RS51708B - Peptidi i njima srodni molekuli koji se vezuju za tall-1 - Google Patents

Abstract

Kompozicija koja sadrži amino kiselinsku sekvencu formule f1 f2 f3 Kf5 Df7 Lf9 f10 Qf12 f13 f14(SEQ:ID:NO: 109)gde:svako f1, f2 i f3 su odsutni ili su amino kiselinski ostaci; f5 je W, Y ili F;f7 je amino kiselinski ostatak; f9 je T ili I; f10 je K, R, ili H ;f12 je C, neutralni hidrofobni ostatak, ili bazni ostatak (W, C, ili R poželjno); f13 je C, neutralni hidrofobni ostatak ili je odsutan ; i f14 je bilo koji amino kiselinski ostatak ili je odsutan;uz uslov da samo jedan od f1, f2 i f3 mogu biti C, a samo jedan od f12, f13 i f14 može da bude C.Prijava sadrži još 34 patentna zahteva.

Description

Stanje tehnike

Posle niza godina proučavanja nekroze tumora, faktori nekroze tumora (TNFs) a i p su konačno klonirani 1984. godine. Narednih godina otkrivena je superfamilija TNF citokina, uključujući fas ligand (FasL), CD27 ligand (CD27L), CD30 ligand (CD30L), CD40 ligand (CD40L), ligand srodan TNF koji indukuje apoptozu (TRAIL, takođe označen i kao AGP-1), protein koji vezuje osteoprotegerin (OPG-BP ili OPG ligand), 4-1BB ligand, LIGHT, APRIL i TALL-1. Smith et al. (1994), Ce|| 76: 959-962; Lacey et aj. (1998), Cell 93: 165-176; Chichepotiche et al., (1997), J. Biol. Chem.272:32401-32410; Mauri et al. (1998), Immunitv 8: 21-30; Hahne et aj. (1998), J, Exp. Med.188:1185-90; Shu et al. (1999), J. Leukocvte Biologv 65: 680-3. Ova familija je ujedinjena na osnovu strukture njenih članova, posebno na C-kraju, Pored toga, većina članova koji su do sada poznati se eksprimiraju u imunim kompartmentima, iako se neki članovi takođe eksprimiraju u drugim tkivima i organima. Smith et al. (1994), Cell 76: 959-62. Svi članovi koji su ligandi, sa izuzetkom LT-a, su transmembranski proteini tipa II, koje karakteriše konzervativan amino kiselinski region od 150 amino kiselina unutar C-terminalnog ekstracelularnog domena, lako je ograničen na samo 20-25% identičnosti, konzervativan amino kiselinski domen od 150 amino kiselina pakuje se u karakterističnu (3-nabranu ploču I formira trimer. Ovaj konzervativni region može biti proteolitički oslobođen, čime se stvara rastvorljiv funkcionalni oblik. Banneretal. (1993), Cell 73: 431-445.

Mnogi članovi unutar ove familije liganada se eksprimiraju u tkivima koja su obogaćena limfnim sudovima i igraju važnu ulogu u razvoju i modulaciji imunog sistema. Smith et al. (1994). Na primer, TNFa se većinom sintetiše u makrofagima i važan je medijator inflamatornih odgovora i imune odbrane. Tracev & Cerami (1994), Ann. Rev. Med. 45: 491-503. Fas-L, koji se pretežno eksprimira u aktiviranoj T ćeliji, modulira TCR-posredovanu apoptozu timocita. Nagata, S. & Suda, T. (1995) Immunolo<g>v Todav 16: 39-43; Castrim etal. (1996), Immunitv 5: 617-27. CD40L, koji se takođe eksprimira u aktiviranim T ćelijama, daje glavni signal za opstanak, proliferaciju B ćelija i promenu izotipa imunoglobulina. Noelle (1996), Immunitv 4: 415-9.

Identifikovani su srodni receptori za većinu članova familije TNF liganada. Ovi receptori imaju iste karakteristične multipne ponovke bogate cisteinom unutar ekstraćelijskih domena, a ne poseduju katalitičke motive unutar citoplazmatičnih regiona. Smith et a|. (1994). Receptorni signal preko direktnih interakcija sa proteinima koji ćine domene preko kojih se signalivira ćelijska smrt (npr. TRADD, FADD i RIP) ili sa TRAF proteinima (npr. TRAF2, TRAF3, TRAF5 i TRAF6), pokreće signalne puteve koji se razilaze i preklapaju, npr. apoptozu, NF-kB aktivaciju ili JNK aktivaciju. VVallach et al. (1999), Annual Revievv of Immunologv 17: 331-67. Ovi signalni događaji dovode do smrti ćelije, proliferacije, aktivacije ili diferencijacije. Ekspresioni profil svakog člana receptora varira. Na primer, TNFR1 se eksprimira kod velikog broja tkiva i ćelija, s obzirom na to da je receptor OPGL na ćelijskoj površini većinom ograničen na osteoklaste. Hsu et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 3540-5.

Određen broj istraživačkih grupa je u skorije vreme identifikovao TNF familiju liganada sa istom ili značajno sličnom sekvencom. Ligand je različito nazvan neutrokin a (WO 98/18921, objavljen 7. maja 1998.), 63954 (WO 98/27114, objavljen 25. juna 1998.), TL5 (EP 869 180, objavljen 7. oktobra, 1998.), NTN-2 (WO 98/55620 i WO 98/55621, objavljen 10. decembra 1998.), TNRL1-alfa (WO 9911791, objavljen 11. marta, 1999.), ključni ligand (WO 99/12964, objavljen 18. marta 1999.) i AGP-3 (U.S. Prov. App. Nos. 60/119, 906, podneta 12. februara 1999. i 60/166,271, podneta 18. novembra 1999., respektivno); i TALL-1 (WO 00/68378, objavljen 16. novembra 2000.). Svaka od ovih referenci je ovim uključena na osnovu reference. Ligandi koji su ovde dati obeleženi su zajedničkim imenom kao TALL-1.

TALL-1 je član superfamilije TNF liganada koji je funkcionalno uključen u opstanak i proliferaciju B ćelija. Transgeni miševi sa prekomernom ekspresijom TALL-1 imaju snažnu hiperplaziju B ćelija i autoimunu bolest sličnu lupusu. Khare et al. (2000) PNAS 97(7): 3370-3375). I TACI i BCMA služe kao receptori za TALL-1 na ćelijskoj površini. Gross et aj. (2000), Nature 404: 995-999; Ware (2000), J. Exp. Med. 192(11): F35-F37; Ware (2000), Nature 404: 949-950; Xia et aj. (2000), J. Exp. Med. 192(1): 137-143; Yu et al. (2000), Nature Immunologv 1(3): 252-256; Marsters et aj. (2000), Current Bioloav 10: 785-788; Hatzoglou et al. (2000) J. of Immunologv 165: 1322-1330; Shu et al. (2000) PNAS 97(16):9156-9161; Thompson et aj. (2000) J. Exp. Med. 192(1):129-135; Mukhopadhvav et al. (1999) J. Biol. Chem. 274(23): 15978-81; Shu et aj. (1999) J. Leukocvte Biol. 65:680-683; Grussetal. (1995) Blood 85(12): 3378-3404; Smith et al. (1994), Cejl 76: 959-962; U.S. Pat. No. 5,969,102, objavljena 19. oktobra 1999; WO 00/67034, objavljen 9. novembra 2000; WO 00/40716, objavljen 13. jula 2000; WO 99/35170, publikovan 15. jula 1999. Oba receptora se eksprimiraju u B ćelijama i šalju signal preko interakcije sa TRAF proteinima. Pored toga, i TACI i BCMA se takođe vezuju za drugog člana familije TNF liganada, APRIL. Yu et aj. (2000), Nature Immunologv 1(3): 252-256. Takođe je pokazano da APRIL indukuje proliferaciju B ćelija.

Do danas nisu otkriveni rekombinantni ili modifikovani proteini koji koriste peptidne modulatore TALL-1. Rekombinantni i rnodifikujući proteini su klasa terapeutskih agenasa koja tek počinje da se razvija. Korisne modifikacije proteinskih terapeutskih agenasa obuhvataju kombinacije sa "Fc" domenom antitela i vezivanje za polimere kao što su polietilenglikol (PEG) i dekstran. Takve modifikacije su detaljno razmatrane u prijavi patenta pod naslovom "Modified Peptides as Therapeutic Agents" koja je objavljena kao VVO 00/24782, koja je ovim uključena u celini na osnovu reference.

Dosta različit pristup razvoju terapeutskih agenasa je skrining peptidne biblioteke. Interakcija proteinskog liganda sa njegovim receptorom se često odvija na relativno velikoj površini. Međutim, kao što je pokazano za humani hormon rasta i njegov receptor, samo nekoliko ključnih ostataka na površini doprinose većem delu energije za vezivanje. Clackson et al. (1995), Science 267: 383-6. Veći deo proteinskog liganda jedino izlaže vezujuće epitope u pravilnoj topologiji ili služi za funkcije koje nemaju veze sa vezivanjem. Prema tome, molekuli dužine samo "jednog peptida" (2 do 40 amino kiselina) se mogu vezati za receptorni protein datog velikog proteinskog liganda. Takvi peptidi mogu da imitiraju biološku aktivnost velikog proteinskog liganda ("peptidni agonisti") ili, preko kompetitivnog vezivanja, da inhibiraju biološku aktivnost velikog proteinskog liganda ("peptidni antagonisti").

Peptidne biblioteke fagnog displeja (prikaza) su se pojavile kao moćan postupak u identifikaciji takvih peptidnih agonista i antagonista. Pogledati, na primer, Scott et aj. (1990), Science 249: 386; Devlin et al. (1990), Science 249: 404; U.S. Pat. No. 5,223,409, objavljena 29. juna 1993; U.S. Pat. No. 5,733,731, objavljena 31. marta 1998; U.S. Pat. No. 5,498,530, objavljena 12. marta 1996; U.S. Pat. No. 5,432,018, objavljena 11. jula 1995; U.S. Pat. No. 5,338,665, objavljena 16. avgusta, 1994; U.S. Pat. No. 5,922,545, objavljena 13. jula 1999; WO 96/40987, publikovan 19. decembra 1996; i WO 98/15833, publikovan 16. aprila 1998 (svaka uključena na osnovu reference u celini). U takvim bibliotekama nasumične peptidne sekvence su prikazane preko fuzije sa proteinima omotača filamentoznog faga. U tipičnom slučaju, prikazani peptidi su eluirani prema afinitetu na imobilizovanom ciljnom proteinu. Zadržani fagi se mogu obogatiti uzastopnim postupcima prečišćavanja prema afinitetu i repropagacije. Peptidi koji se najbolje vezuju mogu biti sekvencirani da bi se indentifikovali ključni ostaci unutar jedne ili više strukturno povezanih familija peptida. Pogledati, npr., Cvvirla et aj. (1997), Science 276: 1696-9, gde su identifikovane dve posebne familije. Peptidne sekvence mogu takođe sugerisati koji se ostaci mogu bezbedno zameniti putem alanin skrininga ili mutagenezom na nivou DNK. Mogu se oformiti i posmatrati biblioteke mutageneze da bi se dodatno optimizovala sekvenca peptida koji se najbolje vezuju. Lovvman (1997), Ann. Rev. Biophvs. Biomol. Struct. 26: 401-24.

Strukturna analiza interakcije protein-protein se takođe može koristiti da bi se označili peptidi koji imitiraju vezujuću aktivnost velikih proteinskih liganada. U takvoj analizi, kristalna struktura može sugerisati identičnost i relativan položaj kritičnih ostataka velikog proteinskog liganda, od koga se može stvoriti peptid. Pogledati, npr., Takasaki et aj. (1997), Nature Biotech. 15: 1266-70. Ovi analitički postupci se takođe mogu koristiti za ispitivanje interakcije između receptornog proteina i peptida koji su izabrani na osnovu fagnog prikaza, što može sugerisati dodatne modifikacije peptida kako bi se povećao afinitet za vezivanje.

Drugi postupci u istraživanju peptida su u kompeticiji sa fagnim prikazom. Peptidna biblioteka se može fuzionisati za karboksil kraj lac represora i može se eksprimirati kod E. coli. Drugi postupak zasnovan na E. coli omogućava prikaz na spoljašnjoj ćelijskoj membrani fuzijom sa lipoproteinom koji je povezan sa peptidoglikanom (PAL). Ovi i slični postupci se zajedničkim imenom označavaju kao " E. coli prikaz". U sledećem postupku, translacija nasumične RNK je zaustavljena pre oslobađanja ribozoma, rezultirajući u biblioteci polipeptida za koje je još uvek vezana odgovarajuća RNK. Ovaj i slični postupci su označeni zajedničkim imenom kao "ribozomski prikaz". Drugi postupci koji koriste peptide vezane za RNK: na primer, PROfuziona tehnologija, Phvlos, Inc. Pogledati, na primer, Roberts & Szostak (1997), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 12297-303. Ovaj i slični postupci su označeni zajedničkim imenom "RNK-peptidni skrining". Razvijene su hemijski izvedene peptidne biblioteke u kojima su peptidi imobilizovani na stabilnim, ne-biološkim materijalima, kao što su polietilenski štapići ili smole koje su propustljive za rastvarače. Druga hemijski izvedena peptidna biblioteka koristi fotolitografiju za skeniranje peptida koji su imobilizovani na staklenim pločicama. Ovaj i slični postupci su označeni zajedničkim imenom kao "hemijsko-peptidni skrining". Hemijsko-peptidni skrining može biti pogodan jer dozvoljava upotrebu D-amino kiselina i drugih neprirodnih analoga, kao i ne-peptidnih elemenata. I biološki i hemijski postupci su dati u VVells & Lovvman (1992), Curr. Opin. Biotechnol. 3: 355-62. U principu, moguće je otkriti peptidne mimetike bilo kog proteina korišćenjem fagnog prikaza, RNK-peptidnog skininga i ostalih postupaka koji su pomenuti u prethodnom tekstu.

Rezime pronalaska

Ovaj pronalazak se bavi terapeutskim agensima koji moduliraju aktivnost TALL-1. U skladu sa ovim pronalaskom, modulatori TALL-1 mogu da sadrže amino kiselinsku sekvencu Dz<2>Lz<4>(SEQ ID NO: 108) gde je z<2>amino kiselinski ostatak i z<4>je treonil ili izoleucil. Takvi modulatori TALL-1 sadrže molekule sledeće formule:

gde:

svako a<1>, a<2>i a<3>je nezavisno odsutno ili je amino kiselinski ostatak;

a6 je amino kiselinski ostatak;

a<9>je bazni ili hidrofobni ostatak;

a8 je treonil ili izoleucil;

a<10>je amino kiselinski ostatak,

a12 je neutralni hidrofobni ostatak; i

svakoa<13>i a<14>je nezavisno odsutno ili je amino kiselinski ostatak.

gde:

svako b<1>i b<2>je nezavisno odsutno ili je amino kiselinski ostatak; b3 je kiseli ili amidni ostatak; b<5>je amino kiselinski ostatak; b<6>je aromatični ostatak; b<8>je amino kiselinski ostatak; b10 je Tili I; b<11>je bazni ostatak; svakob<12>i b<13>je nezavisno amino kiselinski ostatak; b14 je neutralni hidrofobni ostatak; svako b<1>6,b1<7>i b<18>je nezavisno odsutan ili je amino kiselinski ostatak.

gde:

svako c<1>, c<2>i c<3>je nezavisno odsutno ili je amino kiselinski ostatak;

c5 je amino kiselinski ostatak;

c<7>je amino kiselinski ostatak;

c9 je Tili I;

c<10>je bazni ostatak;

svakoc11 i c12 je nezavisno amino kiselinski ostatak;

c<13>je neutralni hidrofobni ostatak;

c14 je amino kiselinski ostatak;

c16 je amino kiselinski ostatak;

c17 je neutralan hidrofobni ostatak; i

c<18>je amino kiselinski ostatak ili je odsutan.

gde:

svako d\ d<2>i d<3>je nezavisno odsutno ili je amino kiselinski ostatak;

svako d<5>, d<6>i d<7>je nezavisno amino kiselinski ostatak;

d<10>je amino kiselinski ostatak;

d12 je T ili I;

d<13>je amino kiselinski ostatak;

d14 je amino kiselinski ostatak; i

svako d<1>6,d1<7>i d<18>je nezavisno odsutan ili je amino kiselinski ostatak.

gde:

svako e<1>, e<2>i e<3>je nezavisno odsutno ili je amino kiselinski ostatak;

svako e<5>, e<6>, e7,e9i e<13>je nezavisno amino kiselinski ostatak;

e11 je T ili I; i

svako e<1>5,e1<6>i e<17>je nezavisno odsutan ili je amino kiselinski ostatak.

gde:

svako f<1>, f<2>i f<3>su odsutni ili su amino kiselinski ostaci (s tim da je f<1>, f<2>if<3>upoželjnom slučaju C kada je jedan od f<12>, f13if<14>C); f<5>je W, Y ili F (W poželjno); f7 je amino kiselinski ostatak (L poželjno); f9 je T ili I (T poželjno); f10je K, R, ili H (K poželjno); f<12>je C, neutralni hidrofobni ostatak, ili bazni ostatak (W, C, ili R poželjno); f13 je C, neutralni hidrofobni ostatak ili je odsutan (V poželjno); i f<14>je bilo koji amino kiselinski ostatak ili je odsutan; uz uslov da samo jedan od f\ f<2>if<3>mogu biti C, a samo jedna od f12,f13if14mogu biti C. Jedinjenja formula l(a) do l(f) iz prethodnog teksta objedinjuju Dz<2>Lz<4>, kao i SEQ ID NO: 63. Sekvenca l(f) je izvedena kao konsenzus sekvenca kao što je opisano u Primeru 1. Od jedinjenja unutar formule l(f), poželjna su ona unutar formule

Jedinjenja koja potpadaju pod formulu l(f) obuhvataju SEQ ID NOS: 32, 58, 60, 62, 63, 66,67, 69, 70, 114, 115, 122, 123, 124, 147-150, 152-177, 179, 180, 187.

Takođe u skladu sa ovim pronalaskom su i jedinjenja koja imaju konsenzus motiv:

koji se takođe vezuje za TALL-1.

Dalje u skladu sa ovim pronalaskom su i jedinjenja formula:

gde:

svako g<1>, g<2>i g<3>je nezavisno odsutno ili je amino kiselinski ostatak;

g<5>je neutralni hidrofobni ostatak;

g<8>je neutralni hidrofobni ostatak;

g10 je kiseli ostatak;

svako g12ig13 je nezavisno amino kiselinski ostatak; i

g<14>je odsutan ili je amino kiselinski ostatak.

gde:

svako h<1>, h<2>i h3 je nezavisno odsutno ili je amino kiselinski ostatak;

h<6>je hidrofobni ostatak;

h<7>je hidrofobni ostatak;

h<10>je kiseli ili polarni hidrofobni ostatak; i

svako h<1>2,h1<3>i h<14>je nezavisno odsutno ili je amino kiselinski ostatak.

gde:

1<1>je odsutan ili je amino kiselinski ostatak; 12 je neutralni hidrofobni ostatak; 13 je amino kiselinski ostatak;

svako i5, i<6>, i<7>i i<8>je nezavisno amino kiselinski ostatak;

i9 je kiseli ostatak;

i10 je amino kiselinski ostatak;

svako i<12>i i13 je nezavisno amino kiselinski ostatak; i

i<14>je neutralni hidrofobni ostatak.

Jedinjenja definisana u formulama l(g) do l(i) takođe vezuju TALL-1.

