ES2527471T3 - Péptidos y moléculas relacionadas que se unen a TALL-1 - Google Patents

Abstract

Una composición objeto del presente que comprende una secuencia de aminoácidos de la fórmula b1b2b3Cb5b6Db8Lb10b11b12b13b14Cb16b17b18 (SEC. ID. N.º: 104) donde: b1 y b2, cada uno de ellos independientemente, es un residuo de aminoácido o está ausente; b3 es D, Q o E; b5 es un residuo de aminoácido; b6 es W o Y; b8 es un residuo de aminoácido; b10 es T; b11 es K o R; b12 y b13, cada uno de ellos independientemente, es un residuo de aminoácido; b14 es V o L; y b16, b17 y b18, cada uno de ellos independientemente, es un residuo de aminoácido o está ausente.

Description

Péptidos y moléculas relacionadas que se unen a TALL-1

Antecedentes de la invención

Tras años de estudio de la necrosis de los tumores, los factores de necrosis tumoral (TNF) α y β fueron finalmente clonados en 1984. En los años siguientes presenciamos la aparición de una superfamilia de citoquinas TNGF, incluyendo el ligando de Fas (FasL), ligando de CD27 (CD27L), ligando de CD30 (CD30L), ligando de CD40 (CD40L), ligando inductor de la apoptosis relacionado con el TNF (TRAIL, también denominado AGP-1), la proteína de enlace de la osteoprotegerina (OPG-BP o ligando de OPG), ligando de 4-1BB, LIGHT, APRIL, y TALL-1. Smith et al. (1994), Cell 76: 959-962; Lacey et al. (1998), Cell 93:165-176; Chichepotiche et al. (1997), J. Biol. Chem. 272: 32401-32410; Mauri et al. (1998), Immunity 8:21-30; Hahne et al. (1998), J. Exp. Med. 188:1185-90; Shu et al. (1999), J. Leukocyte Biology 65:680-3. Esta familia está unificada por su estructura, particularmente en el extremo cterminal. Por otra parte, la mayoría de los miembros conocidos hasta la fecha se expresan en compartimentos inmunológicos, aunque algunos miembros también se expresan en otros tejidos y órganos. Smith et al. (1994), Cell 76:959-62. Todos los miembros de los ligandos, con excepción de LT-a, son proteínas transmembrana de tipo II, que se caracterizan por una región de 150 aminoácidos conservada dentro del dominio extracelular del extremo cterminal. Aunque está limitado a una identidad de tan solo el 20-25%, el dominio conservado de 150 aminoácidos se pliega en un característico beta sándwich de hoja plegada y se trimeriza. Esta región conservada puede ser liberada proteolíticamente, generando así una forma funcional soluble. Banner et al. (1993), Cell 73:431-445.

Muchos miembros de esta familia de ligandos se expresan en tejidos enriquecidos en linfoides y desempeñan papeles importantes en el desarrollo y la modulación del sistema inmunológico. Smith et al. (1994). Por ejemplo, el TNFa se sintetiza principalmente por macrófagos y es un mediador importante de respuestas inflamatorias y defensas inmunológicas. Tracey & Cerami (1994), Ann. Rev. Med. 45:491-503. El Fas-L, expresado predominantemente en células T activadas, modula la apoptosis mediada por TCR de timocitos. Nagata, S. & Suda,

T. (1995) Immunology Today 16:39-43; Castrim et al. (1996), Immunity 5:617-27. El CD40L, también expresado en células T activadas, proporciona una señal esencial para la supervivencia, la proliferación y el cambio de isotipo de inmunoglobulina de las células B. Noelle (1996), Immunity 4:415-9.

Se han identificado los receptores cognados de la mayoría de los miembros de la familia del ligando TNF. Estos receptores comparten múltiples repeticiones ricas en castina características dentro de sus dominios extracelulares y no poseen motivos catalíticos dentro de las regiones citoplásmicas. Smith et al. (1994). Los receptores envían señales mediante interacciones directas con proteínas con dominio de muerte (p. ej. TRADD, FADD y RIP) o con proteínas TRAP (p. ej., TRAF2, TRAF3, TRAF5 y TRAF6), desencadenando rutas de señalización divergentes y superpuestas, p. ej., apoptosis, activación de NF-kB o activación de JNK. Wallach et al. (1999), Annual Review of Immunology 17:331-67. Estos eventos de señalización conducen a la muerte, proliferación, activación o diferenciación celular. El perfil de expresión de cada miembro receptor varía. Por ejemplo, TNFR1 se expresa en un amplio espectro de tejidos y células, mientras que el receptor de superficie celular de OPGL se limita principalmente a los osteoclastos. Hsu et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sd. USA 96:3540-5.

Varios grupos de investigación han identificado recientemente ligandos de la familia del TNF con una secuencia igual o sustancialmente similar. El ligando ha recibido varios nombres: neutrocina a (WO 98/18921, publicado el 7 de mayo de 1998), 63954 (WO 98/27114, publicado el 25 de junio de 1998), TL5 (EP869180, publicado el 7 de octubre de 1998), NTN-2 (WO 98/55620 y WO 98/55621, publicados el 10 de diciembre de 1998), TNRL1-alfa (WO 9911791, publicado el 11 de marzo de 1999), ligando kay (W099/12964, publicado el 18 de marzo de 1999), y AGP-3 (Solicitud prov. EE.UU. Nº 60/119.906, presentada el 12 de febrero 1999 y 60/166.271, presentada el 18 de noviembre de 1999, respectivamente); y TALL-1 (WO00/68378, publicado el 16 de noviembre de 2000). En adelante, los ligandos mencionados en el presente se denominan colectivamente TALL-1.

TALL-1 es un miembro de la superfamilia de ligandos del TNF que está funcionalmente implicado en la supervivencia y proliferación de células B. Los ratones transgénicos con una sobreexpresión de TALL-1 experimentaron una severa hiperplasia de células B y una enfermedad autoinmune similar al lupus. Khare et al. (2000) PNAS 97(7):3370-3375). Tanto TACI como BCMA sirven como receptores de la superficie celular de TALL-1. Gross et al. (2000), Nature 404:995-999; Ware (2000), J. Exp. Med. 192(11): F35-F37; Ware (2000), Nature 404: 949-950; Xia et al. (2000), J. Exp. Med. 192(1):137-143; Yu et al. (2000), Nature Immunology 1(3):252-256; Marsters et al. (2000), Current Biology 10:785-788; Hatzoglou et al. (2000) J of Immunology 165:1322-1330; Shu et al. (2000) PNAS 97(16):9156-9161; Thompson et al. (2000) J Exp. Med. 192(1):129-135; Mukhopadhyay et al. (1999) J. Biol. Chem. 274(23): 15978-81; Shu et al. (1999) J. Leukocyte Biol. 65:680-683; Grass et al. (1995) Blood 85(12): 33783404; Smith et al. (1994), Cell 76:959-962; Patente estadounidense Nº 5.969.102, publicada el 19 de octubre de 1999; WO 00/67034, publicado el 9 de noviembre de 2000; WO 00/40716, publicado el 13 de julio de 2000; WO 99/35170, publicado el 15 de julio de 1999. Ambos receptores se expresan en células B y envían señales mediante interacción con las proteínas TRAF. Por otra parte, tanto TACI como BCMA también se unen a otro miembro de la familia de los ligandos del TNF: APRIL. Yu et al. (2000), Nature Immunology 1(3) 252-256. También se ha demostrado que APRIL induce la proliferación de células B.

Hasta la fecha no se ha divulgado ninguna proteína recombinante o modificada que emplee péptidos moduladores de TALL-1. Las proteínas recombinantes y modificadas son una clase emergente de agentes terapéuticos. Las

modificaciones útiles de agentes terapéuticos de proteína incluyen la combinación con el dominio "Fc" de un anticuerpo y el enlace a polímeros como el glicol de polietileno (PEG) y el dextrano. Estas modificaciones se debaten detalladamente en una solicitud de patente titulada “Péptidos modificados como agentes terapéuticos”, publicada como WO 00/24782.

Un planteamiento muy diferente al desarrollo de agentes terapéuticos es la investigación de la biblioteca de péptidos. La interacción del ligando de una proteína como su receptor a menudo se produce en una interfaz relativamente grande. No obstante, como se ha demostrado en el caso de la hormona de crecimiento humana y su receptor, solamente unos pocos residuos principales de la interfaz contribuyen de forma importante a la energía del enlace. Clackson et al. (1995), Science 267:383-6. La mayor parte del ligando de la proteína solamente presenta los epitopes de unión en la topología correcta o está al servicio de funciones no relacionadas con la unión. Por tanto, las moléculas que solamente tienen una longitud de "péptido" (2 a 40 aminoácidos) se pueden unir a la proteína receptora de un determinado ligando de proteína grande. Estos péptidos pueden imitar la bioactividad del ligando de proteína grande (“agonistas del péptido”) o, mediante una unión competitiva, inhibir la bioactividad del ligando de la proteína grande (“antagonistas del péptido”).

Las bibliotecas de péptidos que presentan fagos se han revelado como un potente método para identificar estos agonistas y antagonistas de los péptidos. Véase, por ejemplo, Scott et al. (1990), Science 249:386; Devlin et al. (1990), Science 249:404; Patente estadounidense Nº 5.223.409, publicada el 29 de junio de 1993; Patente estadounidense Nº 5.733.731, publicada el 31 de marzo de 1998; Patente estadounidense nº 5.498.530, publicada el 12 de marzo de 1996; Patente estadounidense nº 5.432.018, publicada el 11 de julio de 1995; Patente estadounidense nº 5.338.665, publicada el 16 de agosto de 1994; Patente estadounidense nº 5.922.545, publicada el 13 de julio de 1999; WO 96/40987, publicado el 19 de diciembre de 1996; y WO 98/15833, publicado el 16 de abril de 1998. En estas bibliotecas, las secuencias aleatorias de péptidos se despliegan mediante fusión con las proteínas de recubrimiento del fago filamentoso. Típicamente, los péptidos desplegados se eluyen por afinidad frente a una proteína diana inmovilizada. Los fagos retenidos se pueden enriquecer mediante ciclos sucesivos de repropagación y purificación por afinidad. Los mejores péptidos de unión se pueden secuenciar para identificar los principales residuos dentro de una o más de las familias de péptidos estructuralmente relacionadas. Véase, por ejemplo, Cwirla et al. (1997), Science 276:1696-9, donde se identificaron dos familias distintas. Las secuencias de péptidos pueden sugerir también qué residuos pueden ser sustituidos de forma segura mediante escaneado de alanina o mediante mutagénesis en el plano del ADN. Se pueden crear y seleccionar bibliotecas de mutagénesis para optimizar todavía más la secuencia de los mejores elementos de unión. Lowman (1997), Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26:401-24.

El análisis estructural de la interaccción proteína-proteína también se puede utilizar para sugerir los péptidos que imitan la actividad de unión de los ligandos de proteínas grandes. En este análisis, la estructura de cristal puede sugerir la identidad y la orientación relativa de residuos críticos del ligando de proteína grande, a partir del cual se puede diseñar un péptido. Véase, por ejemplo, Takasaki et al. (1997), Nature Biotech. 15:1266-70. Estos métodos analíticos también se pueden emplear para investigar la interacción entre una proteína receptora y los péptidos seleccionados mediante la presentación de fagos, lo que puede sugerir una nueva modificación de los péptidos para incrementar la afinidad de unión.

Otros métodos compiten con la presentación de fagos en la investigación de péptidos. Se puede fusionar una biblioteca de péptidos con el carboxi-terminal del represor lac y expresarse en E. coli. Otro procedimiento basado en

E. coli permite la exposición en la membrana externa de la célula mediante fusión con una lipoproteína asociada al peptidoglicano (PAL). En adelante, estos y otros métodos relacionados se denominan colectivamente “presentación en E. coli”. En otro método, se interrumpe la traducción de ARN aleatorio antes de liberar ribosomas, dando como resultado una biblioteca de polipéptidos con su ARN asociado todavía unido. En adelante, este y otros métodos relacionados se denominan colectivamente “presentación en ribosomas”.

Otros métodos emplean péptidos unidos a ARN; por ejemplo, PROfusion technology, Phylos, Inc. Véase, por ejemplo, Roberts & Szostak (1997), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:12297-303. En adelante, este y los métodos relacionados se denominan colectivamente “selección de ARN-péptido”. Se han desarrollado bibliotecas de péptidos obtenidos por procesos químicos en las que los péptidos son inmovilizados en materiales no biológicos, estables, tales como varillas de polietileno o resinas permeables a disolventes. Otra biblioteca de péptidos obtenida por procesos químicos utiliza la fotolitografía para explorar los péptidos inmovilizados en portaobjetos. En adelante, este y los métodos relacionados se denominan colectivamente “selección de compuesto químico-péptido”. La selección de compuesto químico-péptido puede ser ventajosa porque permite el uso de D-aminoácidos y otros análogos no naturales, así como elementos no peptídicos. Tanto los métodos biológicos como químicos se revisan en Wells & Lowman (1992), Curr. Opin. Biotechnol, 3:355-62. Conceptualmente, se pueden descubrir peptidomiméticos de cualquier proteína utilizando la presentación del fago, la selección de ARN-péptido y los demás métodos anteriormente mencionados.

Resumen de la invención

La presente invención se refiere a agentes terapéuticos que modulan la actividad de TALL-1, tal y como se indica en las reivindicaciones. De acuerdo con la presente divulgación, los moduladores de TALL-1 pueden comprender una secuencia de aminoácidos Dz2Lz4 (SEC. ID. Nº: 108) donde z2 es un residuo de aminoácido y z4 es treonilo o isoleucilo. Estos moduladores de TALL-1 de la divulgación comprenden moléculas de las siguientes fórmulas:

donde: a1, a2, a3 son, cada uno de ellos independientemente, residuos de aminoácidos o están ausentes; 5 a6 es un residuo de aminoácido;

a9 es un residuo hidrófobo o básico; a8 es treonilo o isoleucilo; a12 es un residuo hidrófobo neutro; y

a13 y a14 son, cada uno de ellos independientemente, residuos de aminoácidos o están ausentes. 10

donde: b1 y b2 son, cada uno de ellos independientemente, residuos de aminoácidos o están ausentes; b3 es un residuo ácido o de amida;

15 b5 es un residuo de aminoácido; b6 es un residuo aromático: b8 es un residuo de aminoácido; b10 es T o I; b11 es un residuo básico;

20 b12 y b13 son, cada uno de ellos independientemente, residuos de aminoácidos; b14 es un residuo hidrófobo neutro; y b16, b17 y b18 son, cada uno de ellos independientemente, residuos de aminoácidos o están ausentes.

25 donde:

c1, c2, y c3 son, cada uno de ellos independientemente, residuos de aminoácidos o están ausentes; c5 es un residuo de aminoácido;' c7 es un residuo de aminoácido; c9 es T o I;

30 c10 es un residuo básico; c11 y c12 son, cada uno de ellos independientemente, residuos de aminoácidos; c13 es un residuo polar neutro; c14 es un residuo de aminoácido; c16 es un residuo de aminoácido;

35 c17 es un residuo hidrófobo neutro; y c18 es un residuo de aminoácido o está ausente.

donde:

40 d1, d2, y d3 son, cada uno de ellos independientemente, residuos de aminoácidos o están ausentes; d5, d6, y d7 son, cada uno de ellos independientemente, residuos de aminoácidos; d10 es un residuo de aminoácido; d12 es T o I;

d13 es un residuo de aminoácido; d14 es un residuo de aminoácido; y

d16, d17 y d18 son, cada uno de ellos independientemente, residuos de aminoácidos o están ausentes.

5 1(e)

donde: e1, e2, y e3 son, cada uno de ellos independientemente, residuos de aminoácidos o están ausentes.

e5, e6, e7, e9, y e13 son, cada uno de ellos independientemente, residuos de aminoácidos; 10 e11 es T o I; y

e15, e16 y e17 son, cada uno de ellos independientemente, residuos de aminoácidos o están ausentes.

donde:

15 f1, f2 y f3 son residuos de aminoácidos o están ausentes (con un f1, f2 y f3 preferiblemente C cuando f12, f13, o f14 es C);

f5 es W, Y, o F (preferiblemente W); f7 es un residuo de aminoácido (preferiblemente L);

f9 es T o I (preferiblemente T);

20 f10 es K, R, o H (preferiblemente K); f12 es C, un residuo polar neutro o un residuo básico (preferiblemente W, C o R); f13 es C, un residuo polar neutro o está ausente (preferiblemente V); y

f14 es cualquier residuo de aminoácido o está ausente;

siempre que solamente uno de f1, f2, o f3, pueda ser C, y solamente uno de f12, f13 y f14 pueda ser C.

25 Los compuestos de las fórmulas 1(a) a I (f) anteriores incorporan Dz2Lz4, así como la SEC. ID. Nº: 63, recogida más adelante. La secuencia de I(f) se obtuvo como una secuencia de consenso, tal y como se describe en el Ejemplo 1 más adelante. De los compuestos de la fórmula 1(f), aquellos en la fórmula

son realizaciones preferibles de la divulgación. Los compuestos comprendidos en la fórmula 1(f) incluyen las SEC. ID. Nº: 32, 58, 60, 62, 63, 66, 67, 69, 70, 114,115,122,123,124,147-150,152-177,179,180,187. También de conformidad con la presente divulgación se encuentran los compuestos que cuentan con el motivo de consenso: 35 PFPWE (SEC. ID. Nº: 110)

que también se unen a TALL-1. También de conformidad con la presente divulgación se encuentran los compuestos de las fórmulas:

donde:

g1, g2 y g3 son, cada uno de ellos independientemente, residuos de aminoácidos o están ausentes; g5 es un residuo polar neutro; g8 es un residuo polar neutro; g10 es un residuo ácido;

g12 y g13 son, cada uno de ellos independientemente, residuos de aminoácidos; y g14 está ausente o es un residuo de aminoácido.

I(h) (SEC. ID. Nº: 102)

donde:

h1, h2, y h3 son, cada uno de ellos independientemente, residuos de aminoácidos o están ausentes; h6 es un residuo hidrófobo; h7 es un residuo hidrófobo; h'° es un residuo hidrófobo polar o ácido; y h12, h13, y h14 son, cada uno de ellos independientemente, residuos de aminoácidos o están ausentes

I (i) (SEC. ID. Nº: 103)

donde:

i1 es un residuo de aminoácido o está ausente; i2 es un residuo polar neutro;

i3 es un residuo de aminoácido;

i5, i6, i7, y i8 son, cada uno de ellos independientemente, residuos de aminoácidos; i9 es un residuo ácido; i10 es un residuo de aminoácido; i12 y i13 son, cada uno de ellos independientemente, residuos de aminoácidos; y

i14 es un residuo polar neutro.

Los compuestos definidos por las fórmulas I(g) a I(i) también se unen a TALL-1.

También de conformidad con la presente divulgación, los moduladores de TALL-1 comprenden:

a) un dominio modulador de TALL-1 (por ejemplo, una secuencia de aminoácido de las fórmulas I(a) a I(i)), preferiblemente la secuencia de aminoácido Dz2Lz4 o secuencias derivadas de esta mediante presentación de fagos, selección de ARN-péptido, o las otras técnicas anteriormente mencionadas; y

b) un vehículo, como un polímero (p. ej. PEG o dextrano) o un dominio Fc, que es preferible;

donde el vehículo se une mediante un enlace covalente al dominio modulador de TALL-1. El vehículo y el dominio modulador de TALL-1 pueden estar unidos a través del extremo N-terminal o C-terminal del dominio modulador de TALL-1, tal y como se describe más adelante. El vehículo preferible es un dominio Fc y el dominio Fc preferible es un dominio Fc de IgG. Estos péptidos unidos a Fc se denominan en el presente “pepticuerpos”. Los dominios moduladores de TALL-1 preferibles comprenden las secuencias de aminoácidos descritas más adelante en las Tablas 1 y 2. Otros dominios moduladores de TALL-1 se pueden generar mediante presentación de fagos, selección de ARN-péptido y las demás técnicas mencionadas en el presente.

Asimismo, de conformidad con la presente divulgación se encuentra un proceso para generar moduladores de TALL1, que comprende:

a.

la selección de al menos un péptido que se une a TALL-1; y

b.

el enlace covalente del mencionado péptido con un vehículo.

El vehículo preferible es un dominio Fc. El paso (a) se realiza preferiblemente mediante la selección de las secuencias de péptidos de la Tabla 2 que se recoge más adelante o mediante presentación de fagos, selección de ARN-péptido o las demás técnicas anteriormente mencionadas.

Los compuestos de esta invención se pueden preparar mediante métodos sintéticos estándar, técnicas de ADN recombinante o cualquier otro método para la preparación de péptidos y proteínas de fusión. Los compuestos de esta invención que abarcan porciones no péptidas se pueden sintetizar mediante reacciones estándar de química orgánica, además de reacciones estándar de química peptídica, cuando resulte aplicable.

El uso primario contemplado para los compuestos de esta invención es como agentes terapéuticos o profilácticos. El péptido unido al vehículo puede tener una actividad comparable –o incluso superior-a la del ligando natural imitado por el péptido.

Los compuestos de esta invención se pueden utilizar con fines terapéuticos o profilácticos, formulándolos con unos materiales portadores farmacéuticos apropiados y administrando una cantidad efectiva a un paciente, como un humano (u otro mamífero) que lo necesite. Otros aspectos relacionados también se incluyen en la invención instantánea.

Numerosas ventajas y aspectos adicionales de la presente invención se pondrán de manifiesto tras analizar las cifras y la descripción detallada de la invención.

Breve descripción de las Figuras

La Figura 1 muestra ejemplos de dímeros Fc que se pueden obtener de un anticuerpo IgG1. “Fc” en la figura representa cualquiera de las variantes de Fc dentro del significado de “dominio FC” del presente. "X1” y "X2" representan péptidos o combinaciones enlazador-péptido como las que se definen más adelante. Los dímeros específicos son los siguientes:

A, D: Dímeros unidos por un solo disulfuro. Los anticuerpos IgG1 tienen típicamente dos enlaces de disulfuro en la región bisagra del anticuerpo. El dominio Fc en las Figuras 1A y 1D puede estar formado por truncación entre los dos sitios de enlace de disulfuro o por sustitución de un residuo de cisteinilo por un residuo no reactivo (p. ej., alanilo). En la Figura 1A, el dominio Fc está enlazado al término amino de los péptidos; en 1D, al término carboxilo.

