ES2324466T3

ES2324466T3 - Metodos para cultivar circovirus.

Info

Publication number: ES2324466T3
Application number: ES02712700T
Authority: ES
Inventors: Qiang Liu; Suresh K. Tikoo; Philip Willson; Lorne A. Babiuk
Original assignee: University of Saskatchewan
Current assignee: University of Saskatchewan
Priority date: 2001-03-27
Filing date: 2002-03-27
Publication date: 2009-08-07
Anticipated expiration: 2022-03-27
Also published as: MXPA03008810A; EP1379671B1; DE60232234D1; US6794163B2; KR100876629B1; BRPI0208456B1; PL202951B1; US20020177216A1; DK1379671T3; BR0208456A; AU2002244584B2; US20050239187A1; UA82647C2; HUP0500161A3; WO2002077210A2; MY146518A; RU2312142C2; PT1379671E; CN1840656A; PL364077A1

Abstract

Un método para cultivar un circovirus de mamífero que comprende: a) obtener células de mamífero que expresan una función de adenovirus E1 de mamífero, donde dichas células son permisivas para la replicación de circovirus de mamífero; b) introducir el genoma de circovirus de mamífero, o una porción del mismo capaz de replicarse, dentro de dichas células de mamífero; y c) cultivar dichas células de mamífero bajo condiciones adecuadas para la replicación de dicho circovirus de mamífero.

Description

Métodos para cultivar circovirus.

Campo técnico

La presente invención se refiere al campo de circovirus y proporciona composiciones y métodos para cultivar circovirus, en particular circovirus porcinos. En particular, la presente invención se refiere a métodos para cultivar circovirus porcinos en células de mamífero que expresan una función génica de adenovirus E1 de mamíferos.

Antecedentes de la técnica

Una familia de virus, llamados Circoviridae, encontrada en un intervalo de especies de plantas y animales y denominados comúnmente como circovirus, se caracteriza como viriones redondos, sin cubierta con diámetros medios de 17 a 23,5 nm que contienen ácido desoxirribonucleico circular de cadena sencilla (ssADN). El genoma ssADN de los circovirus representa los replicones de ADN viral más pequeños conocidos. Tal como se describe en WO 99/45956, al menos se han identificado seis virus como miembros de la familia, según con la Sexta Descripción del Comité Internacional para la Taxonomía de Virus (Lukert, P. D. et al., 1995, The Circoviridae, págs. 166-168. En F. A. Murphy, et al., (eds.) Virus Taxonomy, Sexta Descripción del Comité Internacional en Taxonomía de Virus, Arch. Virol. 10 Supl.).

Los virus animales incluidos en la familia son virus de la anemia del pollo (CAV); virus de la enfermedad del pico y las plumas (BFDV); circovirus porcino (PCV); y circovirus de las palomas. El PCV se aisló originalmente en cultivos celulares de riñón de cerdo. El PCV se replica en el núcleo celular y produce grandes cuerpos de inclusión intranucleares. Véase Murphy et al. (1999, Circoviridae p. 357-361, Veterinary Virology, 3ª Ed. Academic Press, San Diego). Actualmente hay dos tipos de PCV reconocidos, PCV tipo 1 (PCV1) y PCV tipo 2 (PCV2). El PCV1, aislado como contaminante persistente de la línea celular continua PK-14 de riñón de cerdo (ATCC CCL31), no causa efectos citopáticos detectables en el cultivo celular y falla en la producción de enfermedades clínicas en cerdos tras infección experimental (véase Allan G., 1995, Vet. Microbiol. 44: 49-64; Tischer, I. et al., 1982, Nature 295:64-66; y Tischer, I. et al., 1986, Arch. Virol. 91:271-276). El PCV2, al contrario que PCV1, está estrechamente asociado al síndrome degenerativo multisistémico tras el destete (PMWS) en cerdos destetados (véase Allan G. et al., 1998, Europe. J. Vet. Diagn. Investig. 10:3-10; Ellis, J. et al., 198, Can. Vet. J. 39:44-51 y Morozov, I. et al., 1998, J. Clin. Microbiol. 36:2535-2541). Las secuencias nucleotídicas para PCV1 están descritas en Mankertz, A., et al. (1997, J. Virol. 71:2562-2566) y Meehan, B. M., et al. (1997, J. Gen. Virol. 78:221-227) y las secuencias nucleotídicas para PCV2 están descritas en Hamel, A. L. et al.(1998, J. Virol. 72:5262-5267); Mankertz, A. et al. (2000, Virus Res. 66:65-67) y Meehan, B. M. et al. (1998, J. Gen. Virol. 79:2171-2179). Las cepas de PCV2 están descritas en el documento WO 00/01409 y han sido depositadas en la Colección Europea de Cultivos Celulares, Centro para Microbiología y Desarrollo Aplicado, Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, Reino Unido e incluye: Nº de acceso V97100219; Nº de acceso V9700218; Nº de acceso V97100217, Nº de acceso V98011608; y Nº de acceso V98011609. El documento WO 00/77216 también describe PCV2.

