підтвердити, чи відбувається інгібування передачі сигналу СС-хемокіном під дією ч КАМТЕБ5(3-68) також в клітинах моноцитів, були проведені експерименти з інгібування в клітинах ТНР-1. -» Експеримент показав, що КАМТЕ5(3-68) виявляє в 10 разів нижчу здатність до підвищення Са |, в моноцитах у порівнянні з інтактним КАМТЕЗ (дані не наводяться). Крім того, хемотаксичну дію інтактного КАМТЕЗ (ЗОонг/мл) на моноцити інгібується (7195) при інкубуванні тестованих клітин з ЗООнг/мл КАМТЕ5(3-68), як показано в -і Таблиці ІМ. сю Крім того, КАМТЕ5(3-68) сприяє зниженню хемотаксичної реакції у відповідь на інші СС-хемокіни, зокрема моноцитарний хемотаксичний білок-З3 (МСР-3) (6795), макрофагальний білок запалення МІР-10, (6190) і МІР'-ТД о (8095). оо 20 Це свідчить про те, що КАМТЕБ5(3-68) діє як інгібітор широкого спектру міграції клітин моноцитів, індукованої іншими СС-хемокінами. (42) о з » юю 11110011 5108 10001801 ве а) КАМТЕ5, МСОСР-3, М1ТР-19;, МІР-1р і буфер додавали в якості хемоатрактантів у нижні лунки мікрокамери.
Б) верхні лунки мікрокамери заповнювали клітинами ТНР-1, попередньо інкубованими (10 хв., 3722) з
ЗООнг/мл КАМТЕЗ (3-68) або з буфером. с) середнє значення ХІ 4 середньо-кв. похибка з чотирьох незалежних експериментів. а) інгібування міграції, індукованої інтактними хемокінами, в присутності КАМТЕ5(3-68) при ЗООнг/мол.
СО26-специфічне вкорочення КАМТЕЗ є необхідним для його противірусної активності
Спочатку оцінювали дію різних форм КАМТЕЗ проти двох різних М-тропних штамів ВІЛ-1 (ВаїЇ і 5Е162) у
МКПК людини, взятих з крові здорових донорів. ІСво для інтактного КАМТЕ5(І-68) стосовно штаму Ва! складав
З,4нм, а ІСбо для КАМТЕ5З (3-68) складав 0,39нМ. Величина 1С 9490 для КАМТЕБЗ (1-68) складала 7/1НМ, що приблизно в 10 разів перевищувала величину ІСоо для КАМТЕ5(3-68). Що стосується штаму 5Е162, то при оцінці 7/0 в ПКМК, КАМТЕЗ (1-68) (ІСво: 23НМ; ІСеро: 95НМ) був більш, ніж у 10 разів менш активним, ніж КАМТЕ (3-68). (ІСво: 2НМ; ІСеро: 8,2нм) (Таблиця М). Залежну від концентрації дію обох хемокінів при концентраціях у межах від 133 до 0,2нНМ проти реплікації 5Е162 ВІЛ-1 у ПКМК проілюстровано на Фіг.8. Концентрація 5,28М КАМТЕЗ (3-68) виявилась досить ефективною для зниження реплікації вірусу, тоді як КАМТЕЗ(І-68) був неактивний при цій концентрації. Якоїсь відмінності в антивірусній активності між інтактними КАМТЕ5, отриманими від 75 РергоТесі або КО Зувіетв, не спостерігалося.
Різка відмінність в антивірусній активності між двома формами КАМТЕ5 була навіть помітнішою при тестуванні в ССК5-Трансфікованих клітинах людини. В клітинах ШУ78.СО04.ССК5, ІСбо для КАМТЕБ5(І-68) і
КАМТЕ5(3-68) стосовно штаму Ва! складали 21НМ і 0,65НМ відповідно. ІСоо для КАМТЕЗ( 1-68) складав більш, ніж 13ЗнНМ, у той час як ІСоо для КАМТЕ5(3-68) складав 6ЗНМ. В Таблиці М також показано, що КАМТЕ2(І-68) був фактично неактивким в клітинах НОЗ.СО4. ССІ5 (ІСво»1З3З3нНМ), тоді як КАМТЕЗ(3-68) виявився сильним інгібітором реплікації Ва! ВІЛ-1 в цих клітинах (ІСзо- 5,5 НМ). Однак для обох форм КАМТЕ5 в цих клітинах не були досягнуті значення ІСед
Противірусна активність КАМТЕЗ залежить від присутності мембранно-асоційованого або розчинного СЮО26б (82026) с
Була оцінена експресія СО26 на двох різних ССКО5-трансфікованих клітинних лініях і на свіжовиділених ПКМК.
