CZ301276B6

CZ301276B6 - Piperidinový derivát vykazující schopnost uvolnování rustového hormonu

Info

Publication number: CZ301276B6
Application number: CZ20004129A
Authority: CZ
Inventors: Kruse Hansen@Thomas; Ankersen@Michael
Original assignee: Novo Nordisk A/S
Priority date: 1998-05-11
Filing date: 1999-05-10
Publication date: 2009-12-30
Also published as: KR100593601B1; CN1300281A; PL194560B1; NO20005668D0; AU757217B2; ES2331102T3; EP1077941B1; CY1109626T1; RU2243215C2; UA72210C2; DK1077941T3; TWI222969B; SI1077941T1; BR9910329A; JP2004500312A; CN1142911C; JP2008156372A; CA2329881C; JP4142253B2; AU3701099A

Abstract

Piperidinový derivát vykazující schopnost uvolnovat rustový hormon u savcu. Tyto látky jsou aktivní složkou farmaceutických prípravku pro lécení onemocnení vyplývajících z nedostatku rustového hormonu.

Description

Piperidinový derivát vykazující schopnost uvolňování růstového hormonu

Oblast techniky

Vynález se vztahuje k novým sloučeninám, obzvláště 4,4-disubstituovaným a 3,3-disubstituovaným piperidinovým sloučeninám, přípravkům, které je obsahují, a jejich použití pro léčení zdravotních obtíží vyvolaných nedostatkem růstového hormonu.

io

Dosavadní stav techniky

Růstový hormon je hormon, který stimuluje růst všech tkání schopných růstu. Kromě toho je růstový hormon také znám tím, že má mnoho efektů na metabolické procesy, například stimulaci syntézy proteinů a mobilizace volných mastných kyselin a způsobuje přepínání v energetickém metabolismu z cukrů na metabolismus mastných kyselin. Nedostatek růstového hormonu může vyústit v mnohé vážné lékařské poruchy, jako je např. zakrslost.

Růstový hormon se uvolňuje z podvěsku mozkového. Uvolňování je pod přísnou kontrolou mno20 ha hormonů a neurotransmiterů, a to jak přímo, tak i nepřímo. Uvolňování růstového hormonu může být stimulováno hormonem uvolňujícím růstový hormon (GHRH) a inhibováno somatostatinem. V obou případech jsou hormony vylučovány z podvěsku mozkového, ale jejich působení je primárně mediováno prostřednictvím specifických receptorů umístěných v podvěsku mozkovém. Byly popsány i další sloučeniny, které stimulují uvolňování růstového hormonu z podvěsku mozkového. Například arginin, L-3,4-dÍhydroxyfenylalanin (L-Dopa), glukagon, vasopresin, PACAP (hypofyzní peptid aktivující adenylylcyklázu), agonisté muskarinových receptorů a syntetický hexapeptid, endogenní růstový hormon uvolňující GHRP (peptid uvolňující růstový hormon) buď přímým působením na podvěsek mozkový, nebo ovlivněním uvolňování GHRH a/nebo somatostatinem z hypotaiamu.

U poruch nebo u případů, kde je vyžadována snížená koncentrace růstového hormonu, Činí proteinová podstata růstového hormonu nemožným jiný způsob podávání než parenterální podávání. Kromě toho, další přímo působící přírodní Činidla stimulující produkci enzymů jako např. GHRH a PACAP jsou delší polypeptidy, u nichž je proto preferováno parenterální podávání.

Použití konkrétních sloučenin pro zvyšování koncentrace růstového hormonu u savců již bylo dříve navrženo např. v EP 18 072, EP 83 864, WO 89/07110, WO 89/01711, WO 89/10933, WO 88/9780, WO 83/02272, WO 91/18016, WO 92/01711, WO 93/04081, WO 95/17422, WO 95/17423, WO 95/14666, WO 94/19367, WO 95/34311, WO 96/02530, WO 96/15148,

WO 96/13265, WO 96/22997, WO 96/35713, WO 96/38471, WO 96/32943, WO 97/00894, WO 97/06803, WO 97/09060, WO 97/07117, WO 97/11697, WO 97/12620, WO 97/23508, WO 97/24369 a WO 97/34604.

Přípravky obsahující sloučeniny uvolňující růstový hormon jsou důležité pro jejich schopnost uvolňovat růstový hormon stejně jako pro jejich biodostupnost. Je tedy předmětem tohoto vynálezu zajištění nových sloučenin se schopností uvolňovat růstový hormon. Kromě toho je předmětem tohoto vynálezu zajištění nových sloučenin uvolňujících růstový hormon (činidlo stimulující produkci růstového hormonu), které jsou specifické a/nebo selektivní a nemají žádné nebo jen minimální vedlejší efekty, jako jsou uvolňování LH (luteinizační hormon), FSH (hormon stimu50 lující folikul), TSH (hormon stimulující štítnou žlázu), ACTH (adrenokortikotropní hormon), vasopresinu, oxytocinu, kortisolu a/nebo prolaktinu. Je také předmětem tohoto vynálezu zajištění sloučenin, které jsou dobře biodostupné orálním podáváním.

Podstata vynálezu

Souhrn vynálezu

V souladu s tímto vynálezem jsou zajištěny nové sloučeniny, které působí přímo na buňky podvěsku mozkového za normálních experimentálních podmínek in vitro a tím uvolňují růstový hormon.

Tyto sloučeniny schopné uvolňovat růstový hormon mohou být použity v in vitro výzkumných technikách pro porozumění, mimo jiné, jak je regulována sekrece růstového hormonu na úrovni podvěsku mozkového.

Kromě toho mohou být nové sloučeniny uvolňující růstový hormon podle tohoto vynálezu podávány in vivo za účelem zvýšení uvolňování endogenního růstového hormonu.

V širokém slova smyslu se tento vynález vztahuje k piperidinovým derivátům vybraným z:

methylamid l-{(2R)-2-[N“((2E)-5-amino-5-methylhex-2-enoyl)-N-methylamino]-3-(2naftyl)propionyl}-4-benzylpiperidin-4-karboxylové kyseliny

methylamid l-{(2R)-2-[N-((2E)-5-amino-3_J5-dimethylhex-2-enoyl)-N-methylamino]-3-(2naíty Qpropiony I }^T-benzy Ipiperídin—4-karboxy love kyseliny

methylamid l-{(2R)-2-[N-((2E)-5-ainino-5-methylhex-2-enoyl)-N_methylamino]-3-(bifenyl-4-yl)propionyl}-4-benzylpiperidin-4-karboxylové kyseliny

methylamid l-{(2R)-2“-[N-((2E)-5-amino-3,5-dimethylhex-2-enoyl)-N-methylaminoJ-3-(bi 5 fenyl^4-yl)propionyl}-4-benzylpiperidin-4-karboxylové kyseliny

methylamid l-{(2R}-2-[N-((2E)-4-(l-aminocyklobutyl)but-2-enoyl)_N-methylamino]-3-(bi fenyI-4-yl)propionyl}-4-benzylpiperidin-4-karboxylové kyseliny

2-amino-N-[( 1 R )-2-[4-benzyl-4XN\N'-dimethy Íhydrazinokarbony !)piperidin-l -vl}-l-({ 1H indol-3-yl)methyl)-2-oxoethyl]-2-methylpropionamid

2-amino-N-{(lR)-2-[(3R}-3-benzyl-3-(N\N'-dimethylhydrazinokarbonyl)piperidin-l-yl]5 1 -benzy loxymethyl-2~oxoethyl]-2-methy Ipropionamid

2-amino-N-{( 1 R>—2—[(3 R)-3-benzy l-3-(N ',N '-dimethy Íhydrazinokarbony l)piperidin-l -y ΟΙ-(( 1 H-indol-3-yl)methy l)-2-oxoethyl]-2-rnethy Ipropionamid

io ethylester l“{(2R)-2-[N-((2E)-5-amino-5-methylhex-2~enoyl)-N-methylamino]-3-(bifenyl 4-yl)propionyl}-4-benzylpiperidin-4-karboxyiové kyseliny

ethytester l-{(2R)-2-[N-((2E)-5-amino-3,5-dimethylhex-2-enoyl)-N-methylamino]-3-(bi fenyl-4-yl)propionyl}^M?enzylpiperidin-4-karboxylové kyseliny

ethylester l-{(2R)-2-[N-{(2E)-5-amino~5-tnethylhex-2*enoyl)-N-methylamíno]-3-(25 naftyI)propionyl}-4—benzylpiperidin-4-karboxylové kyseliny

ethylester l-{(2R)-2-[N^((2E)-5-amino-3,5-dimethylhex-2-enoyl)-N-methylamino]-3-(2 naftyl)propionyl}-4-benzylpiperidin-4~karboxyIové kyseliny

ethylester (3S)-l-[(2R)-2-((2E)-5-amino-5-methylhex-2-enoylamino)-3-{lH-indol-3-yl) propionyI]-3-benzylpiperidin-3-karboxylové kyseliny

