CZ304525B6 - Způsob kultivace circoviru - Google Patents
Způsob kultivace circoviru Download PDFInfo
- Publication number
- CZ304525B6 CZ304525B6 CZ2003-2584A CZ20032584A CZ304525B6 CZ 304525 B6 CZ304525 B6 CZ 304525B6 CZ 20032584 A CZ20032584 A CZ 20032584A CZ 304525 B6 CZ304525 B6 CZ 304525B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- mammalian
- circovirus
- adenovirus
- porcine
- cell
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 95
- 241001533384 Circovirus Species 0.000 title claims abstract description 60
- 238000012258 culturing Methods 0.000 title claims abstract description 23
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims abstract description 77
- 241000202347 Porcine circovirus Species 0.000 claims abstract description 76
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 claims abstract description 46
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 claims abstract 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 92
- 241001673669 Porcine circovirus 2 Species 0.000 claims description 58
- 101150029662 E1 gene Proteins 0.000 claims description 38
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 28
- 241000928435 Porcine circovirus 1 Species 0.000 claims description 23
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 20
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 20
- 241000598171 Human adenovirus sp. Species 0.000 claims description 17
- 210000001525 retina Anatomy 0.000 claims description 14
- 101710185720 Putative ethidium bromide resistance protein Proteins 0.000 claims description 13
- 101150075174 E1B gene Proteins 0.000 claims description 9
- 241000188845 Porcine adenovirus Species 0.000 claims description 9
- 238000012364 cultivation method Methods 0.000 claims description 5
- 108010057360 Adenovirus E1 Proteins Proteins 0.000 claims 7
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 claims 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 41
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 41
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 23
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 19
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 16
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 15
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 12
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 9
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 8
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 8
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 8
- 241001135569 Human adenovirus 5 Species 0.000 description 7
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 7
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 7
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 6
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 6
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 6
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 5
- 208000028489 postweaning multisystemic wasting syndrome Diseases 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical group N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 241001533399 Circoviridae Species 0.000 description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 4
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 4
- 238000004264 monolayer culture Methods 0.000 description 4
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 4
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101710159752 Poly(3-hydroxyalkanoate) polymerase subunit PhaE Proteins 0.000 description 3
- 101710130262 Probable Vpr-like protein Proteins 0.000 description 3
- 230000018199 S phase Effects 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N beta-D-galactosamine Natural products NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- MSWZFWKMSRAUBD-QZABAPFNSA-N beta-D-glucosamine Chemical compound N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-QZABAPFNSA-N 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 3
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 3
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 3
- AJDIZQLSFPQPEY-UHFFFAOYSA-N 1,1,2-Trichlorotrifluoroethane Chemical compound FC(F)(Cl)C(F)(Cl)Cl AJDIZQLSFPQPEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 241001302800 Beak and feather disease virus Species 0.000 description 2
- 241000701106 Bovine adenovirus 3 Species 0.000 description 2
- 101710167800 Capsid assembly scaffolding protein Proteins 0.000 description 2
- 241000725585 Chicken anemia virus Species 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000833492 Homo sapiens Jouberin Proteins 0.000 description 2
- 101000651236 Homo sapiens NCK-interacting protein with SH3 domain Proteins 0.000 description 2
- 102100024407 Jouberin Human genes 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 101710113540 ORF2 protein Proteins 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 101100382437 Porcine circovirus 2 Cap gene Proteins 0.000 description 2
- 101710090523 Putative movement protein Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 2
- 108020002494 acetyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 2
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- KJDSORYAHBAGPP-UHFFFAOYSA-N 4-(3,4-diaminophenyl)benzene-1,2-diamine;hydron;tetrachloride Chemical compound Cl.Cl.Cl.Cl.C1=C(N)C(N)=CC=C1C1=CC=C(N)C(N)=C1 KJDSORYAHBAGPP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150096316 5 gene Proteins 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000701242 Adenoviridae Species 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 101710199711 Early E1A protein Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 108091027974 Mature messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 101100366988 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) stu-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000745220 Pigeon circovirus Species 0.000 description 1
- 241000125945 Protoparvovirus Species 0.000 description 1
- 101000933967 Pseudomonas phage KPP25 Major capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 101001099217 Thermotoga maritima (strain ATCC 43589 / DSM 3109 / JCM 10099 / NBRC 100826 / MSB8) Triosephosphate isomerase Proteins 0.000 description 1
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N [3-[hydroxy(2-hydroxyethoxy)phosphoryl]oxy-2-[(e)-octadec-9-enoyl]oxypropyl] (e)-octadec-9-enoate Chemical compound CCCCCCCC\C=C\CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCCO)OC(=O)CCCCCCC\C=C\CCCCCCCC HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N 0.000 description 1
- GPKUGWDQUVWHIC-UHFFFAOYSA-N [4-(4-hydrazinylphenyl)phenyl]hydrazine tetrahydrochloride Chemical compound Cl.Cl.Cl.Cl.NNC1=CC=C(C=C1)C1=CC=C(NN)C=C1 GPKUGWDQUVWHIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 1
- 108700010877 adenoviridae proteins Proteins 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000010370 cell cloning Methods 0.000 description 1
- 230000018486 cell cycle phase Effects 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000030944 contact inhibition Effects 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 229960002442 glucosamine Drugs 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 210000001739 intranuclear inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 150000002540 isothiocyanates Chemical class 0.000 description 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000002207 retinal effect Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 238000007447 staining method Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
- C12N2710/10322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/10011—Circoviridae
- C12N2750/10021—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/10011—Circoviridae
- C12N2750/10041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2750/10043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/10011—Circoviridae
- C12N2750/10051—Methods of production or purification of viral material
- C12N2750/10052—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Řešení se vztahuje ke způsobům kultivace, replikace a exprese genomu savčího circoviru, zejména prasečího circoviru, v savčích buňkách, které exprimují E1-funkci savčího adenoviru.
Description
Způsob kultivace circoviru
Oblast techniky
Předkládaný vynález se vztahuje k oboru zaměřenému na circoviry a nabízí kultivační složení a postupy pro kultivaci circoviru, zejména prasečího circoviru. Předkládaný vynález se zaměřuje zvláště na způsoby kultivace prasečího circoviru na savčích buňkách, které exprimují funkci savčího adenovirového genu El.
Dosavadní stav techniky
Čeleď vírů Circoviridae, která se nachází se u řady rostlinných a živočišných druhů a běžně je označována jako circoviry, se popisuje jako kulaté, neobalené viriony o průměru 17 až 23,5 mm obsahující cirkulámí, jednořetězcovou deoxyribonukleovou kyselinu (ssDNA).ssDNA genom circovirů představuje nejmenší známý virový replikon. Jak uvádí WO 99/45956 na základě The Sixth Report of the International Committee for the Taxonomy of Virues (6. zpráva mezinárodního výboru pro virovou taxonomii), jako součást čeledi bylo identifikováno nejméně šest virů (Lukert, P. D. et al. 1995, The Circoviridae, pp. 166-168. V F. A. Murphy, et al. (eds.) Virus Taxonomy, Sixth Report of International Committeee on Taxonomy of Virues, Arch. Virol. 10 Suppl.).
Zvířecí viry náležící do čeledi jsou virus kuřecí anemie (CAV), virus onemocnění zobáku a peří (BFDV), prasečí circovirus (PCV) a holubí circovirus. PVC byl původně izolován z buněčných kultur prasečích ledvin. PCV se replikuje v buněčném jádře a tvoří velké jaderné inkluze, viz Murphy et al. (1999, Circoviridae p. 357-361, Veterinary Virology, 3rd ed. Academie Press, San Diego). V současnosti jsou známy dva druhy PCV, PCV1 a PCV2. PCV1 izolovaný jako trvalá kontaminace permanentní buněčné linie prasečích ledvin PK-15 (ATCC CCL31), nezpůsobuje v buněčné kultuře žádné rozeznatelné cytopatické účinky a nezpůsobuje u prasat při experimentální infekci klinické onemocnění (viz Allan G., 1995, Vet. Microbiol. 44:49-64; Tischer, I. et al., 1982, Nátuře 295:64-66; and Tischer, I. et al., 1986, Arch. virol. 91:271-276). PCV2 je na rozdíl od PCV1 úzce spojen se syndromem multisystémového selhání (post weaning multisystemic wasting syndrome - PMWS) vznikajícím po ukončení kojení u odstavených prasat (viz Allan G. et al., 1998, Europe. J. Vet. Diagn. Investig. 10:3-10; Ellis, J. et al., 1998, Can. Vet. J. 39:4451a Morozov, I. et al., 1998, J. Clin. Microbiol. 36:26535-2541). Nukleotidové sekvence PCV1 jsou popsány v Mankertz, A., et al. (1997, J. Virol. 71:2562—2566) a Meehan, Β. M., et al. (1997, J. Gen. Virol. 78:221-227) a nukleotidové sekvence PCV2 v Hamel, A. L. et al. (1998, J. Virol. 72:5262-5267); Mankertz, A., et al. (2000, Virus Res. 66:65-77) a Meehan, Β. M., et al. (1998, J. Gen. Virol. 79:2171-2179). Kmeny PCV2 jsou popsány v WO 00/01409 a jsou uloženy v European Collection of Cell Cultures, Centre for Applied Microbiology & Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, United Kingdom a řadí se k nim: přírůstkové číslo V97100219; přírůstkové číslo V9700218; přírůstkové číslo V97100217; přírůstkové číslo V98011608; a přírůstkové číslo V98011609. WO 00/7721 také popisuje PCV2.