Трансфектанти НОБЗ були негативними стосовно експресії СО26, як було визначено шляхом аналізу методом о проточної цитометрії, тоді як трансфектанти 087 забарвлювались слабко, але виявляли помітно позитивну реакцію з тАб проти СО26 (Фіг.9). Крім того, було виявлено, що субпопуляція свіжовиділених МКПК виявилась у високому ступені позитивною стосовно експресії СО26 (Фіг.9). Га»)
Залежну від концентрації дію КАМТЕ5(1-68) Її КАМТЕ5(3-68) на продукування вірусного р-24-Ад штамом Ваї в трансфікованих клітинах НО5З.СО4.СС5 в присутності 82026 показано на Фіг. 10. Додавання 52026 разом з со
КАМТЕ5 (1-68) на початку ВІЛ-інфікування значно підвищувало антивірусну активність інтактного КАМТЕ5 в о клітинах НОБЗ-СО4. СС. При додаванні 5СО26 при 50од./л разом з КАМТЕ5, ІСво для КАМТЕЗ складало 1З3НМ.
Додавання тільки одного 52026 не справляло якогось впливу на реплікацію вірусу. Додавання 52026 до і. РАМТЕБ(3-68) також не впливало на антивірусну активність КАМТЕЗ(3-68) (дані не наводяться). Таким чином, ї- присутність СО26 відіграє важливу роль в наданні інтактному КАМТЕЗ противірусної активності.
Вкорочення природного МІР-іа на аміно-кінці не впливає на його анти-ВІЛ-1, хемотаксичну і Са?"-мобілізуючу активність «
Оскільки більшість природних МІР-19 є вкороченими на МН»е-кінці (на чотири амінокислоти), то авторами було проведено дослідження для того, щоб визначити, чи має цей вкорочений МІР-1 о(5-70) змінену - с ВІЛ-1-інгібуючу здатність. На відміну від результату, отриманого для КАМТЕ5, якої-небудь значущої різниці в "з розмірах ІСьо для інтактного МІР-1о; і для МІР-15(5-70) в МКПК або в ССК5-трансфікованих клітинах (Таблиця М, " Фіг.8) виявлено не було. Крім того, було проведено порівняльний аналіз впливу інтактного МІР-19, і вкороченого
МІР-1а(5-70) на хемотаксис моноцитів ТНР-1 і мобілізацію в них внутрішньоклітинного Са?", В Таблиці МІ с. й . о - продемонстровано, що мінімальна ефективна доза МІР-19(5-70), що індукує підвищення |Са 7), була лише незначно нижчою, ніж доза інтактного МІР-1у. Більше того, хоча максимальна міграція, що спостерігається при (95) О ЗНМ в аналізі на хемотаксис, була вищою для інтактного МІР-1 у, однак мінімальні пригнічуючі концентрації о обох ізоформ МІР-194, були майже аналогічними. В цілому можна зробити висновок, що МНо-кінцевий процесинг со 50 МІР-12, на відміну від КАМТЕ5, лише незначно послаблює його протизапальну й анти-ВІЛ-1" активність. о
ШИ сс ; ше енер че тенти
ЇСво о Рмвсва 00003400 о 65019059 165 ю бо
Моніторинг виходу вірусу в безклітинному супернатанті проводили через 8-12 днів після інфікування вірусним р-24-Ад в ЕГІЗА. Наведено середні розміри ІСьо і ІСоо (в НМ). Дані є середніми значеннями, отриманими з 2-4 незалежних експериментів. Величина, позначена "»130", вказує на те, що 5095- або 9095-не інгібування не ве досягалося при 1З3ОНМ. МО - не визначали.
і п в а
М мя 1аянкяя ове 0 оию
С 1вов0влво ою
Є юю вім 1001000 ин ПСИ ЕХУИ НОСУ НИ НЕСЕ НН во звіляооокю й нин Ех НН 7 Міграція моноцитів ТНР-1 через 5,0 мкм-пори в мікрокамері. Результатом є середнє значення (5 середньо.кв. похибка з трьох незалежних експериментів. ях Детекція збільшення |Са 2"); в клітинах ТНР-1 Наводяться результати, отримані з двох незалежних експериментів.
Література
Ваоддіоїїпі М. еї аї., Апп. Кем. Іттипої., 55,-97-179, 1994.
Ваоддіоїїпі М. еї аї, Апп. Кему. Іттипої, 15, 675-705, 1997.
Сіагк-і! емуіз І. еї а), 9. Віої. Спет., 266, 23128-23134, 1991. сч
Бе Меезієег І. єї аї, 9. Іттипої. Меїпоаз 189, 99-10526, 1996. епа Н. еї аї. Майшге., 381, 661-666, 1996. о бопа .. еї а. 9. Ехр. Мед, 181, 631-640, 1995.
Сопа, ега|, 9. Вісі. Спет. 271, 10521-10527, 1996.