Dalje, u skladu sa ovim pronalaskom, modulatori TALL-1 obuhvataju:

a) domen koji modulira TALL-1 (npr., amino kiselinsku sekvencu Formula l(a) do l(i)), poželjno amino kiselinska sekvenca Dz<2>Lz<4>, ili sekvence koje su izvedene od nje i to fagnim prikazom, RNK-peptidnim skriningom, ili pomoću drugih poznatih tehnika koje su pomenute u prethodnom tekstu; i b) nosač, kao što je polimer (npr., PEG ili dekstran) ili Fc domen, koji je poželjan;

gde je nosač kovalentno vezan za domen koji modulira TALL-1. Nosač i domen koji modulira TALL-1 mogu biti vezani preko N- ili C- kraja domena koji modulira TALL-1, kao što je detaljnije opisano u daljem tekstu. Poželjan nosač je Fc domen, a poželjan Fc domen je IgG Fc domen. Takvi peptidi vezani za Fc se ovde označavaju kao "peptitela". Poželjni domeni koji moduliraju TALL-1 sadrže amino kiselinske sekvence koje su opisane u daljem tekstu u Tabelama 1 i 2. Drugi domeni koji moduliraju TALL-1 se mogu formirati fagnim prikazom, RNK-peptidnim skriningom i pomoću ostalih tehnika koje su ovde pomenute.

Dalje, u skladu sa ovim pronalaskom je postupak za formiranje modulatora TALL-1, koji obuhvata:

a. izbor najmanje jednog peptida koji se vezuje za TALL-1; i

b. kovalentno vezivanje pomenutog peptida za nosač.

Poželjan nosač je Fc domen. Korak (a) se poželjno izvodi izborom iz peptidnih sekvenci iz Tabele 2 koja je data u daljem tekstu ili iz fagnog prikaza, RNK-peptidnog skriniga, ili drugih tehnika koje su ovde pomenute.

Jedinjenja ovog pronalaska se mogu pripremiti pomoću standardnih postupaka za sintezu, tehnika rekombinantne DNK, ili pomoću bilo kojih drugih postupaka pripremanja peptida i fuzionih proteina. Jedinjenja iz ovog pronalaska koja obuhvataju ne-peptidne delove se mogu sintetisati standardnim reakcijama organske hernije, pored standardnih reakcija koje spadaju u herniju peptida kada se mogu primeniti.

Primarna upotreba koja je razmatrana za jedinjenja ovog pronalaska je njihovo korišćenje kao terapeutskih ili profilaktičkih agenasa. Peptid koji je vezan za nosač može imati dejstvo koje se može uporediti sa dejstvom prirodnog liganda koga peptid imitira, ili čak i snažnije dejstvo od njega.

Jedinjenja ovog pronalaska se mogu upotrebiti u terapeutske ili profilaktičke svrhe njihovim formulisanjem sa odogovarajućim farmaceutskim nosačima i primenom efikasne količine na pacijenta kome je takav tretman potreban, kao što je čovek (ili drugi sisar). Ovim pronalaskom su obuhvaćeni i drugi srodni aspekti.

Brojni dodatni aspekti i prednosti ovog pronalaska će biti očigledni nakon razmatranja slika i detaljnog opisa pronalaska.

Kratak opis slika

Slika 1 pokazuje primere Fc dimera koji se mogu izvesti od lgG1 antitela. "Fc" na slici predstavlja bilo koju od Fc varijanti unutar značenja "Fc domena". "X<1>" i "X<2>" predstavljaju peptide ili kombinacje linkera i peptida kao što je definisano u daljem tekstu. Specifični dimeri su sledeći: A, D: Dimeri vezani jednom disulfidnom vezom. lgG1 antitela u tipičnom slučaju imaju dve disulfidne veze na zglobnom regionu antitela. Fc domen na Slikama 1A i 1D se može formirati isecanjem između dve disulfidne veze ili supstitucijom cisteinil ostatka nereaktivnim ostatkom (npr. alanin). Na Slici 1A, Fc domen je vezan na amino terminusu peptida; u 1D na karboksil terminusu.

B, E: Dimeri vezani dvostrukom disulfidnom vezom. Ovaj Fc domen se može formirati takvim isecanjem sa ishodnog antitela da se oba cisteinil ostatka zadrže u lancima Fc domena ili ekspresijom konstrukta koji sadrži sekvencu koja kodira takav Fc domen. Na Slici 1B, Fc domen je vezan na amino terminusu peptida; u 1E, na karboksil terminusu.

C, F; Nekovalentni dimeri. Ovaj Fc domen se može formirati eliminacijom cisteinil ostataka bilo isecanjem ili supstitucijom. Može biti poželjna eliminacija cisteinil ostataka da bi se izbegle nečistoće koje se formiraju reakcijom cisteinil ostatka sa cisteinil ostacima drugih proteina u ćeliji domaćinu. Nekovalentno vezivanje Fc domena je dovoljno da dimer održi kompaktnim. Drugi dimeri se mogu formirati korišćenjem Fc domena koji su izvedeni od različitih tipova antitela (npr., lgG2, IgM).

Slika 2 pokazuje strukturu poželjnih jedinjenja pronalaska koji poseduju tandem ponovke farmakološki aktivnog peptida. Slika 2A pokazuje jednolančani molekul i može takođe predstavljati konstrukt DNK za molekul. Slika 2B pokazuje dimer u kome se linker-peptidni deo nalazi samo na jednom lancu dimera. Slika 2C pokazuje dimer koji ima peptidni deo na oba lanca. Dimer sa Slike 2C će se spontano formirati u izvesnim ćelijama domaćinima nakon ekspresije konstrukta DNK koji kodira pojedinačan lanac prikazan na Slici 3A. U drugim ćelijama domaćinima, ćelije bi se mogle naći u uslovima koji favorizuju formiranje dimera ili se dimeri mogu formiratiin vitro.

Slika 3 pokazuje primere sekvenci sastavljenih od nukleinskih kiselina i amino kiselina (SEQ ID NOS: 1 i 2, respektivno) humanog lgG1 Fc koji se može upotrebiti u ovom pronalasku.

Slike 4A do 4F pokazuju nukleotidne i amino kiselinske sekvence (SEQ ID NOS: 3-27) S Ndel do Sali fragmenata koji kodiraju peptid i linker.

Slike 5A do 5M pokazuju nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 28) pAMG21-RANK-Fc vektora, koji je upotrebljen da bi se formirali Fc-vezani molekuli ovog pronalaska. Ove slike identifikuju određen broj karakteristika nukleinske kiseline, uključujući: • promotorske regione PcopB, PrepA, RNAI, APHII, luxPR i luxPL; • mRNKza APHII, luxR; • kodirajuće sekvence i amino kiselinske sekvence za proteine: copB protein, copT, repAl, repA4, APHII, luxR, RANK i Fc; • vezujuća mesta za proteine copB, CRP; • strukture u vidu ukosnice T1, T2, T7 i toop sekvence; • mesto operatora za lux protein; • restrikciona mesta enzima za Pflll08l, B<g>lll. Seal, Bmnl, Drdll, Dralll, BstBl, Acelll, AflU, PfIMI, Bgll, Sfll.BstEII, BspLulll. NspV, Bpll, Eagl, Bcgl, Nsil, Bsal, PSpJ406l, Aatll, Bsml, Nrul, Ndel, ApaLI, Acc65l, Kpnl, Sali, Accl, BspEI, Ahdl, BspHI, Econl, BsrGI, Bjmal, Smal, SexAI, BamHI i BIpJ.

Slike 6A i 6B pokazuju DNK sekvencu (SEQ ID NO: 97) koja je umetnuta u pCFM1656 između jedinstvenih Aatll (pozicija #4364 u pCFM1656) i Sacll (pozicija #4585 u pCFM1656) restrikcionih mesta da bi se formirao ekspresioni plazmid pAMG21 (ATCC pristupni br. 98113).

Slika 7 pokazuje da TALL-1 peptitelo (SEQ ID NO: 70) inhibira TALL-1 posredovanu proliferaciju B ćelija. Prečišćene B ćelije (10<5>) iz B6 miševa su uzgajane u kulturi u triplikatima u 96-komornim pločama sa naznačenim količinama TALL-1 konsenzus peptitela u prisustvu 10 ng/ml TALL-1 plus 2 (.ig/ml anti-lgM antitela. Proliferacija je merena preko usvajanja radioaktivnog [<3>H]timidina u poslednjih 18 časova izloženosti radioaktivnosti. Prikazani rezultati predstavljaju srednju vrednost + SD komorica u triplikatu.

Slika 8 pokazuje da su TALL-1 N-terminalna tandem dimer peptitela (SEQ ID NO: 123, 124 u Tabeli 5B) poželjna za inhibiciju TALL-1-posredovane proliferacije B ćelija. Prečišćene B ćelije (10<5>) iz B6 miševa su gajene u kulturi u triplikatu u 96-komornoj ploči sa naznačenim količinama TALL-1 12-3 peptitela i TALL-1 konsenzus peptitelom (SEQ ID NOS: 115 i 122 iz Tabele 5B) ili sličnim dimernim peptitelima (SEQ ID NOS: 123, 124) u prisustvu 10 ng/ml TALL-1 plus 2ng/ml anti-lgM antitela Proliferacija je merena preko usvajanja radioaktivnog [<3>H]timidina u poslednjih 18 časova izloženosti radioaktivnosti. Prikazani rezultati predstavljaju srednju vrednost ± SD komorica u triplikatu.

Slika 9. AGP3 peptitelo se vezuje za AGP3 sa visokim afinitetom. Konstanta ravnotežne disocijacije (KD) je dobijena iz nelinearne regresije kompeticionih krivih korišćenjem homogenog vezujućeg modela dvostruka-kriva jedno-mesto (KinEx™ softver). KDje oko 4 pM za AGP3 peptitelo koje se vezuje sa humanim AGP3 (SEQ ID NO: 123).

Slike 10A i 10B. AGP3 peptitelo blokira i humani i mišji AGP3 u Biacore kompetitivnoj analizi. Rastvorljivi humani TACI protein je imobilizovan za B1 čip. 1 nM rekombinantnog humanog AGP3 proteina (gornji pano) ili 5 nM rekombinantnog mišjeg AGP3 proteina (donji pano) je inkubirano sa naznačenom količinom AGP3 peptitela pre nego što se injektira preko površine receptora. Prikazan je relativni humani AGP3 i mišji AGP3 vezujući odgovor (SEQ ID NO: 123).

Slike 11A i 11B. AGP3 peptitelo je blokiralo vezivanje AGP3 za sva tri receptora TACI, BCMA i BAFFR u Biacore kompeptitivnoj analizi. Rekombinantni rastvorljivi receptorni TACI, BCMA BAFFR proteini su imobilizovani za CM5 čip. 1 nM rekombinantnog humanog AGP3 (gornji pano) je inkubirano sa naznačenom količinom AGP3 peptitela pre nego što je injektiran preko površine svakog receptora. Mereno je relativno vezivanje AGP3. Slično tome, 1 nM rekombinantnog APRIL proteina je inkubirano sa naznačenom količinom AGP3 peptitela pre nego što je injektiran preko površine svakog receptora. AGP3 peptitelo nije inhibiralo vezivanje APRIL za sva tri receptora (SEQ ID NO: 123).

Slike 12A i 12B. AGP3 peptitelo inhibira povećanje nivoa mišjeg imunoglobulina u serumu koje je indukovano humanim APG3 nadražajem. Balb/c miševi su primili 7 dnevnih intraperitonealnih injekcija 1 mg/kg humanog AGP3 proteina zajedno sa slanim rastvorom, humanim Fc, ili AGP3 peptitelom u naznačenim dozama i osmog dana im je uzimana krv. Ukupan nivo IgM i IgA u serumu je meren pomoću ELISA (SEQ ID NO: 123).

Slika 13. Tretman sa AGP3 peptitelom je ublažio artitis kod mišjeg CIA modela. Osam do 12 nedelja stari DBA/I mužjaci miševa su imunizovani sa goveđim kolagenom tipa II (bCII), koji je emulzifikovan u kompletnom Freund-ovom adjuvantu, intradermalno pri osnovi repa i 3 nedelje posle inicijalne imunizacije su naknadno imunizovani sa bCII koji je emulzifikovan u kompletnom Freund-ovom adjuvantu. Tretman sa naznačenom dozom AGP3 peptitela je započet od dana naknadne imunizacije i trajao je 4 nedelje. Kao što je ranije opisano (Khare et al.,J. ImmunoL,155: 3653-9, 1995), sve četiri šape su pojedinačno bodovane od 0 do 3 u odnosu na jačinu artritisa (SEQ ID NO: 123).

Slika 14. Tretman AGP3 peptitelom je inhibirao stvaranje anti-kolagen antitela kod mišjeg CIA modela. Uzorci seruma su uzeti nedelju dana posle krajnjeg tretmana (dan 35) kao što je opisano u prethodnom tekstu. Nivo anti-kolagen II antitela u serumu je određivan pomoću ELISA analize (SEQ ID NO: 123).

Slike 15A i 15B. Tretman AGP3 peptitelom je odložio početak proteinurije i poboljšao preživljavanje kod NZB/NZVV lupus miševa. Pet meseci stari NZB/NZBVVF1 miševi skloni lupusu su tretirani i.p. 3X/nedeljno 8 nedelja sa PBS ili sa naznačenim dozama AGP3 peptitela (SEQ ID NO: 123) ili sa humanim Fc proteinima. Protein u urinu je meren jednom mesečno u toku eksperimenta pomoću Albustix reagens traka (Bayer AG).

Slike 16A i 16B pokazuju nukleinsko kiselinske i amino kiselinske sekvence poželjnog peptitela koje vezuje TALL-1 (SEQ ID NOS: 189 i 123).

Detaljan opis pronalaska

Definicija termina

Termini koji su korišćeni u ovoj specifikaciji su definisani na sledeći način, osim ukoliko nije na drugi način ograničeno u posebnim slučajevima.

Opšte definicije

Termin "obuhvata" označava da jedinjenje može uključivati dodatne amino kiseline na bilo kom ili oba N- ili C- terminusa date sekvence. Naravno, ove dodatne amino kiseline ne bi trebalo da značajnije utiču na dejstvo jedinjenja.

Pored toga, fiziološki prihvatljive soli jedinjenja ovog pronalaska su takođe ovde obuhvaćene. Termin "fiziološki prihvatljive soli" se odnosi na bilo koje soli koje su poznate ili kasnije otkrivene kao farmaceutski prihvatljive. Neki specifični primeri su: acetat; trifluoroacetat; halogeni vodonici, kao što su hidrohlorid i bromhidrat; sulfat; citrat; tartarat; glikolat; i oksalat.

Amino kiseline

Termin "kiseli ostatak" se odnosi na amino kiselinske ostatke u D- ili L- obliku koji poseduju bočne lance koji sadrže kisele grupe. Primeri kiselih ostataka obu hvataju D i E.

Termin "amidni ostatak" se odnosi na amino kiselinske ostatke u D- ili L- obliku koji poseduju bočne lance koji sadrže amidne derivate kiselih grupa. Primeri ovih ostataka obuhvataju N i Q.

Termin "aromatični ostatak" se odnosi na amino kiselinske ostatke u D- ili L-obliku koji poseduju bočne lance koji sadrže aromatične grupe. Primeri aromatičnih ostataka obuhvataju F, Y i W.

Termin "bazni ostatak" se odnosi na amino kiselinske ostatke u D- ili L- obliku koji poseduju bočne lance koji sadrže bazne grupe. Primeri baznih ostataka obuhvataju H, K i R.

Termin "hidrofilni ostatak" se odnosi na amino kiselinske ostatke u D- ili L-obliku koji poseduju bočne lance koji sadrže polarne grupe. Primeri hidrofilnih ostataka obuhvataju C, S, T, N i Q.

Termin "nefunkcionalni ostatak" se odnosi na amino kiselinske ostatke u D- ili L- obliku kojima nedostaju kisele, bazne, ili aromatične grupe. Primeri nefunkcionalnih amino kiselinskih ostataka obuhvataju M, G, A, V, I, L i norleucin (Nle).

Termin "neutralni hidrofobni ostatak" se odnosi na amino kiselinske ostatke u D- ili L- obliku kojima nedostaju bazne, kisele, ili polarne grupe. Primeri neutralnih hidrofobnih amino kiselinskih ostataka obuhvataju A, V, L, I, P, W, M i F.

Termin "polarni hidrofobni ostatak" se odnosi na amino kiselinske ostatke u D-ili L- obliku koji poseduju bočne lance koji sadrže polarne grupe. Primeri polarnih hidrofobnih amino kiselinskih ostataka obuhvataju T, G, S, Y, C, Q i N.

Termin "hidrofobni ostatak" se odnosi na amino kiselinske ostatke u D- ili L-obliku koji poseduju bočne lance kojima nedostaju bazne ili kisele grupe. Primeri hidrofobnih amino kiselinskih ostataka obuhvataju A, V, L, I, P, W, M, F, T, G, S, Y, C, Q i N.

Peptidi

Termin "peptid" se odnosi na molekule sa 1 do 40 amino kiselina, poželjno sa molekulima od 5 do 20 amino kiselina. Primeri peptida mogu da sadrže TALL-1 - modulirajući domen molekula koji se javlja u prirodi ili koji sadrži nasumično izabrane sekvence.

Termin "nasumično izabran" koji je ovde korišćen u odnosu na peptidne sekvence, odnosi se na u potpunosti nasumične sekvence (npr., izabrane postupcima fagnog prikaza ili pomoću RNK-peptidnog skrininga) i sekvence u kojima je jedan ili više ostataka molekula koji se javljaju u prirodi zamenjeno sa amino kiselinskim ostatkom koji se ne javlja u tom položaju kod molekula koji se javlja u prirodi. Primeri postupaka za identifikaciju peptidnih sekvenci obuhvataju fagni prikaz, E. coli prikaz, ribozomski prikaz, RNK-peptidni skrining, hemijski skrining i tome slično.

Termin "domen koji modulira TALL-1" se odnosi na bilo koju amino kiselinsku sekvencu koja se vezuje za TALL-1 i obuhvata sekvence koje se javljaju u prirodi ili nasumično izabrane sekvence. Primeri domena koji moduliraju TALL-1 se mogu identifikovati ili izvesti pomoću fagnog prikaza ili pomoću drugih postupaka koji su ovde pomenuti.

Termin "antagonist TALL-1" se odnosi na molekul koji se vezuje za TALL-1 i povećava ili smanjuje jedan ili više analiziranih parametara suprotno efektu koji ima cela dužina nativnog TALL-1 na ove parametre. Takvo dejstvo se može odrediti, na primer, pomoću takvih analiza kao što je opisano u delu nazvanom "Biological activitv of AGP-3" u delu Materials & Methods prijave patenta pod naslovom, "TNF-RELATED PROTEINS", WO 00/47740, objavljen 17. avgusta 2000.

Nosači i peptitela

Termin "nosač" se odnosi na molekul koji sprečava razlaganje i/ili produžava polu-život, smanjuje toksičnost, smanjuje imunogenost, ili pojačava biološko dejstvo terapeutskog proteina. Primeri nosača obuhvataju Fc domen (koji je poželjan) kao i linearni polimer (npr., polietilenglikol (PEG), polilizin, dekstran, itd.); polimer sa granatim lancem (pogledati, na primer, U.S. Patent No. 4, 289,872 za Denkenvvalter et al., objavljena 15. septembra 1981; 5,229,490 za Tam, objavljena 20. jula 1993; WO 93/21259 od strane Frechet et al., publikovana 28. oktobra 1993); lipid; holesterol grupa (kao što je steroid); ugljeni hidrat ili oligosaharid (npr., dekstran); bilo koji prirodni ili sintetički protein, polipeptid ili peptid koji se vezuje za receptor «za spašavanje«; albumin, uključujući humani serum albumin (HSA), leucin «rajsferšlus» domen i druge takve proteine i fragmente proteina. Nosači su dodatno opisani u daljem tekstu.