Dosud publikované studie o PCV2 používaly buď tkáňový homogenát nebo kultivovaný virus získaný z ložiskových izolátů. Tischer et al. (1987, Arch Virol. 96:39-57) popsal, že buňky prasečích ledvin jsou stimulovány ke vstupu do S-fáze buněčného cyklu, pokud jsou ošetřeny Dglukosaminem. Toto ošetření však musí být provedeno šetrně, protože D-glukosamin je pro buněčnou kulturu toxický (viz Allan et al., 2000. J. Vet. Diagn. Investigation. 12:3-14). Stále přetrvává potřeba existence způsobů kultivace circoviru, například PCV1 a PCV2 a jiných circovirů, která by umožnila získání čistého viru. Tyto způsoby kultivace by byly výhodné zejména pro přípravu vakcíny z antigenů PCV2, kterou by bylo možné použít proti PMWS. Předkládaný vynález vychází z této potřeby.
- 1 CZ 304525 B6
Všechny zde uvedené patenty a publikace jsou v tomto dokumentu zahrnuty formou odkazu v plném znění.
Podstata vynálezu
Předkládaný vynález poskytuje způsoby kultivace savčího circoviru, které zahrnují: a) získání savčích buněk exprimujících El-funkci savčího adenoviru, přičemž tyto buňky umožňují replikaci savčího circoviru; b) vnesení genomu nebo replikace schopné části genomu zmíněného circoviru do těchto savčích buněk; a c) kultivace těchto buněk v podmínkách, vhodných pro replikaci zmíněného savčího circoviru. V někteiých modifikacích je dále součástí metody zpětné získání zmíněného circoviru z uvedených buněk.
V některých modifikacích vynálezu je savčím circovirem prasečí circovirus, jako je například prasečí circovirus 1 (PCV1) nebo prasečí circovirus 2 (PCV2). V ještě dalších modifikacích obsahuje prasečí circovirus chimérickou nukleotidovou sekvenci. V dalších modifikacích jsou savčí buňky prasečího původu. A v ještě dalších modifikacích jde o buňky prasečí sítnice.
V dalších modifikacích je El-funkce savčího adenoviru El-funkcí lidského adenoviru. V ještě dalších modifikacích je El-funkce savčího adenoviru El-funkcí prasečího adenoviru. V dalších modifikacích je funkce El funkcí El A a/nebo E1B. V ještě dalších modifikacích je savčí buňka, která exprimuje savčí funkci El trvale transformována sekvencí savčího genu El. V dalších modifikacích je savčí sekvence genu El heterologní k zmíněné savčí buňce.
Předkládaný vynález také poskytuje rekombinantní savčí buňky, které exprimují El-funkci savčího adenoviru a obsahují celý nebo replikace schopnou část genomu savčího circoviru a umožňující zároveň replikaci zmíněného savčího circoviru. V některých modifikacích je savčím circovirem prasečí circovirus, jako je například prasečí circovirus 1 (PCV1) nebo prasečí circovirus 2 (PCV2). V ještě dalších modifikacích obsahuje prasečí circovirus chimérickou nukleotidovou sekvenci. V některých modifikacích je El-funkce adenoviru El-funkcí lidského adenoviru.
V dalších modifikacích je funkce genu El-funkcí genu El-funkcí genu El prasečího adenoviru.
V dalších modifikacích je savčí buňka prasečího původu. A v dalších modifikacích jde o buňky prasečí sítnice. V ještě dalších modifikacích je savčí buňka exprimující savčí El-funkci trvale transformována El-genovou sekvencí savčího adenoviru. V dalších modifikacích je savčí genová sekvence El heterologní k zmíněné savčí buňce.
Předkládaný vynález také poskytuje způsob přípravy rekombinantních savčích buněk, které exprimují El-funkci savčího adenoviru a obsahují genom savčího circoviru, kdy tyto způsoby zahrnují a) získání savčích buněk exprimujících El-funkci savčího adenoviru; b) vnesení genomu nebo replikace schopné části genomu zmíněného circoviru do zmíněných savčích buněk.
V dalších modifikacích zahrnuje metoda navíc kultivaci rekombinantních buněk v podmínkách vhodných pro replikaci zmíněného savčího circoviru. V dalších modifikacích je součástí metody zpětné získání zmíněného circoviru z uvedených buněk. V některých modifikacích je savčím circovirem prasečí circovirus, jako je například prasečí circovirus 1 (PCV1) nebo prasečí circovirus 2 (PCV2). V ještě dalších modifikacích obsahuje prasečí circovirus chimérickou nukleotidovou sekvenci. V dalších modifikacích obsahuje prasečí circovirus chimérickou nukleotidovou sekvenci. V dalších modifikacích jsou savčí buňky prasečího původu. V ještě dalších modifikacích jde o buňky prasečí sítnice. V dalších modifikacích je El-funkce adenoviru El-funkcí lidského nebo prasečího adenoviru. V ještě dalších modifikacích je savčí buňka exprimující funkci El-genu savčího adenoviru trvale transformována El-genovou sekvencí savčího adenoviru.
V dalších modifikacích je savčí genová sekvence El heterologní k zmíněné savčí buňce.
-2CZ 304525 B6
Nej lepší způsob provedení vynálezu
Předkládaný vynález se zaměřuje na složení a způsoby kultivace savčího circoviru, zejména prasečího circoviru. Předkládaný vynález vychází z poznatku, že prasečí buňky, které exprimují funkci lidského El, je možné transfekovat (vnést do nich) genomem viru PCV2 a tyto buňky poté vytváří PCV2 virus ve vysokém titru. Buněčná linie VIDO Rl uchovávaná v ATCC pod přírůstkový číslem PTA-155 je linie buněk prasečí sítnice transformovaná vnesením genu El lidského adenoviru 5 (ELAV5), přičemž u produktu tohoto genu bylo prokázáno, že přivádí buňku do Sfáze buněčného cyklu a transaktivuje genovou transkripci. Viz, Shenk, T. (1996). „Adenoviridae: the viruses and their replication“ v Fields Virology. 3rd ed. Β. N. Fields, D. M. Knipe and Ρ. M. Howley (ed.) Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, New York, pp. 2111-2148. Jak je popsáno zde v příkladu 3, buňky VIDO Rl byly transfekovány genomem PCV2 a zisk viru představoval 2xl07 IU/ml (IU = infekční jednotka).
Provedení předkládaného vynálezu využívá, pokud není požadováno jinak, běžných mikrobiologických, imunologických, virologických, molekulárně biologických a DNA rekombinantních technik, které odpovídají úrovni dosavadního stavu techniky. Tyto techniky jsou podrobně popsány v literatuře. Viz např., Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); DNA Cloning: A Practical Approach, vols. I & II (D. Glover, ed.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed. (1984)); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, eds. (1985)); Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, eds. (1984)); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); Ausubel, et al., Current Protocols In Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987, 1988, 1989, 1990, 1991, 1992, 1993, 1994, 1995, 1996); a Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition); vols. I, II & III (1989).
Circoviridae, čeleď virů s kulatým neobaleným virionem o středním průměru 17 až 23,5 nm obsahujícím cirkulámí (kruhovou) jednovláknovou DNA (ssDNA) je popsána v The Sixth Report of the International Committee for Taxonomy of Virues, uvedené výše. Mezi členy čeledi se řadí prasečí circoviry, PCV1 a PCV2. Je známo, že některé PCV viry jsou patogenní, jako PCV2, který je spojován s PMWS.