СгупКіем/іс: 0. еї аї, 9. ВіоЇї. Спет., 260, 3440, 1985. о
Ргоові М.ейа). Віоспетівігу, 32, 10170-10177, 1993а.
Ргоозі Р. еваї, 9. Іттипої., 150, 1000-1010; 1993, (ее)
Ргоозві Р. егаї, Суюкіпе, 7, 97-104, 1995. о
Ргоозві Р. еї а), Меїйпоав: А сотрапіоп о Меїййод3вз іп Епгутої, 10, 82, 1996.
Ргоцайосої А. Е. еї аї, 9. Віоі. Спет., І, 2599-2603, 1996. со зЗамрбгоок еї а| МоЇІесцаг Сіопіпо: А Іарогаїгу Мапиаї! Соїд Зргіпд Нагрог М
І арогаюгу, Соїа Зргіпд Нагрог, МУ, 1989. зепаїЇ! Т. У. еї аї, У.Іттипої, 141, 1918-1025, 1988.
Зепоїв 0. еї а, У. Ехр. Меа, 186, 1383-1388, 1997.
Боглапі 5. еї аї, У. Іттипої, 152, 3615, 1994. « 20 Таць 0. еї аіІ, СуюкКіпе 5 Огоумйп Расіог Кеміемув, 7, 335-76, 1996. -о
Мап Оатте .). ей аї, Ешг. У. Віоспет., 181, 337-344, 1989. с Мап Оатте .).. ес аії, Єиг, 9. Іттипої, 20, 2113-8. 1990. :з» Мап Оатте .. еї а1., У. Ехр. Меад, 176, 59, 1992.
Уа: А. еїа!., Віоспет. Віорпуз. Кевз. Соттип., 159, 969-75, 1989. 415 МУцуїв А., еї а!., Віоспетівігу, 36, 2716-2723, 1997. -1 Список послідовностей (1) Загальна інформація: і95) (ї) Заявник о (А) Назва: Арріїеа Кезеагсі Зувіетв Аг: Ноїдіпд М.М. (В) Вулиця: 14 Хдопп В. Согвігажед (о) (С) Місто: Сигасао о (Е) Країна: Тпне Ме(пегіапаз АпіШев (Р) Поштовий індекс (2ІР): немає (б) Телефон: 599-9-639300 (Н) Телефакс: 599-9-614129 (ії) Назва винаходу: Вкорочені на аміно-кінці КАМТЕ5З як антагоністи хемокінів (ії) Число послідовностей: 2 (Ф) (м) Форма комп'ютерного зчитування: г (А) Тип носія: гнучкий диск (В) Комп'ютер: ПК, сумісний з ІВМ во (С) Операційна система: РО-ЮОЗ/М5-БО5 (Ю) Програмне забезпечення: Раїепіїп КеїІеазе З 1.0, Мегзіоп 41.30 (ЕРО) (2) Дані послідовності 5ЕО ІО Мо: 1: (ії) Характеристики послідовності: (А) Довжина: 91 амінокислота (В) Тип: амінокислотна ве (С) Ланцюговість: (ОБ) Топологія: лінійна
(ї) Тип молекули: білок (ії) Гіпотетичність: немає (ім) Антисенсова: немає (у) Відмітна ознака: (А) Ім'я/ключ: Білок (В) Локалізація: 1..68 (хі) Опис послідовності ЗЕО ІО Мо: І: ую Ме уз Ма! Зег Аа Аа Ате Ге Аа Ма! Це Ген Не Аа Тіт Аа -20 -15 -10
Геч Суз Аа Рго Аїа 5ег Аіа 5еї Рго Тут 5ег 5ег А5р ТЛІ Ті Рго -5 1 5 у5 Сув Су Ріє Аа Тут Це Аа Аге Рто Гем Ртго Аге Аа Ніх Це Гуз юю 15 20 25
Сім Тут Рре Тут Тнг бет Сіу цу Сувз бег Ап Рго Аа Уа! Ма! Ріє 30 35 40
Маї Тіг Ате Був Асп. Аге Сп Маї Суз Аа Аєп Рго СПИ. ух ув Тгр 45 50 55
Уаї Атр, ОЇй Тут Ме Азп Зег Тем Си Меї 5ег 60 65 сч (2) Дані послідовності ЗЕО ІЮ Мо: 2: о (І) Характеристики послідовності: (А) Довжина: 66 амінокислот (В) Тип: амінокислотна (С) Ланцюговість: о (2) Топологія: лінійна со (ї) Тип молекули: білок (ії) Гіпотетичність: немає о (ім) Антисенсова: немає с (хі) Опис послідовності ЗЕО ІЮ Мо: 2: з Туг бет бег Авр Тік Тіт Рго Сув Су Ріє Аа Тут Пе Аа Аге Рго те