Termin "nativni Fc" se odnosi na molekul ili sekvencu koja sadrži sekvencu ne-antigen-vezujućeg fragmenta koji nastaje digestijom celog antitela, bilo u monomernom ili multimernom obliku. Originalni imunoglobulinski izvor nativnog Fc je poželjno humanog porekla i može biti bilo koji od imunoglobulina, iako su poželjni lgG1 i lgG2. Nativni Fc su stvoreni od monomernih polipeptida koji mogu biti vezani u dimernim ili multimernim oblicima kovalentnom (tj., disulfidnim vezama) i nekovalentnim vezama. Broj intermolekulskih disulfidnih veza između monomernih podjedinica nativnih Fc molekula se kreće u opsegu od 1 do 4 u zavisnosti od klase (npr., IgG, IgA, IgE) ili podklase (npr., lgG1, lgG2, lgG3, lgA1, lgA2). Jedan primer nativnog Fc je disulfidno-vezani dimer nastao papainskim razlaganjem IgG (pogledati Ellison et al. (1982), Nucleic Acids Res. 10: 4071-9). Termin "nativni Fc" kao što je ovde korišćen je generički za monomerne, dimerne i multimerne oblike.

Termin "varijanta Fc" se odnosi na molekul ili sekvencu koji je modifikovan iz nativnog Fc, ali još uvek sadrži vezujuće mesto za receptor «za spasavanje», FcRn. Međunarodne prijave WO 97/34631 (objavljena 25. septembra 1997.) i WO 96/32478 opisuju primere varijanti Fc, kao i interakcije sa receptorom «za spasavanje» su ovim uključene u celini na osnovu reference. Prema tome, termin "varijanta Fc" obuhvata molekul ili sekvencu koji su humanizovani od nativnog Fc koji nije humanog porekla. Dalje, nativni Fc sadrži mesta koja se mogu ukloniti jer obezbeđuju strukturne karakteristike ili biološko dejstvo koji nisu potrebni fuzionisanim molekulima ovog pronalaska. Prema tome, termin "varijanta Fc" obuhvata molekul ili sekvencu kojima nedostaje jedno ili više nativnih Fc mesta ili ostataka koji utiču na ili su uključeni u (1) formiranje disulfidne veze, (2) inkompatibilnost sa izabranom ćelijom domaćinom (3) N-terminalnu heterogenost usled ekspresije u izabranoj ćeliji domaćinu, (4) glikozilaciju, (5) interakciju sa komplementom, (6) vezivanje za Fc receptor koji nije receptor «za spašavanje«, ili (7) ćelijsku citotoksičnost koja je zavisna od antitela (ADCC). Varijante Fc su detaljnije opisane u daljem tekstu.

Termin "Fc domen" obuhvata molekule i sekvence nativnog Fc i varijanti Fc kao što je definisano u prethodnom tekstu. Kao što je slučaj i sa varijantama Fc i nativnim Fc, termin "Fc domen" obuhvata molekule u monomernom ili multimernom obliku, bilo da je digestijom dobijen od celog antitela ili je proizveden na neki drugi način.

Termin "multimer" kao što je primenjeno za Fc domene ili molekule koji sadrže Fc domene se odnosi na molekule koji imaju dva ili više polipeptidna lanca vezana kovalentnim, nekovalentnim, ili i kovalentnim i nekovalentnim interakcijama. Molekuli IgG u tipičnom slučaju formiraju dimere; IgM, pentamere; IgD, dimere; i IgA, monomere, dimere, trimere i tetramere. Multimeri se mogu formirati korišćenjem sekvence i rezultirajućeg dejstva nativnog Ig izvora Fc ili derivatizacijom (kao što je definisano u daljem tekstu) takvog nativnog Fc.

Termin "dimer" kao što je primenjen za Fc domene ili molekule koji obuhvata Fc domene se odnosi na molekule koji imaju dva polipeptidna lanca vezana kovalentno ili nekovalentno. Prema tome, primeri dimera unutar delokruga ovog pronalaska su kao što je prikazano na Slici 1.

Termini "derivatizacija" i "derivat" ili "derivatizovan" obuhvataju procese i nastala jedinjenja respektivno kod kojih (1) jedinjenje ima cikličan deo; na primer, unakrsno vezivanje između cisteinil ostataka unutar jedinjenja; (2) jedinjenje je unakrsno vezano ili ima unakrsno-vezujuće mesto; na primer, jedinjenje ima cisteinil ostatak i prema tome formira unakrsno vezane dimere u kulturi iliin vivo;(3) jedna ili više peptidil veza je zamenjena ne-peptidil vezom; (4) N-terminus je zamenjen sa - NRR<1>, NRC(0)R<1>, -NRC(O)0R<1>, -NRS(02)R<1>, -NHC(0)NHR, sukcinimid grupom, ili supstituisan ili neuspstituisan benziloksikarbonil-NH-, gde su R i R<1>i supstituenti prstena definisani u daljem tekstu; (5) C-terminus je zamenjen sa -C(0)R<2>ili sa - NR<3>R<4>gde suR<2>,R<3>i R<4>kao što je definisano u daljem tekstu; i (6) jedinjenja u kojima su pojedinačne amino kiselinske grupe modifikovane tretmanom sa agensima koji su sposobni da reaguju sa izabranim bočnim lancima ili terminalnim ostacima. Derivati su dodatno opisani u daljem tekstu.

Termini "peptitelo" i "peptitela" se odnose na molekule koji sadrže Fc domen i najmanje jedan peptid. Takva peptitela mogu biti multimeri ili dimeri ili njihovi fragmenti i mogu biti derivatizovani. U ovom pronalasku, molekuli formula II do VI su peptitela kada je V<1>Fc domen.

Struktura jedinjenja

Uopšteno. Pronalazači su identifikovali sekvence koje su sposobne da se vežu za TALL-1 i da moduliraju njegovo biološko dejstvo. Ove sekvence se mogu modifikovati pomoću tehnika koje su pomenute u prethodnom tekstu pomoću kojih jedna ili više amino kiselina mogu biti promenjene uz održavanje ili čak poboljšanje afiniteta za vezivanje peptida.

U kompozicijama materijala koji je pripremljen u skladu sa ovim pronalaskom, peptid (peptidi) može biti vezan za nosač preko N-terminusa ili C-terminusa peptida. Bilo koji od ovih peptida može biti vezan u tandemu (tj., sekvencijalno), sa ili bez linkera. Prema tome, nosač-peptid molekuli ovog pronalaska se mogu opisati sledećom formulom:

II

gde:

V<1>je nosač (poželjno Fc domen);

svakoX<1>i X<2>je nezavisno izabrano od -(L<1>)c-P<1>,-(L1)c-P<1>-(L<2>)d-P<2>, -(L<1>)c-P<1->

(L<2>)d-P<2->(L<3>)e-P<3>i -(L<1>)c-P<1->(L<2>)d-P<2->(L<3>)e-P<3->(L<4>)f-P<4.>

Svako P1, P<2>,P<3>i P<4>je nezavisna sekvenca domena koji modulira TALL-1, kao što su one sekvence Formula l(a) do l(i);

Svako L1, L<2>,L<3>i L<4>je nezavisno linker; i

Svako a, b, c, d, e i f je nezavisno 0 ili 1, uz uslov da je najmanje jedan od a i b 1.

Prema tome, jedinjenje II obuhvata poželjna jedinjenja sledećih formula

i njegove multimere gde je V<1>Fc domen i vezan je za C-terminus A<1>; i njegove multimere gde je V<1>Fc domen i vezan je na N-terminusu A<2>; i njegove multimere gde je V Fc domen i vezan je na N-terminusu -(L.1)c-P1;

i njegove multimere gde jeV<1>Fc domen i vezan je na N-terminusu -L1-P1-L<2->P<2>;

Peptidi. Peptidi ovog pronalaska su korisni kao peptidi koji moduliraju TALL-1 ili kao domeni koji moduliraju TALL-1 u molekulima formula II do VI. Molekuli ovog pronalaska koji sadrže te peptidne sekvence se mogu pripremiti pomoću postupaka koji su poznati u praksi.

Poželjne peptidne sekvence su sekvence gorenavedenih formula l(a) koje imaju supstituente identifikovane u daljem tekstu.

Poželjne peptidne sekvence su date u Tabeli 2 ispod.

Naznačeno je da poznati receptori za TALL-1 imaju izvesnu homoligiju u sekvencama sa poželjnim peptidima:

Bilo koji peptid koji sadrži cisteinil ostatak može biti unakrsno vezan sa drugim peptidom koji sadrži Cys, od kojih jedan ili oba mogu biti vezana za nosač. Bilo koji peptid koji ima više od jednog Cys ostatka može takođe da formira intrapeptidnu disulfidnu vezu. Bilo koji od ovih peptida može biti derivatizovan kao što je opisano u daljem tekstu.

Dodatne korisne peptidne sekvence mogu nastati iz konzervativnih i/ili ne-konzervativnih modifikacija amino kiselinskih sekvenci iz Tabele 2.

Konzervativne modifikacije će proizvesti peptide koji imaju funkcionalne i hemijske osobine slične onima kod peptida od koga su stvarane takve modifikacije. Nasuprot tome, značajne modifikacije u funkcionalnim i/ili hemijskim osobinama peptida se mogu postići izborom susptitucija u amino kiselinskoj sekvenci koje se značajno razlikuju po njihovom efektu na održavanje (a) strukture molekularne osovine u oblasti supstitucije, na primer, kao ploča ili heliks konformacija, (b) naboja ili hidrofobnosti molekula na ciljnom mestu, ili (c) veličine molekula.

Na primer, "konzervativna amino kiselinska supstitucija" može obuhvatati supstituciju nativnog amino kiselinskog ostatka sa nenativnim ostatkom tako da to ima malo ili nimalo efekta na polarnost ili naelektrisanje amino kiselinskog ostatka na toj poziciji. Dalje, bilo koji nativni ostatak u polipeptidu se takođe može supstituisati sa alaninom, kao što je prethodno opisano za "alanine scanning mutagenesis"

(pogledati, na primer, MacLennan et al., 1998, Acta Phvsiol. Scand. Suppl. 643: 55-67; Sasaki et aj., 1998, Adv. Biophvs. 35: 1-24, u kojima se razmatra alanin skening mutageneza).

Poželjne amino kiselinske supstitucije (bilo konzervativne ili ne-konzervativne) mogu odrediti stručna lica onda kada su takve supstitucije poželjne. Na primer, amino kiselinske supstitucije se mogu upotrebiti za identifikaciju važnih ostataka peptidne sekvence, ili za povećanje ili smanjenje afiniteta peptida ili molekula nosač-peptid (pogledati prethodne formule) koji su ovde opisani. Primeri amino kiselinskih supstitucija su dati u Tabeli 3.

U izvesnim oblicima, konzervativne amino kiselinske supstitucije takođe obuhvataju i amino kiselinske ostatke koji se ne javljaju u prirodi koji se u tipičnom slučaju inkorporišu pre hemijskom sintezom peptida nego sintezom u biološkim sistemima.

Kao što je naznačeno u gorenavedenom delu "Definicija termina", ostaci koji se javljaju u prirodi se mogu podeliti na klase na osnovu opštih osobina bočnog lanca koje mogu biti korisne za modifikacije sekvence. Na primer, ne-konzervativne supstitucije mogu da obuhvate zamenu člana jedne od ovih klasa sa članom iz druge klase. Takvi supstituisani ostaci se mogu uvesti u regione peptida koji su homologi sa ne-humanim ortolozima, ili u ne-homologe regione molekula. Pored toga, moguće je stvarati modifikacije korišćenjem P ili G u cilju delovanja na orijentaciju lanca.

Kod stvaranja takvih modifikacija, može se razmatrati hidropatski indeks amino kiselina. Svakoj amino kiselini je dodeljen hidropatski indeks na osnovu njihove hidrofobnosti i osobina naelektrisanja, a to su: izoleucin (+4.5); valin (+4.2); leucin (+3.8); fenilalanin (+2.8); cistein/cistin (+2.5); metionin (+1.9); alanin (+1.8); glicin (-0.4); treonin (-0.7); serin (-0.8); triptofan (-0.9); tirozin (-1.3); prolin (-1.6); histidin (-3.2); glutamat (-3.5); glutamin (-3.5); aspartat (-3.5); asparagin (-3.5); lizin (-3.9); i arginin (-4.5).

Važnost hidropatskog amino kiselinskog indeksa u određivanju interaktivne biološke funkcije proteina priznato je u tehnici. Kyte et al., J. Mol. Biol., 157: 105-131

(1982). Poznato je da izvesne amino kiseline mogu biti supstituisane sa drugim amino kiselinama koje imaju sličan hidropatski indeks ili skor i da protein i pored te supstitucije zadrži sličnu biološku aktivnost. Kod uvođenja promena zasnovanih na hidropatskom indeksu, poželjna je supstitucija amino kiselina čiji su hidropatski indeksi u okviru ±2, posebno poželjne suptitucije amino kiselina su one koje se nalaze unutar ±1, a one koje su unutar ±0.5 su čak poželjnije.

U tehnici se takođe podrazumeva da se supstitucija sličnih amino kiselina može efikasno izvesti na osnovu hidrofilnosti. Najveća lokalna prosečna hidrofilnost proteina, uslovljena hidrofilnošću njegovih susednih amino kiselina, u korelaciji je sa njegovom imunogenim i antigenim osobinama, tj., sa biološkim svojstvima proteina.

Sledeće vrednosti hidrofilnosti su dodeljene amino kiselinskim ostacima: arginin (+3.0); lizin (+3.0); aspartat (+3.0 ± 1); glutamat (+3.0 ± 1); serin (+0.3); asparagin (+0.2); glutamin (+0.2); glicin (0); treonin (-0.4); prolin (-0.5 ± 1); alanin (-0.5); histidin (-0.5); cistein (-1.0); metionin (-1.3); valin (-1.5); leucin (-1.8); izoleucin (-1.8); tirozin (-2.3); fenilalanin (-2.5); triptofan (-3.4). Kod promena na osnovu sličnih vrednosti hidrofilnosti, poželjna je supstitucija amino kiselina čije su vrednosti hidrofilnosti unutar ±2, posebno poželjne susptitucije amino kiselina su one koje se nalaze unutar ±1, a one koje su unutar ±0.5 su čak poželjnije. Moguće je takođe identifikovati epitope iz primarnih amino kiselinskih sekvenci na osnovu hidrofilnosti. Ovi regioni se takođe označavaju i kao "osnovni regioni epitopa".

Iskusan tehničar će biti u stanju da odredi pogodne varijante polipeptida kao što je dato u gorenavedenim sekvencama korišćenjem dobro poznatih tehnika. Za identifikaciju pogodnih oblasti molekula koje se mogu promeniti bez poništavanja aktivnosti, tehničar se može usredsrediti na oblasti za koje se smatra da nisu važne za aktivnost. Na primer, kada su poznati slični polipeptidi sa sličnim aktivnostima iz iste vrste ili druge vrste, tehničar može da uporedi amino kiselinsku sekvencu peptida sa sličnim peptidima. Sa takvim poređenjem, moguće je identifikovati ostatke i delove molekula koji su konzervativni među sličnim peptidima. Smatra se da je manja verovatnoća da promene u regionima peptida koji nisu konzervativni u odnosu na slične peptide štetno utiču na biološku aktivnost i/ili strukturu peptida. Tehničaru je takođe poznato da je, čak i u relativno konzervativnim regionima, moguća supstitucija hemijski sličnih amino kiselina sa ostacima koji se javljaju u prirodi uz istovremeno zadržavanje dejstva (supstitucije konzervativnog amino kiselinskog ostatka). Prema tome, čak i oblasti koje mogu biti važne za biološko dejstvo ili za strukturu mogu biti podvrgnute supstituciji konzervativnih amino kiselina bez destrukcije biološke aktivnosti ili bez štetnog uticaja na strukturu peptida.

Pored toga, tehničar može uzeti u obzir studije funkcije-strukture identifikacijom ostataka u sličnim peptidima koji su važni za aktivnost ili strukturu. U pogledu takvog poređenja, moguće je da se predvidi značaj amino kiselinskih ostataka u peptidu koji odgovaraju amino kiselinskim ostacima koji su značajni za aktivnost ili strukturu u sličnim peptidima. Tehničar može izabrati hemijski slične amino kiselinske supstitucije za takve predviđene značajne amino kiselinske ostatke peptida.

Tehničar takođe može analizirati trodimenzionalnu strukturu i amino kiselinsku sekvencu u odnosu na tu strukturu kod sličnih polipeptida. U pogledu te informacije, tehničar može da predvidi položaj amino kiselinskih ostataka peptida u odnosu na njegovu trodimenzionalnu strukturu. Tehničar se može opredeliti za izostavljanje radikalnih promena amino kiselinskih ostataka koji su predviđeni da budu na površini proteina, s obzirom da takvi ostaci mogu biti uključeni u važne interakcije sa drugim molekulima. Takođe, tehničar može da stvara test varijante koje sadrže pojedinačnu amino kiselinsku supstituciju na svakom poželjnom amino kiselinskom ostatku. Varijante se zatim mogu procenjivati korišćenjem analiza aktivnosti koje su poznate tehničarima. Takvi podaci se mogu upotrebiti za sakupljanje informacija o pogodnim varijantama. Na primer, ako se pronađe da promena određenog amino kiselinskog ostatka rezultira u nedostatku, do neželjene mere smanjenoj ili nepogodnoj aktivnosti, varijante sa takvom promenom bi bile izbegavane. Drugim recima, na osnovu informacija koje su sukapljene iz ovih rutinskih eksperimenata, tehničar može lako da odredi amino kiseline gde bi trebalo izbegavati dodatne supstitucije bilo same ili zajedno sa drugim mutacijama.

Određen broj naučnih publikacija je posvećen predviđanju sekundarne strukture. Pogledati Moult J., Curr. Op. in Biotech., 7(4): 422-427 (1996), Chou et aj., Biochemistrv, 13(2): 222-245 (1974); Chou et al., Biochemistrv, 113(2): 211-222

(1974); Chou et aj., Adv. Enzvmol. Relat. Areas Mol. Biol.. 47: 45-148 (1978); Chou et ai., Ann. Rev. Biochem., 47: 251-276 i Chou et al., Biophvs. J., 26: 367-384

(1979). Takođe, sada su dostupni kompjuterski programi radi lakšeg predviđanja sekundarne strukture. Jedan postupak predviđanja sekundarne strukture je zasnovan na modelu homologije. Na primer, dva polipeptida ili proteina koji imaju identičnost sekvenci veću od 30%, ili sličnost veću od 40% često imaju slične strukturalne topologije. Skoriji rast baze podataka proteinske strukture (PDB) je obezbedio povećanje predvidljivosti sekundarne strukture, uključujući potencijalni broj zavoja unutar polipeptidne ili proteinske strukture. Pogledati Holm et al., Nucl. Acid Res., 27(1): 244-247 (1999). Sugerisano je da (Brenner et al., Curr. Op. Struct. Biol., 7(3): 369-376 (1997)) postoji ograničen broj zavoja u datom polipeptidu ili proteinu i da kada je rešen kritičan broj struktura, predviđanje strukture će ponovo značajno dobiti na tačnosti.