Estudios publicados hasta la fecha sobre PCV2 usaban tanto homogenado de tejido como virus cultivados derivados de aislados de campo. Tischer et al. (1987, Arch. Virol. 96:39-57) describen que las células de riñón de cerdo son estimuladas para entrar en la fase S del ciclo celular por tratamiento con D-glucosamina. Sin embargo, el tratamiento debe ser realizado con cuidado porque la D-glucosamina es tóxica para el cultivo celular (véase, Allan et al., (2000) J. Vet. Diagn. Investigation. 12:3-14). Queda la necesidad de métodos para cultivar circovirus, tales como PCV1 y PCV2, y otros circovirus de forma que se obtiene el circovirus puro. Dichos métodos pueden ser ventajosos, en particular, para la preparación de antígenos de PCV2 como vacunas dirigidas frente a PMWS. La presente invención trata esta necesidad.

Todas las patentes y publicaciones están incorporadas en su totalidad en la presente memoria.

Descripción de la invención

La presente invención proporciona métodos para cultivar circovirus de mamífero que comprende: a) obtener células de mamífero que expresan una función adenovirus E1 de mamíferos, donde dichas células son permisivas para la replicación de circovirus de mamífero; b) introducir dicho genoma de circovirus de mamífero, o una porción del mismo capaz de replicarse, dentro de dichas células de mamífero; y c) cultivar dichas células de mamífero bajo condiciones adecuadas para la replicación de dichos circovirus de mamífero. En algunas realizaciones, el método además comprende recuperar dichos circovirus de dichas células cultivadas.

En algunas realizaciones, el circovirus de mamífero es circovirus porcino, tal como por ejemplo, circovirus porcino 1 (PCV1) o circovirus porcino 2 (PCV2). Todavía en realizaciones adicionales, el circovirus porcino comprende una secuencia nucleotídica quimérica. En otras realizaciones, las células de mamífero son de origen porcino. Todavía en otras realizaciones, las células de mamífero son células de retina de cerdo.

En otras realizaciones, la función de adenovirus E1 de mamífero es la función de adenovirus E1 humana. Todavía en otras realizaciones, la función de adenovirus E1 de mamífero es la función de adenovirus E1 de cerdo. En realizaciones adicionales, la función E1 es función E1A y/o E1B. Todavía en realizaciones adicionales, la célula de mamífero que expresa la función E1 de mamífero es transformada de forma estable con secuencias génicas E1 de mamífero. En otras realizaciones, la secuencia génica E1 de mamífero es heteróloga a dicha célula de mamífero.

La presente invención también proporciona células recombinantes de mamífero que expresan una función de adenovirus E1 de mamífero y comprenden un genoma de circovirus de mamífero, o una porción del mismo capaz de replicarse, y donde dichas células son permisivas para la replicación de dicho circovirus de mamífero. En algunas realizaciones, el circovirus de mamífero es circovirus porcino, tal como por ejemplo, circovirus porcino 1 (PCV1) o circovirus porcino 2 (PCV2). Todavía en realizaciones adicionales, el circovirus porcino comprende una secuencia nucleotídica quimérica. En algunas realizaciones, la función de adenovirus E1 es función de adenovirus E1 humana. En otras realizaciones, la función E1 es función de adenovirus E1 de cerdo. En otras realizaciones, la célula de mamífero es de origen porcino. En realizaciones adicionales, la célula de mamífero es una célula de retina de cerdo. Todavía en realizaciones adicionales, la célula de mamífero que expresa la función E1 de mamífero es transformada de forma estable con secuencias génicas de adenovirus E1 de mamífero. En otras realizaciones, la secuencia génica E1 de mamífero es heteróloga a dicha célula de mamífero.

La presente invención también proporciona métodos para preparar una célula recombinante de mamífero que expresa una función de adenovirus E1 de mamífero y que comprende un genoma de circovirus de mamífero que comprende las etapas de, a) obtener una célula de mamífero que expresa una función de adenovirus E1 de mamífero; y b) introducir dicho genoma de circovirus de mamífero, o porción del mismo capaz de replicarse, dentro de dicha célula de mamífero. En realizaciones adicionales, el método comprende la etapa adicional de cultivar la célula recombinante de mamífero bajo condiciones adecuadas para la replicación de dicho circovirus de mamífero. En realizaciones adicionales, el método comprende recuperar dicho circovirus de dichas células cultivadas. En algunas realizaciones, el circovirus de mamífero es circovirus porcino, tal como por ejemplo circovirus porcino 1 (PCV1) o circovirus porcino 2 (PCV2). Todavía en realizaciones adicionales, el circovirus porcino comprende una secuencia nucleotídica quimérica. En realizaciones adicionales, las células de mamífero son de origen porcino. Todavía en realizaciones adicionales, las células de mamífero son células de retina de cerdo. En realizaciones adicionales, la función de adenovirus E1 es función de adenovirus E1 humana o función de adenovirus E1 de cerdo. Todavía en realizaciones adicionales, la célula de mamífero que expresa la función E1 de mamífero es transformada de forma estable con secuencias génicas de adenovirus E1 de mamífero. En otras realizaciones, la secuencia génica E1 de mamífero es heteróloga a dicha célula de mamífero.