І 5 | 10 15
Пец Рго Аге Аа Ні Ле Гуз Си Тут Ріє Тут Тпг 5ет СПУ Су5 Су « з 20 25 30 з с бег А5п Рго Аа Ма! Уаї Рпе Ма! Тіг Ате Гуз Ап Агр, Сп Маї Сув :» 35 40 45
Аа Азп Рто Сів Муз Гуз Ттр Ма! Агео Си Тут Пе Авп 5ег Геч Сід 60 і Меї бег о 65 о ВАМТЕ5 50 - со -23 14 ме, МКУБААККАУ ТІЕТАТАПСАР А5ЗАБРУБ5ЗОТ ТРОСЕДХУІЇАВ РІРВБАНІКЕХ ЕЖУТ5СсСКОо5МР
АУМЕМТЕКМК ОМОІАМНРЕККИ МАБТУІЇМЗТЕМ 5 55 68 о Фіг. 1 іме) 60 б5 ав ши о 20 ю Що 35
Ж оз І рі 15 Те 25 ' А ; Ї
З 20 со 15
З 10 | у й ве Б зи і о пишне ут тон тет й зо 1 З 10 30 100 300 1000 ій
Концентрація КАМТЕЗ (нг/мл) ій
І Кк
Фіг. 2 «
З с з щ 45 (95) (ав) со 50 2
Ф) ко
710 нн | - ду 120 у с . о 100 ня 50 й , її БО у є 40 | у ! оч Ї 20 - 7 с 0 - | о 1 З 1030 400 300 4000 з Концентрація КАМТЕ5 (нг/мл) Ф г) " (ав)
Фіг. З Ід ща « - с з щ 45 (65) (ав) со 50 і) (Ф, ко
Фо 100 . 5 т сл 80 ш
Є т то «Во яку | В,
Б в я и шля, щ дю ШЕ гОЖ буга ПІН І я шо Б, пе ІІ СІ ЖЕ ша с о Еко карний нас є НЕ пф и КЕШ лав о з Гі в к вд: і те пешертнюї ЗЕ Вал НІЛ
ОО, 20 зи Енн Шин в то жо 40 --е Шен 0 Ве с б й ПЕ Еш хо вт три ще МоОлтЕНОо ож Зо зт Яхве ут т ДЕ т 2 о сани йснмайиаиняяй Ок
Є о ч са Фо т 8 ее 8 б ци с З є уфер КАМТЕ5 (1-68) ВАМТЕЗ5 (3-68) з й Концентрація першого стимулятора (нг/мл) -І
ГХ) Фіг. 4 («в) о 50 (42) є. іме) 60 б5
ДО стен Я 5 Я я Я г: щ о | . ї хо 30 о 10 Ф 25 | і о
І Щ Кк. о 20 дет І т б ЕНН 15 «її ЕН ее
Е і, шо ло - ! ся
І : ї. г. М хх 5 -
Ку
Гак я сяк ж 25 ДЖ ва 8588 8555 во о
МОСР-З3 гескАМТЕ5 (1-68) гесКАМТЕ5 (3-68) (КАМТЕЗ5 (3-68) концетрація хемокінів (нг/мл) о 30 - г) ! фіг. 5 о 100 2-й со 35 їч- ссві1 ссв5 ж т ї-- їх --е . --ще- Еена с 7 наз БЕЖ шення «7 в щ- |. ;» ЩО б БЕ ЕБб.» ЕЕ
ЕЕ во яз5 Фо ва й ЕЕ . -і З ш і ЕЕ ес БЕ ЗІ. г т» ВЕ». ЕВ со жо БЕ ББЕЕ- Енея жо 20 Еємннвеея з ВВ - 5-8 вн. 0-0 5 Жш З. - 0 НН Бен о ж вве вве вв? ваг іме) то- іо Ша Фо- Зоо-
КАМТЕ5 (1-68) РКАМТЕЗБ (3-68) КАМТЕЗ5 (1-68) КАМТЕ5 (3-68) бо концетрація першого стимулятора (нг/мл)
Фіг. 6 б5
НАМТЕ5(1-68) НАМТЕЗ5(3-68) с ши НН - т ЕЕНЕВ Енея вт
ЗЕБЕ вра
Є, 15 з00о ЕЕ, х БЕ. см ЕЕ Бен БЕ Ей а Ежженю Кешеваннт БЕ:
Ф | пев Бен: 20 ЕЗ ЕЕ БЕ нн
Фі 2000 -- Б. шо шо 2» в . Ен см о Евра ЕЕ | ЕЕ о
С лооо Бере . о
ЕЕ 0 БЕЗ со
ЕН Ен ня шт ЕЕ ЕЄнвна о - . Бі я ЕЕ БЕ о 1000 200 40 8 1.5 0 т000 200 40 8, 1,6 0 о - т
Концентрація (нг/мл; , «
Фіг. 7 З с з -І о о о 50 о (Ф) о) бо б5 вопоо
ВАНТЕБ(1.68) І)АнТЕВ(3-88) у І .