Dodatni postupci za predviđanje sekundarne strukture obuhvataju "threading"

(Jones, D., Curr. Opin. Struct. Biol., 7(3): 377-87 (1997); Sippl et aj., Structure, 4(1): 15-9 (1996)), "analize profila" (Bowie et al., Science, 253: 164-170 (1991); Gribskov et aj., Meth. Enzvm., 183: 146-159 (1990); Gribskov et aj., Proc. Nat. Acad. Sci.. 84(13): 4355-8 (1987)) i "evoluciona veza" (pogledati Home, supra i Brenner, supra).

Nosači. Ovaj pronalazak zahteva prisustvo najmanje jednog nosača (V<1>) koji je vezan za peptid preko N-terminusa, C-terminusa ili bočnog lanca jednog od amino kiselinskih ostataka. Višestruki nosači se takođe mogu koristiti; npr., Fc na svakom terminusu ili Fc na terminusu i PEG grupa na drugom terminusu ili bočnom lancu. Primeri nosača obuhvataju: • Fc domen; • druge proteine, polipeptide, ili peptide koji su sposobni da se vežu za receptor "za spašavanje"; • humani serum albumin (HAS); • leucin "rajsferšlus" (LZ) domen; • polietilenglikol (PEG), uključujući 5 kD, 20 kD i 30 kD PEG, kao i drugi polimeri; • dekstran;

i drugi molekuli koji su poznati u tehnici da bi se obezbedio produženi polu-život i/ili zaštita od proteolitičkog razlaganja ili klirensa.

Fc domen je poželjan nosač. Fc domen može biti fuzionisan za N ili C terminuse peptida ili i na N i na C terminusu. Poželjna je fuzija za N terminus.

Kao što je naznačeno u prethodnom tekstu, varijante Fc su pogodni nosači unutar delokruga ovog pronalaska. Nativni Fc može biti znatno modifikovan tako da formira varijantu Fc u skladu sa ovim pronalaskom, uz uslov da je vezivanje za receptor "za spašavanje" zadržano; polgedati, na primer WO 97/34631 i WO 96/32478. Kod takvih varijanti Fc, moguće je ukloniti jedno ili više mesta nativnog Fc koja obezbeđuju strukturne osobine ili funkcionalnu aktivnost koja nije potrebna za fuzionisane molekule ovog pronalaska. Ova mesta je moguće ukloniti, na primer, supstitucijom ili delecijom ostataka, insercijom ostataka u mesto, ili odsecanjem delova koji sadrže mesto. Umetnuti ili supstituisani ostaci mogu takođe biti zamenjene amino kiseline, kao što su peptidomimetici ili D-amino kiseline. Varijante Fc mogu biti potrebne iz određenih razloga, od kojih su neki opisani u daljem tekstu. Primeri varijanti Fc obuhvataju molekule i sekvence u kojima: 1. Uklonjena su mesta koja su uključena u formiranje disulfidne veze. Takvim uklanjanjem se može izbeći reakcija sa drugim proteinima koji sadrže cistein koji se nalaze u ćeliji domaćinu koja je upotrebljena za proizvodnju molekula pronalaska. Zbog ovoga, segment na N-terminusu koji sadrži cistein može biti odsečen ili cisteinski ostaci mogu biti deletirani ili supstituisani sa drugim amino kiselinama (npr., alanil, seril). Posebno, moguće je iseći N-terminalni segement SEQ ID NO: 2 od 20 amino kiselina. Čak i kada su cisteinski ostaci uklonjeni, pojedinačni lanac domena Fc može još uvek da formira dimerni

domen Fc koji se održava kompaktnim ne-kovalentno.

2. Nativni Fc je modifikovan tako da bi bio kompatibilniji sa izabranom ćelijom domaćinom. Na primer, moguće je ukloniti PA sekvencu blizu N-terminusa tipičnog nativnog Fc, ta sekvenca se može prepoznati pomoću digestivnog enzima kod E. coli kao što je proliniminopeptidaza. Takođe je moguće da se doda N-terminalni metioninski ostatak, posebno kada je molekul eksprimiran rekombinantno u bakterijskoj ćeliji kao što je E. coli. Fc domen SEQ ID NO: 2

je jedna takva varijanta Fc.

3. Deo sa N-terminusa nativnog Fc je uklonjen da bi se sprečila N-terminalna heterogenost kada se eksprimira u izabranoj ćeliji domaćinu. Radi ovoga, moguće je deletirati bilo koji od prvih 20 amino kiselinskih ostataka na N-terminusu, posebno one na pozicijama 1, 2, 3, 4 i 5. 4. Uklonjeno je jedno ili više glikozilacionih mesta. Ostaci koji su u tipičnom slučaju glikozilovani (npr. asparagin) mogu da daju citolitički odgovor. Takvi ostaci mogu biti deletirani ili supstituisani sa neglikozilovanim ostacima (npr.

alanin).

5. Uklonjena su mesta koja su uključena u interakciju sa komplementom, kao što je C1q vezujuće mesto. Na primer, moguće je deletirati ili supstituisati EKK sekvencu humanog lgG1. Aktivacija komplementa ne mora biti povoljan za

molekule ovog pronalaska i može se izbeći sa takvom varijantom Fc.

6. Uklonjena su mesta koja utiču na vezivanje za Fc receptore, osim receptora "za spašavanje". Nativni Fc može imati mesta za interakciju sa izvesnim belim krvnim ćelijama, a ta mesta nisu potrebna za fuzionisane molekule ovog

pronalaska tako da se mogu ukloniti.

7. ADCC mesto je uklonjeno. ADCC mesta su poznata u praksi; pogledati, na primer, Molec. Immunol. 29(5): 633-9 (1992) u pogledu na ADCC mesta u lgG1. Ova mesta, takođe, nisu potrebna za fuzione molekule ovog pronalaska tako da se mogu ukloniti. 8. Kada je nativni Fc izveden od ne-humanog antitela, nativni Fc može biti humanizovan. U tipičnom slučaju, da bi se humanizovao nativni Fc, potrebno je supstituisati izabrane ostatke u ne-humanom nativnom Fc sa ostacima koji se mogu normalno naći u humanom nativnom Fc. Tehnike za humanizaciju antitela su dobro poznate u tehnici.

Poželjne varijante Fc obuhvataju sledeće. U SEQ ID NO: 2 (Slika 3), leucin na poziciji 15 može biti supstituisan sa glutamatom; glutamat na položaju 99, sa alaninom; i lizini na pozicijama 101 i 103, sa alaninima. Pored toga, jedan ili više tirozinskih ostataka mogu biti zamenjeni fenilalanin ostacima.

Alternativan nosač bi bio protein, polipeptid, peptid, antitelo, fragment antitela, ili mali molekul (npr., peptidomimetičko jedinjenje) koji su sposobni da se vežu za receptor "za spašavanje". Na primer, moguće je kao nosač upotrebiti polipeptid kao što je opisano u U.S. Pat. No. 5,739,277, objavljenoj 14. aprila 1998 za Presta et al. Peptidi bi takođe mogli biti izabrani fagnim prikazom ili RNK-peptidnim skriningom za vezivanje za FcRn receptor "za spašavanje". Takva jedinjenja koja se vezuju za receptor "za spašavanje" su takode obuhvaćena terminom "nosač" i uključena su u ovaj pronalazak. Takvi nosači bi trebalo izabrati za produženi polu-život (npr., izbegavanjem sekvenci koje se prepoznaju pomoću proteaza) i smanjenja imunogenosti (npr., favorizovanjem ne-imunogenih sekvenci, kao što je otkriveno u humanizaciji antitela).

Kao što je naznačeno u prethodnom tekstu, polimerni nosači se takođe mogu upotrebiti za V<1>. Sada su dostupna različita sredstva za vezivanje hemijskih grupa koja su korisna kao nosači, pogledati, npr., Patent Cooperation Treaty ("PCT") International Publication No. VVO 96/11953, sa naslovom "N-Terminally Chemically Modified Protein Compositions and Methods," ovde uključena u celini na osnovu reference. Ova PCT publikacija otkriva, između ostalog, selektivno vezivanje polimera koji su rastvorljivi u vodi za N-terminus proteina.

Poželjan polimerni nosač je polietilenglikol (PEG). PEG grupa može imati bilo koju pogodnu molekulsku težinu i može biti prava ili granata. Prosečna molekulska težina PEG će poželjno biti u opsegu od oko 2 kiloDaltona ("kD") do oko 100 kD, poželjnije od oko 5 kD do oko 50 kD, najpoželjnije od oko 5 kD do oko 10 kD. PEG grupe će generalno biti vezane za jedinjenja pronalaska acilacijom ili reduktivnom alkiiacijom preko reaktivne grupe na PEG grupi (npr., aldehidna, amino, tiol, ili estarska grupa) za reaktivnu grupu na jedinjenju pronalaska (npr., aldehidna, amino, ili estarska grupa).

Korisna strategija za PEGilaciju sintetičkih peptida se sastoji u kombinovanju, preko formiranja konjugovane veze u rastvoru, peptida i PEG grupe, gde svako od njih nosi posebnu funkcionalnu grupu koje su uzajamno reaktivne. Peptidi se mogu lako pripremiti pomoću konvencionalne sinteze čvrste faze. Peptidi su "preaktivirani" odgovarajućom funkcionalnom grupom na specifičnom mestu. Prekursori su prečišćeni i potpuno karakterizovani pre reakcije sa PEG grupom. Vezivanje peptida sa PEG se obično odigrava u vodenoj fazi i lako se može pratiti pomoću analitičke HPLC reverzne faze. PEGilovani peptidi se lako mogu prečistiti pomoću preparativne HPLC i karakterizovati pomoću analitičke HPLC, amino kiselinske analize i masene spektrometrije na osnovu laserske desorpcije.

Polisaharidni polimeri su sledeći tip polimera koji je rastvorljiv u vodi, a koji se može upotrebiti za proteinske modifikacije. Dekstrani su polisaharidni polimeri koji se sastoje od pojedinačnih podjedinica glukoze koje se vezane pretežno preko 1a-6 veza. Sam dekstran je dostupan u različitim molekulskim težinama i lako se može dobiti u molekulskim težinama od oko 1 kD do oko 70 kD. Dekstran je pogodan, u vodi rastvorljiv polimer, koristan za upotrebu u ovom pronalasku kao sam nosač ili u kombinaciji sa drugim nosačem (npr., Fc). Pogledati, na primer, WP 96/11953 i VVO 96/05309. Objavljena je upotreba konjugovanog dekstrana za terapeutske ili dijagnostičke imunoglobuline; pogledati, na primer, European Patent Publication No. 0 315 456, koja je ovim uključena u celini na osnovu reference. Poželjan je dekstran od oko 1 kD do oko 20 kD kada se koristi kao nosač u skladu sa ovim pronalaskom.

Linkeri. Bilo koja grupa "linkera" predstavlja opciju. Kada je ta grupa prisutna, njena hemijska struktura nije kritična, s obzirom da ona prvenstveno služi kao spejser. Linker je poželjno napravljen od amino kiselina koje su međusobno vezane peptidnim vezama. Prema tome, u poželjnim oblicima, linker je formiran od 1 do 30 amino kiselina koje su vezane peptidnim vezama, gde su amino kiseline izabrane od 20 amino kiselina koje se javljaju u prirodi. Neke od ovih amino kiselina mogu biti glikozilovane, što je dobro poznato u tehnici. U poželjnijem obliku, 1 do 20 amino kiselina je izabrano od glicina, alanina, prolina, asparagina, glutamina i lizina. Čak poželjnije, vezujuće sredstvo je formirano od većine amino kiselina koje sterički nisu blokirane, kao što su glicin i alanin. Prema tome, poželjni likeri su poliglicini (posebno (Gly)4, (Gly)5), poli(Gly-Ala) i polialanini. Ostali specifični primeri linkera su:

Radi pojašnjenja gorenavedene nomenklature, na primer, (Gly)3Lys(Gly)4označava Gly-Gly-Gly-Lys-Gly-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO: 40). Takođe su poželjne kombinacije Gly i Ala. Linkeri koji su ovde prikazani su dati kao primer; linkeri unutar ovog pronalaska mogu biti mnogo duži i mogu obuhvatati druge ostatke.

Poželjni linkeri su amino kiselinski linkeri koji obuhvataju više od 5 amino kiselina, a pogodni linkeri imaju do oko 500 amino kiselina koje su izabrane od glicina, alanina, prolina, asparagina, glutamina, lizina, treonina, serina ili aspartata. Linkeri od oko 20 do 50 amino kiselina su najpoželjniji. Jedna grupa poželjnih linkera su linkeri sa formulom

gde je svako x<1>i x<3>nezavisno bazni ili hidrofobni ostatak i svako x<2>i x<4>je nezavisno hidrofobni ostatak. Posebno poželjni linkeri su:

Ne-peptidni linkeri su takođe mogući. Mogu se upotrebiti, na primer, alkil linkeri kao što je -NH-(CH2)5-C(0)-, gde je s=2-20. Ovi alkil linkeri se dalje mogu supstituisati sa bilo kojom ne-sterički blokiranom grupom kao što je niži alkil (npr., d-C6) niži acil, halogen (npr., Cl, Br), CN, NH2, fenil, itd. Primer ne-peptidnog linkera je PEG linker.

gde je n takvo da linker ima molekulsku težinu od 100 do 5000 kD, poželjno 100 do 500 kD. Peptidni linkeri mogu biti promenjeni tako da formiraju derivate na isti način kao što je opisano u prethodnom tekstu.

Derivati. U ovom pronalasku je takođe razmatrana derivatizacija peptidnog dela i/ili nosačkog dela jedinjenja. Takvi derivati mogu poboljšati rastvorljivost, apsorpciju, biološki polu-život i slično, jedinjenja. Grupe alternativno mogu da eliminišu ili priguše bilo koji neželjeni sporedan efekat jedinjenja i slično. Primeri derivata obuhvataju jedinjenja gde: 1. Jedinjenje ili neki njegov deo su ciklični. Na primer, peptidni deo može biti modifikovan tako da sadrži dva ili više Cys ostatka (npr., u linkeru), koji se može ciklizovati formiranjem disulfidne veze. 2. Jedinjenje je unakrsno vezano ili je osposobljeno za unakrsno vezivanje molekula. Na primer, peptidni deo može biti modifikovan tako da sadrži jedan Cys ostatak i da na taj način bude sposoban da formira intermolekulsku disulfidnu vezu sa sličnim molekulom. Jedinjenje može takođe može biti unakrsno vezano preko svog C-terminusa, kao što je to slučaj u molekulu prikazanom ispod.

U Formuli VIII, svako "V<1>" može da predstavlja u tipičnom slučaju jedan lanac Fc domena. 3. Jedna ili više peptidil [-C(0)NR-] veza je zamenjeno sa ne-peptidnim vezama. Primeri ne-peptidnih veza su -CH2- karbamat [-CH2-OC(0)NR-], fosfonat, -CH2-sulfonamid [-CH2-S(0)2NR-], urea [-NHC(0)NH-], -CH2-sekundarni amin i alkilovani peptid [-C(0)NR<6>- gde je R<6>niži alkil]. 4. N-terminus je derivatizovan. U tipičnom slučaju, N-terminus može biti acilovan ili modifikovan u supstituisani amin. Primeri N-terminalnih grupa derivata obuhvataju - NRR<1>(osim -NH2), -NRC(0)R<1>, -NRC(0)OR<1>, -NRS(0)2R<1>, -NHC(0)NHR<1>, sukcinimid ili benziloksikarbonil-NH-(CBZ-NH-), gde su svako R i R<1>nezavisno vodonik ili niži alkil i gde fenil prsten može biti supstituisan sa 1 do 3 supstituenta koji su izabrani iz grupe koja se sastoji od C-|-C4alkil, CrC4alkoksi, hloro i bromo. 5. Slobodni C-terminus je derivatizovan. U tipičnom slučaju, C-terminus je esterifikovan ili amidovan. Primeri C-terminalnih grupa derivata obuhvataju, na primer, -C(0)R<2>gde je R<2>niži alkoksi ili -NR3R<4>, gde su R<3>i R<4>nezavisno vodonik ili CrCaalkil (poželjno CrC4alkil). 6. Disulfidna veza je zamenjena sa drugom, poželjno stabilnijom, unakrsno vezanom grupom (npr., alkilen). Pogledati, npr., Bhatnagar et al. (1996), J. Med. Chem. 39: 3814-9; Alberts et aj. (1993) Thirteenth Am. Pep. Svmp..357-9. 7. Jedan ili više pojedinačnih amino kiselinskih ostataka je modifikovano. Poznato je da različiti derivatizujući agensi specifično reaguju sa izabranim bočnim lancima ili terminalnim ostacima, kao što je detaljno opisano u daljem tekstu.

Lizinil ostaci i amino terminalni ostaci mogu da reaguju sa anhidridom ćilibarne kiseline ili sa anhidridom neke druge karboksilne kiseline, koji obrće naelektrisanje lizinil ostataka. Drugi pogodni reagensi za derivatizaciju ostataka koji sadrže alfa-amino obuhvataju imidoestre kao što je metilpikolinimidat; piridoksalfosfat; piridoksal; hloroborohidrid; trinitrobenzensulfo kiselina; O-metilizourea; 2,4-pentandion; i reakcija sa glioksilatom koja je katalizovana transaminazom.

Arginil ostaci se mogu modifikovati reakcijom sa bilo kojim ili sa kombinacijom od nekoliko konvencionalnih reagenasa, uključujući fenilglioksal, 2,3-butandion, 1,2-cikloheksandion i ninhidrin. Derivatizacija arginil ostataka zahteva da se reakcija izvodi u alkalnim uslovima zbog visokog pKa funkcionalne grupe guanidina. Dalje, ovi reagensi mogu da reaguju sa grupama lizina, kao i arginin epsilon-amino grupom.

Specifične modifikacije tirozil ostataka su detaljno proučavane, sa posebnim interesom u uvođenje spektralnih oznaka u tirozil ostatke i to reakcijom sa aromatičnim diazonijum jedinjenjima ili sa tetranitrometanom. Najčešće su upotrebljavani N-acetilimidizol i tetranitrometan za formiranje O-acetiltirozil vrsta i 3-nitro derivata, respektivno.

Karboksil grupe sa bočnim lancem (aspartil ili glutamil) se mogu selektivno modifikovati reakcijom sa karbodiimidima (R'-N=C=N-R') kao što je 1-cikloheksil-3-(2-morfolinil-(4-etil) karbodiimid ili 1-etil-3-(4-azonija-4,4-dimetilpentil) karbodiimid. Dalje, aspartil i glutamil ostaci se mogu prevesti u asparaginil i glutaminil ostatke reakcijom sa amonijum jonima.

Glutaminil i asparaginil ostaci mogu biti deaminovani do odgovarajućih glutamil i aspartil ostataka. Alternativno, ovi ostaci su deaminovani pod umereno kiselim uslovima. Svaki od oblika ovih ostataka je obuhvaćen ovim pronalaskom.

Cisteinil ostaci se mogu zameniti amino kiselinskim ostacima ili drugim grupama bilo da se elimiše disulfidno vezivanje ili, suprotno, da se stabiliše unakrsno vezivanje. Pogledati, na primer, Bhatnagar et al. (1996), J. Med. Chem. 39: 3814-9.

Derivatizacija sa bifunkcionalnim agensima je korisna za unakrsno vezivanje peptida ili njihovih funkcionalnih derivata za potporni matriks koji je nerastvorljiv u vodi ili za druge makromolekularne nosače. Često korišćeni unakrsno-vezujući agensi obuhvataju, npr., 1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletan, glutaraldehid, N-hidroksisukcinimid estre, na primer, estri sa 4-azidosalicilnom kiselinom, homobifunkcionalne imidoestre, uključujući disukcinimidil estre kao što je 3,3'-ditiobis(sukcinimidilpropionat) i bifukcionalne maleimide kao što je bis-N-maleimido-1,8-oktan. Derivatizujući agensi kao što je metil-3-[(p-azidofenil)ditio]propioimidat proizvodi fotoaktivne intermedijere koji su sposobni da formiraju unakrsne veze u prisustvu svetlosti. Alternativno, reaktivni matriksi rastvorljivi u vodi kao što su ugljeni hidrati koji se aktiviraju cijanbromidom i reaktivni supstrati opisani u U.S. Pat. Nos. 3,969,287; 3,691,016; 4,195,128; 4,247,642; 4,229,537; i 4,330,440 su korišćeni za proteinsku imobilizaciju.

