CZ304592B6 - Molekula s aminokyselinovou sekvencí vázající TALL-1, DNA, expresní vektor a hostitelská buňka, léčení autoimunitních onemocnění zprostředkovaných B buňkami - Google Patents

Abstract

Molekula, vázající TALL-1, zahrnující aminokyselinovou sekvenci Dz.sup.2.n..sup.Lz4.n., kde z.sup.2.n. je aminokyselinový zbytek a z.sup.4.n. je T nebo I, a kde molekula nezahrnuje fragment TACI, BCMA, nebo BAFFR (SEQ ID NO: 195, 196 a 197). DNA kódující tuto molekulu, expresní vektor s obsahem této DNA a hostitelská buňka zahrnující tento vektor. Výše uvedená molekula pro použití k léčení autoimunitních onemocnění zprostředkovaných B buňkami.

Description

Oblast techniky

Vynález se týká molekuly mající aminokyselinovou sekvencí. Tato molekula váže TALL-1. Dále se vynález týká, DNA kódující tuto molekulu, expresního vektoru s obsahem této DNA a hostitelské buňky zahrnující tento vektor. Konečně se vynález týká i výše uvedené molekuly pro použití k léčení autoimunitních onemocnění zprostředkovaných B buňkami.

Dosavadní stav techniky

Po letech studií nekrózy nádorů byly konečně v roce 1984 klonovány faktory nekrózy nádorů (TNF) a a β. V následujících letech byla například objevena superrodina cytokinů TNF, zahrnující ligand fas (FasL), ligand CD27 (CD27L), ligand CD30 (CD30L), ligand CD40 (CD40L), ligand příbuzný TNF indukující apoptózu (TNF-related apoptosisinducing ligand, TRAIL, rovněž označovaný jako AGP-1), vazebný protein pro osteoprotegrin (osteopro-tegerin binding protein, OPG-BP, nebo též OPG ligand), ligand 4-1BB ligand, LIGHT, APRÍL a TALL-1. Smith et al. (1994), Cell 76: 959-962; Lacey et al. (1998), Cell 93: 165-176; Chichepotiche et al. (1997), J. Biol. Chem. 272: 32401-32410; Mauři et al. (1998), Immunity 8: 21-30; Hahne et al. (1998), J. Exp. Med. 188: 1185-90; Shu et al. (1999), J. Leukocyte Biology 65: 680-3. Tato rodina je jednotná ve své struktuře, zejména v C-konci. Kromě toho, většina dosud známých členů této rodiny je exprimována v částech imunitního systému, i když někteří z nich jsou rovněž exprimováni v jiných tkáních a orgánech. Smith et al. (1994), Cell 76: 959-62. Všechny ligandy, s výjimkou LT-α, jsou transmembránovými proteiny typu II, charakterizované konzervovanou oblastí o 150 aminokyselinách uvnitř C-koncové extracelulámí domény. I při omezení shodnosti na 20 až 25 %, sbaluje se konzervovaná doména o 150 aminokyselinách na charakteristickou strukturu β-skládaného listu a trimerizuje. Uvedená konzervovaná oblast může být proteolyticky uvolněna, a tak může poskytovat rozpustnou funkční formu. Banner et al. (1993), Cell 73: 431^145.

Mnozí členové v rámci této rodiny ligandů jsou exprimováni v tkáních obohacených lymfoidy a hrají významné úlohy ve vývoji imunitního systému a jeho modulaci. Smith et al. (1994). Tak například, TNFa je převážně syntetizován makrofágy a je významným mediátorem pro zánětlivé odpovědi a imunitní obranu. Tracey & Cerami (1994), Ann. Rev. Med. 45: 491-503. Fas-L, převážně exprimovaný v aktivovaných T-buňkách, moduluje apoptózu thymocytů zprostředkovávanou s TCR. Nagata, S. & Suda, T. (1995) Immunology Today 16: 39-43; Castrim et al. (1996), Immunity 5: 617-27. CD40L, rovněž exprimovaný aktivovanými T-buňkami, poskytuje základní signál pro přežívání B buněk, proliferaci a přepnutí (switching) imunoglobulinových isotypů. Noelle (1996), Immunity 4; 415-9.

Pro většinu členů rodiny ligandů TNF byly identifikovány receptory. Uvedené receptory mají charakteristické četné opakující se sekvence bohaté na cystein uvnitř svých extracelulámích domén a nemají katalytické motivy uvnitř cytoplasmatických oblastí. Smith et al. (1994). Receptory signalizují prostřednictvím přímé interakce se smrtící doménou proteinů (death domain proteins) (např. TRADD, FADD a RIP) nebo s proteiny TRAF (např. TRAF2, TRAF3, TRAF5 a TRAF6), spouštějícími odlišné a vzájemně se překrývající signální dráhy, např. apoptózu, aktivaci NF-£B, nebo aktivaci JNK. Wallach et al. (1999), Annual Review of Immunology VI: 33 Ιό?. Uvedené signální jevy vedou k buněčné smrti, proliferaci, aktivaci, nebo diferenciaci. Profil exprese pro každý z receptorových členů je různý. Tak například, TNFR1 je exprimován v širokém spektru tkání a buněk, zatímco buněčný povrchový receptor buněk OPGL je převážně omezen na osteoklasty. Hsu et al. (1999) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 96: 3540-5.

- 1 CZ 304592 B4

Řada výzkumných týmů nedávno identifikovala rodinu ligandů TNF se shodnou nebo s v podstatně podobnou sekvencí. Ligand byl různě pojmenován jako neutrokin a (přihláška WO 98/18 921, publikovaná 7. května 1998), 63954 (přihláška WO 98/27 114, publikovaná 25. června 1998), TL5 (přihláška EP 869 180, publikovaná 7. října 1998), NTN-2 (přihláška WO 98/55 620 a přihláška WO 98/55 621, publikované 10. prosince 1998), TNRLl-alfa (přihláška WO 99/11 791, publikovaná 11. března 1999), „kay ligand“ (přihláška WO 99/12 964, publikovaná 18. března 1999) a AGP-3 (U.S. prozatímní přihláška č. 60/119 906, podaná 12. února 1999, a U.S. prozatímní přihláška č. 60/166 271, podaná 18. listopadu 1999, v uvedeném pořadí); a TALL-1 (přihláška WO 00/68 378, publikovaná 16. listopadu 2000). Každá z těchto přihlášek je zde zahrnuta formou odkazu. Zde uvedené ligandy jsou souhrnně nazývány jako TALL-1.

TALL-1 je členem superrodiny ligandu TNF, který se funkčně účastní v přežívání a proliferaci B buněk. Transgenní myš nadměrně exprimující TALL-1 měly těžkou hyperplasii B buněk a autoimunitní onemocnění podobné lupus (lupus-like autoimmune disease). Khare et al. (2000) PNAS 97 (7): 3370-3375). Jak TACÍ, tak BCMA slouží jako buněčné povrchové receptory pro TALLI. Gross et al. (2000), Nátuře 404: 995-999; Ware (2000), J. Exp. Med. 192 (11): F35-F37; Ware (2000), Nátuře 404: 949-950; Xia et al. (2000), J. Med. 192(1): 137-143; Yu et al. (2000), Nátuře Immunology 1 (3): 252-256; Marsters et al. (2000), Current Biology 10: 785-788; Hatzoglou et al. (2000), J. of Immunology 165: 1322-1330; Shu et al. (2000) PNAS 97 (16): 9156-9161; Thompson et al. (2000), J. Exp. Md. 192 (1): 129-135; Mukhopadhyay et al. (1999)

J. Biol. Chem. 274 (23): 15978-81; Shu et al. (1999) J. Leukocyte Biol. 65: 680-683; Gruss et al. (1995) Blood 85 (12): 3378-3404; Smith et al. (1994), Cell 76: 959-962; Patent US 5 969 102, vydaný 19. října 1999; přihláška WO 00/40 716, publikované 9. listopadu 2000; přihláška WO 99/35 170, publikovaná 15. července 1999. Oba receptory jsou exprimovány na B buňkách a signalizují prostřednictvím interakce s proteiny TRAF. Kromě toho, jak TACÍ, tak BCMA se rovněž váže k jinému členu rodiny ligandů TNF, a to k ligandu APRÍL. Yu et al. (2000), Nátuře Immunology 1 (3): 252-256. Bylo prokázáno, že APRÍL indukuje proliferaci B buněk.

Až dosud nebyly popsány žádné rekombinantní nebo modifikované proteiny využívající modulátory TALL-1. Rekombinantní a modifikované proteiny jsou nově vznikající třídou terapeutických látek. Vhodné modifikace proteinových terapeutických činidel zahrnují kombinace s doménou „Fc“ z protilátky a navázání na takové polymery, jako je například polyethylenglykol (PEG) a dextran. Uvedené modifikace jsou detailně diskutovány v patentové přihlášce o názvu „Modified Peptides as Therapeutic Agents,“ publikované jako WO 00/24 782, která je zde zahrnuta formou odkazu v celém svém rozsahu.

Zcela odlišným přístupem ve vývoji terapeutických látek je screening peptidových knihoven. Interakce proteinového ligandu s receptorem často probíhá na relativně rozsáhlém rozhraní. Nicméně, tak, jak bylo prokázáno pro lidský růstový hormon a jeho receptor, pouze několik klíčových zbytků na rozhraní přispívá k většině vazebné energie. Clackson et al. (1995), Science 267: 383-6. Podstatná část proteinových ligandů prostě představuje vazebné epitopy ve správné topologii, nebo má funkce nezávislé na vazbě. Z tohoto důvodu molekuly pouze o „peptidové“ délce (2 až 40 aminokyselin) se mohou vázat na receptorový protein uvedeného rozměrného proteinového ligandu. Takové peptidy mohou napodobovat bioaktivitu objemných ligandů („peptidové agonisty“), nebo prostřednictvím kompetitivní vazby inhibují bioaktivitu objemných proteinových ligandů („peptidové antagonisty“).

Pro identifikaci takových peptidových agonistů a antagonistů byla vyvinuta účinná metoda knihoven fágového displeje peptidů (phage display peptide libraries). Viz, například Scott et al. (1990), Science 249: 386; Devlin et al. (1990), Science 249: 404; Pat. US 5 223 409, vydaný 29.6.1993; Pat. US 5 733 731; vydaný 31.3.1998; Pat US 5 498 530, vydaný 12.3.1996; Pat. US 5 432 018, vydaný 11.7.1995; Pat. US 5 338 665, vydaný 16.8.1994; Pat. US 5 922 545, vydaný 13.7.1999; přihláška WO 96/40 987, zveřejněná 19.12.1996; a přihláška WO 98/15 833,

-2CZ 304592 B4 zveřejněná 16.4.1998 (každý z těchto dokumentů je zde zahrnut formou odkazu v celém svém rozsahu).

V takových knihovnách jsou náhodné peptidové sekvence exponovány (displejovány) ve fúzi s obalovými proteiny vláknitého fága. Typicky jsou peptidy exprimované fágy afinitně eluovány proti imobilizovanému cílovému proteinu. Zadržené fágy mohou být obohaceny následující sérií afinitní purifíkace a repropagace. Peptidy, které se nejlépe vážou, mohou být sekvenovány tak, aby byly identifikovány klíčové zbytky uvnitř jedné nebo více strukturně příbuzných rodin peptidů. Viz, například Cwirla et al. (1997), Science 276: 1696—9, kteří identifikovali dvě odlišné rodiny peptidů. Z peptidových sekvencí lze rovněž usoudit, které zbytky mohou být bezpečně nahrazeny alaninovým skenováním nebo mutagenezí na úrovni DNA. Mutagenezí mohou být vytvářeny knihovny, které jsou testovány pro další optimalizaci sekvence nej lepších vazebných členů Lowman (1997), Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26: 401-24.

Strukturní analýza interakce protein-protein může být rovněž použita pro navrhování peptidů, které napodobují vazebnou aktivitu objemných proteinových ligandů. Takovou analýzou je možné z krystalické struktury stanovit identitu a vzájemnou orientaci kritických zbytků v objemném proteinovém ligandu a navrhnout strukturu peptidů. Viz, například Takasaki et al. (1997), Nátuře Biotech. 15: 1266-70. Uvedené analytické metody mohou být rovněž použity pro zkoumání interakcí mezi receptorovým proteinem a peptidy, které jsou fágovým displejem vybírány, což může vést k dalším modifikacím peptidů za účelem zvýšení jejich vazebné afinity.

Ve výzkumu peptidů konkurují metodě fágového displeje i jiné metody. Peptidová knihovna může být fúzována ke karboxylovému konci lac represoru a exprimována v E. coli. Jiná metoda, založená na E. coli umožňuje exponování na vnější membráně buněk prostřednictvím fúze s lipoproteinem asociovaným s peptidoglykanem (peptidoglycan-associated lipoprotein, PAL). Tyto metody a metody níže uvedené jsou souhrnně nazývány jako „E. coli displej“. V jiném postupuje zastavena translace nahodí 1= RNA před uvolněním z ribozómů, což vede ke knihovně polypeptidů s jejich asociovanou RNA, která je dosud připojena. Tyto metody a metody níže uvedené jsou souhrnně nazývány jako „ribozómový displej“. Jiné metody využívají peptidy vázané k RNA; například „PROfusion technology“, Phylos, lne. Viz, například Roberts & Szostak (1997), Proč. Nati. Acad. Sci, USA 94: 12297-303. Tyto metody a metody níže uvedené jsou souhrnně nazývány jako „screening RNA-peptidů“. Rovněž byly připraveny peptidové knihovny chemickými postupy, ve kterých jsou peptidy imobilizovány na stabilních, nebiologických materiálech, jakými jsou polyethylenové nosiče nebo rozpustné permeabilní pryskyřice. V jiné, chemicky připravené peptidové knihovně, je používáno fotolithografie pro zobrazení peptidů imobilizovaných na skleněných sklíčkách. Tyto metody a metody níže uvedené jsou souhrnně nazývány jako chemický screening peptidů (chemical-peptide screening). Chemický screening peptidů může být výhodný proto, že umožňuje použití D-aminokyselin a jiných nepřirozených analogů, stejně jako nepeptidových prvků. Jak biologické, tak chemické metody jsou souhrnně uvedeny ve Walls & Lowman (1992) Curr. Opin. Biotechnol. 3: 355-62. S využitím fágového displeje, RNA-screeningu peptidů, a jiných výše zmíněných metod je možné nalézt peptidová mimetika jakéhokoliv proteinu.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález se týká terapeutických látek, které modulují aktivitu TALL-1. V souladu s tím je prvním aspektem předmětu vynálezu v hlavním provedení i) molekula vázající TALL-1 zahrnující aminokyselinovou sekvenci Dz²Lz⁴, kde z² je aminokyselinový zbytek a z⁴ je T nebo I, a kde molekula nezahrnuje fragment TACÍ, BCMA, nebo BAFFR (SEQ ID NO: 195, 196 a 197). Přednostní provedení tohoto aspektu předmětu vynálezu zahrnují zejména ii) molekula podle provedení i), kde z⁴ je T;

-3CZ 304592 B4 iii) molekulu podle provedení i), kde z⁴ je I;

iv) molekulu podle provedení i) zahrnující aminokyselinovou sekvenci vzorce a¹a²a³CDa⁶La⁸a⁹a¹⁰Ca¹²a¹³a¹⁴ (SEQ ID NO: 100), ve kterém:

a¹, a² a a³ každý nezávisle chybí nebo znamená aminokyselinový zbytek; a⁶ je aminokyselinový zbytek; a⁸ je T nebo I;

a⁹ je bazický nebo hydrofobní zbytek;

a¹⁰ je aminokyselinový zbytek;

a¹² je neutrální hydrofobní zbytek;

a¹³ a a¹⁴ každý nezávisle chybí nebo znamená aminokyselinový zbytek;

v) molekulu podle provedení iv), kde a⁸ je T a a⁹ je bazický zbytek;

vi) molekulu podle provedení iv), kde a⁹ je K a a¹² je F;

vii) molekulu podle provedení i) zahrnující aminokyselinovou sekvenci vzorce b¹b²b³Cb⁵b⁶Db⁸Lb¹⁰b¹¹b¹²b¹³b¹⁴Cb¹⁶b¹⁷b¹⁸ (SEQ ID NO: 104), ve kterém:

b¹ a b² každý nezávisle chybí nebo znamená aminokyselinový zbytek;

b³ je kyselý nebo amidový zbytek;

b⁵ aminokyselinový zbytek b⁶ je aromatický zbytek;

b⁸ je aminokyselinový zbytek;

b¹⁰ je T nebo I;

b¹¹ je bazický zbytek;

b¹² a b¹³ každý nezávisle znamená aminokyselinový zbytek;

b¹⁴ je neutrální hydrofobní zbytek; a b¹⁶, b¹⁷ a b¹⁸ každý nezávisle chybí nebo znamená aminokyselinový zbytek;

viii) molekulu podle provedení vii), kde:

b³ je D, Q nebo E;

b⁶ je W nebo Y;

b'« jeT;

b¹¹ je K nebo R; a b¹⁴ je V nebo L;

ix) molekulu podle provedení i) zahrnující aminokyselinovou sekvenci vzorce c¹c²c³Cc^sDc⁷Lc⁹c¹⁰c¹¹c¹²c¹³c¹⁴Cc¹⁶c¹⁷c¹⁸ (SEQ ID NO: 105), ve kterém:

-4CZ 304592 B4 c¹, c² a c³ každý nezávisle chybí nebo znamená aminokyselinový zbytek; c⁵ je aminokyselinový zbytek; c⁷ je aminokyselinový zbytek; c⁹ je T nebo I;

c¹⁰ je bazický zbytek;

c¹¹ a c¹² každý nezávisle znamená aminokyselinový zbytek;

c¹³ je neutrální hydrofobní zbytek;

c¹⁴ je aminokyselinový zbytek;

c¹⁶ je aminokyselinový zbytek;

c¹⁷ je neutrální hydrofobní zbytek; a c¹⁸ je aminokyselinový zbytek nebo není přítomen;

x) molekulu podle provedení 9, kde:

c je T;

c¹⁰ je K nebo R;

c¹³ je I, L nebo V; a c¹⁷ je A nebo L;

xi) molekulu podle provedení i) zahrnující aminokyselinovou sekvenci vzorce d¹d²d³Cd⁵d⁶d⁷WDd¹⁰Ld¹²d¹³d¹⁴Cd¹⁶d¹⁷d^lS (SEQ ID NO: 106), ve kterém:

d¹, d² a d³ každý nezávisle chybí nebo znamená aminokyselinový zbytek; d⁵, d⁶ a d⁷ každý nezávisle znamená aminokyselinový zbytek; d¹⁰ je aminokyselinový zbytek;

d¹² je T nebo I;

d¹³ je aminokyselinový zbytek;

d¹⁴ je aminokyselinový zbytek; a d¹⁶, d¹⁷ a d¹⁸ každý nezávisle chybí nebo znamená aminokyselinový zbytek;

xii) molekulu podle provedení 1 zahrnující aminokyselinovou sekvenci vzorce e¹e²e³Ce⁵e⁵e⁷De⁹Le¹¹Ke¹³Ce¹⁵e¹⁶e¹⁷e¹⁸ (SEQ ID NO: 107), ve kterém e¹, e² a e³ každý nezávisle chybí nebo znamená aminokyselinový zbytek; e⁵, e⁶, e⁷, e⁹ a e¹³ každý nezávisle znamená aminokyselinový zbytek; e¹¹ jeTnebol; a e , e , e a e každý nezávisle chybí nebo znamená aminokyselinový zbytek;

-5 CZ 304592 B4 xiii) molekulu podle provedení i) zahrnující aminokyselinovou sekvenci vzorce f¹f²f³Kf⁵Df⁷Lf⁹f¹⁰Qf¹²f¹³f¹⁴ (SEQ ID NO: 109), ve kterém:

f¹, f² a f³ chybějí nebo znamenají aminokyselinové zbytky;

f⁵ je W, Y nebo F;

f⁷ je aminokyselinový zbytek;

f je T nebo I;

f¹⁰ jeK, RneboH;

f¹² je C, neutrální hydrofobní zbytek nebo bazický zbytek, přednostně W, C nebo R; f¹³ je C, neutrální hydrofobní zbytek nebo není přítomen; a f¹⁴ je jakýkoliv aminokyselinový zbytek nebo není přítomen;

za předpokladu, že pouze jeden z f¹, f a f³ může být C a pouze jeden z f¹², f¹³ a f¹⁴ může být C;

xiv) molekulu podle provedení xiii), kde f⁵ je W;

xv) molekulu podle provedení xiii), kde f⁷ je L;

xvi) molekulu podle provedení xiii), kde f⁶ je T;

xvii) molekulu podle provedení xiii), kde f¹⁰ je K.

xviii) molekulu podle provedení xiii), kde f¹² je C a jeden z f¹, f² a f³ je C;

xix) molekulu podle provedení xiii), kde f¹³ je V;

xx) molekulu podle provedení xiii) zahrnující aminokyselinovou sekvenci vzorce f¹f²f³KWDf⁷Lf ⁹KQf¹²f ¹³f¹⁴ (SEQ ID NO: 125);

xxi) molekulu podle provedení xx) zahrnující aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny sestávající ze SEQ ID NO: 32, 33, 58, 60, 63, 66, 67, 69, 114, 115, 122, 123, 124, 147-150, 152-177, 179, 180 a 187;

xxii) molekulu podle provedení xx) zahrnující aminokyselinovou sekvenci vzorce

LPGCKWDLLIKQWVCDPL (SEQ ID NO: 33); xxiii) molekulu podle provedení i), která má vzorec (Χ'Χ-ν’-ζΧ²^ a její multimery, kde:

V¹ je molekula, která brání degradaci a/nebo zvyšuje poločas, snižuje toxicitu, snižuje imunogenicitu, nebo zvyšuje biologickou aktivitu terapeutického polypeptidů;

X¹ a X² jsou nezávisle vybrány z -(L^c-p¹,

-(ťVP^VP², -(L¹)c-P¹-(L²)d-P²-(L³)e-P³ a -(L¹)c-P¹-(L²)d-P²-(L³)e-P³-(L⁴)f-P⁴;

-6CZ 304592 B4 každý jeden nebo více z Ρ¹, Ρ², P³ a P⁴ nezávisle zahrnuje

Dz²Lz⁴;

L¹, L², L³ a L⁴ jsou každý nezávisle linkery; a a, b, c, d, e a f jsou každý nezávisle 0 nebo 1, za podmínky, že alespoň jeden z a a b je 1;

xxiv) molekulu podle provedení xxiii) vzorce

PWWV¹;

xxv) molekulu podle provedení xxiii) vzorce

V^KWP²;

xxvi) molekulu podle provedení xxiii), kde V¹ je doména Fc;

xxvii) molekulu podle provedení xxiii), kde V¹ je doména IgG Fc;

xxviii) molekulu podle provedení xxiii), kde V¹ je doména IgGl Fc;

xxix) molekulu podle provedení xxiii), kde V¹ zahrnuje sekvenci SEQ ID NO: 2;

xxx) molekulu podle provedení xxiii), kde jeden nebo více zP¹, Ρ², P³ a P⁴ každý nezávisle zahrnuje sekvenci vybranou z:

aYVCDaWaWY^a¹⁴ (SEQ ID NO: 100), (SEQ ID NO: 104), c¹c²c³Cc⁵Dc⁷Lc⁹c¹⁰c¹¹c¹²c¹³C¹⁴Cc¹⁶c¹⁷c^1B (SEQ ID NO: 105), d¹d²d³Cd⁵d⁶d⁷WDd¹⁰Ld¹²d¹³d¹⁴Cd¹⁶d¹⁷d¹⁸ (SEQ ID NO: 106), e¹e²e³Ce⁵e⁶e⁷De⁹Le¹¹Ke¹³Ce¹⁵e^iee¹⁷e¹⁸ (SEQ ID NO: 107) a fif2f³Kf⁵Df⁷Lf⁹f¹⁰Qf¹²f¹³f¹⁴ (SEQ ID NO: 109)) ve které:

a¹, a², a³ každý nezávisle chybí nebo znamená aminokyselinový zbytek;

a⁶ je aminokyselinový zbytek;

a⁹ je bazický nebo hydrofobní zbytek;

a⁸ je threonyl nebo isoleucyl;

a¹⁰ je aminokyselinový zbytek;

a¹² je neutrální hydrofobní zbytek; a a¹³ a a¹⁴ každý nezávisle chybí nebo znamená aminokyselinový zbytek;

b¹ a b² každý nezávisle chybí nebo znamená aminokyselinový zbytek;

b³ je kyselý nebo amidový zbytek;

b⁵ aminokyselinový zbytek;

b⁶ je aromatický zbytek;

b⁸ je aminokyselinový zbytek;

b¹⁰ je T nebo I;

b¹¹ je bazický zbytek;

b¹² a b¹³ každý nezávisle znamená aminokyselinový zbytek;

b¹⁴ je neutrální hydrofobní zbytek;

b¹⁶, b¹⁷ a b¹⁸ každý nezávisle chybí nebo znamená aminokyselinový zbytek;

-7 CZ 304592 B4 c¹, c² a c³ každý nezávisle chybí nebo znamená aminokyselinový zbytek;

c⁵ je aminokyselinový zbytek;

c⁷ je aminokyselinový zbytek;

c⁹ je T nebo I;

c¹⁰ je bazický zbytek;

c¹¹ a c¹² každý nezávisle znamená aminokyselinový zbytek;

c¹³ je neutrální hydrofobní zbytek;

c¹⁴ je aminokyselinový zbytek;

c¹⁶ je aminokyselinový zbytek;

c¹⁷ je neutrální hydrofobní zbytek;

c¹⁸ je aminokyselinový zbytek nebo není přítomen;

d¹, d² a d³ každý nezávisle chybí nebo znamená aminokyselinový zbytek;

d⁵, d⁶ a d⁷ každý nezávisle znamená aminokyselinový zbytek;

d¹⁰ je aminokyselinový zbytek;

d¹² je T nebo I;

d¹³ je aminokyselinový zbytek;

d¹⁴ je aminokyselinový zbytek;

d¹⁶, d¹⁷ a d¹⁸ každý nezávisle chybí nebo znamená aminokyselinový zbytek;

e¹, e² a e³ každý nezávisle chybí nebo znamená aminokyselinový zbytek;

e⁵, e⁶, e⁷, e⁹ a e¹³ každý nezávisle znamená aminokyselinový zbytek;

e¹¹ je T nebo I;

e¹⁵, e¹⁶, e¹⁷ a e¹⁸ každý nezávisle chybí nebo znamená aminokyselinový zbytek;

f¹, f² a f³ chybějí nebo znamenají aminokyselinové zbytky;

f⁵ je W, Y nebo F;

f⁷ je aminokyselinový zbytek;

f⁹ je T nebo I;

f¹⁰ jeK, RneboH;

f¹² je C, neutrální hydrofobní zbytek nebo bazický zbytek;

f¹³ je C, neutrální hydrofobní zbytek nebo není přítomen; a f¹⁴ je jakýkoliv aminokyselinový zbytek nebo není přítomen;

za předpokladu, že pouze jeden z f¹, f² a f³ může být C a pouze jeden z f¹², f¹³ a f¹⁴ může být C;

xxxi) molekulu podle provedení xxx), kde:

a⁹ je bazický zbytek;

b³ je D, Q nebo E;

b⁶ je W nebo Y;

b¹¹ jeK nebo R;

b¹⁴ je V nebo L;

c¹⁰ je K nebo R;

c¹³ jeal, LneboV;

c¹⁷ je A nebo L;

f⁵ jeW ť je L;

-8CZ 304592 B4 f¹⁰ je K; a f¹³ je V;

xxxii) molekulu podle provedení xxx) kde jeden nebo více z P¹, P², P³ a P⁴ každý nezávisle 5 zahrnuje f¹f²f³KWDf⁷Lf⁹KQf¹²f¹³f¹⁴ (SEQ ID NO: 125);

xxxiii) molekulu podle provedení xxii) vzorce

PALVPAlA-V¹;

xxxiv) molekulu podle provedení xxxii) vzorce

V^L^-P^lVp²;

xxxv) molekulu podle provedení xxxii), která má aminokyselinovou sekvenci vybranou ze SEQ ID NO: 122, 123 a 124;

xxxvi) molekulu podle provedení xxxiii) nebo xxxiv), ve které L² je větší než 5 aminokyselin;

xxxvii) molekulu podle provedení xxxvi), kde L² je vybráno z

GSGSATGGSGSTASSGSGSATx¹x² (SEQ ID NO: 193) a

GSGSATGGSGSTASSGSGSATx¹x²GSGSATGGSGSTASSGSGSATx³x⁴ (SEQ ID NO: 194), kde x¹ a x³ jsou každý nezávisle bazické nebo hydrofobní zbytky a x² a x⁴ jsou každý nezávisle hydrofobní zbytky;

xxxviii) molekulu podle provedení xxxvi), kde L² je vybráno z vybráno z GSGSATGGSGSTASSGSGSATH (SEQ ID NO: 59), GSGSATGGSGSTASSGSGSATGM (SEQ ID NO: 190), GSGSATGGSGSTASSGSGSATGS (SEQ ID NO :191), a

GSGSATGGSGSTASSGSGSATHMGSGSATGGSGSTASSGSGSATHM (SEQ ID NO: 192) ; a ixl) molekulu podle provedení xxiii) zahrnující sekvence vybrané z Tabulky 4 (SEQ ID NO: 4455);

Dalším aspektem předmětu vynálezu (provedení vynálezu xl)) je DNA kódující molekulu podle provedení xxiii).