- s _

CZ 301276 BÓ ethy lester (3 S)-1 -{(2R)-2-((2E}-5 - amino--3,5dimethy lhex-2-enoy lamino)-3-( 1H-indo!—3— yl)propionyl]-3-benzylpiperidin-3-karboxylové kyseliny

ethylester (3S)_l-[(2R)-2-(3-(aminomethyl)benzoylamino)-3-(l H-indol-3-yl)propionylj-3 5 benzylpiperidin-3-karboxylové kyseliny

N-{( 1 R)-2-[4-benzyM-(N \N'-dimethylhydrazinokarbonyl)piperidin-l-yl]-l-((2-naftyt)methyl-2~oxoethyl}-N-methylamid(2E)-5-amino-5-methylhex-2-enové kyseliny

ío N-[( 1 R)-2-[3-benzyl-3-(N',N'-diniethylhydrazinokarbonyl)piperidin-l-yl]-l-(l H-indol-3vl)methyl)-2-oxoethylJamid(2E)~5-amino-5-methylhex-2-enové kyseliny

N_{( 1 R)-2-[3-benzyl-3-(N ',N ^ř-dimethylhydrazinokarbonyl)piperidin-l -yl]—l—((2—naftyl)methyl-2-oxoethyl}-N-methylamid(2E>5-amino-5-rnethylhex-2-enové kyseliny

{(1 R)-2-[3-benzy l-3-(N',N'-dimethy lhydrazinokarbonyl)piperidin-l-y 1]-1 -(benzy loxy5 methyl)-2-oxoethyl}amid(2E)-5-amino-5-methylhex-2-enové kyseliny

2-amino~N-{2-[3-benzy l-3-(N' ,N'-dimethylhydrazinokarbonyOpiperidin-1-y 1]-1-((2naftyl)methyl)-2-oxoethyl]-2-methylpropionamid

ío 2-amino-N-{(lR)-2-[3-benzyl-3-(N',N^,-dimethylhydrazinokarbonyl)piperidin-l-yl]“14(bi fenyl—4-yl)methyl)-2-oxoethyl]-2-methylpropionamid

2-amino-N-{(lR)-2-[3--benzyl-3XN’,N'dimethylhydrazÍnokarbonyl)piperidin-l-vl]-l ((1 H-indol-3-yl)-methyl)-2-oxoethyl]-2-methylpropionamid

2-amino-N-{2-[3-benzyl-3-(N'-methyIhydrazinokarbonyl)pÍperidin-l-yl]-t-(benzyloxy5 methyl)-2-oxoethyl}-2-methylpropionamid

2-amino-N~{(lR)-2-[3-benzyl-3-(N-methylhydrazinokarbonyl)piperidin“l-yl]-l-((lHindol-3-yl)methyl)-2-oxoethyl]-2-methylpropionamid

io l-[(2R)-2-(2-amino-2-methylpropionylamino)-3-( 1 H-indol-3-yl)propionyl]-3-benzylpiperidin-3-karboxylová kyselina, (pyrrolidin-l-yt)amid

2-amino-N-{(lR)-2-[3benzyI-3-(N,N^r,NMrimethyIhydrazinokarbonyl)piperidin-l-yl]-l((1 H-indol-3-yl)methyl)-2-oxoethyl}-2-methylpropionaniid

a jejich farmakologicky akceptovatelné soli.

Sloučeniny podle tohoto vynálezu mohou mít jedno nebo více asymetrických center (chirální uhlíková centra) a jsou zamýšleny jako stereoizomery, proto jsou v rámci tohoto vynálezu zahrnuty separované stereoizomery, čisté nebo částečné čištěné stereoizomery nebo jejich racemické směsi.

Sloučeniny podle tohoto vynálezu mohou tvořit farmakologicky akceptovatelné soli vytvořené jako farmakologicky akceptovatelné adíění soli kyselin sloučenin, které zahrnují takové soli, které se připravují reakcí sloučenin s anorganickou nebo organickou kyselinou, jako je chlorovodík, bromovodík, kyselina sírová, kyselina octová, kyselina fosforečná, kyselina mléčná, kyselina maleinová, kyselina mandlová, kyselina fialová, kyselina citrónová, kyselina glutarová, kyselina glukonová, kyselina methansulfonová, kyselina salicylová, kyselina jantarová, kyselina vinná, kyselina toluensulfonová, kyselina trifluoroctová, kyselina sulfamová nebo kyselina filmařova a/nebo voda.

Sloučenina podle vynálezu může být podávána ve formě farmakologicky akceptovatelné adiční soli s kyselinou nebo, kde je to vhodné, jako sůl alkalického kovu nebo kovu alkalických zemin nebo alkylamonná sůl. Má se za to, že takovéto solné formy vykazují stejný stupeň aktivity jako volné báze.

V dalším aspektu se tento vynález vztahuje k farmakologickým přípravkům zahrnujícím jako aktivní složku sloučeninu podle vynálezu nebo její farmakologicky akceptovatelnou sůl společně s farmakologicky akceptovatelným nosičem nebo ředidlem.

Farmaceutické přípravky obsahující sloučeninu podle tohoto vynálezu mohou být připraveny pomocí konvenčních metod, např. popsaných v Remingtonů Pharmaceutical Sciences, 1985 nebo v Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19. Edition (1995). Přípravky mohou být v konvenčních formách, např. ve formě kapslí, tablet, aerosolů, roztoků, suspenzí nebo místních přípravků.

Použitý farmaceutický nosič nebo ředidlo mohou být konvenční tuhé látky nebo kapalné nosiče. Příklady tuhých nosičů jsou laktosa, terna alba, sacharosa, cyklodextrin, talek, želatina, agar, pektin, akácie, stearát horečnatý, kyselina stearová nebo nižší alkylethery celulózy. Příklady kapalných nosičů zahrnují sirup, arašídový olej, olivový olej, fosfolipidy, mastné kyseliny, aminy mastných kyselin, polyoxyethylen nebo voda.

Podobně, nosič nebo ředidlo může zahrnovat libovolný materiál s postupným uvolňováním známý v oboru, jako jsou glycerin monostearát nebo glycerín distearát samotný nebo ve směsi s voskem.

Je-li použit tuhý nosič pro orální podávání, přípravek může být tabletován, umístěn v tuhé želatinové kapsli v prášku nebo peletách nebo může být ve formě pastilek nebo bonbónků. Množství tuhého nosiče se bude široce lišit, bude ovšem obvykle od 25 mg do asi 1 g. Je-li použit kapalný nosič, mohou být přípravky ve formě sirupu, emulze, měkké želatinové kapsle nebo sterilní kapaliny pro injekci, jako jsou vodné nebo nevodné kapalné suspenze nebo roztoky.

Typická tableta může být připravena konvenční tabletovací technikou a může obsahovat:

io Jádro:

Aktivní sloučenina (jako volná báze nebo její sůl) 100 mg Koloidní oxid křemičitý (Aerosil) 1,5 mg

Celulóza, mikrokrystalická (Avicel) 70 mg

Modifikovaná celulózová guma (Ac-Di-Sol) 7,5 mg

Stearát horečnatý

Povlak:

HPMC (hydroxypropylmethylcelulóza) přibl. 9 mg ♦Mywacett 9-40 T přibl. 0,9 mg *Acylovaný monoglycerid použitý jako plastifikátor pro povlakový film.

Pro nasální podávání mohou přípravky obsahovat sloučeninu podle vynálezu rozpuštěnou nebo suspendovanou v kapalném nosiči, obzvláště ve vodném nosiči, pro aerosolové aplikace. Nosič může obsahovat aditiva, jako jsou činidla usnadňující rozpouštění, např. propylenglykol, surfaktanty, zesilovače absorpce, jako jsou lecithin (fosfatidylcholin) nebo cyklodextrin, nebo preservativa jako parabeny.

Obecně, sloučeniny podle tohoto vynálezu jsou podávány ve formě jednotkové dávky obsahující od 50 do 200 mg aktivní sloučeniny společně s farmaceuticky akceptovatelným nosičem.

Dávkování sloučenin podle tohoto vynálezu je vhodně od 0,01 do 500 mg za den, např. od asi

5 mg do asi 50 mg, asi 10 mg na dávku, je-li podávána pacientům (člověku) jako lék.

V dalším aspektu se tento vynález vztahuje k farmaceutickým přípravkům v jednotkové dávkové formě, zahrnující jako aktivní složku od asi 10 do 200 mg sloučeniny podle vynálezu nebo její farmaceuticky akceptovatelné soli,

Bylo ukázáno, že sloučeniny podle vynálezu vykazují schopnost vylučovat endogenní růstový hormon in vivo. Sloučeniny mohou být tedy použity pro léčení podmínek vyžadujících zvýšení koncentrace růstového hormonu v plazmě, jako je nedostatek růstového hormonu u lidí nebo u přestárlých pacientů nebo u dobytka.

V jednom aspektu se tedy tento vynález vztahuje k farmaceutickému přípravku pro stimulaci uvolňování růstového hormonu z podvěsku mozkového, přičemž přípravek zahrnuje jako aktivní složku sloučeninu podle vynálezu nebo její farmaceuticky akceptovatelnou sůl společně s farmaceuticky akceptovatelným nosičem nebo ředidlem.