З че
Я. восов ! т й - | ! хх Щ о. и
Що моро І
Е т « г
Ф
Ге! :
Фе ще в і-й ше с 20009 ї і п. ше З - Ще Еш шо НЕ Шо о п. п- 7 і Е т 130 25 5.1 1.0 4,2 0 136 26 5.2 1.0 0.2 с ;
Концентрація (нг/мл) о - | т о ваосо : - ;
МІЕР-1(1.70) МіР-145-70) со (ав) - со
КЗ т . (щ БОооо -
Чий
Фо: « о ї «
С3.абосо ! З
І а 8 75 бо 0000 : -ч Є -і о ! о ї (ее) 50 о - 130 16 5,1 1.0 00.2 б 1360 27 З.4 1,1 0,2 0 о Концентрація (нг/мл) фіг. 8 (Ф. ко 60 65
А г - - й і Ще -е24 НЯ 0.4 -3 85 0.35 ноз. сра сс рн зІД- с Я с ва з нин У РЕД ИЧИ 2 сення пути бо! те ою? ою бота! оавй зо? ою т е е е - - ри р щі -
Б Б - д Ка - о ше чо пов ; - 2 ві 24, гЕ--- - - О87.срассні п о дн о Жертви т юю! ще ою? рю коза! зо? ою? ої о Й о . ре і 4 це в з - що е3 2 сч ня с 2 " 0.3 «а а, МКик гі 2 ї-- | о мб зо ою ої юю! чле? о ' о 7 изотип пар шмАЮ против С026 со доль ї , й . о
Відносна флуоресценція в червоному діапазоні Ід
Фіг. 9 те « - с з -І г) о о 50 о (Ф) т бо 65
-88 дАМТЕБ(3-58) пАМТЕБ(1-58) аАМмТЕВ(1-58) різ зСс026 нин т 25000 70 Е І т І г. -
ЕЕ о т й - ке) . о - . о. пр « 10000 -. ру ' - . і (8)
Н | «в) | | со 0 ; о 76 5,21.0 0 («в») 11.0 0.13 130 25 5.11.0 0 130 25 5 со
ВАМТЕ5 (пМ) ї- ші с 2» -і - о Бівигте 10 («в) бо о
Claims (11)
1. Усічений по амінокінцю КАМТЕБ5, у якому відсутні МН о-кінцеві амінокислоти, що відповідають амінокислотним залишкам 1-2 природного КАМТЕЗ, і який має антагоністичну активність відносно хемокінів.
2. Усічений по амінокінцю КАМТЕЗ за п.1, що має амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮО Мо: 2.
3. Усічений по амінокінцю КАМТЕЗ за п. 1 або 2 у глікозилованій формі. (Ф)
4. Усічений по амінокінцкю КАМТЕЗ5 за будь-яким з пп. 1-3 для застосування як лікарський засіб. ГІ
5. Усічений по амінокінцю КАМТЕЗ за будь-яким з пп. 1-3, придатний для виготовлення лікарського засобу для терапії і/або діагностики захворювань, при яких потрібна антагоністична активність відносно хемокінових во ефектів.
6. Усічений по амінокінцкю КАМТЕЗ за п. 5, придатний для виготовлення лікарського засобу для лікування запальних захворювань, ВІЛ-інфекції, захворювань, асоційованих з ангіогенезом і гемопоезом, та пухлин.
7. Молекула ДНК, що містить послідовність ДНК, яка кодує усічений по амінокінцю КАМТЕЗ за будь-яким з пп. 1-3, включаючи нуклеотидну послідовність, що кодує по суті той же білок. 65
8. Експресуючий вектор, що містить молекулу ДНК за п. 7.
9. Клітина-хазяїн, що містить експресуючий вектор за п. 8.
10. Рекомбінантний спосіб одержання білка за будь-яким з пп. 1-3, який включає культивування клітин згідно з п. 9 у відповідному культуральному середовищі.