B, E: Dímeros unidos por dos enlaces disulfuro. Este dominio Fc puede estar formado por truncación del anticuerpo parental de modo que retenga ambos residuos de cisteinilo en las cadenas del dominio Fc o por expresión a partir de una construcción que incluye una secuencia que codifica un dominio Fc de este tipo. En la Figura 1B, el dominio Fc está enlazado al término amino de los péptidos; en 1E, al término carboxilo.

C, F: Dímeros no covalentes. Este dominio Fc puede estar formado por eliminación de los residuos de

cisteinilo por truncación o sustitución. Puede ser deseable eliminar los residuos de cisteinilo para evitar las

impurezas generadas por la reacción del residuo de cisteinilo con residuos de cisteinilo de otras proteínas

presentes en la célula hospedadora. La unión no covalente de los dominios Fc es suficiente para mantener

unido el dímero.

Otros dímeros pueden formarse utilizando dominios Fc obtenidos de diferentes tipos de anticuerpos (p. ej., IgG2, IgM).

La Figura 2 muestra la estructura de compuestos preferibles de la invención que presentan repeticiones en tándem del péptido farmacológicamente activo. La Figura 2A muestra una molécula de una sola cadena y puede también representar la estructura de ADN para la molécula. La Figura 2B muestra un dímero en el que la porción enlazadorpéptido está presente solamente en una cadena del dímero. La Figura 2C muestra un dímero que tiene la porción peptídica en ambas cadenas. El dímero de la Figura 2C se formará espontáneamente en determinadas células hospedadoras después de la expresión de una estructura de ADN que codifica la cadena sencilla que se muestra en la Figura 3A. En otras células hospedadoras, las células podrían encontrarse en condiciones que favorezcan la formación de dímeros o los dímeros pueden formarse in vitro.

La Figura 3 muestra ejemplos de secuencias de ácido nucleico y de aminoácidos (SEC. ID. Nº 1 y 2, respectivamente) de Fc humano de IgG1 que puede utilizarse en la presente invención.

Las Figuras 4A a 4F muestran las secuencias de nucleótidos y aminoácidos (SEC. ID. Nº: 3-27) S de los fragmentos Ndel a Sall que codifican el péptido y el enlazador.

Las Figuras 5 A a 5M muestran la secuencia del nucleótido (SEC. ID. Nº: 28) del vector pAMG21-RANK-Fc, que se ha utilizado para generar las moléculas unidas a Fc de la presente invención. Estas figuras identifican una serie de características del ácido nucleico, entre las que se incluyen:

.

regiones promotoras PcopB, PrepA, ARN, APHII, luxFR, y luxPL;

.

mARN para APHII. luxR;

.

Secuencias de codificación y secuencias de aminoácidos para las proteínas copB, copT, repAI, repA4,

APHII luxR, RANK, y Fc;

.

Sitios de unión para las proteínas copB, CRP;

horquillas T1.T2.T7, y toop;

. Sitio del operador para la proteína de lujo;

Las Figuras 6A y 6B muestran la secuencia de ADN (SEC. ID. Nº: 97) insertada en pCFM1656 entre los sitios de restricción únicos AatII (posición #4364 en pCFM1656) y SacII (posición #4585 en pCFM1656) para formar el plásmido de expresión pAMG21 (nº de acceso ATCC 98113).

La Figura 7 muestra que el pepticuerpo TALL-1 (SEC. ID. Nº: 70) inhibe la proliferación de células B mediada por TALL-1. Las células B purificadas (105) de los ratones B6 se cultivaron por triplicado en placas de 96 pocillos con las cantidades indicadas del pepticuerpo de consenso TALL-1 en presencia de 10 ng/ml de TALL-1 más 2 μg/ml del anticuerpo anti-IgM . La proliferación se midió mediante la ingesta de timidina radioactiva [3H] en las últimas 18 horas de pulso. Los datos indicados representan la media de los pocillos por triplicado ± SD.

La Figura 8 muestra que los pepticuerpos de un dímero en tándem del extremo N-terminal de TALL-1 (SEC. ID. Nº: 123,124 en la Tabla 5B del presente) son preferibles para la inhibición de la proliferación de células B mediada por TALL-1. Las células B purificadas (105) de los ratones B6 se cultivaron por triplicado en placas de 96 pocillos con las cantidades indicadas del pepticuerpo 12-3 de TALL-1 y el pepticuerpo de consenso de TALL-1 (SEC. ID. Nº: 115 y 122 de la Tabla 5B) o los pepticuerpos del dímero relacionado (SEC. ID. Nº: 123,124) en presencia de 10 ng/ml de TALL-1 más 2 μg/ml del anticuerpo anti-IgM. La proliferación se midió mediante la ingesta de timidina radiactiva [3H] en las últimas 18 horas de pulso. Los datos indicados representan la media de los pocillos por triplicado ± SD.

Figura 9. El pepticuerpo AGP3 se une a AGP3 con gran afinidad. La constante del equilibrio de disociación (KD) se obtuvo de una regresión no lineal de las curvas de competencia, utilizando un modelo de unión homogéneo de doble curva en un sitio (software KinEx™). La KD es de unos 4 pM para el pepticuerpo AGP3 que se une al AGP3 humano (SEC. ID. Nº: 123).

Figuras 10A y 10B. El pepticuerpo AGP3 bloquea el AGP3 tanto humano como murino en el ensayo de competencia Biacore. La proteína humana soluble TACI se inmovilizó en el chip B1. Se incubó 1 nM de proteína humana recombinante AGP3 (panel superior) o 5 nM de proteína murina recombinante AGP3 (panel inferior) con la cantidad indicada del pepticuerpo AGP3, antes de inyectarlo sobre la superficie del receptor. Se mostró la respuesta de unión relativa de AGP3 humana y AGP3 murina (SEC. ID. Nº: 123).

Figuras 11A y 11B. El pepticuerpo AGP3 bloqueó la unión de AGP3 en los tres receptores TACL BCMA y BAFFR en el ensayo de competencia Biacore. Las proteínas TACI, BCMA y BAFFR del receptor soluble recombinante se inmovilizaron en el chip CM5. Se incubó 1 nM de AGP3 humana recombinante (panel superior) con la cantidad indicada del pepticuerpo AGP3 antes de inyectarlo sobre la superficie de cada receptor. Se midió la unión relativa de AGP3. Asimismo, se incubó 1 nM de la proteína recombinante APRIL con la cantidad indicada del pepticuerpo AGP3 antes de inyectarlo sobre la superficie de cada receptor. El pepticuerpo AGP3 no inhibió la unión de APRIL a los tres receptores (SEC. ID. Nº: 123).

Figuras 12A y 12B. El pepticuerpo AGP3 inhibe el aumento del nivel de inmunoglobulina sérica de ratón inducido por el desafío de la AGP3 humana. Los ratones Balb/c recibieron siete inyecciones intraperitoneales diarias de 1 mg/Kg de proteína AGP3 humana junto con suero, Fc humano o el pepticuerpo AGP3, a las dosis indicadas, y fueron desangrados al octavo día. Se midieron los niveles totales de IgM e IgA en suero mediante un ensayo ELISA (SEC. ID. Nº: 123).

Figura 13. El tratamiento con el pepticuerpo AGP3 redujo la gravedad de la artritis en el modelo de ratón CIA. Los ratones macho DBA/1 de 8 a 12 semanas de vida fueron inmunizados intradermalmente, en la base de la cola, con colágeno bovino tipo II (bCII) emulsionado en adyuvante completo de Freund, y se les administró una dosis de refuerzo tres semanas después de la inmunización inicial con bCII emulsionado en adyuvante incompleto de Freund. El tratamiento con la dosis indicada del pepticuerpo AGP3 comenzó a partir del día de la inmunización de refuerzo durante cuatro semanas. Como se ha descrito anteriormente (Khare et al., J. Immunol. 155: 3653-9,1995), se asignó una puntuación de 0-3 a cada una de las cuatro patas individualmente para calificar la gravedad de la artritis (SEC. ID. Nº: 123).

Figura 14. El tratamiento con el pepticuerpo AGP3 inhibió la generación de anticuerpos anti-colágeno en el modelo de ratón CIA. Como se ha descrito anteriormente, se tomaron muestras de suero una semana después del tratamiento final (día 35). El nivel de anticuerpos anti-colágeno II en suero se determinó mediante un ensayo ELIS A (SEC. ID. Nº: 123).

Figuras 15A y 15B. El tratamiento con el pepticuerpo AGP3 retrasó la aparición de la proteinuria y mejoró la supervivencia en los ratones con lupus NZB/NZW. Los ratones NZBx NZBWF1 de cinco meses de vida propensos al lupus fueron tratados intraperitonealmente tres veces por semana durante ocho semanas con PBS o las dosis indicadas del pepticuerpo AGP3 (SEC. ID. Nº: 123) o proteínas Fc humanas. La proteína en la orina se evaluó mensualmente durante toda la vida del experimento con las tiras reactivas Albustix (Bayer AG).

Las Figuras 16A y 16B muestran las secuencias de ácido nucleico y aminoácidos de un pepticuerpo de unión a TALL-1 preferible (SEC. ID. Nº: 189 y 123)

Descripción detallada de la invención

Definición de términos

Los términos empleados en la presente especificación se definen como sigue, a menos que se indique lo contrario en casos específicos.

Definiciones generales

El término “que comprende” significa que un compuesto puede incluir aminoácidos adicionales en cualquiera de los extremos N-terminal o C-terminal, o en ambos, de la secuencia dada. Por supuesto, estos aminoácidos adicionales no deben interferir de forma significativa en la actividad del compuesto.

Adicionalmente, las sales fisiológicamente aceptables de los compuestos de esta invención también están incluidas en el presente. El término “sales fisiológicamente aceptables” se refiere a cualquier sal ya conocida o descubierta con posterioridad que resulte farmacéuticamente aceptable. Algunos ejemplos específicos son: acetato; trifluoroacetato; hidrohaluros, como el hidrocloro y el hidrobromuro; sulfato; citrato; tartrato; glicolato; y oxalato.

Aminoácidos

El término “residuo ácido” se refiere a residuos de aminoácidos en forma D o L que tienen cadenas laterales que comprenden grupos ácidos. Algunos ejemplos de residuos ácidos incluyen el D y E.

El término “residuo de amida” se refiere a aminoácidos en forma D o L que tienen cadenas laterales que comprenden derivados de amida de grupos ácidos. Algunos ejemplos de residuos incluyen el N y Q.

El término “residuo aromático” se refiere a residuos de aminoácidos en forma D o L que tienen cadenas laterales que comprenden grupos aromáticos. Algunos ejemplos de residuos aromáticos incluyen el F, Y y W.

El término “residuo básico” se refiere a residuos de aminoácidos en forma D o L que tienen cadenas laterales que comprenden grupos básicos. Algunos ejemplos de residuos básicos incluyen el H, K y R.

El término “residuo hidrófilo” se refiere a residuos de aminoácidos en forma D o L que tienen cadenas laterales que comprenden grupos polares. Algunos ejemplos de residuos hidrófilos incluyen el C, S, T, N y Q.

El término “residuo no funcional” se refiere a residuos de aminoácidos en forma D o L que tienen cadenas laterales que carecen de grupos ácidos, básicos o aromáticos. Algunos ejemplos de residuos de aminoácidos no funcionales incluyen el M, G, A, V, I, L y norleucina (Nle).

El término “residuo hidrófobo neutro” se refiere a residuos de aminoácidos en forma D o L que tienen cadenas laterales que carecen de grupos ácidos, básicos o polares. Algunos ejemplos de residuos de aminoácidos hidrófobos neutros incluyen el A, V, L, I, P, W, M y F.

El término “residuo hidrófobo polar” se refiere a residuos de aminoácidos en forma D o L que tienen cadenas laterales que comprenden grupos polares. Algunos ejemplos de residuos de aminoácidos hidrófobos polares incluyen el T, G, S, Y, C, Q y N.

El término “residuo hidrófobo” se refiere a residuos de aminoácidos en forma D o L que tienen cadenas laterales que carecen de grupos ácidos o básicos. Algunos ejemplos de residuos de aminoácidos hidrófobos incluyen el A, V, L, I, P, W, M, F, T, G, S, Y, C, Q, y N.

Péptidos

El término "péptido" se refiere a moléculas de 1 a 40 aminoácidos, siendo preferibles las moléculas de 5 a 20 aminoácidos. Algunos ejemplos de péptidos pueden comprender el dominio de modulación de TALL-1 de una molécula naturalmente presente o comprenden secuencias aleatorizadas.

El término "aleatorizado" empleado para referirse a secuencias peptídicas se refiere a secuencias totalmente aleatorias (p. ej., seleccionadas mediante métodos de presentación de fagos o selección de ARN-péptido) y secuencias en las que uno o más residuos de una molécula naturalmente presente se sustituyen por un residuo de aminoácido que no aparece en esa posición en la molécula naturalmente presente. Algunos ejemplos de métodos para identificar las secuencias peptídicas incluyen la presentación de fagos, la presentación de E. coli, la presentación de ribosomas, la selección de ARN-péptido, la selección química y similares.

El término “dominio de modulación de TALL-1” se refiere a cualquier secuencia de aminoácidos que se une a TALL1 y comprende secuencias naturalmente presentes o secuencias aleatorizadas. Algunos ejemplos de dominios de modulación de TALL-1 se pueden identificar u obtener mediante presentación de fagos u otros métodos mencionados en el presente.

El término "antagonista de TALL-1" se refiere a una molécula que se une a TALL-1 y que aumenta o reduce uno o más de los parámetros del ensayo de forma opuesta al efecto sobre esos parámetros de TALL-1 nativo en toda su longitud. Esta actividad se puede determinar, por ejemplo, mediante ensayos como los descritos en la subsección titulada “Actividad biológica de AGP3”, de la sección de Materiales y métodos de la solicitud de patente titulada "Proteínas relacionadas con el TNF”, WO00/47740, publicada el 17 de agosto de 2000.

Vehículos y pepticuerpos

El término “vehículo” se refiere a una molécula que evita la degradación y/o aumenta la vida media, reduce la toxicidad, reduce la inmunogenicidad, o aumenta la actividad biológica de una proteína terapéutica. Algunos ejemplos de vehículos incluyen un dominio Fc (que es preferible), así como un polímero lineal (como glicol de polietileno (PEG), polilisina, dextrano, etc.); un polímero de cadena ramificada (véase, por ejemplo, la Patente estadounidense nº 4.289.872 de Denkenwalter et al., publicada el 15 de septiembre de 1981; 5.229.490 de Tarn, publicada el 20 de julio de 1993; WO 93/21259 de Frechet et al., publicada el 28 de octubre de 1993); un lípido; un grupo de colesterol (como un esteroide); un carbohidrato u oligosacárido (como dextrano); cualquier proteína, polipéptido o péptido natural o sintético que se une a un receptor de salvamento; albúmina, incluyendo albúmina sérica humana (HSA), dominio de cremallera de leucina, y cualesquiera otras de estas proteínas y fragmentos de proteínas. Los vehículos se describen más detalladamente más adelante.

El término “Fc nativo” se refiere a una molécula o secuencia que comprende la secuencia de un fragmento de unión no antigénico resultante de la digestión del anticuerpo entero, sea en forma monómera o multímera. La fuente original de inmunoglobulina del Fc nativo es preferiblemente de origen humano y puede ser cualquiera de las inmunoglobulinas, aunque preferiblemente la IgG1 e IgG2. Los Fc nativos se componen de polipéptidos monoméricos que pueden estar enlazados en forma dimérica o multimérica mediante asociación covalente (como uniones de disulfuro) y no covalente. El número de uniones intermoleculares disulfuro entre las subunidades monoméricas de moléculas de Fc nativo oscila entre 1 y 4, dependiendo de la clase (p. ej., IgG, IgA, IgE) o subclase

(p. ej., IgG1, IgG2, IgG3, IgA1, IgGA2). Un ejemplo de Fc nativo es un dímero unido por disulfuro resultante de la digestión de papaína de una IgG (véase Ellison et al. (1982), Nucleic Acids Res. 10:4071-9). El término "Fc nativo" empleado en el presente es genérico para las formas monoméricas, diméricas y multiméricas.

El término “variante de Fc” se refiere a una molécula o secuencia que está modificada a partir de un Fc nativo, pero comprende todavía un sitio de unión para el receptor de salvamento, FcRn. Las solicitudes internacionales WO 97/34631 (publicadas el 25 de septiembre de 1997) y WO 96/32478 describen ejemplos de variantes de Fc, así como la interacción con el receptor de salvamento. Así pues, el término “variante de Fc” comprende una molécula o secuencia que está humanizada a partir de un Fc nativo no humano.

Asimismo, un Fc nativo comprende sitios que pueden eliminarse porque proporcionan características estructurales o actividad biológica que no son necesarias para las moléculas de fusión de la presente invención. Así, el término “variante de Fc” comprende una molécula o secuencia que carece de uno o más sitios o residuos de Fc nativo que afectan o están implicados en (1) la formación de enlaces de disulfuro, (2) la incompatibilidad con una célula hospedadora seleccionada, (3) heterogeneidad del extremo C-terminal por expresión en una célula hospedadora seleccionada, (4) glicosilación, (5) interacción con el complemento, (6) fijación a un receptor de Fc distinto de un receptor de salvamento, o (7) citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC). Las variantes de Fc se describen detalladamente más adelante.

El término “dominio de Fc” abarca secuencias y moléculas de Fc nativo y variantes de Fc anteriormente descritas. Como en el caso de las variantes de Fc y Fc nativo, el término "dominio de Fc” incluye moléculas en forma monomérica o multimérica, tanto si están digeridas a partir del anticuerpo entero como se si han producido por otros medios.

El término “multimérico” aplicado a los dominios de Fc o moléculas que comprenden dominios de Fc se refiere a las moléculas que tienen dos o más cadenas de polipéptido asociadas covalentemente, no covalentemente, o mediante interacciones tanto covalentes como no covalentes. Las moléculas de IgG forman típicamente dímeros; las de IgM, pentámeros; las de IgD, dímeros; y las de IgA, monómeros, dímeros, trímeros o tetrámeros. Los multímeros pueden formarse por aprovechamiento de la secuencia y la actividad resultante de la fuente nativa de Ig del Fc o por derivatización (como se define más abajo) de un Fc nativo de este tipo.

El término “dímero” aplicado a los dominios de Fc o moléculas que comprenden dominios de Fc se refiere a moléculas que tienen dos cadenas de polipéptido asociadas covalentemente o no covalentemente. En la Figura 1 se muestran ejemplos de dímeros dentro del ámbito de aplicación de esta invención.

Los términos “derivatización” y “derivado” o “derivatizado” comprenden procesos y compuestos resultantes respectivamente en los que (1) el compuesto tiene una porción cíclica; por ejemplo, reticulación entre residuos de cisteinilo dentro del compuesto; (2) el compuesto está reticulado o tiene un sitio de reticulación; por ejemplo, el

compuesto tiene un residuo de cisteinilo y forma por tanto dímeros reticulados en cultivo o in vivo; (3) uno o más enlaces peptídicos están reemplazados por un enlace no peptídico; (4) el extremo N-terminal está reemplazado por -NRR1, NRC(O)R1 –NRC(O)OR1, -NRS(O)2R1, -NHC(O)NHR, un grupo succinimida, o benciloxicarbonil-NHsustituido o no sustituido, donde R y R1 y los sustituyentes del anillo son los que se definen más adelante; (5) el extremo C-terminal está reemplazado por -C(O)R2 o –NR3R4 , donde R2, R3 y R4 son los que se definen más adelante; y (6) compuestos en los que hay fracciones individuales de aminoácido modificadas por tratamiento con agentes capaces de reaccionar con determinadas cadenas laterales o residuos terminales. Los derivados se describen más detalladamente más adelante.

Los términos "pepticuerpo" y "pepticuerpos" se refieren a moléculas que comprenden un dominio de Fc y al menos un péptido. Estos pepticuerpos pueden ser multímeros o dímeros o fragmentos de los mismos, y pueden haber sido derivatizados. En la presente invención, las moléculas de las fórmulas II a VI del presente son pepticuerpo, donde V1 es un dominio de Fc.

Estructura de los compuestos

En general. Los autores de la presente invención identificaron secuencias capaces de unirse a TALL-1 y de modular su actividad biológica. Estas secuencias se pueden modificar a través de las técnicas anteriormente mencionadas, por las que se puede cambiar uno o más de los aminoácidos, manteniendo o incluso mejorando la afinidad de unión del péptido.

En las composiciones objeto del presente elaboradas de conformidad con esta invención, el péptido o los péptidos pueden unirse al vehículo a través del extremo N-terminal o C-terminal del péptido. Cualquiera de estos péptidos puede estar unido en tándem, es decir, secuencialmente, o con o sin enlazadores. Así, las moléculas vehículopéptido de la presente invención se pueden describir mediante la fórmula siguiente:

II

donde: V1 es un vehículo que consiste en una molécula que previene la degradación y/o aumenta la vida media, reduce la toxicidad, reduce la inmunogenicidad, o aumenta la actividad biológica de una proteína terapéutica, (preferiblemente un dominio Fc);

X1 y X2 son cada una seleccionadas independientemente de –(L1)C-P1, –(L1)C-P1-(L2)d-P2, -(L1)C-P1-(L2)d-P2(L3)e-P3 y –(L1)C-P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3-(L)f-P4

P1; P2 y P3 son cada una independientemente secuencias de dominios de modulación de TALL-1 tales como los de las Fórmulas I(a) a I(i); L1 y L2, L3 y L4 son cada una independientemente enlazadores; y a, b, c, d, e y f son cada una independientemente 0 o 1, siempre que al menos una de a y b sea 1.

Así, el compuesto II comprende compuestos preferibles de las fórmulas III X1-V1 y multímeros de la misma, donde V1 es un dominio Fc y está unido al extremo C-terminal de A1; IV V1-X2 y multímeros de la misma, donde V1 es un dominio Fc y está unido al extremo N-terminal de A2; V V1-(L1)C-P1 y multímeros de la misma, donde V1 es un dominio Fc y está unido al extremo N-terminal de -(L1)C-P1; y

VI V1-(L1)C-P1-(L2)d-P2

y multímeros de la misma, donde V1 es un dominio Fc y está unido al extremo N-terminal de -L1-P1-L2-P2.

Péptidos. Los péptidos de la presente invención son útiles como péptidos moduladores de TALL-1 o como dominios moduladores de TALL-1 en las moléculas de las fórmulas II a VI. Las moléculas de la presente invención que comprenden estas secuencias de péptidos se pueden preparar con métodos conocidos en el campo.

Las secuencias de péptidos preferibles de la divulgación son aquellas de las anteriores fórmulas I(a) que tienen los sustituyentes que se identifican a continuación.