Ještě v dalším aspektu se tento vynález vztahuje k použití sloučeniny podle vynálezu nebo farmaceutického přípravku pro přípravu léčiv pro stimulaci uvolňování růstového hormonu z podvěsku mozkového.

Λ

Odborníkům v oboru je známo, že použití růstového hormonu u lidí se může lišit a může být různorodé v závislosti na okolnostech. Tak, sloučeniny podle vynálezu mohou být podávány za účelem stimulace uvolňování růstového hormonu z podvěsku mozkového a měly by mít podobný efekt jako použití růstového hormonu samotného. Sloučeniny podle vynálezu jsou užitečné pro stimulaci vylučování růstového hormonu u starých pacientů, pro prevenci katabolických vedlejších účinků glukokortikoidů, prevenci a/nebo léčení osteoporosy, léčení chronického únavového syndromu (CFS), léčení akutního únavového syndromu a ztráta svalů po výběrové chirurgii, stimulaci imunitního systému, urychlení léčení poranění, urychlení nápravy fraktury kostí, urychlení fraktury kostí, např. distrakce osteogeneze, léčení atrofíe po zlomeninách, léčení růstové retardace, léčení růstové retardace vyplývající z nefunkčních ledvin nebo ledvinové nedostatečnosti, léčení kardiomyopatie, léčení chronického onemocnění jater, léčení trombocytopenie, léčení Crohnovy nemoci, léčení syndromu krátkého střeva, léčení chronické obstruktivní plicní nemoci (COPD), léčení komplikací po transplantacích, léčení fyziologického nízkého vzrůstu zahrnující dětský nedostatek růstového hormonu a nízký vzrůst spojený s chronickou nemocí, léčení obezity a růstové retardace spojené s obezitou, léčení anorexie, léčení růstové retardace spojené s Prader-Willi syndromem a Turnérovým syndromem; zvyšování rychlosti růstu u pacientů majících částečně syndrom nesensitivity, což vede k urychlení rychlosti vyléčení a ke zkrácení hospitalizace u pacientů; léčení retardace intrauterinní, skeletální dysplasie, hyper20 kortikolismus a Cushingův syndrom; zavedení pulzujícího uvolňování hormonu, náhrada růstového hormonu u stresovaných pacientů, léčení osteochondrodysplasíe, Noonanův syndrom, schizofrenie, deprese, Alzheimerovy nemoci, odložené léčení při poranění a psychosociální deprivace, léčení pulmonámí dysfunkce, léčení nesprávné srdeční funkce, léčení nebo prevence infarktu myokardu, snížení krevního tlaku, ochrana proti ventrikulámí dysfunkci nebo prevenci reperfuze, léčení dospělých při chronické dialýze, zmírnění katabolické odezvy po velkých chirurgických zákrocích, snížení kachexie a ztráty proteinů díky chronické nemoci, jako je rakovina nebo AIDS; léčení hyperinsulinemie včetně nesidioblastosy, léčení indukce ovulace, ke stimulaci hypoťyzního rozvoje a pro prevenci ochabování thymických bází, léčení pacientů se sníženým stupněm thyminové funkce, léčení sarkopenie, léčení ochabnutí vyplývajících z AIDS, upravení svalového tonusu, tloušťku svalové pohyblivosti, metabolická homeostáze, renální homeostáze, stimulaci osteoblastů, remodelování kostí a růst chrupavek, regulace příjmu potravin, stimulace imunitního systému v souvislosti se zvířaty, léčení poruch při stárnutí doprovázejících zvířat, povzbuzení růstu u domácího zvířectva a stimulace růstu vlny u ovcí, léčení metabolického syndromu (syndrom X), léčení insulinové resistence, včetně NIDDM (diabetes mellitus nezávislý na inzulínu), u savců, to jest u lidí, zlepšení kvality spánku, korekce relativního hyposomatotropismu při stárnutí vzhledem k vysokému zvýšení REM rychlých pohybů očí) spánku a snížení REM latence a léčení hypothemie. Léčení je také zamýšleno tak, aby obsahovalo profylaktické léčení.

Pro výše uvedené indikace se budou dávky lišit v závislosti na použité sloučenině podle vynálezu, na způsobu podávání a na požadované terapii. Ovšem, obecně se budou denní dávky podávané pacientům nebo zvířatům za účelem uvolnění endogenního růstového hormonu pohybovat mezi 0,0001 a 100 mg/kg hmotnosti těla. Kromě toho, sloučeniny podle vynálezu nemají žádné nebo jen malé vedlejší efekty, jsou—li podávány ve výše uvedených dávkách, přičemž těmito efekty jsou např. uvolňování LH, FSH, TSH, ACTH, vasopresinu, oxytocinu, kortisolu a/nebo prolaktinu. Obvykle dávkové formy vhodné pro podávání orální, nasální, pulmonální nebo transdermální zahrnují od 0,0001 mg do asi 100 mg, s výhodou od 0,001 do 50 mg sloučeniny podle vynálezu smíchané s farmaceuticky akceptovatelným nosičem nebo ředidlem.

Farmaceutický přípravek podle tohoto vynálezu může také případně obsahovat sloučeninu podle vynálezu kombinovanou s jednou nebo více sloučeninami vykazujícími jinou aktivitu, např. antibiotika nebo jiný farmakologicky aktivní materiál.

1

Způsob podávání může být libovolný způsob, který účinně transponuje aktivní sloučeninu na vhodné nebo požadované místo, tedy orální, nasální, pulmonámí, transdermální nebo parenterální, přičemž orální cesta je preferována.

Kromě farmaceutického využití mohou být sloučeniny podle vynálezu užitečné jako in vitro prostředky pro výzkum regulace uvolňování růstového hormonu.

Sloučeniny podle vynálezu mohou být také užitečné jako in vivo prostředky pro vyhodnocování schopnosti uvolňovat růstový hormon z hypoťyzy. Například, vzorky séra odebrané před a po io aplikaci těchto sloučenin pacientům mohou být testovány na koncentraci růstového hormonu.

Srovnání růstového hormonu v každém vzorku séra by přímo určilo schopnost pacientovy hypofyzy uvolňovat růstový hormon.

Sloučeniny podle vynálezu mohou být podávány komerčně důležitým zvířatům za účelem zvýše15 ní rychlosti růstu a zvýšení produkce mléka.

Další využití sloučenin podle vynálezu schopných povzbudit vylučování růstového hormonu spočívá v kombinaci s dalšími podobnými látkami, jako je GHRP (2 nebo 6), GHRH a jeho analogů, růstového hormonu a jeho analogů nebo somatomedinů včetně IGF-l a IGF-2.

Farmako logické metody

Sloučeniny podle vynálezu mohou být vyhodnoceny in vitro na jejich účinnost a schopnost uvolňovat růstový hormon v primární kultuře krysí hypofyzy, přičemž toto stanovení může být prove25 děno podle následujícího popisu.

Izolace buněk krysí hypoťyzy je modifikací postupu O. Sartor et al., Endocrinology 116, 1985, str. 952-957. Samci albínů kiys Sprague-Dawley (250 +/- 25 g) byli získáni od Mollegaard, Lilie Skensved, Dánsko. Krysy byly pěstovány v klecích po skupinách (čtyři zvířata na klec) a umístěny do místnosti s 12 hod denním cyklem. Teplota místnosti se pohybovala od 19 do °C a vzdušná vlhkost od 30 do 60 %.

Krysy byly usmrceny a byla vybrána hypofyza. Byly odstraněny neurointermediální laloky a zbývající tkáň byla ihned umístěna do ledem chlazeného ledového pufru (Geyovo médium) (Gibco

041-04030) doplněném s 0,25% D-glukózou, 2% neesenciálními aminokyselinami, 1% albuminem kravského séra (BSA) (Sigma A-4503). Tkáň byla nakrájena na malé kousky a převedena do izolačního pufru doplněném s 3,8 mg/ml trypsinu (Worthington #3707 TRL-3) a 330 mg/ml DNasou (Sigma [>4527). Tato směs byla inkubována při 70 otáčkách za minutu po dobu 35 minut při teplotě 37 °C v atmosféře kyslíku a oxidu uhličitého v poměru 95:5. Tkáň byla poté třikrát promyta výše uvedeným pufrem. S využitím standardní Pasterovy pipety byla poté tkáň nasáta na jednotlivé buňky. Po dispergaci byly buňky zfiltrovány přes nylonový filtr (160 nm) za účelem odstranění nestrávených buněk. Suspenze buněk byla třikrát promyta s izolačním pufrem doplněným s inhibitorem tiypsinu (0,75 mg/ml, Worthington #2829) a konečně znovu suspendována v kultivačním médiu, DMEM (Gibco 041-01965) doplněný s25 mM HEPES (Sigma H45 3375), 4mM glutaminu (Gibco 043-05030H), 0,75% hydrogenuhličitanu sodného (Sigma S8875), 0,1% neesenciálních aminokyselin, 2,5% séra telecího plodu (FCS, Gibco 011- 06290), 3 % koňského séra (Gibco 034-06050), 10% čerstvého kiysího séra, 1 nM T₃ (Sigma T-2752) a 40 mg/1 dexamethasonu (Sigma D-4902) pH 7,3, s hustotou 2x10⁵ buněk/ml. Buňky byly přeneseny do mikrotitračních destiček (Nunc, Dánsko), 200 ml/jamku, a kultivovány po 3 dny při teplotě 37 °C a 8 % CO₂,

Testování sloučenin

Po kultivaci byly buňky promyty dvakrát se stimulačním pufrem (Hanksův vyvážený solný roz55 tok (Gibco 041-04020) doplněný s 1% BSA (Sigma A—4503), 0,25% D-glukózou (Sigma GCZ 301276 Bó

5250) a 25 mM HEPES (Sigma H-3375) pH 7,3) a preinkubovány po dobu 1 h při 37 °C, Pufr byl zaměněn za 90 ml stimulačního pufřu (37 °C), bylo přidáno 10 ml roztoku testované látky a na deskách bylo inkubováno 15 min při 37 °C a 5% CO₂. Médium bylo dekantováno a analyzováno na obsah GH v rGH SPA testovacím systému.