Ugljeno hidratne (oligosaharidne) grupe se mogu pogodno vezati za mesta koja su poznata kao glikozilaciona mesta u proteinima. Uopšteno, O-vezani oligosaharidi su vezani za serinske (Ser) ili treoninske (Thr) ostatke, dok su N-vezani oligosaharidi vezani za asparaginske (Asn) ostatke kada su oni deo sekvence Asn-X-Ser/Thr, gde X može biti bilo koja amino kiselina osim prolina. Poželjno, X je jedna od 19 amino kiselina koje se javljaju u prirodi osim prolina. Struktura N-vezanih i O-vezanih oligosaharida i šećernih ostataka je različita kod svakog tipa. Jedan od tipova šećera koji se često može naći na oba je N-acetilneuraminska kiselina (označena kao sialinska kiselina). Sialinska kiselina je obično terminalni ostatak i N-vezanih i O-vezanih oligosaharida koja zahvaljujući svom negativnom naelektrisanju može dati glikozilovanom jedinjenju kisela svojstva. Takvo mesto (mesta) se mogu inkorporisati u linker jedinjenja ovog pronalaska i u poželjnom slučaju su glikozilovana od strane ćelije u toku rekombinantne proizvodnje polipeptidnih jedinjenja (npr., u sisarskim ćelijama kao što su CHO, BHK, COS). Međutim, takva mesta se dalje mogu glikozilovati sintetičkim ili polu-sintetičkim postupcima koji su poznati u tehnici.

Druge moguće modifikacije obuhvataju hidroksilaciju prolina i lizina, fosforilaciju hidroksil grupa seril i treonil ostataka, oksidaciju atoma sumpora u Cys, metilaciju alfa-amino grupa lizinskih, argininskih i histidinskih bočnih lanaca. Creighton, Proteins: Structure and Molecule Properties (VV.H. Freeman & Co., San Francisco), pp. 79-86 (1983).

Jedinjenja ovog pronalaska mogu biti promenjena i na nivou DNK. DNK sekvenca bilo kog dela jedinjenja može biti promenjena u kodone koji su kompatibilniji sa izabranom ćelijom domaćinom. Za E. coli, koja predstavlja poželjnu ćeliju domaćina, u tehnici su poznati optimizovani kodoni. Kodoni mogu biti supstituisani da bi se eliminisala restrikciona mesta ili da bi se uključila tiha restrikciona mesta, koja mogu da pomognu u obradi DNK u izabranoj ćeliji domaćinu. Nosač, linker i peptidna DNK sekvenca se mogu modifikovati tako da obuhvate bilo koju od prethodnih promena sekvence.

Postupci za pripremanje

Jedinjenja ovog pronalaska se većinom mogu formirati u transformisanim ćelijama domaćinima korišćenjem tehnika rekombinantne DNK. Da bi se to postiglo, priprema se molekul rekombinantne DNK koji kodira peptid. Postupci za pripremanje takvih molekula DNK su takođe dobro poznati u tehnici. Na primer, sekvence koje kodiraju peptide bi se mogle iseći iz DNK korišćenjem pogodnih restrikcionih enzima. Alternativno, molekul DNK bi se mogao sintetisati korišćenjem tehnika hemijske sinteze, kao što je fosforoamidatni postupak. Takođe, moguće je upotrebiti kombinaciju ovih tehnika.

Pronalazak takođe obuhvata vektor koji je sposoban da eksprimira peptide u odgovarajućem domaćinu. Vektor sadrži molekul DNK koji kodira peptide koji su operativno povezani sa odgovarajućim sekvencama ekspresione kontrole. Dobro su poznati postupci za postizanje ovog operativnog povezivanja, bilo pre ili nakon što je molekul DNK umetnut u vektor. Sekvence ekspresione kontrole obuhvataju promotore, aktivatore, pojačivače, operatore, vezujuća mesta ribozoma, start siganle, stop signale, "cap" signale, poliadenilacione signale i druge signale koji su uključeni u kontrolu transkripcije i translacije.

Dobijeni vektor koji ima molekul DNK se koristi za transformaciju odgovarajućeg domaćina. Ova transformacija se može izvesti korišćenjem postupaka koji su dobro poznati u tehnici.

Bilo koja od velikog broja dostupnih i dobro poznatih ćelija domaćina se može upotrebiti u primeni ovog pronalaska. Izbor određenog domaćina zavisi od određenog broja faktora koji su priznati u tehnici. Oni obuhvataju, na primer, kompatibilnost sa izabranim ekspresionim vektorom, toksičnost peptida koje kodira molekul DNK, stopu transformacije, lakoću izdvajanja peptida, ekspresione karakteristike, biološku bezbednost i troškove. Ravnoteža ovih faktora mora biti prožeta razumevanjem da ne mogu svi domaćini da budu podjednako efikasni u ekspresiji određene sekvence DNK. U okviru ovih opštih smernica, korisni mikrobijalni domaćini obuhvataju bakterije (kao što je E. coli sp.), kvasce (kao što je Saccharomvces sp.) i druge gljivice, insekte, biljke, sisarske (uključujući humane) ćelije u kulturi, ili druge domaćine koji su poznati u tehnici.

Sledeće, transformisani domaćin je kultivisan i prečišćen. Ćelije domaćini se mogu kultivisati pod konvencionalnim fermentacionim uslovima tako da se eksprimiraju željena jedinjenja. Takvi fermentacioni uslovi su dobro poznati u tehnici. Konačno, peptidi su prečišćeni iz kulture pomoću postupaka koji su dobro poznati u tehnici.

Jedinjenja se takođe mogu pripremiti pomoću sintetičkih postupaka. Na primer, mogu se koristiti tehnike sinteze čvrste faze. Pogodne tehnike su dobro poznate u praksi i obuhvataju one koje su opisane u Merrifield (1973), Chem. Polvpeptides, pp. 335-61 (Katsovannis and Panavotis eds.); Merrifield (1963), J. Am. Chem. Soc. 85: 2149; Daviš et al. (1985), Bochem. Intl. 10: 394-414; Stewart and Young (1969), Solid Phase Peptide Svnthesis: U.S. Pat. No. 3,941,763; Finn et al.

(1976), The Proteins (3rd ed.) 2: 105-253; i Erickson et al. (1976), The Proteins (3rd ed.) 2: 257-527. Sinteza čvrste faze je poželjna tehnika pripremanja pojedinačnih peptida s obzirom da je najefikasniji postupak u pogledu cene pripremanja malih peptida.

Jedinjenja koja sadrže derivatizovane peptide ili koja sadrže ne-peptidne grupe se mogu sitetisati pomoću dobro poznatih tehnika organske hernije.

Upotreba jedinjenja

Jedinjenja ovog pronalaska mogu biti posebno korisna u lečenju autoimunih bolesti posredovanih B ćelijama. Posebno, jedinjenja ovog pronalaska mogu biti korisna u lečenju, prevenciji, ublažavanju, dijagnostifikovanju ili prognozi lupusa, uključujući sistemski lupus ervthematosus (SLE) i bolesti i stanja koji su povezani sa lupusom. Druge poželjne indikacije obuhvataju kancere posredovane B ćelijama, uključujući limfom B-ćelija.

Jedinjenja ovog pronalska se takođe mogu koristiti za tretman inflamatornih stanja zglobova. Inflamatorna stanja zglobova su hronične bolesti zglobova koje nanose bol i onesposobljavaju, do različitog stepena, milione ljudi širom sveta. Reumatoidni artritis je bolest zglobova kod koje invazivno vezivno tkivo zvano panus, nastalo od sinovijalne membrane, polako nagriza hrskavicu i kost. Bolest može obuhvatiti periartikulame strukture kao što su burza, omotači tetiva i tetive kao i ekstraartikularna tkiva kao što su potkožno tkivo, kardiovaskulrni sistem, pluća, slezina, limfni čvorovi, skeletni mišići, nervni sistem (centralni i periferni) i oči (Silberberg (1985), Anderson's Pathologv, Kissane (ed.), II: 1828). Osteoartritis je česta bolest zglobova koju karakterišu degenerativne promene u zglobnoj hrskavici i reaktivna proliferacija kosti i hrskavice oko zgloba. Osteoartritis je ćelijski posredovan aktivan proces i može nastati kao rezultat neadekvatnog odgovora hondrocita na kataboličke i anaboličke stimuluse. Promene u nekim molekulima matriksa zglobne hrskavice se prema navodima javljaju kod ranog osteoartritisa (Thonar et aj. (1993), Rheumatic disease clinics of North America, Moskowitz (ed.), 19: 635-657 i Shinmei et aj. (1992), Arthritis Rheum., 35: 1304-1308). Veruje se da su TALL-1, TALL-1 R i njihovi modulatori korisni u lečenju ovih i srodnih stanja.

Jedinjenja ovog pronalaska takođe mogu biti korisna u lečenju određenog broja dodatnih bolesti i poremećaja, uključujući: • akutni pankreatitis; • ALS; • Alchajmerovu bolest; • astmu; • aterosklerozu; • autoimunu hemolitičku anemiju; • kancer, posebno kanceri koji su povezani sa B ćelijama; • kaheksiju/anoreksiju; • hronični sindrom zamora; • cirozu (npr., primarna bilijarna ciroza); • dijabetes (npr., insulinski dijabetes); • groznicu; • glomerulonefritis, uključujući IgA glomerulonefritis i primarni glomerulonefritis; • Goodpasture-ov sindrom; • Guillain-Barre sindrom; • graft vs domaćin bolest; • Hashimoto-ov tiroiditis; • hemoragički šok; • hiperalgeziju; • inflamatornu bolest creva; • inflamatorna stanja zglobova, uključujući osteoartritis, psorijatički artritis i reumatoidni artritis; • inflamatorna stanja koja nastaju kao posledica iščašenja, uganuća, oštećenja hrskavice, traume, ortopedske operacije, infekcije ili neke druge bolesti ili procesa; • insulin-zavisni diabetes mellitus; • ishemičnu povredu, uključujući cerebralnu ishemiju (npr., povredu mozga kao rezultat traume, epilepsije, krvarenja ili šloga, gde svaki od ovih uzroka može voditi ka neurodegeneraciji); • smanjenje sposobnosti učenja; • bolesti pluća (npr., ARDS); • multipni mijelom; • multipnu sklerozu; • Mvasthenia gravis; • mijelogene (npr., AML i CML) i druge leukemije; • miopatije (npr., mišićni metabolizam proteina, naročito u sepsi); • neurotoksičnost (npr., kao što je ona indukovana HlV-om); • osteoporozu; . bol; • Parkinsonovu bolest; • Pemphigus; • polimiozitis/dermatomiozitis; • inflamaciju pluća, uključujući autoimunu inflamciju pluća; • prevremeni porođaj; • psorijazu; • Reiter-ovu bolest; • reperfuzionu povredu; • septički šok; • sporedne efekte nastale kao posledica terapije zračenjem; • Sjogren-ov sindrom; • poremećaj sna; • bolest temporalnog mandibularnog zgloba; • trombocitopeniju, uključujući idiopatsku trombocitopeniju i autoimunu neoanatalnu trombocitopeniju; • metastaze tumora;

• uveitis; i

• vaskulitis.

Jedinjenja ovog pronalaska se mogu primeniti sama ili u kombinaciji sa terapeutski efikasnim količinama drugih lekova, uključujući analgetičke agense, anti-reumatske lekove za modifikaciju bolesti (DMARD), ne-steroidne anti-inflamatorne lekove (NSAID) i sve imune i/ili inflamatorne modulatore. Pema tome, jedinjenja ovog pronalaska se mogu primeniti sa: • Modulatorima drugih članova TNF/TNF receptorne familije, uključujući antagoniste TNF, kao što su etanercept (Enbrel™), sTNF-RI, onercept, D2E7 i Remicade™

• Modulatorima nervnog faktora rasta (NGF).

• IL-1 inhibitorima, uključujući IL-1ra molekule kao što su anakinra i skorije otkriveni molekuli slični IL-1 ra kao što su IL-1Hy1 i IL-1Hy2; IL-1 "klopka" molekuli kao što je opisano u U.S. Pat. No. 5,844,099, objavljenoj 1. decembra 1998; IL-1 antitela; rastvorljivi IL-1 receptor i tome slično.

• IL-6 inhibitorima (npr., antitela za IL-6).

• IL-8 inhibitorima (npr., antitela za IL-8).

• IL-18 inhibitorima (npr., protein koji vezuje IL-18, rastvorljivi IL-18 receptor, ili IL-18 antitela).

• Modulatorima enzima koji konvertuju interleukin-1 (ICE).

• Faktorima rasta koji su slični insulinu (IGF-1, IGF-2) i njihovim modulatorima.

• Transformišućim faktorom rasta-p (TGF-p), članovima familije TGF-p i modulatorima TGF-p.

• Faktorima rasta fibroblasta FGF-1 do FGF-10 i modulatorima FGF.

• Osteoprotegerinom (OPG), analozima OPG, osteoprotektivnim agensima i antitelima za OPG-ligand (OPL-L). • anaboličkim agensima kostiju, kao što su paratiroidni hormon (PTH), fragmenti PTH i molekuli koji se ugrađuju u PTH fragmente (npr., PTH (1-34)-Fc).

• Antagonistima PAF.

• Faktorom rasta keratinocita (KGF), molekulima koji su srodni sa KGF (npr., KGF-2) i modulatorima KGF.

• Inhibitorima COX-2, kao što su Celebrex™ i Vioxx™.

• Analozima prostaglandina (npr., prostaglandini E serije).

• Modulatorima metaloproteinaze matriksa (MMP).

• Modulatorima sintaze azotoksida (NOS), uključujući modulatore inducibilne

NOS.

• Modulatorima glukokortikoidnog receptora.

• Modulatorima receptora za glutamat.

• Modulatorima nivoa lipopolisahaida (LPS).

• Anti-kancer agensima, uključujući inhibitore onkogena (npr., fos, jun) i interferone.

• Noradrenalinom i njegovim modulatorima i mimeticima.

Farmaceutske kompozicije

Uopšteno. Ovaj pronalazak takođe daje postupke za upotrebu farmaceutskih kompozicija jedinjenja ovog pronalaska. Takve farmaceutske kompozicije mogu biti namenjene za primenu putem injekcije, ili za oralni, plućni, nazalni, transdermalni ili drugi oblik primene. Uopšteno, pronalazak obuhvata farmaceutske kompozicije koje sadrže efikasne količine jedinjenja pronalaska zajedno sa farmaceutski prihvatljivim razblaživačima, zaštitnim sredstvima, solubilizatorima, emulzifikatorima, adjuvantima i/ili nosačima. Takve kompozicije obuhvataju razblaživače različitog puferskog sastava (npr., Tris-HCI, acetat, fosfat), različite pH vrednosti i jonske jačine; aditive kao što su deterdženti i agensi koji povećavaju rastvorljivost (npr., Tween 80, Polisorbat 80), anti-oksidante (npr., askorbinska kiselina, natrijummetabisulfit), zaštitna sredstva (npr., Thimersol, benzilakohol) i supstance za punjenje (npr., laktoza, manitol); ugrađivanje materijala u određene preparate polimernih jedinjenja kao što je polilaktična (polimlečna) kiselina, poliglikolna kiselina, itd. ili u lipozome. Hijaluronska kiselina se takođe može koristiti i može imati takav efekat da utiče na produženo trajanje u cirkulaciji. Takve kompozicije mogu uticati na fizičko stanje, stopuin vivooslobađanja i stopuin vivoklirens ovih proteina i derivata. Pogledati, na primer, Remington' s Pharmaceutical Sciences, 18<th>Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042) strane 1435-1712 ovde uključeno u celini na osnovu reference. Kompozicije se mogu pripremiti u tečnom obliku, ili u obliku suvog praha, kao što je liofilizovani oblik. Formulacije koje se implantiraju kao što su one sa produženim oslobađanjem takođe su razmatrane, kao što su transdermalne formulacije.

Oralni oblici dozaže. Ovde su za upotrebu predviđeni oralni čvrsti oblici dozaže, koji su uopšteno opisani u Poglavlju 89 u Remington' s Pharmaceutical Sciences (1990), 18th Ed., Mack Publishing Co. Easton PA 18042, ovde uključeno u celini na osnovu reference. Čvrsti oblici dozaže obuhvataju tablete, kapsule, pilule orbilete ili pastila, obeležene tablete ili granule. Takođe, za formulaciju ovih kompozicija se mogu koristiti lipozomalne ili protenoidne inkapsulacije (kao što su, na primer, protenoidne mikrosfere objavljene u U.S. Patent No. 4,925,673). Lipozomalne inkapsulacije se mogu koristiti i lipozomi se mogu derivatizovati sa različitim polimerima (npr., U.S. Patent No. 5,013,556). Opis mogućih čvrstih doznih oblika za terapeutike je dat u Poglavlju 10 u Marshall, K., Modern Pharmaceutics (1979), edited by G.S. Banker and C.T. Rhodes, ovde uključeno u celini na osnovu reference. Uopšteno, formulacije će obuhvatati jedinjenja pronalaska, kao i inertne sastojke koji omogućavaju zaštitu od želudačne sredine i koji oslobađaju biološki aktivan materijal u creva.

Takođe su posebno predviđeni i oralni dozni oblici gorepomenutih jedinjenja pronalaska. Ukoliko je neophodno, jedinjenja se mogu hemijski modifikovati tako da oralna primena bude efikasna. Upšteno, razmatrana hemijska modifikacija je vezivanje najmanje jedne grupe za sam molekul jedinjenja, gde pomenuta grupa omogućava (a) inhibiciju proteolize; i (b) prenos iz želuca ili creva u krvotok . Takođe je poželjno povećanje u opštoj stabilnosti jedinjenja i povećanje u vremenu cirkulacije u telu. Grupe koje su korisne kao kovalentno vezani nosači u ovom pronalasku se mogu koristiti i u tu svrhu. Primeri takvih grupa obuhvataju: PEG, kopolimere etilenglikola i propilenglikola, karboksimetil celulozu, dekstran, polivinilalkohol, polivinilpirolidon i poliprolin. Pogledati, na primer, Abuchowski and Daviš, Soluble Polvmer- Enzvme Adducts, Enzvmes and Dru<g>s (1981), Hocenberg and Roberts, eds., Wiley-lnterscience, New York, NY, pp. 367-83; Newmark, et al. (1982), J. Appl. Biochem. 4:185-9. Drugi polimeri koji se mogu koristiti su poli-1,3-dioksolan i poli-1,3,6-tioksokan. Poželjne za farmaceutsku upotrebu, kao što je naznačeno u prethodnom tekstu, su PEG grupe.

Za oralne oblike dozaže, takođe je moguće upotrebiti so modifikovane alifatične amino kiseline, kao što je natrijum-N-(8-[2-hidroksibenzoil]amino)kaprilat (SNAC), kao nosač da bi se povećala apsorpcija terapeutskih jedinjenja ovog pronalaska. Klinička efikasnost heparinske formulacije korišćenjem SNAC je prikazana u Fazi II testu sprovedenom od strane Emisphere Technologies. Pogledati US Patent No. 5,792,451, "Oral drug deliverv composition and methods".