Tabla 1 – Sustituyentes de péptidos preferibles

Fórmula I(a)

a8 es T; a9 es un residuo básico (preferiblemente K); y a12 es un residuo hidrófobo neutro (preferiblemente F).

Fórmula I(b)

b3 es D, Q, o E; b6 es W o Y; b10 es T; b11 es K o R; y B14 es V o L.

Fórmula I(c)

c9 es T; c10 es K o R; c13 es a I L, o V; y c17 es A o L.

Fórmula I(d)

d12 es T.

Fórmula I(e)

e11 es T.

Fórmula I(f)

f9 es T; f10 es K; y f13 es V.

Fórmula I(g)

g5 es W; g8 es P; g10 es E; y g13 es un residuo básico.

Fórmula I(h)

hl es G; h6 es A; h7 es un residuo hidrófobo neutro; y h10 es un residuo ácido.

Fórmula I(i)

i2 es W; y I14 es W.

Las secuencias de péptidos preferibles aparecen en la Tabla 2 más abajo.

Tabla 2 – Dominios moduladores TALL-1 preferibles

Secuencia

Cabe señalar que los receptores conocidos para TALL-1 presentan cierta homología en las secuencias con los péptidos preferibles:

5 (SEC. ID. Nº: 33,195,196, y 197, respectivamente).

Cualquier péptido que contenga un residuo de cisteinilo puede reticularse con otro péptido que contenga Cys, pudiendo estar enlazados cualquiera de ellos o ambos a un vehículo. Asimismo, cualquier péptido que tenga más de un residuo Cys puede formar un enlace de disulfuro intrapeptídico. Cualquiera de estos péptidos puede derivatizarse

10 como se describe más adelante.

Se pueden obtener otras secuencias peptídicas útiles de modificaciones conservadoras y/o no conservadoras de las

secuencias de aminoácidos de la Tabla 2.

Las modificaciones conservadoras producirán péptidos que tienen características funcionales y químicas similares a

las del péptido en el que se han hecho tales modificaciones. Por lo contrario, las modificaciones sustanciales en las

5 características funcionales y/o químicas de los péptidos pueden realizarse seleccionando sustituciones en la secuencia de aminoácidos que difieren significativamente en su efecto o mantenimiento (a) de la estructura de la cadena molecular principal en el área de la sustitución, por ejemplo, como una conformación en hoja o helicoidal, (b) de la carga o carácter hidrófobo de la molécula en el sitio diana, o (c) el tamaño de la molécula.

Por ejemplo, una “sustitución conservadora de aminoácido” puede implicar una sustitución de un residuo de

10 aminoácido nativo por un residuo no nativo, de tal modo que se produzca poco o ningún efecto sobre la polaridad o la carga del residuo de aminoácido en dicha posición. Por otra parte, cualquier residuo nativo en el polipéptido puede sustituirse también por alanina, como se ha descrito previamente para la “mutagénesis por barrido de alanina” (véase, por ejemplo, MacLennan et al., (1998), Acta Physiol. Scand. Suppl. 643: 55-67; Sasaki et al., 1998, Adv. Biophys. 35: 1-24, que exponen la mutagénesis por barrido de alanina).

15 Las personas con conocimientos en el campo pueden determinar las sustituciones de aminoácidos deseadas (sean conservadoras o no conservadoras) en el momento en que se deseen dichas sustituciones. Por ejemplo, pueden utilizarse las sustituciones de aminoácidos para identificar residuos importantes de la secuencia peptídica, o para aumentar o disminuir la afinidad del péptido o de las moléculas vehículo-péptido (véanse las fórmulas precedentes) descritas en el presente. Algunos ejemplos de sustituciones de aminoácidos se recogen en la Tabla 3.

20 Tabla 3-Sustituciones de Aminoácidos

Residuos originales

Ejemplos de sustituciones Sustituciones preferibles

Ala (A)

Val, Leu, lle Val

Arg(R)

Lys, Gin, Asn Lys

Asn (N)

Gin Gin

Asp (D)

Glu Glu

Cys(C)

Ser, Ala Ser

Gln (Q)

Asn Asn

Glu (E)

Asp Asp

Gly(G)

Pro, Ala Ala

His (H)

Asn,<3ln, Lys, Arg Arg

lle(l)

Leu, Val, Met, Ala, Phe, Norleucina Leu

Leu (L)

Norleucina, lle, Val, Met, Ala, Phe lle

Lys(K)

Arg, ácido 1,4-diaminobutírico, Gin, Asn Arg

Met (M)

Leu, Phe, lle Leu

Phe (F)

Leu, Val, lle, Ala, Tyr Leu

Pro (P)

Ala Gly

Ser (S)

Thr, Ala, Cys Thr

Thr(T)

Ser Ser

Trp(W)

Tyr, Phe Tyr

Tyr(Y)

Trp, Phe, Thr, Ser Phe

Val (V)

IIe, Met, Leu, Phe, Ala, Norleucina Leu

En determinadas realizaciones, las sustituciones conservadoras de aminoácidos abarcan también residuos de aminoácidos no naturalmente presentes que se incorporan típicamente por síntesis química de péptidos en lugar de hacerlo por síntesis en sistemas biológicos.

Como se ha indicado en la sección anterior “Definición de términos”, los residuos naturalmente presentes pueden dividirse en clases basándose en propiedades comunes de las cadenas laterales que pueden ser útiles para las modificaciones de la secuencia. Por ejemplo, las sustituciones no conservadoras pueden implicar el cambio de un miembro de una de estas clases por un miembro de otra clase. Estos residuos sustituidos pueden introducirse en regiones del péptido que son homólogas a los ortólogos no humanos, o en las regiones no homólogas de la molécula. Adicionalmente, pueden hacerse también modificaciones utilizando P o G con el fin de influir en la orientación de la cadena.

Al hacer estas modificaciones, puede tenerse en cuenta el índice hidropático de los aminoácidos. Se ha asignado a cada aminoácido un índice hidropático basándose en sus características de hidrofobicidad y carga, siendo éstos: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteína/cistina (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptófano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9) y arginina (-4,5).

La importancia del índice hidropático de los aminoácidos para conferir una función biológica interactiva a una proteína es conocida en el campo. Kyte et al., J. Mol. Biol., 157:105-131 (1982). Es sabido que ciertos aminoácidos pueden sustituirse por otros aminoácidos que tienen un índice o registro hidropático similar, reteniendo todavía una actividad biológica similar. Al realizar los cambios basados en el índice hidropático, es preferible la sustitución de los aminoácidos cuyos índices hidropáticos están dentro de ± 2, siendo particularmente preferibles los que están dentro de ± 1, y todavía más preferibles los que están dentro de ± 0,5.

También se conoce en el campo que la sustitución de aminoácidos similares puede realizarse eficazmente sobre la base de la hidrofilicidad. La hidrofilicidad media local máxima de una proteína, regida por la hidrofilicidad de sus aminoácidos adyacentes, está en correlación con su inmunogenicidad y su antigenicidad, es decir, con una propiedad biológica de la proteína.

Se han asignado a los residuos de aminoácidos los valores de hidrofilicidad siguientes: arginina (+3,0); lisina (+3,0); aspartato (+3,0 ± 1); glutamato (+ 3,0 ± 1); serina (+0,3); asparagina (+0,2) glutamina (+0,2); glicina (0); treonina (0,4); prolina (-0,5 ±1); alanina (-0,5); histidina (-0,5); cisteína (-1,0); metionina (-1,3), valina (-1,5); leucina (-1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina (-2,5); triptófano (-3,4).

Al realizar los cambios basados en valores de hidrofilicidad similares, se prefiere la sustitución de aminoácidos cuyos valores de hidrofilicidad están dentro de ± 2, siendo particularmente preferibles los que están dentro de ± 1, y todavía más preferibles los que están dentro de ± 0,5:

También se pueden identificar epítopes a partir de secuencias primarias de aminoácidos basándose en la hidrofilicidad. Estas regiones también se denominan “regiones epitópicas centrales”.

Una persona experta en el campo será capaz de determinar las variantes adecuadas del polipéptido expuestas en las secuencias anteriores utilizando técnicas bien conocidas. Para identificar áreas adecuadas de la molécula que pueden cambiarse sin destrucción de la actividad, una persona con conocimientos en el campo puede dirigirse a las áreas que no se consideran importantes para la actividad. Por ejemplo, cuando se conocen polipéptidos similares con actividades similares de la misma especie o de otras especies, una persona con conocimientos en el campo puede comparar la secuencia de aminoácidos de un péptido con péptidos similares. Con una comparación de este tipo, se pueden identificar residuos y porciones de las moléculas que están conservadas entre polipéptidos similares. Se apreciará que los cambios en las áreas de un péptido que no están conservadas en relación con péptidos similares de este tipo tendrían menos posibilidades de afectar negativamente a la actividad biológica y/o la estructura del péptido. Una persona con conocimientos en el campo sabrá también que, incluso en regiones relativamente conservadas, se pueden sustituir aminoácidos químicamente similares por los residuos naturalmente presentes, manteniendo al mismo tiempo la actividad (sustituciones por residuos de aminoácidos conservadores). Por tanto, incluso áreas que pueden ser importantes para la actividad biológica o para la estructura pueden someterse a sustituciones conservadoras de aminoácidos sin destruir la actividad biológica o sin afectar negativamente a la estructura del péptido.

Adicionalmente, una persona con conocimientos en el campo puede revisar estudios estructura-función que identifican residuos en péptidos similares que son importantes para la actividad o la estructura. Viendo una comparación de este tipo, se puede predecir la importancia de los residuos de aminoácidos en un péptido que corresponden a residuos de aminoácidos que son importantes para la actividad o la estructura en péptidos similares. Una persona con conocimientos en el campo puede optar por sustituciones de aminoácidos químicamente similares para estos residuos de aminoácidos de los péptidos previstos como importantes.

Una persona con conocimientos en el campo puede analizar también la estructura tridimensional y la secuencia de aminoácidos en relación con dicha estructura en polipéptidos similares. En vista de dicha información, una persona con conocimientos en el campo puede predecir la alineación de los residuos de aminoácidos de un péptido con respecto a su estructura tridimensional. Una persona con conocimientos en el campo puede elegir no hacer cambios

radicales en residuos de aminoácidos que se prevé se encuentran en la superficie de la proteína, dado que tales residuos pueden estar implicados en interacciones importantes con otras moléculas. Además, una persona con conocimientos en el campo puede generar variantes de ensayos que contengan una sustitución de un solo aminoácido en cada residuo añadido de aminoácido deseado. Las variantes pueden analizarse después utilizando ensayos de actividad conocidos por las personas con conocimientos en el campo. Estos datos podrían utilizarse para recoger información acerca de variantes adecuadas. Por ejemplo, si se descubre que un cambio en un residuo de un aminoácido determinado da como resultado una actividad destruida, reducida indeseablemente, o inadecuada, deberían evitarse las variantes que contengan dicho cambio. Dicho de otro modo, basándose en la información recopilada a partir de estos experimentos rutinarios, una persona con conocimientos en el campo puede determinar fácilmente los aminoácidos en los que deberían evitarse otras sustituciones, sea aisladas o en combinación con otras mutaciones.

Varias publicaciones científicas se han dedicado a la predicción de la estructura secundaria. Véase Moult J., Curr. Op. in Biotech.. 7(4): 422-427 (1996), Chou et al., Biochemistry, 13(2): 222-245 (1974); Chou et al., Biochemistry, 113(2): 211-222 (1974); Chou et al., Adv. Enzvmol. Relat. Areas Mol. Biol., 47:45-148 (1978); Chou et al., Ann. Rev. Biochem., 47: 251-276 y Chou et al., Biophys. J., 26:367-384 (1979). Además, actualmente existen programas informáticos que ayudan a la predicción de la estructura secundaria. Un método de predicción de la estructura secundaria se basa en los modelos de homologías. Por ejemplo, dos polipéptidos o proteínas que tienen una identidad de secuencia superior al 30%, o similitud superior al 40%, tienen a menudo topologías estructurales similares. El reciente crecimiento de la base de datos estructurales de proteínas (PDB) ha proporcionado una predictibilidad mejorada de la estructura secundaria, incluyendo el número potencial de pliegues dentro de la estructura del polipéptido o la proteína. Véase Holm et al., Nucl Acid. Res., 27(1): 244-247 (1999). Se ha sugerido (Brenner et al.Curr. Op. Struct. Biol., 7(3): 369-376 (1997) que existe un número limitado de pliegues en un determinado polipéptido o proteína y que, una vez que se haya resuelto un número crítico de estructuras, la predicción estructural ganará espectacularmente en exactitud.

Otros métodos de predicción de la estructura secundaria incluyen el “ensartado” (Jones, D., Curr. Opin. Struct. Biol., 7(3): 377-87 (1997); Sippl et al., Structure, 4(1): 15-9 (1996)), "análisis de perfiles" (Bowie et al., Science, 253:164170 (1991); Gribskov et al., Meth. Enzym., 183:146-159 (1990); Gribskov et al., Proc. Nat. Acad. Sci., 84(13): 4355-8 (1987)), y "enlace evolutivo" (véase Home, supra, y Brenner, supra).

Vehículos. Esta invención requiere la presencia de al menos un vehículo (V1) unido a un péptido a través del extremo N-terminal, C-terminal o de una cadena lateral de uno de los residuos de aminoácidos. También se pueden emplear múltiples vehículos; por ejemplo, los Fc de cada extremo terminal o un Fc de un extremo terminal y un grupo PEG del otro extremo terminal o una cadena lateral. Algunos ejemplos de vehículos incluyen:

. un dominio Fc;

. otras proteínas, polipéptidos o péptidos capaces de unirse a un receptor de salvamento;

. albúmina sérica humana (HSA);

. un dominio de cremallera de leucina (LZ);

•

glicol de polietileno (PEG), incluyendo 5 kD, 20 kD y 30 kD PEG, así como otros polímeros;

•

dextrano;

y otras moléculas conocidas en el campo por proporcionar un aumento de la vida media y/o protección frente a la degradación proteolítica o la eliminación.

Un dominio Fc es el vehículo preferible. El dominio Fc puede estar fusionado al extremo N-terminal o C-terminal de los péptidos, o a ambos extremos. La fusión al extremo N-terminal es preferible.

Como se ha indicado arriba, las variantes de Fc son vehículos adecuados dentro del alcance de aplicación de esta invención. Un Fc nativo puede modificarse extensamente para formar una variante de Fc de acuerdo con esta invención, siempre que se mantenga la unión al receptor de salvamento; véase, por ejemplo, WO 97/34631 y WO 96/32478.En tales variantes de Fc, se pueden eliminar uno o más sitios de un Fc nativo que proporcionan características estructurales o actividad funcional no requeridas por las moléculas de fusión de esta invención. Se pueden eliminar estos sitios, por ejemplo, por sustitución o deleción de residuos, insertando residuos en el sitio, o truncando porciones que contienen el sitio. Los residuos insertados o sustituidos pueden ser también aminoácidos alterados, tales como peptidomiméticos o D-aminoácidos. Las variantes de Fc pueden ser deseables por diversas razones, algunas de las cuales se describen a continuación. Algunos ejemplos de variantes de Fc incluyen las moléculas y secuencias en las que:

1. Se eliminan los sitios implicados en la formación de enlaces de disulfuro. Esta eliminación puede evitar la reacción con otras proteínas que contienen cisteína presentes en la célula hospedadora utilizada para producir las moléculas de la invención. Para este propósito, se puede truncar el segmento que contiene cisteína en el extremo C-terminal, o se pueden delecionar o sustituir por otros aminoácidos los residuos de cisteína (p. ej., alanilo, serilo). En particular, se puede truncar el segmento de 20 aminoácidos del extremo Nterminal de la SEC. ID. Nº: 2 o delecionar o sustituir los residuos de cisteína en las posiciones 7 y 10 de la

SEC. ID. Nº: 2. Incluso cuando se eliminan residuos de cisteína, los dominios Fc de una sola cadena pueden

formar todavía un dominio Fc dimérico que se mantiene unido de modo no covalente.

2. Se modifica un Fc nativo para hacerlo más compatible con una célula hospedadora seleccionada. Por ejemplo, se puede eliminar la secuencia PA cerca del extremo N-terminal de un Fc nativo típico, que puede ser reconocido por una enzima digestiva en E. coli, como la prolina-iminopeptidasa. También se puede añadir un residuo de metionina del extremo N-terminal, especialmente cuando la molécula se expresa recombinantemente en una célula bacteriana como E. coli. El dominio Fc de la SEC. ID: Nº: 2 es una variante Fc de este tipo.

3.Se elimina una porción del extremo N-terminal de un Fc nativo para prevenir la heterogeneidad del extremo N-terminal cuando se expresa en una célula hospedadora seleccionada. Para este propósito, se puede delecionar cualquiera de los 20 primeros residuos de aminoácidos del extremo N-terminal, particularmente los que se encuentran en las posiciones 1, 2, 3, 4 y 5.

4.Se eliminan uno o más sitios de glicosilación. Los residuos que están glicosilados típicamente (p. ej.,

asparagina) puede conferir una respuesta citolítica. Estos residuos se pueden delecionar o sustituir por

residuos no glicosilados (p. ej., alanina).

5.

Se eliminan los sitios implicados en la interacción con el complemento, tales como el sitio de unión C1q. Por ejemplo, se puede delecionar o sustituir la secuencia EKK de la IgG1 humana. El reclutamiento del complemento puede no ser ventajoso para las moléculas de esta invención y, por tanto, podría evitarse con una variante de Fc de este tipo.

6.

Se eliminan los sitios que afectan a la unión a receptores de Fc distintos de un receptor de salvamento. Un Fc nativo puede tener sitios para la interacción con determinados leucocitos que no son necesarios para las moléculas de fusión de la presente invención y, por consiguiente, pueden ser eliminados.

7.

Se elimina el sitio ADCC. Los sitios ADCC son conocidos en el campo; véase, por ejemplo, Molec. Immunol. 29 (5): 633-9 (1992) relativo a los sitios ADCC en IgG1. Estos sitios tampoco son necesarios para las moléculas de fusión de la presente invención y, por tanto, pueden ser eliminados.

8.

Cuando el Fc nativo se obtiene de un anticuerpo no humano, el Fc nativo puede humanizarse. Típicamente, para humanizar un Fc nativo se sustituirán residuos seleccionados del Fc nativo no humano por residuos que se encuentran normalmente en el Fc nativo humano. Las técnicas para la humanización de anticuerpos son bien conocidas en el campo.

Las variantes de Fc preferibles incluyen las siguientes. En la SEC. ID. Nº: 2 (Figura 3), la leucina de la posición 15 se puede sustituir por glutamato; el glutamato de la posición 99, por alanina; y las lisinas de las posiciones 101 y 103, por alaninas. Asimismo, se puede sustituir uno o más residuos de tirosina por residuos de fenilalanina.

Un vehículo alternativo sería una proteína, un polipéptido, péptido, anticuerpo, fragmento de anticuerpo o una molécula pequeña (p. ej., un compuesto petidomimético) capaz de unirse a un receptor de salvamento. Por ejemplo, se podría utilizar como vehículo un polipéptido como el descrito en la Patente estadounidense nº 5.739.277, publicada el 14 de abril de 1998 por Presta et al. También se podrían seleccionar péptidos mediante presentación de fagos o selección de ARN-péptido para la unión al receptor de salvamento FcRn. Estos compuestos de unión al receptor de salvamento también se incluyen dentro del significado de “vehículo” y se encuentran dentro del ámbito de aplicación de esta invención. Estos vehículos se deberían seleccionar para un aumento de la vida media (p. ej., evitando secuencias reconocidas por las proteasas) y una reducción de la inmunogenicidad (p. ej., favoreciendo las secuencias no inmunogénicas, como las descubiertas en la humanización del anticuerpo).

Como se ha seleccionado anteriormente, también se pueden utilizar vehículos del polímero para V1. Actualmente existen varios medios para unir fracciones químicas que se pueden emplear como vehículos; véase, p. ej., la publicación internacional Patent Cooperation Treaty (“PCT”) nº WO 96/11953, titulada “N-Terrninally Chemically Modified Protein Compositions and Methods” (Métodos y compuestos de la proteína modificada químicamente en el extremo N-terminal). Esta publicación PCT revela, entre otras cosas, la unión selectiva de polímeros solubles en agua al extremo N-terminal de las proteínas.

Un vehículo del polímero preferible es el glicol de polietileno (PEG). El grupo PEG puede tener cualquiera de los pesos moleculares convenientes y puede ser lineal o ramificado. El peso molecular medio del PEG oscilará preferiblemente entre 2 kiloDalton ("kD") y 100 kD, más preferiblemente entre 5 kD y 50 kD aproximadamente, y todavía más preferiblemente entre 5 kD y 10kD aproximadamente. Por lo general, los grupos PEG se unirán a los compuestos de la invención mediante acilación o alquilación reductiva a través de un grupo reactivo de la fracción PEG (p. ej., un grupo aldehído, amino, tiol o éster) a un grupo reactivo del compuesto de la invención (p. ej., un grupo aldehído, amino o éster).

Una estrategia útil para la PEGilación de los péptidos sintéticos consiste en combinar un péptido con una fracción PEG, mediante la formación de un enlace conjugado en solución, portando cada uno de ellos una funcionalidad especial que es mutuamente reactiva frente a la otra. Los péptidos se pueden preparar fácilmente con síntesis convencionales en fase sólida. Los péptidos son “preactivados” con un grupo funcional apropiado en un sitio

específico. Los precursores son purificados y totalmente caracterizados antes de reaccionar con la fracción PEG. Normalmente la unión del péptido con el PEG se produce en fase acuosa y se puede controlar fácilmente mediante una HPLC analítica de fase inversa. Los péptidos PEGilados pueden ser purificados fácilmente, mediante una HPLC preparativa y caracterizados mediante una HPLC analítica, un análisis de aminoácidos y una espectrometría de masas por desabsorción láser.

Los polímeros de polisacáridos son otro tipo de polímero soluble en agua que se puede utilizar para la modificación de proteínas. Los dextranos son polímeros de polisacáridos compuestos por subunidades individuales de glucosa, unidos predominantemente por enlaces a1-6. El propio dextrano está disponible en varios rangos de peso molecular y se puede obtener fácilmente con pesos moleculares de entre 1 kD a 70 kD aproximadamente. El dextrano es un polímero soluble en agua adecuado para utilizarlo en la presente invención como vehículo por sí solo o en combinación con otro vehículo (p. ej., Fc). Véase, por ejemplo, WO 96/11953 y WO 96/05309. El uso de dextrano conjugado con inmunoglobulinas de diagnóstico o terapéuticas se ha documentado; véase, por ejemplo, la Publicación de Patente Europea nº 0 315 456. Es preferible el dextrano de entre 1 kD a 20 kD aproximadamente, cuando el dextrano se utiliza como vehículo de acuerdo con la presente invención.