11. Фармацевтична композиція, що містить білок за будь-яким з пп. 1-3 у поєднанні з одним або декількома фармацевтично прийнятними носіями і/або наповнювачами. Офіційний бюлетень "Промислоава власність". Книга 1 "Винаходи, корисні моделі, топографії інтегральних мікросхем", 2005, М 6, 15.06.2005. Державний департамент інтелектуальної власності Міністерства освіти і науки України. с щі 6) «в) (ее) «в) (зе) і - -
с . и? -І (95) («в) ге» ШИ (42) іме) 60 б5
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP97116863A EP0906954A1 (en) | 1997-09-29 | 1997-09-29 | Amino-terminal truncated c-c chemokines as chemokine antagonist |
| EP98104216A EP0905241A1 (en) | 1997-09-29 | 1998-03-10 | Amino-terminally truncated c-c chemokines as chemokine antagonists |
| PCT/EP1998/006143 WO1999016877A1 (en) | 1997-09-29 | 1998-09-28 | Amino-terminally truncated rantes as chemokine antagonists |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| UA73080C2 true UA73080C2 (en) | 2005-06-15 |
Family
ID=8227408
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| UA2000042496A UA73080C2 (en) | 1997-09-29 | 1998-09-28 | Amino-terminally truncated rantes as chemokine antagonists |
| UA2000042499A UA73081C2 (en) | 1997-09-29 | 1998-09-28 | Amino-terminally truncated mcp-2 as chemokine antagonists |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| UA2000042499A UA73081C2 (en) | 1997-09-29 | 1998-09-28 | Amino-terminally truncated mcp-2 as chemokine antagonists |
Country Status (28)
| Country | Link |
|---|---|
| US (5) | US6977071B2 (uk) |
| EP (6) | EP0906954A1 (uk) |
| JP (2) | JP4230659B2 (uk) |
| KR (2) | KR100542934B1 (uk) |
| CN (3) | CN1145693C (uk) |
| AR (2) | AR013529A1 (uk) |
| AT (3) | ATE368742T1 (uk) |
| AU (2) | AU750341B2 (uk) |
| BG (2) | BG64679B1 (uk) |
| BR (2) | BR9812565A (uk) |
| CA (2) | CA2304827A1 (uk) |
| CY (1) | CY1110927T1 (uk) |
| CZ (2) | CZ299478B6 (uk) |
| DE (3) | DE69823218T2 (uk) |
| DK (3) | DK1439231T3 (uk) |
| EA (2) | EA003940B1 (uk) |
| EE (2) | EE200000151A (uk) |
| ES (3) | ES2215324T3 (uk) |
| HU (2) | HU226414B1 (uk) |
| IL (2) | IL135352A (uk) |
| NO (2) | NO20001584D0 (uk) |
| NZ (3) | NZ503235A (uk) |
| PL (2) | PL197569B1 (uk) |
| PT (3) | PT1021541E (uk) |
| SK (2) | SK286495B6 (uk) |
| UA (2) | UA73080C2 (uk) |
| WO (2) | WO1999016877A1 (uk) |
| ZA (2) | ZA988676B (uk) |
Families Citing this family (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6989435B2 (en) | 1997-09-11 | 2006-01-24 | Cambridge University Technical Services Ltd. | Compounds and methods to inhibit or augment an inflammatory response |
| US7067117B1 (en) | 1997-09-11 | 2006-06-27 | Cambridge University Technical Services, Ltd. | Compounds and methods to inhibit or augment an inflammatory response |
| WO1999028474A2 (en) * | 1997-12-01 | 1999-06-10 | The Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary Of Health And Human Services | Chemokine variants and methods of use |
| US7238711B1 (en) | 1999-03-17 | 2007-07-03 | Cambridge University Technical Services Ltd. | Compounds and methods to inhibit or augment an inflammatory response |
| EP1167527A1 (en) * | 2000-06-22 | 2002-01-02 | Euroscreen S.A. | Processed human chemokines PHC-1 and PHC-2 |
| DE60030749T2 (de) * | 1999-10-25 | 2007-09-20 | Pharis Biotec Gmbh | Prozessiertes menschliches chemokin phc-1 |
| WO2001036459A2 (en) * | 1999-11-15 | 2001-05-25 | Forssmann Wolf Georg | Novel use of hcc-2 |
| CA2316405A1 (en) * | 2000-05-26 | 2001-11-26 | Ian Clark-Lewis | Modulation of inflammation by protease products |
| EP1176200A3 (de) | 2000-06-20 | 2005-01-12 | Switch Biotech Aktiengesellschaft | Verwendung von Polypeptiden oder diese kodierende Nukleinsäuren zur Diagnose oder Behandlung von Hauterkrankung oder Wundheilung sowie ihre Verwendung zur Indentifizierung von pharmakologisch aktiven Substanzen |
| UA77950C2 (en) * | 2000-10-04 | 2007-02-15 | Applied Research Systems | Use of mutants of cc chemokines for treatment of multiple sclerosis |
| GB2373785A (en) * | 2001-03-28 | 2002-10-02 | Rega Inst For Medical Res | Truncating chemokines using dipeptidyl peptidase IV |
| EP1458756B1 (en) | 2001-12-17 | 2009-01-28 | Laboratoires Serono SA | Chemokine mutants acting as chemokine antagonists |