Jedinjenja ovog pronalaska mogu biti uključena u formulaciju kao fine mikročestice u obliku granula ili kuglica čestica veličine oko 1 mm. Formulacija materijala za primenu kapsula takođe može biti u obliku praška, blago kompresovanih čepića ili čak i tableta. Terapeutik se može pripremiti kompresijom.

Bojene materije i aromatizeri mogu biti takođe uključeni. Na primer, protein (ili derivat) mogu biti formulisani (kao što je lipozomska ili mikrosferna inkapsulacija) i zatim se mogu dodatno ubaciti u jestiv proizvod, kao što je hlađeni napitak koji saedrži bojene materije i aromatizere.

Moguće je da se jedinjenje pronalaska razblaži ili da se zapremina jedinjenja pronalaska poveća sa inertnim materijalom. Ovi razblaživači mogu obuhvatiti ugljene hidrate, posebno manitol, a-laktozu, anhidrovanu laktozu, celulozu, saharozu, modifikovane dekstrane i škrob. Izvesne neorganse soli se takođe mogu upotrebiti kao punioci uključujući kalcijumtrifosfat, magnezijumkarbonat i natrijumhlorid. Neki komercijalno dostupni razblaživači su Fast-Flo, Emdex, STA-Rx 1500, Emcompress i Avicell.

Dezintegranti mogu biti uključeni u formulaciju terapeutika u čvrstom doznom obliku. Materijali upotrebljeni kao dezintegranti obuhvataju, ali nisu ograničeni na škrob uključujući komercijalni dezintegrant baziran na škrobu, Explotlab. Mogu se upotrebiti natrijum škrob glikolat, Amberlite, natrijumkarboksimetilcelulozu, ultramilopektin, natrijumalginat, želatin, narandžinu koru, kiselu karboksimetil celulozu, prirodni sunđer i bentonit. Drugi oblik dezintegranata su nerastvorljive katjon-izmenjivačke smole . Gume u prahu se mogu upotrebiti kao dezintegranti i kao vezujuća sredstva i mogu obuhvatati gume u prahu kao što su agar, Karava ili tragantova guma. alginska kiselina i njena natrijumova so su takođe korisni kao dezintegranti.

Vezujuća sredstva se mogu koristiti da bi terapeutski agens držali zajedno za formiranje tvrde tablete i obuhvataju materijale iz prirodnih proizvoda kao što su akacija, tragantova guma, škrob i želatin. Drugi obuhvataju metil celulozu (MC), etil celulozu (EC) i karboksimetil celulozu (CMC). Polivinilpirolidon (PVP) i hidroksipropilmetil celuloza (HPMC) se mogu upotrebiti u alkoholnim rastvorima da bi granulisali terapeutik.

Antifrikcioni agens može biti uključen u formulacju terapeutika da bi sprečio zgušnjavanje u toku postupka formulacije. Lubrkanti se mogu upotrebiti kao sloj između terapeutika i zida kalupa, a mogu obuhvataju, ali nisu ograničeni na: stearinsku kiselinu uključujući njene magnezijumove i kalcijumove soli, politetrafluoroetilen (PTFE), tečni parafin, biljna ulja i voskove. Rastvorljivi lubrikanti se takođe mogu koristiti kao što su natrijumlaurilsulfat, magnezijumlaurilsulfat, polietilenglikoi različite molekulske težine, Carbowax 4000 i 6000.

Da bi se olakšalo rastvaranje jedinjenja ovog pronalaska u vodenoj sredini može se dodati površinski aktivno sredstvo kao agens za vlaženje. Površinski aktivna sredstva mogu obuhvatati anjonske deterdžente kao što su natrijumlaurilsulfat, dioktilnatrijumsulfosukcinat i dioktilnatrijumsulfonat. Katjonski deterdženti se mogu upotrebiti i mogu obuhvatati benzalkonijumhlorid ili benzetonijumhlorid. Spisak potencijalnih nejonskih deterdženata koji se mogu uključiti u formulaciju kao surfaktanti su lauromakrogol 400, polioksil 40 stearat, polioksietilen hidrogenisano ricinusovo ulje 10, 50 i 60, glicerol monostearat, polisorbat 40, 60, 65 i 80, estar saharoze i masne kiseline, metil celulozu i karboksimetil celulozu. Ovi surfaktanti mogu biti prisutni u formulaciji proteina ili derivata bilo sami ili kao smeša u različitim odnosima.

Aditivi se takođe mogu uključiti u formulaciju da bi se povećalo preuzimanje jedinjenja. Aditivi koji potencijalno imaju ovu osobinu su na primer masne kiseline, i to oleinska kiselina, linolna kiselina i linolenska kiselina.

Formulacije sa kontrolisanim oslobađanjem mogu biti poželjne. Jedinjenje ovog pronalaska može biti ugrađeno u inertni matriks koji omogućava oslobađanje bilo difuzionim ili mehanizmima izvlačenja; npr., gume. Matriksi koji se sporo razgrađuju se takođe mogu ugraditi u formulaciju, npr., alginati, polisaharidi. Drugi oblik kontrolisanog oslobađanja jedinjenja ovog pronalaska je postupak zasnovan na Oros terapeutskom sistemu (Alza Corp.), tj., lek je zatvoren u polupropustljivu membranu koja dozvoljava vodi da uđe i gura lek napolje preko jednog malog otvora zahvaljujući osmotskim efektima. Neki enterički omotači takođe imaju efekat odloženog oslobađanja.

U formulaciji se mogu upotrebiti drugi omotači. Oni obuhvataju čitav niz različitih šećera koji se mogu primeniti u sudu za oblaganje. Terapeutski agens takođe može biti dat u tableti koja je obložena tankim filmom, a materjali koji se koriste u te svrhe su podeljeni u dve grupe. Prvu grupu čine neenterički materijali koji obuhvataju metil celulozu, etil celulozu, hidroksietil celulozu, metilhidroksi-etil celulozu, hidroksipropil celulozu, hidroksipropil-metil celulozu, natrijumkarboksi-metil celulozu, providon i polietilenglikole. Druga grupa se sastoji od enteričkih materijala koji su često estri ftalne kiseline.

Može se upotrebiti smeša materijala da bi se obezbedilo optimalno oblaganje filmom. Oblaganje filmom se može izvesti u sudu za oblaganje ili granulacijom u struji fluida ili kompresionim oblaganjem.

Oblici za plućnu primenu. Ovde je takođe predviđena i plućna primena proteina iz ovog pronalaska (ili njegovog derivata). Protein (ili derivati) se primenjuje na pluća sisara inhalacijom nakon čega taj protein prelazi preko plućnog epitelijalnog sloja u krvotok. (Drugi radovi o ovoj temi obuhvataju Adjei et al., Pharma. Res. (1990) 7; 565-9; Adjei et al.s (1990), Internati. J. Pharmaceutics 63; 135-44 (leuprolidacetate); Braquet et aj. (1989), J. Cardiovasc. Pharmacol. 13 (suppl.5): s.143-146 (endotelin-1); Hubbard et al. (1989), Hubbard et aj. (1989), Annals Int. Med. 3: 206-12 (a1-antitripsin); Smith et aj. (1989), J. Clin. Invest. 84: 1145-6 (a1-proteinaza); Osvvein et al. (March 1990), " Aerosolization of Proteins", Proc. Svmp. Resp. Drug Deliverv II, Kevstone, Colorado (rekombinantni humani hormon rasta); Debs et aj. (1988), J. Immunol. 140: 3482-8 (interferon-y i faktor o. nekroze tumora) i Platz et al., U.S. Patent No. 5,284,656 (faktor stimulacije kolonije granulacita).

Za upotrebu u praksi ovog pronalaska je razmatran i čitav niz mehaničkih aparata koji su dizajnirani za plućnu primenu terapeutskih proizvoda, uključujući, ali ne ograničavajući se na, nebulizatore, inhalatore sa odmeravanjem doze i inhalatore za prašak, koji su poznati tehničarima. Neki specifični primeri komercijalno dostupnih uređaja koji su pogodni u praktičnoj primeni ovog pronalska su ultraviolentni nebulizator, koji se proizvodi u Mallinckrodt, Inc., St. Louis, Missouri; Acorn II nebulizator, koji se proizvodi u Marquest Medical Products, Englewood, Colorado; Ventolin inhalator sa odmeravanjem doze, koji se proizvodi u Glaxo Inc., Research Triangle Park, North Carolina; i Spinhaler inhalator za prašak, koji se proizvodi u Fisons Corp., Bedford, Massachusetts.

Svi takvi uređaji zahtevaju upotrebu formulacija koje su pogodne za pripremanje i upotrebu jedinjenja pronalaska. U tipičnom slučaju, svaka formulacija je specifična za tip uređaja koji se koristi i može obuhvatati upotrebu odgovarajućeg reaktivnog goriva, pored razblaživača, adjuvanata i/ili nosača korisnih u terapiji.

Jedinjenje pronalaska se najpovoljnije može pripremiti u čestičnom obliku sa prosečnom veličinom čestica manjom od 10 u.m (ili mikrona), najpoželjnije 0.5 do 5 u.m, radi najefikasnije primene na distalni deo pluća.

Farmaceutski prihvatljivi nosači obuhvataju ugljene hidrate kao što su trehaloza, manitol, ksilitol, saharoza, laktoza i sorbitol. Drugi sastojci koji se koriste u ovim formulacijama mogu obuhvatati DPPC, DOPE, DSPC i DOPC. Mogu se koristiti prirodna ili sintetička površinski-aktivna sredstva. PEG se može upotrebiti (čak i nezavisno od njegove upotrebe u derivatizaciji proteina ili analoga). Mogu se koristiti dekstrani, kao što je ciklodekstran. Mogu se koristiti žučne soli i drugi slični pojačivači. Mogu se koristiti celuloza i derivati celuloze. Mogu se koristiti amino kiseline, na primer u puferskim formulacijama.

Takođe, razmatrana je i upotreba lipozoma, mikrokapsula ili mikrosfera, inkluzionih kompleksa, ili drugih tipova nosača.

Formulacije koje su pogodne za upotrebu sa nebulizatorima, bilo džet ili ultrazvučnim, u tipičnom slučaju će sadržati jedinjenje pronalaska rastvoreno u vodi u koncentraciji od oko 0.1 do 25 mg biološki aktivnog proteina po ml rastvora. Formulacije mogu takođe da obuhvataju pufer i prosti šećer (npr., za proteinsku stablizaciju i regulaciju osmotskog pritiska). Formulacija za nebulizator može takođe sadržati površinski-aktivno sredstvo, da bi se smanjilo ili sprečilo površinski indukovano sakupljanje proteina izazvano atomizacijom rastvora prilikom formiranja aerosola.

Formulacije koje se koriste sa uređajem za inhalaciju sa odmeravanjem doze će u opštem slučaju sadržati fino podeljeni prašak koji sadrži jedinjenje pronalaska suspendovano u reaktivnom gorivu uz pomoć površinski-aktivnog sredstva. Reaktivno gorivo može biti bilo koji konvencionalni materijal upotrebljen u tu svrhu, kao što je hlorirani i fluorirani ugljovodonik (hlorofluorougljovodonik), hidrohlorofluorougljovodonik, hidrofluorougljovodonik, ili ugljovodonik, uključujući trihlorofluorometan, dihlorodifluorometan, dihlorotetrafluoroetanol i 1,1,1,2-tetrafluoroetan, ili njihove kombinacije. Pogodna površinski-aktivna sredstva obuhvataju sorbitantrioleat i soja lecitin. Oleinska kiselina takođe može biti korisna kao površinski-aktivno sredstvo.

Formulacije za primenu iz uređaja za inhalaciju praška će sadržati fino podeljeni suvi prašak koji sadrži jedinjenje pronalaska,a može takođe obuhvatati i punioc, kao što je laktoza, sorbitol, saharoza, manitol, trehaloza, ili ksilitol u količinama koje olakšavaju rasipanje praška iz uređaja, npr., 50 do 90% po težini formulacije.

Oblici za nazalnu primenu. Nazalna primena jedinjenja pronalaska je takođe razmatrana. Nazalna primena omogućava prelazak proteina u krvotok direktno posle primene terapeutskog proizvoda na nos, bez potrebe da se proizvod doprema u pluća. Formulacije za nazalnu primenu obuhvataju formulacije sa dekstranom ili ciklodekstranom. Primena putem prenosa kroz druge mukozne membrane je takođe razmatrana.

Doze. Dozni režim uključen u postupak za tretiranje gorepomenutih stanja će odrediti nadležni lekar, uzimajući u obzir različite faktore koji modifikuju dejstvo lekova, npr., starost, stanje, telesna težina, pol i isharna pacijenta, težina bilo koje infekcije, vreme primene i drugi klinički faktori. Uopšteno, dnevni režim bi trebalo da je u opsegu od 0.1-1000 mikrograma jedinjenja pronalaska po kilogramu teiesne težine, poželjno 0.1-150 mikrograma po kilogramu.

Specifični poželjni oblici

Pronalazači su odredili poželjne strukture za poželjne peptide date u Tabeli 4 u daljem tekstu. Simbol "A" može biti bilo koji od linkera koji su ovde opisani ili može jednostavno predstavljati normalnu peptidnu vezu (tj., takvu da linker nije prisutan). Tandem ponovci i linkeri su u datoj tabeli odvojeni crticama radi jasnoće.

V<1>je Fc domen kao što je prethodno definisano. Pored onih koji su navedeni u Tabeli 4, u ovom pronalasku su dalje razmatrani heterodimeri kod kojih je svaki lanac Fc dimera vezan za različitu peptidnu sekvencu; na primer, gde je svaki Fc vezan za različitu sekvencu izabranu iz Tabele 2.

Sva jedinjenja ovog pronalaska se mogu pripremiti pomoću postupaka koji su opisani u PCT appl. No. WO 99/25044.

Pronalazak će sada biti dodatno opisan sledećim radnim primerima, koji su pre ilustrativni nego ograničavajući.

PRIMER 1

Peptidi

Peptidni fagni prikaz

1. M agnetno pripremanje kuglica

A. Fc-TALL-1 imobilizacija na magnetnim kuglicama

Rekombinantni Fc-TALL-1 protein je imobilizovan na Protein A Dvnabeads (Dynal) u koncentraciji od 8^g Fc-TALL-1 na 100 ul stoku kuglica od proizvođača. Povlačenjem kuglica ka jednoj strani epruvete korišćenjem magneta i izvlačenjem tečnosti napolje pipetom, kuglice su dva puta ispirane slanim rastvorom fosfatnog pufera (PBS) i resuspendovane u PBS. Fc-TALL-1 protein je je dodat ispiranim kuglicama u gorenavedenoj koncentraciji i inkubiran uz rotaciju 1 čas na sobnoj temperaturi. Kuglice obložene sa Fc-TALL-1 su zatim blokirane dodavanjem goveđeg serum albumina (BSA) do 1% krajnje koncentracije i inkubiranjem u toku noći na 4°C uz rotaciju. Dobijene kuglice koje su obložene sa Fc-TALL-1 su zatim dva puta ispirane sa PBST (PBS sa 0.05% Tween-20) pre nego što su podvrgnute selekcionim postupcima.

B. Pripremanje kuglica za negativnu selekciju

Pripremljene su i dodatne kuglice za negativnu selekciju. Za svaki korak ispiranja, 250 u.l stoka kuglica od proizvođača je podvrgnuto goreopisanom postupku (deo 1A) sa tom razlikom što je inkubacioni korak sa Fc-TALL-1 izostavljen. U poslednjem koraku ispiranja, kuglice su podeljene u pet 50 jal alikvota.

2. Selekcija faga koji se vezuje za TALL- 1

A. Opšta strategija

Dve biblioteke filamentoznog faga, TN8-IX (5X10<9>nezavisni transformanti) i TN12-I (1.4X10<9>nezavisni transformanti) (Dyax Corp.), su upotrebljeni za selekciju faga koji se vezuje za TALL-1. Svaka biblioteka je podvrgnuta bilo pH 2 eluiranju ili "eluiranju kuglica" (deo 2E). Prema tome, četiri različita koraka ispiranja su sprovedena za TALL-1 projekat (TN8-IX korišćenjem pH2 elucionog postupka, TN8-IX korišćenjem postupka eluiranja kuglica, TN12-I korišćenjem pH2 eluirajućeg postupka i TN12-I korišćenjem postupka eluiranja kuglica). Za svako stanje su izvršena tri kruga selekcije.

B. Negativna selekcija

Za svaki korak ispiranja, oko 100 nasumičnih ekvivalenata biblioteke (5X1011 pfu za TN8-IX i 1.4X10<11>pfu za TN12-I) je kao alikvot uzeto iz stoka biblioteke i razblaženo do 300 u.l sa PBS. Nakon poslednjeg ispiranja tečnost je izbačena iz prvih 50 u.l alikvota kuglica pripremljenih za negativne selekcije (deo 1B), kuglicama je dodato 300] i\razblaženog stoka biblioteke. Dobijena smeša je inkubirana 10 minuta na sobnoj temperaturi uz rotaciju. Supernatant faga je izvučen korišćenjem magneta i dodat je drugoj alikvoti od 50 (il za drugi korak negativne selekcije. Na ovaj način, izvedeno je pet koraka negativne kontrole. C. Selekcija korišćenjem kuglica koje su obložene sa Fc-TALL-1 proteinom Supernatant faga nakon poslednjeg koraka negativne kontrole (deo 1B) je dodat kuglicama koje su obložene sa Fc-TALL-1 nakon poslednjeg koraka ispiranja (deo 1A). Ova smeša je inkubirana uz rotaciju dva časa na sobnoj temperaturi, omogućavajući specifičnom fagu da se veže za target protein. Pošto je supernatant odbačen, kuglice su ispirane sedam puta sa PBST.

D. pH2 eluiranje vezanog faga

Nakon poslednjeg koraka ispiranja (deo 2C), vezani fagi su eluirani sa magnetnih kuglica dodavanjem 200 u! CBST (50 mM natrijumcitrat, 150 mM natrijumhlorid, 0.05% Tween-20, pH2). Posle 5 minuta inkubacije na sobnoj temperaturi, tečnost koja sadrži eluirani fag je izdvojena i prenesena u drugu epruvetu. Korak eluiranja je ponavljen dodavanjem 200 yi\ CBST i inkubiranjem od 5 minuta. Tečnosti iz dva koraka eluiranja su zajedno dodate i 100 u.l 2 M Tris rastvora (pH 8) je dodato da bi se pH neutralisala. 500^IMin A Salts rastvora (60 mM K2HP04, 33 mM KH2PO4, 7.6 mM (NH4)S04i 1.7 mM natrijumcitrata) je dodato da bi se stvorila konačna zapremina do 1 mi.

E. "eluiranje kuglica"

Nakon poslednjeg ispiranja tečnost je izbačena (deo 2C), kuglicama je dodato 1 ml Min A rastvora soli. Ova smeša kuglica je dodata direktno u koncentrovan bakterijski uzorak za infekciju (deo 3A i 3B).

3. Amplifikacija

A. Pripremanje ćelija za oblaganje

Sveža E. coli (XL-1 Blue MRF') kultura je uzgajana do OD600=0.5 u LB podlozi koja sadrži 12.5 u.g/ml tetraciklina. Za svaki korak ispiranja, 20 ml ove kulture je hlađeno na ledu i centrifugi rano. Bakterijski talog je resuspendovan u 1 ml Min A Salts rastvoru.