Enlazadores. Cualquier grupo “enlazador” es opcional. Cuando está presente, su estructura química no es crítica, dado que sirve fundamentalmente como separador. El enlazador está constituido preferiblemente por aminoácidos unidos entre sí por enlaces peptídicos. Así, en realizaciones preferibles, el enlazador está compuesto por 1 a 30 aminoácidos unidos por enlaces peptídicos, en los que los aminoácidos están seleccionados de entre los 20 aminoácidos naturalmente presentes. Algunos de estos aminoácidos pueden ser glicosilados, como es bien conocido por las personas con conocimientos en el campo. En una realización más preferible, los 1 a 20 aminoácidos se seleccionan de entre la glicina, alanina, prolina, asparagina, glutamina, y lisina. De modo todavía más preferible, un enlazador está compuesto por una mayoría de aminoácidos que no presentan impedimento estérico, tales como la glicina y alanina. Así, los enlazadores preferibles son poliglicinas (particularmente (Gly)4, (Gly)s), poli(Gly-Ala) y polialaninas. Otros ejemplos específicos de enlazadores son:

(Gly)3Lys(Gly)4 (SEC. ID: Nº: 40);

(Gly)3AsnGlySer(Gly)2, (SEC. ID. Nº: 41);

(Gly)3,Cys(Gly)4 (SEC. ID. Nº: 42); y

GlyProAsnGlyGly (SEC. ID. Nº: 43).

Para explicar la nomenclatura anterior, por ejemplo,(Gly)3-Lys (Gly)4 significa Gly-Gly-Gly-Lys-Gly-Gly-Gly-Gly (SEC. ID. Nº: 40). Las combinaciones de Gly y Ala también son preferibles. Los enlazadores aquí mostrados son solo algunos ejemplos; los enlazadores dentro del ámbito de aplicación de la presente invención pueden ser mucho más largos e incluir otros residuos.

Los enlazadores preferibles son enlazadores de aminoácidos que comprenden más de cinco aminoácidos, aunque los enlazadores adecuados tienen hasta unos 500 aminoácidos seleccionados de entre la glicina, alanina, prolina, asparagina, glutamina, lisina, treonina, serina o aspartato. Los enlazadores de entre 20 y 50 aminoácidos aproximadamente son los más preferibles. Un grupo de enlazadores preferibles son los de las siguientes fórmulas:

GSGSATGGSGSTASSGSGSATx1x2 (SEC. ID. Nº:193)

y

GSGSATGGSGSTASSGSATx1x2GSGSATGGSGSTASSGSGSATx3x4 (SEC. ID. Nº:194)

donde x1 y x3 son, cada uno de ellos independientemente, residuos básicos o hidrófobos, y x2 y x4 son, cada uno de ellos e independientemente, residuos hidrófobos. Los enlazadores preferibles específicos son:

GSGSATGGSGSTASSGSGSATHM (SEC. ID. Nº:59)

GSGSATGGSGSTASSGSGSAGM (SEC. ID. Nº: 190)

GSGSATGGSGSTASSGSGSATGS (SEC. ID. Nº:191) y

GSGSATGGSGSTASSGSGSATHMGSGSATGGSGSTASSGSGSGSATHM (SEC. ID. Nº:192)

También son posibles los enlazadores no peptídicos. Por ejemplo, podrían utilizarse enlazadores alquílicos tales como -NH-(CH2)-C(O)--NH-(CH2),-C(O)-, donde s = 2-20. Estos enlazadores alquílicos también pueden ser sustituidos por cualquier grupo que no presente impedimento estérico, como el alquilo inferior (p. ej. C1-C6)p. ej., C1-C6 acilo inferior, halógeno (p. ej., Cl, Br), CN,NH2, NH2, fenilo, etc. Un ejemplo de enlazador no peptídico es un enlazador PEG,

VII

donde n es tal que el enlazador tiene un peso molecular de 100 a 5000 kD, preferiblemente de 100 a 500 kD. Los enlazadores peptídicos pueden ser alterados para formar derivados de la misma manera que se ha descrito anteriormente.

Derivados. Los autores de la invención contemplan también la derivatización de la porción del péptido y/o vehículo de los compuestos. Estos derivados pueden aumentar la solubilidad, absorción, vida media biológica, etc., de los compuestos. Las fracciones pueden eliminar o atenuar alternativamente cualquier efecto secundario indeseable de los compuestos, etc. Algunos ejemplos de derivados incluyen compuestos en los que:

1.

El compuesto o alguna porción del mismo es cíclico. Por ejemplo, la porción del péptido puede modificarse para contener dos o más residuos Cys (p. ej., en el enlazador), que podrían ciclarse mediante la formación de enlaces de disulfuro.

2.

El compuesto está reticulado o se ha hecho susceptible de reticulación entre moléculas. Por ejemplo, la porción del péptido puede modificarse de modo que contenga un residuo Cys y, de este modo, que sea capaz de formar un enlace de disulfuro intermolecular con una molécula semejante. El compuesto puede reticularse también a través de su extremo C-terminal, como en la molécula que se muestra a continuación.

VIII

En la Fórmula VIII, cada "V1'" puede representar típicamente una cadena del dominio Fc.

3.

Uno o más enlaces (uniones) peptídicos [-C(O)NR-] se reemplaza por un enlace no peptídico. Algunos ejemplos de enlaces no peptídicos son -CH2-carbamato [-CH2-OC(O)NR-], fosfonato, -CH2-sulfonamida [CH2-S (O)2NR-], urea [-NHC(O)NH-], -CH2-amina secundaria, y péptido alquilado [-C(O)NR6-] en donde R6 es alquilo inferior.

4.

El extremo N-terminal está derivatizado. Típicamente, el extremo N-terminal puede ser acilado o modificado para formar una amina sustituida. Algunos ejemplos de grupos derivados del extremo N-terminal incluyen -NRR1 (distinto de -NH2, -NRC(O)R1, -NRC(O)OR1, -NRS(O)2R1, -NHC(O)NHR1, succinimida o benciloxicarbonil-NH-(CBZ-NH-), en donde R y R1, son cada uno de ellos independientemente, hidrógeno o alquilo inferior, y donde el anillo fenilo puede ser sustituido por 1 a 3 sustituyentes seleccionados del grupo compuesto por alquilo C1,-C4, alcoxi C1,C4, cloro y bromo.

5.

El extremo C-terminal libre está derivatizado. Típicamente, el extremo C-terminal está esterificado o amidado Algunos ejemplos de grupos derivados del extremo C-terminal incluyen, por ejemplo, -C(O)R2 donde R2 es alcoxi inferior o -NR3R4 donde R3 y R4 son independientemente hidrógeno o alquilo C1-C8 (preferiblemente alquilo C1-C4).

6.Un enlace de disulfuro es sustituido por otra fracción reticuladora, preferiblemente más estable (p.ej., un alquileno). Véase, p. ej., Bhatnagar et al, (1996), J. Med. Chem. 39:3814-9; Alberts et al. (1993) Thirteenth Am. Pep. Symp., 357-9.

7. Uno o más residuos de aminoácidos individuales están modificados. Se sabe que varios agentes de derivatización reaccionan específicamente con cadenas laterales o residuos terminales seleccionados, tal y como se describe detalladamente más abajo.

Los residuos lisinilo y residuos amino terminales pueden hacerse reaccionar con anhídrido succínico u otros anhídridos de ácidos carboxílicos, que invierten la carga de los residuos lisinilo. Otros reactivos adecuados para la derivatización de residuos que contienen grupos alfa-amino incluyen imidoésteres tales como picolinimidato de

metilo; fosfato de piridoxal; piridoxal; cloroborohidruro; ácido trinitrobencenosulfónico; O-metilisourea; 2,4pentanodiona; y reacción con glioxilato catalizada por transaminasas.

Los residuos de arginilo pueden modificarse por reacción con uno cualquiera o una combinación de varios reactivos convencionales, que incluyen fenilglioxal, 2,3-butanodiona, 1,2-ciclohexanodiona y ninhidrina. La derivatización de los residuos de arginilo requiere que la reacción se lleve a cabo en condiciones alcalinas, debido al alto pKa del grupo funcional guanidino. Asimismo, estos reactivos pueden reaccionar con los grupos de lisina, así como con el grupo epsilon-amino de la arginina.

La modificación específica de los residuos de tirosilo ha sido estudiada extensamente, prestando especial atención a la introducción de marcadores espectrales en los residuos tirosilo mediante reacción con compuestos aromáticos de diazonio o tetranitrometano. Más generalmente, se utilizan N-acetilimidizol y tetranitrometano para formar especies de O-acetiltirosilo y 3-nitroderivados, respectivamente.

Los grupos de cadena lateral carboxilo (aspartilo o glutamilo) pueden modificarse selectivamente mediante reacción con carbodiimidas (R’-N=C=N-R’), tales como 1-ciclohexil-3-(2-morfolinil-(4-etil)-carbodiimida o 1-etil-3-(4-azonia4,4-dimetilpentil)-carbodiimida. Asimismo, los residuos de aspartilo y glutamilo pueden convertirse en residuos de asparaginilo y glutaminilo por reacción con iones de amonio.

Los residuos de glutaminilo y asparaginilo pueden desamidarse para obtener los residuos de glutamilo y aspartilo correspondientes. Alternativamente, estos residuos se desamidan en condiciones moderadamente ácidas. Cualquiera de las formas de estos residuos corresponde al ámbito de aplicación de esta invención.

Los residuos de cisteinilo pueden reemplazarse por residuos de aminoácidos u otras fracciones, sea para eliminar los enlaces de disulfuro o, por lo contrario, para estabilizar la reticulación. Véase, p. ej., Bhatnagar et al. (1996), J-Med. Chem. 39:3814-9.

La derivatización con agentes bifuncionales es útil para la reticulación de los péptidos o sus derivados funcionales con una matriz de soporte no soluble en agua o con otros vehículos macromoleculares. Algunos agentes de reticulación utilizados comúnmente incluyen, p. ej., 1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano, glutaraldehido, ésteres de Nhidroxisuccinimida, por ejemplo, ésteres con ácido 4-acidosalicílico, imidoésteres homobifuncionales, que incluyen ésteres de disuccinimidoílo tales como 3,3’-ditiobis(succinimidilpropionato), y maleimidas bifuncionales tales como bis-N-maleimido-1,8-octano. Los agentes de derivatización tales como metil-3-[(p-azidofenil)ditio]propioimidato producen compuestos intermedios fotoactivables que son capaces de formar reticulaciones en presencia de luz. Alternativamente, las matrices reactivas no solubles en agua tales como los carbohidratos activados con bromuro de cianógeno y los sustratos reactivos descritos en las patentes estadounidenses nº 3.969.287; 3.691.016; 4.195.128; 4.247.642; 4.229.537 y 4.330.440 se emplean para la inmovilización de proteínas.

Los grupos de carbohidratos (oligosacáridos) pueden unirse convenientemente a sitios que se sabe que son sitios de glicosilación en las proteínas. Generalmente, los oligosacáridos unidos a O se fijan a los residuos de serina (Ser)

o treonina (Thr), mientras que los oligosacáridos unidos a N se fijan a los residuos asparagina (Asn) cuando éstos forman parte de la secuencia Asn-X-Ser/Thr, donde X puede ser cualquier aminoácido excepto prolina. X es preferiblemente uno de los 19 aminoácidos naturalmente presentes distintos de la prolina. Las estructuras de los oligosacáridos unidos a N o unidos a O y los residuos de azúcar encontrados en cada tipo son diferentes. Un tipo de azúcar que se encuentra comúnmente en ambos es el ácido N-acetilneuramínico (denominado ácido siálico). El ácido siálico es habitualmente el residuo terminal tanto de los oligosacáridos unidos a N como de los unidos a O y, debido a su carga negativa, puede conferir propiedades ácidas al compuesto glicosilado. Este sitio o sitios se pueden incorporar en el enlazador de los compuestos de esta invención y son glicosilados preferiblemente por una célula durante la producción recombinante de los compuestos polipéptidos (p. ej., en células de mamífero tales como CHO, BHK, COS). Sin embargo, estos sitios pueden glicosilarse también mediante procedimientos sintéticos o semisintéticos conocidos en el campo.

Otras posibles modificaciones incluyen la hidroxilación de prolina y lisina, fosforilación de grupos hidroxilo de los residuos de serilo o treonilo, oxidación del átomo de azufre en Cys, metilación de los grupos alfa-amino de las cadenas laterales de lisina, arginina e histidina. Creighton, Proteins: Structure and Molecule Properties (W. H. Freeman & Co., San Francisco), pp. 79-86(1983).

Los compuestos de la presente invención pueden cambiarse también a nivel del ADN. La secuencia de ADN de cualquier porción del compuesto puede cambiarse a codones más compatibles con la célula hospedadora seleccionada. Para E. coli, que es la célula hospedadora preferible, los codones optimizados se conocen en el campo. Los codones pueden ser sustituidos para eliminar sitios de restricción o incluir sitios de restricción silenciosos, que pueden ayudar al procesamiento del ADN en la célula hospedadora seleccionada. Las secuencias de vehículo, enlazador y ADN peptídico se pueden modificar para incluir cualquiera de los cambios de secuencia anteriores.

Métodos de producción

Los compuestos de esta invención pueden producirse en gran parte en células hospedadoras transformadas utilizando técnicas de ADN recombinante. Para ello, se prepara una molécula de ADN recombinante que codifica el péptido. Los métodos de preparación de estas moléculas de ADN son bien conocidos en el campo. Por ejemplo, las

secuencias que codifican los péptidos se podrían eliminar del ADN utilizando enzimas de restricción adecuadas. Alternativamente, la molécula de ADN podría sintetizarse utilizando técnicas de síntesis química, como el método del fosforamidato. Asimismo, podría utilizarse una combinación de estas técnicas.

La invención incluye también un vector capaz de expresar los péptidos en un hospedador apropiado. El vector comprende la molécula de ADN que codifica los péptidos enlazados operativamente a secuencias apropiadas de control de la expresión. Los métodos para efectuar este enlace operativo, sea antes o después de insertar la molécula de ADN en el vector, son bien conocidos. Las secuencias de control de la expresión incluyen promotores, activadores, intensificadores, operadores, sitios de unión de ribosomas, señales de inicio, señales de parada, señales de formación del casquete, señales de poliadenilación y otras señales implicadas en el control de la transcripción o la traducción.

El vector resultante que tiene la molécula de ADN en el mismo se utiliza para transformar un hospedador apropiado. Esta transformación se puede realizar utilizando métodos bien conocidos en el campo.

Se puede emplear cualquiera de un gran número de células hospedadoras disponibles y bien conocidas en la práctica de esta invención. La selección de un hospedador determinado depende de varios factores reconocidos en el campo. Entre ellos se incluyen, por ejemplo, la compatibilidad con el vector de expresión seleccionado, la toxicidad de los péptidos codificados por la molécula de ADN, la tasa de transformación, la facilidad de recuperación de los péptidos, las características de expresión, la bioseguridad y los costes. Es necesario alcanzar un equilibrio de estos factores, entendiendo que no todos los hospedadores pueden ser igualmente eficaces para la expresión de una secuencia de ADN determinada. Dentro de estas directrices generales, los hospedadores microbianos útiles incluyen las bacterias (tales como E. coli sp.), levaduras (tales como Sacharomyces sp.) y otros hongos, insectos, plantas, células de mamífero (incluyendo células humanas) en cultivo u otros hospedadores conocidos en el campo.

A continuación, el hospedador transformado se cultiva y se purifica. Las células hospedadoras pueden cultivarse en condiciones convencionales de fermentación, a fin de que se expresen los compuestos deseados. Tales condiciones de fermentación son bien conocidas en el campo. Finalmente, los péptidos se purifican del cultivo por métodos bien conocidos en el campo.

Los compuestos pueden producirse también por métodos sintéticos. Por ejemplo, pueden utilizarse técnicas de síntesis en fase sólida. Las técnicas adecuadas son bien conocidas en el campo e incluyen las descritas en Merrifield (1973), Chem. Polypeptides, pp. 335-61 (Katsoyannis and Panayotis eds.); Merrifidd (1963), J. Am. Chem. Soc. 85:2149; Davis et al. (1985), Biochem. Intl. 10:394-414; Stewart y Young (1969), Solid Phase Peptide Synthesis: Patente estadounidense nº 3.941.763; Finn et al. (1976), The Proteins (3rd ed.) 2:105-253; and Erickson et al. (1976), The Proteins (3rd ed.) 2: 257-527. La síntesis en fase sólida es la técnica preferible para producir péptidos individuales, dado que es el método más rentable para producir péptidos pequeños.

Los compuestos que contienen péptidos derivatizados o que contienen grupos no peptídicos pueden sintetizarse por técnicas bien conocidas de química orgánica.

Usos de los compuestos

Los compuestos de esta invención pueden resultar particularmente útiles para el tratamiento de enfermedades autoinmunes mediadas por células B. En particular, los compuestos de esta invención pueden ser útiles para el tratamiento, la prevención, la mejora, el diagnóstico o pronóstico del lupus, incluyendo el lupus sistémico eritematoso (SLE), y las condiciones y enfermedades asociadas con el lupus. Otras indicaciones preferibles incluyen los cánceres mediados por células B, incluyendo el linfoma de células B.

Los compuestos de esta invención también se pueden utilizar para tratar estados inflamatorios de las articulaciones. Las condiciones inflamatorias de una articulación son enfermedades crónicas de las articulaciones que afligen y discapacitan, en diversos grados, a millones de personas en todo el mundo. La artritis reumatoide es una enfermedad de las juntas articulares en las que el cartílago y el hueso son erosionados lentamente por un tejido conectivo invasivo y proliferativo llamado pannus, que se deriva de la membrana sinovial. La enfermedad puede implicar estructuras periarticulares, tales como la bolsa, la vaina del tendón y los tendones, así como tejidos extraarticulares, tales como la hipodermis, el sistema cardiovasculoar, los pulmones, el bazo, los nódulos linfáticos, músculos esqueléticos, el sistema nervioso (central y periférico) y los ojos (Silberberg (1985), Anderson's Pathology, Kissane (ed.), II:1828). La osteoartritis es una enfermedad articular común que se caracteriza por cambios degenerativos en el cartílago articular y la proliferación reactiva de hueso y cartílago alrededor de la articulación. La osteoartritis es un proceso activo mediado por células que puede resultar de una respuesta inapropiada de los condrocitos a los estímulos catabólicos y anabólicos. Se ha documentado que los cambios en algunas moléculas de la matriz del cartílago articular se producen en la osteoartritis temprana (Thonar et al. (1993), Rheumatic disease clinics of North America, Moskowitz (ed.), 19:635-657 y Shinmei et al. (1992), Arthritis Rheum., 35:1304-1308). Se cree que TALL-1, TALL-1R y sus moduladores son útiles para el tratamiento de estas condiciones y otras relacionadas.

Los compuestos de esta invención pueden ser útiles también para el tratamiento de una serie de enfermedades y trastornos adicionales, entre los que se incluyen:

 Pancreatitis aguda;

 Esclerosis lateral amiotrófica (ALS);  Enfermedad de Alzheimer;  Asma;  Aterosclerosis;  Anemia hemolítica autoinmune;  Cáncer, particularmente los cánceres relacionados con las células B;  Cachexia / anorexia;  Síndrome de fatiga crónica;  Cirrosis (p. ej., cirrosis biliar primaria);  Diabetes (p. ej., diabetes de insulina);  Fiebre;  Glomerulonefritis, incluyendo glomerulonefritis de IgA y glomerulonefritis primaria;  Síndrome de Goodpasture;  Síndrome de Guillain-Barre;  Enfermedad de injerto contra huésped;  Tiroiditis de Hashimoto;  Shock hemorrágico;  Hiperalgesia;  Enfermedad intestinal inflamatoria;

Condiciones inflamatorias de una articulación, incluyendo osteoartritis, artritis psoriática y artritis reumatoide; Condiciones inflamatorias resultantes de tensión, torcedura, daños en el cartílago, traumatismos, cirugía ortopédica,

infección u otros procesos patológicos;  Diabetes mellitus dependiente de insulina;  Lesión isquémica, incluyendo isquemia cerebral (p. ej., lesiones cerebrales resultantes de un traumatismo,

epilepsia, hemorragia o accidente cerebrovascular, pudiendo provocar cada una de ellas una neurodegeneración);  Problemas de aprendizaje;  Enfermedades pulmonares (p. ej., síndrome de dificultad respiratoria aguda –ARDS);  Mieloma múltiple;  Esclerosis múltiple;  Miastenia grave;  Leucemias mielogenosas (p. ej., leucemia mieloide aguda (AML) y leucemia mieloide crónica (CML)) y otras leucemias;  Miopatías (p. ej., metabolismo de la proteína muscular, especialmente en la sepsis);  Neurotoxicidad (p. ej., como la inducida por el HIV);  Osteoporosis;  Dolor;  Enfermedad de Parkinson; penfigus;  Poliomiositis/dermatomiositis;  Inflamación pulmonar, incluyendo enfermedad pulmonar autoinmune;  Inflamación;  Parto pretérmino;

 Psoriasis;

 Síndrome de Reiter;

 Lesión por reperfusión;

 Shock séptico;

 Efectos secundarios de la terapia con radiación;

 Síndrome de Sjogren;

 Trastornos del sueño;

 Enfermedad de la articulación temporomandibular;

 Trombocitopenia, incluyendo trombocitopenia idiopática y trombocitopenia neonatal autoinmune;

 Metástasis tumoral;

 Uveítis; y

 Vasculitis.

Los compuestos de esta invención se pueden administrar solos o en combinación con una cantidad terapéuticamente efectiva de otros fármacos, incluyendo agentes analgésicos, fármacos antirreumáticos modificadores de la enfermedad (DMARD), fármacos antiinflamatorios no esteroideos (NSAID) y cualquier modulador inmune y/o inflamatorio. De este modo, los compuestos de la presente invención se pueden administrar con:

 Moduladores de otros miembros de la familia de receptores TNF/TNF, incluyendo antagonistas del TNF, como etanercept (Enbrd™), sTNF-RI, onercept, D2E7 y Remicade™.  Moduladores del factor de crecimiento nervioso (NGF).

 Inhibidores de IL-1, incluyendo moléculas IL-1ra, tales como anakinra y moléculas descubiertas más recientemente similares a IL-1ra, como IL-1Hy1 e IL-1Hy2; moléculas “trampa” como las descritas en la Patente estadounidense nº 5.844.099, publicada el 1 de diciembre de 1998; anticuerpos de IL-1; receptor de

 IL-1 solubilizado, y similares.