-9CZ 304592 B4

Ještě dalším aspektem předmětu vynálezu (provedení vynálezu xli) expresní vektor zahrnující DNA podle provedení xl).

Jiným aspektem předmětu vynálezu (provedení vynálezu xiii)) je hostitelská buňka zahrnující expresní vektor podle provedení xli).

Ve výhodném provedení (xliii) buňky podle provedení xiii) je buňkou buňkaE. coli.

Jiným aspektem předmětu vynálezu (provedení vynálezu xl iv)) je molekula podle provedení i), iv), vii), ix), xi), xii), xxiii) nebo xxiii) pro použití pro léčení autoimunitních onemocnění zprostředkovaných B buňkami.

Jiným aspektem předmětu vynálezu (provedení vynálezu xlv)) je molekula podle provedení i), iv), vii), ix), xi), xii), xxiii) nebo xxiii) pro použití pro léčení lupus.

Jiným aspektem předmětu vynálezu (provedení vynálezu xlvi)) je molekula podle provedení i), iv), vii), ix), xi), xii), xxiii) nebo xxiii) pro použití pro léčení rakoviny zprostředkované B buňkami.

Jiným aspektem předmětu vynálezu (provedení vynálezu xl vii)) je molekula podle provedení i), iv), vii), ix), xi), xii), xxiii) nebo xxiii) pro použití pro léčení B-buněčného lymfomu.

Modulátory TALL-1 podle vynálezu tedy zahrnují molekuly následujícího vzorce:

I(a)

(SEQ ID NO: 100), ve kterém:

každý z a¹, a², a³ jsou nezávisle nepřítomny nebojsou aminokyselinové zbytky;

a⁶ je aminokyselinový zbytek;

a⁹ je bazický nebo hydrofobní zbytek;

a⁸ je threonyl nebo isoleucyl;

a¹⁰ je aminokyselinový zbytek;

a¹² je neutrální hydrofobní zbytek; a každý z a¹³ a a¹⁴ jsou nezávisle nepřítomny nebojsou aminokyselinové zbytky.

1S_U17U18

I(b) b¹b²b³Cb⁵b^sDb⁸Lb¹⁰b¹¹b¹²b¹³b¹⁴Cb^lsb¹⁷b^: (SEQ ID NO: 104), ve kterém:

každý z b¹ a b² jsou nezávisle nepřítomny nebojsou aminokyselinové zbytky;

b³ je kyselý nebo amidový zbytek;

b⁵ aminokyselinový zbytek;

b⁶ je aromatický zbytek;

b⁸ je aminokyselinový zbytek;

b¹⁰ je T nebo I;

b¹¹ je bazický zbytek;

každý z b¹² a b¹³ jsou nezávisle aminokyselinové zbytky;

b¹⁴ je neutrální hydrofobní zbytek; a každý z b¹⁶, b¹⁷ a b¹⁸ jsou nezávisle nepřítomny nebojsou aminokyselinové zbytky.

- 10CZ 304592 B4

Takové modulátory TALL-1 zahrnují molekuly následujícího vzorce:

I (a) a¹a²a³CDa⁶La⁸a⁹a¹⁰Ca¹²a¹³a¹⁴ (SEQ ID NO: 100), ve kterém:

každý z a¹, a², a³ jsou nezávisle nepřítomny nebojsou aminokyselinové zbytky; a⁶ je aminokyselinový zbytek; a⁹ je bazický nebo hydrofobní zbytek; a⁸ je threonyl nebo isoleucyl;

io a¹⁰ je aminokyselinový zbytek;

a¹² je neutrální hydrofobní zbytek; a každý z a¹³ a a¹⁴ jsou nezávisle nepřítomny nebojsou aminokyselinové zbytky.

I (b) b¹b²b³Cb⁵b⁶Db⁸Lb¹⁰b^Ub¹²b¹³b¹⁴Cb¹⁶b¹⁷b¹⁸ (SEQ ID NO: 104), ve kterém:

každý z b¹ a b² jsou nezávisle nepřítomny nebojsou aminokyselinové zbytky; b³ je kyselý nebo amidový zbytek; b⁵ je aminokyselinový zbytek; b⁶ je aromatický zbytek;

b⁸ je aminokyselinový zbytek; b¹⁰ je T nebo I; b¹¹ je bazický zbytek;

každý z b¹² a b¹³ jsou nezávisle aminokyselinové zbytky; b¹⁴ je neutrální hydrofobní zbytek; a každý z b¹⁶, b¹⁷ a b¹⁸jsou nezávisle nepřítomny nebojsou aminokyselinové zbytky.

I (c) g¹c²C³Cc⁵Dc⁷Lc⁹g¹⁰Cⁱ¹c¹²c¹³c¹⁴Cc¹⁶c¹⁷c¹⁸ (SEQ ID NO: 105) , ve kterém:

každý z c’, c² a c³ jsou nezávisle nepřítomny nebojsou aminokyselinové zbytky;

c⁵ je aminokyselinový zbytek; c⁷ je aminokyselinový zbytek; c⁹ je T nebo I;

c¹⁰ je bazický zbytek;

každý z c¹¹ a c¹² jsou nezávisle aminokyselinové zbytky;

C¹³ je neutrální hydrofobní zbytek;

c¹⁴ je aminokyselinový zbytek; c¹⁶ je aminokyselinový zbytek; c¹⁷ je neutrální hydrofobní zbytek; a c¹⁸ je aminokyselinový zbytek nebo není přítomen.

-11 CZ 304592 B4

I (d) d¹d²d³Cd⁵d⁶d⁷WDd¹⁰Ld¹²d¹³d¹⁴Cd¹⁵d¹⁶d¹⁷ (SEQ ID NO: 106) , ve kterém:

každý z d¹, d² a d³ jsou nezávisle nepřítomny nebojsou aminokyselinové zbytky;

každý z d⁵, d⁶ a d⁷ jsou nezávisle aminokyselinové zbytky;

d¹⁰ je aminokyselinový zbytek;

d¹² je T nebo i;

d¹³ je aminokyselinový zbytek;

d¹⁴ je aminokyselinový zbytek; a každý z d¹⁶, d¹⁷ a d¹⁸ jsou nezávisle nepřítomny nebojsou aminokyselinové zbytky.

I (e) e¹e²e³Ce⁵e^ee⁷De⁹Le¹¹Ke¹³Ce¹⁵e¹⁶e¹⁷e¹⁸ (SEQ ID NO: 107), ve kterém:

každý z e¹, e² a e³ jsou nezávisle nepřítomny nebojsou aminokyselinové zbytky;

každý z e⁵, e⁶, e⁷, e⁹ a e¹³ jsou nezávisle aminokyselinové zbytky;

e¹¹ je T nebo I; a každý z e¹⁵, e¹⁶ a e¹⁷ jsou nezávisle nepřítomny nebojsou aminokyselinové zbytky.

I (f) f ¹f²f³Kf⁵Df⁷Lf⁹f¹⁰Qf¹²f¹³f¹⁴ (SEQ ID NO: 109), ve kterém:

f¹, f² a f³ jsou nepřítomny nebo jsou aminokyselinové zbytky (s tím, že výhodně jeden z f¹, f² a f³ je C, jestliže jeden z f¹², f⁴³ a f¹⁴ je C);

f⁵ je W, Y, nebo F (výhodně W);

f⁷ je aminokyselinový zbytek (výhodně L);

f⁹ je T nebo I (výhodně T);

f¹⁰ je K, R nebo H (výhodně K);

f¹² je C, neutrální hydrofóbní zbytek nebo bazický zbytek (výhodně W, C nebo R);

f¹³ je C, neutrální hydrofóbní zbytek nebo není přítomen (výhodně V); a f¹⁴ je jakýkoliv aminokyselinový zbytek nebo není přítomen;

za předpokladu, že pouze jeden z f¹, f² a f³ může být C a pouze jeden z f¹², f¹³ a f¹⁴ může být C.

Výše uvedené sloučeniny vzorců I(a) až I(f) obsahují Dz²Lz⁴, stejně jako SEQ ID NO: 63, uvedenou níže. Sekvence I(f) byla odvozena jako konsensus sekvence tak, jak je popsáno v Příkladu 1, uvedeném níže. Ze sloučenin vzorce I(f), jsou preferovány sloučeniny vzorce

I(f') f¹f²f³KWDf⁷Lf⁹KQf¹²f¹³f¹⁴ (SEQ ID NO: 125).

Sloučeniny, spadající do vzorce I(f), zahrnují sekvence SEQ ID NO: 32, 58, 60, 62, 63, 66, 67, 69, 70, 114, 115, 122, 123, 124, 147-150, 152-177, 179, 180, 187.

-12CZ 304592 B4

V souladu s předkládaným vynálezem jsou rovněž sloučeniny mající konsensus motiv:

PFPWE (SEQ ID NO: 110), které rovněž vážou TAFF-1.

Dalšími sloučeninami podle předkládaného vynálezu jsou sloučeniny vzorce: I (g) g¹g²g³Cg⁵PFg⁸Wg¹⁰Cg¹¹g¹²g¹³ (SEQ ID NO: 101), ve kterém:

každý z g¹, g² a g³ jsou nezávisle nepřítomny nebojsou aminokyselinové zbytky; g⁵ je neutrální hydrofobní zbytek; g⁸ je neutrální hydrofobní zbytek; g¹⁰ je kyselý zbytek;

každý z g¹² a g¹³ jsou nezávisle aminokyselinové zbytky; a g¹⁴ je nepřítomen nebo je aminokyselinový zbytek.

I (h) h¹h²h³CWh⁶h⁷WGh¹⁰Ch¹²h¹³h¹⁴ (SEQ ID NO: 102), ve kterém:

každý z h¹, h² a h³ jsou nezávisle nepřítomny nebojsou aminokyselinové zbytky;

h⁶ je hydrofobní zbytek;

h⁷ je hydrofobní zbytek;

h¹⁰ je kyselý nebo polární hydrofobní zbytek; a každý z h¹², h¹³ a h¹⁴ jsou nezávisle nepřítomny nebojsou aminokyselinové zbytky.

I (i) i¹i²i³Ci⁵i⁶i⁷í⁸i⁹i¹⁰Ci¹²i¹³i¹⁴ (SEQ ID NO: 103), ve kterém:

1¹ je nepřítomen nebo je aminokyselinový zbytek;

1² je neutrální hydrofobní zbytek;

1³ je aminokyselinový zbytek;

každý z i⁵, i⁶, i⁷ a i⁸ jsou nezávisle aminokyselinové zbytky;

i⁸ je kyselý zbytek;

i¹⁰ je aminokyselinový zbytek;

každý z i¹² a i¹³ jsou nezávisle aminokyselinové zbytky; a i¹⁴ je neutrální hydrofobní zbytek.

- 13 CZ 304592 B4

Sloučeniny definované vzorci I(g) až I(i) rovněž vážou TALL-1.

Dále podle předkládaného vynálezu zahrnují modulátory TALL-1:

a) TALL-1 modulující doménu (např. aminokyselinovou sekvenci vzorce I(a) až I(i), výhodně aminokyselinovou sekvenci Dz²Lz⁴, nebo sekvence z ní odvozené pomocí fágového displeje, screeningu RNA-peptid, nebo jinými technikami uvedenými výše; a

b) vehikulum, jako například polymer (např. PEG nebo dextran) nebo Fc doménu, která je preferována;

přičemž vehikulum je kovalentně připojeno k doméně modulující TALL-1. Vehikulum a doména modulující TALL-1 mohou být spojeny prostřednictvím N- nebo C-konce domény modulující TALL-1 tak, jak je popsáno níže dále. Preferovaným vehikulem je doména Fc, a preferovanou doménou Fc je doména IgG Fc. Takto Fc-spojené peptidy jsou zde nazývány „peptibodies“. Preferované domény modulující TALL-1 zahrnují aminokyselinové sekvence zde popsané v tabulkách 1 a 2. Další domény modulující TALL-1 mohou být generovány fágovým displejem, screeningem RNA-peptid a dalšími zde zmíněnými technikami.

Dalším předmětem podle předkládaného vynálezu je způsob přípravy modulátorů TALL-1, který zahrnuje:

a. selekci alespoň jednoho peptidu, který se váže s TALL-1; a

b. kovalentní připojení uvedeného peptidu k vehikulu.

Výhodným vehikulem je doména Fc. Krok (a) je výhodně prováděn selekcí z peptidových sekvencí zde uvedených v tabulce 2, nebo fágovým displejem, screeningem RNA-peptid, nebo jinými zde zmíněnými technikami.

Sloučeniny podle vynálezu mohou být připraveny standardními metodami syntézy, technikami rekombinantní DNA, nebo sjakýmikoliv jinými metodami přípravy peptidů a fúzních proteinů. Sloučeniny podle vynálezu, které obsahují nepeptidové podíly, mohou být vedle standardních reakcí peptidové chemie syntetizovány reakcemi standardní organické chemie, pokud je to vhodné.

Primárním zamýšleným použitím sloučenin podle vynálezu je jejich použití jako terapeutických a profylakčních agens. Peptid spojený s vehikulem může mít aktivitu srovnatelnou, nebo dokonce větší, než má přirozený ligand napodobovaný peptidem.

Sloučeniny podle tohoto vynálezu mohou být použity pro terapeutické nebo proiylaktické účely tak, že jsou upraveny s vhodnými farmaceutickými nosičovými materiály a podávány v účinném množství potřebnému pacientovi, jakým je například člověk (nebo jiný savec). Další související aspekty jsou rovněž zahrnuty v předmětném vynálezu.

Četné další aspekty a přednosti předkládaného vynálezu se stanou zřejmými z podrobného popisu vynálezu s přihlédnutím k obrázkům.

Přehled obrázků na výkresech

Obrázek 1 znázorňuje příkladné dimery Fc, které mohou být odvozeny z protilátky IgGl. „Fc“ na obrázku představuje jakoukoliv z variant Fc ve zde použitém významu „doména Fc“. „XI“ a „X2“ představují peptidy nebo linker-peptidové kombinace tak, jak jsou definovány níže. Specifické dimery jsou následující:

- 14CZ 304592 B4

A, D: Dimery s jednoduchou disulfidovou vazbou. Protilátky IgGl mají běžně dva disulfidové můstky v pantové oblasti protilátky. Doména Fc na obrázcích 1A a ID může být vytvořena zkrácením mezi místy dvou disulfidových můstků, nebo substitucí zbytku cysteinylu za nereagující zbytek, který nevytváří disulfidový můstek (například alanyl). Na obrázku 1A, je doména Fc vázána na aminokonec peptidů; na obrázku ID pak na karboxykonec.

Β, E: Dimery s dvojitou disulfidovou vazbou. Tato doména Fc může být vytvořena zkrácením rodičovské proti látky se zachováním obou zbytků cysteinylu v řetězcích domény Fc, nebo expresí z konstruktu obsahujícího sekvenci kódující takovou doménu Fc. Na Obrázku 1B je doména Fc vázána na aminokonec peptidů; na Obrázku 1E pak na karboxykonec.

C, F: Nekovalentní dimery. Tato doména Fc může být vytvořena eliminací zbytků cysteinylu buďto zkrácením, nebo substitucí. Může být požadována eliminace zbytků cysteinylu tak, aby byly vyloučeny nečistoty, které se vytvářejí reakcí zbytků cysteinylu se zbytky cysteinylu jiných proteinů, jež jsou přítomny v hostitelské buňce. Nekovalentní vazba domén Fc je pro soudržnost dimeru postačující.

Další dimery mohou být vytvářeny s použitím domén Fc získaných z odlišných typů protilátek (například IgG2, IgM).

Obrázek 2 znázorňuje strukturu výhodných sloučenin podle vynálezu, které jsou charakterizovány tandemovým opakováním farmakologicky aktivního peptidů. Obrázek 2A znázorňuje jednořetězcovou molekulu a může rovněž představovat konstrukt DNA pro molekulu. Obrázek 2B znázorňuje dimer, ve kterém linker-peptidový podlije přítomen pouze v jednom řetězci dimeru. Obrázek 2C znázorňuje dimer, který má peptidový podíl v obou řetězcích. Dimer podle obrázku 2C se spontánně vytváří v určitých hostitelských buňkách po expresi konstrukci DNA kódujícího jednotlivý řetězec znázorněný na obrázku 3A. V případě jiných hostitelských buněk mohou být buňky pěstovány za podmínek, které favorizují tvorbu dimerů, nebo dimery mohou být vytvářeny in vitro.

Obrázek 3 znázorňuje příkladnou sekvenci nukleové kyseliny a sekvenci aminokyselin (SEQ ID NO: 1 a 2, v uvedeném pořadí) lidského IgGl Fc, které mohou být použity podle tohoto vynálezu.

Obrázky 4A až 4F znázorňují nukleotidové a aminokyselinové sekvence (SEQ ID NO: 3-27) fragmentů NdelaiSall, kódujících peptid a linker.

Obrázky 5A až 5M znázorňují nukleotidovou sekvenci (SEQ ID NO: 28) vektoru pAMG21RANK-Fc, který byl použit ke konstruování Fc-spojených molekul podle předkládaného vynálezu. Tyto obrázky identifikují řadu znaků nukleové kyseliny, včetně:

• oblastí promotoru PcopB, PreA, RNAI, APHII, luxPR a luxPL;

• mRNA pro APHII, luxR;

• kódující sekvence a proteinové aminokyselinové sekvence pro protein copB, copT, repAI, repA4, APHII, luxR, RANK, a Fc;

• vazebná místa proteinů copB, CRP;

• vlásenkové struktuiy Tl, T2, T7 a „toop“;

• místo operátoru pro protein lux;

• místa pro restrikční enzymy Pfl 11081, Bglll, Seal, Bmnl, Drdll, Dralll, BstBI, Acelll, Aflll, PflMl, Bgll, Sfll, BstEll, BspLulll, NspV, Bpll, Eagl, Bcgl, Nsil, Bsal, Pspl4061, Aaťll, Bsml, Nrul, Ndel, ApaLl, Acc651, Kpnl, Saň, Accl, BspEl, Ahdl, BspPB, Econl, BsrGl, Bmdl, Smál, SexAI, BamHl a Blpl.

- 15CZ 304592 B4

Obrázky 6A a 6B znázorňují sekvence DNA (SEQ ID NO: 97) inzerované do pCFM1656 mezi jedinečné restrikční místo AatlI (pozice číslo 4364 v pCFM1656) a restrikční místo Sacll (pozice číslo 4585 vpCFM1656) k vytvoření expresivního plasmidu pAMG21 (přírůstkové číslo ATCC 98113).

Obrázek 7 znázorňuje, že „TALF-1 peptibody“ (SEQ ID NO; 70) inhibuje proliferaci B buněk zprostředkovanou TAFF-1. Puntíkované B buňky (10⁵) z myší B6 byly triplicitně kultivovány na plotnách o 96 jamkách s určitým množstvím TAFF-1 konsensus peptibody v přítomnosti 10 ng/ml TALF-1 plus 2 pg/ml protilátky anti-IgM. Proliferace byla měřena příjmem radioaktivního [³H]thymidinu v posledních 18 hodinách značení. Uvedené výsledky reprezentují průměr ± SD ze tří jamek.

Obrázek 8 uvádí, že TALL-1 N-terminální tandemové dimemí teploty (peptibodies) (SEQ ID NO: 123, 124 v níže uvedené Tabulce 5B) jsou výhodné pro inhibici proliferace B buněk zprostředkované TALL-1. Puntíkované B buňky (10⁵) z myší B6 byly triplicitně kultivovány v 96jamkových plotnách s určitým množstvím TALL-1 12-3 peptibody a TALL-1 konsensus peptibody (SEQ ID NO: 115 a 122 z tabulky 5B) nebo s příbuznými dimerovými peptidy (peptibodies) (SEQ ID NO: 123, 124) v přítomnosti 10 ng/ml TALL-1 plus 2 pg/ml anti-IgM protilátky. Proliferace byla měřena příjmem radioaktivního [³H]thymidinu v posledních 18 hodinách značení. Uvedené výsledky reprezentují průměr ± SD ze tří jamek.

Obrázek 9. Peptibody AGP3 se váže k AGP3 s vysokou afinitou. Disociační rovnovážná konstanta (K_D) byla získána z nelineární regrese kompetičních křivek s použitím „dualcurve one-site homogeneous binding model“ (KinEx™ software). K_D je přibližně 4 pM pro vazbu peptibody AGP3 s lidským AGP3 (SEQ ID NO: 123).

Obrázky 10A a 10B. Peptibody AGP3 blokuje lidský a myší AGP3 v kompetiční zkoušce Biacore (Biacore competition assay). Rozpustný lidský protein TACÍ byl imobilizován kčipu Bl. 1 nM rekombinantního lidského proteinu AGP3 (horní panel) nebo 5 nM rekombinantního myšího proteinu AGP3 (dolní panel) bylo inkubováno s určitým množstvím peptibody AGP3 před nastříknutím na povrch receptoru. Byla stanovena relativní vazebná odpověď lidského AGP3 a myšího AGP3 (SEQ ID NO: 123).

Obrázky 11A a 11B. Peptibody AGP3 blokoval vazbu AGP3 ke všem třem receptorům TACÍ, BCMA a BAFFR v kompetiční zkoušce Biacore. Rekombinantní rozpustné receptorové proteiny TACÍ, BCMA a BAFFR byly imobilizovány k čipu CM5. 1 nM rekombinantního lidského AGP3 (horní panel) byl inkubován s určitým množstvím peptibody AGP3 před nastříknutím na každý z povrchů receptoru. Byla stanovena relativní vazebná odpověď AGP3. Podobně, 1 nM rekombinantního proteinu APRÍL byl inkubován s určitým množstvím peptibody AGP3 před nastříknutím na každý z povrchů receptoru. Peptibody AGP3 neinhiboval vazbu APRÍL ke všem třem receptorům (SEQ ID NO: 123).

Obrázky 12A a 12B. Peptibody AGP3 inhibuje zvýšení hladiny imunoglobulinu v séru myší, indukované imunizací s lidským AGP3. Myši Balb/c dostávaly denně po dobu 7 dnů intraperitoneální injekce 1 mg/kg lidského proteinu AGP3 zároveň s fyziologickým roztokem, lidským Fc, nebo peptibody AGP3 v uvedených dávkách a byly v 8. dnu usmrceny. Celkové hladiny IgM a IgA v séru byly měřeny metodou ELISA (SEQ ID NO: 123).

Obrázek 13. Ošetření s peptibody AGP3 snižovalo intenzitu artritidy v myším modelu CIA. Samečkové myší DBA/1, staří osm až dvanáct týdnů, byli intradermálně imunizováni u kořene ocasu s hovězím kolagenem typu II (bCII), emulzifíkovaném v kompletním Freundově adjuvans, a 3 týdny po primární imunizaci byli opakovaně imunizováni (boosted) s bCII, emulzifíkovaném v nekompletním Freundově adjuvans. Ošetření se stanovenými dávkami peptibody AGP3 bylo zahájeno v den opakované imunizace po dobu 4 týdnů. Způsobem dříve popsaným (Khare et al.,

- 16CZ 304592 B4

J. Immunol. 155: 3653-9, 1995), byly všechny čtyři packy z hlediska postižení artritidou jednotlivě skórovány body 0-3 (SEQ ID NO: 123).

Obrázek 14. Ošetření s peptibody AGP3 inhibovalo v myším modelu CIA tvorbu anti-kolagenové protilátky. Vzorky séra byly odebrány jeden týden po konečném ošetření (den 35) tak, jak bylo popsáno výše. Hladina protilátky proti kolagenu II byla v séru stanovena metodou ELISA (SEQ ID NO: 123).

Obrázky 15A a 15B. Ošetření s peptibody AGP3 oddálilo počátek proteinurie a zlepšilo přežívání myší „NZB/NZW lupus“. Pět měsíců staré myši NZBx NZBWF1 náchylné k lupus byly ošetřeny i.p. 3x/týden po 8 týdnů s PBS, nebo se stanovenými dávkami peptibody AGP3 (SEQ ID NO: 123), nebo s lidskými proteiny Fc. Po dobu pokusu byl protein v moči stanovován každý měsíc po dobu trvání pokusu, a to s proužky „Albustix reagent strips“ (Bayer AG).

Obrázky 16A a 16B uvádějí nukleokyselinové a aminokyselinové sekvence výhodného TALL1-vazebného peptibody (SEQ ID NO: 189 a 123).

Podrobný popis vynálezu

Definice pojmů

Termíny, použité v tomto popise, mají následující význam, pokud nejsou ve specifických případech jiným způsobem omezeny.