Všechny sloučeniny byly testovány v dávkách pohybujících se od 10 pM do 100 mM. Závislost na dávce byla zkonstruována s využitím Hillovy rovnice (Obr. P, Bíosoft). Účinnost (maximální uvolněný GH, E^) byla vyjádřena v % GHPR-6. Účinnost (EC_S0) byla určena jako koncentrace, při níž dochází k polovině maximální stimulace uvolňování GH.

Sloučeniny podle vynalezu mohou být vyhodnoceny na jejich metabolickou stabilitu s využitím níže popsané procedury:

Sloučeniny se rozpustí při koncentraci 1 mg/ml ve vodě. 25 ml tohoto roztoku je přidáno do i5 175 ml odpovídajícího enzymového roztoku (vedoucího k poměru enzym/substrát (w/w) přibližně 1:5). Roztok se ponechá přes noc při 37 °C. 10 ml různých degradačních roztoků je analyzováno oproti odpovídajícímu nulovému vzorku s využitím injekční elektrospray hmotové spektroskopie (ESMS) s monitorováním vybraného molekulárního iontu. Jestliže signál poklesl o více než 20 % ve srovnání s nulovým vzorkem, je zbývající roztok analyzován pomocí HPLC a hmo20 tové spektroskopie za účelem přesné identifikace rozsahu a místa degradace.

Několik standardních peptidů (ACTH 4-10, Angiotensin 1-14 a Glukagon) bylo zahrnuto do testů stability za účelem ověření schopností různých roztoků degradovat peptidy.

Standardní peptidy (angiotensin 1-14, ACTH 4-10 a glukagon) byly získány od firmy Sigma (MO, USA).

Enzymy (trypsin, chymotrypsin, elastása amínopeptídáza M a karboxypeptidáza Y a B) byly získány od firmy Boehringer Manheim GmbH (Mennheim, Německo).

Pankreatická enzymová směs: trypsin, chymotrypsin a elastáza ve 100 ml hydrogenuhličitanu amonného pH 8.0 (všechny koncentrace 0,025 mg/ml).

Karboxypeptidázová směs: karboxypeptidáza Y a B v 50 ml octanu amonného pH 4,5 (všechny koncentrace 0,025 mg/ml).

Roztok aminopeptidázy M: aminopeptidáza M (0,025 mg/ml) ve 100 mM hydrogenuhličitanu sodného při pH 8,0.

Hmotnostní spektrometrická analýza byla prováděna s využitím dvou různých spektrometrů. Sciex API III LC-MS s trojitým kvadrupolem (Sciex Instruments, Thomhill, Ontario) vybavený s elektrosprejem a přístroj Bio-Ion 20 time-of-flight Plasma Desorption (Bio-Ion Nordic AB, Uppsala, Švédsko).

Kvantifikace sloučenin (před a po degradaci) byla prováděna na přístroji API III s využitím single ion monitoringu molekulárního iontu s flow injektáží analytu. Tok kapaliny (MeOH (methyl alkohol) : voda 1:1) 100 ml/min byla kontrolována pomocí ABI 140B HPLC jednotky (Perkin-Elmer Applied Biosystems Dívisions, Poster City, CA), Parametry přístroje byly nastaveny na provozní podmínky a SIM monitoring byl prováděn s využitím nej intenzivnějšího mole50 kulámího iontu (ve většině případů odpovídá dvojnásobně nabitému molekulárnímu iontu).

Identifikace degradačních produktů kromě toho zahrnovala použití hmotnostní spektrometrie s plazmovou desorpcí (PDMS) s aplikací vzorku na terčík potažený nítrocelulózou a se standardním nastavením přístroje. Přesnost takto určených hmot je obecně lepší než 0,1 %.

i τ

Separace a izolace degradačních produktů byla provedena s využitím HY-TACH C-18 reversní fáze 4,6 x 105 mm HPLC kolony (Hewlett-Packard Company, Palo Alto, CA) se standardním separačním gradientem acetonitriLTFA. Použitý HPLC systém byl HP1090M (Hewlett-Packard Company, Palo Alto, CA).

Peptidový derivát	MW/SIM ion (AMU)	Kaiboxypeptidázová směs	Pankreatická enzymová směs
Standardy
ACTH4-10	1124,5/562,8	+	-
Glukagon	3483/871,8	-	-
Insulin (B23-29)	859,1/430,6
Angiotensin 1-14	1760,1/881,0	-	-
GHRP-2	817,4/409,6	-	-
GHRP-ó	872,6/437,4	-	-

+: Stabilní (méně než 20% snížení SIM signálu po 24 h v degradačním roztoku)

Nestabilní (více než 20% snížení SIM signálu po 24 h v degradačním roztoku) io

Příklady provedení vynálezu

Přípravy sloučenin podle vynálezu jsou dále ilustrovány pomocí příkladů, které však nejsou zamýšleny jako limitující pro tento vynález.

Struktury sloučenin jsou potvrzeny pomocí buď HPLC, NMR (Bruker 400 MHz) nebo LC-MS. NMR posuny (6) jsou udány v parts per milion (ppm) a jsou uvedeny pouze vybrané píky. Mp označuje teploty tání a jsou udány v °C. Sloupcová chromatografíe byla prováděna s využitím techniky popsané v W. C. Still et al., J. Org. Chem., 1978, 43, 2923-2925 na silikagelu Merck silica gel 60 (Art 9385). Sloučeniny použité jako výchozí materiály jsou buď známé, nebo mohou být snadno připraveny metodami známými v oboru, Roztok methanol/amoniak je 10% roztok amoniaku v methanolu.

HPLC analýzy:

Metoda A1.

Analýza na reverzní fázi byla provedena s využitím UV detekce při 214, 254, 276 a 301 nm na koloně 218TP5 4,6 mm x 250 mm 5m C~18 silikagelu (The Separations Group, Hesperia), která byla eluována při 1 mi za minutu při 42 °C. Kolona byla ekvilibrována s 5% acetonitrilem v pufru obsahujícím 0,1 M síranu amonného, který byl adjustován na pH 2,5 se 4M kyselinou sírovou a po nastříknutí byl vzorek eluován gradientem 5% až 60% acetonitrilu ve stejném pufru během 50 min.

Metoda Bl.

Analýza na reverzní fázi byla provedena s využitím UV detekce při 214, 254, 276 a 301 nm na koloně 218TP5 4,6 mm x 250 mm 5m C-18 silikagelu (The Separations Group, Hesperia), která byla eluována při 1 ml za minutu při 42 °C. Kolona byla ekvilibrována s 5% (acetonitril + 0,1%

TFA) ve vodném roztoku TFA ve vodě (0,1 %). Po nastříknutí byl vzorek eluován gradientem 5% až 60% (acetonitril + 0,1% TFA) ve stejném pufru během 50 min.

LC-MS analýza:

LC-MS analýza byla prováděna na PE Sciex API 100 LC/MS Systém s využitím kolony Waters® 3 mm x 150 mm 3,5 m C—18 a $ pozitivním ionsprejem s rychlostí toku 20 ml/min. Kolona byla eluována s lineárním gradientem 5 až 90% acetonitril, 85az0% voda a 10% trifluoroctové kyseliny (0,l%)/voda během 15 min při rychlosti toku 1 ml/min.

Zkratky:
TLC:	tenko vrstva chromatografie
DMSO:	dimethylsulfoxid
min:	minuty
h:	hodiny
Boc:	terc-butoxykarbonyl
DMF:	dimethylformamid
THF:	tetrahydrofuran
EDAC:	N-ethyl-N '-dimethylaminopropy lkarbodiimid hydrochlorid
HOAt:	1 -hydroxy-7-azabenzonitriazol
DIEA:	diisopropylethylamin
TFA:	trifluoroctová kyselina

Stavební kameny:

N-methylované aminokyseliny použité v následujících příkladech byly připraveny podle Can. J. Chem. 1977, 55, 906.