B. Transdukcija

Svaka smeša iz različitog postupka eluiranja (deo 2D i 2E) je dodata u koncentrovani bakterijski uzorak (deo 3A) i inkubirana na 37°C 15 minuta. 2 ml NZCYM podloge (2XNZCYM, 50fag/ml ampicilina) je dodato u svaku od smeša i inkubirano na sobnoj temperaturi 15 minuta. Dobijenih 4 ml rastvora je stavljeno na veliku NZCYM agar ploču koja sadrži 50 fag/ml ampicilina i inkubirano je u toku noći na 37°C.

C. Prikupljanje faga

Svaka bakterija/fag smeša koja je u toku noći rasla na velikoj NZCYM ploči (deo 3B) je sastrugana i sipana u 35 ml LB medijuma i agar ploča je dodatno ispirana sa dodatnih 35 ml LB podloge. Dobijena bakterija/fag smeša u LB podlozi je centrifugirana da bi se odtaložile bakterije. 50 ml fagnog supernatanta je preneto u novu epruvetu i dodato je 12.5 ml PEG rastvora (20% PEG8000, 3.5M amonijumacetat) i inkubirano na ledu 2 časa da bi se istaložili fagi. Istaloženi fagi su centrifugirani i resuspendovani u 6 ml fagnog resuspenzionog pufera (250 mM NaCI, 100 mM Tris pH 8, 1 mM EDTA). Ovaj fagni rastvor je dalje prečišćen uklanjanjem preostalih bakterija centrifugiranjem i taloženjem faga po drugi put dodavanjem 1.5 ml PEG rastvora. Nakon koraka centrifugiranja, fagni talog je resuspendovan u 400 |il PBS. Ovaj rastvor je podvrgnut krajnjem centrifugiranju da bi se oslobodio preostalih otpadaka bakterija. Dobijeni fagni preparat je titrovan pomoću standardne analize formiranja plaka (Molecular Cloning, Maniatis et al 3rd Edition).

4. D va dodatna kruga selekcije i amplifikaciie

U drugom krugu, amplifikovani fag (10<10>pfu) iz prvog kruga (pasus 3C) je upotrebljen kao ulazni fag da bi se izveli koraci selekcije i amplifikacije (pasus 2 i 3). Amplifikovani fag (10<10>pfu) iz drugog kruga je upotrebljen kao ulazni fag da bi se izveo treći krug selekcije i amplifikacije (delovi 2 i 3). Posle koraka eluiranja (delovi 2D i 2E) trećeg kruga, mala frakcija eiuiranog faga je skinut sa podloge kao u analizi formiranja plaka (deo 3C). Pojedinačni plakovi su uzeti i postavljeni u 96-komorne mikrotitarske ploče sa po 100 |_il TE pufera u svakoj komori. Ove glavne ploče su inkubirane u inkubatoru na 37°C 1 čas da bi se omogućilo da fagi eluiraju u TE pufer.

5. Klonalna analiza ( Fagna ELISA i sekvenciranje)

Fagni klonovi su analizirani pomoću fagne ELISA i postupaka sekvenciranja. Sekvence su rangirane na osnovu kombinovanih rezultata iz ove dve analize.

A. Fagna ELISA

XL-1 Blue MRF' kultura je gajena dok OD6oonije dostiglo 0.5. 30 u.l ove kulture je kao alikvota dodato u svaku komoricu 96-komorne mikrotitaske ploče. 10 pl eiuiranog faga (deo 4) je dodato u svaku komoricu i omogućeno je da inficira bakterije u trajanju od 15 minuta na sobnoj temperaturi. 130^l LB podloge koja sadrži 12.5 pg/ml tetraciklina i 50 u.g/ml ampicilina je dodato u svaku komoricu. Mikrotitarska ploča je zatim inkubirana u toku noći na 37°C. Rekombinantni TALL-1 protein (1fig/ml u PBS) je ostavljen da obloži 96-komorne Maxisorp ploče (NUNC) u toku noći i na 4°C. Kao kontrola, rekombinantni Fc-Trail protein je obložen preko posebne Maxisorp ploče u istoj molarnoj koncentraciji kao i TALL-1 protein.

Sledećeg dana, odbačene su tečnosti iz Maxisorp ploča koje su obložene proteinom i svaka komorica je blokirana sa 300 jal 2% BSA rastvora na 37°C jedan čas. BSA rastvor je odbačen i komorice su ispirane tri puta sa rastvorom PBST. Posle poslednjeg koraka ispiranja, 50^l PBST je dodato u svaku komoricu Maxisorp ploča koje su obložene proteinom. Svaka od 50 pl kultura koje su stajale u toku noći u 96-komornoj mikrotitarskoj ploči su prenete u odgovarajuće komorice ploča koje su obložene sa TALL-1 kao i u kontrolne ploče koje su obložene sa Fc-Trial. 100 uJ smeša u dve vrste ploča su inkubirane 1 čas na sobnoj temperaturi. Tečnost je odbačena iz Maxisorp ploča i komorice su ispirane pet puta sa PBST. HRP-konjugovano anti-M13 antitelo (Pharmacia) je razblaženo do 1:7500 i 100 uJ razblaženog rastvora je dodato u svaku komoricu Maxisorp ploča i vršena je inkubacija 1 čas na sobnoj temperaturi. Tečnost je ponovo odbačena i komorice su ispirane sedam puta sa PBST. 100^l tetrametilbenzidin (TMB) supstrata (Sigma) je dodato u svaku komoricu da bi se razvila bojena reakcija koja je zaustavljena sa 50 \ i\ 5 N H2S04rastvora. OD450je očitavan na čitaču ploča (Molecular Devices).

B. Sekvenciranje fagnih klonova

Za svaki fagni klon, sekvencioni kalup je pripemljen pomoću PCR postupka. Sledeći oligonukleotidni par je upotrebljen da bi se amplifikovalo oko 500 nukleotidnih fragmenata: prajmer#1 (5-CGGCGCAACTATCGGTATCAAGCTG-3') (SEQ ID NO: 56) i prajmer

# 2 (5'-CATGTACCGTAACACTGAGTTTCGTC-3') (SEO ID NO: 57).

Sledeće smeše su pripremljene za svaki klon.

Aparat za temperaturne cikluse (GeneAmp PCR Svstem 9700, Applied Biosvstems) je upotrebljen da bi se izveo sledeći program: 94°C 5 minuta; [94°C 30 sekundi, 55°C 30 sekundi, 72°C 45 sekundi]x30 ciklusa; 72°C 7 minuta; hlađenje do 4°C. Proizvod PCR-a je proveren propuštanjem 5 til svake PCR reakcije na 1% agaroznom gelu. Proizvod PCR-a u preostalih 45 i-il iz svake reakcije je očišćen korišćenjem QIAquick Multivvell PCR Purification kit (Qiagen), sledeći uputstva proizvođača. Dobijeni proizvod je zatim sekvenciran korišćenjem ABI 377 Sequencer (perkin-EImer) sledeći protokol koji je preporučen od strane proizvođača.

6. Rangiranje sekvenci i određivanje konsenzus sekvence

A. Rangiranje sekvenci

Peptidne sekvence koje su translatirane iz varijabilnih nukleotidnih sekvenci (deo 5B) su korelisane sa podacima dobijenim u ELISA. Klonovi koji su pokazali visok OD450u komoricama koje su obložene sa TALL-1 i nizak OD450u komoricama koje su obložene sa Fc-Trial su smatrane važnijima. Sekvence koje se pojavljuju više puta su takođe smatrane važnim. Kandidat sekvence su izabrane na osnovu ovih kriterijuma radi dalje analize kao peptidi ili peptitela. Pet i devet kandidata peptidnih sekvenci je izabrano iz TN8-IX i TN12-I biblioteka, respektivno.

B. Određivanje konsenzus sekvence

Velika većina sekvenci koje su izabrane iz TN12-I biblioteke su sadržale veoma konzervativan DBL motiv. Ovaj motiv je takođe primećen u sekvencama koje su izabrane i iz biblioteke TN8-IB. Drugi motiv, PFPVVE (SEQ ID NO: 110) je takođe primećen u sekvencama koje su dobijene iz TN8-IB biblioteke.

Konsenzus peptid, FHDC KWDLLTKQWVCHGL (SEQ ID NO: 58), je stvoren na osnovu DBL motiva. S obzirom da su peptidi koji su izvedeni iz TN12-I bibiloteke najaktivniji, prvih 26 peptidnih sekvenci koje su zasnovane na gorenavedenim kriterijumima (deo 5A) su poravnate pomoću DBL motiva. Podvučeno "jezgro amino kiselinska sekvenca" je dobijeno određivanjem amino kiseline koja se najčešće javlja u svakom od položaja. Dva cisteina susedna sekvencama jezgra bile su fiksirane amino kiseline u TN12-I biblioteci. Ostatak amino kiselinske sekvence u konsenzus peptidu je uzet sa jednog od peptida kandidata, TALL-1-12-10 (Tabela 2, SEQ ID NO: 37). Peptid i peptitelo koji su izvedeni iz ove konsenzus sekvence bili su najaktivniji u testu priliferacije B ćelija.

PRIMER 2

Peptitela

Formirana je grupa od 12 peptitela koji inhibiraju TALL-1 (Tabela 5) kod kojih je monomer svakog peptida u okviru fuzionisan sa Fc regionom humanog lgG1. Svako peptitelo koje inhibira TALL-1 je konstruisano spajanjem parova oligonukleotida koji su prikazani u Tabeli 6 da bi se stvorio dupleks koji kodira peptid i linkera koji se sastoji od 5 ostataka glicina i jednog ostatka valina kao što je Ndel vezan za Sali fragment. Ovi dupleks molekuli su ugrađeni u vektor (pAMG21-RANK-Fc, ovde opisan) koji sadrži humani Fc gen, koji se takođe razlaže sa Ndel i Sali. Dobijene ligacione smeše su transformisane elektroporacijom u E. coli soj 2596 ćelija (GM221, ovde opisan). Izvršen je skrining klonova na sposobnost proizvodnje rekombinantnog proteinskog proizvoda i da bi se otkrilo da li poseduju fuziju gena koja ima ispravnu nukleotidnu sekvencu. Jedna takav klon je izabran od svakog od peptitela. Nukleotidne i amino kiselinske sekvence fuzionih proteina su prikazane na Slici 4A do4F.

pAMG21 - RANK- Fc vektor

pAMG21. Ekspresioni plazmid pAMG21 (ATCC pristupni broj 98113) se može izvesti iz Amgen ekspresionog vektora pCFM1656 (ATCC #69576) koji se zauzvrat može izvesti iz Amgen ekspresionog vektorskog sistema koji je opisan u US Patent No. 4,710,473. pCFM1656 plazmid se može izvesti iz opisanog pCFM836 plazmida (U.S. Patent No. 4,710,473) na sledeći način:

• destrukcijom dva endogena Ndel restrikciona mesta popunjavanjem kraja molekula enzimom T4 polimeraza, a zatim vezivanjem otvorenih krajeva; • zamenom DNK sekvence između jedinstvenih Aatll i Clal restrikcionih mesta koja sadrže sintetički PLpromotor sa sličnim fragmentom koji je dobijen od pCFM636 (patent Br. 4,710,473) koji sadrži PLpromotor (pogledati SEQ ID NO: 95 u daljem tekstu); i • supstitucijom male DNK sekvence između jedinstvenih Clal i Kpnl restrikcionih mesta sa oligonukleotidom koji ima sekvencu SEQ ID NO: 96. SEQ ID NO: 95:

Ekspresioni plazmid pAMG21 se zatim može izvesti od pCFM1656 formiranjem serije baznih promena usmerenih ka određenom mestu pomoću PCR-a preklapajući oligonukleotidnu mutagenezu i supstitucije DNK sekvence. Počevši sa Bglll mestom (plazmid bp # 180) koje se nalazi u 5' položaju u odnosu na promotor replikacje plazmida P copB i dalje duž gena za replikaciju plazmida, promene baznih parova su kao što je prikazano u Tabeli 7 u daljem tekstu.

DNK sekvenca između jedinstvenih Aatll (pozicija #4364 u pCFM1656) i Sacll (pozicija #4585 u pCFM1656) restrikcionih mesta je supstituisana sa sledećom DNK sekvencom (SEQ ID NO: 97):

U toku povezivanja lepljivih krajeva ove supstitucione sekvence DNK, spoljna Aatll i Sacll mesta su uništena. U supstituisanoj DNK se nalaze jedinstvena Aatll i Sacll mesta.

Gen koji kodira humani RANK fuzionisan za N-terminus Fc je ubačen u pAMG21 kao Ndel do BamHI fragment da bi se stvorio Amgen soj #4125. Ovaj konstrukt je modifikovan tako da inserira kodon za valin na spoju RANK i Fc. Susedni kodoni za valin i aspartat čine jedinstveno Sali mesto. Ovo omogućava fuziju peptida na N-terminusu Fc3 između jedinstvenih Ndel i Sali mesta. RANK sekvenca je deletirana usled insercije novog Ndel-Sall fragmenta. Sekvenca vektora je data na Slici 5A do 5M.

GM221 ( Amgen # 2596). Amgen soj domaćina #2596 u E. coli K-12 soj izveden od Amgen soja #393, koji je derivat E. coli VV1485, dobijen iz E. coli Genetic Stock Center, Yale Universitv, New Haven, Connecticut (CGSC soj 6159). Modifikovan je da bi obuhvatio i lambda represor cl857s7 koji je osetljiv na temperaturu u ranom ebg regionu i i lacl<Q>represor u kasnom ebg regionu (68 minuta). Prisustvo ova dva represorna gena omogućava upotrebu ovog domaćina sa različitm ekspresionim sistemima, međutim oba ova represora su nebitni za ekspresiju iz luxPR. Netransformisan domaćin ne poseduje otpornost na antibiotike.

Vezujuće mesto ribozoma cl857s7 gena je modifikovano tako da obuhvati pojačani RBS. On je umetnut u ebg operon između nukleotidne pozicije 1170 i 1411 kao što je navedeno u Genbank pristupni broj M64441Gb_Ba sa delelcijom ebg sekvence koja predstavlja smetnju. Sekvenca inseriranog dela je prikazana u daljem tekstu sa slovima u subskriptu koja predstavljaju ebg sekvence koje se nalaze sa obe strane inserta prikazanog ispod (SEQ ID NO: 98):

Konstrukt je dopremljen do hromozoma korišćenjem rekombinantnog faga nazvanog MMebg-cl857s7 enhanced RBS #4 u F'tet/393. Posle rekombinacije i rastavljanja samo hromozomski insert opisan u prethodnom tekstu ostaje u ćeliji. Promenjen mu je naziv u F'tet/GM101. F'tet/GM101 je zatim modifikovan dopremanjem lacl<Q>konstrukta u ebg operon između nukleotidne pozicije 2493 i 2937 kao što je numerisano Genbank pristupnim brojem M64441 Gb_Ba sa delecijom ebg sekvence. Sekvenca inserta je prikazana u daljem tekstu sa slovima u subskriptu koja predstavljaju ebg sekvencu koja se nalazi sa obe strane inserta (SEQ ID NO: 99) prikazanog ispod:

Konstrukt je dopremljen do hromozoma korišćenjem rekombinantnog faga nazvanog AGebg-LaclQ#5 u F'tet/GM101. Posle rekombinacije i rastavljanja samo rekombinantni insert koji je opisan u prethodnom tekstu ostaje u ćeliji. Njemu je promenjen naziv u F'tet/GM221. F'tet epizom je izdvojen iz soja korišćenjem akridin oranž u koncentraciji od 25 ng/ml u LB. Izdvojeni soj je identifikovan kao osetljiv na tetraciklin i sačuvan je kao GM221.

Ekspresija kod E. coli. Kulture svakog od pAMG21-Fc-fuzionog konstrukta u E, coli GM221 su rasle na 37°C u Luria Broth medijumu. Indukcija ekspresije genskog proizvoda iz luxPR promotora je postignuta posle dodavanja sintetičkog autoinduktora N-(3-oksoheksanoil)-DL-homoserin laktona u medijum kulture do krajnje koncentracije od 20 ng/ml. Kulture su inkubirane na 37°C još 3 časa. Posle 3 časa, bakterijske kulture su posmatrane pod mikroskopom da bi se otkrilo prisustvo inkluzionih tela i da bi se ona zatim sakupila centrifugiranjem. Refrakciona inkluziona tela su primećena u indukovanim kulturama ukazujući da su Fc-fuzije najverovatnije proizvedene u nerastvorljivoj frakciji u E. coli. Taloži ćelija su lizirani direktno resuspendovanjem u Laemmli uzorku pufera koji sadrži 10% p-merkaptoetanol i analizirani su pomoću SDS-PAGE. U svakom od slučajeva, na SDS-PAGE gelu je primećena Coomassie-obojena traka odgovarajuće molekulske težine.

PRIMER 3

TALL-1 peptitelo inhibira TALL-1 posredovanu proliferaciju B ćelija

B limfociti miševa su izolovani iz C57BL/6 slezina negativnom selekcijom.

(MACS CD43 (Ly-48) Microbeads, Miltenvi Biotech, Auburn, CA). Prečišćene (10<5>) B ćelije su kultivisane u MEM, 10% FCS koji je inaktiviran toplotom, 5x10"<5>M 2-merkaptoetanolu, 100 U/mi penicilina, 100 ng/ml streptomicina) u triplikatu u 96-komornim pločama za kulturu tkiva sa ravnim dnom sa 10 ng/ml TALL-1 proteina i 2iag/ml F(ab')2anti-mišjeg IgM koze (Jackson ImmunoResearch Laboratory, VVest Grove, Pennsylvania) sa naznačenom količinom rekombinantnog TALL-1 peptitela u

toku vremenskog perioda od 4 dana na 37°C, 5% C02. Proliferacija je merena preko preuzimanja radoaktivnog<3>[H] timidina posle 18-časovnog perioda inkubacije.

PRIMER 4

TALL-1 peptitelo blokira vezivanje TALL-1 za njegove receptore Reacti-Gel 6x (Pierce) je prethodno obložen sa humanim AGP3 (koji je takođe poznat i kao TALL-1, Khare et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 97: 3370-3375, 2000) i blokiran sa BSA. 100 pM i 40 pM uzoraka AGP3 peptitela je inkubirano sa naznačenim različitm koncentracjama humanog AGP3 na sobnoj temperaturi 8 časova pre propuštanja kroz humane AGP3-obložene kuglice. Količina peptitela vezanih za kuglice je kvantifikovana pomoću fluorescentno (Cy5) obeleženog kozjeg anti-humanog-Fc anitela (Jackson Immuno Research). Vezujući signal je proporcionalan koncentraciji slobodnog peptitela na ravnotežnom vezivanju. Ravnotežna konstanta disocijacije (KD) dobijena je iz nelinearne regresije kriva kompeticije korišćenjem homogenog vezujućeg modela dvostruka-kriva jedno-mesto (KinEx™ softver). KDje oko 4 pM za AGP3 peptitelo (SEQ ID NO: 123) koje se vezuje za humani AGP3 (Slika 9).