Nukleotidové sekvence PCV1 jsou uvedeny v Mankerz, A., et al., 1997, J. Virol. 71:2562-2566 a Meehan, Β. M. et al., 1997, J. Gen. Virol. 78:221-227. Nukleotidové sekvence PCV2 jsou uvedeny v Hamel, A. L. et al., 1998, J. Virol. 72:5262-5267; Mankertz, A. et al., 2000, Virus Res. 66:65-77 a Meehan, Β. M. et al., 1998, J. Gen. Virol. 79:2171-2179. Zástupci kmenů PCV2 jsou vedeny v European Collection for Cell Cultures, Centre for Applied Microbiology & Research, Portin Down, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, United Kingdom and jsou zahrnuty pod přírůstkovými čísly V97100219, V9700218, V97100217, V98011608 a V98011609. PCV2 je také popsáno v přihlášce WO 00/77216. Nukleotidové sekvence PCV2 byly také publikovány v Hamel et al., (1998), J. Virol. vol. 72, 6:5262-5267 (GenBank AF027217) a vMorozov et al., (1998), J. Clinical Microb. vol. 36, 9:2535-2541, jakož i GenBank AF086834, AF086835, a AF086836. Srovnání publikovaných nukleotidových sekvencí PCV1 a PCV2 ukazuje menší než 80% shodu, ačkoliv organizace genomu je podobná, zejména v uspořádání dvou největších otevřených čtecích rámců (ORFs) považovaných za počátek DNA replikace.
Předkládaný vynález zahrnuje způsoby kultivace savčího circoviru a zejména prasečího circoviru (PCV). Předkládaný vynález zahrnuje způsoby kultivace PCV využívající nukleotidové sekvence PCV popsané zde nebo známé v oboru nebo ORFs zmíněných sekvencí nebo části zmíněných sekvencí schopné replikace. Předpokládaný vynález také zahrnuje způsoby kultivace PCV, jakož PCV nukleotidové sekvence se na základě degeneračních změn genetického kódu liší od zde nebo v oboru popsaných sekvencí, eventuálně využívá ORFs těchto sekvencí nebo částí těchto sekvencí schopných replikaci. Předkládaný vynález dále zahrnuje způsoby kultivace PCV využívající genetické varianty nukleotidových sekvencí PCV nebo jejich ORFs nebo jejich částí schopných replikace, kdy zmíněná variabilita nemění funkční vlastnosti ani kmenovou přísluš-3CZ 304525 B6 nost nukleotidové sekvence. Předkládaný vynález také zahrnuje způsoby kultivace PCV využívající PCV nukleotidové sekvence schopné za středně až vysoce přísných podmínek hybridizovat na sekvence popisované zde a způsoby kultivace PCV využívající mutace zde nebo v literatuře popsaných PCV nukleotidových sekvencí nebo jejich ORFs nebo jejich částí schopných replikace, kdy zmíněné mutace jsou delece nebo bodové mutace. Předkládaný vynález také zahrnuje způsoby kultivace PCV, které využívají heterologní nukleotidové sekvence. Předkládaný vynález také zahrnuje způsoby kultivace PCV, které využívají chimérické circovirové nukleotidové sekvence, například nukleotidové sekvence prasečích circovirů fušované s nukleotidovými sekvencemi jiných patogenních virů, jako je prasečí patogenní virus, včetně parvoviru.
Ve významu, v jakém je zde používána, je sekvence heterologní k circovirů nebo k savčí buňce takovou sekvencí, která není fyziologicky spojena s circovirovými sekvencemi jako součást genomu circovirů, respektive ta, která není fyziologicky přítomna v savčí buňce.Mezi heterologní nukleotidové sekvence patří syntetické sekvence. Hybridizační reakce mohou probíhat za různě přísných podmínek. Podmínky, které zvyšují striktnost hybridizační reakce, jsou obecně známy a v oboru publikovány. Viz např., Sambrook et al., (1989), str. 7.52. Příklady příslušných podmínek zahrnují (v pořadí vzrůstající přísnosti hybridizace): inkubační teplotu 25 °C, 37 °C, 50 °C a 68 °C; koncentraci pufru lOkrát SSC, 6krát SSC, lkrát SSC, 0,lkrát SSC (SSC je 0,15 M NaCl a 15 mM citrátový pufr) a ekvivalentní koncentraci jiných pufrovacích systémů; koncentraci formamidu 0 %, 25 %, 50 % a 75 %; inkubační dobu od 5 minut do 24 hodin; 1,2 nebo více promývacích kroků; délku promývání 1, 2 nebo 15 minut; a promývací roztok 6krát SSC, lkrát SSC, 0,1 krát SSC nebo deionizovanou voda. Vzorovým protokolem přísných hybridizačních podmínek je 68 °C a 0,lkrát SSC.
PCV genom kóduje několik polypeptidových sekvencí v přibližném rozmezí velikostí od 8 do 35 kDa. Určení otevřených čtecích rámců (ORFs) prasečích circovirů za použití standardního softwaru, např. MacVector® (Oxford Molecular Group lne., MD 21030) je považováno za rutinní metodiku. ORF1, největší ORF u dvou druhů PCV se pouze málo odlišují, jsou identické z 85 % a bylo prokázáno, že u PCV se jedná o Rep protein (Mankertz, A., et al., 1998, J. Gen. Virol. 79:381-384). Bez úmyslu vydávat to za teorii, vyšší míra odlišnosti nalezená v ORF2 sekvencích PCV1 a PCV2 (shoda představuje okolo 65 %) by mohla naznačovat, že typově specifické vlastnosti by mohly být určeny příslušným proteinem ORF2. Do oblasti PCV2 ORF2 sekvence bylo mapováno několik PCV typově specifických epitopů. Viz Mahe, D. et al., 2000, J. Gen. Virol. 81:1815-24. V další nedávné studii byl PCV2 ORF2 popsán jako hlavní strukturní protein schopný utvářet částice podobné virové kapsidě v buňkách hmyzu infikovaných rekombinantním baculovirem exprimujícím ORF2. Viz Nawagitgul. P. et al., 2000, J. Gen. Virol. 81:2281-2287.
V některých názorných modifikacích vynálezu, které jsou zde uvedeny, vzniká rekombinantní vektor obsahující PCV genom nebo jeho ORF nebo jeho část, jako je antigenní oblast, rekombinací plazmidů a PCV genomu in vitro. V některých modifikacích je PCV genom PCV2 genom.
V jiných modifikacích vzniká rekombinantní vektor obsahující PCV genom nebo jeho ORF nebo jeho část, jako je antigenní oblast, in vivo rekombinací. Způsoby in vivo rekombinace jsou v oblasti techniky známy a zahrnují, například, způsoby popsané v Chartier, et al. (1996, J. Virol. 70:4805—4810). Mezi vektory, do kterých je možné vnést circovirové genomy, patří například bakteriální plasmidy, které dokáží produkovat mnoho kopií zaklonované circovirové sekvence.
V některých modifikacích je za účelem rekombinace do vhodné hostitelské buňky společně transfekován plasmid. Buňkou vhodnou k rekombinaci je jakákoliv buňka, která podpoří rekombinací PCV genomu a plasmidu obsahujícího PCV sekvence nebo rekombinaci dvou nebo více plasmidů obsahujících PCV sekvence. Rekombinace se obvykle provádí v prokaryotických buňkách, například E. coli, zatímco produkce circovirů je přednostně uskutečňována v savčích buňkách s příhodným prostředím pro replikaci PCV, například v prasečích buňkách a zejména v prasečích buňkách exprimujících El-funkci savčího adenoviru.
Předkládaný vynález zahrnuje použití jakékoliv savčí hostitelské buňky umožňující replikaci circovirů a zejména replikaci PCV, jako jsou PCV1 a PCV2. Allan et al. (1995, Veterinaiy
-4CZ 304525 B6
Microbiology 44:49-64) uvádí, že PCV se replikuje v buňkách prasečí a bovinní monocytomakrofágové kultury. Tischer et al. (1987, Arch. Virol. 96:39-57) uvádí, že PCV vyžaduje k replikaci v buněčné kultuře aktivně se dělicí buňky. Mezi příklady buněk nebo buněčných linií, které jsou vhodné pro replikaci PCV patří savčí buňky disponující El-funkcí a tolerující PCV replikaci, což zahrnuje prasečí buňky, jako jsou prasečí monocyto-makrofágy a prasečí buňky sítnice, které exprimují El-adenovirovou funkci. V názorné modifikaci, která je zde představena, je ukázáno, že buňky prasečí sítnice exprimující El-funkci lidského adenoviru umožňují replikaci PCV2 a zisk jimi produkovaného viru činí 2xl07 IU/ml. Prasečí buněčné linie je možné získat z veřejně dostupných zdrojů, jako je např. American Type Tissue Collection (ATTC). Růst bakteriálních buněčných kultur, stejně jako kultivace a udržování eukaryotických buněk a savčích buněčných linií jsou postupy dobře známé odborníkům v dané oblasti techniky.