Příklad 1 methylamid l-{(2R)-2-[N-<(2E)-5-amino-5-methylhex-2-enoyl)-N-methylamino]-342naftyl)propionyl}-4-benzylpiperidin-4-karboxylové kyseliny

Krok A

N-terc-butoxykarbony 1-4-benzy lpiperidin-4-karboxy lová kysel ina

EthylesterN-terc-butoxykarbonyl-4-benzylpiperidin-4-karboxylové kyseliny (připravený podle Gilligan et ak, J. Med. Chem. 1994,364-370 s využitím benzylbromidu jako alkylačního činidla) (11,0 g, 32 mmol) byl refluxován 7 hodin ve směsi ethanol (190 ml) a vodný roztok hydroxidu _ i<;_ sodného (18%, 190 ml). Objem směsi byl zredukován na jednu třetinu ve vakuu a pH bylo adjustováno na 3 pomocí hydrogensíranu sodného. Pak byla ke směsi přidána voda (300 ml) a směs byla extrahována s ethylacetátem (2 x 250 ml). Spojené organické fáze byly odpařeny za vzniku 8,6 g N-terc-butoxykarbonyl-4-benzylpiperidin-4-karboxylové kyseliny.

'H NMR: § (CDCb) 1,45 (s, 9H), 1,5 (m(br), 2H), 2,08 (m(br), 2H), 2,88 (m(br), 2H), 2,89 (s, 2H), 3,95 (m(br), 2H), 7,09-7,30 (5 arom. H).

Krok B io terc-butylester 4-benzy 1-4-methylkarbamoy lpi peridin-1-karboxylové kyseliny

N-terc-butoxykarbonyl-4-benzylpiperidin-4-karboxylová kyselina (3,0 g, 9,0 mmol) byla rozpuštěna v dichlormethanu (25 ml) a EDAC (1,8 g, 9,0 mmol) a byl přidán HOAt (1,3 g,

9,0 mmol). Směs byla míchána 15 min, pak byl přidán methylamin (33% v ethanolu, 2,3 ml, mmol) a DIEA (1,6 ml, 9,0 mmol) a směs byla míchána přes noc. Pak bylo přidáno 100 ml dichlormethanu a směs byla promyta s nasyceným roztokem vodného hydrogenuhličitanu sodného (50 ml) a vodným roztokem hydrogensíranu sodného (10%, 50 ml), sušena nad MgSO₄a odpařena ve vakuu. Zbytek byl chromatografován na 90 g silikagelu s využitím směsi vodný amoniak/ethanol/dichlormethan (1:7:92) jako eluentu za vzniku 2,8 g terc-butylesteru 4-benzyl4-methylkarbamoylpiperidin-l-karboxylové kyseliny.

’H NMR: δ (CDC1₃) 1,44 (s, 9H), 1,55 (m(br), 2H), 1,98 (m(br), 2H), 2,70 (d, 3H), 2,98 (m(br), 2H), 2,89 (s, 2H), 3,87 (m(br), 2H), 5,15 (q(br), 1H), 7,01-7,32 (5 arom. H).

KrokC

Methylamid 4-benzylpiperidin-4-karboxylové kyseliny

Terc-butylester 4-benzyM-methylkarbamoylpiperidÍn-l-karboxylové kyseliny (2,8 g) byl rozpuštěn ve směsi TFA a dichlormethanu a směs byla míchána 40 min. Rozpouštědlo bylo poté odstraněno ve vakuu a zbytek byl rozpuštěn ve vodě (30 ml) a pH bylo adjustováno na 13 pomocí IN vodného roztoku hydroxidu sodného. Vodná fáze byla extrahována s dichlormethanem (3 x 75 ml) a spojené organické fáze byly sušeny nad MgSO₄ a odpařeny ve vakuu za vzniku

1,50 g methylamidu 4-benzylpiperidin-4-karboxylové kyseliny.

'HNMR: δ(CDClj) 1,80(td, 2H), 2,14 (d(br), 2H), 2,70 (d, 3H), 2,81 (s, 2H), 2,85 (dt, 2H), 3,21 (dt, 2H), 5,25 (t, 1H), 7,00-7,35 (5 arom. H).

methylamid 4-benzyl-l-((2R)-2-methylamino)-3-(2-naftyl)propionyl)piperidin-4-karboxylové kyseliny (2R)-2-terc-butyloxykarbonylamino-N-methyl-3-(2-naftyl)prúpionová kyselina (709 mg, 2,15 mmol), HOAt (293 mg, 2,25 mmol) a EDAC (412 mg, 2,25 mmol) bylo rozpuštěno v 5 ml dichlormethanu a mícháno 15 min. Pak byl přidán methylamid 4-benzylpiperidin-4—karboxylové kyseliny (500 mg, 2,25 mmol) a DIEA (0,35 ml) a směs byla míchána přes noc. Pak bylo přidáno 30 ml dichlormethanu a směs byla promyta nasyceným roztokem hydrogenuhličitanu sodného (20 ml) a vodným roztokem hydrogensíranu sodného (10%, 20 ml), sušena nad MgSO₄ a odpařena ve vakuu. Zbytek byl chromatografován na silikagelu (40 g) s využitím ethylacetátu jako eluentu za vzniku 810 mg methylamid 4~benzyl-l-((2R)-2-(N-methyl-terc-butylkarbonylamino)-3-(2-naftyl)propionyl)piperidin-4-karboxylové kyseliny, který byl rozpuštěn ve směsi

TFA/dichlormethan (8+8 ml) a míchán 40 minut při laboratorní teplotě. Rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu a zbytek byl neutralizován s nasyceným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a extrahován s ethylacetátem (50 ml). Organická fáze byla sušena nad MgSO₄ a odpařena za

ZT vzniku 729 mg methylamidu 4-benzyl-H(2R)-2-methylamino}-3-(2-naftyl)propionyl)piperidin-4-karboxylové kyseliny.

KrokE

Methylamid 4-benzyl-l~((2R)-2-methylamino)-3-(2-naftyl)propionyl)piperidin^kkarboxylové kyseliny (360 mg, 0,82 mmol) byl kaplován s (2E)-5-(terc-butoxykarbonylamino)-5methyl-2-hexenovou kyselinou s využitím stejné kaplovací procedury, jaká byla použita v kroku D. Odstranění N-koncové Boc skupiny bylo provedeno stejně jako v kroku D, ale při io -10 °C. Surový produkt byl čištěn na RP-18-Seppak® (5 g, Waters) s využitím gradientu od

0,1% TFA ve voda/acetonitril 100/0 do 0,1% TFA ve voda/acetonitril 60/40 za vzniku 306 mg titulní sloučeniny ve formě trifluoracetátu.

’H NMR: δ (MeOH) (vybrané píky pro hlavní rotamer) 1,30 (s, 3H), 1,31 (a, 3H), 2,10 15 (AB-syst., 2H), 2,55 (s,3H), 5,81 (m, 1H).

HPLC: r_t= 31,88 min (AI) r_t = 33,50 min (Bl)

ESMS: m/z: 569,4 (M+H)⁺

Příklad 2 methylamid 1 -{(2R)-2-[N-((2E>-5-amino-3,5-dimethylhex-2-enoyl)-N-methylamino]-3-(2naftyl)propionyl}^t-benzylpiperidin-4-karboxylové kyseliny

Tato sloučenina byla připravena stejně jako v příkladu 1 s využitím (2E)-5-(terc-butoxykarbonylamíno)-3,5-dimethyl-2-hexenové kyseliny namísto (2E)-5-(terc-butoxykarbonyl30 amino)-5-methyl-2-hexenové kyseliny v kroku E.

HPLC: r, = 33,70 min (AI) r_t = 34,22 min (Bl)

ESMS: m/z: 583,4 (M+H)⁺ _ Π CZ 301276 B6

Příklad 3 methylamid l-{(2R)-2-[N-((2E)-5-amino-5-methylhex-2-enoyl)-N-methylamino]-3-(bifenyl—4—yl)propionyl} -4- benzylpiperidin—4—karboxylové kyseliny

Tato sloučenina byla připravena stejně jako v příkladu 1 s využitím (2R)-2-terc-butoxykarbo nyl-amino-N-methyl-3-(4-bifenylyl)propionové kyseliny namísto (2R)-2-terc-butoxykarbo nylamíno-N-methyl-3-(2-nafty])propionové kyseliny v kroku D.

to HPLC: r_t- 34,53 min (AI) r, = 36,15 min (Bl)

ESMS: m/z: 595,4 (M+H)⁺

Příklad 4 methylamid l-{(2R)-2~[N--{(2E)--5-amino-3,5-dimethylhex-2-enoyl)-N-rnethylamino]—3-<bi fenyl—4-yl)propionyl}-4-benzylpiperidin-4—karboxylové kyseliny

Tato sloučenina byla připravena stejně jako v příkladu 1 s využitím (2R)-2-terc-butoxykarbo nyl-am ino-N-methy 1-3-( 4—bi feny lyl)propionové kyseliny namísto (2R)-2-terc-butoxy karbony lam i no-N-methyl-3-(2-naftyl)propionové kyseliny v kroku D a s využitím (2E)-5(terc-butoxykarbonyl-amino)-3,5-dimethyl-2-hexenové kyseliny namísto (2E)-5-(terc-butoxy karbonylamino)-5-methyl-2-hexenové kyseliny v kroku E.