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Breve descripción de las figuras

Las Figuras 1A-1B proporcionan la caracterización y titulación de virus PCV2 generados por transfección de ADN y extracción a partir de células VIDO R1 infectadas por el método de Hirt. (A) PCR usando cebadores específicos de PCV2 y ADN de células infectadas con PCV2 (carril 1) y células infectadas con mock (carril 2). Se usó un plásmido que contiene el genoma de PCV2 como control (carril 3). Se cargó la escalera de ADN de 1 kb de GIBCO BRL en el carril M. (B) El ADN viral de células infectadas con PCV2 (carriles 1, 3, y 5) y células infectadas con mock (carriles 2, 4, y 6) se digirió con NcoI y StuI (carriles 1 y 2), EcoRI y StuI (carriles 3 y 4), y EcoRI y EcoRV (carriles 5 y 6). Se cargó una escalera de ADN de 1 kb de GIBCO BRL en el carril M.

Las Figuras 2A-2B representan la titulación de PCV2 por tinción con inmunoperoxidasa. A 72 h.p.i., las células VIDO R1 infectadas con mock (A) o PCV2 (B) se incubaron con anticuerpo policlonal anti-ORF2 de ratón y anticuerpo secundario biotinilado. Tras la aplicación de un complejo de avidina y peroxidasa de rábano picante biotinilado, la monocapa se desarrolló por tetrahidrocloruro de diaminobencidina (DAB). Se dio como resultado una célula oscura a partir de una infección de partícula vírica.

Las Figuras 3A-3C muestran la secuencia nucleotídica (A) y la secuencia de aminoácidos para ORF 1 (B) y ORF 2 (C) de circovirus porcino 2 (PCV2) tal como se describe en el número de acceso de Genebank AF086834.

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Mejor forma de llevar a cabo la invención

La presente invención se refiere a composiciones y métodos para cultivar circovirus de mamíferos, en particular circovirus porcino. La presente invención está basada en el descubrimiento de que una célula de cerdo que expresa la función E1 humana era capaz de ser transfectada con un genoma del virus PCV2 y generar virus PCV2 con un alto título de virus. La línea celular VIDO R1, depositada con el ATCC y que tiene un número de acceso de ATCC PTA-155, es una línea de células de retina de cerdo transformadas con el adenovirus-5 humano (HAV5) E1, que se ha mostrado que induce la fase S del ciclo celular y transactiva la transcripción. Véase, Shenk, T. (1996). "Adenoviridae: The viruses and their replication" en Fields Virology. 3º ed. B. N. Fields, D. M. Knipe y P. M. Howley (ed.) Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, New York, págs. 2111-2148. Tal como se describe en la presente memoria en el Ejemplo 3, las células VIDO R1 se transfectaron con un genoma de PCV2 y se generaron virus a 2x10^{7} IU/ml.

La práctica de la presente invención emplea, a no ser que se indique lo contrario, técnicas convencionales de microbiología, inmunología, virología, biología molecular, y ADN recombinante que se encuentran dentro del estado de la técnica. Estas técnicas están totalmente explicadas en la literatura. Véase, por ejemplo, Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); DNA Cloning: A Practical Approach, vols. I & II (D. Glover, ed.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed. (1984)); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, eds. (1985)); Transcription and Translation (B. Hannes & S. Higgins, eds. (1984)); Animal Cell Culture (R. Freshney, ed. (1986)); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); Ausubel et al., Current Protocols In Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987, 1988, 1989, 1990, 1991, 1992, 1993, 1994, 1995, 1996); Y Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2ª Edición); vols. I, II & III (1989).

Circoviridae, una familia de virus que tiene viriones sin envuelta, redondeados con un diámetro medio de 17 a 23,5 nm que contienen ADN circular de cadena sencilla (ssADN), se describen en La Sexta Descripción del Comité Internacional para la Taxonomía de Virus, más arriba. Los miembros del grupo incluyen circovirus porcinos, PCV1 y PCV2. Se sabe que algunos de los PCVs que son patogénicos, tales como PCV2, asociado a PMWS.

Las secuencias nucleotídicas para PCV1 se proporcionan en Mankertz, A., et al., 1997, J. Virol. 71:2562-2566 y Meehan, B. M. et al., 1997, J. Gen. Virol. 78:221-227. Las secuencias nucleotídicas para PCV2 se proporcionan en Hamel, A. L. et al., 1998, J. Virol. 75:5262-5267; Mankertz, A. et al., 2000, Virus. Res. 66:65-77 y Meehan, B. M. et al., 1998, J. Gen. Virol. 79:2171-2179. Las cepas representativas de PCV2 han sido depositadas con la Colección europea de Cultivos Celulares, Centro para Microbiología e Investigación Aplicada, Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, Reino Unido e incluyen el Nº de acceso V97100219; Nº de acceso V9700218; Nº de acceso V97100217; Nº de acceso Nº de acceso 98011608; y Nº de acceso V98011609. El documento WO 00/77216 también describe PCV2. Las secuencias nucleotídicas de PCV2 también han sido publicadas en Hamel et al., (1998), J. Virol. Vol 72, 6:5262-5267 (GenBank AF027217) y en Morozov et al., (1998), J. Clinical Microb. Vol. 36, 9:2535-2541, así como GenBank AF086834; AF086835; y AF086836. La comparación para las secuencias nucleotídicas publicadas para PCV1 y PCV2 revelan identidad de > 80%, aunque la organización genómica es similar, especialmente en la colocación de los dos marcos de lectura abierta (ORFs) más grandes con un origen de replicación de ADN putativo.