Předkládaný vynález zahrnuje způsoby kultivace savčích circovirů, zejména prasečího circoviru, v savčích hostitelských buňkách, do kterých byla vnesena (byly transfekovány) El-genová sekvence savčího adenoviru. V některých modifikacích jsou savčí buňky trvale transformovány Elgenovou sekvencí adenoviru. V některých modifikacích jsou tyto El-genové sekvence integrovány do genomu savčí buňky. V dalších modifikacích jsou genové sekvence součástí replikačního plasmidu. V ještě dalších modifikací je genová sekvence El heterologní k savčí buňce. V názorné modifikaci, která je zde představena, je prasečí buňka transformována El-genovou sekvencí lidského adenoviru 5. Předkládaný vynález zahrnuje použití jakékoliv savčí buňky nebo savčí buněčné linie exprimující El-funkci za předpokladu, že savčí buňka nebo buněčná linie exprimující El-funkci umožňuje replikaci circoviru, zejména prasečího circoviru, jako např. prasečího circoviru 1 nebo prasečího circoviru 2. Jsou upřednostňovány modifikace, kde savčí buňkou je prasečí buňka nebo buněčná linie. Předkládaný vynález zahrnuje použití jakékoliv savčí El-funkce za předpokladu, že savčí hostitelská buňka exprimující El-funkci umožňuje replikaci circoviru, zejména PCV, jako jsou např. prasečí circovirus 1 a prasečí circovirus 2. Genomické sekvence savčích adenovirů jsou v oboru známy a jsou popsány, např. v Reddy et al. (1998, Joumal of Virology, 72:1394), který uvádí nukleotidovou sekvenci, organizaci genomu a transkripční mapu bovinního adenoviru 3 (BAV3); a vKleiboeker (1995, Virus Res. 36:259268), který ukazuje El-oblast u PAV-4. Předkládaný vynález zahrnuje El-funkci jakéhokoliv z různých sérotypů lidského adenoviru, jako jsou sérotypy Ad2, Ad5, Adl2 a Ad40. V názorné modifikaci uvedené zde v příkladu 1 je použitou El-funkcí El-funkce lidského adenoviru Ad5. K expresi lidského El A genu dochází bezprostředně po infekci virem (0 až 2 hodiny) a před jakýmkoliv jiným virovým genem. Flint (1982) Biochem. Biophys. Acta 651:175-208; Flint (1986) Advances Virus Research 31:169-228; Grand (1987) Biochem. J. 241:25-38. Místo počátku transkripce Ad5 E1A je v pozici (nukleotidové sekvence) 498 a ATG začátek E1A proteinu je v pozici 560 virového genomu. E1B protein je aktivní v trans konformaci aje nezbytný pro transport zralé mRNA z jádra do cytoplazmy. Promotor E1B u Ad5 je tvořen jednou vysoce afinní rozpoznávací sekvencí pro Spi a TAT-boxem. Konkrétně, genové sekvence E1A a E1B lidského adenoviru 5 se nachází v rozsahu 505 až 4034 nukleotidu nukleotidové sekvence popsané v Chroboezek, J. et al. (1992, Virology. 186:280-285). V názorné modifikaci popsané zde v příkladech je savčí hostitelskou buňkou prasečí hostitelská buňka transfekovaná El-genovou sekvencí lidského adenoviru 5.
PCV genom je možné izolovat z PCV virionu nebo jako součást PCV genomu inzertovaného do plasmidu a to za využití běžných molekulárně biologických a biotechnologických postupů. Zaklonování kompletního PCV2 genomu do vektoru pBluescript II KS(+) od Stratagene pomocí PCR je popsáno v Liu, et al. (2000, J. Clin. Microbiol. vol. 38:3474-3477). Kompletní genomickou DNA PCV2 je možné získat za vzniklého plasmidu po jeho štěpení enzymem SacII.
Circovirovou nukleotidovou sekvenci je možné vnést do akceptující hostitelské savčí buňky jakoukoliv metodou známou v oblasti techniky, což zahrnuje (nejenom však) transfekci a transformaci, včetně (nejenom však) mikroinjekce, elektroporace, CaPO4 precipitace, DEAE-dextranu, liposomů, ostřelování částicemi, atd. Názorný způsob transfekce PCV2 nukleotidové sekvence do VIDO Rl buněk je zde popsáno v příkladu 3.
-5 CZ 304525 B6
Způsoby kultivace prokaryotických buněk, jako jsou bakteriální buňky, a eukaryotických buněk, jako jsou savčí hostitelské buňky exprimující adenovirovou El-funkci, jsou chápány jako rutinní pro odborníky v dané oblasti techniky.
Následující příklady mají sloužit k ilustraci vynálezu, ne však kjeho omezení na tyto příklady. Všechny uvedené citace a patentové publikace jsou zde zahrnuty formou odkazu v plném znění.
Přehled obrázků na výkresech
Obrázky IA až 1B ukazují charakterizaci a titraci viru PCV2 získaného DNA transfekcí a následnou extrakcí z infikovaných buněk VIDO Rl pomocí Hirtovi metody. (A) V PCR (polymerasová řetězová reakce) byly použity primery specifické pro PCV2 a DNA získaná z PCV2 infikovaných buněk (sloupec 1) a buněk zpracovaných stejnou metodou, ale bez vnesení virové DNA (tzv. falešně infikované buňky) (sloupec 2). Jako pozitivní kontrola byl použit plasmid obsahující PCV2 genom (sloupec 3). Sloupec M je 1-kb (kb = kilobase, 1 kb = 103 pb) DNA žebříček od GIBCO BRL. (B) Virová DNA buněk infikovaných PCV2 (sloupce 1, 3 a 5) a DNA falešně infikovaných buněk (sloupce 2, 4 a 6) byla štěpena enzymy Ncol a Stul (sloupce 1 a 2), EcoRI a Stul (sloupce 3 a 4) a EcoRI a EcoRV (sloupce 5 a 6). Sloupec M je 1-kb (kb = kilobase, 1 kb = 103 pb) DNA žebříček od GIBCO BRL.
Obrázky 2A až 2B ukazují titraci PCV2 pomocí imunoperoxidasového barvení. V 72 h.p.i. (hodina po infikaci) byly falešně infikované (A) nebo PCV2 infikované (B) VIDO Rl buňky inkubovány s králičí polyklonální protilátkou anti-ORF2 a sekundární protilátkou s navázaným biotinem. Po aplikaci avidinu a s biotinem vázaného isothiokyanátperoxidasovému komplexu byla jednovrstevná buněčná kultura finálně vyvolána diaminobenzidintetrachloridem (DAB). Jedna černě zbarvená buňka odpovídá infekci jednou virovou partikulí.
Obrázky 3A až 3C zobrazují nukleotidovou sekvenci (A) a aminokyselinovou sekvenci ORF1 (B) a ORF2 (C) prasečího circoviru 2 (PCV2), nukleotidová sekvence je shodná se sekvencí uvedenou pod přírůstkovým číslem Genbank AF086834.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1: Příprava prasečích buněk sítnice transfekovaných El-genovými sekvencemi lidského adenoviru (VIDO Rl buňky)
Primární kultury prasečích embryonálních buněk sítnice byly transfekovány 10 pg plazmidu pTG 4671 (Transgene, Strasbourg, France) kalciumfosfátovou technikou. Plasmid pTG 4671 obsahuje celou E1A a E1B sekvenci (nukleotidy 505 až 4034) viru HAV5 a gen pro puromycinacetyltransferasu jako markér umožňující selekci. V tomto plasmidu je El-oblast kontrolována bazálním promotorem myšího genu pro fosfoglycerátkinasu, a gen pro puromycinacetyltransferasu je kontrolován počátečním bazálním promotorem SV40. Transformované buňky byly selektovány pomocí trojí pasáže v mediu obsahujícím 7 pg/ml puromycinu, rozpoznány na základě změn v jejich morfologii v jednotlivých polích (t.j. ztráta kontaktní inhibice) a podrobeny postupům klonování jedné buňky. Získaná buněčná linie byla nejprve testována na schopnost podporovat replikaci mutant HAV5 s deletovaným El. Dále byla u buněčné linie zjišťována přítomnost sekvence El v genomu pomocí PCR, exprese proteinů E1A a E1B pomocí Western blotu a délka intervalu buněčného dělení v kultivačních podmínkách buněčné kultury. Byla potvrzena přítomnost sekvence El a produkce EA1 a E1B byla prokázána pomocí imunoprecipitace. Interval buněčného dělení byl ve srovnání s primární buněčnou kulturou zkrácen.