HPLC: r_t = 35,15 min (AI) r, = 36,83 min (Bl)

ESMS: m/z: 609,4 (M+H)⁺

Příklad 5 methylamid 1 -{(2R}-2-[N-((2E)-4-( 1 -aminocyklobutyl)but-2-enoyl)-N-methylamino]-3 —(bi 5 fenyl-4-yl)propionyl}-4-benzylpiperidin-4-karboxylove kyseliny

Tato sloučenina byla připravena stejně jako v příkladu 1 s využitím (2R)-2-terc-butoxykarbonyl-amino-N-methyl-3-(4-bÍfenylyl)propionové kyseliny namísto (2R)-2-terc-butoxykarbonylamino-N-methyl“3-(2-naftyl)propÍonové kyseliny v kroku D a s využitím (2E)-4-(1io (terc)(butoxykarbonylamino)cyklobutyl)but-2-enové kyseliny namísto (2E)-5-(terc-butoxykarbonylamino)-5-methyI-2-hexenové kyseliny v kroku E.

HPLC: r_t = 35,15 min (AI) r_t = 36,83 min (Bl)

ESMS: m/z: 607,4 (M+H)⁺

Příklad 6

2-amino-N-[( 1 R)-2-[4-benzyM~{N',N'-dimethylhydrazinokarbonyl)piperÍdin-l-yl]-l-((l Hindol-3-yl)methyl)-2-oxoethyI]-2-methylpropionamid

Terc-butylester 4-benzyl-4-(N ',N -dimethylhydrazinokarbonyl)piperÍdÍn-1 -karboxylové kyseliny

K. roztoku 1-terc-butylesteru 4-benzylpiperidin-l,4-dikarboxylové kyseliny (0,75 g, 2,35 mmol) 5 (připravené podle Gilligan et al., J. Med. Chem., 1994, 364-370) v dichlormethanu (10 ml) byl přidán l-hydroxy-7-azabenzotriazol (0,32 mg, 2,35 mmol) a 1 -ethy 1-3-(3-dimethylaminopropyl)karbodiimid hydrochlorid (0,45 g, 2,35 mmol) a směs byla míchána 30 min. Poté byl přidán Ν',Ν'-dimethylhydrazid (0,27 ml, 3,53 mmol) a diisopropylethylamin (0,52 mí,

3,06 mmol) a směs byla míchána 2 dny. Dichlormethan (100 ml) byl přidán k reakční směsi io a směs byla promyta nasyceným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného (20 ml), vodou (20 ml), sušena nad MgSO₄, zfiltrována a zkoncentrována ve vakuu. Získaný olej byl chromatografován na silikagelu (40 g) s využitím směsi heptan/ethylacetát (1:2) za vzniku 0,76 g terc-butylesteru 4-benzyl-4-(N',N'-dimethylhydrazinokarbonyl)piperidin-l-karboxylové kyseliny ve formě bezbarvého oleje.

HPLC: R_f = 9,66 min (H8)

LC-MS: R_f= 9,29 min, m/z = 362,0 (m+1)

Ν',Ν'-dimethylhydrazid 4—benzylpiperidin-4-karboxylové kyseliny

K roztoku terc-butylesteru 4-benzyM-(N\N'-dimethylhydrazinokarbonyl)piperidin-l -karboxylové kyseliny (0,76 g, 2,02 mmol) v dichlormethanu (2 ml) byla při 0 °C přidána trifluoroctová kyselina (5 ml) a směs byla míchána 60 min. Směs byla rozložena s ethanolem (20 ml), zkoncentrována ve vakuu a zpracován a třikrát s dichlormethanem za vzniku Ν',Ν'-dimethylhydrazidu 425 benzylpiperidin-4-karboxylové kyseliny v kvantitativním výtěžku.

LC-MS: Rf = 5,64 min, m/z ~ 262,0 (m+1)

Terc-butylester 2-(4-benzyl-4-(N',N -dímethylhydrazinokarbonyl)piperidin-l -y 1)-1-( l Hindol-3-ylmethyl)-2-oxoethyl karbamové kyseliny

K roztoku 2-terc-butoxykarbonylamino-3-(lH-indol-3-yl)propÍonové kyseliny (0,37 g, 5 1,2 mmol) v 15 ml dichlormethanu a 5 ml dimethylformamidu byl přidán l-hydroxy-7-azabenzotriazol (0,16 mg, 1,20 mmol) a l-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)karbodiimid hydrochlorid (0,23 g, 1,20 mmol) a směs byla míchána 30 min. Pak byl přidán Ν',Ν'-dimethylhydrazid 4-benzylpiperidin-4-karboxylové kyseliny (0,26 g, 1,0 mmol) a diisopropylethylamin (0,69 ml, 4,0 mmol) a směs byla míchána přes noc. Ke směsi byl poté přidán dichlormethan io (100 ml) a směs byla promyta nasyceným vodným roztokem hydrogenuhličitanů sodného (20 ml), vodou (20 ml), sušena nad MgSO₄, zfiltrována a zkoncentrována ve vakuu. Získaný olej byl chromatografován na silikagelu (40 g) se směsí dichlormethan/(10% amoniak v methanolu) (9:1) za vzniku 0,43 g terc-butylesteru (2-(4-benzyl-4-(N',N'-dimethylhydrazinokarbonyl)piperidin-l-yÍ)-l-(lH-mdol-3-ylmethyl)-2-oxoethyl) karbamové kyseliny ve formě bezbar15 vého oleje.

HPLC: Rf=10,45 min (H8)

LC-MS: R_f= 9,92 min, m/z = 548,2 (m+1)

Ν',Ν'-dimethylhydrazid (2-amino-3-0H-indol-3-yl)propionyl)-4-benzylpiperidin-4karboxylové kyseliny

K roztoku terc-butylesteru (244-benzyM-(N'_JN'-dimethylhydrazinokarbonyl)piperidin-l-yl)l-(lH-indoI-3-ylmethyl)-2-oxoethyl) karbamové kyseliny (0,40 g, 0,73 mmol) ve 3 ml dichlor25 methanu byla při 0 °C přidána trifluoroctová kyselina (3 ml) a směs byla míchána 30 min. Směs byla rozložena s 20 ml ethanolu, zkoncentrována ve vakuu a třikrát zpracována s dichlormethanem za vzniku 0,63 g Ν',Ν'-dimethylhydrazidu l-(2-amino-3-(lH-indol-3-yl)propionyl}-4-benzylpiperidm-4-karboxylové kyseliny ve formě bezbarvého oleje.

HPLC: Rf= 7,52 min (H8)

LC-MS: R_f= 7,61 min, m/z = 448,4 (m+1) _ TI

Terc-butylester (1-(2-( 4-benzyM-(N\N'-dimethy Ihydrazinokarbony l)p iperidin-1-y 1)-1-( 1Hindol-3-ylmethyl)“2-oxoethylkarbamoyl}-l-methylethyl)karbamové kyseliny

K. roztoku 2-terc-butoxykarbonylamino-2-methylpropionové kyseliny (0,18 g, 0,88 mmol) v 10 ml dichlormethanu byl přidán l-hydroxy-7-azabenzotriazol (0,12 mg, 0,88 mmol) a 1ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)karbodiimid hydrochlorid (0,12 g, 0,88 mmol) a směs byla míchána 30 min. Pak byl přidán Ν',Ν'-dimethylhydrazid (2-amino-3-(lH-indol-3-yl)propionyl)-4-benzylpiperidin-4-karboxylové kyseliny (0,46 g, 0,73 mmol) a diisopropylethylamin ío (0,50 ml, 2,92 mmol) a směs byla míchána přes noc. Pak byl ke směsi přidán dichlormethan (100 ml) a směs byla promyta nasyceným vodným roztokem hydrogenuliČitanu sodného (20 ml), vodou (20 ml), sušena nad MgSO₄, zfiltrována a zkoncentrována ve vakuu. Získaný olej byl chromatografován na sílikagelu (40 g) se směsí dichlormethan/(10% amoniak v methanolu) (9:1) za vzniku 0,31 g terc-butylesteru (l-(2-(4-benzyl-4-(N',N'-dimethy Ihydrazinokarbony l)piperi15 din-1 —y 1)— 1 —(1 H-Índol-3-ylmethyl)-2-oxoethylkarbamoyl)-l -methylethyl)karbamové kyseliny ve formě bezbarvého oleje.