 Inhibidores de IL-6 (p. ej., anticuerpos de IL-6).

 Inhibidores de IL-8 (p. ej., anticuerpos de IL-8).

 Inhibidores de IL-18 (p. ej., proteína de unión a IL-18, receptor de IL-18 solubilizado o anticuerpos de IL-18).

• Moduladores de la enzima de conversión de IL-1 (ICE).  Factores de crecimiento similares a la insulina (IGF-1, IGF-2) y moduladores de los mismos.  Factores beta de crecimiento transformador (TGF-β), miembros de la familia TGF-β, y moduladores de

TGF-β.  Factores de crecimiento de fibroblasto FGF-1 a FGF-10, y moduladores de FGF.  Osteoprotegerina (OPG), análogos de OPG, agentes osteoprotectores y anticuerpos del ligando de OPG

(OPG-L).  Agentes anabólicos óseos, como la hormona paratiroide (PTH), fragmentos de PTH y moléculas que

incorporan fragmentos de PTH (p. ej., PTH (1-34)-Fc).  Antagonistas PAF.  Factor de crecimiento de queratinocito (KGF), moléculas relacionadas con el KGF (p. ej., KGF-2) y

moduladores de KGF.  Inhibidores de COX-2, como Celebrex™ y Vioxx™.  Análogos de prostaglandinas (p. ej., prostaglandinas de la serie E).  Moduladores de la metaloproteinasa de matriz (MMP).  Moduladores de óxido nítrico sintasa (NOS), incluyendo moduladores de NOS inducible.  Moduladores del receptor glucocorticoide.

 Moduladores del receptor glutamato.

 Moduladores de los niveles de lipopolisacáridos (LPS).

 Agentes contra el cáncer, incluyendo inhibidores de oncogenes (p. ej., fos, jun) e interferones.

 Noradrenalina, y moduladores y miméticos de noradrenalina.

Composiciones farmacéuticas

En general. La presente invención proporciona también métodos de utilización de composiciones farmacéuticas de los compuestos de la invención. Estas composiciones farmacéuticas pueden ser administradas mediante una inyección, o para administración oral, pulmonar, nasal, transdérmica u otras formas de administración. En general, la invención abarca composiciones farmacéuticas que comprenden cantidades efectivas de un compuesto de la invención junto con diluyentes, conservantes, solubilizantes, emulsionantes, adyuvantes y/o vehículos farmacéuticamente aceptables. Estas composiciones incluyen diluyentes con diversos contenidos de solución tampón (p. ej., Tris-HCl, acetato, fosfato), pH y concentración iónica; aditivos como detergentes y agentes solubilizantes (p. ej., Tween 80, Polisorbato 80), antioxidantes (p. ej., ácido ascórbico, metabisulfito de sodio), conservantes (p. ej., Thimersol, alcohol bencílico) y sustancias aumentadoras de volumen (p. ej., lactosa, manitol); la incorporación del material en preparaciones de partículas de compuestos poliméricos, tales como ácido poliláctico, ácido poliglicólico, etc. o en liposomas. También puede utilizarse ácido hialurónico y esto puede promover una duración prolongada en la circulación. Estas composiciones pueden influir en el estado físico, la estabilidad, la tasa de liberación in vivo y la tasa de eliminación in vivo de las proteínas y derivados presentes. Véase, p. ej., Remington's Pharmaceutical Sciences. 18th Ed.. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042), páginas 14351712. Las composiciones se pueden preparar en forma líquida o pueden encontrarse en polvo seco, como forma liofilizada. Se contemplan también formulaciones implantables de liberación prolongada, como las formulaciones transdérmicas.

Formas de dosificación oral. En el presente se contempla el uso de formas sólidas de dosificación oral, que se describen generalmente en el capítulo 89 de Remington’s Pharmaceutical Sciences (1990), Edición 18ª, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042. Las formas sólidas de dosificación incluyen tabletas, cápsulas, píldoras, trociscos o pastillas, sellos o gránulos. Asimismo, puede utilizarse encapsulación liposómica o proteinoide para formular las presentes composiciones (como, por ejemplo, las microesferas proteinoides documentadas en la Patente estadounidense nº 4.925.673). Puede utilizarse la encapsulación liposómica, y los liposomas pueden derivatizarse con diversos polímeros (p. ej., Patente estadounidense nº 5.013.556). Una descripción de formas sólidas de dosificación posibles para la terapéutica se recoge en el capítulo 10 de Marshall, K., Modern Pharmaceutics (1979), editado por G.S. Banker y C.T. Rhodes. En general, la formulación incluirá el compuesto de la invención e ingredientes inertes que ofrecen protección frente al entorno del estómago y la liberación del material biológicamente activo en el intestino.

Se contemplan también específicamente formas de dosificación oral de los compuestos de la invención mencionados anteriormente. En caso necesario, los compuestos pueden ser modificados químicamente para que el suministro oral sea eficaz. Por lo general, la modificación química contemplada es la unión de al menos una fracción a la molécula del compuesto en sí, donde dicha fracción permite (a) la inhibición de la proteólisis; y (b) la absorción en el torrente sanguíneo desde el estómago o el intestino. Es deseable también el aumento de la estabilidad general del compuesto y el aumento del tiempo de circulación en el cuerpo. Las fracciones útiles como vehículos unidos covalentemente en esta invención pueden utilizarse también para este fin. Algunos ejemplos de estas fracciones incluyen: PEG, copolímeros de etilenglicol y propilenglicol, celulosa de carboximetilo, dextrano, alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona y poliprolina. Véase, por ejemplo, Abuchowski y Davis, Soluble Polymer-Enzyme Adducts, Enzymes as Drugs (1981), Hocenberg and Roberts, eds., Wiley-Interscience, New York, NY,, pp.. 367-83; Newmark, et al. (1982), J. Appl. Biochem, 4:185-9. Otros polímeros que se podrían utilizar son poli-1,3,6-dioxolano y poli-1,3,6tioxocano. Como se ha indicado anteriormente, las fracciones PEG son preferibles para uso farmacéutico.

Para las formas de dosificación de administración oral, también se puede utilizar una sal de un aminoácido alifático modificado, como N-(8-[2-hidroxibenzoil]amino)-caprilato de sodio (SNAC), como vehículo para mejorar la absorción de los compuestos terapéuticos de esta invención. La eficacia clínica de una formulación de heparina que utiliza SNAC ha sido demostrada en un ensayo de Fase II realizada por Emisphere Technologies. Véase la Patente estadounidense nº 5.792.451, "Métodos y composición para la administración oral del fármaco".

Los compuestos de esta invención se pueden incluir en la formulación como multipartículas finas en forma de gránulos o píldoras con un tamaño de partícula aproximado de 1 mm. La formulación del material para la administración de la cápsula podría ser también en forma de polvo, bloques ligeramente comprimidos o incluso como tabletas. El agente terapéutico podría prepararse por compresión.

Pueden incluirse agentes colorantes y aromatizantes. Por ejemplo, la proteína (o derivado) puede formularse (por ejemplo por encapsulación en liposomas o microesferas) e incluirse luego dentro de un producto comestible, como una bebida refrigerada que contenga agentes colorantes y aromatizantes.

Se puede diluir o aumentar el volumen del compuesto de la invención con un material inerte Estos diluyentes podrían incluir carbohidratos, especialmente manitol, α-lactosa, lactosa anhidra, celulosa, sacarosa, dextranos

modificados y almidón. Ciertas sales inorgánicas pueden utilizarse también como material de carga, incluyendo el trifosfato de calcio, carbonato de magnesio y cloruro de sodio. Algunos diluyentes disponibles en el mercado son Fast-Flo, Emdex, STA-Rx 1500, Emcompress y Avicell.

Pueden incluirse desintegrantes en la formulación del compuesto terapéutico en forma de dosificación sólida. Los materiales utilizados como desintegrantes incluyen, a título meramente enunciativo, el almidón, incluyendo el desintegrante comercial basado en almidón, Explotab. También se puede emplear glicolato de almidón de sodio, Amberlite, carboximetilcelulosa de sodio, ultramilopectina, alginato de sodio, gelatina, piel de naranja, carboximetilcelulosa ácida, esponja natural y bentonita. Otra forma de desintegrantes son las resinas cambiadoras de cationes insolubles. Se pueden utilizar gomas en polvo como desintegrantes y como aglomerantes, y estas pueden incluir gomas en polvo como agar, Karaya o tragacanto. El ácido algínico y su sal de sodio son también útiles como desintegrantes.

Se pueden utilizar aglomerantes para mantener el agente terapéutico unido, a fin de formar una tableta dura, e incluyen materiales de productos naturales tales como la goma arábiga, tragacanto, almidón y gelatina. Otros incluyen metilcelulosa (MC), etilcelulosa (EC) y carboximetilcelulosa (CMC). Se podría utilizar tanto polivinilpirrolidona (PVP) como hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC) en soluciones alcohólicas para granular el producto terapéutico.

Se puede incluir un agente antifricción en la formulación del agente terapéutico para prevenir la adherencia durante el proceso de formulación. Se pueden utilizar lubricantes como una capa entre el agente terapéutico y la pared de la matriz, y éstos pueden incluir, a título meramente enunciativo, ácido esteárico, incluyendo sus sales de magnesio y calcio, politetrafluoretileno (PTFE), parafina líquida, aceites vegetales y ceras. También se pueden utilizar lubricantes solubles como laurilsulfato de sodio, laurilsulfato de magnesio, polietilenglicol de diversos pesos moleculares, Carbowax 4000 y 6000.

Se podrían añadir deslizantes para mejorar las propiedades del flujo del fármaco durante la formulación y para favorecer el reordenamiento durante la compresión. Los deslizantes pueden incluir almidón, talco, sílice pirógena y silicoaluminato hidratado.

Para favorecer la disolución del compuesto de esta invención en el entorno acuoso se podría añadir un agente tensioactivo como agente humectante. Los agentes tensioactivos pueden incluir detergentes aniónicos tales como laurilsulfato de sodio, sulfosuccinato de dioctil-sodio y sulfonato de dioctil-sodio. Se podrían utilizar detergentes catiónicos, que podrían incluir cloruro de benzalconio o cloruro de bencetonio. La lista de detergentes no iónicos potenciales que se podrían incluir en la formulación como agentes tensioactivos son lauromacrogol 400, polioxil-40estearato, polioxietileno-aceite de ricino hidrogenado 10, 50 y 60, monoestearato de glicerol, polisorbato 40, 60, 65 y 80, sacarosa-éster de ácido graso, metilcelulosa y carboximetilcelulosa. Estos agentes tensioactivos podrían estar presentes en la formulación de la proteína o del derivado, sea solos o en forma de mezcla en diferentes ratios.

También se pueden incluir aditivos en la formulación para mejorar la absorción del compuesto. Los aditivos que tienen potencialmente esta propiedad son, por ejemplo, los ácidos grasos como el ácido oleico, ácido linoleico y ácido linolénico.

Puede ser deseable una formulación de liberación controlada. El compuesto de la presente invención se podría incorporar en una matriz inerte que permita la liberación por mecanismos de difusión o lixiviación, p. ej., gomas. También se pueden incorporar en la formulación matrices de degeneración lenta, como alginatos y polisacáridos. Otra forma de liberación controlada de los compuestos de esta invención es a través de un método basado en el sistema terapéutico Oros (Alza Corp.), es decir, en el que el fármaco está encapsulado en una membrana semipermeable que permite que el agua entre y haga salir el fármaco a través de una única abertura pequeña debido a los efectos osmóticos. Algunos recubrimientos entéricos tienen también un efecto de liberación retardada.

Pueden emplearse otros recubrimientos para la formulación. Estos incluyen diversos azúcares que podrían aplicarse en un recubridor en bombo. El agente terapéutico también se podría administrar en una tableta recubierta de una película y los materiales utilizados en este caso se dividen en dos grupos. El primero son los materiales no entéricos e incluyen metilcelulosa, etilcelulosa, hidroxietilcelulosa, metilhidroxietilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica, providona y los polietilenglicoles. El segundo grupo está compuesto por los materiales entéricos que son comúnmente ésteres de ácido ftálico.

Se podría utilizar una mezcla de materiales para proporcionar el recubrimiento de película óptimo. El recubrimiento de película se puede llevar a cabo en un recubridor en bombo o en un lecho fluidizado, o bien mediante recubrimiento por compresión.

Formas de administración pulmonar. Se contempla también en esta invención la administración pulmonar de la presente proteína (o derivados de la misma). La proteína (o su derivado) se administra en los pulmones de un mamífero mientras inhala y pasa a través del recubrimiento epitelial del pulmón al torrente sanguíneo. (Otros casos documentados de esto incluyen Adjei et al., Pharma. Res. (1990) 7: 565-9; Adjei et al. (1990), Internatl. J-Pharmaceutics 63:135-44 (acetato de leuprolida); Braquet et al. (1989), J. Cardiovasc Pharmacol. 13 (suppl.5): s.143-146 (endotelina-1); Hubbard et al (1989), Annals Int Med. 3:206-12 (a1-antitripsina); Smith et al. (1989), J. Clin. Invest. 84:1145-6 (a1-proteinasa); Oswein et al. (marzo de 1990), "Aerosolization of Proteins", Proc. Symp. Resp.

Drug Delivery II, Keystone, Colorado (hormona del crecimiento humano recombinante); Debs et al.,(1988), J. Immunol. 140:3482-8 (interferón-γ y factor de necrosis tumoral a) y Platz et al., Patente estadounidense nº 5.284.656 (factor estimulante de colonias de granulocitos).

Se contemplan para el uso en la práctica de esta invención una extensa gama de dispositivos mecánicos diseñados para la administración pulmonar de productos terapéuticos que incluyen, a título meramente enunciativo, nebulizadores, inhaladores de dosis medidas, e inhaladores de polvos, siendo todos ellos conocidos para las personas con conocimientos en el campo. Algunos ejemplos específicos de dispositivos disponibles en el mercado adecuados para la práctica de esta invención son el nebulizador Ultravent, fabricado por Mallinckrodt, Inc., St. Louis, Missouri; el nebulizador Acorn II, fabricado por Marquest Medical Products, Englewood, Colorado; el inhalador de dosis medidas Ventolin, fabricado por Glaxo Inc., Research Triangle Park, North Carolina; y el inhalador de polvos Spinhaler, fabricado por Fisons Corp., Bedford, Massachusetts.

Todos estos dispositivos requieren el uso de formulaciones adecuadas para la dispensación del compuesto de la invención. Típicamente, cada formulación es específica para el tipo de dispositivo empleado y puede implicar el uso de un material propelente apropiado, además de diluyentes, adyuvantes y/o vehículos útiles en la terapia.

El compuesto de la invención debería prepararse de manera muy provechosa en forma de partícula con un tamaño de partícula medio inferior a 10 μm (o micrones), más preferiblemente de 0,5 a 5 μm, para la administración más efectiva al pulmón distal.

Algunos vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen carbohidratos como la trehalosa, manitol, xilitol, sacarosa, lactosa, y sorbitol. Otros ingredientes para el uso en formulaciones pueden incluir DPPC, DOPE, DSPC y DOPC. Pueden utilizarse agentes tensioactivos naturales o sintéticos. Puede utilizarse PEG (incluso aparte de su uso en la derivatización de la proteína o análogo). Pueden utilizarse dextranos, como el ciclodextrano. Se pueden utilizar sales biliares y otros potenciadores relacionados. Puede utilizarse celulosa y derivados de la celulosa. Se pueden utilizar aminoácidos, por ejemplo para emplearlos en una formulación tampón.

Se contempla también el uso de liposomas, microcápsulas o microesferas, complejos de inclusión u otros tipos de vehículos.

Las formulaciones adecuadas para utilizarlas con un nebulizador, sea de tipo chorro o ultrasónico, comprenderán típicamente el compuesto de la invención disuelto en agua a una concentración de aproximadamente 0,1 a 25 mg de proteína biológicamente activa por ml de solución. La formulación puede incluir también un tampón y un azúcar simple (p. ej., para la estabilización de la proteína y la regulación de la presión osmótica). La formulación del nebulizador puede contener también un agente tensioactivo, a fin de reducir o prevenir la agregación superficial inducida de la proteína causada por la atomización de la solución en la formación del aerosol.

Por lo general, las formulaciones para uso con un dispositivo inhalador de dosis medidas comprenderán un polvo finamente dividido que contiene el compuesto de la invención suspendido en un propelente con ayuda de un agente tensioactivo. El propelente puede ser cualquier material convencional empleado para este propósito, como un clorofluorocarbono, un hidroclorofluorocarbono, un hidrofluorocarbono, o un hidrocarburo, incluyendo el triclorofluorometano, diclorodifluorometano, diclorotetrafluoroetanol y 1,1,1,2-tetrafluoroetano o combinaciones de los mismos. Los agentes tensioactivos adecuados incluyen el trioleato de sorbitán y lecitina de soja. También puede ser útil el ácido oleico como agente tensioactivo.

Las formulaciones para la dispensación desde un dispositivo inhalador de polvos comprenderán un polvo seco finamente dividido que contiene el compuesto de la invención y pueden incluir también un agente aumentador del volumen, como lactosa, sorbitol, sacarosa, manitol, trehalosa o xilitol, en cantidades que faciliten la dispersión del polvo desde el dispositivo, p. ej., 50 a 90% en peso de la formulación.

Formas de administración nasal. Se contempla también la administración nasal del compuesto de la invención. La administración nasal permite el paso de la proteína al torrente sanguíneo directamente después de la administración del producto terapéutico a la nariz, sin necesidad de deposición del producto en el pulmón. Las formulaciones para administración nasal incluyen las que contienen dextrano o ciclodextrano. También se contempla la administración por transporte a través de otras membranas mucosas.

Dosificaciones. El régimen de dosificación implicado en un método para el tratamiento de las afecciones anterior descritas será determinado por el médico responsable, teniendo en cuenta diversos factores que modifican la acción de los fármacos, p. ej., la edad, la condición, el peso corporal, el sexo y la dieta del paciente, la gravedad de cualquier infección, el tiempo de administración y otros factores clínicos. Por lo general, el régimen diario debería estar comprendido en el rango de 0,1-1000 microgramos del compuesto de la invención por kilogramo de peso corporal, preferiblemente de 0,1-150 microgramos por kilogramo.

Realizaciones específicas preferibles

Los autores de la invención han determinado estructuras preferibles para los péptidos preferibles que se recogen en la Tabla 4 más abajo. El símbolo “A” puede ser cualquiera de los enlazadores descritos en el presente o puede representar simplemente un enlace peptídico normal (es decir, sin ningún enlazador presente). Las repeticiones y enlazadores en tándem se muestran separados por guiones para una mayor claridad.

Tabla 4 – Realizaciones preferibles

"V1" es un dominio Fc como el definido anteriormente en el presente. Además de los recogidos en la Tabla 4, los autores de la invención contemplan también heterodímeros en los que cada una de las cadenas de un dímero Fc está unida a una secuencia peptídico diferente; por ejemplo, donde cada Fc está unido a una secuencia diferente seleccionada de la Tabla 2.

Todos los compuestos de esta invención se pueden preparar mediante los métodos descritos en la solicitud PCT nº WO99/25044. La invención se describirá ahora también a través de los siguientes ejemplos prácticos, que tienen un carácter ilustrativo y no limitador. Cualquier ejemplo que no corresponda al ámbito de aplicación de las reivindicaciones se ofrece con fines comparativos únicamente.

EJEMPLO 1

Péptidos

Péptidos con presentación de fagos

1. Preparación de perlas magnéticas

A. Inmovilización de Fc-TALL-1 en perlas magnéticas

La proteína Fc-TALL-1 recombinante se inmovilizó en Protein A Dynabeads (Dynal) a una concentración de 8 μg de Fc-TALL-1 por 100 μl del producto de perlas del fabricante. Arrastrando las perlas a un lado de un tubo utilizando un imán y retirando el líquido, las perlas se lavaron dos veces con la solución salina de fosfato (PBS) y se resuspendieron en PBS. Se añadió la proteína Fc-TALL-1 a las perlas lavadas a la concentración indicada y se incubaron por rotación durante una hora a temperatura ambiente. Las perlas de Fc-TALL-1 recubiertas fueron entonces bloqueadas añadiendo albúmina de suero bovino (BSA) a una concentración final del 1% y se incubaron durante una noche a 4ºC con rotación. Las perlas recubiertas de Fc-TALL-1 resultantes se lavaron entonces dos veces con PBST (PBS con 0,05% de Tween-20), antes de someterlas a los procedimientos de selección.

B. Preparación de perlas para selección negativa

También se prepararon perlas adicionales para selecciones negativas. Para cada condición de las bandejas, 250 μl del producto de perlas del fabricante se sometió al anterior procedimiento (sección 1A), salvo por el hecho de que se omitió el paso de incubación con Fc-TALL-1. En el último paso de lavado, las perlas se dividieron en cinco alícuotas de 50 μl.

2. Selección del fago de unión de TALL-1

A. Estrategia general

Para seleccionar el fago de unión a TALL-1, se emplearon dos bibliotecas de fagos filamentosos: TN8-IX-(5X109 transformantes independientes) y TN12-1 (1,4X109 transformantes independientes) (Dyax Corp.). Cada biblioteca se sometió a una elución de pH 2 o a una “elución de perlas” (sección 2E). Por tanto, se prepararon cuatro condiciones de bandejas diferentes para el proyecto TALL-1 (TN8-IX utilizando el método de elución de pH 2, TN8-IX utilizando

el método de elución de perlas, TN12-I utilizando el método de elución de pH 2 y TN12-I utilizando el método de elución de perlas). Se realizaron tres rondas de selección para cada condición.

B. Selección negativa

Para cada condición de bandeja, del producto de la biblioteca se dividieron en partes alícuotas unos 100 equivalentes aleatorios de la biblioteca (5X1011 pfu para TN8-IX y 1.4X1011 pfu para TN12-I) y se diluyeron en 300 μl con PBST. Después de retirar el último líquido de lavado de la primera alícuota de 50 μl de las perlas preparadas para selecciones negativas (Sección 1B), los 300 μl del producto de la biblioteca diluido se añadieron a las perlas. La mezcla resultante se incubó durante 10 minutos a temperatura ambiente con rotación. Se retiró el supernatante del fago utilizando el imán y se añadió a la segunda alícuota de 50 μl para otro paso de selección negativa. De este modo, se realizaron cinco pasos de selección negativa.