-6CZ 304525 B6
Pro stanovení stability exprese El byly VIDO Rl buňky kultivovány ve více než 50-ti po sobě následujících pasáží (podíl 1:3, dvakrát týdně) a testovány na schopnost podporovat replikaci mutanty HAV5 s de letovaným El. Exprese proteinů E1A a E1B byla také v pravidelných intervalech monitorována pomocí Western blotu. Výsledky ukazují, že buněčná linie VIDO Rl si zachovává schopnost podporovat replikaci viru s deletovaným Ela exprimovat El-protein na téměř stejné hladině v průběhu více než 50-ti pasáží v buněčné kultuře. Na základě toho je možné považovat VIDO Rl za stabilní buněčnou linii. VIDO Rl buněčné linie je uložena v American Type Culture Collection (ATCC) a vedena pod přírůstkovým číslem PTA-155.
Příklad 2: Popis molekulárního klonování kompletního genomu PCV2
Počátečně byla PCV2 DNA amplifikována pomocí PCR ze vzorku celkové DNA získané od selat s PMWS. Zaklonování kompletního PCV2 DNA genomu do vektoru pBluescript II KS(+) (Stratagene) pomocí PCR je popsáno v Liu, et al. (2000, J. Clin. Microbiol. vol 38:3474-3477). Genová sekvence PCV2 byla podána do GenBank (přírůstkové č. AF086834). Kompletní genomickou DNA PCV2 je možné získat ze vzniklého plasmidu po jeho štěpení enzymem SacII.
Příklad 3: Transfekce VIDO Rl buněk plasmidem obsahujícím PCV2 genom
Příklad 3 popisuje transfekci VIDO Rl buněk, tak jako je popsáno v příkladu 1, plasmidem obsahujícím PCV2 genom získaným podle příkladu 2.
Materiál a metody
Buněčná kultura
Buněčná linie prasečích embryonálních buněk sítnice, VIDO Rl, popsaná v příkladu 1 a Věro buňky (ATCC) byly udržovány v prostředí 37 °C, 5% CO2 v Eaglově MEM mediu s přídavkem 10% nebo 5% teplem inaktivovaného fetálního bovinního séra (FBS).
Transfekce a infikace
Jednovrstevné kultury VIDO Rl buněk narostlé v 6-ti jamkové kultivační misce byly transfekovány nakloňovanou PCV2 DNA za použití Lipofectinu podle pokynů výrobce (GIBCO BRL). Transfekci předcházelo uvolnění kompletního PCV2 genomu z plasmidu štěpením plazmidu enzymem SacII (Liu, Q., et al., 2000, J. Clin. Microbiol. 38:3474-3477). V případě infikace virem byly transfekované VIDO Rl buňky podrobeny třem cyklům opakovaného zamrazování (70 °C) a zpětného rozmrazování (37 °C). Lysát byl poté pročištěn centrifugací a použit k infikaci čerstvých VIDO Rl buněk. V publikovaných studiích je buněčná linie prasečích ledvin, která neobsahuje PCV1, použita ke kultivaci viru PCV2. K stimulaci vstupu buňky do S-fáze buněčného cyklu jsou v těchto publikacích buňky vždy ošetřeny B-glukosaminem (viz Tischer et al., (1987). Arch Virol. 96:39-57). Toto ošetření však musí být provedeno opatrně, protože Dglukosamin je pro buněčnou kulturu toxický (viz Allan et al., (2000). J. Vet. Diagn. Investigation. 12:3-14). Ve srovnání s tím, protože VIDO Rl buňky byly v této studii transformovány HAV5El, který u nich dokáže indukovat S-fázi, nebylo zde ošetření D-glukosaminem nutné.
Příklad 4
Purifikace a titrace viru
Za účelem purifikace PCV2 viru byly PCV2-infikované VIDO Rl buňky inkubovány s 0,5% Triton X-l 14 v prostředí fosfátového pufru (PBS) při 37 °C po dobu 45-ti minut s následnou
-7CZ 304525 B6 extrakcí Freonem 113 (1,1,2-trichlorotrifluoroethan). Buněčná drť a membrány byly pročištěny pomocí centrifugace při zrychlení 2000 g po dobu 15-ti min. Viry přítomné v supematantu byly s cílem získat jejich peletu centrifugovány při zrychlení 35 000 g po dobu 3 h přes 20% sacharosový „tlumič“. Virová peleta byla zpět rozpuštěna v PBS a uskladněna při -70 °C. Virové titry byly hodnoceny v infekčních jednotkách (1U) na základě kvantifikace ORF2 proteinu imunoperoxidasovým barvením. Za účelem určení titru byly jednovrstevné buněčné kultury v 12-ti jamkových kultivačních miskách infikovány ředicí řadou viru. Po 1-hodinové adsorpci viru byly buňky promyty a převrstveny MEM obsahujícím 2% FBS a 0,7% agarosu. 3 dny po infikaci (p.i.) byla agarosová vrstva odstraněna a buňky byly fixovány a permeabilizovány směsí methanol/acetát (v objemovém poměru 1:1) po dobu 20 min. při -20 °C. Po stabilizaci 1% bovinním sérovým albuminem po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě byly buňky inkubovány s králičím anti-ORF2 sérem (Liu et al., 2001, Protein Expression and Purification. 21:115-120). Po 2hodinové inkubaci byly inkubační destičky promyty PBS a poté zpracovány za použití VECTASTAIN Elitě ABC kitu (Vector Laboratories). Reakce byla výsledně vyvinuta pomocí 3,3'-diaminobenzidintetrahydrochloridu (DAB) a prohlížena pod mikroskopem. Na základě počítání pozitivně obarvených buněk byl virový titr vyjádřen v IU, kde 1 IU byla definována jako 1 pozitivně se barvící buňka/pole (čtverec) 3 dny p.i.
Extrakce a určení virové DNA
Virová DNA byla extrahována z jednovrstevné kultury PCV2-infikovaných VIDO R1 buněk metodou podle Hirta (1967, J. Mol. Biol. 26:365-369). Virová DNA byla poté charakterizována pomocí restrikční analýzy a PCR způsobem popsaným v Liu et al., (2000), J. Clin Microbil. 38:3474-3477).
Pro PCR byla jako templát použita DNA extrahovaná z infikovaných buněk a pomocí PCV2specifíckých primerů byl amplifikován produkt specifické velikosti, žádná DNA nebyla amplifikována u kontrolních, neinfikováných buněk. Ve shodě s předpokládaným restrikčním vzorem vedlo restrikční štěpení virové DNA enzymy Ncol and Stul ke vzniku dvou fragmentů o velikosti 1291 pb a 477 pb; enzymy EcoRi a Stul ke vzniku dvou fragmentů o velikosti 1492 pb a 276 pb; a enzymy EcoRi a EcoRV ke vzniku dvou fragmentů 1094 pb a 674 pb. Data značí pro úspěšný zisk viru. Použitím imunologických barvicích metod a počítáním pozitivně obarvených buněk byl virový titr získaný výše popsaným postupem určen jako 2x107 IU/ml.
Claims (74)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Způsob kultivace savčího circoviru, který zahrnuje:a) získání savčích buněk exprimujících El-funkci savčího adenoviru, přičemž tyto buňky umožňují replikaci savčího circoviru;b) vnesení genomu nebo replikace schopné části genomu zmíněného circoviru do těchto savčích buněk; ac) kultivaci těchto buněk v podmínkách vhodných pro replikaci zmíněného savčího circoviru.
- 2. Způsob kultivace podle nároku 1, který dále zahrnuje zpětné získání zmíněného circoviru z uvedených buněk.
- 3. Způsob kultivace podle nároku 1, kde zmíněným savčím circovirem je prasečí circovirus.-8CZ 304525 B6
- 4. Způsob kultivace podle nároku 3, kde zmíněným prasečím circovirem je prasečí circovirus2.