| WO2004104216A2 (en) * | 2003-05-21 | 2004-12-02 | Bayer Healthcare Ag | Diagnostics and therapeutics for diseases associated with dipeptidylpeptidase iv (dpp4) |
| DE102005049637A1 (de) * | 2005-10-14 | 2007-04-26 | Rheinisch-Westfälische Technische Hochschule Aachen | Antagonisten gegen die Interaktion von PF4 und RANTES |
| ES2453592T3 (es) | 2007-08-02 | 2014-04-08 | Novimmune Sa | Anticuerpos anti-RANTES y métodos de uso de los mismos |
| US20130053257A1 (en) * | 2010-02-08 | 2013-02-28 | Paul E. Oran | RANTES Multiplexed Assay, RANTES Variants Related to Disease, and RANTES Variants Related to Enzymatice Activity |
| CN102884194B (zh) | 2010-03-11 | 2015-07-22 | 健康研究股份有限公司 | 含增强免疫应答的Fc融合蛋白的方法和组合物 |
| TW201718851A (zh) * | 2015-09-18 | 2017-06-01 | 通用醫院公司 | 具有抗化學排斥(anti-fugetactic)性質之經修飾自然殺手細胞及其用途 |
| WO2019229615A1 (en) | 2018-05-28 | 2019-12-05 | Université De Genève | Methods of inhibiting cerebral inflammation |
| US11629196B2 (en) | 2020-04-27 | 2023-04-18 | Incelldx, Inc. | Method of treating SARS-CoV-2-associated hypercytokinemia by administering a human monoclonal antibody (PRO-140) that inhibits CCR5/CCL5 binding interactions |
| US11402391B2 (en) | 2020-12-21 | 2022-08-02 | Incelldx, Inc. | Methods of treating a long-hauler subject for chronic COVID-19 by administering a CCR5 or CCL5 antagonist |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH01265099A (ja) | 1987-10-08 | 1989-10-23 | Stichting Rega Vzw | 抗ｈｉｖ活性をもつ３’，−フルオロプリン−２’，３’−ジデオキシリボシド類 |
| US5739103A (en) * | 1993-11-12 | 1998-04-14 | Dana-Farber Cancer Institute | Chemokine N-terminal deletion mutations |
| FI972433A0 (fi) * | 1994-12-08 | 1997-06-06 | Glaxo Group Ltd | Rantes-peptidi ja fragmentteja sekä tätä sisältäviä tulehduksen hoitoon soveltuvia koostumuksia |
| AU1532697A (en) * | 1996-01-12 | 1997-08-01 | Genetics Institute Inc. | Beta-chemokine, h1305 (mcp-2) |
| JP2000508527A (ja) * | 1996-03-27 | 2000-07-11 | アイコス コーポレイション | 単球走化性タンパク質―５物質及び方法 |
| FR2748938B1 (fr) * | 1996-05-22 | 1998-07-31 | Pasteur Institut | Utilisation de molecules antagonistes de chemokines pour leur activite antivirale notamment contre un retrovirus de type vih |
| US6168784B1 (en) * | 1997-09-03 | 2001-01-02 | Gryphon Sciences | N-terminal modifications of RANTES and methods of use |
-
1997
- 1997-09-29 EP EP97116863A patent/EP0906954A1/en not_active Withdrawn
- 1997-12-19 EP EP97122471A patent/EP0905240A1/en not_active Withdrawn
-
1998
- 1998-03-10 EP EP98104216A patent/EP0905241A1/en not_active Withdrawn
- 1998-09-22 ZA ZA9808676A patent/ZA988676B/xx unknown
- 1998-09-22 ZA ZA9808675A patent/ZA988675B/xx unknown
- 1998-09-28 SK SK451-2000A patent/SK286495B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1998-09-28 AU AU97474/98A patent/AU750341B2/en not_active Ceased
- 1998-09-28 EP EP98947553A patent/EP1021541B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-09-28 AU AU94420/98A patent/AU750606B2/en not_active Ceased
- 1998-09-28 ES ES98947553T patent/ES2215324T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-09-28 NZ NZ503235A patent/NZ503235A/xx unknown
- 1998-09-28 ES ES04007579T patent/ES2287601T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-09-28 DK DK04007579T patent/DK1439231T3/da active
- 1998-09-28 EP EP04007579A patent/EP1439231B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-09-28 HU HU0003505A patent/HU226414B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1998-09-28 CZ CZ20001146A patent/CZ299478B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1998-09-28 ES ES98951476T patent/ES2218860T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-09-28 EE EEP200000151A patent/EE200000151A/xx unknown
- 1998-09-28 KR KR1020007003020A patent/KR100542934B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 1998-09-28 CA CA002304827A patent/CA2304827A1/en not_active Abandoned
- 1998-09-28 HU HU0003563A patent/HU226468B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1998-09-28 CA CA002305017A patent/CA2305017A1/en not_active Abandoned
- 1998-09-28 SK SK450-2000A patent/SK286439B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1998-09-28 KR KR1020007003019A patent/KR100560275B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 1998-09-28 DE DE69823218T patent/DE69823218T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-09-28 UA UA2000042496A patent/UA73080C2/uk unknown