Obecné definice

Výraz „zahrnující“ znamená, že sloučenina může obsahovat další aminokyseliny na jak jednom, tak na obou N- a C- koncích dané sekvence. Je zřejmé, že tyto další (dodatečné) aminokyseliny by neměly signifikantně interferovat s aktivitou sloučeniny.

Kromě toho, jsou zde zahrnuty fyziologicky přijatelné soli sloučenin podle vynálezu. Výraz „fyziologicky přijatelnou sůl“ se týká jakýchkoliv solí, které jsou známé, nebo budou později objeveny, které jsou farmaceuticky přijatelné. Některými ze specifických příkladů jsou: octan; trifluoroctan; hydrohalogenid, jako je například hydrochlorid a hydrobromid; síran; citrát; tartarát; glykolát; a oxalát.

Aminokyseliny

Výraz „kyselý zbytek“ se týká zbytku aminokyselin v D— nebo L— formě, které mají boční řetězce obsahující kyselé skupiny. Příkladné kyselé zbytky zahrnují D a E.

Výraz „amidový zbytek“ se týká aminokyselin v D- a L- formě, které mají boční řetězce obsahující amidové deriváty kyselých skupin. Příkladné zbytky zahrnují N a Q.

Výraz „aromatický zbytek“ se týká aminokyselinových zbytků v D- nebo L- formě, které mají boční řetězce obsahující aromatické skupiny. Příkladné aromatické zbytky zahrnují F, Y a W.

Výraz „bazický zbytek“ se týká aminokyselinových zbytků v D- nebo L-formě, které mají boční řetězce obsahující bazické skupiny. Příkladné bazické zbytky zahrnují Η, K a R.

Výraz „hydrofilní zbytek“ se týká aminokyselinových zbytků v D- nebo L- formě, které mají boční řetězce obsahující polární skupiny. Příkladné hydrofilní zbytky zahrnují C, S, T, N a Q.

- 17CZ 304592 B4

Výraz „nefunkční zbytek“ se týká aminokyselinových zbytků v D- nebo L- formě, které mají boční řetězce, jež postrádají kyselé, bazickém nebo aromatické skupiny. Příkladné nefunkční aminokyselinové zbytky zahrnují M, G, A, V, I, L a norleucin (Nle).

Výraz „neutrální hydrofobní zbytek“ se týká aminokyselinových zbytků v D- nebo L- formě, které mají boční řetězce, jež postrádají bazické, kyselé, nebo polární skupiny. Příkladné neutrální hydrofobní aminokyselinové zbytky zahrnují A, V, L, I, P, W, M a F.

Výraz „polární hydrofobní zbytek“ se týká aminokyselinových zbytků v D- nebo L- formě, které mají boční řetězce obsahující polární skupiny. Příkladnými polárními hydrofobními aminokyselinovými zbytky jsou T, G, S, Y, C, Q a N.

Výraz „hydrofobní zbytek“ se týká aminokyselinových zbytků v D- nebo L- formě, které mají boční řetězce, jež postrádají bazické nebo kyselé skupiny. Příkladné hydrofobní aminokyselinové zbytky zahrnují A, V, L, I, P, W, M, F, T, G, S, Y, C, Q a N.

Peptidy

Výraz „peptid“ se týká molekul z 1 až 40 aminokyselin, výhodně molekul z 5 až 20 aminokyselin. Příkladné peptidy mohou zahrnovat doménu modulující TALL-1 z přirozeně se vyskytující molekuly, nebo zahrnují náhodné sekvence.

Výraz „náhodné“ tak, jak je zde použit ve vztahu k peptidovým sekvencím, se týká zcela náhodných sekvencí (například selektovaných pomocí metod fágového displeje nebo RNA-peptidového screeningu) a sekvencí, ve kterých jeden nebo více zbytků v přirozeně se vyskytující molekule je zaměněno aminokyselinovým zbytkem, který se v dané pozici v přirozené molekule nevyskytuje. Příkladné způsoby pro identifikaci peptidových sekvencí zahrnují fágový displej, E. coli displej, ribozómový displej, RNA-peptidový screening, chemický screening a podobně.

Výraz „doména modulující TALL-1“ se týká jakékoliv aminokyselinové sekvence, která se váže k TALL-1 a obsahuje přirozeně se vyskytující sekvence nebo náhodné sekvence. Příkladné domény modulující TALL-1 mohou být identifikovány nebo odvozeny fágovým displejem nebo jinými zde zmíněnými metodami.

Výraz „antagonista TALL-1 se týká molekuly, která se váže k TALL-1 a zvyšuje nebo snižuje jeden nebo více zkouškových parametrů, na rozdíl od účinku přirozeného TALL-1 o úplné délce na tyto parametiy. Takováto aktivita může být stanovena metodami, které jsou popsány v subsekci nazvané „Biological activity of AGP-3“ v části Materials & Methods“ přihlášky vynálezu o názvu „TNF-RELATED PROTEINS“, WO 00/47 740, publikované 17. srpna 2000.

Vehikula a peptibodies

Výraz „vehikulum“ se týká molekuly, která brání degradaci a/nebo zvyšuje biologický poločas, snižuje toxicitu, snižuje imunogenicitu, nebo zvyšuje biologickou aktivitu terapeutického proteinu. Příkladná vehikula zahrnují doménu Fc (která je preferována), stejně jako lineární polymer (například polyethylenglykol (PEG), polylysin, dextran, atd.); polymer s rozvětveným řetězcem (viz, například patenty US 4 289 872, původců Denkenwalter et al., vydaný 15. září 1981; US 5 229 490, původce Tam, vydaný 20. července 1993; přihlášku WO 93/21 259, původců Frechet et al., publikovanou 28. října 1993); lipid; cholesterolová skupina (jako je steroid); uhlovodan nebo oligosacharid (například dextran); jakýkoliv přirozený nebo syntetický protein, polypeptid nebo peptid, který se váže k ochrannému (salvage) receptoru; albumin, zahrnující lidský sérový albumin (human sérum albumin, HSA), leucínovou zipovou (zipper) doménu, a další takové proteiny a proteinové fragmenty. Vehikula jsou zde popsána dále.

-18CZ 304592 B4

Výraz „nativní Fc“ se týká molekuly nebo sekvence obsahující sekvenci neantigenního vazebného fragmentu, který vzniká štěpením úplné protilátky, ať už v monomemí, nebo multimemí formě. Původní imunoglobulinový zdroj nativního Fc je výhodně lidského původu a může jím být jakýkoliv z imunoglobulinů, ačkoliv IgGl a IgG2 jsou preferovány. Nativní fragmenty Fc jsou připravovány z monomemích peptidů, které mohou být spojeny do dimemích nebo multimemích forem kovalentní (například disulfidovými můstky) a nekovalentní vazbou. Počet intermolekulárních disulfidových můstků mezi monomemími podjednotkami nativních molekul Fc se pohybuje od 1 do 4 v závislosti na třídě (například IgG, IgA, IgE) nebo podtřídě (například IgGl, IgG2, IgG3, IgAl, IgGA2). Jedním příkladem nativního Fc je dimer s disulfidovým můstkem, který vzniká štěpením IgG s papainem (viz Ellison et al. (1982), Nucleic Acids Res. 10: 4071-9). Výraz „nativní Fc“ tak, jak je zde používán, je generický pro monomemí, dimemí a multimemí formy.

Výraz „varianta Fc“ se týká molekuly nebo sekvence, která je modifikovanou formou nativního Fc, avšak stále obsahuje vazebné místo pro chráněný (salvage) receptor, FcRn. Mezinárodní přihláška WO 97/34 631 (zveřejněné 25. září 1997) a přihláška WO 96/32 478 popisují příkladné varianty Fc, stejně jako interakce s ochranným receptorem, a jsou zde v celém svém rozsahu zahrnuty formou odkazu. Proto výraz „varianta Fc“ zahrnuje molekulu nebo sekvenci, která je humanizována z nativního Fc, jenž není lidského původu. Kromě toho, nativní Fc obsahuje místa, která mohou být odstraněna, protože poskytují strukturní charakteristiky nebo biologickou aktivitu, jež nejsou pro fúzi molekul podle předkládaného vynálezu nezbytné. Z tohoto důvodu výraz „varianta Fc“ zahrnuje i molekulu nebo sekvenci, která postrádá jedno nebo více nativních Fc míst nebo zbytků, které působí nebo jsou zúčastněny v (1) tvorbě disulfidového můstku, (2) inkompatibilně s vybranou hostitelskou buňkou, (3) N-terminální heterogenitě po expresi ve vybrané hostitelské buňce, (4) glykosylaci, (5) interakci s komplementem, (6) vazbě k receptoru Fc odlišnému od ochranného (salvage) receptoru, nebo (7) protilátkově dependentní buněčné cytotoxicitě (antibody-dependent cellular cytotoxicity, ADCC). Varianty Fc jsou detailně popsány níže.

Výraz „doména Fc“ zahrnuje molekuly a sekvence nativního Fc a varianty Fc definované výše. Podobně jako v případě variant Fc a nativních fragmentů Fc, zahrnuje výraz „doména Fc“ molekuly v monomemí nebo multimemí formě, které jsou připravovány štěpením úplné protilátky, nebo jinými způsoby.

Výraz „multimer“ tak, jak je použit pro domény Fc nebo molekuly obsahujících domény, se týká molekul majících dva nebo více polypeptidových řetězců spojených kovalentně, nekovalentně, nebo jak kovalentními, tak nekovalentními interakcemi. Molekuly IgG typicky vytvářejí dimery; IgM, pentamery; IgD, dimery; a IgA, monomery, dimery, trimery, nebo tetramery. Multimery se mohou vytvářet s využitím sekvence a rezultující aktivity nativního zdroje Ig či Fc, nebo derivatizace (tak, jak je definována níže) takových nativních Fc.

Výraz „dimer“ tak, jak je použit pro domény Fc nebo molekuly obsahujících domény, se týká molekul majících dva nebo více polypeptidových řetězců spojených kovalentně, nebo nekovalentně. Příkladnými dimeiy v rozsahu tohoto vynálezu jsou ty, které jsou zobrazeny na obrázku 1.

Výrazy „derivatizující“ a „derivát“ a „odvozený“ zahrnují procesy a z nich rezultující sloučeniny, kde (1) sloučenina má cyklickou část; například příčné vazby mezi cysteinylovými zbytky uvnitř sloučeniny; (2) sloučenina je příčně spojena nebo má místo pro příčnou vazbu; například sloučenina má cysteinový zbytek a tvoří tak dimery s příčnými vazbami v kultuře nebo in vivo·, (3) jedna nebo více peptidových vazeb je nahrazena nepeptidovou vazbou; (4) N-konec je nahrazen s -NRR¹, NRC(O)R^], -NRC(O)OR', -NRSÍO^R¹, -NHC(O)NHR, sukcinimidovou skupinou, nebo je substituován nebo nesubstituován s benzyloxykarbonyl-ΝΗ-, kde R a R¹ a substituenty kruhů jsou takové, jak je definováno níže; (5) C-konec je nahrazen -C(O)R² nebo -NR³R⁴, kde R², R³ a R⁴ jsou takové, jak je definováno níže; a (6) sloučeniny, ve kterých jednotlivé amino-19CZ 304592 B4 kyselinové části jsou modifikovány působením agens, jež jsou schopna reagovat s vybraným bočním řetězcem nebo koncovými zbytky. Deriváty jsou zde popsány níže.

Výraz „peptibody“ a „peptibodies“ se týká molekul obsahujících doménu Fc a alespoň jeden peptid. Takovými peptibodies mohou být multimery nebo dimery nebo jejich fragmenty, které mohou být derivatizovány. Podle předkládaného vynálezu se jedná o molekuly peptibodies vzorců II až VI, uvedené níže, v nichž V¹ je doména Fc.

Struktura sloučenin

Obecně. Původci vynálezu identifikovali sekvence schopné vázat se a modulovat biologickou aktivitu TALL-1. Tyto sekvence mohou být modifikovány výše zmíněnými technikami, se kterými jedna nebo více aminokyselin může být pozměněna při zachování nebo dokonce zlepšení vazebné afinity peptidů.

V kompozicích připravených podle tohoto vynálezu mohou být peptid (peptidy) připojeny k vehikulu prostřednictvím peptidového N-konce nebo C-konce. Jakýkoliv z těchto peptidů může být spojen v tandem (například následně) s použitím nebo bez linkerů. Proto mohou být molekuly vehikulum-peptid popsány následujícím vzorcem:

(ii) (xVvAxA ve kterém:

V^I je vehikulum (výhodně doména Fc);

X¹ a X² jsou nezávisle vybrány z -(Li)c-P', -(L^!)c-P¹-(L²)(í-P², -(L¹)c-P¹-(L²)d-P²-(L³)e-P³ a -(L')c-P'-(L²)d-(L³)e-P³-<L⁴)_f-P⁴;

Ρ¹, Ρ², P³ a P⁴ jsou každý nezávisle sekvencemi domén modulujících TALL-1, jako jsou například domény vzorce I(a) až I(i);

L¹, L², L³ a L⁴ jsou každý nezávisle linkery; a a, b, c, d, e a f jsou každý nezávisle 0 nebo 1, za podmínky, že alespoň jeden z a a b je 1.

Proto sloučenina vzorce II zahrnuje výhodné sloučeniny vzorce:

(III) X-V¹ a jejich multimery, kde V¹ je doména Fc a je připojena na C-konci A¹;

(IV) V-X² a jejich multimery, kde V¹ je doména Fc a je připojena na N-konci A²;

(V) ν’-οΛ-ρ¹ a jejich multimery, kde V¹ je doména Fc a je připojena na N-konci -(LÝ-P¹; a (VI) VÚLjcPÚL²)^² a jejich multimery, kde V¹ je doména Fc a je připojena na N-konci -ί'-Ρ'-ί²-?².

-20CZ 304592 B4

Peptidy. Peptidy podle vynálezu jsou vhodné jako peptidy modulující TALL-1 nebo jako domény modulující TALL-1 v molekulách vzorců II až VI. Molekuly podle vynálezu, zahrnující tyto sekvence, mohou být připraveny v oboru známými metodami.

Výhodnými peptidovými sekvencemi jsou sekvence následujícího vzorce I(a), které mají substituenty identifikované níže.

Tabulka 1 - Výhodné peptidové substituenty

Vzorec Ka)	a8 je T; a9 je bazický zbytek (nejvýhodněji K; a
	a12 je neutrální hydrofobní zbytek (nejvýhodněji F) -
Vzorec	b3 je D, A nebo E;
I (b)	b6 je W nebo Y; b10 T; b11 je K nebo R; a b14 je V nebo L.
Vzorec	c9 je T;
Kc)	c10 je K nebo R; c13 je I, L nebo V; a C17 je A nebo L.
Vzorec	d12 je T.
I(d)
Vzorec	e3,3 je T.
I(e)
Vzorec	f9 je T;
I(f)	f10 je K; a f13 je V.
Vzorec	g5 je W;
Kg)	g8 je P; g10 je E; a g13je bazický zbytek.
Vzorec	h1 je G;
I(h)	h6 je A; h7 je neutrální hydrofobní zbytek; a h10 je kyselý zbytek.
Vzorec	i2 je W; a
Ki) i	i14 je W.

-21 CZ 304592 B4

Výhodné peptidové sekvence jsou uvedeny v tabulce 2 níže.

Tabulka 2 - Výhodné TALL-1 modulující domény

Sekvence	SEQ ID NO:
PGTCFPFPWECTHA	29
WGACWPFPWECFKE	30
VPFCDLLTKHCFEA.	31
GSRCKYKWDVLTKQCFHH	32.
LPGCKWDLLIKQWVCDPL	33
SADCYFDILTKSDVCTSS	34
SDDCMYDQLTRMFICSNL	35
DLNCKYDELTYKEWCQFN	36
FHDCKYDLLTRQMVCHGL	37
RNHCFWDHLLKQDICPSP	38
ANQCWWDSLTKKNVCEFF	39
YKGRQMWDILTRSWWSL	12Θ
QDVGLWWDILTRAWMPNI	127
QNAQRVWDLLIRTWVYPQ	128
GWNEAWWPELTKIWVLEQ	129
RITCDTWDSLIKKCVPQS	130
gaimqfwdsltktwlrqs	131
WLHSGWWDPLTKHWLQKV	132
SEWFFWFDPLTRAQLKFR	133
GVWFWWFDPLTKQWTQAG	134
MQCKGYYDILTKWCVTNG	135
LWSKEVWDILTKSWVSQA	136
KAAGWWFDWLTKVWVPAP	137
AYQTWFWDSLTRLWLSTT	138
SGQHFWWDLLTRSWTPST	139
LGVGQKWDPLTKQWVSRG	140
VGKMCQWDPLIKRTVCVG	141
CRQGAKFDLLTKQCLLGR	142
GQAIRHWDVLTKQWVDSQ	143
RGPCGSWDLLTKHCLDSQ	144
WQWKQQWDLLTKQMVWVG	145
PITICRKDLLTKQWCLD	146
KTCNGKWDLLTKQCLQQA	147
KCLKGKWDLLTKQCVTEV	148
RCWNGKWDLLTKQCIHPW	149
NRDMRKWDPLIKQWrVRP	150
QAAAATWDLLTKQWLVPP	151
PEGGPKWDPLTKQFLPPV	152
QTPQKKWDLLTKQWFTRN	153
IGS PCKWDLLTKQMIGQT	154
CTAAGKWDLLTKQCIQEK	155
VSQCMXWDLLTKQCLQGW	156
VWGTWKWDLLTKQYLPPQ	157
GWWEMKWDLLTKQWYRPQ	158
TAQVSKWDLLTKQWLPLA	159
QLWGTKWDLLTKQYIQIM	160
WATSQKWDLLTKQWVQNM	161
QRQCAKWDLLTKQCVLFY	162

-22CZ 304592 B4

KTTDCKWDLLTKQRICQV	163
LLCQGKWDLLTKQCLKLR	164
LMWFWKWDLLTKQLVPTF	165
QTWAWKWDLLTKQWIGPM	166
NKELLKWDLLTKQCRGRS	167
GQKDLKWDLLTKQYVRQS	16Θ
pkpcqkwdlltkqclgsv	169
GQIGWKWDLLTKQWIQTR	170
VWLDWKWDLLTKQWIHPQ	171
QEWEYKWDLLTKQWGWLR	172
HWDSWKWDLLTKQWWQA	173
trplqkwdlltkqwlrvg	174
SDQWQKWDLLTKQWFWDV	175
QQTFMKWDLLTKQWIRRH	176
QGECRKWDLLTKQCFPGQ	177
GQMGWRWDPLIKMCLGPS	178
QLDGCKWDLLTKQKVCIP	179
HGYWQKWDLLTKQWVSSE	180
HQGQCGWDLLTRIYLPCH	181
LHKACKWDLLTKQCWPMQ	182
GPPGSVWDLLTKIWIQTG	183
ITQDWRFDTLTRLWLFLR	184
QGGFAAWDVLTKMWITVP	185
GHGTPWWDALTRIWILGV	186
VWPWQKWDLLTKQFVFQD	187
WQWSWKWDLLTRQYISSS	188
NQTLWKWDLLTKQFITYM	60
PVYQGWWDTLTKLYIWDG	61
WLDGGWRDPLIKRSVQLG	62
GHQQFKWDLLTKQWVQSN	63
QRVGQFWDVLTKMFITGS	64
QAQGWSYDALIKTWIRWP	65
GWMHWKWDPLTKQALPWM	66
GHPTYKWDLLTKQWILQM	67
WNNWSLWDPLTKLWLQQN	68
WQWGWKWDLLTKQWVQQQ	69
GQMGWRWDPLTKMWLGTS	70

Je třeba uvést, že známé receptory pro TALL-1 nesou určitou sekvenční homologií s výhodnými peptidy:

12-3 LPGCKWDLLIKQWVCDPL

BAFFR MRRGPRSLRGRDAPVPTPCVPTECYDLLVRKCVDCRLL

TACÍ TICNHQSQRTCAAFCRSLSCRKEQGKFYDHLLRDCISCASI

BCMA FVSPSQEIRGRFRRMLQMAGQCSQNEYFDSLLHACIPCQLRC (SEQ ID NO: 33, 195, 196 a 197, v uvedeném pořadí).

Jakýkoliv peptid obsahující cysteinylový zbytek se může příčně vázat s jiným Cys-obsahujícím peptidem, přičemž buďto jeden, nebo oba mohou být vázány na vehikulum. Rovněž jakýkoliv peptid, který má více než jeden zbytek Cys, může vytvářet intrapeptidový disulfidový můstek. Jakýkoliv z těchto peptidů může být derivatizován tak, jakje dále popsáno.

ío Další užitečné peptidové sekvence mohou vznikat na základě konzervativních a nekonzervativních modifikací aminokyselinových sekvencí ze sekvencí uvedených v tabulce 2.

-23 CZ 304592 B4

Konzervativní modifikace poskytují peptidy, které mají funkční a chemické charakteristiky podobné těm, jež má peptid, ze kterého takové modifikace jsou připraveny. Naopak významné modifikace funkčních a/nebo chemických charakteristik peptidů mohou být provedeny selekcí substitucí v aminokyselinové sekvenci, které se signifikantně odlišují ve svém účinku na zachování (a) struktury molekulární páteře v oblasti substituce, například listové nebo šroubovicové konformace, (b) náboje nebo hydrofobnosti molekuly v cílovém místě, nebo (c) velikosti molekuly·

Tak například, „konzervativní aminokyselinová substituce“ může zahrnovat substituce přirozeného aminokyselinového zbytku nepřirozeným zbytkem tak, že je v této pozici malý nebo žádný účinek na polaritu nebo na náboj aminokyselinového zbytku. Kromě toho, jakýkoliv přirozený zbytek v polypeptidu může být rovněž substituován za alanin tak, jak bylo dříve popsáno pro „alanine scanning mutagenesis“ (viz, například MacLennan et al., 1998, Acta Physiol. Scand.

Suppl. 643: 55-67; Sasaki et al., 1998, Adv. Biophys. 35: 1-24, kde je mutageneze alaninovým skenování diskutována.

Požadované aminokyselinové substituce (ať již konzervativní nebo nekonzervativní) mohou být odborníkem v oboru stanoveny v čase, kdy jsou takové substituce požadovány. Tak například, aminokyselinové substituce mohou být použity pro identifikaci významných zbytků v polypeptidové sekvenci, nebo ke zvýšení či snížení afinity zde popsaných peptidových nebo vehikulumpeptidových molekul (viz výše uvedené vzorce). Příkladné aminokyselinové substituce jsou uvedeny v tabulce 3.

Tabulka 3 - Aminokyselinové substituce

Původní zbytky	Příkladné substituce	Výhodné substituce
Ala (A)	Val, Leu, Ile	Val
Arg (R)	Lys, Gin, Asn	Lys
Asn (N)	Gin	Gin
Asp (D)	Glu	Glu
Cys (C)	Ser, Ala	Ser
Gin (Q)	Asn	Asn
Glu (E)	Asp	Asp
Gly (G)	Pro, Ala	Ala
His (H)	Asn, Gin, Lys, Arg	Arg
Ile (I)	Leu, Val, Met, Ala, Phe, Norleucin	Leu
Leu (L)	Norleucin, Ile, Val, Met, Ala, Phe	Ile
Lys (K)	Arg, kyselina 1,4 diaminomáselná, Gin, Asn	Arg
Met (M)	Leu, Phe, Ile	Leu

-24CZ 304592 B4

Phe (F)	Leu, Val, Ile, Ala, Tyr	Leu
Pro (P)	Ala	Gly
Ser (S)'	Thr, Ala, Cys	Thr
Thr (T)	Ser	Ser
Trp (W)	Tyr, Phe	Tyr
Tyr (Y)	Trp, Phe, Thr, Ser	Phe
Val (V)	Ile, Met, Leu, Phe,Ala, Norleucin	Leu

V určitých provedeních zahrnují konzervativní aminokyselinové substituce rovněž nepřirozeně se vyskytující aminokyselinové zbytky, které jsou typicky začleňovány při chemické syntéze peptidů spíše než při syntéze v biologických systémech.

Jak bylo uvedeno výše v části „Definice pojmů“, přirozeně se vyskytující zbytky mohou být rozděleny do tříd na základě obecných vlastností bočního řetězce, které mohou být vhodné pro modifikace sekvence. Tak například, nekonzervativní substituce mohou zahrnovat záměnu člena jedné z těchto tříd za člena z jiné třídy. Takto zaměněné zbytky mohou být zavedeny do oblasti peptidu, které jsou homologní s ne-lidskými ortology, nebo do nehomologních oblastí molekuly. Kromě toho, lze též připravit modifikace s použitím P nebo G za účelem ovlivnění orientace řetězce.

Při přípravě takových modifikací je třeba vzít v úvahu hydropatický index aminokyselin. Každé z aminokyselin byl přidělen hydropatický index na základě jejich hydrofobních a nábojových charakteristik, který je pro: isoleucin (+4,5); valin (+4,2); leucin (+3,8); fenylalanin (+2,8); cystein/cystin (+2,5); methionin (+1,9); alanin (+1,8); glycin (-0,4); threonin (-0,7); serin (-0,8); tiyptofan (-0,9); tyrosin (-1,3); prolin (-1,6); histidin (-3,2); glutamát (-3,5); glutamin 3,5); aspartát (-3,5); asparagin (-3,5); lysin (-3,9) a arginin (—4,5).

Význam hydropatického aminokyselinového indexu pro řečené interaktivní biologické funkce proteinu je v oboru znám. Kyte et al., J. Mol. Biol., 157: 105-131 (1982). Je známo, že určité aminokyseliny mohou být zaměněny za jiné aminokyseliny, které mají podobný hydropatický index nebo skóre a stále si uchovávají podobnou biologickou aktivitu. Při provádění záměn na základě hydropatického indexu jsou výhodné ty substituce aminokyselin, jejichž hydropatické indexy jsou mezi ± 2, výhodněji ty, jejichž hydropatické indexy jsou mezi ± 1, a nejvýhodněji ty, jejichž hydropatické indexy jsou mezi ± 0,5.

Rovněž je v oboru známo, že substituce podobných aminokyselin může být účinně prováděna na základě hydrofobnosti. Nejvyšší místní průměrná hydrofobnost proteinu tak, jak je určována hydrofilitou sousedících aminokyselin, koreluje s jeho imunogenitou a antigenitou, tj. s biologickou vlastností proteinu.

Aminokyselinovým zbytkům byly přiděleny následující hodnoty hydrofility: arginin (+3,0); lysin (+3,0); aspartát (+3,0 ± 1); glutát (+3,0 ± 1); serin (+0,3); asparagin (+0,2); glutamin (+0,2); glycin (0); threonin (-0,4); prolin (-0,5 ± 1); alanin (-0,5); histidin (-0,5); cystein (1,0); methionin (-1,3); valin (-1,5); leucin (-1,8); isoleucin (-1,8); tyrosin (-2,3); fenylalanin (-2,5); tryptofan (-3,4). Při provádění záměn na základě podobných hodnot hydrofility jsou výhodné substituce aminokyselin, jejichž hodnoty hydrofility jsou v rámci ± 2, výhodněji ty, jejichž hodnoty hydrofility jsou v rámci ± 1, a nejvýhodněji ty, jejichž hodnoty hydrofility jsou v rámci ± 0,5. Na základě hydrofility lze rovněž identifikovat epitopy z primárních aminokyselinových sekvencí. Tyto oblasti jsou rovněž nazývány jako Jaderné oblasti epitopu“.