- 5. Způsob kultivace podle nároku 3, kde zmíněným prasečím circovirem je prasečí circovirus1.
- 6. Způsob kultivace podle nároku 1, kde zmíněné savčí buňky jsou prasečího původu.
- 7. Způsob kultivace podle nároku 1, kde zmíněné savčí buňky jsou prasečí buňky sítnice.
- 8. Způsob kultivace podle nároku 1, kde zmíněná El-funkce savčího adenoviru je El-funkcí lidského adenoviru.
- 9. Způsob kultivace podle nároku 1, kde zmíněná El-funkce savčího adenoviru je El-funkcí prasečího adenoviru.
- 10. Způsob kultivace podle nároku 1, kde zmíněné savčí buňky exprimující El-funkci savčího adenoviru jsou trvale transformovány genovou sekvencí El savčího adenoviru.
- 11. Způsob kultivace podle nároku 10, kde zmíněná genová sekvence El je genovou sekvencí El lidského adenoviru.
- 12. Způsob kultivace podle nároku 10, kde zmíněná genová sekvence El savčího adenoviru je heterologní k zmíněné savčí buňce.
- 13. Způsob kultivace podle nároku 1, kde zmíněná El-funkce je E1A- a/nebo ElB-funkcí.
- 14. Způsob kultivace podle nároku 3, kde zmíněný circovirus obsahuje chimérickou nukleotidovou sekvenci.
- 15. Rekombinantní savčí buňka, vyznačující se tím, že exprimuje El-funkci savčího adenoviru a obsahuje celý nebo replikace schopnou část genomu prasečího circoviru a zároveň umožňuje replikaci zmíněného prasečího circoviru.
- 16. Rekombinantní savčí buňka podle nároku 15, vyznačující se tím, že zmíněná El-funkce adenoviru je El-funkcí lidského adenoviru.
- 17. Rekombinantní savčí buňka podle nároku 15, vyznačující se tím, že zmíněná El-funkce adenoviru je El-funkcí prasečího adenoviru.
- 18. Rekombinantní savčí buňka podle nároku 15, vyznačující se tím, že zmíněná buňka je prasečího původu.
- 19. Rekombinantní savčí buňka podle nároku 15, vyznačující se tím, že zmíněná savčí buňka je prasečí buňka sítnice.
- 20. Rekombinantní savčí buňka podle nároku 15, vyznačující se tím, že tato savčí buňka exprimující El-funkci savčího adenoviru je trvale transformována genovou sekvencí El savčího adenoviru.
- 21. Rekombinantní savčí buňka podle nároku 20, vyznačující se tím, že zmíněná genová sekvence El je genovou sekvencí El lidského adenoviru.
- 22. Rekombinantní savčí buňka podle nároku 20, vyznačující se tím, že zmíněná genová sekvence El savčího adenoviru je heterologní k zmíněné savčí buňce.-9CZ 304525 B6
- 23. Způsob přípravy rekombinantní savčí buňky nesoucí El-funkci savčího adenoviru a obsahující genom prasečího circoviru, který zahrnuje následující kroky:a) získání savčí buňky exprimující El-funkci savčího adenoviru; ab) vnesení genomu nebo replikace schopné části genomu zmíněného prasečího circoviru do této savčí buňky.
- 24. Způsob přípravy podle nároku 23, který v dalším kroku zahrnuje kultivaci zmíněné rekombinantní savčí buňky za podmínek vhodných pro replikaci zmíněného savčího circoviru.
- 25. Způsob přípravy podle nároku 24, který dále zahrnuje zpětné získání zmíněného circoviru ze zmíněných kultivovaných savčích buněk.
- 26. Způsob přípravy podle nároku 23, kde zmíněným prasečím circovirem je prasečí circovirus2.
- 27. Způsob přípravy podle nároku 23, kde zmíněným prasečím circovirem je prasečí circovirus 1.
- 28. Způsob přípravy podle nároku 23, kde zmíněné savčí buňky jsou prasečího původu.
- 29. Způsob přípravy podle nároku 28, kde zmíněné savčí buňky jsou prasečí buňky sítnice.
- 30. Způsob přípravy podle nároku 23, kde zmíněná El-funkce adenoviru je El-funkcí lidského adenoviru.
- 31. Způsob přípravy podle nároku 23, kde zmíněná El-funkce adenoviru je El-funkcí prasečího adenoviru.
- 32. Způsob přípravy podle nároku 23, kde zmíněný prasečí circovirus obsahuje chimérickou nukleotidovou sekvenci.
- 33. Způsob přípravy podle nároku 23, kde zmíněná savčí buňka nesoucí El-funkci savčího adenoviru je trvale transformována genovou sekvencí El savčího adenoviru.
- 34. Způsob přípravy podle nároku 33, kde zmíněná genová sekvence El savčího adenoviru je heterologní k zmíněné savčí buňce.
- 35. Způsob replikace savčího circoviru zahrnující kultivování savčí buňky, která obsahuje genom savčího circoviru nebo jeho část schopnou replikace, za podmínek vhodných pro replikaci zmíněného savčího circoviru, přičemž savčí buňka exprimuje funkční protein El savčího adenoviru a je permisivní pro replikaci savčího circoviru, a popřípadě izolaci zmíněného circoviru z kultivované buňky.
- 36. Způsob podle nároku 35, kde zmíněným savčím circovirem je prasečí circovirus.
- 37. Způsob podle nároku 36, kde zmíněným prasečím circovirem je prasečí circovirus typu 2.
- 38. Způsob podle nároku 36, kde zmíněným prasečím circovirem je prasečí circovirus typu 1.
- 39. Způsob podle nároku 35, kde zmíněné savčí buňky jsou prasečího původu.
- 40. Způsob podle nároku 39, kde zmíněné savčí buňky jsou prasečí buňky sítnice.-10CZ 304525 B6
- 41. Způsob podle nároku 35, kde funkční protein El zmíněného savčího adenoviru je funkční protein El lidského adenoviru.
- 42. Způsob podle nároku 35, kde funkční protein El zmíněného savčího adenoviru je funkční protein El prasečího adenoviru.
- 43. Způsob podle nároku 35, kde zmíněné savčí buňky exprimující funkční protein El savčího adenoviru jsou trvale transformovány genovou sekvencí El savčího adenoviru.
- 44. Způsob podle nároku 43, kde zmíněná genová sekvence El je genovou sekvencí El lidského adenoviru.
- 45. Způsob podle nároku 43, kde zmíněná genová sekvence El savčího adenoviru je heterologní ke zmíněné savčí buňce.
- 46. Způsob podle nároku 35, kde zmíněný funkční protein El je funkční protein El A a/nebo E1B.
- 47. Způsob podle nároku 36, kde zmíněný prasečí circovirus obsahuje chimérickou nukleotidovou sekvenci.
- 48. Způsob přípravy rekombinantní savčí buňky zahrnující zavedení genomu savčího circoviru nebo jeho části schopné replikace do savčí buňky, která exprimuje funkční protein El savčího adenoviru, kde tato buňka je permisivní pro replikaci savčího circoviru.
- 49. Způsob přípravy rekombinantní savčí buňky zahrnující zavedení genové oblasti El savčího adenoviru do savčí buňky, která obsahuje genom savčího circoviru a/nebo jeho část schopnou replikace, kde tato buňka je permisivní pro replikaci savčího circoviru.
- 50. Způsob podle nároku 48 nebo 49, který dále zahrnuje stupeň kultivování zmíněné rekombinantní savčí buňky za podmínek vhodných pro replikaci zmíněného circoviru.
- 51. Způsob podle nároku 50, dále zahrnující izolaci zmíněného circoviru ze zmíněné kultivované buňky.
- 52. Způsob podle nároku 48 nebo 49, kde zmíněným circovirem je prasečí circovirus.
- 53. Způsob podle nároku 52, kde zmíněným prasečím circovirem je prasečí circovirus typu 1 nebo prasečí circovirus typu 2.
- 54. Způsob podle nároku 48 nebo 49, kde zmíněná savčí buňka je prasečího původu.
- 55. Způsob podle nároku 54, kde zmíněná savčí buňka je prasečí buňka sítnice.
- 56. Způsob podle nároku 48 nebo 49, kde zmíněný funkční protein El adenoviru je funkční protein El lidského adenoviru.
- 57. Způsob podle nároku 48 nebo 49, kde zmíněný funkční protein El adenoviru je funkční protein El prasečího adenoviru.