La presente invención abarca métodos para cultivar circovirus de mamíferos y en particular, circovirus porcino (PCV). La presente invención abarca métodos para cultivar PCV que comprenden las secuencias nucleotídicas de PCV descritas en la presente memoria o conocidas en el estado de la técnica, u ORFs de las mismas, o porciones de las mismas que son capaces de replicarse. La presente invención también abarca métodos para cultivar PCV que tienen secuencias nucleotídicas de PCV que difieren a través de la degeneración del código genético con aquellas descritas en la presente memoria o las conocidas en el estado de la técnica, u ORFs de las mismas, o porciones de las mismas capaces de replicarse. La presente invención además abarca métodos para cultivar PCV que comprenden variaciones de secuencias nucleotídicas de PCV que no cambian la funcionalidad o la especificidad de cepa de la secuencia nucleotídica, u ORFs de las mismas, o porciones de las mismas capaces de replicarse. La presente invención también abarca métodos para cultivar PCV que comprenden secuencias nucleotídicas de PCV capaces de hibridarse con aquellas secuencias descritas en la presente memoria bajo condiciones de rigurosidad de intermedia a alta, y métodos para cultivar PCV que comprenden mutaciones de la secuencia nucleotídica de PCV descrita en la presente memoria o conocidas en el estado de la técnica, tales como deleciones o mutaciones puntuales, u ORFs de las mismas, o porciones de las mismas, capaces de replicarse. La presente invención también abarca métodos para cultivar PCV que comprenden secuencias nucleotídicas heterólogas. La presente invención abarca métodos para cultivar PCV que comprenden secuencias nucleotídicas de circovirus quiméricos, tales como, por ejemplo, secuencias nucleotídicas de circovirus porcino en fusión con secuencias nucleotídicas de otros virus patogénicos, tales como un virus patogénico porcino, incluyendo parvovirus.

Tal como se usa en la presente memoria, una secuencia nucleotídica heteróloga, con respecto a circovirus o célula de mamífero, es una que normalmente no está asociada con las secuencias del circovirus como parte del genoma de circovirus o una que normalmente no está asociada con la célula de mamífero, respectivamente. Secuencias nucleotídicas heterólogas incluyen secuencias sintéticas. Las reacciones de hibridación se pueden llevar a cabo bajo condiciones diferentes de "rigurosidad". Las condiciones que aumentan la rigurosidad de una reacción de hibridación son ampliamente conocidas y están publicadas en el estado de la técnica. Véase, por ejemplo, Sambrook et al. (1989) página 7.52. Ejemplos de condiciones relevantes incluyen (con el fin de aumentar la rigurosidad): temperaturas de incubación de 25ºC, 37ºC, 50ºC y 68ºC; concentraciones de tampón de SSC 10X, SSC 6X, SSC 1X, SSC 0,1X (donde SSC es NaCl 0,15 M y Tampón citrato 15 mM) y sus equivalentes usando otros sistemas tampón; concentraciones de formamida de 0%, 25%, 50%, y 75%; tiempos de incubación de 5 minutos a 24 horas; 1, 2, o más etapas de lavado; tiempos de incubación del lavado de 1, 2, o 15 minutos; y soluciones de lavado de SSC 6X, SSC 1X, SSC 0,1X o agua desionizada. Un conjunto ejemplar de condiciones de hibridación rigurosa es 68ºC y SSC 1X.

Los genomas de PCV codifican varias secuencias polipeptídicas, con un intervalo de tamaño aproximado de 8 a 35 kD. Se considera rutinario determinar los marcos de lectura abierta (ORFs) para circovirus porcinos usando un software clásico, como por ejemplo, MacVector ® (Oxford Molecular Group Inc., MD 21030). El ORF más grande, ORF1, de los dos tipos de PCV muestra sólo variaciones mínimas con una identidad de 85% (tal como se midió en el programa clustal) y se ha demostrado que es la proteína Rep en PCV1 (Mankertz, A., et al., 1998, J. Gen. Virol. 79:381-384). Sin querer unirse a la teoría, un rango superior de variación expuesto en las secuencias de ORF2 del PCV1 y PCV2 (identidad de aproximadamente 65%) podría sugerir que las características de PCV específicas de tipo podrían ser determinadas por la respectiva proteína ORF2. Se han cartografiado varios epítopos de PCV específicos de tipo sobre las secuencias ORF2 de PCV2. Véase Mahe, D. et al., 2000, J. Gen. Virol. 81:1815-24. En otro estudio reciente, el ORF2 de PCV2 ha sido identificado como una proteína estructural principal que puede formar partículas virales de tipo cápsida en células de insecto infectadas con el ORF2 que expresan baculovirus recombinantes. Véase Nawagitgul, P. et al., 2000, J. Gen. Virol. 81:2281-2287.