HPLC: R_f = 10,25 min (H8)

LC-MS: Rf= 9,66 min, m/z = 633,2 (m+1)

2-amino-N-[( 1 R)-2-[4-benzy l-4-(N ',N '-dimethy Ihydrazinokarbony l)piperidín-1 -y 1]-1 -((1Hi ndo 1-3-y 1 )methy 1 }-2-oxoethy I ]-2-methy 1 propi on am i d

K roztoku terc-butylesteru (l-(2-(4-benzyM-(N',N' dimethyIhydrazinokarbonyl)piperidin-l25 yl)-1-(lH-indol-3-ylmethyl)-2-oxoethylkarbamoyl)-l-methylethyl)karbamové kyseliny (0,29 g, 0,46 mmol) ve 3 ml dichlormethanu byla při 0 °C přidána trifluoroctová kyselina (3 ml) a směs byla míchána 30 min. Směs byla rozložena s 20 ml ethanolu, zkoncentrována ve vakuu a zpracována třikrát s dichlormethanem za vzniku 0,25 g 2-amino-N-[( 1 R)-2-[4-benzyl-4(N ',N -dimethylhydrazinokarbony 1 )piperidin— 1 -y 1]-1-(( 1 H-indol-3-yl)methyl)-2-oxoethyI]30 2-methylpropionamidu ve formě amorfního prášku.

HPLC: Rf= 24,56 min (Al), R_f= 24,95 min (Bl), R_f = 7,73 min (H8), LC-MS: R_f- 7,74 min, m/z - 533,4 (m+1)

Příklad 7

2-amino-N-{( 1 R)-2-[(3R)-3-benzyl-3-(N ',N '-dimethylhydrazinokarbonyl)piperidin-l -yl]l-benzyloxymethyl-2-oxoethyl]-2-methylpropionamid

io

Tato sloučenina byla připravena s využitím procedury analogické s tou z příkladu 6. ESMS: m/z: 524,4 (M+H)⁺

Příklad 8

2-amino-N-{( 1 R)-2-[(3R)-3-benzyl-3-(N',N'-dimethylhydrazinokarbonyl)piperidÍn-l-y 1]l-(( 1 H-indol-3-y l)methyl)-2-oxoethyl]-2-methylpropionamid

Tato sloučenina byla připravena s využitím procedury analogické s tou z příkladu 6.

ESMS: m/z: 533,4 (M+H)⁺

HPLC: r_t= 27,60 min (Al)

HPLC: r,= 26,84 min (Bl) _ 77 _

Příklad 9 ethylester l-{(2R)_2-[N-((2E)-5-amino-5-methy]hex-2-enoyl)-N-methylamino]-3-(bifenyí 4—yl)propionyl}^4-benzylpiperidin—4—karboxylové kyseliny

LC-MS: Rt = 12,11 min, m/z: 610,4 (M+H)

HPLC: r_t = 42,075 min (Al)

HPLC: r_t = 44,383 min(Bl)

Příklad 10 ethylester l-{(2R)_2-[N-((2E)-5-amino-3,5-dimethylhex-2-enoyl)-N-methylamino]-3-(bi fenyM-yl)propionyl}-4-benzylpiperidin^4-karboxylové kyseliny

LC-MS: R₍ - 12,36 min, m/z: 624,4 (M+H) HPLC: r,= 42,785 min (Al)

HPLC: r_t = 45,148 min (Bl)

Příklad 11 ethylester 1 -{(2R)-2-[N-((2E)-5-amino-5-methy lhex-2-enoy l)-N-methy lam i no]-3-(2naftyl)propionyl}-4-benzylpiperidin-4-karboxylové kyseliny

LC-MS: R, = 11,92 min, m/z: 584,4 (M+H)

HPLC: r_t = 39,893 min (AI)

HPLC: r_t = 42,046 min (Bl)

Příklad 12 ethylester l-{(2R)-2-[N-((2E)-5-amino-3,5-dimethylhex-2-enoyl)-N-methy laminoj—3—(2 nafty l)propionyl}-4—benzylpiperidin—4-karboxylové kyseliny

LC-MS: Rt = 12,21 min, m/z: 598,2 (M+H) HPLC: r, = 40,541 min (AI)

HPLC: r_t = 42,780 min (Bl)

Příklad 13 ethylester (3S)-l-[(2R)-2-((2E)-5-amino-5-methylhex-2-enoylamino)-3-( 1 H-indol-3-yl) propionyl]-3-benzylpiperidin-3-karboxylové kyseliny

_ TA _

LC-MS: R,= 10,07 min, m/z: 559,4 (M+H) HPLC: r_t = 35,585 min (AI)

HPLC: η = 37,441 min (Bl)

Příklad 14 ethylester (3S)-l-[(2R)-2-((2E)-5-amino-3,5-dimethylhex-2-enoylamino)-3-(1 H-indol-3 ío yl)propionyl]-3-benzylpiperidin-3-karboxylové kyseliny

LC-MS: R_t = 10,42 min, m/z: 573,2 (M+H) HPLC: r_t = 36,680 min (AI)

HPLC: r,-38,561 min (Bl)

Příklad 15 ethylester (3S)-l-[(2R)-2-{3-{^ami^nomethyl)benzoylamino)-3-(lH-indol-3-yl)propionyl]-3 20 benzylpiperidin-3-karboxylové kyseliny

LC-MS: Rt = 10,24 min, m/z: 567,4 (M+H) HPLC: η = 36,118 min(Al)

HPLC: r_t = 38,052 min (Bl)

Příklad 16

N-{( 1 R)-2-[4_benzyM-(N ',N Mimethy lhydrazinokarbonyl)píperidin-1 -yl]-1 -((2-nafty 1)methyl-2~oxoethyl} -N-methylamid(2E)-5-amino-5-methy lhex-2-enové kyseliny

LC-MS: R, = 8,82 min, m/z: 598,4 (M+H)

HPLC: r, = 30,858 min (Al)

HPLC: r_t = 31,198 min(Bl)

Příklad 17

N-[( 1 R)-2-[3-benzyl-3XN^,,N^r-4imethylhydrazmokarbonyl)piperidin-l-yl]-l-( 1 H-indol-3 yl)methyl)-2-oxoethyl]amid(2E)-5-amino-5-methylhex-2-enové kyseliny

ESMS: m/z: 573,2 (M+H)⁺

Příklad 18

N-{ (1 R)-2-[3-benzy 1-3XN' ,N'-dimethy Ihydrazinokarbonyl)piperidin-1-yí]-l-((2-naftyl)methyl-2-oxoethyl}-N-methylamid(2E)-5-amin0-5-methylhex-2-enové kyseliny

ESMS: m/z: 598,4 (M+H)⁺ _ ΊΊ

Příklad 19 {(1 R)~2-[3-benzyl-3-(N',N'-dimethylhydrazinokarbonyl)piperidin-l-yl]-l-(benzyloxy 5 methvl)-2-Oxoethyl}amíd(2E)-5-amino-5-methylhex-2-enové kyseliny

LC-MS: Rí = 8,77 min, m/z: 564,2 (M+H)

HPLC: r, = 29,829 min (Al)

HPLC: r_t = 29,250 min(Bl) io

Příklad 20

2-am ino-N- {2-[3 -benzy 1—3—(N' ,N '-dimethy Íhydrazinokarbony 1) p i pe r i d i η— 1 —y l ]— 1 —((2 15 nafty l)methyl)-2-oxoethyl]-2-methy Ipropionamid

LC-MS: R_t = 4,77 min, m/z: 544,4 (M+H) HPLC: r, = 30,900/31,586 min (Al)

HPLC: r, = 30,188/30,727 min (Bl)

TO

Příklad 21

2-amino-N-{( 1 R)-2-[3-benzy l-3-(N ',N ^f-dimethylhydrazinokarbonyl)piperidin-l -y 1]-1 ((bifenyl-4-yl)methylý-2-oxoethyl]-2-methylpropionamid

LC-MS: Rt = 4,98 min, m/z: 570,4 (M+H)

HPLC: Rt = 33,839/34,313 min (Al)

HPLC: R, = 33,297/33,640 min (Bl)

Příklad 22

2-amino-N-{( 1 R)-2-[3-benzyl-3-(N \N'-dimethylhydrazinokarbonyl)piperidin-l-y l]-l ((1 H-indoI-3-yl)methyl)-2-oxoethyl]-2-methylpropionamid

LC-MS: Rt = 4,32 min, m/z: 533,4 (M+H) HPLC: Rt = 25,946/27,231 min(Al) HPLC: Rt = 25,822/26,685 min (Bl)

Příklad 23

2-amino-N-{2-[3-benzyl-3-(N -methylhydrazinokarbonyl)piperidin-l —yl]—1 -(benzy loxy methyl)-2-oxoethyl}-2-methylpropionamid

LC-MS: R_t = 4,33/4,75 min, m/z: 510,4 (M+H)

HPLC: R, = 30,737/30,945 min (AI)

HPLC: R, = 26,809/27,307 min (Bl)

Příklad 24

2-amino-N-{( 1R)—2—[3 -benzy 1—3—(N ^ř-methylhydrazinokarbonyl)piperidin-l-yl]-l-(( 1Hindol-3-yl)methyl)-2-oxoethyl]-2-methylpropionamid

LC-MS: R_t = 4,25/5,27 min, m/z: 519,4 (M+H) HPLC: R,-24,994 min (AI)