-25 CZ 304592 B4

Odborník v oboru je schopen s použitím dobře známých technik stanovit vhodné varianty polypeptidu tak, jak jsou uvedeny v následujících sekvencích. Pro identifikaci vhodných oblastí molekuly, které mohou být měněny bez narušení aktivity, může odborník v oboru vytipovat oblasti, o kterých se předpokládá, že nejsou významné pro aktivitu proteinu. Tak například, jestliže jsou známy polypeptidy s podobnými aktivitami ze stejných druhů nebo z jiných druhů, může odborník v oboru porovnat aminokyselinovou sekvenci peptidu s podobnými peptidy. Na základě takového porovnání mohou být identifikovány zbytky nebo části molekul, které jsou u podobných polypeptidů konzervovány. Je třeba zdůraznit, že změny v oblastech peptidu, které nejsou konzervovány vzhledem k takovým podobným peptidům, by méně pravděpodobněji měly nepříznivý účinek na biologickou aktivitu a/nebo strukturu peptidu. Odborník v oboru by měl rovněž vědět, že dokonce i v relativně konzervovaných oblastech je možné substituent chemicky podobné aminokyseliny za přirozeně se vyskytující zbytky při zachování aktivity (konzervativní aminokyselinové substituce). Proto dokonce i oblasti, které mohou být významné pro biologickou aktivitu nebo pro strukturu, mohou být podrobeny konzervativním aminokyselinovým substitucím bez narušení biologické aktivity nebo bez nepříznivého působení na strukturu peptidu.

Kromě toho, odborník v oboru může vyhodnotit studie o struktuře-funkci, které identifikují zbytky v podobných peptidech, jež jsou významné pro aktivitu nebo strukturu. S ohledem na takové porovnání je možné předpovědět význam aminokyselinových zbytků v peptidu, které korespondují s aminokyselinovými zbytky, jež jsou významné pro aktivitu nebo strukturu u podobných peptidů. Odborník v oboru může vybrat chemicky podobné aminokyselinové substituce pro takto předpovězené významné aminokyselinové zbytky v peptidech.

Odborník v oboru může rovněž u podobných peptidů analyzovat trojrozměrnou strukturu a aminokyselinovou sekvenci ve vztahu k této struktuře. Na základě této informace může odborník v oboru předpovědět seřazení sekvencí (alignment) aminokyselinových zbytků peptidu s ohledem na trojrozměrnou strukturu. Odborník v oboru může zvolit postup, při kterém nejsou prováděny radikální změny v aminokyselinových zbytcích, o kterých se předpokládá, že jsou na povrchu proteinu, neboť tyto zbytky mohou být zúčastněny ve významných interakcích s jinými molekulami. Navíc, odborník v oboru může vytvořit testovací varianty obsahující jednoduché aminokyselinové substituce v každém z požadovaných aminokyselinových zbytků. Varianty mohou být screenovány s použitím zkoušek aktivity, jež jsou v oboru známy. Uvedené výsledky mohou být použity pro shromáždění informací o vhodných variantách. Tak například, jestliže je zjištěno, že změna v konkrétním aminokyselinovém zbytku vedla k destruované, nežádoucně snížené, nebo nevhodné aktivitě, jsou varianty s takovou změnou vyloučeny. Jinak řečeno, na základě informací shromážděných z takovýchto rutinních pokusů může odborník v oboru snadno stanovit aminokyseliny, kde další substituce by neměly být prováděny buďto samostatné, nebo v kombinaci s jinými mutacemi.

Řada odborných publikací byla věnována predikci sekundární struktury. Viz Moult./., Curr. Op. in Biotech., 7 (4): 422-427 (1996), Chou et al., Biochemistry, 13 (2): 222-245 (1974); Chou et al., Biochemistry, 113 (2): 211-222 (1974); Chou et al., Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol.,41: 45-148 (1978); Chou et al., Ann. Rev. Biochem., 47: 251-276 a Chou et al., Biophys. /, 26: 367-384 (1979). Kromě toho jsou v současné době dostupné počítačové programy, které napomáhají s predikcí sekundární struktury. Jedna z metod predikce sekundární struktury je založena na homologním modelování. Tak například, dva polypeptidy nebo proteiny, které mají sekvenční identitu vyšší než 30 %, nebo podobnost vyšší než 40 %, mají často podobné strukturální topologie. Současný nárůst databází údajů o proteinové struktuře (protein structural data base, PDB) poskytuje zvýšenou předpověditelnost sekundární struktury, včetně potenciálního počtu sbalení uvnitř polypeptidové nebo proteinové struktury. Viz Holm et al., Nucl. Acid. Res., 27(1): 244-247 (1999). Bylo naznačeno (Brenner et al. Curr. Op. Struc. Biol., 7 (3): 369-376 (1997)), že v daném polypeptidů nebo proteinu existuje omezený počet sbalení, a jestliže byl jednou stanoven kritický počet struktur, dosáhne strukturální předpověď významné přesnosti.

-26CZ 304592 B4

Další metody predikce sekundární struktury zahrnují „threading“ (Jones, D., Curr. Opin. Struct. Biol., 7 (3): 377-87 (1997); Sippl et al., Structure, 4(1): 15-9 (1996)), „profile analysis“ (Bowie et al., Science, 253: 164-170 (1991); Gribskov et al., Meth. Enzym., 183: 146-159 (1990); Gribskov et al., Proč. Nat. Acad. Sci., 84 (13): 4355-8 (1987)), a „evolutionay linkage“ (Viz Home, výše, a Brenner, výše).

Vehikula. Tento vynález vyžaduje přítomnost alespoň jednoho vehikula (V¹) připojeného k peptidu prostřednictvím N-konce, C-konce nebo bočního řetězce jednoho z aminokyselinových zbytků. Mnohonásobná vehikula mohou být rovněž použita, například fragmenty Fc na každém konci, nebo Fc na konci a skupina PEG na jiném konci nebo bočním řetězci. Příkladná vehikula zahrnují:

• doménu Fc;

• jiné proteiny, polypeptidy, nebo peptidy schopné vazby na ochranný (salvage) receptor;

• lidský sérový albumin (human sérum albumin, HSA);

• doménu kukuřičného leucinové zipperu (FZ);

• polyethylenglykol (PEG), zahrnující 5kD, 20kD a 30kD PEG, stejně jako jiné polymery;

• dextran a jiné molekuly známé v oboru jako látky poskytující prodloužení biologického poločasu a/nebo ochranu před proteolytickou degradací nebo odstraněním (clearancí).

Preferovaným vehikulem je doména Fc. Doména Fc může být fúzována s N- nebo C- konci peptidů, nebo na obou N- a C- koncích. Fúze k N-konci je preferována.

Jak bylo zmíněno výše, jsou varianty Fc vhodnými vehikuly spadajícími do rozsahu tohoto vynálezu. Přirozený Fc může být extenzivně modifikován za tvory varianty Fc v souladu s tímto vynálezem, za předpokladu že vazba k ochrannému (salvage) receptoru je zachována; viz, například WO97/34 631 a WO 96/32 478. U takovýchto variant Fc je možné odstranit jedno nebo více míst nativního Fc, které poskytují strukturální znaky nebo funkční aktivitu, jež nejsou požadovány pro fúzi molekul podle vynálezu. Místa lze odstranit například substitucí nebo delecí zbytků, inzercí zbytků od místa, nebo zkrácením částí, které místo obsahují. Inzerovanými nebo substituovanými zbytky mohou rovněž být pozměněné aminokyseliny, jako jsou peptidomimetika nebo D-aminokyseliny. Varianty Fc mohou být žádoucí z řady důvodů, z nichž některé jsou popsány níže. Příkladné varianty Fc zahrnují molekuly a sekvence ve kterých:

1. Místa zúčastněná v tvorbě disulfidových můstků jsou odstraněna. Takové odstranění může zabránit reakci s jinými proteiny obsahujícími cystein, které jsou přítomny v hostitelské buňce použité pro produkci molekul podle vynálezu. Pro tento účel může být segment obsahující cystein na N-konci zkrácen, nebo mohou být cysteinové zbytky deletovány nebo substituovány jinými aminokyselinami (například alanylem, serylem). Konkrétně, je možné odstranit N-koncový 20aminokyselinový segment ze sekvence SEQ ID NO: 2, nebo odstranit nebo substituovat cysteinové zbytky v pozicích 7 a 10 v sekvenci SEQ ID NO: 2. Přes to, že jsou cysteinové zbytky odstraněny, mohou jednořetězcové domény Fc stále vytvářet dimemí domény Fc, které jsou vzájemně spojeny nekovalentními vazbami.

2. Nativní Fc je modifikován tak, aby byl více kompatibilní s vybranou hostitelskou buňkou. Tak například, je možné odstranit sekvence PA poblíž N-konce v typickém nativním Fc, které mohou být rozpoznány štěpícím enzymem v E. coli, jakým je prolin iminopeptidáza. Rovněž je možné na N-konec přidat methioninový zbytek, zejména tehdy, jestliže je molekula rekombinantně exprimována v bakteriální buňce, jakou je E. coli. Doména Fc ze sekvence SEQ ID NO: 2 je jednou z takových variant Fc.

-27CZ 304592 B4

3. Část N-konce nativního Fc je odstraněna k zabránění N-koncové heterogenity, jestliže je exprimován ve vybrané hostitelské buňce. K tomuto účelu je možné deletovat jakýkoliv z prvních 20 aminokyselinových zbytků na N-konci, zejména těch, které jsou v pozicích 1, 2, 3, 4 a 5.

4. Jedno nebo více glykosylačních míst je odstraněno. Zbytky, které jsou typicky glykosylovány (například asparagin), mohou udílet cytolytickou odpověď. Takové zbytky mohou být deletovány nebo substituovány s neglykosylovanými zbytky (například alaninem).

5. Místa zúčastněná v reakci s komplementem, jako je vazebné místo Clq, jsou odstraněna. Tak například, je možné deletovat nebo substituovat sekvenci EKK lidského IgGl. Zapojení komplementu nemusí být pro molekuly podle tohoto vynálezu výhodné a s takovouto variantou Fc je lze vyloučit.

6. Jsou odstraněna místa, která ovlivňují vazbu k receptorům Fc jiným, než je ochranný (salvage) receptor. Nativní Fc může mít místa pro interakci s určitými bílými krevními buňkami, která není požadována pro fúzi molekul podle předkládaného vynálezu, a proto mohou být odstraněna.

7. Je odstraněno místo ADCC. Místa ADCC jsou v oboru známá; viz, například Molec. Immunol. 29 (5): 633-9 (1992) týkající se míst ADCC v IgGl. Tato místa nejsou rovněž požadována pro fůzi molekul podle předkládaného vynálezu, a proto mohou být odstraněna.

8. Jestliže je nativní Fc odvozen z protilátky nikoliv lidské, může být nativní Fc humanizován. Typicky se pro humanizaci nativního Fc substituují vybrané zbytky v nikoliv lidském nativním Fc ze zbytky, které normálně nejsou v lidském nativním Fc nalézány. Techniky humanizace protilátek jsou v oboru velmi dobře známy.

Výhodné varianty Fc zahrnují následující. V SEQ ID NO: 2 (Obrázek 3) může být leucin v pozici 15 substituován glutamátem; glutamát v pozici 99 alaninem; a lysiny v pozicích 101 a 103 alaniny. Kromě toho, jeden nebo více tyrosinových zbytků může být zaměněno zbytky fenylalaninu.

Alternativním vehikulem může být protein, polypeptid, peptid, protilátka, fragment protilátky, nebo malá molekula (například peptidomimetická sloučenina), které jsou schopné vazby k ochrannému (salvage) receptoru. Tak například, jako vehikulum je možné použít polypeptid tak, jakje popsán v pat. US 5 739 277, vydaném 14. dubna 1998 původcům Presta et al. Peptidy mohou být také selektovány metodou fágového displeje nebo RNA-peptidovým screeningem na vazbu k FcRn ochrannému (salvage) receptoru. Takové sloučeniny, které se vážou k ochrannému (salvage) receptoru, jsou rovněž zahrnuty do významu pojmu „vehikulum“ a spadají do rozsahu tohoto vynálezu. Vehikula tohoto typu by měla být vybrána ke zvýšení poločasu (například vyloučením sekvencí, které jsou rozpoznávané proteázami) a ke snížení imunogenity (například upřednostněním neimunogenních sekvencí, jak bylo objeveno humanizací protilátek).

Jak bylo uvedeno výše, jako V¹ mohou být použita i polymemí vehikula. V současnosti jsou dostupné různé prostředky pro připojení chemických sloučenin vhodných jako vehikula, viz, například zveřejněná mezinárodní přihlášky PCT WO 96/11 953, s názvem „N-Terminally Chemically Modified Protein Compositions and Methods“, která je zde zahrnuta formou odkazu v celém svém rozsahu. Tato PCT publikace, mimo jiné, vyjevuje selektivní připojení ve vodě rozpustných polymerů k N-konci proteinů.

Preferovaným polymemím vehikulem je polyethylenglykol (PEG). Skupina PEG může být o jakékoliv vhodné molekulové hmotnosti a může být lineární nebo větvená. Průměrná molekulová hmotnost PEG se bude výhodně pohybovat v rozsahu od přibližně 2 kiloDaltonů („kD“) do přibližně 100 kD, výhodněji od přibližně 5 kD do přibližně 50 kD, nejvýhodněji od přibližně

-28CZ 304592 B4 kD do přibližně 10 kD. Skupiny PEG budou obecně připojeny ke sloučeninám podle vynálezu prostřednictvím acylace nebo redukční alkylace na reaktivní skupině části PEG (například na aldehydové, aminoskupině, thiolové, nebo esterové skupině) k reaktivní skupině sloučeniny podle vynálezu (například aldehydové, aminoskupině, nebo esterové skupině).

Vhodná strategie pro pegylaci syntetických peptidů spočívá v kombinaci, prostřednictvím vytváření konjugačních vazeb v roztoku, peptidové části a podílu PEG, z nichž každý nese speciální funkční skupinu, které jsou vůči sobě vzájemně reaktivní. Peptidy mohou být snadno připraveny běžnou syntézou na pevné fázi. Peptidy jsou „předem aktivovány“ s vhodnými funkčními skupinami na specifickém místě. Prekursory jsou purifikovány a plně charakterizovány před reakcí s podílem PEG.

Vazba peptidu s PEG se obvykle provádí ve vodné fázi a může být snadno monitorována analýzou HPLC s reverzní fází. Pegylované peptidy mohou být snadno purifikovány preparativní HPLC a charakterizovány analytickou HPLC, aminokyselinovou analýzou a laserovou desorpční hmotovou spektrometrií.

Polysacharidové polymery jsou dalším typem ve vodě rozpustného polymeru, který může být použit pro modifikaci proteinu. Dextrany jsou polysacharidové polymery sestávající z jednotlivých podjednotek glukózy, přednostně spojených vazbami 1 až 6. Dextran sám o sobě je dostupný v mnoha rozmezích molekulové hmotnosti aje snadno dostupný v molekulových hmotnostech od přibližně 1 kD do přibližně 70 kD. Dextran je vhodným ve vodě rozpustným polymerem pro použití podle předkládaného vynálezu jako vehikulum sám o sobě nebo v kombinaci s jiným vehikulem (například s Fc). Viz, například WO 96/11 953 a WO 96/05 309. Použití dextranu konjugovaného s terapeutickými nebo diagnostickými imunoglobuliny bylo publikováno; viz, například zveřejněnou evropskou patentovou přihlášku EP-A 0 315 456, která je zde zahrnuta formou odkazu v celém svém rozsahu. Jestliže je dextran použit jako vehikulum v souladu s předkládaným vynálezem, je preferován dextran o molekulové hmotnosti přibližně 1 kD až přibližně 20 kD.

Linkery. Případně lze použít jakoukoliv skupinu „linkeru“. Jestliže je linker přítomen, jeho chemická struktura není kritická, neboť slouží primárně jako spacer. Linker je přednostně připraven z aminokyselin vzájemně spojených peptidovými vazbami. A tak je ve výhodných provedeních linker tvořen z 1 až 30 aminokyselin spojených peptidovými vazbami, přičemž aminokyseliny jsou vybrány z 20 přirozeně se vyskytujících aminokyselin. Některé z těchto aminokyselin mohou být glykosylovány tak, jak je odborníkovi v oboru dobře známo. Ve výhodnějším provedení je 1 až 20 aminokyselin vybráno z glycinu, alaninu, prolinu, asparaginu, glutaminu a lysinu. Ještě výhodněji je linker tvořen z převažujícího množství aminokyselin, které nejsou stéricky bráněny, tj. takovými, jako je glycin a alanin. Z tohoto důvodu jsou preferovanými linkery polyglyciny (konkrétně (Gly)₄, (Gly)₅), poly(Gly-Ala) a polyalaniny.

Dalšími specifickými příklady linkerů jsou:

(Gly) ₃Lys(Gly) (SEQ ID NO: 40);

(Gly) aAsnGlySer(Gly)₂ (SEQ ID NO: 41);

(Gly)₃Cys(Gly)₄ (SEQ ID NO: 42); a GlyProAsnGlyGly (SEQ ID NO: 43).

Pro objasnění výše použité nomenklatury například (Gly)₃Lys(Gly)₄ znamená Gly-Gly-GlyLys-Gly-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO: 40). Kombinace Gly a Ala jsou rovněž preferovány. Zde uvedené linkery jsou příkladné; linkery, spadající do rozsahu tohoto vynálezu, mohou být mnohem delší a mohou obsahovat i jiné zbytky.

-29CZ 304592 B4

Výhodnými linkery jsou aminokyselinové linkery obsahující více než 5 aminokyselin, s vhodnými linkery majícími až přibližně 500 aminokyselin vybraných z glycinu, alaninu, prolinu, asparaginu, glutaminu, lysinu, threoninu, šeřinu nebo aspartátu. Linkery z přibližně 20 až 50 aminokyselin jsou nejvýhodnější. Jednou skupinou linkerů jsou linkery vzorce

GSGSATGGSGSTASSGSGSATxV (SEQ ID NO: 193)

GSGSATGGSGSTASSGSGSATx¹x²GSGSATGGSGSTASSGSGSATx³x⁴ (SEQ ID NO: 194), kde x¹ a x³ jsou každý nezávisle bazické nebo hydrofobní zbytky a x² a x⁴ jsou každý nezávisle hydrofobní zbytky.

Specifickými výhodnými linkery jsou:

GSGSATGGSGSTASSGSGSATHM (SEQ ID NO: 59)

GSGSATGGSGSTASSGSGSATGM (SEQ ID NO: 190)

GSGSATGGSGSTASSGSGSATGS (SEQ ID NO: 191), a

GSGSATGGSGSTASSGSGSATHMGSGSATGGSGSTASSGSGSATHM (SEQ ID NO: 192).

Nepeptidové linkery jsou rovněž možné. Tak například, mohou být použity alkylové linkery, jako je -NH-(CH2)_s-C(O)-, kde s = 2-20. Tyto alkylové linkery mohou být dále substituovány jakoukoliv stéricky nebránící skupinou, jakou je nižší alkyl (například Ci-C₆), nižší acyl, halogen (například Cl, Br), CN, NH₂, fenyl a podobně. Příkladným nepeptidovým linkerem je PEG linker vzorce VII

O kde n je takové, že linker má molekulovou hmotnost od 100 do 5000 kD, výhodně 100 až 500 kD. Peptidové linkery mohou být pozměněny tak, že tvoří deriváty stejným způsobem, jak bylo popsáno výše.

Deriváty. Původci rovněž zamýšlejí derivatizaci peptidového podílu a/nebo podílu vehikula sloučenin podle vynálezu. Takovéto deriváty mohou u sloučenin zlepšovat rozpustnost, absorpci, biologický poločas apod. Části derivátů mohou alternativně eliminovat nebo zmírňovat nežádoucí vedlejší účinky sloučenin apod. Příkladné deriváty zahrnují sloučeniny, ve kterých:

1. Sloučenina nebo její část je cyklická. Tak například, peptidový podíl může být modifikován tak, že obsahuje dva nebo více zbytků Cys (například v linkeru), které mohou cyklizovat tvorbou disulfidového můstku.

2. Sloučenina je příčně vázaná nebo je upravena tak, že je schopna příčné vazby mezi molekulami. Tak například, peptidový podíl může být modifikován tak, že obsahuje zbytek Cys,

-30CZ 304592 B4 aje proto schopen vytvářet intermolekulámí disulfidové vazby s podobnou molekulou. Sloučenina může být též příčně propojena prostřednictvím C-konce, tak jak je znázorněno v molekule zobrazené níže.

Vzorec VIII

NH

O

Ve vzorci VIII každý z V¹ může typicky znamenat jeden řetězec domény Fc.

3. Jedna z peptidových [-C(O)NR-] vazeb (můstků) je nahrazena nepeptidovou vazbou. Příkladnými nepeptidovými vazbami jsou -CH₂-karbamát [-CH₂-OC(O)NR-], fosfonát, -CH₂-sulfonamid[-CH₂-S(O)₂NR-], močovina [-NHC(O)NH-], -CH₂-sekundámí amin a alkylovaný peptid [-C(O)NR⁶-, kde R⁶ je nižší alkyl].

N-konec je derivatizován. Typicky může být N-konec acylován nebo modifikován na substituovaný amin. Příkladné N-koncové skupiny derivátů zahrnují -NRR¹ (jiné než -NH₂),

-NRC(O)R’, -NRC(O)OR', -NRS(O)₂R^], -NHCÍOjNHR¹, sukcinimid, nebo benzyloxykarbonyl-NH-(CBZ-NH-), kde R a R¹ jsou každý nezávisle vodík nebo nižší alkyl a kde kruh fenylu může být substituován s 1 až 3 substituenty vybranými ze skupiny sestávající z C1-C4 alkylu, C1-C4 alkoxyskupiny, chloru a bromu.

5. Volný C-konec je derivatizován. Typicky je C-konec esterifikován nebo amidován. Příkladné C-koncové skupiny derivátů zahrnují například -C(O)R², kde R² je nižší alkyloxy, nebo -NR³R⁴, kde R³ a R⁴ jsou nezávisle vodík nebo Ci-C₈ alkyl (výhodně C1-C4 alkyl).

6. Disulfidový můstek je nahrazen jinou, výhodně stabilnější příčně vazebnou skupinou (například alkylenem). Viz, například Bhathnagar et al. (1996), 1 Med. Chem. 39: 3814-9; Alberts et al. (1993) Thirteenth Am. Pep. Symp., 357-9.

7. Jeden nebo více aminokyselinových zbytků je modifikováno. Jsou známy různé derivatizující agens, které specificky reagují s vybranými bočními řetězci terminálních zbytků tak, jak je detailně popsáno níže.

Lysiny love zbytky a aminoterminální zbytky mohou reagovat s anhydridy kyseliny jantarové nebo jiné karboxylové kyseliny, které mění náboj lysinylových zbytků. Jiné vhodné reagencie pro derivatizaci zbytků obsahujících alfa-amino-skupiny zahrnují imidoesteiy, jako je methylpikolinimidát; pyridoxal fosfát; pyridoxal; chlorborhydrid; trinitrobenzensulfonová kyselina; Omethylisomočovina; 2,4-pentandion; a transaminázou katalyzovaná reakce s glyoxylátem.

Arginylové zbytky mohou být modifikovány reakcí s jakoukoliv nebo s kombinací z řady konvenčních reagencií, zahrnujících fenylglyoxal, 2,3-butandion, 1,2-cyklohexandion a ninhydrin. Derivatizace arginylových zbytků vyžaduje, aby reakce byla prováděna za alkalických podmínek vzhledem k vysoké hodnotě pKa guanidinové funkční skupiny. Kromě toho mohou tyto reagencie reagovat se skupinami lysinu, stejně jako s argininovými epsilon-aminoskupinami.

Specifické modifikace tyrosylových zbytků byly intenzivně studovány s obzvláštním zájmem na zavedení spektrálních značek do tyrosylových zbytků reakcí s aromatickými diazoniovými sloučeninami nebo s tetranitromethanem. Nejběžněji jsou používány N-acetylimidizol atetranitromethan pro tvorbu O-acetyl tyrosylových typů derivátů a 3-nitro derivátů, v uvedeném pořadí.

-31 CZ 304592 B4

Karboxylové skupiny bočních řetězců (aspartylu nebo glutamylu) mohou být selektivně modifikovány reakcí s karbodiimidy (R'-N=C=N-R'), jako je l-cyklohexyl-3-(2-morfolinyl-(4ethyljkarbodiimid, nebo l-ethyl-3-(4-azonia-4,4-dimethylpentyl) karbodiimid. Kromě toho mohou být aspartylové a glutamylové zbytky konvertovány na asparaginylové a glutaminylové zbytky reakcí s amoniovými ionty.

Glutaminylové a asparaginylové zbytky mohou být deamidovány na odpovídající glutamylové a aspartylové zbytky. Jinak řečeno, tyto zbytky jsou deamidovány za mírně kyselých podmínek. Každá z forem těchto zbytků spadá do rozsahu tohoto vynálezu.

Cysteiny lově zbytky mohou být nahrazeny aminokyselinovými zbytky nebo jinými sloučeninami buďto pro eliminaci disulfidové vazby, nebo naopak, pro stabilizaci příčné vazby. Viz, například Bhatnagar et al. (1996), J. Med. Chem. 39: 3814-9.

Derivatizace s bifunkčními činidly je vhodná pro příčné připojení peptidů nebo jejich funkčních derivátů k ve vodě nerozpustným nosičům, nebo jiným makromolekulámím vehikulům. Obecně používaná agens vytvářející příčné vazby zahrnují například l,l-bis(diazoacetyl)-2-fenylethan, glutaraldehyd, N-hydroxysukcinimidové estery, například estery se 4-azidosalicylovou kyselinou, homobifunkční imidoestery, zahrnující disukcinimidylové estery, jako je 3,3'-dithiocis(sukcinimidylpropionát), a bifunkční maleimidy, jako je bis-N-maleimido-l,8-oktan. Derivatizační agens, jako je methyl-3-[(p-azidofenyl)dithio]propioimidát, poskytují fotoaktivovatelné meziprodukty, které jsou schopny tvořit příčné vazby v přítomnosti světla. Jinak řečeno, reaktivní ve vodě nerozpustné materiály, jako jsou kyanogenní bromidem-aktivované uhlovodany a reaktivní substráty popsané v patentech US 3 969 287; US 3 691 016; US 4 195 128; US 4 247 642; US 4 229 537 a US 4 330 440, jsou zavedeny pro imobilizaci proteinů.

Uhlovodanové (oligosacharidové) skupiny mohou být vhodné připojeny k místům, o nichž je známo, že jsou v proteinech glykosylačními místy.