- 58. Způsob podle nároku 48 nebo 49, kde zmíněný circovirus obsahuje chimérickou nukleotidovou sekvenci.
- 59. Způsob podle nároku 48 nebo 49, kde zmíněná savčí buňka je trvale transformována genovou sekvencí El savčího adenoviru.-11 CZ 304525 B6
- 60. Způsob podle nároku 48 nebo 49, kde zmíněná genová sekvence El savčího adenoviru je heterologní ke zmíněné savčí buňce.
- 61. Způsob podle nároku 48 nebo 49, kde zmíněný funkční protein El je funkční protein E1A a/nebo E1B.
- 62. Způsob exprese genomu savčího circoviru nebo jeho části zahrnující kultivování savčí buňky, která obsahuje genom savčího circoviru nebo jeho část za podmínek vhodných pro expresi zmíněného genomu savčího circoviru nebo jeho části, kde savčí buňka exprimuje funkční protein El savčího adenoviru, a popřípadě izolování zmíněného circoviru nebo jeho části z kultivované buňky.
- 63. Způsob podle nároku 62, kde zmíněným savčím circovirem je prasečí circovirus.
- 64. Způsob podle nároku 63, kde zmíněným prasečím circovirem je prasečí circovirus typu 2.
- 65. Způsob podle nároku 63, kde zmíněným prasečím circovirem je prasečí circovirus typu 1.
- 66. Způsob podle nároku 62, kde zmíněná savčí buňka je prasečího původu.
- 67. Způsob podle nároku 66, kde zmíněná savčí buňka je prasečí buňka sítnice.
- 68. Způsob podle nároku 62, kde zmíněný funkční protein El savčího adenoviru je funkční protein El lidského adenoviru.
- 69. Způsob podle nároku 62, kde zmíněný funkční protein El savčího adenoviru je funkční protein El prasečího adenoviru.
- 70. Způsob podle nároku 62, kde zmíněná savčí buňka je trvale transformována genovou sekvencí El savčího adenoviru.
- 71. Způsob podle nároku 70, kde zmíněná genová sekvence El je genovou sekvencí El lidského adenoviru.
- 72. Způsob podle nároku 70, kde zmíněná genová sekvence El savčího adenoviru je heterologní ke zmíněné savčí buňce.
- 73. Způsob podle nároku 23 nebo 62, kde zmíněný funkční protein El je funkční protein E1A a/nebo E1B.
- 74. Způsob podle nároku 62, kde zmíněný prasečí circovirus obsahuje chimérickou nukleotidovou sekvenci.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US27917301P | 2001-03-27 | 2001-03-27 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ20032584A3 CZ20032584A3 (en) | 2004-03-17 |
| CZ304525B6 true CZ304525B6 (cs) | 2014-06-18 |
Family
ID=23067939
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ2003-2584A CZ304525B6 (cs) | 2001-03-27 | 2002-03-27 | Způsob kultivace circoviru |
Country Status (24)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US6794163B2 (cs) |
| EP (1) | EP1379671B1 (cs) |
| JP (1) | JP4038127B2 (cs) |
| KR (1) | KR100876629B1 (cs) |
| CN (2) | CN1309836C (cs) |
| AT (1) | ATE430807T1 (cs) |
| AU (1) | AU2002244584B2 (cs) |
| BR (1) | BRPI0208456B8 (cs) |
| CA (1) | CA2442135C (cs) |
| CY (1) | CY1109267T1 (cs) |
| CZ (1) | CZ304525B6 (cs) |
| DE (1) | DE60232234D1 (cs) |
| DK (1) | DK1379671T3 (cs) |
| ES (1) | ES2324466T3 (cs) |
| HU (1) | HU228065B1 (cs) |
| MX (1) | MXPA03008810A (cs) |
| MY (2) | MY148759A (cs) |
| PL (1) | PL202951B1 (cs) |
| PT (1) | PT1379671E (cs) |
| RU (2) | RU2312142C2 (cs) |
| SK (1) | SK287969B6 (cs) |
| UA (1) | UA82647C2 (cs) |
| WO (1) | WO2002077210A2 (cs) |
| ZA (1) | ZA200307517B (cs) |
Families Citing this family (31)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2772047B1 (fr) * | 1997-12-05 | 2004-04-09 | Ct Nat D Etudes Veterinaires E | Sequence genomique et polypeptides de circovirus associe a la maladie de l'amaigrissement du porcelet (map), applications au diagnostic et a la prevention et/ou au traitement de l'infection |
| US20040062775A1 (en) * | 1997-12-05 | 2004-04-01 | Agence Francaise De Securite Sanitaire Des Aliments | Circovirus sequences associated with piglet weight loss disease (PWD) |
| ES2170622B1 (es) * | 1999-12-03 | 2004-05-16 | Consejo Superior De Investigaciones Cientificas | Clones y vectores infectivos derivados de coronavirus y sus aplicaciones. |
| MXPA03008810A (es) * | 2001-03-27 | 2004-02-17 | Univ Saskatchewan | Metodos para cultivar circovirus. |
| US20030096377A1 (en) * | 2001-06-28 | 2003-05-22 | Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. | Differential PCR-RFLP assay for detecting and distinguishing between nonpathogenic PCV-1 and pathogenic PCV-2 |
| US7276353B2 (en) * | 2001-12-12 | 2007-10-02 | Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. | Chimeric infectious DNA clones, chimeric porcine circoviruses and uses thereof |
| US7279166B2 (en) | 2001-12-12 | 2007-10-09 | Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. | Chimeric infectious DNA clones, chimeric porcine circoviruses and uses thereof |
| US7833707B2 (en) * | 2004-12-30 | 2010-11-16 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Methods of overexpression and recovery of porcine circovirus type 2 ORF2 |
| UA95602C2 (ru) | 2004-12-30 | 2011-08-25 | Берингер Ингельхейм Ветмедика, Инк. | Иммуногенная композиция цвс2 и способы приготовления такой композиции |
| US7700285B1 (en) | 2005-12-29 | 2010-04-20 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | PCV2 immunogenic compositions and methods of producing such compositions |
| US8834891B2 (en) | 2005-03-14 | 2014-09-16 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Immunogenic compositions comprising Lawsonia intracellularis |
| MX338626B (es) | 2005-12-29 | 2016-04-26 | Boehringer Ingelheim Vetmed | Uso de una composicion inmunogenica de pcv2 para producir los sintomas clinicos en cerdos. |
| EP2275132B1 (en) | 2005-12-29 | 2021-03-03 | Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc. | Multivalent PCV2 immunogenic compositions and methods of producing them |
| EP2859900A1 (en) * | 2006-12-11 | 2015-04-15 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Effective method of treatment of porcine circovirus and lawsonia intracellularis infections |
| BRPI0721083A2 (pt) * | 2006-12-15 | 2014-02-25 | Boehringer Ingelheim Vetmed | Tratamento de porcos com antígeno de pcv2 |
| EP1941903A1 (en) * | 2007-01-03 | 2008-07-09 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Prophylaxis and treatment of PRDC |
| EP1958644A1 (en) | 2007-02-13 | 2008-08-20 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Prevention and treatment of sub-clinical pcvd |
| US8518696B2 (en) * | 2007-05-11 | 2013-08-27 | Temasek Life Sciences Laboratory Limited | Production of homogeneous cell line highly permissive to porcine circovirus type 2 (PCV2) infection |
| WO2008151215A1 (en) * | 2007-06-04 | 2008-12-11 | Merial Limited | Production of porcine circovirus proteins in plants |
| US7829274B2 (en) | 2007-09-04 | 2010-11-09 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Reduction of concomitant infections in pigs by the use of PCV2 antigen |
| AU2008343172B2 (en) * | 2007-12-21 | 2015-02-19 | Zoetis Services Llc | Methods and compositions for immunizing pigs against porcine circovirus |
| JP2011508595A (ja) * | 2007-12-31 | 2011-03-17 | ベーリンガー インゲルハイム フェトメディカ インコーポレイテッド | 外来性アミノ酸の挿入を含むｐｃｖ２ｏｒｆ２ウイルス様粒子 |
| JP5613061B2 (ja) * | 2008-01-23 | 2014-10-22 | ベーリンガー インゲルハイム フェトメディカ インコーポレイテッド | Ｐｃｖ２マイコプラズマ・ハイオニューモニエ免疫原性組成物および前記組成物の製造方法 |
| NZ588639A (en) * | 2008-04-16 | 2012-10-26 | Virginia Tech Intell Prop | CHIMERIC PORCINE CIRCOVIRUS PCV2Gen-1Rep AND USES THEREOF |