En algunas realizaciones ilustrativas de la invención descrita en la presente memoria, un vector recombinante que comprende un genoma de PCV o un ORF del mismo, o una porción del mismo, tal como una región antigénica, es construido por recombinación in vitro entre un plásmido y un genoma de PCV. En algunas realizaciones, el genoma de PCV es un genoma de PCV2. En otras realizaciones, un vector recombinante que comprende un genoma de PCV o un ORF del mismo, o una porción del mismo, tal como una región antigénica, es construido por recombinación in vivo. Los métodos para la recombinación in vivo son conocidos en el estado de la técnica e incluyen, por ejemplo, los métodos descritos en Chartier, et al. (1996, J. Virol. 70:4805-4810). Los vectores para construir genomas de circovirus incluyen por ejemplo, plásmidos bacterianos que permiten múltiples copias de la secuencia nucleotídica del circovirus clonado a ser producido. En algunas realizaciones, el plásmido es co-transfectado dentro de una célula hospedadora adecuada para la recombinación. Células hospedadoras adecuadas para la recombinación incluyen cualquier célula que soportará la recombinación entre un genoma de PCV y un plásmido que contiene secuencias de PCV, o entre dos o más Plásmidos, cada uno conteniendo secuencias de PCV. Generalmente, la recombinación se lleva a cabo en células procariotas, tales como E. coli, por ejemplo, mientras que la generación de circovirus preferiblemente se lleva a cabo en células de mamífero permisivas para la replicación de PCV, tales como por ejemplo células de cerdo y en particular, células de cerdo capaces de expresar la función de adenovirus E1 de mamíferos.

La presente invención abarca el uso de cualquier célula hospedadora de mamífero permisiva para la replicación de circovirus, y en particular, permisiva para la replicación de PCV, tales como PCV1 y PCV2. Allan et al. (1995, Veterinary Microbiology 44: 49-64) describen que el PCV se replica en cultivos de monocitos/macrófagos porcinos y vacunos. Tischer et al. (1987, Arch. Virol. 96:39-57) describen que PCV es conocido por necesitar células que se dividen activamente para replicarse en el cultivo celular. Ejemplos de células o líneas celulares útiles para la replicación de PCV incluyen células de mamífero que comprenden la función E1 y permisivas para la replicación de PCV, incluyendo células de cerdo, tales como células monocitos/macrógagos de cerdo y células de retina de cerdo, que expresan la función de adenovirus E1. En una realización ilustrativa descrita en la presente memoria, las células de retina de cerdo que expresan la función de adenovirus E1 se muestra que son permisivas para la replicación de PCV2 y se muestra que generan virus a 2x10^{7} IU/ml. Las líneas celulares de cerdo están disponibles a partir de fuentes públicas tales como por ejemplo, la American Type Tissue Collection (ATCC). El crecimiento de cultivos de células bacterianas, así como el cultivo y mantenimiento de células eucarióticas y líneas celulares de mamífero son procedimientos bien conocidos por aquellos expertos en la materia.

La presente invención abarca métodos para cultivar circovirus de mamíferos, en particular, circovirus porcino, en células hospedadoras de mamífero transfectadas con secuencias génicas del adenovirus E1 de mamíferos. En algunas realizaciones, la célula de mamífero es transformada de forma estable con secuencias génicas del adenovirus E1. En algunas realizaciones, las secuencias génicas E1 están integradas dentro del genoma de la célula de mamífero. En otras realizaciones, las secuencias génicas E1 están presentes en un plásmido que se replica. Todavía en otras realizaciones, la secuencia génica E1 es heteróloga a la célula de mamífero. En una realización ilustrativa descrita en la presente memoria una célula de mamífero porcino es transformada con una secuencia génica del adenovirus 5 E1 humano. La presente invención abarca el uso de cualquier célula de mamífero o línea celular de mamífero que expresa la función E1 mientras la célula de mamífero o línea celular de mamífero que expresa función E1 es permisiva para la replicación de circovirus, en particular circovirus porcino, tal como por ejemplo, circovirus porcino 1 o circovirus porcino 2. En realizaciones preferidas, la célula de mamífero es una célula o línea celular de cerdo. La presente invención abarca el uso de cualquier función E1 de mamífero mientras la célula de mamífero hospedadora que expresa la función E1 de mamífero es permisiva para la replicación de circovirus, en particular, PCV, tal como por ejemplo, circovirus porcino 1 o circovirus porcino 2. Los genomas de adenovirus de mamíferos son conocidos en el estado de la técnica y están descritos en, por ejemplo, Reddy et al. (1998, Journal of Virology, 72:1394), que describe la secuencia nucleotídica, la organización genómica, y el mapa de transcripción del adenovirus 3 bovino (BAV3); y Kleiboeker (1995, Virus Res. 36:259-268), que describe la región E1 de PAV-4. La presente invención abarca la función E1 de cualquiera de los varios serotipos de adenovirus humanos, tales como Ad2, Ad5, Ad12, y Ad40. En una realización ilustrativa descrita en la presente memoria en el Ejemplo 1, la función E1 es la función E1 de Ad5 humano. El gen E1A humano es expresado inmediatamente después de la infección viral (0-2 horas) y antes de cualquier otro gen viral. Flint (1982) Biochem. Biophys. Acta 651:175-208; Flint (1986) Advances Virus Research 31:169-228; Grand (1987) Biochem. J. 241:25-38. El sitio de comienzo de la transcripción de Ad5 E1A está en el nucleótido 498 y el sitio de comienzo ATG de la proteína E1A está en el nucleótido 560 en el genoma viral. La proteína E1B funciona en trans y es necesaria para el transporte de ARNm tardío del núcleo al citoplasma. El promotor E1B de Ad5 consiste de un solo sitio de reconocimiento de alta afinidad para SpI y una caja TATA. En particular, las secuencias génicas E1A y E1B del adenovirus 5 humano están localizadas en los nucleótidos 505-4034 de la secuencia nucleotídica proporcionada en Chroboezek, J. et al. (1992, Virology. 186:280-285). En una realización ilustrativa descrita en la presente memoria en los Ejemplos, la célula hospedadora de mamífero es una célula hospedadora de cerdo transfectada con secuencias génicas del adenovirus 5 E1 humano.