Obecně, O-vázané oligosacharidy jsou připojeny k serinovým (Ser) nebo threoninovým (Thr) zbytkům, zatímco N-vázané oligosacharidy jsou připojeny k asparaginovým (Asn) zbytkům, jestliže jsou součástí sekvence Asn-X-Ser/Thr, kde X může být jakákoliv aminokyselina s výjimkou prolinu. X je výhodně jedna z 19 přirozeně se vyskytujících aminokyselin odlišných od prolinu. Struktury N-vázaných a O-vázaných oligosacharidů a zbytků cukrů, které jsou nalézány v každém typu, jsou odlišné. Jedním typem cukru, který je běžně nalézán u obou, je N-acetylneuraminová kyselina (uváděná jako kyselina sialová). Kyselina sialová je obvykle terminálním zbytkem N-vázaných a O-vázaných oligosacharidů a díky svému negativnímu náboji může přinášet glykosylované sloučenině kyselé vlastnosti. Takové místo (místa) může (mohou) být inkorporována do linkeru sloučenin podle tohoto vynálezu a jsou výhodně glykosylována buňkou během rekombinantní produkce polypeptidových sloučenin (například v savčích buňkách, jako jsou buňky CHO, BHK, COS). Nicméně, takováto místa mohou být dále glykosylována syntetickými nebo semi-syntetickými postupy, známými v oboru.

Další možné modifikace zahrnují hydroxylaci prolinu a lysinu, fosforylaci hydroxylových skupin serylových nebo threonylových zbytků, oxidaci atomu síry v Cys, methylaci alfa-aminoskupin lysinových, argininových a histidinových bočních řetězců. Creighton, Proteins: Structure and Molecule Properties (W. H. Freeman & Co., San Francisco), pp. 79-86 (1983).

Stejně tak mohou být sloučeniny podle vynálezu změněny na úrovni DNA. Sekvence DNA pro jakoukoliv část sloučeniny mohou být změněny na kodóny, které jsou s vybranou hostitelskou buňkou kompatibilnější. Pro E. coli, která je preferovanou hostitelskou buňkou, jsou optimalizované kodóny v oboru známé.

Kodóny mohou být substituovány pro eliminaci restrikčních míst nebo pro zavedení tichých restrikčních míst, což může pozitivně působit v úpravě (processing) DNA ve vybrané hostitelské

-32CZ 304592 B4 buňce. Vehikulum, linker a DNA sekvence pro peptidy mohou být modifikovány tak, aby zahrnovaly jakoukoliv z výše uvedených sekvenčních změn.

Způsoby přípravy

Sloučeniny podle vynálezu mohou být ve velkém připraveny v transformovaných hostitelských buňkách s použitím technik rekombinantních DNA. Za tímto účelem je připravena rekombinantní DNA molekula kódující peptid, jenž je připravován. Způsoby přípravy takových molekul DNA jsou v oboru dobře známé. Tak například, sekvence kódující peptidy mohou být vyříznuty z DNA s použitím vhodných restrikčních enzymů. V jiném provedení může být molekula DNA syntetizována s použitím technik chemické syntézy, jako je například fosforamidátová metoda. Rovněž může být použito kombinace obou těchto technik.

Vynález rovněž zahrnuje vektor schopný exprese peptidů ve vhodném hostiteli. Vektor obsahuje molekulu DNA, která kóduje peptidy operabilně připojené ke vhodným řídícím sekvencím pro expresi. Způsoby působení tohoto operabilního spojení, buďto před, anebo za molekulu DNA inzerovanou do vektoru, jsou dobře známy. Řídicí sekvence pro expresi zahrnují promotory, aktivátory, zesilovače (enhancery), operátory, ribozomální vazebná místa, start signály, stop signály, čepičkové signály (cap signals), polyadenylační signály a jiné signály zúčastněné v řízení transkripce nebo translace.

Výsledný vektor nesoucí molekulu DNA je použit pro transformaci vhodného hostitele. Tato transformace může být prováděna s použitím metod v oboru dobře známých.

K provádění tohoto vynálezu mohou být použity jakékoliv z velkého počtu dostupných a dobře známých hostitelských buněk. Výběr konkrétního hostitele je závislý na řadě v oboru zjištěných faktorů. Tyto faktory zahrnují například kompatibilitu s vybraným expresivním vektorem, toxicitu peptidů kódovaných molekulou DNA, rychlost transformace, snadnost získání peptidů, charakteristiky exprese, biologickou bezpečnost a nákladnost. Je třeba dosáhnout rovnováhy mezi těmito faktory s tím, že je třeba chápat, že ne všichni hostitelé mohou být shodně účinní pro expresi konkrétní sekvence DNA. V rámci těchto obecných pravidel zahrnují vhodní mikrobiální hostitelé bakterie (jako například E. coli sp.), kvasinky (například Saccharomyces sp.) a jiné houby, hmyzí, rostlinné, savčí buňky (včetně lidských) v kultuře, nebo jiné hostitele známé v oboru.

Dále, transformovaný hostitel je kultivován a purifíkován. Hostitelské buňky mohou být kultivovány za konvenčních fermentaěních podmínek tak, že požadované sloučeniny jsou exprimovány. Takové fermentační podmínky jsou v oboru dobře známé. Konečně, peptidy jsou purifikovány z kultury s postupy dobře v oboru známými.

Sloučeniny mohou být rovněž připravovány syntetickými postupy. Tak například, mohou být použity techniky syntézy na pevné fázi. Vhodné techniky jsou v oboru dobře známé a zahrnují ty, které jsou popsány vMerrifield (1973), Chem. Polypeptides, pp. 335-61 (Katsoyannis and Panayotis eds.); Merrifield (1963), J. Am. Chem. Soc. 85: 2149; Davis et al. (1985), Biochem. Intl.. 10: 394-414; Stewart and Young (1969), Solid Phase Peptide Synthesis·, Pat. US 3 941 763; Finn et al. (1976), The Proteins (3rd ed.) 2: 105-253; a Erickson et al. (1976), The Proteins (3rd ed.) 2: 257-527. Syntéza na pevné fázi je preferovanou technikou při přípravě jednotlivých peptidů, neboť se jedná o nejúčinnější metodu z hlediska nákladovosti při přípravě malých peptidů.

Sloučeniny, které obsahují derivatizované peptidy, nebo které obsahují nepeptidové skupiny, mohou být syntetizovány dobře známými technikami organické chemie.

Použití sloučenin

Sloučeniny podle tohoto vynálezu mohou být konkrétně užitečné v léčbě autoimunitních onemocnění zprostředkovaných B-buňkami. Konkrétně, sloučeniny podle tohoto vynálezu mohou

-33CZ 304592 B4 být užitečné v léčbě, prevenci, zlepšení, diagnostice nebo prognózy lupus, včetně lupus erythematosus (SLE) a onemocnění a stavů spojených s lupus. Další výhodné indikace zahrnují nádory zprostředkované B-buňkami, včetně B-buněčného lymfomu.

Sloučeniny podle tohoto vynálezu mohou rovněž být použity k léčbě zánětlivých stavů kloubů. Zánětlivé stavy kloubů jsou chronická kloubní onemocnění, která postihují a oslabují v různém stupni miliony lidí na celém světě. Rheumatoidní artritida je onemocnění kloubních spojení, ve kterých chrupavka a kost jsou pomalu narušovány proliferativní, invazivní pojivovou tkání nazývanou pannus, která je odvozena ze synoviální membrány. Onemocnění může zahrnovat periarti10 kulámí struktury, jako jsou burzy, šlachová pouzdra, stejně jako extraartikulámí tkáně, jako je subkutis, kardiovaskulární systém, plíce, slezina, lymfatické uzliny, kosterní svaly, nervový systém, (centrální a periferní) a oči (Silberberg (1985), Anderson'?, Pathology, Kissane (ed.), 11: 1828). Osteoartritida je běžné kloubní onemocnění charakteristické degenerativními změnami v artikulámí chrupavce a reaktivní proliferaci kosti a chrupavky kolem kloubu. Osteoartritida je buňkami zprostředkovaný aktivní proces, který může být výsledkem nevhodné odpovědi chondrocytů na katabolické a anabolické stimuly. Změny v některých molekulách matrix artikulámí chrupavky se údajně objevují u časné osteoartritidy (Thonar et al. (1993), Rheumatic disease clinics of North America, Moskowitz (ed.), 19: 635-657 a Shinmei et al. (1992), Arthritis Rheum., 35: 1304—1308). Předpokládá se, že TALL-1, TALL-1R ajejich modulátory jsou vhodné pro léčbu těchto a souvisejících stavů.

Sloučeniny podle tohoto vynálezu mohou být rovněž užitečné v léčbě řady dalších onemocnění a poruch, zahrnujících:

· akutní pankreatitidu;

• ALS;

• Alzheimerovu chorobu;

• astma;

• aterosklerózu;

· autoimunitní hemolytickou anemii;

• rakovinu, zejména rakovinu týkající se B buněk;

• kachexii/anorexii;

• chronický únavový syndrom;

• cirhózu (například primární biliámí cirhózu);

· diabetes (například inzulínová diabetes);

• horečku;

• glomerulonefritidu, včetně IgG glomerulonefritidy a primární glomerulonefritidy;

• Goodpasturův syndrom;

• Guillainův-Barrého syndrom;

· transplantát versus onemocnění příjemce;

• Hashimotovu tyreoiditidu;

• hemorhagický šok;

• hyperalgezii;

• zánětlivé onemocnění střev;

-34CZ 304592 B4 • zánětlivé stavy kloubu, včetně osteoartritidy, psoriasové artritidy a rheumatoidní artritidy;

• zánětlivé stavy rezultující z námahy, vymknutí, poškození chrupavky, traumatu, ortopedické operace, infekce a průběhu jiných nemocí;

• inzulin-dependentní diabetes mellitus;

• ischemické poškození včetně cerebrální ischemie (například poškození mozku jako výsledek traumatu, epilepsie, hemoragie, mrtvice, z nichž každý může vést k neurodegeneraci);

• poruchy učení;

• plicní choroby (například ARDS);

• mnohočetný myelom;

• roztroušenou sklerózu;

• myastenii gravis;

• myelogenní (například AML a CML) a jiné leukemie;

• myopatie (například svalový proteinový metabolismus zejména při sepsi);

• neurotoxicitu (například takovou, jako indikuje HIV);

• osteoporózu;

• bolest;

• Parkinsonovu chorobu • Pemphigus;

• polymyozitidu/dermatomyozitidu;

• zápal plic, včetně autoimunitního zápalu plic;

• předčasný porod;

• psoriázu;

• Reiterovu chorobu;

• reperfuzní poškození;

• septický šok;

• vedlejší účinky radiační terapie;

• Sjogrenův syndrom;

• poruchy spánku;

• onemocnění čelistního kloubu;

• trombocytopenii, včetně idiopatické trombocytopenie a autoimunitní neonatální trombocytopenie;

• nádorové metastáze;

• uveitidu; a • vaskulitidu.

Sloučeniny podle tohoto vynálezu mohou být podávány samotné, nebo v kombinaci s terapeuticky účinným množstvím jiných léčiv, zahrnujících analgetika, antirevmatická léčiva modifikující onemocnění (disease-modifying anti-rheumatic drugs, DMARDs), nesteroidní protizánětlivá

-35CZ 304592 B4 léčiva (non-steroidal anti-inflammatory drugs, NSAIDs) a jakékoliv modulátory imunity a zánětů. Proto mohou sloučeniny podle tohoto vynálezu být podávány s:

• Modulátory jiných členů z rodiny TNF/TNF receptorů, včetně antagonistů TNF, jako je etanercept (Enbrel™), s TNF-RI (rozpustný TNF-alfa receptor I), onercept (TNF vazebný protein1), D2E7 a Remicade™.

• modulátory faktoru nervového růstu (NGF modulators);

• IL-1 inhibitory, zahrnující IL-lra molekuly (antagonista receptoru pro IL-1) jako je anakinra, a nedávno objevené „IL-lra-like“ molekuly, jako jsou IL-lHyl a IL-lHy2; IL-1 „trap“ molekuly, jak jsou popsány v pat US 5 844 099, vydaném 1. prosince 1998; IL-1 protilátky; rozpustný receptor IL-1 a podobně.

• IL-6 inhibitory (například protilátky proti IL—6).

• IL-8 inhibitory (například protilátky proti IL—8).

• IL-18 inhibitory (například IL-18 vazebný protein, solubilizovaný IL-18 receptor, nebo IL18 protilátky).

• Modulátory interleukin-1-konvertuj ícího enzymu (ICE).

• Insulinu-podobnými růstovými faktory (insulin-like growth factors IGF-1 a IGF-2) ajejich modulátory.

• Transformujícím růstovým faktorem-β (TGF-β), členy rodiny TGF-β a modulátory TGFβ· • Fibroblastovými růstovými faktory FGF-1 až FGF-10 a modulátory FGF.

• Osteoprotegrinem (OPG), analogy OPG, osteoprotektivními látkami a protilátkami proti OPG-ligandu (OPG-L).

• kostními anaboliky, jako je parathyroidní hormon (PTH), fragmenty PTH a molekulami inkorporujícími fragmenty PTH (například PTH (1—34)Fc).

• antagonisty PAF.

• Keratinocytovým růstovým faktorem (KGF), molekulami příbuznými s KGF (například KGF-2) a modulátory KGF.

• inhibitory COX-2, jako je Celebrex™ a Vioxx™.

• Analogy prostaglandinu (například E řady prostaglandinů).

• Modulátory matrixových metaloproteináz (MMP).

• Modulátory syntázy oxidů dusíku (nitric oxide synthase, NOS), včetně modulátorů indukovatelné NOS.

• Modulátory glukokortikoidního receptoru.

-36CZ 304592 B4 • Modulátory glutamátového receptoru.

• Modulátory hladin lipopolysacharidů (LPS).

• Protirakovinnými látkami, zahrnujícími inhibitory onkogenů (například fos, jun) a interferony.

• Noradrenalinem a jeho modulátory a mimetiky.

Farmaceutické kompozice

Obecně. Předkládaný vynález rovněž poskytuje způsoby použití farmaceutických kompozic sloučenin podle vynálezu. Takové farmaceutické kompozice mohou být ve formě pro injekční, orální, pulmonální, nasální, transdermální nebo jinou formu podání. Obecně, vynález zahrnuje farmaceutické kompozice obsahující účinné množství sloučeniny podle vynálezu společně s farmaceuticky přijatelnými ředidly, konzervačními látkami, rozpouštědly, emulzifikátory, adjuvans/nebo nosiči. Takové kompozice obsahují ředidla s různým obsahem pufru (např. Tris-HCl, acetát, fosfát), pH a iontovou silou; aditiva, jako jsou detergenty a rozpouštědla (například Tween 80, Polysorbate 80), antioxidanty (například kyselinu askorbovou, metabisulfit sodný), konzervační látky (například Thimersol, benzylalkohol) a plnidla (například laktózu, mannitol); zapracování materiálu do zvláštních přípravků z polymemích sloučenin, jako je kyselina polymléčná, kyselina polyglykolová, atd., nebo do liposomů. Rovněž může být použita kyselina hyaluronová, což může mít účinek na podporu udržovaného přetrvávání v cirkulaci. Takové kompozice mohou ovlivňovat fyzikální stav, stabilitu, rychlost uvolňování in vivo a rychlost in vivo clearance proteinů a derivátů podle vynálezu. Viz, například Remingtonů Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042) pages 1435-1712, tj. publikace zde zahrnuté formou odkazu v celém svém rozsahu. Kompozice mohou být připraveny v kapalné formě, nebo mohou být jako suchý prášek, jako je lyofilizovaná forma. Rovněž jsou míněny implantovatelné přípravky s postupným uvolňováním, jako jsou transdermální přípravky.

Orální dávkovači formy. Pro použití podle vynálezu jsou zamýšleny orální pevné dávkovači formy, které jsou popsány v Kapitole 89 v publikaci Remingtonů Pharmaceutical Sciences (1990), 18th Ed., Mack Publishing Co. Easton PA 18042, která je zde zahrnuta formou odkazu v celém svém rozsahu. Pevné dávkovači formy zahrnují tablety, kapsle, pilulky, pastilky, tabletky, zdravotní bonbony nebo pelety. Pro přípravu kompozic podle vynálezu může rovněž být použita liposomální nebo protenoidní enkapsulace (jako například protenoidní mikrokuličky popsané v patentu US 4 925 673). Může být použita liposomální enkapsulace a liposomy mohou být derivatizovány s různými polymery (například patent US 5 013 556). Popis možných pevných dávkovačích forem pro terapeutika je uveden v Kapitole 10 publikace Marshall, K., Modem Pharmaceutics (1979), edited by G. S. Bankéř and C. T. Rhodes, která je zde zahrnuta formou odkazu v celém svém rozsahu. Obecně, prostředek bude zahrnovat sloučeninu podle vynálezu, inertní ingredience, které umožňují ochranu před prostředím žaludku a uvolnění biologicky aktivního materiálu ve střevě.

Rovněž jsou specificky zamýšleny orální dávkovači formy výše uvedených sloučenin podle vynálezu. Jestliže je to nezbytné, sloučeniny mohou být chemicky modifikovány tak, aby orální podání bylo účinné. Obecně, uvažovanou chemickou modifikací je připojení alespoň jedné sloučeniny k vlastní molekule sloučeniny podle vynálezu, přičemž tato sloučenina dovoluje (a) inhibici proteolýzy; a (b) vstřebávání do krevního řečiště ze žaludku a střeva. Rovněž je žádoucí zvýšení celkové stability sloučeniny a zvýšení doby cirkulace v těle. Sloučeniny, vhodné jako kovalentně připojená vehikula podle tohoto vynálezu, mohou rovněž být použity k tomuto účelu. Příklady takových sloučenin zahrnují: PEG, kopolymery ethylenglykolu a propylenglykolu, karboxymethylcelulózu, dextran, polyvinylalkohol, polyvinylpyrrolidon a polyprolin. Viz, například Abuchowski and Davis, Soluble Polymer-Enzyme Adducts, Enzymes as Drugs (1981),

-37CZ 304592 B4

Hocenberg and Roberts, eds., Wiley-lnterscience, New York, NY, pp. 367-83; Newmark, et al. (1982), J. Appl. Biochem. 4: 185-9. Dalšími polymery, které mohou být použity, jsou poly-1,3dioxolan a poly-l,3,6-tioxocan. Jak bylo uvedeno, jsou pro farmaceutické použití výhodné sloučeniny PEG.

Pro dávkovači formy k orálnímu podání je rovněž možné použít sůl modifikované alifatické aminokyseliny, jako například N-(8-[2-hydroxybenzoyl]amino) kaprylát sodný (SNAC), jako nosič ke zvýšení absorpce terapeutických sloučenin podle tohoto vynálezu. Klinická účinnost heparinových přípravků používajících SNAC byla prokázána Emisphere Technologies v pokusech označených „Phase II“. Viz patent US 5 792 451, „Oral drug delivery composition and methods“.

Sloučeniny podle tohoto vynálezu mohou být zapracovány do přípravků jako jemné multičástice ve formě granulí nebo pelet o velikosti částic přibližně 1 mm. Úprava materiálu pro podání v kapslích může být také na formu prášku, mírně stlačených válečků nebo dokonce i tablet. Léková forma může být připravena lisováním.

Rovněž mohou být zahrnuty barviva a ochucovadla. Tak například, protein (nebo derivát) může být upraven (jako zapouzdření mikrokuliček v liposomu) a dále může být uveden do kontaktu s poživatelným produktem, jako je chlazený nápoj obsahující barviva a ochucovadla.

Je možné provádět ředění nebo zvětšení objemu sloučeniny podle vynálezu pomocí inertního materiálu. Tato ředidla mohou zahrnovat uhlovodany, konkrétně mannitol, α-laktózu, bezvodou laktózu, celulózu, sacharózu, modifikované dextrany a škrob. Rovněž mohou být jako plnidla použity určité anorganické soli, které zahrnují kalcium trifosfát, uhličitan hořečnatý a chlorid sodný. Některými z komerčně dostupných ředidel jsou Fast-Flo, STA-Rx 1500, Emcompress a Avicell.

Do terapeutických přípravků v pevné dávkovači formě, mohou být začleněny dezintegranty. Materiály použité jako dezintegranty zahrnují, bez omezení, škrob obsahující komerční dezintegrant na bázi škrobu, Explotab. Glykolát sodný škrobu, Amberlit, karboxymethylcelulóza sodná, ultramylopektin, alginát sodný, želatina, pomerančová kůra, kyselá karboxymethylcelulóza, přírodní houba a bentonit mohou být všechny použity. Jinou formou dezintegrantů jsou nerozpustné kationto-výměnné pryskyřice. Práškové gumy mohou být použity jako dezintegranty a pojivá a zahrnují práškové gumy, jako je agar, guma karaya nebo tragant. Kyselina alginová a její sodná sůl jsou rovněž vhodné jako dezintegranty.

Pojivá mohou být použita pro spojení terapeutické látky na formu pevné tablety a zahrnují materiály z přírodních produktů, jako je arabská guma, tragant, škrob a želatina. Jiná pojivá zahrnují methylcelulózu (MC), ethylcelulózu (EC) a karboxymethylcelulózu (CMC). Ke granulaci terapeutik je možné použít jak polyvinylpyrrolidon (PVP), tak hydroxypropylmethylcelulózu (HPMC) v alkoholových roztocích.

Antifřikční agens může být zahrnuto do přípravku k zabránění lepení během postupu přípravy. Lubrikanty mohou být použity jako vrstva mezi terapeutiky a stěnou lisu, a tyto mohou zahrnovat, bez omezení, kyselinu stearovou včetně jejích hořečnatých a vápenatých solí, polytetrafluorethylen (PTFE), tekutý parafin, rostlinné oleje a vosky. Mohou být použity rozpustné lubrikanty, jako je laurylsulfát sodný, laurylsulfát hořečnatý, polyethylenglykoly o různých molekulových hmotnostech, Carbowa 4000 a 6000.

Též mohou být přidány kluzné látky (glidanty), které mohou zlepšovat tekutost během přípravy léku k podpoře přeskupení během lisování. Kluzné látky mohou zahrnovat škrob, mastek, pyrogenní oxid křemičitý (silica) a hydratovaný silikoaluminát.

-38CZ 304592 B4

Pro podporu rozpouštění sloučeniny podle vynálezu ve vodném prostředí může být přidána povrchově aktivní látka jako smáčedlo. Povrchově aktivní látky mohou zahrnovat aniontové detergenty, jako je laurylsulfát sodný, dioktylsulfosukcinát sodný a dioktylsulfonát sodný. Mohou být použity kationtové detergenty, které mohou zahrnovat benzalkonium chlorid nebo benzethonium chlorid. Seznam potenciálních neionogenních detergentů, které mohou být použity v přípravcích jako povrchově aktivní látky, zahrnuje „lauromacrogol 400“, „polyoxyl 40 stearate“, „polyoxyethylene hydrogenated castor oil 10, 50 a 60“, glycerol monostearát, polysorbát 40, 60, 65 a 80, sacharózové estery mastných kyselin, methylcelulózu a karboxymethylcelulózu. Tyto surfaktanty mohou být přítomny v přípravku s proteinem buďto samostatně, nebo jako směs v různém poměru složek.

Do přípravku mohou též rovněž přidána aditiva ke zvýšení příjmu sloučeniny. Aditivy, které mají tuto vlastnost, jsou například mastné kyseliny, kyselina olejová, kyselina linolová a kyselina linolenová. Mohou být žádoucí přípravky s řízeným uvolňováním. Sloučenina podle tohoto vynálezu může být zapracována do inertní matrix, která dovoluje uvolňování buďto difúzí, nebo mechanismem vyluhování; například do gumy. Pomalu se degradující materiály mohou rovněž být zahrnuty v přípravku, například algináty, polysacharidy. Jinou formu řízeného uvolňování podle tohoto vynálezu je způsob založený na Orosově terapeutickém systému (Alza Corp.), kdy je například léčivo uzavřeno v semipermeabilní membráně, která dovoluje vodě vstupovat a vytlačovat léčivo ven skrz malý otvor působením osmotických účinků. Některé z enterických potahovacích látek mají rovněž účinek odloženého uvolňování.

Pro přípravu mohou být použity další potahovací látky. Tyto zahrnují řadu cukrů, které mohou být aplikovány v potahovacím stroji. Terapeutická látka může být také dána do tablet potažených filmem a materiály použité v tomto případě jsou rozděleny do 2 skupin. První skupinu tvoří neenterické materiály a tato skupina zahrnuje methylcelulózu, ethylcelulózu, hydroxyethylcelulózu, methylhydroxyethylcelulózu, hydroxypropylcelulózu, hydroxypropylmethylcelulózu, sodium karboxymethylcelulózu, providon a polyethylenglykoly. Druhá skupina sestává z enterických materiálů, kterými jsou obvykle estery kyseliny fialové.

Může být použita směs materiálů pro poskytnutí optimálního filmu k potažení. Potažení filmem může být prováděno v potahovacím zařízení nebo ve fluidizačním zařízení nebo kompresním potahováním.

Formy pro pulmonální podání. Rovněž je míněno pulmonální podání proteinu podle vynálezu (nebo jeho derivátů). Protein (nebo jeho derivát) je podáván pulmonálně do plic savce při inhalaci a prostupuje přes plicní epitelovou linii do krevního oběhu. (K tomu další zprávy zahrnují Adjei et al., Pharma. Res. (1990) 7: 565-9; Adjei et al. (1990), Internatl. J. Pharmaceutics 63: 135-44 (leuprolid acetát); Braquet et al. (1989), J. Cardiovasc. Pharmacol. 13 (suppl. 5): s. 143— 146 (endothelin-1); Hubbard et al. (1989), Annals Int. Med. 3: 206-12 (αΐ-antitrypsin); Smith et al. (1989), J. Clin. Invest. 84: 1145-6 (αΐ-proteináza); Oswein etal. (March 1990), „Aerosolization of Proteins“, Proč. Symp. Resp. Drug Delivery II, Keystone, Colorado (rekombinantní lidský růstový hormon); Debs et al. (1988), J. Immunol. 140: 3482-8 (interferon-γ a faktor nekrózy nádorů) a Platz et al., patent US 5 284 656 (faktor stimulující kolonie granulocytů).

Pro praktické použití tohoto vynálezu je uvažováno o velkém množství mechanických zařízení navržených pro pulmonální podání terapeutických produktů, které zahrnují, bez omezení, rozprašovače, odměmé dávkovači inhalátory a práškové inhalátory, které jsou odborníkům v oboru důvěrně známé. Některými z konkrétních příkladů komerčně dostupných zařízení vhodných k provádění tohoto vynálezu jsou rozprašovač Ultravent, vyráběný Mallinckrodt, lne., St. Louis, Missouri; rozprašovač Acom II, vyráběný Marquest Medical Products, Englewood, Colorado; odměmý dávkovači inhalátor Ventolin, vyráběný Glaxo lne., Research Triangle Park, North Carolina; a práškový inhalátor Spinhaler, vyráběný Fisons Corp., Bedford, Massachusetts.