- 1998-09-28 PT PT98947553T patent/PT1021541E/pt unknown
- 1998-09-28 BR BR9812565-6A patent/BR9812565A/pt not_active Application Discontinuation
- 1998-09-28 WO PCT/EP1998/006143 patent/WO1999016877A1/en not_active Ceased
- 1998-09-28 WO PCT/EP1998/006142 patent/WO1999016876A1/en not_active Ceased
- 1998-09-28 UA UA2000042499A patent/UA73081C2/uk unknown
- 1998-09-28 EA EA200000379A patent/EA003940B1/ru not_active IP Right Cessation
- 1998-09-28 PT PT98951476T patent/PT1019507E/pt unknown
- 1998-09-28 AT AT04007579T patent/ATE368742T1/de active
- 1998-09-28 CN CNB988095696A patent/CN1145693C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1998-09-28 NZ NZ503234A patent/NZ503234A/en unknown
- 1998-09-28 AR ARP980104820A patent/AR013529A1/es active IP Right Grant
- 1998-09-28 PL PL339559A patent/PL197569B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1998-09-28 EA EA200000378A patent/EA003942B1/ru not_active IP Right Cessation
- 1998-09-28 AT AT98947553T patent/ATE264390T1/de active
- 1998-09-28 DK DK98947553T patent/DK1021541T3/da active
- 1998-09-28 DE DE69822856T patent/DE69822856T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-09-28 EE EEP200000152A patent/EE200000152A/xx unknown
- 1998-09-28 EP EP98951476A patent/EP1019507B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-09-28 CN CNB988095726A patent/CN1148447C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1998-09-28 AR ARP980104819A patent/AR013528A1/es active IP Right Grant
- 1998-09-28 NZ NZ516027A patent/NZ516027A/en unknown
- 1998-09-28 AT AT98951476T patent/ATE263242T1/de active
- 1998-09-28 JP JP2000513946A patent/JP4230659B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1998-09-28 JP JP2000513947A patent/JP4233214B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1998-09-28 PT PT04007579T patent/PT1439231E/pt unknown
- 1998-09-28 BR BR9812394-7A patent/BR9812394A/pt not_active Application Discontinuation
- 1998-09-28 CN CNB031492991A patent/CN1233415C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1998-09-28 DK DK98951476T patent/DK1019507T3/da active
- 1998-09-28 CZ CZ20001147A patent/CZ299479B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1998-09-28 DE DE69838188T patent/DE69838188T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-09-28 PL PL339545A patent/PL196427B1/pl not_active IP Right Cessation
-
2000
- 2000-03-22 BG BG104266A patent/BG64679B1/bg unknown
- 2000-03-22 BG BG104267A patent/BG64757B1/bg unknown
- 2000-03-27 NO NO20001584A patent/NO20001584D0/no not_active Application Discontinuation
- 2000-03-28 NO NO20001609A patent/NO20001609D0/no unknown
- 2000-03-28 US US09/537,858 patent/US6977071B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-03-28 US US09/537,859 patent/US6905676B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-03-29 IL IL135352A patent/IL135352A/en not_active IP Right Cessation
- 2000-03-29 IL IL135351A patent/IL135351A/en not_active IP Right Cessation
-
2005
- 2005-03-07 US US11/072,454 patent/US7326411B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2005-05-06 US US11/123,089 patent/US7338653B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2005-05-18 US US11/131,221 patent/US20050220790A1/en not_active Abandoned
-
2007
- 2007-10-08 CY CY20071101290T patent/CY1110927T1/el unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| UA73080C2 (en) | Amino-terminally truncated rantes as chemokine antagonists | |
| CA2690399C (en) | Il-6 antagonist peptides | |
| JP4813720B2 (ja) | ヒト循環ウイルス阻害ペプチド（ｖｉｒｉｐ）及びその使用 | |
| Vita et al. | Synthesis and characterization of biologically functional biotinylated RANTES | |
| US7361737B2 (en) | Mouse CXC chemokine receptor | |
| MXPA00002881A (en) | Amino-terminally truncated rantes as chemokine antagonists | |
| US20020064831A1 (en) | Nucleic acid sequences encoding CMG proteins, CMG proteins, and methods for their use | |
| Bethune | Distinct regions of viral macrophage inflammatory protein (vMIP)-II account for its unique ability to bind the three chemokine receptors CCR5, CXCR4 and CCR3 | |
| MXPA98010425A (en) | Uses of a chemiocine receiver to inhibit theinfection with human immunodeficiency viruses |