El genoma de PCV se puede aislar de viriones de PCV, o puede comprender un genoma de PCV que ha sido insertado en un plásmido, usando técnicas clásicas de biología molecular y biotecnología. La clonación del genoma completo de PCV2 dentro del vector pBluescript II KS (+) de Stratagene por PCR está descrito en Liu, et al. (2000, J. Clin. Microbiol. Vol. 38:3474-3477). El ADN del genoma completo de PCV2 se puede liberar del plásmido resultante en la digestión con SacII.

La introducción de secuencias nucleotídicas de circovirus dentro de células hospedadoras permisivas de mamífero se puede lograr por cualquier método conocido en el estado de la técnica, incluyendo, pero no limitándose a, transfección y transformación incluyendo, pero no limitándose a, microinyección, electroporación, precipitación con CaPO_{4}, DEAE-dextrano, liposomas, bombardeo de partículas, etc. Un método ilustrativo para transfectar secuencias nucleotídicas de PCV2 dentro de células VIDO R1 está descrito en la presente memoria en el Ejemplo 3.

Los métodos para cultivar células procarióticas, tales como células bacterianas, y células eucarióticas, tales como células hospedadoras de mamífero, que expresan la función de adenovirus E1 se consideran rutinarias para aquellos expertos en la maeria.

Se proporcionan los siguientes ejemplos para ilustrar, pero no limitar, la invención. Todas las referencias y publicaciones de patente descritas en la presente memoria están incorporadas en la misma en su totalidad por referencia.

Ejemplos Ejemplo 1 Preparación de células de retina de cerdo transfectadas con secuencias génicas de adenovirus E1 humano (células VIDO R1)

Se transfectaron cultivos primarios de células embrionarias de retina de cerdo con 10 \mug del plásmido pTG 4671 (Transgene, Estrasburgo, Francia) por la técnica de fosfato cálcico. El plásmido pTG4671 contiene las secuencias enteras E1A y E1B (nucleótidos 505-4034) de HAV-5, además del gen de la puromicina acetiltransferasa como marcador selectivo. En este plásmido, la región E1 está bajo el control del promotor constitutivo del gen de la fosfoglicerato quinasa de ratón, y el gen de la puromicina acetiltransferasa está controlado por el promotor constitutivo temprano SV40. Se seleccionaron células transformadas por tres pases en medio que contiene 7 \mug/ml de puromicina, se identificaron en base al cambio de su morfología a partir de un solo foco (es decir, pérdida de inhibición de contacto), y se sometieron a clonación de una sola célula, La línea celular establecida primero se ensayó para su capacidad para soportar el crecimiento de mutantes de deleción E1 de HAV-5. Además, posteriormente, se investigó la línea celular para la presencia, por PCR, de secuencias E1 en el genoma, para la expresión de proteínas E1A y E1B por transferencia Western, y duplicando el tiempo bajo condiciones de cultivo celular. Se detectaron secuencias E1, y se demostró la producción de proteínas E1A y E1B por inmunoprecipitación. La duplicación del tiempo fue más corta, cuando se comparó con la línea celular pariente.

Para evaluar la estabilidad de la expresión de E1, se cultivaron células VIDO R1 a lo largo de más de 50 pases (divididas 1:3 dos veces por semana) y se ensayaron para su capacidad para soportar la replicación de HAV-5 sin E1. También se monitorizó por transferencia Western la expresión de proteínas E1A y E1B a intervalos regulares. Los resultados indicaron que la línea VIDO R1 conservaba la capacidad para soportar el crecimiento de virus sin E1 y expresaba niveles similares de proteínas E1 durante más de 50 pases en cultivo. Por ello, VIDO R1 pueden ser consideradas como una línea celular establecida. La línea celular VIDO R1 ha sido depositada con la American Type Culture Collection (ATCC) y tiene un número de acceso ATCC PTA-155.