-39CZ 304592 B4

Všechna tato zařízení vyžadují použití přípravků vhodných pro rozprašování sloučeniny podle vynálezu. Typicky každý přípravek je specifický pro typ používaného zařízení a může obsahovat použití vhodného hnacího materiálu, kromě ředidel, adjuvans a/nebo nosičů vhodných pro léčbu.

Sloučenina podle vynálezu by měla být nejvýhodněji připravována ve formě částic s průměrnou velikostí částic menší než 10 μιη (nebo mikronů), nejvýhodněji 0,5 až 5 μπι pro nejúčinnější podávání distálně do plic.

Farmaceuticky přijatelné nosiče zahrnují uhlovodany, jako je trehalóza, mannitol, xylitol, sacharóza, laktóza a sorbitol. Další ingredience pro použití v přípravcích mohou zahrnovat DPPC, DOPE, DSPC a DOPC. Mohou být použity přírodní nebo syntetické povrchově aktivní látky. Může být použit PEG (bez ohledu na jeho použití při derivatizací proteinu nebo analogu). Mohou být použity dextrany, jako je cyklodextran. Mohou být použity žlučové soli a jiné podobné zesilovače. Též mohou být použity celulóza a deriváty celulózy. Mohou být použity aminokyseliny takové, jako při přípravě pufru.

Rovněž je uvažováno použití liposomů, mikrokapsulí nebo mikrokuliček, inkluzních komplexů a jiných typů nosičů.

Přípravky vhodné pro použití v rozprašovači, buď tryskovém, nebo ultrazvukovém, bude typicky obsahovat sloučeninu podle vynálezu rozpouštěnou ve vodě v koncentraci od přibližně 0,1 do 25 mg biologicky aktivního proteinu na ml roztoku. Přípravek může rovněž obsahovat pufr a jednoduchý cukr (například ke stabilizaci proteinu a k regulaci osmotického tlaku). Přípravek pro použití v rozprašovači může rovněž obsahovat povrchově aktivní látku ke snížení nebo k zabránění povrchově indukovaného shlukování proteinu, způsobeného atomizací roztoku při vytváření aerosolu.

Přípravky pro použití v odměřovacím dávkovacím inhalačním zařízení budou obecně obsahovat jemný prášek obsahující sloučeninu podle vynálezu suspendovanou v hnací látce s pomocí povrchově aktivní sloučeniny. Hnací látkou může být běžný materiál používaný k tomuto účelu, jako je chlorfluorovaný uhlovodík, hydrochlorfluorovaný uhlovodík, hydrofluorovaný uhlovodík, nebo uhlovodík, zahrnující trichlorfluormethan, dichlordifluormethan, dichlortetrafluorethanol a 1,1,1,2-tetrafluorethan, nebo jejich kombinace. Vhodné povrchově aktivní látky zahrnují sorbitan trioleát a sojový lecitin. Kyselina olejová může být rovněž vhodná jako povrchově aktivní látka.

Přípravky pro dávkování z práškového inhalačního zařízení budou obsahovat jemný suchý prášek obsahující sloučeninu podle vynálezu a mohou rovněž obsahovat plnidlo, jako je laktóza, sorbitol, sacharóza, mannitol, trehalóza, nebo xylitol v množstvích, která umožňují rozptýlení prášku ze zařízení, například v 50 až 90 % hmotnosti přípravku.

Formy pro nasální podání. Rovněž je uvažováno nasální podání sloučeniny podle vynálezu. Nasální podání umožňuje průnik proteinu do krevního řečiště přímo po podání terapeutického produktu do nosu, aniž je nezbytné ukládání produktu v plicích. Přípravky pro nasální podání zahrnují přípravky s dextranem nebo cyklodextranem. Rovněž je zamýšleno podání, při kterém dochází k přenosu i přes jiné mukózní membrány.

Dávkování. Dávkovači režim použitý ve způsobu léčby výše popsaných stavů bude stanoven ošetřujícím lékařem, jenž zváží různé faktory, které modifikují působení léčiv, například věk, stav, hmotnost těla, pohlaví a dietu pacienta, závažnost jakékoliv infekce, dobu podání a další klinické faktory. Obecně, denní režim by měl být v rozsahu od 0,1 do 1000 mikrogramů sloučeniny podle vynálezu na kilogram hmotnosti těla, výhodně 0,1 až 150 mikrogramů na kilogram.

-40CZ 304592 B4

Specifická výhodná provedení

Původci určili výhodné struktury preferovaných peptidů, které jsou uvedeny v tabulce 4 níže. Symbol „A“ může znamenat kterýkoliv z linkerů zde popsaných, nebo může prostě znamenat normální peptidovou vazbu (tj., že není linker přítomen). Z důvodu jasnosti jsou tandemová opakování a linkeiy znázorněny odděleně pomocí pomlček.

Tabulka 4 - Výhodná provedení

Sekvence/struktura	SEQ ID NO:
LPGCKWDLLIKQWVCDPL-A-V1	44
vKa-lpgckwdllikqwvcdpl	45
lpgckwdllikqwvcdpl-a- LPGCKWDLLIKQWVC DPL-Λ-V1	46
v^a-lpgckwdllikqwvcdpl-a- LPGCKWDLLIKQWVCDPL	47
SADCYFDILTKSDVCTSS-A-V1	48
V^A-SADCYFDILTKSDVCTSS	49
SADCYFDILTKS DVTS S-A-SADCY FDILTKS DVTS S -A-V1	50
V^A-SADCYFDILTKSDVTSS-A- SADCYFDILTKSDVTSS	51
FHDCKWDLLTKQWVCHGL-A-V1	52
V1-A-FH’DCKWDLLTKQWVCHGL	53
FHDCKWDLLTKQWVCHGL-A- fhdckwdlltkqwvchgl-A-v1	54
V1-A- FHDCKWDLLTKQWVCHGL-A- FHDCKWDLLTKQWVCHGL	55

„V¹“ je doména Fc, jak byla zde dříve definována. Kromě struktur uvedených v Tabulce 4, původci dále zamýšlejí heterodimery, ve kterých každý z řetězců dimeru Fc je připojen k odlišné peptidové sekvenci; tak například se jedná o ty, v nichž je Fc připojen k odlišné sekvenci vybrané z tabulky 2.

Všechny sloučeniny podle vynálezu mohou být připraveny postupy popsanými v PCT přihlášce zveřejněné pod číslem WO 99/25 044.

Vynález bude dále popsán příklady provedení, které jsou spíše ilustrativní než limitující.

-41 CZ 304592 B4

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Peptidy

Fágový displej peptidů

1. Příprava magnetických kuliček

A. Imobilizace Fc-TALL-1 na magnetických kuličkách

Rekombinantní protein Fc-TALL-1 byl imobilizován na kuličkách Protein A Dynabeads (Dynal) v koncentraci 8 pg Fc-TALL-1 na 100 μΐ zásobních kuliček od výrobce. Kuličky byly přitaženy k jedné straně zkumavky s použitím magnetu a odpipetováním kapaliny, pak byly promyty dvakrát s fosfátem pufrovaným fyziologickým roztokem (phosphate buffer šalině, PBS) a resuspendovány v PBS. Protein Fc-TALL-1 byl přidán k promytým kuličkám ve výše uvedených koncentracích a inkubován za rotace po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti. Kuličky potažené s FcTALL-1 byly poté blokovány přidáním hovězího sérového albuminu (bovine sérum albumin, BSA) na konečnou 1% koncentraci a inkubovány přes noc při 4 °C za rotace. Výsledné kuličky potažené Fc-TALL-1 byly poté dvakrát promyty s PBST (PBS s 0,05 % Tween-20) před tím, než byly podrobeny selekčním postupům.

B. Příprava kuliček pro negativní selekci

Další kuličky byly rovněž připraveny pro negativní selekce. Pro každou z podmínek panningu (třídění) bylo 250 μΐ zásobních kuliček od výrobce podrobeno výše uvedeným postupům (podle části Al) stou výjimkou, že inkubační krok s Fc-TALL-1 byl vynechán. V posledním stupni promývání byly kuličky rozděleny do pěti 50μ1 alikvotů.

2. Selekce fágů vázajících se k TALL-1

A. Celková strategie

Knihovny vláknitých fágů TN8-IX (5xl0⁸ nezávislých transformant) a TN12-I (l,4x 10⁹ nezávislých transformant) Dyax Corp.) bylo použito k selekci fágů vázajících se k TALL-1. Každá z knihoven byla podrobena buďto eluci při pH 2, nebo „kuličkové eluci“ (část 2E). V pokusech s TALL-1 bylo takto provedeno uspořádání čtyř odlišných podmínek panningu (TN8-IX s použitím eluční metody s pH 2, TN8-IX s použitím metody eluce kuliček, TN12-I s použitím eluční metody s pH 2 a TNI2-1 s použitím metody eluce kuliček). V každém z provedení byly provedeny tři cykly selekce.

B. Negativní selekce

Pro každé z provedení podmínek panningu bylo připraveno přibližně 100 ekvivalentů náhodné knihovny (5xl0^u pfu pro TN8-IX a l,4xlOⁿ pfu pro TN12-I) ze zásobního kmene knihovny, které byly zředěny na 300 μΐ s PBST. Po posledním promytí byla odstraněna kapalina z prvního 50μ1 alikvotů kuliček, připravených pro negativní selekci (podle části 1B) a ke kuličkám bylo přidáno 300 μΐ zředěného zásobního kmene knihovny. Výsledná směs byla inkubována po dobu 10 minut při teplotě místnosti za rotace. Fágový supematant byl odstraněn s použitím magnetu a byl přidán ke druhému 50μ1 alikvotů pro další krok negativní selekce. Tímto způsobem bylo provedeno pět stupňů negativní selekce.

-42CZ 304592 B4

C. Selekce s použitím kuliček potažených proteinem Fc-TALL-1

Fágový supematant po posledním kroku negativní selekce (podle části IB) byl přidán ke kuličkám potaženým s Fc-TALL-1 po posledním promývacím kroku (podle části IA). Tato směs byla inkubována za rotace po dobu dvou hodin při teplotě místnosti, což umožňovalo specifické navázání fágů k cílovému proteinu. Po odstranění supematantu byly kuličky sedmkrát promyty s PBST.

D. Eluce navázaných fágů elucí při pH 2.

Po posledním kroku promytí (podle části 2C) byly navázané fágy eluovány z magnetických kuliček přidáním 200 μΐ CBST (50 mM citrát sodný, 150 mM chlorid sodný, 0,05 % Tween-20, pH 2). Po inkubaci po dobu 5 minut při teplotě místnosti byla kapalina obsahující eluované fágy odstraněna a přenesena do jiné zkumavky. Eluční krok byl znovu zopakován přidáním 200 μΐ CBST a inkubací po dobu 5 minut. Kapaliny ze dvou elučních kroků byly spojeny a bylo přidáno 100 μΐ 2M roztoku Tris (pH 8) pro neutralizaci pH. Dále bylo přidáno 500 μΐ roztoku „Min A Salts“ (60 mM K₂HPO₄, 33 mM KH₂PO₄, 7,6 mM (NH₄)SO₄ a 1,7 mM citrát sodný) na konečný objem 1 ml.

E. „Kuličková eluce“

Po konečném promytí byla kapalina odstraněna (podle části 2C) a poté byl ke kuličkám přidán 1 ml roztoku „Min A salts“. Tato směs kuliček byla přidána přímo ke koncentrovanému vzorku bakterií pro infekci (podle částí 3A a 3B).

3. Amplifikace

A. Příprava buněk k výsevu

Čerstvá kultura buněk E. coli (XL-1 Blue MRF') byla pěstována k OD₆₀o = 0,5 v médiu LB obsahujícím 12,5 pg/ml tetracyklinu. Pro každou z podmínek panningu bylo 20 ml této kultury zchlazeno na ledu a centrifugováno.

Bakteriální pelet byl resuspendován v 1 ml roztoku „Min A Salts“.

B. Transdukce

Každí ze směsí z různých elučních postupů (podle části 2D a 2E) byla přidána ke koncentrovanému bakteriálnímu vzorku (podle části 3A) a inkubována při 37 °C po dobu 15 minut. 2 ml média NZCYM media (2XNZCYM, 50 pg/ml ampicilin) byly přidány do každé směsi a následovala inkubace při teplotě místnosti po dobu 15 minut. Výsledný 4ml roztok byl vyset na velké plotny s agarem NZCYM, obsahujícím 50 pg/ml ampicilinu, a plotny byly inkubovány přes noc při 37 °C.

C. Sklizení fágů

Každá ze směsí bakterie/fág, která byla pěstována přes noc na velkých plotnách s agarem NZCYM (podle části 3B) byla seškrábnuta do 35 ml média LB a agarová plotna byla dále promyta s dalšími 35 ml média LB. Výsledná směs bakterie/fág v médiu LB byla centrifugována pro odstranění bakterií v peletu. 50 ml fágového supematantu bylo přeneseno do další zkumavky, bylo přidáno 12,5 ml roztoku PEG (20% PEG 8000, 3,5 M acetát amonný) a následovala inkubace na ledu po dobu 2 hodin k precipitaci fágů. Precipitované fágy byly odstředěny centrifugací a resuspendovány v 6 ml fágového resuspenzního pufru (250 mM NaCl, 100 mM Tris pH 8, 1 mM EDTA). Tento fágový roztok byl dále purifikován odstřeďováním centrifugací k odstraně-43 CZ 304592 B4 ní zbývajících bakterií a druhou precipitací fága přidáním 1,5 ml roztoku PEG. Po kroku centrifugace byl fágový pelet resuspendován ve 400 μΐ PBS. Tento roztok byl podroben konečné centrifugaci k odstranění zbytkového bakteriálního debris. Výsledný fágový preparát byl titrován standardní zkouškou tvorby plaků (Molecular Cloning, Maniatis et al., 3^rd Edition).

4. Další dva cykly selekce a amplifikace.

Ve druhém cyklu byl amplifikovaný fág (10¹⁰ pfu) z prvého cyklu (podle části 3C) použit jako vstupní fág k provedení selekčních a amplifikačních kroků (podle částí 2 a 3). Amplifikovaný fág (10¹⁰ pfu) z druhého cyklu byl střídavě použit jako vstupní fág k provedení třetího cyklu selekce a amplifikace (podle částí 2 a 3). Po elučních krocích (podle částí 2D a 2E) třetího cyklu byla malá frakce eluovaných fágů vyseta tak, jako ve zkoušce tvorby plaků (podle části 3C). Jednotlivé plaky byly odpíchnuty a naneseny do 96jamkových mikrotitračních destiček obsahujících v každé jamce 100 μΐ pufru TE. Tyto základní plotny byly inkubovány při 37 °C v inkubátoru po dobu 1 hodiny tak, aby byla umožněna eluce fágů do pufru TE.

5. Analýza klonů (ELISA fágů a sekvenování)

Klony fágů byly analyzovány zkouškou ELISA fágů a sekvenovacími postupy. Sekvence byly klasifikovány na základě kombinovaných výsledků z těchto dvou zkoušek.

ELISA fágů

Kultura XL-1 Blue MRF' byla pěstována k dosažení OD₆₀₀ 0,5. Alikvot 30 μΐ této kultury bylo přenesen do každé jamky 96jamkové mikrotitrační destičky. 10 μΐ eluovaných fágů (podle části 4) bylo přidáno do každé jamky a ponecháno k infekci bakterií po dobu 15 minut při teplotě místnosti. 130 μΐ média LB obsahujícího 12,5 pg/ml tetracyklinu a 50 pg/ml ampicilinu bylo přidáno do každé jamky. Mikrotitrační destička byla poté inkubována přes noc při 37 °C. Rekombinantní protein TALL-1 (1 pg/ml v PBS) byl ponechán k potažení 96jamkových destiček Maxisorp (NUNC) přes noc při 4 °C. Jako kontrola byl k potažení použit rekombinantní protein Fc-Trail na oddělené destičce Maxisorp ve stejné molámí koncentraci, jako protein TALL-1.

Následující den byly z destiček Maxisorp potažených proteinem odstraněny kapaliny a každá z jamek byla blokována se 300 μΐ 2% roztoku BSA při 37 °C po dobu 1 hodiny. Roztok BSA byl odstraněn a jamky byly třikrát promyty s roztokem PBST. Po posledním promývacím kroku bylo 50 μΐ PBST přidáno do každé jamky destičky Maxisorp potažené proteinem. Každá z 50μ1 kultur pěstovaných přes noc v 96jamkové mikrotitrační destičce byla přenesena do odpovídajících jamek destiček potažených TALL-1 stejně jako do kontrolních destiček potažených Fc-Trail. 100 μΐ směsí ve dvou typech destiček bylo inkubováno po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti. Kapalina byla z destiček Maxisorp odstraněna a jamky byly pětkrát promyty s PBST. Protilátka anti-M13 konjugovaná s HRP (HRP-conjugated anti-M13 antibody, Pharmacia) byla ředěna 1:7500 a 100 μΐ zředěného roztoku bylo přidáno do každé jamky destiček Maxisorp pro 1 hodinovou inkubaci při teplotě místnosti. Kapalina byla odstraněna a jamky byly promyty sedmkrát sPBST. Do každé jamky bylo přidáno 100 μΐ tetramethylbenzidinového (TMB) substrátu (Sigma) pro vyvinutí barevné reakce a reakce byla zastavena s 50 μΐ 5N roztoku NH₂SO₄. OD₄₅₀ byla odečtena na čtečce ploten (Molecular Devices).

B. Sekvenování fágových klonů.

Pro každý fágový klon byl připraven sekvenační templát metodou PCR. Následující oligonukleotidový pár byl použit kamplifikaci přibližně 500nukleotidového fragmentu: primer #1 (5CGGCGCAACTATCGGTATCAAGCTG-3') (SEQ ID NO: 56) a primer #2 (5'-CATGTACCGTAACACTGAGTTTCGTC-3') (SEQ ID NO: 57) Pro každý klon byla připravena následující směs.

-44CZ 304592 B4

Reagencie	objem (μΐ)/zkumav ka
dH2O	26,25
50% glycerol	10
10B PCR pufr (w/o MgCl2)	5
25 mM MgCl2	4
10 mM směs dNTP	1
100 μΜ primer 1	0,25
100 μΜ primer 2	0,25
Taq polymeráza	0,25
Fág v TE (podle části 4)	3
Celkový reakční objem	50

Byl použit termocykler (GeneAmp PCR System 9700, Applied Biosystems) k provádění následujícího pogragu: 94° C po dobu 5 min; [94 °C po dobu 30 s, 55 °C po dobu 30 s, 72 °C po dobu 45 s] x 30 cyklů; 72 °C po dobu 7 min; ochlazení na 4 °C. Produkt PCR byl kontrolován nanesením 5 μΐ každé PCR reakce na 1% agarózový gel. Produkt PCR ve zbývajících 45 μΐ z každé reakce byl přečištěn s použitím soupravy QIAquick Multiwell PCR Purification kit (Qiagen), podle doporučení výrobce. Výsledný produkt byl poté sekvenován s použitím ABI 377 sekvenátoru (Perkin-Elmer podle výrobcem doporučeného protokolu).

6. Klasifikace sekvencí a stanovení konsensus sekvence

A. Klasifikace sekvencí (Sequence ranking)

Peptidové sekvence, které byly translatovány z různých nukleotidových sekvencí (podle části 5B), byly korelovány s údaji ELISA. Klony, které vykazovaly vysoké OD450 na jamkách potažených TALL-1 a nízké OD₄₅₀ na jamkách potažených Fc-Trail, byly považovány za významnější. Sekvence, které se objevují mnohonásobně, byly rovněž považovány za důležité. Kandidátské sekvence byly vybrány na základě těchto kriterií pro další analýzu peptidů nebo peptibodies. Pět a devět kandidátských peptidových sekvencí byly vybrány z knihoven TN8-IX a TNI2-1, v uvedeném pořadí.

B. Stanovení konsensus sekvence

Většina sekvencí selektovaných z knihovny TNI2-1 obsahovala zcela konzervativní motiv DBL. Stejně tak byl tento motiv rovněž pozorován v sekvencích selektovaných z knihovny TN8-IB. Jiný motiv, PFPWE (SEQ ID NO: 110) byl rovněž pozorován v sekvencích získaných z knihoven TN8-IB library.

Konsensus peptid, FHDCKWDLLTKQ WVCHGL (SEQ ID NO: 58), byl navržen na základě motivu DBL. Vzhledem ktomu, že peptidy odvozené z knihovny TNI 2-1 byly nej aktivnější, byly sekvence nej lepších 26 peptidových sekvencí seřazeny (alignment) na základě výše uvedených klasifikačních kritérií (podle části 5A) s motivem DBL 26. Podtržená ,jaderná aminokyselinová sekvence“ byla získána stanovením aminokyselin, které se nejčastěji vyskytují v každé pozici. Dva cysteiny přiléhající k jaderným sekvencím byly v knihovně TN12-I fixovanými aminokyselinami. Zbytek aminokyselinové sekvence v konsensus peptidů je odvozen z jednoho z kandidátských peptidů, TALL-1-12-10 (tabulka 2, SEQ ID NO: 37). Peptid a peptibody, které byly odvozeny z této konsensus sekvence, byly nejúěinnější ve zkoušce proliferace B buněk.

-45CZ 304592 B4

Příklad 2

Peptibodies

Byla zkonstruována sada dvanácti TALL-1 inhibitomích peptibodies (tabulka 5), ve kterých monomer každého z peptidů byl fúzován ve čtecím rámci s Fc oblastí lidského IgGl. Každý TALL-1 inhibitomí peptibody byl zkonstruován teplotní hybridizaci (annealing) párů oligonukleotidů zobrazených v tabulce 6 pro generování duplexu kódujícího peptid a linker složený z 5 glycinových zbytků a jednoho valinového zbytku, jako fragment Ndel až Sall. Tyto duplexní molekuly byly ligovány do vektoru (pAMG21-RANK-Fc, zde popsaného) obsahujícího lidský gen Fc, rovněž rozštěpeného s Ndel a Sall. Výsledné ligační směsi byly transformovány elektroporací do buněk kmene E. coli 2596 (GM221, zde popsaný). Klony byly screenovány na schopnost produkovat rekombinantní proteinový produkt a na to, zda mají genovou fúzi se správnou nukleotidovou sekvencí. Pro každý z peptibodies byl vyselektován jeden takový klon. Nukleotidové a aminokyselinové sekvence fúzních proteinů jsou uvedeny na Obrázcích 4A až 4F.

Tabulka 5. Peptidové sekvence a oligonukleotidy použité pro generování TALL-1 inhibitomích peptibodies.

Peptibody	Peptibody SEQ ID NO	Sekvence peptidu	Sense oligo- nukleotid	Antisense oligo- nukleotid
TALL-l-8-l-a	29	PGTCFPFPWECTHA	2517-24	2517-25
TALL-l-8-2-a	30	WGACWPFPWECFKE	2517-26	2517-27
TALL-l-8-4-a	•31	VPFCDLLTKHCFEA	2517-28	2517-29
TALL-l-12-4-a	32	GSRCKYKWDVLTKQCFHH	2517-30	2517-31
TALL-l-12-3-a	33	LPGCKWDLLIKQWVCDPL	2517-32	2517-33
TALL-l-12-5-a	34	SADCYFDILTKSDVCTSS	2517-34	2517-35
TALL-l-12-8-a	35	SDDCMYDQLTRMFICSNL	2517-36	2517-37
TALL-l-12-9-a	36	DLNCKYDELTYKEWCQFN	2521-92	2521-93
TALL-l-12-10-a	37	FHDCKYDLLTRQMVCHGL	2521-94	2521-95
TALL-l-12-ll-a	38	RNHCFWDHLLKQDICPSP	2521-96	2521-97
TALL-1-12-14-3	39	ANQCWWDSLTKKNVCEFF	2521-98	2521-99
TALL-1- konsensus	58	FHDCKWDLLTKQWVCHGL	2551-48	2551-49

-46CZ 304592 B4

Tabulka 5B - TALL-1 inhibitomí peptibodies.

Peptibody

TALL-1-8TALL-1-82-a

TALL-1-84-a

TALL-1-124-a

TALL-1-123-a

TALL-1-125-a

TALL-1-128-a

Peptibody

SEQ ID NO

111

Peptidová sekvence

112

113

114

115

116

117 mpgtcfpfpw ecthaggggg vdkthtcppc. papellggps

VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVWDVSHE DPEVKFNWYV ĎGVEVHNAKT KPREEQYNST. YRWSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSRDELT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK_

MWGACWPFPW ECFKEGGGGG VDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVWDVSHE DPEVKFNWYV ĎGVEVHNAKT KPREEQYNST YRWSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSRDELT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK_

MVPFCDLLTK HCFEAGGGGG VDKTHTCPPC PAPELLGGPS

VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVWDVSHE DPEVKFNWYV ĎGVEVHNAKT KPREEQYNST YRWSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSRDELT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK_

MGSRCKYKWD VLTKQCFHHG GGGGVDKTHT CPPCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVWD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRWSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR DELTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK_

MLPGCKWDLL IKQWVCDPLG GGGGVDKTHT CPPCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVWD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRWSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR DELTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK_·_

MSADCYFDIL TKSDVCTSSG GGGG VDKTHT CPPCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVWD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRWSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR DELTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK_

MSDDCMYDQL TRMFICSNLG GGGGVDKTHT CPPCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVWD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRWSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR DELTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP

-47CZ 304592 B4

		PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK
TALL-1-129-a	118	MDLNCKYDEL TYKEWCQFNG GGGGVDKTHT CPPCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCWVD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRWSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR DELTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK
TALL-1-1210-a	119	MFHDCKYDLL TRQMVCHGLG GGGGVDKTHT CPPCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCWVD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRWSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR DELTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK
TALL-1-1211-a	120	MRNHCFWDHL LKQDICPSPG GGGGVDKTHT CPPCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCWVD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRWSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR DELTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK
TALL-1-1214-a	121	MANQCWWDSL TKKNVCEFFG GGGGVDKTHT CPPCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCWVD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRWSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR DELTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK
TALL-1 konsensus	122	MFHDCKWDLL TKQWVCHGLG GGGGVDKTHT CPPCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCWVD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRWSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR DELTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK
TALL-1 12- 3 tandemový dimer	123	MLPGCKWDLL IKQWVCDPLG SGSATGGSGS TASSGSGSAT HMLPGCKWDL LIKQWVCDPL GGGGGVDKTH TCPPCPAPEL LGGPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCWV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QYNSTYRWS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR EPQVYTLPPS RDELTKNQVS LTCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVWHEALHN HYTQKSLSLS PGK
TALL-1 konsensus tandemová dfmer	124	MFHDCKWDLL TKQWVCHGLG SGSATGGSGS TASSGSGSAT HMFHDCKWDL LTKQWVCHGL GGGGGVDKTH TCPPCPAPEL LGGPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCWV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QYNSTYRWS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR EPQVYTLPPS RDELTKNQVS LTCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS PGK

-48 CZ 304592 B4

Tabulka 6 - Sekvence oligonukleotidů použité při konstrukci peptibody.