C. Selección utilizando las perlas recubiertas de proteína Fc-TALL-1

El supernatante del fago después del último paso de selección negativa (sección 1B) se añadió a las perlas recubiertas de Fc-TALL-1 después del último paso de lavado (Sección 1A). Esta mezcla se incubó con rotación durante dos horas a temperatura ambiente, permitiendo que el fago específico se uniese a la proteína diana. Tras desechar el supernatante, las perlas se lavaron siete veces con PBST.

D. Elución de pH2 del fago de unión

Después del último paso de lavado (sección 2C), los fagos de unión fueron eluidos de las perlas magnéticas añadiendo 200 μl de CBST (50 mM de citrato de sodio, 150 mM de cloruro de sodio, 0,05% de Tween-20, pH2). Tras cinco minutos de incubación a temperatura ambiente, el líquido que contenía el fago eluido fue retirado y transferido a otro tubo. El paso de elución se repitió una vez más, añadiendo 200 μl de CBST e incubando durante cinco minutos. Se juntaron los líquidos de los dos pasos de elución y se añadieron 100 μl de solución 2 M Tris (pH 8) para neutralizar el pH. Se añadieron 500 μl de solución Min A Salts (60 mM K2HPO4,33 mM KH2PO4,7,6 mM (NH4)SO4, y 1,7 mM de citrato de sodio) para conseguir el volumen final de 1 ml.

E. “Elución de perlas”

Después de retirar el líquido de lavado final (sección 2C), se añadió 1 ml de solución de sales Min A a las perlas. Esta mezcla de las perlas se añadió directamente a una muestra de bacterias concentrada para la infección (sección 3A y 3B).

3. Amplificación

A. Preparación de células en placas

Un cultivo fresco de E. Coli. (XL-1 Blue MRF’) se desarrolló a OD600 = 0,5 en medios LB que contenían 12,5 μg/ml de tetraciclina. Para cada condición de bandeja, se enfriaron 20 ml de este cultivo sobre hielo y se centrifugaron. El gránulo de la bacteria se resuspendió en 1 ml de la solución Min A Salts.

B. Transducción

Cada mezcla de los diferentes métodos de elución (sección 2D y 2E) se añadió a una muestra de bacterias concentrada (sección 3A) y se incubó a 37 °C durante 15 minutos. Se añadieron 2 ml de medios NZCYM (2XNZCYM, 50 ug/ml de ampicilina) a cada mezcla y se incubaron a temperatura ambiente durante 15 minutos. La solución de 4 ml resultante se colocó en una placa grande de agar NZCYM que contenía 50 μg/ml de ampicilina y se incubó durante una noche a 37 °C.

C. Recolección de fagos

Cada una de las mezclas de bacterias/fagos se cultivó durante una noche en una placa grande de agar NZCYM (sección 3B), se rasparon en 35 ml de medios LB, y la placa de agar fue posteriormente enjuagada con otros 35 ml de medios LB. La mezcla de bacterias/fagos resultante en medios LB se centrifugó para separar los gránulos de bacterias. Se transfirieron 50 ml del supernatante de fagos a un tubo limpio, se añadieron 12,5 ml de solución PEG (20% PEG8000, 3,5M de acetato de amonio) y se incubó sobre hielo durante dos horas para precipitar los fagos. Los fagos precipitados fueron centrifugados y resuspendidos en 6 ml de la solución de resuspensión de fagos (250 mM de NaCl, 100 mM de Tris pH8,1 mM de EDTA). Esta solución de fagos fue posteriormente purificada mediante centrifugado para retirar las bacterias restantes y precipitando el fago por segunda vez mediante la adición de 1,5 ml de la solución PEG. Tras un paso de centrifugado, los gránulos del fago se resuspendieron en 400 μl de PBS. Esta solución se sometió a un centrifugado final para eliminar los últimos restos de bacterias. La preparación de fagos resultante fue titulada mediante un ensayo estándar de formación de placas (Molecular Clonin, Maniatis et al., 3rd Edition).

4. Dos rondas más de selección y amplificación.

En la segunda ronda, el fago amplificado (1010 pfu) de la primera ronda (sección 3C) se utilizó como fago administrado para realizar los pasos de selección y amplificación (secciones 2 y 3). El fago amplificado (1010 pfu) de la segunda ronda se utilizó, a su vez, como fago administrado para realizar la tercera ronda de selección y

amplificación (secciones 2 y 3). Después de los pasos de elución (secciones 2D y 2E) de la tercera ronda, una pequeña fracción del fago eluido se colocó en placas como en el ensayo de formación de placas (sección 3C). Las placas individuales se recogieron y se colocaron en placas de microtitulación de 96 pocillos que contenían 100 μl de solución tampón de TE en cada pocillo. Estas placas principales se incubaron en una incubadora a 37ºC durante una hora para permitir la elución de los fagos en la solución tampón de TE.

5. Análisis clonal (secuenciación y ensayo ELISA de fagos)

Los clones de fagos fueron analizados mediante métodos de secuenciación y ensayo ELISA de fagos. Las secuencias se clasificaron basándose en los resultados combinados de estos dos ensayos.

A. ELISA de fagos

Se realizó un cultivo de XL-1 Blue MRF hasta que OD600 alcanzó 0,5. 30μl de este cultivo fueron divididos en alícuotas en cada uno de los pocillos de la placa de microtitulación de 96 pocillos. Se añadieron 10 μl de fagos eluidos (sección 4) a cada pocillo y se permitió la infección por bacterias durante 15 minutos a temperatura ambiente. Se añadieron 130 μl de medios LB que contenían 12,5 μg/ml de tetraciclina y 50 μg/ml de ampicilina a cada pocillo. Después la placa de microtitulación se incubó durante una noche a 37ºC. Se permitió el recubrimiento de la proteína TALL-1 recombinante (1 μg/ml en PBS) en placas Maxisorp de 96 pocillos (NUNC) durante una noche a 4ºC. Como control, la proteína Fc-Trail recombinante se recubrió en una placa Maxisorp separada a la misma concentración molar que la proteína TALL-1.

Al día siguiente, los líquidos de las placas Maxisorp recubiertas de proteína se descartaron y cada pocillo fue bloqueado con 300 μl de solución BSA al 2% a 37 °C durante una hora. Se desechó la solución BSA y los pocillos se lavaron tres veces con la solución PBST. Después del último paso de lavado, se añadieron 50 μl de PBST a cada pocillo de las placas Maxisorp recubierto de proteína. Cada uno de los 50 μl cultivados durante una noche en la placa de microtitulación de 96 pocillos fue transferido a los correspondientes pocillos de las placas recubiertas de TALL-1, así como a las placas de control recubiertas de Fc-Trail. Las mezclas de 100 μl de los dos tipos de placas se incubaron durante una hora a temperatura ambiente. Se desechó el líquido de las placas Maxisorp y los pocillos se lavaron cinco veces con PBST. El anticuerpo anti-M13 conjugado con HRP (Pharmacia) se diluyó hasta un ratio de 1:7.500, y se añadieron 100 μl de la solución diluida a cada pocillo de las placas Maxisorp para una hora de incubación a temperatura ambiente. El líquido fue desechado de nuevo y los pocillos se lavaron siete veces con PBST. Se añadieron 100 μl de sustrato de tetrametilbencidina (TMB) (Sigma) a cada pocillo para desarrollar la reacción del color, y la reacción se detuvo con 50 μl de la solución de 5 N H2SO4. Los valores de OD450 se leyeron en un lector de placas (Molecular Devices).

B. Secuenciación de los clones de fagos.

Para cada clon de fago, se preparó la plantilla de secuenciación a través de un método PCR. Se utilizó el siguiente par de oligonucleótidos para amplificar unos 500 fragmentos de nucleótido:

cebador #1 (5'-CGGCGCAACTATCGGTATCAAGCTG-3') (SEC. ID. Nº: 56)

y cebador #2 (5 '-CATGTACCGTAACACTGAGTTTGGTC-3' ). (SEC. ID. Nº: 57)

Se preparó la siguiente mezcla para cada clon.

Reactivos

volumen (μL) / tubo

dH20

26,25

50% glicerol

10

10B PCR tampón (sin MgCl2)

5

25 mM MgCl2

4

10 mM dNTP mix

1

100 μM cebador 1

0,25

100 μM cebador 2

0,25

Taq polimerasa

0,25

Fago en TE (sección 4)

3

Volumen de la reacción final

50

Se utilizó el termociclador (GeneAmp PCR System 9700, Applied Biosystems) para ejecutar el siguiente programa: 94°C durante 5 min; [94°C durante 30 seg., 55°C durante 30 seg., 72°C durante 45 seg.] x30 ciclos; 72°C durante 7 min; frío a 4°C. El producto de la PCR se comprobó poniendo 5 μl de cada reacción PCR en un gel de agarosa al 1%. El producto de la PCR en los restantes 45 μl de cada reacción se limpiaron utilizando el kit QIAquick Multiwell PCR Purification kit (Qiagen), siguiendo el protocolo del fabricante. El producto resultante fue después secuenciado utilizando el ABI 377 Sequencer (Perkin-Elmer), siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante.

6. Clasificación de secuencias y determinación de la secuencia de consenso

A. Clasificación de secuencias

Las secuencias del péptido que se tradujeron de secuencias de nucleótidos variables (sección 5B) fueron correlacionadas con los datos del ensayo ELISA. Los clones que demostraron un elevado OD450 en los pocillos recubiertos de TALL-1 y un bajo OD450 en los pocillos recubiertos de Fc-Trail se consideraron más importantes. Las secuencias que ocurren múltiples veces se consideraron también importantes secuencias candidatas cuando se elegían basándose en estos criterios para un posterior análisis como péptidos o pepticuerpos. Se seleccionaron cinco y nueve secuencias de péptidos candidatas de las bibliotecas de TN8-IX y TN I2-1, respectivamente.

B. Determinación de la secuencia de consenso

La mayoría de las secuencias seleccionadas de la biblioteca de TN12-I contenían un motivo de DBL muy conservado. Este motivo se observó también en secuencias seleccionadas de la biblioteca de TN8-1B. Otro motivo, PFPWE (SEC. ID. Nº: 110) también se observó en las secuencias obtenidas de la biblioteca de TN8-1B.

Un péptido de consenso, FHDCKWDLLTKQWVCHGL (SEC. ID. Nº: 58), se diseñó basándose en el motivo de DBL. Dado que los péptidos obtenidos de la biblioteca de TN12-I eran los más activos, las 26 secuencias de péptidos principales basándose en los anteriores criterios de clasificación (sección 5A) fueron alineadas por el motivo de DBL. La “secuencia de aminoácidos central” subrayada se obtuvo determinando el aminoácido que más ocurre en cada posición. Las dos cisteínas adyacentes a las secuencias centrales eran aminoácidos fijados en la biblioteca de TN12. El resto de la secuencia de aminoácido en el péptido de consenso se toma de uno de los péptidos candidatos, TALL-1-12-10 (Tabla 2, SEC. ID. Nº: 37). El péptido y el pepticuerpo que se obtuvo de esta secuencia de consenso eran sumamente activos en el ensayo de proliferación de células B.

EJEMPLO 2

Pepticuerpos

Se construyó un conjunto de 12 pepticuerpos inhibidores de TALL-1 (Tabla 5) en los que un monómero de cada péptido se fusionó estructuralmente con la región Fc de la IgGI humana. Cada pepticuerpo inhibidor de TALL-1 se construyó anillando los pares de oligonucleótidos mostrados en la Tabla 6 para generar un dúplex que codifica el péptido y un enlazador compuesto por cinco residuos de glicina y un residuo de valina como un fragmento Ndel de Sall. Estas moléculas dúplex se unieron en un vector (pAMG21-ANK-Fc, descrito en el presente) que contenía el gen Fc humano, también digerido con Ndel y Sall. Las mezclas de unión resultantes se transformaron mediante electroporación en las células 2596 de la cadena de E. coli (GM221, descritas en el presente). Se comprobó la capacidad de los clones para producir el producto de la proteína recombinante y para poseer la fusión de genes que cuenta con la secuencia de nucleótidos correcta. Se seleccionó uno solo de estos clones para cada uno de los péptidos. El nucleótido y las secuencias de aminoácidos de las proteínas de fusión se muestran en la Figura 4A a 4F.

Tabla 5. Secuencias de péptidos y oligonucleótidos empleados para generar pepticuerpos inhibidores de TALL-1.

Tabla 5B. Pepticuerpos inhibidores de TALL-1

consenso de TALL-1

dímero en tándem TALL-1 123

dímero en tándem de consenso

Tabla 6. Secuencias de oligonucleótidos utilizadas en la construcción del pepticuerpo.

Vector pAMG21-RANK-Fc

pAMG21. El plásmido de expresión pAMG21 (nº de acceso ATCC 98113) se puede obtener del vector de expresión de Amgen pCFM1656 (ATCC #69576) que, a su vez, se puede obtener del sistema del vector de expresión de

5 Amgen descrito en la Patente estadounidense nº 4.710.473. El plásmido pCFM1656 se puede obtener del plásmido pCFM836 descrito (Patente estadounidense nº 4.710.473) de la siguiente manera:

•

destruyendo los dos sitios de restricción endógenos de Ndel, rellenando el extremo con la enzima de la polimerasa T4 seguida de la unión al extremo romo;

•

sustituyendo la secuencia de ADN entre los sitios de restricción únicos Aatll y Clal que contienen el promotor

10 sintético PL por un fragmento similar obtenido de pCFM636 (patente nº 4.710.473) que contiene el promotor PL (véase la SEC. ID. Nº: 95 más abajo); y

 sustituyendo la secuencia de ADN pequeña entre los sitios de restricción únicos Clal y Kpnl por el oligonucleótido que tiene la secuencia de la SEC. ID. Nº: 96

SEC. ID. Nº: 95

SEC. ID. Nº: 96

El plásmido de expresión pAMG21 se puede obtener entonces de pCFM1656 haciendo una serie de cambios básicos orientados al sitio mediante PCR, solapando la mutagénesis de oligonucleótidos con las sustituciones de la

20 secuencia de ADN. Comenzando por el sitio BgIII (plásmido bp # 180) inmediatamente 5' al promotor de replicación del plásmido PcopB y continuando por los genes de replicación del plásmido, los cambios de los pares básicos se muestran en la Tabla 7 a continuación.

Tabla 7—Cambios en los pares básicos resultantes en pAMG21

La secuencia de ADN entre los sitios de restricción únicos AatII (posición #4364 en pCFM1656) y SacII (posición #4585 en pCFM1656) es sustituida por la secuencia de ADN siguiente (SEC. ID. Nº: 97):.

extremo adherente Aatll posición #4358 en pAMG21

Durante la unión de los extremos adherentes de esta secuencia de ADN de sustitución, los sitios fuera de AatII y

SacII son destruidos. Hay sitios de AatII y SacII únicos en el ADN sustituido.

Un gen que codifica el RANK humano fusionado al extremo N-terminal de Fc se unió a pAMG21 como un fragmento

5 Ndel a BamHI para generar la Cadena Amgen #4125. Esta estructura fue modificada para insertar un codón de valina en la unión de RANK y Fc. Los codones de valina y aspartato adyacentes crean un sitio SaII único. Esto permite la fusión de los péptidos en el extremo N-terminal de Fc3 entre los sitios únicos Ndel y SaII. La secuencia RANK se somete a deleción tras la inserción de un nuevo fragmento Ndel-Sall. La secuencia del vector se proporciona en la Figura 5A a 5M.

10 GM221 (Amgen #2596"). La cadena hospedadora de Amgen #2596 es una cadena K-12 de E. coli K-12 obtenida de la cadena de Amgen #393, que es un derivado de E. coli W1485 obtenido del E. coli Genetic Stock Center, Universidad de Yale, New Haven, Connecticut (cadena CGSC 6159). Ha sido modificado para contener tanto el represor lambda sensible a la temperatura cI857s7 en la región ebg temprana como el represor laclQ en la región ebg tardía (68 minutos). La presencia de estos dos genes represores permite el uso de este hospedador en diversos

15 sistemas de expresión, aunque ambos represores son irrelevantes para la expresión desde luxPR. El hospedador no transformado no tiene ninguna resistencia antibiótica.

El sitio de unión ribosomal del gen cI857s7 ha sido modificado para incluir un RBS potenciado. Ha sido insertado en el operón ebg entre la posición del nucleótido 1170 y 1411 conforme a la numeración del nº de acceso Genbank M64441Gb_Ba con deleción de la secuencia ebg interviniente. La secuencia del elemento insertado se muestra a

20 continuación en minúsculas que representan las secuencias ebg que flanquean el elemento insertado mostrado a continuación (SEC. ID. Nº: 98):

La estructura se administró en el cromosoma utilizando un fago recombinante llamado MMebg-cI857s7 potenciado

25 RBS #4 en Ftet/393. Tras la recombinación y la resolución solamente el elemento insertado del cromosoma se mantiene en la célula. Fue rebautizado como F’tet/GM101. Ftet/GM101 fue entonces modificado mediante la administración de una estructura laclQ en el operón ebg entre la posición del nucleótido 2493 y 2937 conforme a la numeración del número de acceso de Genbank M64441Gb_Ba con la deleción de la secuencia ebg interviniente. La secuencia del elemento insertado se muestra a continuación en minúsculas que representan las secuencias ebg que

30 flanquean el elemento insertado (SEC. ID. Nº: 99) que se muestra a continuación:

La estructura se administró en el cromosoma utilizando un fago recombinante denominado AGebg-LacIQ#5 en F'tet/GM101. Tras la recombinación y resolución solamente el elemento insertado del cromosoma anteriormente descrito se mantiene en la célula. Fue rebautizado como F'tet/GM221. El episoma F'tet se obtuvo de la cadena utilizando naranja de acridina a una concentración de 25 μg/ml en LB. La cadena obtenida se identificó como sensible a la tetracilina y se almacenó como GM221.

Expresión en E. coli. Los cultivos de cada una de las estructuras de fusión pAMG21-Fc en E. coli GM221 se cultivaron a 37 °C en un medio de Luria Broth. La inducción de la expresión del producto genético del promotor luxPR se consiguió tras la adición del autoinductor sintético N-(3-oxohexanoil)-DL-homoserina lactona al medio de cultivo a una concentración final de 20 ng/ml. Los cultivos se incubaron a 37 °C durante tres horas más. Después de tres horas, los cultivos bacterianos se examinaron al microscopio para comprobar la presencia de cuerpos de inclusión y se recogieron mediante centrifugado. Se observaron cuerpos de inclusión retráctiles en cultivos inducidos, lo que indica que las fusiones de Fc se produjeron más probablemente en la fracción no soluble de E. coli. Los gránulos de las células fueron lisados directamente mediante resuspensión en una solución tampón de Laemmli que contenía 10% de β-mercaptoetanol y se analizaron mediante SDS-PAGE. En cada caso, se observó una intensa banda de tinción de Coomassie del peso molecular apropiado sobre un gel SDS-PAGE.

EJEMPLO 3

El pepticuerpo TALL-1 inhibe la proliferación de células B mediada por TALL-1

Los linfocitos B de ratón fueron aislados de bazos C57BL/6 mediante selección negativa. (MACS CD43 (Ly-48) Microbeads, Miltenyi Biotech, Auburn, CA). Las células B purificadas (105) se cultivaron en MEM, un 10% de FCS inactivado por calor, 5x10-5M 2-mercaptoetanol, 100 U/ml de penicilina, 100 μg/ml de estreptomicina) por triplicado en placas de cultivo de tejidos de fondo plano de 96 pocillos con 10 ng/ml de proteína TALL-1 y 2 μg/ml de F(ab’)2 de cabra anti IgM de ratón (Jackson ImmunoResearch Laboratory, West Grove, Pennsylvania) con la cantidad indicada del pepticuerpo TALL-1 recombinante durante un período de cuatro días a 37ºC, 5% C02. La proliferación se midió por la absorción de timidina radiactiva 3[H] tras un período de incubación de 18 horas

EJEMPLO 4

El pepticuerpo TALL-1 bloquea la unión de TALL-1 a sus receptores

El Reacti-Gel 6x (Pierce) se recubrió previamente con AGP3 humana (también conocida como TALL-1, Khare et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 97:3370-3375, 2000) y se bloqueó con BSA. 100 pM y 40 pM de muestras del pepticuerpo AGP3 se incubaron con diversas concentraciones indicadas de AGP3 humana a temperatura ambiente durante 8 horas, antes de pasar a las perlas recubiertas de AGP3 humana. La cantidad de pepticuerpo unido a las perlas se cuantificó mediante anticuerpo de cabra anti-Fc humano fluorescente (Cy5) (Jackson Immuno Research). La señal de unión es proporcional a la concentración de pepticuerpo libre en el equilibrio de unión. La constante del equilibrio de disociación (KD) se obtuvo de una regresión no lineal de las curvas de competencia, utilizando un modelo de unión homogéneo de doble curva en un sitio (software KinEx™). Kd es de unos 4 pM por pepticuerpo de AGP3 (SEC. ID. Nº: 123) unión con AGP3 humana (Figura 9)

Para determinar si este pepticuerpo de AGP3 puede neutralizar la unión de AGP3 murina así como de AGP3 humana, se utilizó un ensayo de neutralización de BIAcore. Todos los experimentos se realizaron en un BlAcore 3000 a temperatura ambiente. La proteína humana TACI-Fc (Xia et al, J. Exp. Med. 192,137-144, 2000) se inmovilizó en un chip B1, utilizando 10 mM de acetato a un pH de 4.0 hasta un nivel de 2900RU. Se utilizó una célula

de flujo en blanco como control de fondo. Utilizando una solución tampón corriente de PBS (sin calcio ni magnesio) que contenía 0,005% P20, 1 nM de AGP3 humana recombinante (en solución tampón corriente más 0,1 mg/ml de BSA) se incubó sin y con diversas cantidades indicadas de pepticuerpo AGP3 (eje x) antes de su inyección sobre la superficie del receptor. La regeneración se realizó utilizando 8 mM de glicina a un pH de 1.5 durante un minuto, 25 mM de ácido 3-[cidohexilaminoJ-l-propanosulfónico (CAPS) a un pH 10.5, 1 M NaCI durante un minuto. Para la determinación de la unión de AGP3 murina, se inmovilizó la TACI humana marcada con his en 1000 RU en la mencionada solución tampón. Se incubaron 5 nM de AGP3 murina recombinante (en solución tampón corriente más 0,1 mg/ml de BSA) sin y con las diversas cantidades indicadas en la Figura 11 de pepticuerpo AGP3 (eje x), antes de la inyección sobre la superficie del receptor. La regeneración se realizó con 10 mM de HC1 de pH2, en dos ocasiones durante 30 segundos. Se midió la unión relativa tanto de la AGP3 humana como murina en presencia/ausencia del pepticuerpo AGP3 (SEC. ID. Nº: 123) (eje Y). La respuesta de unión relativa se determinó como (RU-RU en blanco/RUo-RU en blanco). El pepticuerpo AGP3 (SEC. ID. Nº: 123) inhibió tanto la unión de la AGP3 humana como de la murina a su TACI receptor (Figura 10).