Ejemplo 2

El ejemplo 2 proporciona una descripción de la clonación molecular del genoma completo de PCV2.

Inicialmente, el ADN de PCV2 se amplificó por PCR a partir de ADN total extraído de un lechón con PMWS. La clonación del ADN genómico completo de PCV2 dentro del vector pBluescript II KS (+) (Stratagene) por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se describió en Liu et al. (2000) J. Clin. Microbiol. 38:3474-3477). La secuencia de PCV2 se presentó en GenBank (Nº de acceso AF086834). El ADN genómico completo de PCV2 se liberó a partir del plásmido resultante en la digestión con SacII.

Ejemplo 3

El ejemplo 3 describe la transfección de células VIDO R1, tal como se describe en le Ejemplo 1, con un plásmido que contiene el genoma de PCV2 tal como se construyó en el Ejemplo 2.

Materiales y Métodos Cultivo celular

Se mantuvieron la línea celular fetal de retina de cerdo, VIDO R1, tal como se describe en el Ejemplo 1, y células Vero (ATCC) a 37ºC con CO_{2} al 5% en medio MEM basado en Eagle's suplementado con suero fetal bovino (FBS) al 10% o 15% respectivamente, inactivado por calor.

Transfección e infección

Se transfectaron con el ADN de PCV2 clonado monocapas de células VIDO R1 crecidas en una placa de 6 pocillos usando Lipofectamina según las recomendaciones del fabricante (GIBCO BRL). Antes de la transfección, se liberó el genoma completo de PCV2 a partir del plásmido por digestión con SacII (Liu, Q., et al. 2000, J. Clin. Microbiol. 38:3474-3477). Para la infección, las células VIDO R1 se sometieron a tres ciclos de congelación (-70ºC) y descongelación (37ºC). Luego, el lisado se aclaró por centrifugación y se usó para infectar células VIDO R1 frescas. En documentos publicados, se usó una línea de células de riñón de cerdo libres de PCV1 para cultivar virus PCV2. Para estimular la entrada en la fase S en el ciclo celular, las células de riñón de cerdo siempre se trataron con D-glucosamina (véase Tischer et al., (197) Arch. Virol. 96:39-57). Sin embargo, el tratamiento se debe llevar a cabo con cuidado porque la D-glucosamina es tóxica para el cultivo celular (véase, Allan et al., (2000) J. Vet. Diagn. Investigation 12:3-14). Por el contrario, desde que la línea celular VIDO R1 usada en esta estudio ha sido transformada por HAV5-E1 que puede inducir la fase S, no es necesario el tratamiento con D-glucosamina.

Ejemplo 4 Purificación y titulación de virus

Para la purificación de virus PCV2, se incubaron, con Triton X-114 al 0,5% en solución salina tamponada con fosfato (PBS) a 37ºC durante 45 minutos seguido de extracción con Freon 113 (1,1,2-tricloro-trifluoroetano), células VIDO R1 infectadas con PCV2. Los restos y membranas celulares se aclararon por centrifugación a 2000 g durante 15 minutos. Los virus en el sobrenadante se sedimentaron a 3500 g durante 3 horas a través de una protección de sacarosa al 20%. El sedimento de virus se suspendió en PBS y se almacenó a -70ºC. Se determinaron los títulos virales como unidades infecciosas (IU) por tinción inmuno-peroxidasa cuantitativa de la proteína ORF2. Para este propósito, se infectaron las monocapas celulares en placas de 12 pocillos con diluciones seriadas de virus. Tras la adsorción del virus durante 1 hora, las células se lavaron y se revistieron con MEM que contiene FBS al 2% y agarosa al 0,7%. En el día 3 tras la infección (p.i.), se separó el revestimiento de agarosa y se fijaron y permeabilizaron las células con metanol/acetona (1:1 en volumen) durante 20 minutos a -20ºC. Tras bloquear con albúmina sérica bovina al 1% durante 1 hora a temperatura ambiente, las células se incubaron con suero anti-ORF2 de conejo (Liu et al., 2001, Protein Expresión and Purification 21:115-120). Tras 2 horas de incubación, las placas se lavaron con PBS y luego se procesaron usando el kit VECTASTAIN Elite ABC (Vector Laboratories). La reacción se desarrolló con tetrahidrocloruro de 3,3' diaminobenzidina (DAB) y se observó bajo un microscopio. Contando las células teñidas positivas, el título viral se expresó como IU, donde IU se definió como una célula teñida positiva/foco a 3 d.p.i.