Oligo- nukleotid ID číslo	SEQ ID NO	Sekvence
2517-24	71	TAT GCC GGG TAC TTG TTT CCC GTT CCC GTG GGA ATG CAC TCA CGC TGG TGG AGG CGG TGG GG
2517-25	72	TCG ACC CCA CCG CCT CCT GGA GCG TGA GTG CAT TCC CAC GGG AAG CCG AAA CAA GTA CCC GGC A
2517-25	73	TAT GTG GGG TGC TTG TTG GCC GTT CCC GTG GGA ATG TTT CAA AGA AGG TGG AGG CGG TGG GG
2517-27	74	TCG ACC CCA CCG CCT CCA CCT TCT TTG AAA CAT TCC CACGGG AAC GGC CAA CAAGCA CCC CAC A
2517-28	75	TAT GGT TCC GTT CTG TGA CCT GCT GAC TAA ACA CTG TTT CGA AGC TGG TGG AGG CGG TGG GG
2517-29	76	TCG ACC CCA CCG CCT CCA CCA GCT TCG AAA CAG TGT TTA GTC AGC AGG TCA CAGAAC GGA ACC A
2517-30	77	TAT GGG TTC TCG TTG TAA ATA CAA ATG GGA CGT TCT GAC TAA ACA GTG TTT CCA CCA CGG TGG AGG CGG TGG GG
2517-31	78	TCG ACC CCA CCG CCT CCA CCG TGG TGG AAA CAC TGT TTA GTC AGA ACG TCC CAT TTG TAT TTA CAA CGA GAA CCC A
2517-32	79	TAT GCT GCC GGG TTG TAA ATG GGA CCT GCT GAT CAA ACA GTG GGT TTG TGA CCC GCT GGG TGG AGG CGG TGG GG
2517-33	80	TCG ACC CCA CCG CCT CCA CCC AGC GGG TCA CAA ACC CAC TGT TTG ATC AGC AGG TCC CAT TTA CAA CCC GGC AGC A
2517-34	81	TAT GTC TGC TGA CTG TTA CTT CGA CAT CCT GAC TAA ATC TGA CGT TTG TAC TTC TTC TGG TGG AGG CGG TGG GG
2517-35	B2	TCG ACC CCA CCG CCT CCA CCA GAA GAA GTA CAA ACG TCA GAT TTA GTC AGG ATG TCG AAG TAA CAG TCA GCA GAC A
2517-36	83	TAT GTC TGA CGA CTG TAT GTA CGA CCA GCT GAC TCG TAT GTT CAT CTG TTC TAA CCT GGG TGG AGG CGG TGG GG
2517-37	84	TCG ACC CCA CCG CCT CCA CCC AGG TTA GAA CAG ATG AAC ATA CGA GTC AGC TGG TCG TAC ATA CAG TCG TCA GAC A
2521-92	85	TAT GGA CCT GAA CTG TAA ATA CGA CGA ACT GAC TTA CAA AGA ATG GTG TCA GTT CAA CGG TGG AGG CGG TGG GG
25221-93	86	TCG ACC CCA CCG CCT CCA CCG TTG AAC TGA CAC CAT TCT TTG TAA GTC AGTTCG TCG TAT TTA CAG TTC AGG TCC A
2521-94	87	TAT GTT CCA CGA CTG TAA ATA CGA CCT GCT GAC TCG TCA GAT GGT TTG TCA CGG TCT. GGG TGG AGG CGG TÚG GG
2521-95	88	TCG ACC CCA CCG CCT CCA CCC AGA CCG TGA CAA ACC ATC TGA CGA GTC AGC AGG TCG TAT TTA CAG TCG TGG AAC A
2521-96	89	TAT GCG TAA CCA CTG TTT CTG GGA CCA CCT GCT GAA ACA

-49CZ 304592 B4

		GGA CAT CTG TGC GTC TCC GGG TGG AGG CGG TGG GG
2521-97	90	TCG ACC CCA CCG CCT CCA CCC GGA GAC GGA CAG ATG TCC TGT TTC AGC AGG TGG TCC CAG AAA CAG TGG TTA CGC A
2521-98	91	TAT GGC TAA CCA GTG TTG GTG GGA CTC TCT GCT GAA AAA AAA CGT TTG TGA ATT CTT CGG TGG AGG CGG TGG GG
2521-99	92	TCG ACC CCA CCG CCT CCA CCG AAG AAT TCA CAA ACG TTT TTT TTC AGC AGA GAG TCC CAC CAA CAC TGG TTA GCC A
2551-48	93	TAT GTT CCA CGA CTG CAA ATG GGA CCT GCT GAC CAA ACA GTG GGT TTG CCA CGG TCT GGG TGG AGG CGG TGG GG
2551-49	94	TCG ACC CCA CCG CCT CCA CCC AGA CCG TGG CAA ACC CAC TGT TTG GTC AGC AGG TCC CAT TTG CAG TCG TGG AAC A

Vektor pAMG-21-RANK-Fc.

pAMG21. Expresní plasmid pAMG21 (ATCC přístupové číslo 98113) může být odvozen 5 z expresivního vektoru (firmy Amgen) pCFM1656 (ATCC přístupové číslo 69576), který byl postupně odvozen z expresivního vektorového systému (firmy Amgen), popsaném v patentu

US 4 710 473. Plasmid pCFM1656 může být odvozen z plasmidu pCFM836 (popsaném v patentu US 4 710 473) takto:

ío · destrukcí dvou endogenních restrikčních míst Ndel koncovým zaplněním s enzymem

T4 polymerázou a následnou ligací zarovnaných konců;

• záměnou sekvence DNA mezi jedinečnými restrikčními místy datli a Clal obsahující syntetický promotor P_L podobným fragmentem získaným z pCFM636 (patent US 4 710 473) obsahujícím promotor P_L (viz SEQ ID NO: 85 níže); a • substituováním malé sekvence DNA mezi jedinečnými restrikčními místy Clal a Kpnl za oligonukleotid, který má sekvenci SEQ ID NO: 96.

SEQ ID NO: 95:

AatlI

5’ CTA ATTCCGCTCTCACCTACCAAACAATGCCCCCCTGCAAAAAATA A ATTCATAT3 ’ TGCAGATTAAGGCGAG AGTGGATGGTTTGTTACGGGGGGACGTTTTTTATTTAAGTATA-AAAAAACATACAGATAACCATCTGCGGTGATAAATTATCTCTGGCGGTGTTGACATAAA-TTTTTTGTATGTCTATTGGTAGACGCCACTATTTAATAGAGACCGCCACAACTGTATTT-TACCACTGGCGGTGATACTGAGCACAT 3‘

-ATGGTGACCGCCACTATGACTCGTGTAGC 5'

Clal

SEQ ID NO: 96:

5'CGATTTGATTCTAGAAGGAGGAATAACATATGGTTAACGCGTTGGAATTCGGTAC 3'

3'TAAACTAAGATCTTCCTCCTTATTGTATACCAATTGCGCAACCTTAAGC 5'

Clal Kpnl

Expresivní plasmid pAMG21 může pak být odvozen zpCFM1656 provedením řady místně řízených záměn bází sPCR mutagenezi překrývajících se oligonukleotidů („PCR overlapping oligonucleotide mutagenesis“) a se sekvenčními substitucemi DNA. Počínaje od místa Bglll

-50CZ 304592 B4 (plasmid bp # 180) hned vedle 5' k plasmidovému replikačnímu promotoru Pc_opb a pokračujíc k plasmidovým replikačním genům, jsou záměny párů bází takové, jak jsou uvedeny v tabulce 7 níže.

Tabulka 7 - Záměny párů bází vedoucí k pAMG21

pAMG21 bp #	bp v pCFM1656	bp zaměněný na v pAMG2
# 204	T/A	C/G
#428	A/T	G/C
#509	G/C	A/T
#617	—	inzert dvou G/C b{
#679	G/C	T/A
#980	T/A	C/G
#994	G/C	A/T
#1004	A/T	C/G
#1007	C/G	T/A
#1028	A/T	T/A
#1047	C/G	T/A
#1178	G/C	T/A
#1466	G/C	T/A
#2028	G/C	delece bp
#2187	C/G	T/A
#2480	A/T	T/A
#2499-2502	AGTG	GTCA
	TCAC	CAGT
#2642	TCCGAGC AGGCTCG	delece 7 bp
#3435	G/C	A/T
#3446	G/C	A/T
#3643	A/T	T/A

CZ 304592 B4

Sekvence DNA mezi jedinečnými restrikčními místy Aatll (pozice # 4364 v pCFM1656) a SčkII (pozice #4585 v pCFM1656) je substituována sekvencí DNA uvedenou níže (SEQ ID NO: 97):

[Aatll kohezní konec] 5' GCGTAACGTATGCATGGTCTCC1'pozice # 4 35 8 v pAMG21] 3' TGCACGCATTGCATACGTACCAGAGG-ccatgcgagagtagggaactgccaggcatcaaataaaacgaaaggctcagtcgaaagact-GGTACGCTCTCATCCCTTGACGGTCCGTAGTTTATTTTGCTTTCCGAGTCAGCTTTCTGA-gggcctttcgttttatctgttgtttgtcggtgaacgctctcctgagtaggacaaatccgc-CCCGGAAAGCAAAATAGACAACAAACAGCCACTTGCGAGAGGACTCATCCTGTřTAGGCG-cgggagcggatttgaacgttgcgaagcaacggcccggagggtggcgggcaggacgcccgc-GCCCTCGCCTAAACTTGCAACGCTTCGTTGCCGGGCCTCCCACCGCCCGTCCTGCGGGCG-CATAAACTGCCAGGCATCAAATTAAGCAGAAGGCCATCCTGACGGATGGCCTTŤTTGCGT-GTATTTGACGGTCCGTAGTTTAATTCGTCTTCCGGTAGGACTGCCTACCGGAAAAACGCA-TTCTACAAACTCTTTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGGACGTCGTACTTAAC-aagatgtttgagaaaacaaataaaaagatttatgtaagtttatacctgcagcatgaattg-ttttaaagtatgggcaatcaattgctcctgttaaaattgctttagaaatactttggcagc-AAAATTTCATACCCGTrAGTTAACGAGGACAATTTTAACGAAATCTTTATGAAACCGTCG“ “GGTTTGTTGTATTGAGTTTCATTTGCGCATTGGTTAAATGGAAAGTGACCGTGCGCTTAC-ccaaacaacataactcaaagtaaacgcgtaaccaatttacctttcactggcacgcgaatg-tacagcctaatatttttgaaatatcccaagagctttttccttcgcatgcccacgctaaac-atgtcggattataaaaactttatagggttctcgaaaaaggaagcgtacgggtgcgatttg-ATTCTTTTTCTCTTTTGGTTaaatcgttgtttgatttattatttgctatatttatttttc-taagaaaaagagaaaaccaatttagcaacaaactaaataataaacgátataaataaaaag-gataattatcaactagagaaggaacaattaatggtatgttcatacacgcatgtaaaaata-ctattaatagttgatctcttccttgttaattaccatacaagtatgtgcgtacatttttat-aactatctatatagttgtctttctctgaatgtgcaaaactaagcattccgaagccattat-ttgatagatatatcaacagaaagagacttačacgttttgattcgtaaggcttcggtaata-tagcagtatgaatagggaaactaaacccagtgataagacctgatgatttcgcttctttaa-atcgtcatacttaťccctttgatttgggtcactattctggactactaaagcgaagaaatt-52CZ 304592 B4

-TTACATTTGGAGATTTTTTATTTACAGCATTGTTTTCAAATATATTCCAATTAATCGGTG-aatgtaaacctctaaaAaataaatgtcgtaácaaaagtttatataaggttaattagccac-aatgattggagttagaataatctactataggatcatattttattaaattagcgtcatcat-ttactaacctcaatcttattagatgatatcctagtataaaataatttaatcgcagtagta-aatattgcctccattttttagggtaattatccagaattgaaatatcagatttaaccatag. -ttataacggaggtaaaaaatcccattaataggtcttaactttatagtctaaattggtatc-AATGAGGATAAATGATCGCGAGTAAATAATATTCAeAATGTACCATTTTAGTCATATCAG-ttactcctatttactagcgctcatttattataagtgttacatggtaáaatcagtatagtc-ataagcattgattaatatcattattgcttctacaggctttaattttattaattattctgt-tattcgtaactaattatagtaataacgaagatgtccgaaattaaaataattaataagaca-aagtgtcgtcggcatttatgtctttcatacccatctctttatccttacctattgtttgtc-ttcacagcagccgtaaatacagaaagtatgggtagagaaataggaatggataacaaacag-GCAAGTTTTGGGTGTTATATATCATTAAAAeGGTAATAGATTGACATTTGATTCTAATAA-CGTTCAAAACGCACAATATATAGTAATTTTGCCATTATCTAACTGTAAACTAAGATTATT-attggatttttgtcacactattatatcgcttgaaatacaa.ttgtttaacataagtacctg-TAACCTAAAAACAGTGTGATAATATAGCGAACTTTATGTTAACAAATTGTATTCATGGAC-taggatcgtacaggtttacgcaagaaaatggtttgttatagtcgattaatcgatttgatt-atcctagcatgtccaaatgcgttcttttaccaaacaatatcagctaattagctaaactaa-ctagatttgttttaactaattaaaggaggaataacatatggttaacgcgttggaattcga-gatctaaacaaaattgattaatttcctccttattgtataccaattgcgcaaccttaagctSaclI

-gctcactagtgtcgacctgcagggtaccatggaagcttactcgaggatccgcggaaagaa-cgagtgatcacagctggacgtcccatggtaccttcgaatgagctcctaggcgcctttctt-gaagaagaagaagaaagcccgaaaggaagctgagttggctgctgccaccgctgagcaata-cttcttcttcttctttcgggctttccttcgactcaaccgacgacggtggcgactcgttat-actagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttgctgaaaggagg-tgatcgtattggggaaccccggagatttgcccagaactccccaaaaaacgactttcctcc-AACCGCTCTTCACGCTCTTCACGC 3' [SacM kohezni konec] —TTGGCGAGAAGTGCGAGAAGTG 5' [pozice H 5904 v pAMG21]

Během ligace kohezních konců této substituce sekvence DNA jsou vnější místa Aatll a Sacll destruována. V substituované DNA existují jedinečná místa Aatll a SacII.

Gen, kódující lidský RANK fúzovaný kN-konci Fc, byl ligován do pAMG21 jako fragment Ndel až BamHl pro vytvoření kmene (firmy Amgen) #4125. Uvedený konstrukt byl modifikován inzercí kodónu pro valin ve spojení RANK a Fc. Sousedící kodóny pro valin a aspartát vytvářejí jedinečné místo Sall. Toto umožňuje fúzi peptidů na N-konci Fc3 mezi jedinečnými mísy Ndel a Sall. RANK sekvence je deletována po inzerci nového fragmentu Ndel-Sall. Sekvence vektoru ío je uvedena na obrázku 5A až 5M.

GM221 (Amgen #2596). Hostitelským kmenem #2596 (firmy Amgen) je kmen E. coli K-12 odvozený od kmene #393 (firmy Amgen), který je derivátem zE. coli W1485, získaným od E. coli Genetic Stock Center, Yale University, New Haven, Connecticut (CGSC kmen 6159).

Kmen byl modifikován tak, že obsahuje oba teplotně senzitivní lambda represory cI857s7 v rané oblasti ebg a represor lacI^Q v pozdní oblasti ebg (68 minut). Přítomnost těchto dvou represorových genů umožňuje použití tohoto hostitele v řadě systémů exprese, nicméně oba z těchto represorů jsou irelevantní vzhledem k expresi luxP_R. Netransformovaný hostitel nemá rezistenci na antibiotika.

Ribozómové vazebné místo genu cI857s7 bylo modifikováno tak, aby obsahovalo zesílený RBS. Bylo inzerováno do peronu ebg mezi nukleotidovou pozici 1170 a 1411 tak, jak je číslováno

-53CZ 304592 B4 v Genbank accession number M64441Gb_Ba s delecí intervenující sekvence ebg. Sekvence inzertu je znázorněna níže s tím, že malá písmena reprezentují sekvence ebg lemující inzert uvedený níže (SEQ ID NO: 98):

uaiutcgtGCGGCCGCACCATTATCACCGCCAGAGGTAAACTAGTCAACACGCACGGTGTTAGATAT

TTATCCCTTGCGGTGATAGATTGAGCACATCGATTTGATTCTAGAAGGAGGGATAATATATGAG

CACAAAAAAGAAACCATTAACACAAGAGCAGCTTGAGGACGCACGTCGCCTrAAAGCAATTTA

TGAAAAAAAGAAAAATGAACTTGGCTTATCCCAGGAATCTGTCGCAGACAAGATGGGGATGGG

GCAGTCAGGCGTTGGTGCTTTATTTAATGGCATCAATGCATTAAATGCTTATAACGCCGCATTGC

TTACAAAAATTCTCAAAGTTAGCGTTGAAGAATTTAGCCCTTCAATCGCCAGAGAATCTACGAG

ATGTATGAAGCGGTTACTATGCAGCCGTCACTTAGAAGTGAGTATGAGTACCCTGTTTTTTCTCA

TGTTCAGGCAGGGATGTTCTCACCTAAGCTTAGAACCTTTACCAAAGGTGATGCGGAGAGATGG

GTAAGCACAACCAAAAAAGCCAGTGATTCTGCATTCTGGCTTGAGGTTGAAGGTAATTCCATGA.

CCGCACCAACAGGCTCCAAGCCAAGCTTTCCTGACGGAATGTTAATTCTCGTTGACCCTGAGCA ggctgttgágccaggtgatttctgcatagccagacttgggggtoatgagtttaccťtcaagaaa ctgatcagggatagcggtcaggtgtttttacaaccactaaacccacagtačccaatgatcccat gcaatgagagttgttccgttgtggggaaagttatcgctagtcagtggcctgaagagacgtttgg

CTGATAGACTAGTGGATCCACTAGTgutctgccc

Konstrukt byl vnesen do chromozómu s použitím rekombinantního fága nazvaného „MMebgcI857s7enhancedRBS #4“ do F'tet/393. Po rekombinaci a štěpení zůstává v buňce pouze chromozomální inzert popsaný výše. Byl pojmenován F'tet/GM101. F'tet/GM101 byl pak modifikován vnesením lacI^Q konstruktu do operonu ebg mezi nukleotidovou pozici 2493 a 2937 tak, jak je číslováno v Genbank accession number M64441Gb_Ba s delecí intervenující sekvence ebg. Sekvence inzertu je znázorněna níže s tím, že malá písmena reprezentují sekvence ebg lemující inzert uvedený níže (SEQ ID NO: 99):

ggcggiaaccGACGTCCATCGAATGGTGCAAAACCTTTCGCGGTATGGCATGATAGCGCCCGGAAGA

GAGTCAATTCAGGGTGGTGAATGTGAAACCAGTAACCTTATACCATGTCGCAGAGTATGCCGGT

GTCTCTTATCAGACCGTTTCCCGCGTGGTGAACCAGGCCAGCCACGTTTCTGCGAAAACGCGGG

AAAAAGTCGAAGCGGCCATGGCGGAGCTGAATTACATTCCCAACCGCGTGGCACÁACAACTGO

CGGGCAAACAGTCGCTCCTGATTGGCGTTGCCACCTCCAGTCTGGCCCTGCACGCGCCGTCGCA

AATTGTCGCGGCGATTAAATCŤCGCGCCGATCAÁCTGGGTGCCAGCGTGGTGGTGTCGATGGTA

GAACGAAGCGGCGTCGAAGCCTGTAAAGCGGCGGTGCACAATCTTCTCGCGCAACGCGTCAGTG ggctgatcattaactatccgctggatgaccaggatgccattgctgtggaagctgcctgcactaa

TGTTCrGGCGTrATTTCTTGATGTCTCTGACCAGACACCCATCAACAGTATTArrTTCTCCCATGA agacggtacgcgactgggcgtggagcatctggtcgcattgggtcaccagcaaatcgcgctgtta gcgggcccattaagttctgtctcggcgcgtotgcgtctggctggctggcataaatatctcactcg caatcaaattcaoccgatagcggaacoggaaggcgactggagtgccatgtccggttttcaacaa accatccaaatgctgaatgagggcatcgttcxxactgcgatoctggttgccaacgatcagatgg

CGCTGGGCGCAATGCGCCCCATTACCGAGTCCGGCKTGCGCCrTGGTGCGGATATCTCGGTAGT

GCOATACGACGATACCGAAGACAGCrCATGTTATATCCCGCCGTTAACCACCATCAAACAGGAT

TITCOCCrGCTGGCGCAAACCACXrGTCGACCGCTTGCrGCAACTVrCTCAGGGCCÁGGCGGTGA

AGGGCAATCAGCTGTTGCCCGTCTCACTGGTCAAAAGAAAAACCACCCTGGCGCCCAATACGCA

AACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGG

A A AGCGGACAGTAAGGTACCATA GGATCCaggcacagga

Konstrukt byl vnesen do chromozómu s použitím rekombinantního fága nazvaného „AGebgLacIQ#5“ do F'tet/GM101. Po rekombinaci a štěpení zůstává v buňce pouze chromozomální inzert popsaný výše. Byl pojmenován F'tet/GM221. Epizóm F'tet byl z mene odstraněn použitím akridinové oranže v koncentraci 25 pg/ml v LB. Získaný kmen byl identifikován jako citlivý na tetracyklin a byl uložen jako GM221. Exprese v E. coli. Kultury každého z pAMG21-Fc-fúzních konstruktů v E. coli GM221 byly pěstovány při 37 °C v médiu Luria Broth. Indukce exprese genového produktu z promotoru luxPR bylo dosaženo po přidání syntetického autoinduktoru N-(3-oxohexanoyl)-DL-homoserin laktonu ke kultivačnímu médiu na konečnou koncentraci 20 ng/ml. Kultury byly inkubovány při 37 °C po další 3 hodiny. Po 3 hodinách byly bakteriální kultury mikroskopicky vyšetřeny na přítomnost inkluzních tělísek a byly shromážděny centrifugací. Refrakční inkluzní tělíska byla pozorovna v indukovaných kulturách, což naznačuje, že Fc-fúze byly nej pravděpodobněji produkovány v nerozpustné frakci v E. coli. Buněčné pelety byly přímo lyžovány resuspendováním ve vzorkovém pufru podle Laemmliho, obsahujícím

-54CZ 304592 B4

10% β-merkaptoethanol, a byly analyzovány s SDS-PAGE. V každém případě byl na gelu SDS-PAGE pozorován Coomassie-barvený pruh o odpovídající molekulové hmotnosti.

Příklad 3

TALL-1 peptibody inhibuje proliferaci B buněk zprostředkovanou TALL-1

Myší B lymfocyty byly izolovány ze slezin myší C57BL/6 negativní selekcí (MACS CD43 (Ly-48) Microbeads, Miltenyi Biotech, Aubum, CA). Purifikované (10⁵) B buňky byly kultivovány v MEM, 10% tepelně inaktivovaný FCS, 5xl0“⁵ M 2-merkaptoethanol, 100 U/ml penicilín, 100 pg/ml streptomycin) triplicitně v96jamkových tkáňových kultivačních plotnách s plochým dnem s 10 ng/ml proteinu TALL-1 a 2 mg/ml kozích F(ab')2 z anti-myšího IgM (Jackson ImmunoResearch Laboratory, West Grove, Pennsylvania) se stanoveným množstvím TALL-1 peptibody po dobu 4 dnů při 37 °C, 5% CO₂. Proliferace byla měřena příjmem radioaktivního ³[H]thymidinu po 18hodinové inkubační době.

Příklad 4

TALL-1 peptibody blokuje vazbu TALL-1 kjeho receptorům

Reacti-Hel 6x (Pierce) byl předem potažen s lidským AGP3 (rovněž známým jako TALL-1, Khare et al., Proč. Nati. Acad. Sci. 97: 3370-3375, 2000) a blokován s BSA. 100 pM a 40 pM vzorků AGP3 peptibody bylo inkubováno se stanovenými různými koncentracemi lidského AGP3 při teplotě místnosti po dobu 8 hodin před nanesením na kuličky potažené lidským AGP3. Množství peptibody navázaného na kuličky bylo kvantifikováno fluorescenčně (Cy5) značenou kozí anti-lidskou-Fc protilátkou (goat anti-human-Fc antibody, Jackson Immuno Research). Vazebný signál je úměrný koncentraci volného peptibody při vazebné rovnováze. Disociační rovnovážná konstanta (K_D) byla získána z nelineární regrese kompetitivních křivek s použitím „dual-curve one-side homogeneous binding model“ (KinEx™ software). K_D je přibližně 4 pM pro peptibody AGP3 (SEQ ID NO 123), vázajícím se s lidským AGP3 (Obrázek 9).

Ke stanovení, zda tento AGP3 peptibody může neutralizovat vazbu myšího AGP3, stejně jako lidského AGP3, byla použita neutralizační zkouška BIAcore. Všechny pokusy byly prováděny na BLAcore 3000 při teplotě místnosti. Lidský protein TACI-Fc (Xia et al., J. Exp. Med. 192, 137-144, 2000) byl imobilizován kčipu Bl s použitím 10 mM acetátu pH 4,0 na úroveň 2900 RU. Jako kontrola pozadí byl použit slepý vzorek proudu buněk. S použitím pracovního pufru PBS (bez vápníku nebo hořčíku) obsahujícího 0,005% P20 byl 1 nM rekombinantního lidského AGP3 (v pracovním pufru plus, 0,1 mg/ml BSA) inkubován bez a s určeným množstvím peptibody AGP3 (osa x) před jeho nanesením na povrch receptoru. Regenerace byla prováděna s použitím 8 mM glycinu pH 1,5 po dobu 1 minuty, 25 mM 3-[cyklohexylamino]-1-propansulfonová kyselina (CAPS) pH 10,5, 1 M NaCl po dobu 1 minuty. Ke stanovení vazby myšího AGP 3 byl lidský TACÍ značený his (human his-tagged TACÍ) imobilizován na 1000 RU ve výše uvedeném pufru. 5 nM rekombinantního myšího AGP3 (v pracovním pufru plus, 0,1 mg/ml BSA) bylo inkubováno bez a s různými množstvími peptibody AGP3, jak je uvedeno na obrázku 11 (osa x) před nanesením na povrch receptoru. Regenerace byla provedena s 10 mM HC1 pH 2, dvakrát po dobu 30 sekund. Byla stanovena relativní vazba jak lidského, tak myšího AGP3 v přítomnosti oproti (vs) nepřítomnosti peptibody AGP3 (SEQ ID NO: 123) (osa y). Relativní vazební odpověď byla stanovena jako (RU-RU slepého vzorku/RU_o -RU slepého vzorku). Peptibody AGP3 (SEQ ID NO: 123) inhiboval vazbu jak lidského, tak myšího AGP3 kjeho receptoru TACÍ (Obrázky 10A a 1 OB).