Para examinar si este pepticuerpo AGP3 bloquea la unión de AGP3 a los tres receptores (TACl, BCMA y BAFFR), las proteínas TACI, BCMA y BAFFR del receptor soluble recombinante se inmovilizaron en el chip CM5. Utilizando 10 mM de acetato de pH4, se inmovilizó el TACI-Fc humano en 6300 RU, el BCMA-Fc humano en 5000 RU, y el BAFFR-Fc en 6000 RU. 1 nM de AGP3 humana recombinante (en solución tampón corriente con 0,1 mg/ml de BSA y 0,1 mg/ml de heparina) o 1 nM de proteína APRIL recombinante (Yu, et al., Nat. Immunol., 1:252-256, 2000) se incubaron con la cantidad indicada de pepticuerpo de AGP3, antes de la inyección sobre la superficie de cada receptor. La regeneración para el experimento de AGP3 se realizó con 8 mM de glicina de pH 1.5, durante un minuto, seguido de 25 mM de CAPS de pH 10.5, 1M NaCl durante un minuto. La regeneración para el experimento de APRIL se realizó con 8 mM de glicina de pH 2, durante un minuto, seguido de 25 mM de CAPS de pH 10.5, 1M NaCl durante un minuto. Se midió la unión relativa de AGP3 o APRIL. El pepticuerpo de AGP3 (SEC. ID. Nº 123) bloqueó la unión de AGP3 a los tres receptores (Figura 11A). El pepticuerpo de AGP3 no afectó a la unión de APRIL a los receptores (Figura 11B).

EJEMPLO 5

El pepticuerpo de AGP3 bloquea la proliferación de células B mediada por AGP3

Los linfocitos B de ratón fueron aislados de bazos C57BL/6 mediante selección negativa. (MACS CD43 (Ly48) Microbeads, Miltenyi Biotech, Auburn, CA). Las células B purificadas (105) se cultivaron en un medio esencial mínimo (MEM), un 10% de suero bovino fetal (FCS) inactivado por calor, 5x10-5M 2-mercaptoetanol, 100 U/ml de penicilina, 100 μg/ml de estreptomicina) por triplicado en placas de cultivo de tejidos de fondo plano de 96 pocillos con 10 ng/ml de proteína AGP3 (TALL-1) y 2 μg/ml de F(ab’)2 de cabra anti IgM de ratón (Jackson ImmunoResearch Laboratory, West Grove, Pennsylvania) con la cantidad indicada del pepticuerpo de AGP3 recombinante (SEC. ID. Nº: 123) durante un período de cuatro días a 37 °C, 5% CO2. La proliferación se midió por la absorción de timidina radiactiva 3[H] tras un período de incubación de 18 horas.

EJEMPLO 6

Pepticuerpo de AGP3 sobre la producción de Ig estimulada por AGP3 en ratones

Los ratones (hembras Balb/c de 9-14 semanas de edad y 19-21 g de peso) se adquirieron a Charles River Laboratories, Wilmington, MA. Los ratones (n = 10) se trataron intraperitonealmente con I mg/Kg de AGP3 humana una vez al día durante cinco días consecutivos, seguido de 5 mg/Kg o 0,5 mg/Kg de pepticuerpo de AGP3 (SEC. ID. Nº: 123) o de suero salino o de 5 mg/Kg Fc humano. Otros ratones quedaron sin tratar. Los ratones fueron sacrificados al sexto día para medir la IgM e IgA sérica, donde se midieron mediante un ensayo ELISA. Dicho brevemente, las placas se recubrieron con anticuerpos de captura específicos para IgM o IgA (Southern Biotechnology Associates, Birmingham, AL), se bloquearon, y se añadieron diluciones de muestras estándar (IgM de Calbiochem, San Diego, CA e IgA de Southern Biotechnology Associates) o muestras de prueba. La Ig capturada se reveló utilizando anticuerpos biotinilados específicos para IgM o IgA (Southern Biotechnology Associates), peroxidasa conjugada con neutravidina (Pierce, Rockford, IL), y sustrato de peroxidasa por pocillo (KPL, Gaithersbur, MD) / tetrametilbencidina (TMB). Las densidades ópticas se cuantificaron en un lector de ELISA Thermomax ELISA (Molecular Devices, Menlo Park, CA).

El aumento estimulado por AGP3 humana de los niveles séricos de IgM e IgA se bloqueó mediante 5 mg/Kg del pepticuerpo anti-AGP3 (SEC. ID. Nº: 123) y no mediante 0,5mg/Kg (Figuras 12A y 12B).

EJEMPLO 7

El pepticuerpo de AGP3 redujo el número de células B del bazo en ratones

Los ratones (como anteriormente, n = 7) se trataron intraperitonealmente durante siete días consecutivos con 5 mg/Kg o 1,5 mg/Kg o 0,5 mg/Kg del pepticuerpo de AGP3 (SEC. ID. Nº: 123) o de suero salino o de 5 mg/Kg Fc humano. Los ratones fueron sacrificados al octavo día para contar el número de células B del bazo. Los bazos se recogieron en suero salino y se manipularon con cuidado mediante homogenización manual para producir la

suspensión de células. El número total de células se obtuvo con un contador HIE (Technicon, Tarrytown, NY). Los porcentajes de células B se obtuvieron mediante tinción doble de inmunofluorescencia y citometría de flujo, utilizando un conjugado de isotiocianato de fluoresceína (FTTC) y un conjugado de ficoeritrina (PE) Ab frente a CD3 y B220, respectivamente (PharMingen, San Diego. CA) y un analizador FACScan (Becton and Dickinson, Mountain View.CA). Las células B se identificaron por ser CD3-B220+. A todas las dosis, el pepticuerpo de AGP3 (SEC. ID. Nº: 123) redujo el número de células B en el bazo en forma de respuesta a la dosis (Figuras 12A y 12B) (SEC. ID. Nº: 123).

El tratamiento con pepticuerpo de AGP3 redujo el número de células B en ratones. Los ratones Balb/c recibieron siete inyecciones intraperitoneales diariamente de la cantidad indicada de pepticuerpo de AGP3 (SEC. ID. Nº: 123) o proteínas Fc humanas. El día 8 recopilamos los bazos y se sometieron a análisis FAC para comprobar la presencia de células B B220+ como se recoge en la Tabla 8.

Tabla 8

AGP3 Pb reduce el número de células B en ratones normales

n=7

dosis (l/dayx7) Células B bazo (Ixl0e6) SD Test t

salino

51,3 9,6

Fc

5mg/Kg 45,5 7,1

pepticuerpo

5mg/Kg 20,1 3,8 1,37856E-05

1,5mg/Kg

22,6 6,9 5,10194E-05

0,5mg/Kg

25,8 3.6 0,000111409

EJEMPLO 8

El pepticuerpo AGP3 redujo la gravedad de la artritis en el modelo de ratón CIA

Los ratones DBA/1 de ocho a doce semanas de edad (obtenidos de Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) fueron inmunizados intradermalmente, en la base de la cola, con colágeno bovino de tipo II (bC II) (adquirido en la Universidad de Utah), emulsionado en adyuvante completo de Freunds (Difco). Cada inyección era de 100 μl que contenían 100 μg de bCII. Los ratones recibieron una inmunización de refuerzo tres semanas después de la inmunización inicial con bCII emulsionado en adyuvante incompleto de Freunds. El tratamiento comenzó a partir del día de la inmunización de refuerzo durante cuatro semanas. Los ratones fueron examinados para comprobar el desarrollo de la artritis. Como se ha descrito anteriormente (Khare et al.. J. Immunol. 155:3653-9,1995), se asignó una puntuación de 0-3 a cada una de las cuatro patas. Por tanto, la gravedad de la artritis podría variar de 0 a 12 en cada animal. El tratamiento con el pepticuerpo de AGP3 (SEC. ID. Nº: 123) redujo notablemente la gravedad de las puntuaciones de la artritis (Figura 13).

Se tomaron muestras de suero una semana después del tratamiento final (día 35) para el análisis del nivel de anticuerpo anti-colágeno. Se recubrieron las placas de ELISA de alta unión (Immulon, Nunc) con 50 μl de 4 μg/ml de solución de bCII en solución tampón de carbonato y las placas se mantuvieron en frío durante la noche en el frigorífico. Las placas se lavaron tres veces con agua fría. Se utilizaron 75 μl de solución de bloqueo compuesta por PBS/.05% Tween 20/1% BSA para bloquear la unión no específica durante una hora. Las muestras se diluyeron (en solución tampón de bloqueo) en placas de dilución a 1:25, 1:100,1:400, y 1:1600 y 25 μl de estas muestras se añadieron a cada pocillo de la placa ELISA para una dilución final de 100, 400,1600, y 6400 con un volumen final de 100 μl/pocillo. Tras la incubación a temperatura ambiente durante tres horas, las placas se lavaron tres veces de nuevo. 100 μl del anticuerpo secundario diluidos en solución tampón de bloqueo (IgM de rata anti-ratón, IgG2a, IgG2,. IgGl, IgG3-HRP) se añadieron a cada uno de los pocillos y las placas se incubaron durante al menos dos horas. Las placas se lavaron cuatro veces. 100 μl de solución TMB (Sigma) se añadieron a cada pocillo y la reacción se detuvo utilizando 50 μl de ácido sulfúrico al 25%. Se leyeron las placas utilizando un lector de placas ELISA a 450 nm. Se comparó el OD con un grupo estándar que representa unidades/ml. El tratamiento con el pepticuerpo de AGP3 (SEC. ID. Nº: 123) redujo los niveles séricos de IgGl, IgG3, IgG2a e IgG2b anti-colágeno en comparación con los grupos del tratamiento de control con PBS o Fc (Figura 14).

El tratamiento con pepticuerpo de AGP3 redujo el número de células B en ratones. Los ratones Balb/c recibieron siete inyecciones intraperitoneales diariamente de la cantidad indicada de pepticuerpo de AGP3 (SEC. ID. Nº: 123) o proteínas Fc humanas. El día 8 se recopilaron los bazos y se sometieron a análisis FAC para comprobar la presencia de células B B220+ como se recoge en la Tabla 8.

Tabla 8 AGP3 Pb reduce el número de células B en ratones normales

n=7

dosis (l/dayx7) Célula B bazo (Ixl0e6) SD Test t

salino

51,3 9,6

Fc

5mg/KR 45,5 7,1

Pepticuerpo

5mg/Kg 20,1 3,8 1,37856E-05

1,5mg/Kg

22,6 6,9 5,10194E-05

0,5mg/Kg

25,8 3,6 0,000111409

En la invención que ahora se está describiendo por completo, resultará evidente para una persona con

5 conocimientos en el campo que se pueden introducir numerosos cambios y modificaciones en la misma, sin desviarse de la invención recogida en el presente.

La divulgación se definirá ahora por las siguientes cláusulas

1. Una composición de unión a TALL-1 objeto del presente que comprende una secuencia de aminoácidos

Dz2Lz4, donde z2 es un residuo de aminoácido y z4 es T o I, y donde la composición objeto del presente no10 comprende un fragmento de TACI, BCMA ni BAFFR (SEC. ID. Nº: 195.196 y 197).

2.

La composición objeto de la cláusula 1, donde z4 es T.

3.

Una composición de unión a TALL-1 objeto del presente que comprende una secuencia de aminoácidos Dz2, donde z2 es un residuo de aminoácido.

4.

La composición objeto de la cláusula 1 que comprende una secuencia de aminoácido de la fórmula:

donde: a1, a2, y a3 son, cada uno de ellos independientemente, residuos de aminoácidos o ausentes. a6 es un residuo de aminoácido; a8 es T o I;

20 a9 es un residuo hidrófobo o básico; a12 es un residuo polar neutro; y a13 y a14 son, cada uno de ellos independientemente, residuos de aminoácidos o ausentes.

5.

La composición objeto de la cláusula 4 donde a8 es T y a9 es un residuo básico.

6.

La composición objeto de la cláusula 4 donde a9 es K y a12 es F

25 7. La composición objeto de la cláusula 1 que comprende una secuencia de aminoácido de la fórmula:

donde: b1 y b2 son, cada uno de ellos independientemente, residuos de aminoácidos o ausentes; b3 es un residuo ácido o amida;

30 b5 es un residuo de aminoácido; b6 es un residuo aromático; b8 es un residuo de aminoácido; b10 es T o I; b11 es un residuo básico;

35 b12 y b13 son, cada uno de ellos independientemente, residuos de aminoácidos; b14 es un residuo polar neutro; y

b16, b17 y b18 son, cada uno de ellos independientemente, residuos de aminoácidos o ausentes.

8.

La composición objeto de la cláusula 7 donde: b3 es D, Q, o E; b6 es W o Y; b10 es T; b11 es K o R; y

b14 es V o L.

9.

La composición objeto de la cláusula 1 que comprende una secuencia de aminoácido de la fórmula:

donde: c1, c2, y c3 son, cada uno de ellos independientemente, residuos de aminoácidos o ausentes. c5 es un residuo de aminoácido; c7 es un residuo de aminoácido;

15 c9 es T o I; c10 es un residuo básico; c11 y c12 son, cada uno de ellos independientemente, residuos de aminoácidos; c13 es un residuo polar neutro; c14 es un residuo de aminoácido;

20 c16 es un residuo de aminoácido; c17 es un residuo polar neutro; y c18 es un residuo de aminoácido o está ausente.

10. La composición objeto de la cláusula 9 donde: c9 es T;

25 c10 es K o R; c13 es I, L, o V; y c17 es A o L

11. La composición objeto de la cláusula 1 que comprende una secuencia de aminoácido de la fórmula:

30 donde:

d1, d2, y d3 son, cada uno de ellos independientemente, residuos de aminoácidos o están ausentes; d5, d6, y d7 son, cada uno de ellos independientemente, residuos de aminoácidos; d'° es un residuo de aminoácido; d13 es T o I;

35 d14 es un residuo de aminoácido; y d16, d17 y d18 son, cada uno de ellos independientemente, residuos de aminoácidos o ausentes.

12. La composición objeto de la cláusula 1 que comprende una secuencia de aminoácido de la fórmula:

(SEC. ID. Nº: 107) donde: 40 e1, e2, y e3 son, cada uno de ellos independientemente, residuos de aminoácidos o ausentes. e5, e6, e7, e9, y e13 son, cada uno de ellos independientemente, residuos de aminoácidos;

e11 es T o I; y e15, e16 y e17 son, cada uno de ellos independientemente, residuos de aminoácidos o están ausentes.

13. La composición objeto de la cláusula 1 que comprende una secuencia de aminoácido de la fórmula:

(SEC. ID. Nº: 109) donde:

f1, f2 y f3 son residuos de aminoácidos o están ausentes:

f5 es W, Y, o ;

f7es un residuo de aminoácido;

f9 es T o I;

f10 es K, R, o H;

f12 es C, un residuo polar neutro, o un residuo básico (preferiblemente W, C o R);

f13 es C, un residuo polar neutro o está ausente; y

f14 es cualquier residuo de aminoácido o está ausente;

siempre que solamente uno de f1, f2, o f3, pueda ser C, y solamente uno de f12, f13 y f14 pueda ser C.

14.

La composición objeto de la cláusula 13, donde f5 es W.

15.

La composición objeto de la cláusula 13, donde f7 es L.

16.

La composición objeto de la cláusula 13, donde f9 es T.

17.

La composición objeto de la cláusula 13, donde f10 es K.

18.

La composición objeto de la cláusula 13, donde f12 es C y uno de f1, f2, o f3 es C.

19.

La composición objeto de la cláusula 13, donde f13 es V.

20.

La composición objeto del presente de la cláusula 13 que comprende una secuencia de aminoácido de la fórmula:

(SEC. ID. Nº: 125).

21.

La composición objeto de la cláusula 20 que comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo compuesto por SEC. ID. Nº: 32,33,58, 60,63,66,67,69,114,115,122,123,124,147-150,152-177,179,180 y 187.

22.

La composición objeto del presente de la cláusula 20 que comprende una secuencia de aminoácido de la fórmula:

(SEC. ID. Nº: 33).

23.

Una composición objeto del presente que comprende una secuencia de aminoácidos de la fórmula:

(SEC. ID. Nº: 101)

donde:

g1, g2 y g3 son, cada uno de ellos e independientemente, residuos de aminoácidos o están ausentes; g5 es un residuo polar neutro; g8 es un residuo polar neutro; g10 es un residuo ácido;

g12 y g13 son, cada uno de ellos independientemente, residuos de aminoácidos; y

g14 es un residuo de aminoácido o está ausente.

24. La composición objeto de la cláusula 23 donde:

g2 es G; g5 es W; g8 es P; g10 es E; y g13 es un residuo básico;

25. Una composición objeto del presente que comprende una secuencia de aminoácidos de la fórmula:

donde:

h1, h2 y h3 son, cada uno de ellos independientemente, residuos de aminoácidos o ausentes. 10 h6 es un residuo hidrófobo;

h7 es un residuo hidrófobo;

h10 es un residuo hidrófobo polar o ácido; y

h12, h13, y h14 son, cada uno de ellos independientemente, residuos de aminoácidos o ausentes.

26. La composición objeto de la cláusula 25 donde:

15 h1 es G; h6 es A; h7 es un residuo polar neutro; y h10 es un residuo ácido.

27. Una composición objeto del presente que comprende una secuencia de aminoácidos de la fórmula:

donde:

i1 es un residuo de aminoácido o está ausente; i2 es un residuo polar neutro;

i3 es un residuo de aminoácido;

25 i5, i6, i7, y i8 son, cada uno de ellos independientemente, residuos de aminoácidos; i9 es un residuo ácido; i10 es un residuo de aminoácido; i12 e i13 son, cada uno de ellos independientemente, residuos de aminoácidos; y

i14 es un residuo polar neutro.

30 28. La composición objeto de la cláusula 27 donde:

i2 es W; y

i14 es W.

29. Un compuesto de unión a TALL-1 objeto del presente que comprende una secuencia de aminoácidos de la fórmula PFPWE (SEC. ID. Nº: 110).

35 30. La composición objeto de la cláusula 1 que tiene la siguiente fórmula:

y multímeros de la misma, donde:

V1 es un vehículo

X1 y X2 son, cada uno de ellos independientemente, seleccionados de entre – (L1)C-P1,-(L1)c-P1-(L2)d-P2,

(L1)c-P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3, and –(L1)C-P1-(L2)d-P2-(L3)e – P3-(L4),-P4

Uno o más de P1, P2, P3 y P4, cada uno de ellos independientemente, comprenden: Dz2Lz4; L1, L2, L3, y L4 son, cada uno de ellos independientemente, enlazadores; y a,b,c,d,e y f son, cada uno de ellos independientemente, 0 o 1, siempre que al menos uno de a o b sea 1.

31.

La composición objeto de la cláusula 30 de la siguiente fórmula:

32.

La composición objeto de la cláusula 30 de la siguiente fórmula:

33. La composición objeto de la cláusula 30, donde V1 es un dominio Fc. 10 34. La composición objeto de la cláusula 30, donde V1 es un dominio Fc de IgG.

35.

La composición objeto de la cláusula 30, donde V1 es un dominio Fc de IgG1.

36.

La composición objeto de la cláusula 30, donde V1 comprende la secuencia de SEC. ID. Nº: 2.

37.

La composición objeto de la cláusula 30 donde uno o más de P1, P2,P3, y P4, cada uno de ellos independientemente, comprende una secuencia seleccionada de:

(SEC. ID. Nº: 100) (SEC. ID. Nº: 104)

(SEC. ID. Nº: 105) (SEC. ID. Nº: 106) (SEC. ID. Nº: 107)

(SEC. ID. Nº: 103)

25 donde: a1, a2, y a3 son, cada uno de ellos independientemente, residuos de aminoácidos o ausentes. a6 es un residuo de aminoácido; a9 es un residuo básico o hidrófobo; a8 es treonilo o isoleucilo;

30 a12 es un residuo polar neutro; y a13 y a14 son, cada uno de ellos independientemente, residuos de aminoácidos o ausentes. b1 y b2 son, cada uno de ellos independientemente, residuos de aminoácidos o ausentes;

b3 es un residuo ácido o amida;

b5 es un residuo de aminoácido;

b6 es un residuo aromático;

b8 es un residuo de aminoácido;

b10 es T o I; b11 es un residuo básico; b12 y b13 son, cada uno de ellos independientemente, residuos de aminoácidos; b14 es un residuo polar neutro; y b16, b17 y b18 son, cada uno de ellos independientemente, residuos de aminoácidos o ausentes. c1, c2, y c3 son, cada uno de ellos independientemente, residuos de aminoácidos o ausentes. c5 es un residuo de aminoácido; c7 es un residuo de aminoácido; c9 es T o I; c10 es un residuo básico; c11 y c12 son, cada uno de ellos independientemente, residuos de aminoácidos; c13 es un residuo polar neutro; c14 es un residuo de aminoácido; c16 es un residuo de aminoácido;

c17 es un residuo polar neutro; y c18 es un residuo de aminoácido o está ausente. d1, d2, y d3 son, cada uno de ellos independientemente, residuos de aminoácidos o están ausentes;

d5, d6, y d7 son, cada uno de ellos independientemente, residuos de aminoácidos;

d'° es un residuo de aminoácido;

d12 es T o I;

d13 es un residuo de aminoácido; y

d16, d17 y d18 son, cada uno de ellos independientemente, residuos de aminoácidos o ausentes.

e1, e2, y e3 son, cada uno de ellos independientemente, residuos de aminoácidos o ausentes.

e5, e6, e7, e9, y e13 son, cada uno de ellos independientemente, residuos de aminoácidos;

e11 es T o I; y

e15, e16 y e17 son, cada uno de ellos independientemente, residuos de aminoácidos o ausentes;

f1, f2 y f3 son residuos de aminoácidos o ausentes;

f5 es W, Y, o F;

f7es un residuo de aminoácido;

f9 es T o I;

f10 es K, R, o H;

f12 es C, un residuo polar neutro, o un residuo básico;

f13 es C, un residuo polar neutro o está ausente; y

f14 es cualquier residuo de aminoácido o está ausente;

siempre que solamente uno de f1, f2, o f3, pueda ser C, y solamente uno de f12, f13 y f14 pueda ser C.

g1, g2 y g3 son, cada uno de ellos e independientemente, residuos de aminoácidos o están ausentes;

g5 es un residuo polar neutro;

g8 es un residuo polar neutro;

g10 es un residuo ácido;

g12 y g13 son, cada uno de ellos independientemente, residuos de aminoácidos; y

g14 es un residuo de aminoácido o está ausente.

h1, h2 y h3 son, cada uno de ellos independientemente, residuos de aminoácidos o ausentes.

h6 es un residuo hidrófobo; h7 es un residuo hidrófobo; h10 es un residuo hidrófobo polar o ácido; y h12, h13, y h14 son, cada uno de ellos independientemente, residuos de aminoácidos o ausentes. i1 es un residuo de aminoácido o está ausente;

i2 es un residuo polar neutro; i3 es un residuo de aminoácido; i5, i6, i7, y i8 son, cada uno de ellos independientemente, residuos de aminoácidos;

i9 es un residuo ácido;

i10 es un residuo de aminoácido;

i12 e i13 son, cada uno de ellos independientemente, residuos de aminoácidos; y

i14 es un residuo polar neutro.