Extracción y caracterización del ADN viral

El ADN viral se extrajo de monocapas de células VIDO R1 infectadas con PCV2 por el método de Hirt (1967, J. Mol. Biol.. 26:365-369). Luego, el ADN viral se caracterizó por análisis de restricción y por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) tal como se describe en Liu et al., (20000) J. Clin. Microbiol. 38:3474-3477)-

La PCR usando ADN extraído de células infectadas como plantilla y cebadores específicos para PCV2 amplificó un producto de tamaño específico, mientras que no se amplificó ADN de las células control no infectadas. En consistencia con los patrones de restricción esperados, la digestión del ADN viral con NcoI y StuI dio como resultado dos fragmentos de 1291 pares de bases y 477 pares de bases de tamaño, respectivamente; la digestión con EcoRI y StuI produjo dos fragmentos de 1492 pares de bases y 276 pares de bases de tamaño, respectivamente; y la digestión con EcoRI y EcoRV generó dos fragmentos de 1094 pares de bases y 674 pares de bases de tamaño respectivamente. Los datos indican que se obtuvo el virus PCV2. Usando un ensayo de inmunotinción y contando las células teñidas positivas, el título de virus de esta preparación fue determinado en 2x10^{7} IU/ml.

Claims

1. Un método para cultivar un circovirus de mamífero que comprende:

a) obtener células de mamífero que expresan una función de adenovirus E1 de mamífero, donde dichas células son permisivas para la replicación de circovirus de mamífero;

b) introducir el genoma de circovirus de mamífero, o una porción del mismo capaz de replicarse, dentro de dichas células de mamífero; y

c) cultivar dichas células de mamífero bajo condiciones adecuadas para la replicación de dicho circovirus de mamífero.

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2. Un método para replicar un circovirus de mamífero que comprende, cultivar una célula de mamífero que comprende un genoma de circovirus de mamífero, o una porción del mismo capaz de replicarse, bajo condiciones adecuadas para la replicación de dicho circovirus de mamífero, donde la célula de mamífero expresa una proteína funcional de adenovirus E1 de mamífero y es permisiva para la replicación de circovirus de mamífero.

3. El método de la reivindicación 1 o 2, donde dicho circovirus de mamífero es circovirus porcino.

4. Un método para preparar una célula recombinante de mamífero que comprende una función de adenovirus E1 de mamífero y un genoma de circovirus porcino que comprende las etapas de, a) obtener una célula de mamífero que expresa una función de adenovirus E1 de mamífero; y b) introducir dicho genoma de circovirus porcino, o una porción del mismo capaz de replicarse, dentro de la célula de mamífero.

5. Un método para preparar una célula recombinante de mamífero que comprende, introducir una región del gen de adenovirus E1 de mamífero dentro de una célula de mamífero que comprende un genoma de circovirus de mamífero, o una porción del mismo capaz de replicarse, donde la célula es permisiva para la replicación del circovirus de mamí-
fero.

6. El método de la reivindicación 4 o 5 que además comprende la etapa de cultivar dicha célula recombinante de mamífero bajo condiciones adecuadas para la replicación de dicho circovirus porcino.

7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o 6 que además comprende recuperar dicho circovirus a partir de las células cultivadas.

8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7, donde dicho circovirus porcino es circovirus porcino tipo 2.

9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7, donde dicho circovirus porcino es circovirus porcino tipo 1.

10. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dichas células de mamífero son de origen porcino.

11. El método de la reivindicación 10, donde dichas células de mamífero son células de retina de cerdo.

12. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dicha función de adenovirus E1 de mamífero es función de adenovirus E1 humano.

13. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, donde dicha función de adenovirus E1 de mamífero es función de adenovirus E1 porcino.

14. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dichas células de mamífero que expresan la función de adenovirus E1 de mamífero son transformadas de forma estable con una secuencia del gen de adenovirus E1 de mamífero.

15. El método de la reivindicación 14, donde dicha secuencia del gen de adenovirus E1 de mamífero es heteróloga a dicha célula de mamífero.

16. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dicha función E1 es una función E1A y/o E1B.

17. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 16, donde dicho circovirus porcino comprende una secuencia nucleotídica quimérica.

18. Una célula recombinante de mamífero que expresa una función de adenovirus E1 de mamífero y comprende un genoma de circovirus porcina, o una porción del mismo capaz de replicarse, y donde dicha célula es permisiva para la replicación de dicho circovirus porcino.

19. La célula recombinante de mamífero de la reivindicación 18, donde dicha función de adenovirus E1 de mamífero es función de adenovirus E1 humano.

20. La célula recombinante de mamífero de la reivindicación 18, donde dicha función de adenovirus E1 de mamífero es función de adenovirus E1 porcino.

21. La célula recombinante de mamífero de una de las reivindicaciones 18 a 20, donde dicha célula es de origen porcino.

22. La célula recombinante de mamífero de la reivindicación 21, donde dicha célula es una célula de retina de cerdo.

23. La célula recombinante de mamífero de una de las reivindicaciones 18 a 22, donde la célula de mamífero que expresa la función de adenovirus E1 de mamífero es transformada de forma estable con una secuencia del gen de adenovirus E1 de mamífero.

24. La célula recombinante de mamífero de la reivindicación 23, donde dicha secuencia del gen E1 es una secuencia del gen de adenovirus E1 humano.

25. La célula recombinante de mamífero la reivindicación 23, donde dicha secuencia del gen de adenovirus E1 de mamífero es heteróloga a dicha célula de mamífero.