Ke zjištění, zda tento peptibody AGP3 blokuje vazbu ke všem třem receptorům (TACÍ, BCMA a BAFFR) byly proteiny TACÍ, BCMA a BAFFR imobilizovány k čipu CM5. S použitím 10 mM

-55CZ 304592 B4 acetátu, pH 4 byl lidský TACI-Fc imobilizován na 6300 RU, lidský BMCA-Fc na 5000 RU a BAFFR-Fc na 6000 RU. 1 nM rekombinantního AGP3 (v pracovním pufru obsahujícím 0,1 mg/ml BSA a 0,1 mg/ml Heparinu) nebo 1 nM rekombinantního proteinu APRÍL (Yu et al., Nat. Immunol., 1: 252-256, 2000) byl inkubován s určeným množstvím peptibody AGP3 před nanesením na každý z receptorových povrchů. Regenerace v pokuse s AGP3 byla provedena s 8 mM glycinu, pH 1,5 po dobu 1 minuty a následně s 25 mM CAPS, pH 10,5, 1M NaCl po dobu 1 minuty. Regenerace v pokuse s APRÍL byla provedena s 8 mM glycinu, pH 2 po dobu 1 minuty a následně s25mM CAPS, pH 10,5, 1 M NaCl po dobu 1 minuty. Byla měřena relativní vazba AGP3 a APRILu. Peptibody AGP3 (SEQ ID NO: 123) blokoval vazbu AGP3 ke všem třem receptorům (Obrázek 11 A). Peptibody AGP3 neměl účinek na vazbu APRILu k receptorům (Obrázek 11B).

Příklad 5

Peptibody AGP3 blokuje proliferaci B buněk zprostředkovanou AGP3

Myší B lymfocyty byly izolovány negativní selekcí ze slezin myší C57BL/6. (MACS CD43 (Ly-48) Microbeads, Miltenyi Biotech, Aubum, CA). Purifikované (10⁵) B buňky byly kultivovány v minimálním základním médiu (minimal essential medium, MEM) 10% tepelně inaktivované fetální hovězím sérem (fetal calf sérum, FCS), 5x10^-5 M 2-merkaptoethanol, 100 U/ml penicilín, 100 pg/ml streptomycin) triplicitně v 96jamkových tkáňových kultivačních plotnách s plochým dnem s 10 ng/ml proteinu AGP3 (TALL-1) a 2 mg/ml kozích F(ab')2 z anti-myšího IgM (Jackson ImmunoResearch Laboratory, West Grove, Pennsylvania) se stanoveným množstvím rekombinantního AGP3 peptibody (SEQ ID NO: 123) po dobu 4 dnů při 37 °C, 5 % CO₂. Proliferace byla měřena příjmem radioaktivního ³[H] thymidinu po 18hodinové inkubační době.

Příklad 6

Peptibody AGP3 a produkce Ig u myši stimulované s AGP3

Myši (Balb/c samičky staré 9 až 14 týdnů o hmotnosti 19 až 21 g) byly získány od Charles River Laboratories, Wilmington, MA. Myši (n = 10) byly intraperitoneálně ošetřeny s 1 mg/kg lidského AGP3 jednou denně po pět následujících dnů a následně s 5 nebo 0,5 mg/kg peptibody AGP3 (SEQ ID NO: 123), nebo s fyziologickým roztokem, nebo s 5 mg/kg lidského Fc. Další myši byly ponechány bez ošetření. Myši byly usmrceny v šestém dnu a byly měřeny sérový IgM a IgA, které byly měřeny metodou ELISA. Stručně řečeno, plotny byly potaženy zachycujícími protilátkami specifickými pro IgM nebo IgA (Southern Biotechnology Associates, Birmingham, AL), blokovány a byly přidány roztoky standardních (IgM od Calbiochem, San Diego, CA a IgA od Southern Biotechnology Associates), nebo testovaných vzorků. Zachycené Ig byly zjišťovány s použitím biotinylovaných protilátek specifických proti IgM nebo IgA (Southern Biotechnology Associates), peroxidázou konjugovanou s neutravidinem (neutravidin-conjugated peroxidase, Pierce, Rockford, IL) a tetramethylbenzidinovým (TMB) peroxidázovým substrátem (KPL, Gaithersburg, MD) určeným pro mikrodestičky. Hodnoty optické hustoty byly kvantifikovány na čtečce ELISA (Thermomax ELISA reader, Molecular Devices, Menlo Park, CA).

Zvýšení sérových hladin IgM a IgA stimulované lidským AGP3 bylo blokováno s 5 mg/kg antiAGP3 peptibody (SEQ ID NO: 123) a nikoliv s 0,5 mg/kg (Obrázky 12A a 12B).

-56CZ 304592 B4

Příklad 7

Peptibody AGP3 snižoval počet slezinných buněk u myši

Myši (shodné, jak je uvedeno výše, n = 7) byly ošetřeny po dobu sedmi následujících dnů s 5 nebo 1,5 nebo 0,5 mg/kg peptibody AGP3 (SEQ ID NO: 123), nebo s fyziologickým roztokem, nebo s 5 mg/kg lidského Fc. Myši byly usmrceny v osmém dnu ke stanovení počtu slezinných B buněk. Sleziny byly odebrány do fyziologického roztoku a jemně rozrušeny manuální homogenizací za poskytnutí buněčné suspenze. Celkový počet buněk byl stanoven na H1E čítači (H1E counter, Technicon, Tarrytown, NY). Procento B buněk bylo odvozeno z imunofluorescenčního dvojího barvení a z průtokové cytometrie s použitím fluorescein isothiokyanát (FITC)-konjugované a fykoerytrin (PE)-konjugované protilátky (Ab) proti CD3 a B220, v uvedeném pořadí (PharMingen, San Diego, CA) a FACScan analyzátoru (FACScan analyser Becton and Dickinson, Mountain View, CA). B buňky byly identifikovány jako CD3-B220+. Ve všech dávkách snižoval AGP3 peptibody (SEQ ID NO: 123) počet slezinných B buněk způsobem závislým na dávce (Obrázky 12A a 12B) (SEQ ID NO: 123).

Tabulka 8

AGP peptibody snižuje u normálních myší počet B buněk

n = 7	dávka (1/den x7)	slezinné B buňky (1 x 10e6)	SD	t test
fyziologický roztok		51,3	9,6
FC	5 mg/kg	45,5	7,1
Peptibody	5 mg/kg	20,1	3,8	l,37856E-05
	1,5 mg/kg	22,6	6,9	5,10194E-05
	0,5 mg/kg	25,8	3,6	0,000111409

Příklad 8

Peptibody AGP3 snižoval intenzitu artritidy na myším modelu CIA

Osm 12 týdnů starých myší DBA/1 (získaných od Jackon Laboratories, Bar Harbor, ME) bylo imunizováno s hovězím kolagenem typu II (bCII) (poskytnutým z University of Utah), emulzifikovaném v kompletním Freundově adjuvans (Difco) intradermálně ke kořeni ocasu. Každá injekce byla 100 μΐ a obsahovala 100 μg bCII. Myši byly opakovaně imunizovány (boosted) 3 týdny po primární imunizaci s bCII emulzifikovaném v nekompletním Freundově adjuvans. Léčba byla započata ode dne opakované imunizace po dobu 4 týdnů. Myši byly vyšetřeny na vznik artritidy. Jak bylo dříve popsáno (Khare et al., J. Immunol. 155: 3653-9, 1995), všechny čtyři tlapky byly jednotlivě skórovány hodnotou 1 až 3. Proto intenzita artritidy se může pohybovat od 0 do 12 pro každé zvíře. Léčba s AGP3 (SEQ ID NO: 123) signifikantně snížila intenzitu skóre artritidy. (Obrázek 13).

Byly odebrány vzorky séra jeden týden po poslední léčbě (den 35) pro analýzu hladiny antikolagenových protilátek. High binding ELISA plotny (Immulon, Nunc) byly potaženy s 50 μΐ

-57CZ 304592 B4 roztoku 4 pg/ml hovězího Cil v uhličitanovém pufru a byly udržovány v chladu přes noc ledničce. Plotny byly třikrát promyty s ledovou vodou. 75 μΐ blokujícího roztoku připraveného zPBS/,05% tween 20/1% BSA bylo použito k blokování nespecifické vazby po dobu jedné hodiny. Vzorky byly zředěny (do blokujícího pufru) v ředicích destičkách 1:25, 1:100, 1:400 a 1:1600 a 25 μΐ těchto vzorků bylo přidáno do každé jamky destičky ELISA na konečné ředění 100, 400, 1600 a 6400 s konečným objemem 100 μΐ/jamka. Po inkubaci při teplotě místnosti po dobu 3 hodin byly destičky opět třikrát promyty. 100 μΐ druhotné protilátky naředěné v blokujícím pufru (krysí anti-myší IgM, IgG2a, IgH2b, IgGl, IgG3-HRP) bylo přidáno do každé jamky a destičky byly inkubovány po alespoň 2 hodiny. Destičky byly promyty čtyřikrát. 100 μΐ roztoku TMB (Sigma) bylo přidáno do každé jamky a reakce byla zastavena s použitím 50 μΐ 25% kyseliny sírové. Destičky byly odečítány s použitím ELISA čtečky při 450 nm. OD byla porovnána se standardním vzorkem (poolem) představujícím jednotky/ml. Léčba s peptibody AGP3 (SEQ ID NO: 123) snižovala hladiny sérových anti-kolagen II IgGl, IgG3, IgG2a a IgG2b ve srovnání s PBS nebo Fc kontrolní léčebnými skupinami (Obrázek 14).

Příklad 9

Léčba lupus myší NZB/NZW s peptibody AGP3

Pět měsíců staré myši NZBx NZBWF1 náchylné k lupus byly ošetřeny intraperitoneálně 3x/týden po dobu 8 týdnů s PBS, nebo s určenými dávkami peptibody AGP3 nebo lidských proteinů Fc. Před léčbou byla zvířata předem screenována na protein v moči s proužky Albustix reagents strips (Bayer AG). Myši, které měly více než 100 mg/dl proteinu v moči, nebyly do studie zahrnuty. Protein v moči byl hodnocen měsíčně po celou dobu pokusu. Léčba s AGP3 peptibody (SEQ ID NO: 123) vedla k oddálení vypuknutí proteinurie a zlepšila přežívání (Obrázky 15A a 15B).

Léčba s AGP3 peptibody snižovala počet B buněk u myší. Myši Balb/c dostaly 7 denních intraperitoneálních injekcí stanoveného množství AGP3 peptibody (SEQ ID NO: 123), nebo lidského proteinu Fc. V osmém dnu byly odebrány sleziny a tyto byly podrobeny analýze FACS na B buňky B220+, jakje uvedeno v Tabulce 8.

Vynález byl zde zcela popsán a je zřejmé, že odborník v oboru může provést mnohé změny a modifikace, aniž by došlo k odklonu od podstaty a rozsahu vynálezu, tak, jak je zde uveden.

Claims (47)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Molekula vázající TALL-1 zahrnující aminokyselinovou sekvenci Dz^{1 2}Lz^{4 *}, kde z² je aminokyselinový zbytek a z⁴ je T nebo I, a kde molekula nezahrnuje fragment TACÍ, BCMA, nebo BAFFR (SEQ ID NO: 195, 196 a 197).
2. 2. Molekula podle nároku 1, kde z⁴ je T.
3. 3. Molekula podle nároku 1, kde z⁴ je I.
4. 4. Molekula podle nároku 1 zahrnující aminokyselinovou sekvenci vzorce a¹a²a³CDa⁶La⁸a⁹a¹⁰Ca¹²a¹³a¹⁴ (SEQ ID NO: 100),

   -58CZ 304592 B4 a¹, a² a a³ každý nezávisle chybí nebo znamená aminokyselinový zbytek; a⁶ je aminokyselinový zbytek; a⁸ je T nebo I;

   a⁹ je bazický nebo hydrofobní zbytek;
5. 5 a¹⁰ je aminokyselinový zbytek;

   a¹² je neutrální hydrofobní zbytek; a a¹³ a a¹⁴ každý nezávisle chybí nebo znamená aminokyselinový zbytek.

   5. Molekula podle nároku 4, kde a⁸ je T a a⁹ je bazický zbytek.
6. 6. Molekula podle nároku 4, kde a⁹ je K a a¹² je F.
7. 7. Molekula podle nároku 1 zahrnující aminokyselinovou sekvenci vzorce b¹b²b³Cb⁵b⁶Db⁸Lb¹⁰b¹¹b¹²b¹³b¹⁴Cb¹⁶b¹⁷b¹⁸ {SEQ ID NO: 104), ve kterém:

   b¹ a b² každý nezávisle chybí nebo znamená aminokyselinový zbytek; b³ je kyselý nebo amidový zbytek;

   20 b⁵ aminokyselinový zbytek; b⁶ je aromatický zbytek; b⁸ je aminokyselinový zbytek; b¹⁰ je T nebo I; b¹¹ je bazický zbytek;

   25 b¹² a b¹³ každý nezávisle znamená aminokyselinový zbytek;

   b¹⁴ je neutrální hydrofobní zbytek; a b¹⁶, b¹⁷ a b¹⁸ každý nezávisle chybí nebo znamená aminokyselinový zbytek.
8. 8. Molekula podle nároku 7, kde:

   b³ je D, Q nebo E; b⁶ je W nebo Y; b» jeT;

   b¹¹ je K nebo R; a

   35 b¹⁴ je V nebo L.
9. 9. Molekula podle nároku 1 zahrnující aminokyselinovou sekvenci vzorce c¹c²c³Cc⁵Dc⁷Lc⁹c¹⁰c¹¹c¹²c¹³c¹⁴Cc¹⁶c¹⁷c¹⁸ (SEQ ID NO: 105), ve kterém:

   c\ c² a c³ každý nezávisle chybí nebo znamená aminokyselinový zbytek;

   c⁵ je aminokyselinový zbytek;

   -59CZ 304592 B4 c⁷ je aminokyselinový zbytek;

   c⁹ je T nebo I;

   c¹⁰ je bazický zbytek;

   c” a c¹² každý nezávisle znamená aminokyselinový zbytek;

   c¹³ je neutrální hydrofobní zbytek;

   c¹⁴ je aminokyselinový zbytek;

   c¹⁶ je aminokyselinový zbytek;

   c¹⁷ je neutrální hydrofobní zbytek; a c¹⁸ je aminokyselinový zbytek nebo není přítomen.
10. 10. Molekula podle nároku 9, kde:

    c jeT;

    c¹⁰ je K nebo R;

    c¹³ je I, L nebo V; a c¹⁷ je A nebo L.
11. 11. Molekula podle nároku 1 zahrnující aminokyselinovou sekvenci vzorce d¹d²d³Cd⁵d⁶d⁷WDd¹⁰Ld¹²d¹³d¹⁴Cd¹⁶d¹⁷d¹⁸ (SEQ ID NO: 106), ve kterém:

    d¹, d² a d³ každý nezávisle chybí nebo znamená aminokyselinový zbytek; d⁵, d⁶ a d⁷ každý nezávisle znamená aminokyselinový zbytek; d¹⁰ je aminokyselinový zbytek;

    d¹² je T nebo I;

    d¹³ je aminokyselinový zbytek;

    d¹⁴ je aminokyselinový zbytek; a d¹⁶, d¹⁷ ad¹⁸ každý nezávisle chybí nebo znamená aminokyselinový zbytek.
12. 12. Molekula podle nároku 1 zahrnující aminokyselinovou sekvenci vzorce e¹e²e³Ce⁵e⁶e⁷De⁹Le¹¹Ke¹³Ce¹⁵e¹⁶e¹⁷e¹⁸ (SEQ ID NO: 107), ve kterém e¹, e² a e³ každý nezávisle chybí nebo znamená aminokyselinový zbytek; e⁵, e⁶, e⁷, e⁹ a e¹³ každý nezávisle znamená aminokyselinový zbytek; e¹¹ jeT nebol; a e¹⁵, e¹⁶, e¹⁷ a e¹⁸ každý nezávisle chybí nebo znamená aminokyselinový zbytek.

    -60CZ 304592 B4
13. 13. Molekula podle nároku 1 zahrnující aminokyselinovou sekvenci vzorce f¹f²f³Kf⁵Df⁷Lf⁹f¹⁰Qf¹²f¹³f¹⁴ (SEQ ID NO: 109), ve kterém:

    f⁴, f² a f³ chybějí nebo znamenají aminokyselinové zbytky;

    f⁵ je W, Y nebo F;

    f⁷ je aminokyselinový zbytek;

    f⁹ je T nebo I;

    f¹⁰ jeK, RneboH;

    f⁴² je C, neutrální hydrofobní zbytek nebo bazický zbytek, přednostně W, C nebo R; f¹³ je C, neutrální hydrofobní zbytek nebo není přítomen; a f⁴⁴ je jakýkoliv aminokyselinový zbytek nebo není přítomen;

    za předpokladu, že pouze jeden z f⁴, í² a f³ může být C a pouze jeden z f⁴², f¹³ a f⁴⁴ může být C.
14. 14. Molekula podle nároku 13, kde f⁵ je W.
15. 15. Molekula podle nároku 13, kde f⁷ je L.
16. 16. Molekula podle nároku 13, kde f je T.
17. 17. Molekula podle nároku 13, kde f⁴⁰ je K.
18. 18. Molekula podle nároku 13, kde f¹² je C a jeden z f⁴, f² a f³ je C.
19. 19. Molekula podle nároku 13, kde f¹³ je V.
20. 20. Molekula podle nároku 13 zahrnující aminokyselinovou sekvenci vzorce f¹f²f³KWDf⁷Lf⁹KQf¹²f¹³f¹⁴ (SEQ ID NO: 125).
21. 21. Molekula podle nároku 20 zahrnující aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny sestávající ze SEQ ID NO: 32, 33, 58, 60, 63, 66, 67, 69, 114, 115, 122, 123, 124, 147-150, 152-177, 179, 180 a 187.
22. 22. Molekula podle nároku 20 zahrnující aminokyselinovou sekvenci vzorce

    LPGCKWDLLIKQWVCDPL (SEQ ID NO: 33).
23. 23. Molekula podle nároku 1, která má vzorec (Χ’Χ-ν'-ίΧ²^ a její multimery, kde:

    V¹ je molekula, která brání degradaci a/nebo zvyšuje poločas, snižuje toxicitu, snižuje imunogenicitu, nebo zvyšuje biologickou aktivitu terapeutického polypeptidů;

    -61 CZ 304592 B4

    X¹ a X² jsou nezávisle vybrány z -(L^c-P¹, -(ύχ-Ρ'-ίύ^-Ρ², -(L^c-P^^jd-P^^je-P³ a-(L¹)c-P¹-(L²)d-P²-(L³)e-P³-(L⁴)(-P⁴;

    každý jeden nebo více z P¹, P², P³ a P⁴ nezávisle zahrnuje

    Dz²Lz⁴;

    L¹, L², L³ a L⁴ jsou každý nezávisle linkery; a a, b, c, d, e a f jsou každý nezávisle 0 nebo 1, za podmínky, že alespoň jeden z a a b je 1.
24. 24. Molekula podle nároku 23 vzorce

    P^Úja-P^LÝ-V¹.
25. 25. Molekula podle nároku 23 vzorce ν’-σΛ-ρ'-ίΐΛ-ρ².
26. 26. Molekula podle nároku 23, kde V¹ je doména Fc.
27. 27. Molekula podle nároku 23, kde V¹ je doména IgG Fc.
28. 28. Molekula podle nároku 23, kde V¹ je doména IgGl Fc.
29. 29. Molekula podle nároku 23, kde V¹ zahrnuje sekvenci SEQ ID NO: 2.
30. 30. Molekula podle nároku 23, kde jeden nebo více z P¹, P², P³ a P⁴ každý nezávisle zahrnuje sekvenci vybranou z:

    a¹a²a³CDa⁶La⁸a⁹a¹⁰Ca¹²a¹³a¹⁴ (SEQ ID NO: 100), b¹b²b³Cb⁵b⁶Db⁸Lb¹⁰b¹¹b¹²b¹³b¹⁴Cb¹⁶b¹⁷b¹⁸ (SEQ ID NO: 104) , c¹c²c³Cc⁵Dc⁷Lc⁹c¹⁰c¹¹c¹²c¹³c¹⁴Cc¹⁶c¹⁷c¹⁸ (SEQ ID NO: 105) , d¹d²d³Cd⁵d⁶d⁷WDd¹⁰Ld¹²d¹³d¹⁴Cd¹⁶d¹⁷d¹⁸ (SEQ ID NO: 106), e¹e²e³Ce⁵e⁶e⁷De⁹Le¹¹Ke¹³Ce¹⁵e¹⁶e¹⁷e¹⁸ (SEQ ID NO: 107) a f¹f²f³Kf⁵Df⁷Lf⁹f¹⁰Qf¹²f¹³f¹⁴ (SEQ ID NO: 109)) ve které:

    a¹, a², a³ každý nezávisle chybí nebo znamená aminokyselinový zbytek;

    a⁶ je aminokyselinový zbytek;

    a⁹ je bazický nebo hydrofobní zbytek;

    a⁸ je threonyl nebo isoleucyl;

    a¹⁰ je aminokyselinový zbytek;

    a¹² je neutrální hydrofobní zbytek; a a¹³ a a¹⁴ každý nezávisle chybí nebo znamená aminokyselinový zbytek;

    -62CZ 304592 B4 b¹ a b² každý nezávisle chybí nebo znamená aminokyselinový zbytek;

    b³ je kyselý nebo amidový zbytek;

    b⁵ aminokyselinový zbytek;

    b⁶ je aromatický zbytek;

    b⁸ je aminokyselinový zbytek;

    b¹⁰ je T nebo I;

    b¹¹ je bazický zbytek;

    b¹² a b¹³ každý nezávisle znamená aminokyselinový zbytek;

    b¹⁴ je neutrální hydrofobní zbytek;

    b¹⁶, b¹⁷ a b¹⁸ každý nezávisle chybí nebo znamená aminokyselinový zbytek;

    c¹, c² a c³ každý nezávisle chybí nebo znamená aminokyselinový zbytek; c⁵ je aminokyselinový zbytek; c⁷ je aminokyselinový zbytek; c⁹ je T nebo I;

    c¹⁰ je bazický zbytek;

    c¹¹ a c¹² každý nezávisle znamená aminokyselinový zbytek;

    c¹³ je neutrální hydrofobní zbytek;

    c¹⁴ je aminokyselinový zbytek;

    c¹⁶ je aminokyselinový zbytek;

    c¹⁷ je neutrální hydrofobní zbytek;

    c¹⁸ je aminokyselinový zbytek nebo není přítomen;

    d¹, d² a d³ každý nezávisle chybí nebo znamená aminokyselinový zbytek; d⁵, d⁶ a d⁷ každý nezávisle znamená aminokyselinový zbytek; d¹⁰ je aminokyselinový zbytek;

    d¹² je T nebo I;

    d¹³ je aminokyselinový zbytek;

    d¹⁴ je aminokyselinový zbytek;

    d¹⁶, d¹⁷ a d¹⁸ každý nezávisle chybí nebo znamená aminokyselinový zbytek;

    e¹, e² a e³ každý nezávisle chybí nebo znamená aminokyselinový zbytek; e⁵, e⁶, e⁷, e⁹ a e¹³ každý nezávisle znamená aminokyselinový zbytek; e¹¹ je T nebo I;

    1 c i z i*7 iq e , e , e a e každý nezávisle chybí nebo znamená aminokyselinový zbytek;

    f¹, f² a f³ chybějí nebo znamenají aminokyselinové zbytky;

    f⁵ je W, Y nebo F;

    f⁷ je aminokyselinový zbytek;

    f⁹ je T nebo I;

    f¹⁰ jeK, RneboH;

    f¹² je C, neutrální hydrofobní zbytek nebo bazický zbytek;

    f¹³ je C, neutrální hydrofobní zbytek nebo není přítomen; a

    -63CZ 304592 B4 f¹⁴ je jakýkoliv aminokyselinový zbytek nebo není přítomen;

    za předpokladu, že pouze jeden z f¹, f² a f³ může být C a pouze jeden z f¹², f¹³ a f¹⁴ může být C.
31. 31. Molekula podle nároku 30, kde:

    a⁹ je bazický zbytek;

    b³ je D, Q nebo E;

    b⁶ je W nebo Y;

    b¹¹ je K nebo R;

    b¹⁴ je V nebo L;

    c¹⁰ je K nebo R;

    c¹³ jeal, LneboV;

    c¹⁷ je A nebo L;

    f⁵ je W f jeU f*° jeK;a f¹³ je V.
32. 32. Molekula podle nároku 30, kde jeden nebo více z Ρ¹, Ρ², P³ a P⁴ každý nezávisle zahrnuje fWKWDfl/KQf¹²^¹⁴ (SEQ ID NO: 125).
33. 33. Molekula podle nároku 32 vzorce
34. 34. Molekula podle nároku 32 vzorce ν’-σΛ-ρ'-σΛ-ι-ρ².
35. 35. Molekula podle nároku 32, která má aminokyselinovou sekvenci vybranou ze SEQ ID NO: 122,123 a 124.
36. 36. Molekula podle nároku 33 nebo 34, ve které L² je větší než 5 aminokyselin.
37. 37. Molekula podle nároku 36, kde L² je vybráno z

    GSGSATGGSGSTASSGSGSATx^rx² (SEQ ID NO: 193)

    GSGSATGGSGSTASSGSGSATx¹x²GSGSATGGSGSTASSGSGSATx³x⁴ (SEQ ID NO: 194), kde x¹ a x³ jsou každý nezávisle bazické nebo hydrofobní zbytky a x² a x⁴ jsou každý nezávisle hydrofobní zbytky.

    -64CZ 304592 B4
38. 38. Molekula podle nároku 36, kde L² je vybráno z

    GSGSATGGSGSTASSGSGSATH (SEQ ID NO: 59),

    GSGSATGGSGSTASSGSGSATGM (SEQ ID NO: 190),

    GSGSATGGSGSTASSGSGSATGS (SEQ ID NO :191), a

    GSGSATGGSGSTASSGSGSATHMGSGSATGGSGSTASSGSGSATHM (SEQ ID NO: 192).
39. 39. Molekula podle nároku 23 zahrnující sekvence vybrané z Tabulky 4 (SEQ ID NO: 44-55).
40. 40. DNA kódující molekulu podle nároku 23.
41. 41. Expresní vektor zahrnující DNA podle nároku 40.
42. 42. Hostitelská buňka zahrnující expresní vektor podle nároku 41.
43. 43. Buňka podle nároku 42, kde buňkou je buňka E. coli.
44. 44. Molekula podle nároků 1, 4, 7, 9, 11, 12, 13 nebo 23 pro použití pro léčení autoimunitních onemocnění zprostředkovaných B buňkami.
45. 45. Molekula podle nároků 1, 4, 7, 9, 11, 12, 13 nebo 23 pro použití pro léčení lupus.
46. 46. Molekula podle nároků 1, 4, 7, 9, 11, 12, 13 nebo 23 pro použití pro léčení rakoviny zprostředkované B buňkami.
47. 47. Molekula podle nároků 1, 4, 7, 9, 11, 12, 13 nebo 23 pro použití pro léčení B-buněčného lymfomu.