| TWI627281B (zh) * | 2009-09-02 | 2018-06-21 | 百靈佳殷格翰家畜藥品公司 | 降低ｐｃｖ－２組合物殺病毒活性之方法及具有改良免疫原性之ｐｃｖ－２組合物 |
| US20120100168A1 (en) * | 2010-01-25 | 2012-04-26 | Blood Systems, Inc. | Cyclovirus and methods of use |
| KR102319843B1 (ko) | 2013-09-25 | 2021-10-29 | 조에티스 서비시즈 엘엘씨 | Pcv2b 분지형 백신 조성물 및 사용 방법 |
| US9505808B2 (en) | 2013-10-02 | 2016-11-29 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | PCV2 ORF2 protein variant and virus like particles composed thereof |
| HK1252427A1 (zh) | 2015-05-14 | 2019-05-24 | Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc. | 猪环状病毒生产方法和pcv2疫苗 |
| WO2018071511A1 (en) * | 2016-10-11 | 2018-04-19 | Orion Labs | Group communication forwarding to a secondary service |
| CN114934020B (zh) * | 2022-01-30 | 2024-02-13 | 山东省滨州畜牧兽医研究院 | 猪视网膜上皮细胞系及其建立方法和应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000001409A2 (en) * | 1998-07-06 | 2000-01-13 | Merial | Porcine circovirus and parvovirus vaccine |
| WO2000026395A2 (en) * | 1998-11-02 | 2000-05-11 | University Of Saskatchewan | Bovine cells expressing adenovirus essential functions for propagation of recombinant adenoviral vectors |
Family Cites Families (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1257976C (zh) * | 1996-10-23 | 2006-05-31 | 宾夕法尼亚州立大学托管会 | 改良疫苗 |
| AUPO856097A0 (en) | 1997-08-14 | 1997-09-04 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Vector |
| US7192594B2 (en) | 1997-10-03 | 2007-03-20 | Merial Limited | Postweaning multisystemic wasting syndrome and porcine circovirus from pigs |
| UA78180C2 (uk) | 1997-10-03 | 2007-03-15 | Меріаль | Кільцевий вірус свині типу ii, вакцини та діагностичні реагенти |
| US6517843B1 (en) * | 1999-08-31 | 2003-02-11 | Merial | Reduction of porcine circovirus-2 viral load with inactivated PCV-2 |
| US6391314B1 (en) | 1997-10-03 | 2002-05-21 | Merial | Porcine circoviruses vaccines diagnostic reagents |
| FR2772047B1 (fr) | 1997-12-05 | 2004-04-09 | Ct Nat D Etudes Veterinaires E | Sequence genomique et polypeptides de circovirus associe a la maladie de l'amaigrissement du porcelet (map), applications au diagnostic et a la prevention et/ou au traitement de l'infection |
| US6287856B1 (en) | 1998-03-13 | 2001-09-11 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Vaccines against circovirus infections |
| US6492343B1 (en) | 1998-04-15 | 2002-12-10 | University Of Saskatchewan | Porcine adenovirus type 3 genome |
| WO2000014092A1 (en) | 1998-09-08 | 2000-03-16 | Giri Brij P | Chemiluminescent 1,2-dioxetanes |
| FR2789695B1 (fr) | 1999-02-11 | 2003-03-07 | Merial Sas | Vecteurs et vaccins viraux a base d'adenovirus porcins recombines et replicatifs |
| US6497883B1 (en) | 1999-06-10 | 2002-12-24 | Merial | Porcine circovirus recombinant poxvirus vaccine |
| US6943152B1 (en) | 1999-06-10 | 2005-09-13 | Merial | DNA vaccine-PCV |
| CA2413265A1 (en) | 2000-05-03 | 2001-11-08 | University Of Guelph | Porcine adenovirus type 5 vector and vaccine |
| MXPA03008810A (es) | 2001-03-27 | 2004-02-17 | Univ Saskatchewan | Metodos para cultivar circovirus. |
-
2002
- 2002-03-27 MX MXPA03008810A patent/MXPA03008810A/es active IP Right Grant
- 2002-03-27 CN CNB02809221XA patent/CN1309836C/zh not_active Expired - Lifetime
- 2002-03-27 CA CA002442135A patent/CA2442135C/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-03-27 MY MYPI2011006359A patent/MY148759A/en unknown
- 2002-03-27 US US10/112,540 patent/US6794163B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-03-27 CN CN2006100731464A patent/CN1840656B/zh not_active Expired - Lifetime
- 2002-03-27 DE DE60232234T patent/DE60232234D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2002-03-27 AU AU2002244584A patent/AU2002244584B2/en not_active Expired
- 2002-03-27 HU HU0500161A patent/HU228065B1/hu unknown
- 2002-03-27 CZ CZ2003-2584A patent/CZ304525B6/cs not_active IP Right Cessation
- 2002-03-27 UA UA2003109561A patent/UA82647C2/uk unknown
- 2002-03-27 WO PCT/CA2002/000413 patent/WO2002077210A2/en not_active Ceased
- 2002-03-27 PT PT02712700T patent/PT1379671E/pt unknown
- 2002-03-27 PL PL364077A patent/PL202951B1/pl unknown
- 2002-03-27 JP JP2002576653A patent/JP4038127B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2002-03-27 SK SK1210-2003A patent/SK287969B6/sk unknown
- 2002-03-27 MY MYPI20021106A patent/MY146518A/en unknown
- 2002-03-27 RU RU2003131342/13A patent/RU2312142C2/ru active
- 2002-03-27 AT AT02712700T patent/ATE430807T1/de active
- 2002-03-27 EP EP02712700A patent/EP1379671B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-03-27 BR BRPI0208456A patent/BRPI0208456B8/pt active IP Right Grant
- 2002-03-27 ES ES02712700T patent/ES2324466T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-03-27 DK DK02712700T patent/DK1379671T3/da active
- 2002-03-27 KR KR1020037012491A patent/KR100876629B1/ko not_active Expired - Lifetime
-
2003
- 2003-09-26 ZA ZA200307517A patent/ZA200307517B/en unknown
-
2004
- 2004-05-07 US US10/840,879 patent/US7172899B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2007
- 2007-01-17 US US11/654,869 patent/US7560278B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2007-03-23 RU RU2007110808/13A patent/RU2007110808A/ru not_active Application Discontinuation
-
2009
- 2009-08-04 CY CY20091100822T patent/CY1109267T1/el unknown
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000001409A2 (en) * | 1998-07-06 | 2000-01-13 | Merial | Porcine circovirus and parvovirus vaccine |
| WO2000026395A2 (en) * | 1998-11-02 | 2000-05-11 | University Of Saskatchewan | Bovine cells expressing adenovirus essential functions for propagation of recombinant adenoviral vectors |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Fenaux M. et al.: "Cloned genomic DNA of type 2 porcine circovirus is infectious when injected directly into the liver and lymph nodes of pigs: characterization of clinical disease, virus distribution, and pathologic lesions", J. Virol., Vol. 76(2), 541-551, leden 2002 * |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US7560278B2 (en) | Methods to culture circovirus | |
| AU2002244584A1 (en) | Methods to culture circovirus | |
| CN1620310B (zh) | 嵌合传染性dna克隆,嵌合猪环状病毒及其用途 | |
| JP5362750B2 (ja) | ブタサーコウイルス、ワクチンおよび診断試薬 | |
| US20040253270A1 (en) | Chimeric infectious DNA clones, chimeric porcine circoviruses and uses thereof | |
| JP2010222359A (ja) | ブタサーコウイルスおよびパルボウイルスワクチン | |
| Pan et al. | Development of recombinant porcine parvovirus-like particles as an antigen carrier formed by the hybrid VP2 protein carrying immunoreactive epitope of porcine circovirus type 2 | |
| Huang et al. | Construction and biological characterisation of recombinant porcine circovirus type 2 expressing the V5 epitope tag | |
| AU5913796A (en) | Neutralizing conformational epitopes of chicken anemia virus | |
| HK1076484A (en) | Methods to culture circovirus | |
| Juhan et al. | Construction and in vitro characterization of a chimeric porcine circovirus with the PCV1 rep gene in the genomic backbone of PCV2 | |
| HK1151539B (en) | Chimeric infectious dna clones of porcine circovirus and uses thereof | |
| HK1151988B (en) | Chimeric infectious dna clones of porcine circovirus and uses thereof |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MK4A | Patent expired |
Effective date: 20220327 |