Da bi se odredilo da li ovo AGP3 peptitelo može da neutrališe vezivanje mišjeg AFP3 kao i humanog AGP3, korišćena je BlAcore analiza neutralizacije. Svi eksperimenti su izvedeni na BlAcore 3000 na sobnoj temperaturi. Humani TACI-Fc protein (Xia et al., J. Exp. Med. 192, 137-144, 2000) je imobilizovan na B1 chip korišćenjem 10 mM acetata pH 4.0 do nivoa 2900RU. Blanko ćelijski protok je upotrebljen kao osnovna kontrola. Korišćenjem tekućeg pufera PBS (bez kalcijuma ili magnezijuma) koji sadrži 0.005% P20, 1 nM rekombinantnog humanog AGP3 (u tekućem puferu plus, 0.1 mg/ml BSA) je inkubiran bez i sa naznačenim različitim količinama AGP3 peptitela (x osa) pre nego što se injektira preko površine receptora. Regeneracija je izvedena korišćenjem 8 mM glicina pH 1.5 1 minut, 25 mM 3-[cikloheksilamino]-1-propansulfo kiseline (CAPS) pH 10.5, 1 M NaCI 1 minut. Za određivanje vezivanja mišjeg AGP3, humani his-obeleženi TACI je imobilizovan do 1000 RU u gorenavedenom puferu. 5nM rekombinantnog mišjeg AGP3 (u tekućem puferu plus, 0.1 mg/ml BSA) je inkubiran bez i sa razlilčitim količinama AGP3 peptitela koje su naznačene na Slici 11 (x osa) pre njegovog injektiranja preko površine receptora. Regeneracija je izvedena sa 10 mM HCI pH2, dva puta za 30 sekundi. Relativno vezivanje i humanog i mišjeg AGP3 u prisustvu vs odsustvu AGP3 peptitela (SEQ ID NO: 123) je mereno (y osa). Odgovor relativnog vezivanja je određen kao (RU-RU blanko/RUo-RU blanko). AGP3 peptitelo (SEQ ID NO: 123) je inhibiralo vezivanje i humanog i mišjeg AGP3 za njihov receptor TACI (Slike 10A i 10B).

Da bi se ispitalo da li ovo AGP3 peptitelo blokira vezivanje AGP3 za sva tri receptora (TACI, BCMA i BAFFR), rekombinantni rastvorljivi receptorni TACI, BCMA i BAFFR proteini su imobilizovani na CM5 chip. Korišćenjem 10 mM acetata, pH4, humani TACI-Fc je imobilizovan na 6300 RU, humani BCMA-Fc na 5000 RU i BAFFR-Fc na 6000 RU. 1nM rekombinantnog humanog AGP3 (u tekućem puferu koji sadrži 0.1 mg/ml BSA i 0.1 mg/ml Heparina) ili 1 nM rekombinantnog APRIL proteina (Yu, et al., Nat. Immunol., 1: 252-256, 2000) su inkubirani sa naznačenom količinom AGP3 peptitela pre injektiranja preko površine svakog od receptora. Regeneracija za AGP3 eksperiment je izvedena sa 8 mM glicinom, pH 1.5, za 1 minut, a zatim sa 25 mM CAPS, pH 10.5, 1 M NaCI za 1 minut. Regeneracija za APRIL eksperiment je izvedena sa 8 mM glicina, pH 2, za jedan minut, a zatim sa 25 mM CAPS, pH 10.5, 1 M NaCI za 1 minut. Mereno je relativno vezivanje AGP3 ili APRIL. AGP3 peptitelo (SEQ ID NO: 123) je blokiralo vezivanje AGP3 za sva tri receptora (Slika 11A). AGP3 peptitelo nije uticalo na vezivanje APRIL za receptore (Slika 11B).

PRIMER 5

AGP3 peptitelo blokira AGP3 posredovanu proliferaciju B ćelija

B limfociti miševa su izolovani iz C57BL/6 slezina negativnom selekcijom.

(MACS CD43 (Ly-48) Microbeads, Miltenyi Biotech, Auburn, CA). Prečišćene (10<5>) B ćelije su kultivisane u minimalnom glavnom medijumu (MEM), 10% fetalnom serumu teleta koji je inaktiviran toplotom (FCS), 5x10"<5>M 2-merkaptoetanolu, 100 U/ml penicilina, 100 u.g/ml streptomicina) u triplikatu u 96-komornim pločama za kulturu tkiva sa ravnim dnom sa 10 ng/ml AGP3 (TALL-1) proteina i 2 ng/ml F(ab')2anti-

mišjeg IgM koze (Jackson ImmunoResearch Laboratorv, VVest Grove, Pennsylvania) sa naznačenom količinom rekombinantnog AGP3 peptitela (SEQ ID NO: 123) u toku vremenskog perioda od 4 dana na 37°C, 5% C02. Proliferacija je merena preko preuzimanja radoaktivnog<3>[H] timidina posle 18-časovnog perioda inkubacije.

PRIMER 6

AGP3 peptitelo na AGP3-stimulisanoj proizvodnji Ig kod miševa

Miševi (Balb/c ženke starosti 9-14 nedelja i telesne težine od 19-21 g) su nabavljeni iz Charles River Laboratories, VVilmington, MA. Miševi (n=10) su tretirani i.p. sa 1 mg/kg humanog AGP3 jednom dnevno 5 uzastopnih dana, a zatim sa 5 mg/kg ili 0.5 mg/kg AGP3 peptitela (SEQ ID NO: 123) ili sa slanim rastvorom ili sa 5 mg/kg humanog Fc. Ostali miševi nisu tretirani. Miševi su žrtvovani šestog dana da bi se merili IgM i IgA u serumu, što je izvedeno pomoću ELISA. Ukratko, ploče su obložene sa antitelima za vezivanje koja su specifična za IgM ili IgA (Southern Biotechnology Associates, Birmingham, AL), blokirane i dodati su im rastvori standardnih (IgM iz Calbiochem, San Diego, CA i IgA iz Southern Biotechnology Associates) ili test uzoraka. Vezani IgA je otkriven korišćenjem biotinizovanih antitela koja su specifična za IgM ili IgA (Southern Biotechnology Associates), neutravidin-konjugovane peroksidaze (Pierce, Rockford, IL) i tetrametiibenzidin (TMB) mikrokomornog peroksidaznog supstrata (KPL, Gaithersburg, MD). Optička gustna je izračunavana u Thermomax ELISA čitaču (Molecular Devices, Menlo Park, CA).

Povećanje nivoa IgM i IgA u humanom serumu koje je stimulisano sa AGP3 je blokirano sa 5 mg/kg anti-AGP3 peptitela (SEQ ID NO: 123), a nije blokirano sa 0.5 mg/kg (Slike 12A i 12B).

PRIMER 7

AGP3 peptitelo redukujebroj B ćelijausiezinikodmiševa

Miševi (kao u prethodnom primeru, n=7) su tretirani i.p. sedam uzastopnih dana sa 5 mg/kg ili 1.5 mg/kg AGP3 peptitela (SEQ ID NO: 123) ili sa slanim rastvorom ili sa 5 mg/kg humanog Fc. Miševi su žrtvovani osmog dana da bi se izbrojale B ćelija u siezini. Slezine su sakupljene u slanom rastvoru i pažljivo rastavljene ručnom homogenizacijom da bi se dobila ćelijska suspenzija. Ukupan broj ćelija je dobijen pomoću H1E brojača (Technicon, Tarrytown, NY). Procenti B ćelija su dobijeni imunofluorescentnim dvostrukim bojenjem i «flow» citometrijom korišćenjem fluorescein izotiocijanat (FITC)-konjugovanog i fikoeritrin (PE)-konjugovanog Ab protiv CD3 i B220, respektivno (PharMingen, San Diego, CA) i FACScan analizatora (Becton and Dickinson, Mountain View, CA). B ćelije su identifikovane kao CD3-B220+. U svim dozama, AGP3 peptitelo (SEQ ID NO: 123) je snižavalo broj B ćelija u siezini na doza-odgovor način (Slika 12A i 12B) (SEQ ID NO: 123).

PRIMER 8

AGP3 peptitelo redukuje težinu artritisa kod CIA modela kod miševa Osam do 12 nedelja stari DBA/I miševi (dobijeni iz Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) su imunizovani sa goveđim kolagenom tip II (bCII) (kupljen u Universitv of Utah), koji je emulzifikovan u kompletnom Freund-ovom adjuvantu (Difco) intradermalno pri osnovi repa. Svaka injekcija bila je od 100 jal i sadržala je 100 p,g bCII. Miševi su naknadno imunizovani 3 nedelje posle početne imunizacje sa bCII koji je emulzifikovan u kompletnom Freund-ovom adjuvantu. Tretman je započet od dana naknadne imunizacije i trajao je 4 nedelje. Miševi su ispitivani da bi se videlo da li se kod njih razvio artritis. Kao što je prethodno opisano (Khare et al., J. Immunol. 155: 3653-9, 1995), sve četiri šape su pojedinačno bodovane od 0-3. Prema tome jačina atritisa može da varira od 0 do 12 kod svake životinje. Tretman sa AGP3 (SEQ ID NO: 123) peptitelom je značajno redukovao težinu artritičkih rezultata (Slika 13).

Uzorci seruma su uzimani nedelju dana posle krajnjeg tretmana (dan 35) radi analize nivoa anti-kolagen antitela. Visoko vezujuće ELISA ploče (Immulon, Nunc) su obložene sa 50 ni 4 ng/ml rastvora goveđeg Cll u karbonatnom puferu i na pločamu su čuvane na hladnom u toku noći u frižideru. Ploče su ispirane tri puta sa hladnom vodom. 75 n' blokirajućeg rastvora koji je napravljen od PBS/.05% tvveen 20/1% BSA je upotrebljeno za blokiranje ne-specifičnog vezivanja u toku 1 časa. Uzorci su razblaženi (u blokirajućem puferu) u pločama za razblaživanje u 1:25, 1:100, 1:400 i 1:1600 i 25 uJ ovih uzoraka je dodato u svaku komoricu ELISA ploče za krajnje razblaženje od 100, 400, 1600 i 6400 sa krajnjom zapreminom od 100 nl/komorici. Posle inkubacije na sobnoj temperaturi 3 časa, ploče su ispirane još tri puta. 100 uJ sekundarnog antitela koje je razblaženo u blokirajućem puferu (anti-mišji IgM, lgG2a, lgG2b, lgG1, lgG3-HRP pacova) je dodato u svaku komoricu i ploče su inkubirane najmanje 2 časa. Ploče su ispirane četiri puta. 100 uJ TMB rastvora (Sigma) je dodato u svaku komoricu i reakcija je stopirana korišćenjem, 50 j.il 25% sumporne kiseline. Ploče su očitavane korišćenjem čitača ELISA ploča na 450 nm. OD je upoređivan sa standardnim pulom izraženim u jedinicama/ml. Tretman AGP3 peptitelom (SEQ ID NO: 123) je redukovao serumske nivoe anti-kolagena li lgG1, lgG3, lgG2a i lgG2b u poređenju sa PBS ili Fc kontrolnim grupama (Slika 14).

PRIMER 9

Tretman AGP3 peptitelom NZB/NZVVmiševa salupusom

Pet meseci stari NZBx NZBVVF1 miševi skloni lupusu su tretirani i.p. 3X/nedeljno 8 nedelja sa PBS ili naznačenim dozama AGP3 peptitela ili humanih Fc proteina. Pre tretmana, životinje su ispitivane na protein u urinu pomoću traka sa Albustix reagensom (Bayer AG). Miševi koji su imali više od 100 mg/dl proteina u urinu nisu uključeni u studiju. U toku eksperimenta protein u urinu je određivan jednom mesečno. Tretman sa AGP3 peptitelom (SEQ ID NO: 123) je doveo do odlaganja početka proteinurije i poboljšao je preživljavanje (Slika 15A i 15B).

Tretman sa AGP3 peptitelom je smanjio broj B ćelija kod miševa. Balb/c miševi su primili 7 intraperitonealnih injekcija (jedna dnevno) naznačene količine AGP3 peptitela (SEQ ID NO: 123) ili humanog Fc proteina. Osmog dana sakupljane su slezine i podvrgnute FACS analizi na B220+ B ćelije kao što je dato u Tabeli 8.

LISTING SEKVENCI:

• Artificial sequence - veštačka sekvenca; • Ndel to Sali fragment - Ndel do Sali fragment; • Miscjeature - razne karakteristike; • Xaa (Pos<*>) are each independentlv absent or amino acid residues - svaki Xaa (Poz<*>) su nezavisno odsutni ili amino kiselinski ostaci; • Xaa (Pos<*>) are each independentlv amino acid residues - svaki Xaa (Poz <*>) su nezavisno amino kiselinski ostaci; • Preffered TALL-1 modulating domains - Poželjni TALL-1 modulirajući domeni; • Polyglycine linkers - poliglicinski linkeri; • Peptide bond - peptidna veza; • Fc domain attached at Position (<*>) to C-terminus - Fc domen vezan na poziciji (<*>) na C-terminusu; • Fc domain attached at Position (<*>)1 to N-terminus - Fc domen vezan na poziciji (<*>) na N-terminusu; • Preffered linker sequence - poželjna linker sekvenca; • Xaa (Pos<*>) is an amino acid residue; Xaa (Pos 9) is a basic or hydrophobic residue - Xaa (Poz *) je amino kiselinski ostatak; Xaa (Poz<*>) je bazni ili hidrofobni ostatak; • Xaa (Pos<*>) is neutral hydrophobic residue - Xaa (Poz<*>) je neutralni hidrofobni ostatak; • Modulators of TALL-1 - modulatori TALL-1; • Xaa (<*>) is an acidic residue - Xaa (<*>) je kiseli ostatak; • Xaa (<*>) is an aromatic residue - Xaa (<*>) je aromatičan ostatak; • Xaa (<*>) is a basic residue - Xaa (<*>) je bazni ostatak; • Xaa (*) isTorl -Xaa (*)jeT ili I; • X at (Pos<*>) are absent or are amino acid residues (with one of X1, X2, and X3 preferred to be C when one of X12, X13 and X14 is C - X na (Poz

<*>) su odsutni ili su amino kiselinski ostaci (gde je jedan od X1, X2 i X3 u poželjnom slučaju C, kada je jedan od X12, X13 i X14 Q • TALL-1 inhibitorv peptibodies - peptitela koja inhibiraju TALL-1; • X at (Pos<*>) and (Pos<*>) are each independentlv basic or hvdrophobic residues and X at (Pos<*>) and (Pos<*>) are each independentlv hvdrophobic residues - svako X na (Poz<*>) i (Poz<*>) su nezavisno bazni ili hidrofobni ostaci i svako X na (Poz<*>) i (poz<*>) su nezavisno hidrofobni ostaci.

<*>- TEKST SE PONAVLJA VIŠE PUTA SA RAZLIČITIM BROJEVIMA

Claims (35)

1. Kompozicija koja sadrži amino kiselinsku sekvencu formule gde: svako f<1>, f<2>if<3>su odsutni ili su amino kiselinski ostaci; f5 je W, Y ili F; f7 je amino kiselinski ostatak; f9 je T ili I; f10 je K, R, ili H ; f<12>je C, neutralni hidrofobni ostatak, ili bazni ostatak (W, C, ili R poželjno); f<3>je C, neutralni hidrofobni ostatak ili je odsutan ; i f4 je bilo koji amino kiselinski ostatak ili je odsutan; uz uslov da samo jedan od f<1>, f<2>i f<3>mogu biti C, a samo jedan od f 2, f<13>i f '4 m<ož>e da bude C.

2. Kompozicija iz zahteva 1, naznačena time, štofje W.

3. Kompozicija iz zahteva 1, naznačena time, što f<7>jeL.

4. Kompozicija iz zahteva 1, naznačena time, što f<®>je T.

5. Kompozicija iz zahteva 1, naznačena time, što f<10>je K.

6. Kompozicija iz zahteva 1, naznačena time, što f<2>je C i jedan od f<1>, f2 i f<3>je C.

7. Kompozicija iz zahteva 1, naznačena time, što f<13>je V.

8. Kompozicija iz zahteva 1 koja sadrži amino kiselinsku sekvencu formule

9. Kompozicija iz zahteva 8, naznačena time, što sadrži amino kiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOS: 32, 33, 58, 60, 63, 66, 67, 69, 114, 115, 122, 123, 124, 147-150, 152-177, 179, 180 i 187.

10. Kompozicija iz zahteva 8 koja sadrži amino kiselinsku sekvencu formule

11. Kompozicija formule i njenih multimera, naznačena time, što: V<1>je nosač; svakoX<1>i X<2>je nezavisno izabrano od -(L1)c-P1, -(L<1>)c-P<1->(L<2>)d-P<2>,-(L<1>)c-P<1->(L<2>)d-P<2->(L<3>)e-P<3>i -(L1)c-P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3-(L4)rP4 svaki od P<1>, P<2>, P<3>i P4 jedan ili više nezavisno obuhvataju aminokiselinsku sekvencu formule: gde:f1, f2, if<3>nisu priutni ili su amino kiselinski ostaci;f je W, Y,ili F; f7 je amino kiselinski ostatak; f \ el \\\ I; f10je K, R, ili H; f<12>je C, neutralni hidrofobni ostatak, ili bazni ostatak (W, C, ili R poželjno); f13 je C, neutral hidrophobni ostatak ili je odsutan; i f14 je bilo koji amino kiselinski ostatak ili je odustan; pod uslovom da jedan od f1,f<2>, if<3>može da bude C, i samo jedan od f<1>2,f13,if4može da bude C; svakoL1, L<2>,L<3>i L<4>je nezavisno linker; i svako a, b, c, d, e i f je nezavisno 0 ili 1, uz uslov da najmanje jedan od a i b je 1.

12. Kompozicija iz zahteva 11 formule

13. Kompozicija iz zahteva 11 formule

14. Kompozicija iz zahteva 11, naznačena time, što V<1>je Fc domen.

15. Kompozicija iz zahteva 11, naznačena time, što V<1>je IgG Fc domen.

16. Kompozicija iz zahteva 11, naznačena time, što V<1>je lgG1 Fc domen.

17. Kompozicija iz zahteva 11, naznačena time, što V<1>sadrži sekvencu SEQ ID NO: 2.

18. Kompozicija iz zahteva 11 formule

19. Kompozicija koja je iz zahteva 11, naznačena time, što: fjeVV; f7 je L; f7je K;i f<10>jeV.

20. Kompozicija iz zahteva 11, naznačena time, što svaki jedan ili višeP<1>,P2, P<3>i P<4>nezavisno sadrže

21. Kompozicija iz zahteva 20 formule

22. Kompozicija iz zahteva 20 formule

23. Kompozicija iz zahteva 20, naznačena time, što ima amino kiselinsku sekvencu izabranu od SEQ ID NOS: 122, 123 i 124.

24. Kompozicija iz zahteva 21 ili zahteva 22, naznačena time, što je L<2>veće od 5 amino kiselina.

25. Kompozicija iz zahteva 24 , naznačena time, što je L<2>izabran od gde je svako x<1>i x<3>nezavisno bazni ili hidrofobni ostatak i svako x<2>i x<4>je nezavisno hidrofobni ostatak.

26. Kompozicija iz zahteva 21 ili zahteva 22, naznačena time, što je L<2>izabran od

27. Kompozicija iz zahteva 11 , naznačena time, što sadrži sekvencu izabranu iz grupe koju čine (SEQ ID NOS: 44,45,46,47,52,53,54 i 55).

28. DNK koja kodira kompoziciju koja je iz zahteva 11.

29. Ekspresioni vektor koji sadrži DNK iz zahteva 28.

30. Ćelija domaćin koja sadrži ekspresioni vektor iz zahteva 29.

31. Ćelija iz zahteva 30, gde je ćelija E. coli ćelija.

32. Upotreba kompozicije koja se sastoji od supstance iz zahteva 1 ili zahteva 11 za proizvodnju leka za lečenje autoimune bolesti posredovane B-ćelijama.

33. Upotreba kompozicije koja se sastoji od supstance iz zahteva 1 ili zahteva 11 za proizvodnju leka za lečenje lupusa.

34. Upotreba kompozicije koja se sastoji od supstance iz zahteva 1 ili zahteva 11 za proizvodnju leka za lečenje kancera posredovanog B-ćelijama.

35. Upotreba kompozicije koja se sastoji od supstance iz zahteva 1 ili zahteva 11 za proizvodnju leka za lečenje limfoma B-ćelija.