HPLC: R, = 25,742 min(Bl)

Příklad 25 l-[(2R)-2A2-amino-2-methylpropionylamino)-3-(lH-indoI-3-yl)propionyl]-3-benzylpíperidin-3-karboxylová kyselina (pyrrolÍdin-l-yl)amid

Směs diastereoizomerů

Diastereoízomer 1:

io LC-MS: Rt = 4,40 min, m/z: 559,4 (M+H)

HPLC: Rt= 26,04 min (AI)

HPLC: Rt = 25,79 min (Bl)

Diastereoízomer 2:

HPLC: Rt= 27,38 min (AI)

Příklad 26

2-amino-N-{(lR)-2-[3-benzyl-3-(N,N',N'-trimethylhydrazinokarbonyl)piperidin-l-yl]-l ((1 H-indol-3-yl)methyl)-2-oxoethyl}-2-methylpropionamid

Směs diastereoizomerů

Diastereoízomer I:

LC-MS: Rt = 5,07 min, m/z: 547,4 (M+H) HPLC: Rt = 32,16 min (AI) _ Ί1 _

Diastereoizomer II:

LC-MS: R, = 5,24 min, m/z: 547,4 (M+H)

HPLC: R_t = 33,60 min (AI)

Sloučeniny v příkladech 9 až 26 byly připraveny s využitím procedury analogické s těmi popsanými v příkladech 1 až 6.

io

Průmyslová využitelnost

Sloučeniny podle vynálezu vykazují schopnost stimulovat uvolňování růstového hormonu a jsou tedy užitečné pro výrobu farmaceutických přípravků vhodných pro léčení poruch a onemocnění vyplývajících z nedostatku růstového hormonu.

Claims

20 PATENTOVÉ NÁROKY

1. Piperidinový derivát vybraný ze skupiny obsahující

25 methylamid l-{(2R)-2-[N-((2E)-5-amino-5-methylhex-2-enoyl)-N-methylamino]-3-(2naftyl)propionyl}^l-benzylpiperidín^l-karboxylové kyseliny vzorce methylamid l-{(2R)-2-[N-((2E)-5-amino-3.5-<limethylhcx-2-enoyl)-N-methylamino]-3Á2naftyl)propionyl}^l-benzylpiperidin-Φ-karboxylové kyseliny vzorce

methylamid l-{(2R)-2-[N4(2E}-5-amino-5-methylhex-2-enoyl)-N-methylamino]-3-(bifenyM-yl)propionyl}-4-benzyÍpiperidin-4_karboxylové kyseliny vzorce methylamid l-{(2R)-2-[N-((2E}-5-amino-3,5-dimethylhex-2-enoyl)-N“methylamino]-3-(hi 5 fenyl-4-yl)propionyl}-4-benzylpiperidin-4“karboxylové kyseliny vzorce methylamid l-{(2R)-2-[N-((2E)-4-( l-aminocyklobutyl)but-2-enoyl) -N-methylamino]-3(bifenyM-y l)propiony 1 }-4-benzy Ipiperidin-4-karboxy lové kyseliny vzorce

- 33 _
2-amíno-N-[( ] R)-2-[4-benzyl-4-(N ’,N'-dimethylhydrazinokarbonyl)piperidin-l-yl]-l-(( 1H indol-
3-yl)methyl)-2-oxoethyl]-2-methylpropionamÍd vzorce

2-amino-N-{(l R)-2-[(3R)-3-benzyl-3-(N',N'-dimethylhydrazinokarbonyl)piperidin-l-yl]5 1 -berizy loxymethy 1-2-oxoethy l]-2-methylpropionamid vzorce

2-amino-N-{(lR)-2-[(3R)-3-benzyl-3“(N\N'-dÍmethylhydrazinokarbonyl)piperidin-l-yl]1~(( ] H—indol—3—y l)m ethyl }-2—oxoethyl]—2—methyl propionam i d vzorce io ethylester l-{(2R)-2-[N-((2E)-5-aniino-5-methylhex-2-enoyl}-N-methylamÍno]-3-(bifenyl 4-yl)propionyl}^4—benzylpiperidin-4-karboxylové kyseliny vzorce

1 Λ ethylester 1 - {(2R)-2-(N-((2E)-5-amÍno-3,5-dimethy lhex-2-enoyl)-N-methy lamino]-3-(bi fenyM~-yl)propionyl}-4-benzylpÍperidin-A-karboxyIové kyseliny vzorce ethylester l-{(2R)-2-[N-((2E)-5-amino-5-methylhex-2-enoyl}-N-methylamino]-3-(25 naftyl)propionyl}-4-benzylpiperidin--4_karboxylové kyseliny vzorce ethylester 1 -{(2R)-2-[N-((2E)-5-amino-3,5-diniethy lhex-2-enoy l)-N-methylanuno]-3-(2 naftyl)propionyl}^t-benzylpÍperidin-4-karboxylové kyseliny vzorce i o ethylester (3S)-1 -[(2R>24(2E)-5-amino-5-methylhex-2-enoylamino)-3A 1 H-indol-3-yl) propionyl]-3-benzylpiperidin-3-karboxylové kyseliny vzorce ethylester (3S)-l-[(2R)-2-((2E)-5-amino-3,5-dimethylhex-2-enoylamino)-3-( 1 H-indol-3 yl)propionyl]-3-benzylpiperidin-3-karboxylové kyseliny vzorce ethylester (3S)-l-[(2R)-2-(3-(ammoniethyl)benzoylamino)-3-(lH-Índol-3-yl)propionyl]-3 5 benzylpiperidin-3-karboxylové kyseliny vzorce

N-{( 1 R)-2-[4--benzyM-(N ',N'-dimethylhydrazinokarbonyl)piperidin-l-yl]-l-((2-naftyl)methyl-2-oxoethyl}-N-methylamid(2E)-5-amino-5-methylhex-2-enové kyseliny vzorce io N-[( 1 R)-2-[3~benzyl-3-(N\N'-dimethylhydrazinokarbonyl)piperidin-l-yl]-l-(l H-indol-3 yl)methyl)-2-oxoethyl]amid(2E>-5-amino-5-methylhex-2-enové kyseliny vzorce

Z'

N-{( 1 R)-2-[3-benzyl-3-(N',N -dimethylhydrazinokarbonyl)piperidin-l-yl]-l-((2-naftyl)methyI-2-oxoethyl}-N-methylamid(2E)-5-amino-5-methylhex-2-enové kyseliny vzorce {(lR)-2-[3-benzyl-3-(N\N'-dimethylhydrazinokarbonyl)piperidin-l-yl]-l-(benzyloxyg methyl)-2-oxoethyl}amid(2E)-5-artiino-5-methylhex-2-enové kyseliny vzorce

2-am ino-N-{2-[3-benzy l-3-(N' ,N'-d i methy Ihydrazinokarbony 1 )p iperidin-1-y 1]-1-((2naftyl)-methyl)-2-Oxoethyl]-2-methylpropionamid vzorce io 2-amino-N-{(lR)-2-[3-benzyl-3-(N\N^,-dimethylhydrazinokarbonyl)piperidin-l-yl]-l-((bi fenyl-4-yl)methyl)-2-oxoethyl]-2-methylpropionamid vzorce . 37 .

2-amino-N-{( 1 R)-2-[3-benzyl-3-(N',N'-dimethylhydrazinokarbony l)piperidín-l-yl]-l ((1 H-indol-3-yl)methyl)-2-oxoethyl]-2-methylpropionamid vzorce

2-aniino-N-{2-[3-benzyl-3-(N'-methylhydrazinokarbonyl)piperidin-l-yl]-l-<benzyloxy 5 methyl)-2-oxoethyl}-2-methylpropionamÍd vzorce

2-amino-N-{( 1 R)-2-[3-benzyl-3-(N'~methyIhydrazinokarbonyí)piperidin-l-yl]-1-((1 Hindol-3-yl)methyl)-2~oxoethyl]-2-methylpropÍonamid vzorce i o 1 -[(2R)--2 ‘ (2-amino-2-methylpropiony lamino)-3-( 1 H-indol-3-yl)propionyl]-3-benzylpiperidin-3-karboxylová kyselina (pyrrolidin-l-yl)amid vzorce

2-amino-N- {(1 R)-2-[3-benzy l-3-(N,N \N '-trímethylhydrazinokarbonyl)piperidin-1 -y 1]-1 ((1 H-indol-3-y l)methy l)-2-oxoethy 1 }-2-methy lpropionamid vzorce a jejich farmaceuticky akceptovatelné soli.

2. Farmaceutický přípravek, vyznačující se tím, že obsahuje jako aktivní složku piperidinové deriváty podle nároku 1 společně s farmaceuticky akceptovatelným nosičem nebo ředidlem.

io 3. Použití piperidinového derivátu podle nároku 1 pro přípravu léčiva.
4. Použití farmaceutického přípravku podle nároku 2 pro přípravu léčiva.
5. Použití podle nároků 3 a 4, kde léčivo je léčivo pro stimulaci uvolňování růstového hormonu 15 z podvěsku mozkového u savců.