38.

La composición objeto de la cláusula 37 donde: a9 es un residuo básico; b3 es D, Q, o E; b6 es W o Y; b11 es K o R; y b14 es V o L. c10 es K o R; c13 es I, L, o V; y c17 es A o L; f5 es W; f7 es L; f6es K; y f10 es V.

39.

La composición objeto de la cláusula 37, donde uno o más de P1, P2, P3 y P4, cada uno de ellos independientemente, comprende:

40.

La composición objeto de la Reivindicación 39 de la siguiente fórmula:

41.

La composición objeto de la cláusula 39 de la siguiente fórmula:

42.

La composición objeto de la cláusula 39 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de las SEC. ID. Nº: 122, 123 y 124.

43.

La composición objeto de la cláusula 40 donde L2 es mayor de 5 aminoácidos.

44.

La composición objeto de la cláusula 43 donde L2 se selecciona de:

(SEC. ID. Nº: 193)

y

(SEC. ID. Nº: 194).

donde x1 y x3 son, cada uno de ellos independientemente, residuos básicos o hidrófobos, y x2 y x4 son, cada uno de ellos e independientemente, residuos hidrófobos.

45. La composición objeto de la Reivindicación 41 donde L2 se selecciona de:

(SEC. ID. Nº: 192).

46. La composición objeto de la cláusula 28 que comprende una secuencia seleccionada de la Tabla 2 (SEC. ID. Nº: 10 29-39,30-70, y 126-188).

47.

La composición objeto de la cláusula 30 que comprende una secuencia seleccionada de la Tabla 4 (SEC. ID. Nº: 44-55).

48.

La composición objeto de la cláusula 46, donde V1 es un dominio Fc.

49.La composición objeto de la cláusula 46, donde V1 es un dominio Fc de IgG. 15 50. La composición objeto de la cláusula 46, donde V1 es un dominio Fc de IgG1.

51.

Un ADN que codifica una composición objeto de la cláusula. 34.

52.

Un vector de expresión que comprende el ADN de la cláusula 51.

53.

Una célula hospedadora que comprende el vector de expresión de la cláusula. 52.

54.

La célula de la cláusula 53, donde la célula es una célula de E. coli.

20 55. Un método para tratar una enfermedad autoinmune mediada por células B, que comprende la administración de una composición objeto de la cláusula 1.

56.Un método para tratar una enfermedad autoinmune mediada por células B, que comprende la administración de una composición objeto de la cláusula 13.

57. Un método para tratar el lupus, que comprende la administración de una composición objeto de la cláusula 1. 25 58. Un método para tratar el lupus, que comprende la administración de una composición objeto de la cláusula 13

59.

Un método para tratar un cáncer mediado por células B, que comprende la administración de una composición objeto de la cláusula

60.

Un método para tratar un cáncer mediado por células B, que comprende la administración de una composición objeto de la cláusula 13.

30 61. Un método para tratar el linfoma de células B, que comprende la administración de una composición objeto de la cláusula 1.

62. Un método para tratar el linfoma de células B, que comprende la administración de una composición objeto de la cláusula 13.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> AMGEN INC.

<120> PÉPTIDOS Y MOLÉCULAS RELACIONADAS QUE SE UNEN A TALL-1 5 <130> A-743 (PCT)

<140> PCT/US 02/15273

<141> 2002-05-13

<150> US 60/290,196

<151> 2001-05-11 10 <160> 197

<170> Patente en versión 3.2

<210> 1

<211> 684

<212> ADN 15 <213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS

<222> (1)…(684)

<210> 2

<211> 288

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 2

<210> 3

<211> 62

<212> ADN 5 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Fragmento NdeI a SalI

10 <220>

<221> CDS

<222> (2)…(61)

<400> 3

10 <210> 4

<211> 20

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

15 <220>

<223> Estructura sintética

<400> 4

20 <210> 5

<211> 62

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

25 <220>

<223> Fragmento NdeI a SalI

<220>

<221> CDS 30 <222> (2)…(61)

<210> 6

<211> 20

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Estructura sintética

<210> 7

<211> 62

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Fragmento NdeI a SalI

<220> 20 <221> CDS

<222> (2)…(61)

<210> 8

<211> 20 25 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Estructura sintética

5 <210> 9

<211> 74

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

10 <220>

<223> Fragmento NdeI a SalI

<220>

<221> CDS 15 <222> (2)…(73)

<210> 10

<211> 24 20 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Estructura sintética

<210>11

<211> 74

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 5 <223> Fragmento NdeI a SalI

<220>

<221> CDS

<222> (2)…(73)

<210> 12

<211> 24

<212> PRT 15 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Estructura sintética

<210> 13

<211> 74

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Fragmento NdeI a SalI

<220> 30 <221> CDS

<222> (2)…(73)

<210> 14

<211> 24

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Estructura sintética

<210> 15

<211> 74

<212> ADN 15 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Fragmento NdeI a SalI

20 <220>

<221> CDS

<222> (2)…(73)

<210> 16 25 <211> 24

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Estructura sintética

5

<210> 17

<211> 76

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

10

<220>

<223> Fragmento NdeI a SalI

<220>

15

<221> CDS

<222> (2)…(73)

<210> 18 20 <211> 24

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 25 <223> Estructura sintética

<210> 19

<211> 74

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 5 <223> Fragmento NdeI a SalI

<220>

<221> CDS

<222> (2)…(73)

<210> 20

<211> 24

<212> PRT 15 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Estructura sintética

<210> 21

<211> 74

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Fragmento NdeI a SalI

<220> 30 <221> CDS

<222> (2)…(73)

<210> 22

<211> 24

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Estructura sintética

10 <210> 23

<211> 74

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

15 <220>

<223> Fragmento NdeI a SalI

<220>

<221> CDS 20 <222> (2)…(73)

<210> 24

<211> 24

<212> PRT 25 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Estructura sintética

<210> 25

<211> 74 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Fragmento NdeI a SalI

<220>

<221> CDS

<222> (2)…(73)

<210> 26

<211> 24

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Estructura sintética

<210> 27 25 <211> 7285

<212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Vector pAMG21-Rank-Fc

<210> 28

<211> 7285

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Vector pAMG21-Rank-Fc

<220>

<221> misc_feature

<223> Xaa (Pos, 1,2,3,15,16,17) son, cada uno de ellos independientemente, residuos de aminoácidos o ausentes; Xaa (Pos 5,6,7,9,13) son, cada uno de ellos independientemente, residuos de aminoácidos.

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Dominios de modulación de TALL-1 preferibles

<400> 29

<210> 30

<213> 14

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Dominios de modulación de TALL-1 preferibles

<400> 30

<210> 31

<213> 14

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Dominios de modulación de TALL-1 preferibles

<400> 31

<210> 32

<213> 18

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Dominios de modulación de TALL-1 preferibles

<400> 32 His His

<210> 33

<213> 18

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Dominios de modulación de TALL-1 preferibles

<400> 32

Pro Leu

<210> 34

<213> 18

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Dominios de modulación de TALL-1 preferibles

<400> 34

Ser Ser

<210> 35

<213> 18

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Dominios de modulación de TALL-1 preferibles

<400> 34

Asn Leu <210> 36

5

<213> 18 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <223> Dominios de modulación de TALL-1 preferibles

10

<400> 36

<210> 37

<213> 18

<212> PRT 15 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Dominios de modulación de TALL-1 preferibles

20 <400> 37

<210> 38

<213> 18 25 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Dominios de modulación de TALL-1 preferibles

<400> 38 <210> 39

<213> 18

<212> PRT 5 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Dominios de modulación de TALL-1 preferibles

10 <400> 39

15

<210> 40 <213> 8 <212> PRT <213> Secuencia artificial

20

<220> <223> Dominios de modulación de TALL-1 preferibles <400> 40

25

<210> 41 <213> 8 <212> PRT <213> Secuencia artificial

30 35

<220> <223> Enlazadores de poliglicina <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> N is asparagina

<400> 41

gggngssg

<210> 42

<213> 8

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Enlazadores de poliglicina

<400> 42 gggcggg

<210> 43

<213> 5

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Enlazadores de poliglicina

<400> 43

<210> 44

<213> 19

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Enlace peptídico

<220>

<221> misc_feature

<222> (19)..(19)

<223> Xaa = un enlace peptídico

Dominio Fc unido en la posición 19 del extremo C-terminal <400> 44

<210> 45

<213> 19

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Enlace peptídico

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> Xaa = un enlace peptídico Dominio Fc unido en la posición 1 del extremo N-terminal

Asp Pro Leu

<210> 46

<213> 38

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Enlace peptídico

<220>

<221> misc_feature

<222> (38)..(38)

<223> Xaa = un enlace peptídico Dominio Fc unido en la posición 38 del extremo C-terminal

<210> 47

<213> 38

<212> PRT 5 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Enlace peptídico

10 <220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> Xaa = un enlace peptídico Dominio Fc unido en la posición 1 del extremo N-terminal

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(20)

<223> Xaa = un enlace peptídico

<210> 48 25 <213> 19

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> <223> Enlace peptídico

<220>

<221> misc_feature

<222> (19)..(19)

<223> Xaa = un enlace peptídico Dominio Fc unido en la posición 1 del extremo N-terminal

<210> 49

<213> 19

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Enlace peptídico

<220> 20 <221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> Xaa = un enlace peptídico Dominio Fc unido en la posición 1 del extremo N-terminal

<400> 49

<210> 50

<213> 36

<212> PRT 30 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Enlace peptídico

<220>

<221> misc_feature

<222> (18)..(18)

<223> Xaa = un enlace peptídico Dominio Fc unido en la posición 1 del extremo N-terminal

<210> 51

<213> 36 10 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Enlace peptídico

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> Xaa = un enlace peptídico 20 Dominio Fc unido en la posición 1 del extremo N-terminal

<220>

<221> misc_feature

<222> (19)..(19) 25 <223> Xaa = un enlace peptídico

<400> 51

<210> 52

<213> 19

<212> PRT 5 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Enlace peptídico

10 <220>

<221> misc_feature

<222> (19)..(19)

<223> Xaa = un enlace peptídico Dominio Fc unido en la posición 19 del extremo C-terminal

<210> 53

<213> 19

<212> PRT 20 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Enlace peptídico

25 <220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> Xaa = un enlace peptídico Dominio Fc unido en la posición 1 del extremo N-terminal

<210> 54

<213> 38

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

5 <220>

<223> Enlace peptídico

<220>

<221> misc_feature 10 <222> (38)..(38)

<223> Xaa = un enlace peptídico Dominio Fc unido en la posición 38 del extremo C-terminal

15 <210> 55

<213> 38

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

20 <220>

<223> Enlace peptídico

<220>

<221> misc_feature 25 <222> (1)..(1)

<223> Xaa = un enlace peptídico Dominio Fc unido en la posición 1 del extremo N-terminal

30 <220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(20)

<223> Xaa = un enlace peptídico

<210> 56

<213> 25

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido

<400> 56 Cggcgcaact atcggtatca agctg

<210> 57

<213> 26

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido

<400> 57 Catgtaccgt aacactgagt ttcgtc

<210> 58

<213> 18

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Péptido de consenso

<400> 58

<210> 59 5 <213> 23

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 10 <223> Secuencia de enlazador preferible

<400> 59

15

<210> 60

<213> 18

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

20

<220>

<223> Dominios de modulación de TALL-1 preferibles

<400> 60

25

<210> 61

<213> 18 30 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Dominios de modulación de TALL-1 preferibles

<400> 61

Asp Gly

<210> 62

<213> 18

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Dominios de modulación de TALL-1 preferibles

<400> 62

<210> 63

<213> 18

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Dominios de modulación de TALL-1 preferibles

<400> 63

<210> 64

<213> 18

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Dominios de modulación de TALL-1 preferibles

<400> 64

5 <210> 65

<213> 18

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

10 <220>

<223> Dominios de modulación de TALL-1 preferibles

<400> 65

15

<210> 66

<213> 18

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

20

<220>

<223> Dominios de modulación de TALL-1 preferibles

<400> 66

<210> 67

<213> 18

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Dominios de modulación de TALL-1 preferibles

<400> 67

<210> 68

<213>

18 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Dominios de modulación de TALL-1 preferibles

<400> 68

<210> 69

<213>

18 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Dominios de modulación de TALL-1 preferibles

<400> 69

<210> 70 25 <213> 18

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 30 <223> Dominios de modulación de TALL-1 preferibles

<400> 70

<210> 71

<213> 62

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótidos

<213> 64

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótidos

<210> 73

<213> 62

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótidos

30 <210> 74 <213> 64

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótidos

<210> 75

<213> 62 10 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótidos

<210> 76

<213> 64

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótidos

25 <210> 77

<213> 74

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

30 <220>

<223> Oligonucleótidos

<210> 78

<213> 76

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótidos

<210> 79

<213> 74

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótidos

<210> 80

<213> 76

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótidos

<210> 81

<213> 74

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótidos

5 <210> 82

<213> 76

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

10 <220>

<223> Oligonucleótidos

<210> 83 15 <213> 74

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 20 <223> Oligonucleótidos

<210> 84

<213> 76

<212> ADN 25 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótidos

30 <210> 85 <213> 74

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótidos

<210> 86

<213> 76 10 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótidos

<210> 87

<213> 74

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótidos

25 <210> 88

<213> 76

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

30 <220>

<223> Oligonucleótidos

<210> 89

<213> 74

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótidos

10 <210> 90

<213> 76

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

15 <220>

<223> Oligonucleótidos

<210> 91

<213>

74 20 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótidos

<210> 92

<213> 76

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótidos

<210> 93

<213>

74 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótidos

<210> 94

<213> 76

<212> ADN 15 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótidos

20 <210> 95

<213> 141

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

25 <220>

<223> Vector pAMG21-Rank-Fc

<400>95

<210> 96

<213> 55

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Vector pAMG21-Rank-Fc

10 <210> 97

<213> 1546

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

15 <220>

<223> pAMG21

<210> 98

<213> 872

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> GM221

<210> 99

<213> 1197

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> GM221

<210> 100

<213> 14

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Moduladores de TALL-1

<220>

<223> Moduladores de TALL-1

<220>

<221> misc_feature <222>(1,2,3,13)…(14)

<223> Xaa (Pos, 1,2,3,13,14) son, cada uno de ellos independientemente, residuos de aminoácidos o ausentes;

<220>

<221> misc_feature <222>(6)…(6) <223) Xaa (Pos6) es un residuo de aminoácido;

<220>

<221> misc_feature <222>(8)…(8) <223) Xaa (Pos8) es treonilo o isoleucilo:

<220>

<221> misc_feature <222>(9)…(9) <223) Xaa (Pos9) es un residuo hidrófobo o básico;

<220>

<221> misc_feature <222>(10)…(10) <223) Xaa (Pos10) es un residuo de aminoácido;

<220>

<221> misc_feature

<222>(12)…(12) <223) Xaa (Pos12) es un residuo hidrófobo neutro;

<210> 101

<213> 14

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Moduladores de TALL-1

15 <220>

<221> misc_feature <222>(1,2,3,12 y)…(13)

<223> Xaa (Pos, 1,2,3,12,13) son, cada uno de ellos independientemente, residuos de aminoácidos o ausentes;

<220>

<221> misc_feature <222>(5 y )…(8) <223) Xaa (Pos5,8) es un residuo hidrófobo neutro;

<220>

<221> misc_feature

<222> (10)..(10)

<223> Xaa (Pos 10) es un residuo ácido; 30 <220>

<221> misc_feature

<222> (14)..(14)

<223> Xaa (Pos14) es un residuo de aminoácidos o ausente.

<210> 102 <213> 14

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

5 <220>

<223> Moduladores de TALL-1

<220>

<221> misc_feature 10 <222>(1,2,3,12, 13 y)…(14)

<223> Xaa (Pos, 1,2,3,12,13,14) son, cada uno de ellos independientemente, residuos de aminoácidos o ausentes;

<220>

15 <221> misc_feature <222>(6 y )…(7) <223) Xaa (Pos 6,7) es un residuo hidrófobo neutro;

<220> 20 <221> misc_feature

<222> (10)..(10)

<223> Xaa (Pos 10) es un residuo hidrófobo polar o ácido;

25 <210> 103

<213> 14

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

30 <220>

<223> Moduladores de TALL-1

<220>

<221> misc_feature 35 <222>(1)…(1)

<223> Xaa (Pos1) es un residuo de aminoácidos o ausente;

<220>

<221> misc_feature <222>(2 y )…(14) <223) Xaa (Pos 2,14) es un residuo hidrófobo neutro;

5 <220>

<221> misc_feature <222>(3 y )…(10) <223) Xaa (Pos 3,10) es un residuo de aminoácido;

10 <220>

<221> misc_feature

<222> (5,6,7,8,12 y )..(13)

<223> Xaa (Pos 5,6,7,8,12,13) son, cada uno de ellos independientemente, aminoácidos

<220> 15 <221> misc_feature

<222> (9 )..(9)

<223> Xaa (Pos 9) es un residuo de aminoácido;

<210> 104

<213> 18

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Moduladores de TALL-1

30 <220>

<221> misc_feature <222>(1,2,12,13, 16, 17 y)…(18)

<223> Xaa (Pos, 1,2,12,13,16,17,18) son, cada uno de ellos independientemente, residuos de aminoácidos o ausentes;

<220>

<221> misc_feature <222>(3)…(3)

<223> Xaa (Pos 3) es un residuo ácido o amida;

<220>

<221> misc_feature 5 <222>(5 y )…(8)

<223> Xaa (Pos 5,8) es un residuo de aminoácido;

<220>

10 <221> misc_feature <222>(6 y )…(6)

<223> Xaa (Pos 6) es un residuo aromático;

<220>

15 <221> misc_feature

<222> (10)..(10)

<223> Xaa (Pos 10) es T o I;

<220>

20 <221> misc_feature

<222> (11)..(11)

<223> Xaa (Pos 11) es un residuo básico;

<220>

25 <221> misc_feature

<222> (14)..(14) <223) Xaa (Pos 14) es un residuo hidrófobo neutro;

30

<210> 105

<213> 18

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

35

<220>

<223> Moduladores de TALL-1

<220>

<221> misc_feature <222>(1,2 y )…(3)

<223> Xaa (Pos, 1,2,3) son, cada uno de ellos independientemente, residuos de aminoácidos o ausentes;

<220>

<221> misc_feature <222>(5,7,14 y )…(16) <223) Xaa (Pos 5,7,14,16) es un residuo de aminoácido;

<220>

<221> misc_feature

<222> (9)..(9)

<223> Xaa (Pos 9) es T o I;

<220>

<221> misc_feature

<222> (10)..(10)

<223> Xaa (Pos 10) es un residuo básico;

<220>

<221> misc_feature <222>(11 y )…(12)

<223> Xaa (Pos 11,12) son, cada uno de ellos independientemente, residuos de aminoácidos;

<220>

<221> misc_feature <222>(13 y )…(17)

<223> Xaa (Pos 13, 17) es un residuo hidrófobo neutro;

<220>

<221> misc_feature

<222> (18)..(18)

<223> Xaa (Pos 18) es un residuo de aminoácido o está ausente;

<210> 106

<213> 18 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Moduladores de TALL-1

<220>

<221> misc_feature <222>(1,2,3,16, 17 y)…(18)

<223> Xaa (Pos, 1,2,3,16,17,18) son, cada uno de ellos independientemente, residuos de aminoácidos o ausentes;

<220>

<221> misc_feature

<222>(5,6,7,10 y )…(14) 20 <223> Xaa (Pos 6,7,10,14) son, cada uno de ellos independientemente, residuos de aminoácidos;

<220>

<221> misc_feature

<222>

(12)..(12) 25 <223> Xaa (Pos 12) es T o I;

<220>

<221> misc_feature

<222>

(13)..(13) 30 <223> Xaa (Pos 13) es un residuo de aminoácido;

<210> 107

<213> 18

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

5 <220>

<223> Moduladores de TALL-1

<220>

<221> misc_feature 10 <222>(1,2,3,15,16,17)…(18)

<223> Xaa (Pos, 1,2,3,15,16,17,18) son, cada uno de ellos independientemente, residuos de aminoácidos o ausentes;

15 <220>

<221> misc_feature <222>(5,6,7,9 y )…(13)

<223> Xaa (Pos 5,6,7,9,13) son, cada uno de ellos independientemente, residuos de aminoácidos;

20 <220>

<221> misc_feature

<222> (11)..(11)

<223> Xaa (Pos 11) es T o I; y

<210> 108

<213> 4

<212> PRT 30 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Moduladores de TALL-1

35 <220>

<221> misc_feature <222>(2)…(2)

<223> X en (Pos 2) es un residuo de aminoácido;

<220>

<221> misc_feature <222>(4)…(4) <223) X en (Pos 4) es treonilo o isoleucilo

<210> 109

<213> 14

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Moduladores de TALL-1

<220>

<221> misc_feature <222>(1,2 y )…(3)

<223> X en (Pos,1,2,3) son residuos de aminoácidos o están ausentes (con uno de X1,X2, y X3 preferible para ser C cuando uno de x12,x13, y x14 es c);

<220>

<221> misc_feature <222>(5 )…(5) <223) X en (Pos 5) es W, Y, o F (W preferible);

<220>

<221> misc_feature

<222> (7)..(7)

<223> X en (Pos 7) es un residuo de aminoácido (L preferible);

<220>

<221> misc_feature

<222> (9)..(9)

<223> X en (Pos 9) es T o I (T preferible);

<220>

<221> misc_feature

<222> (10)..(10)

<223> X en (Pos 10) es K, R, o H (K preferible);

<220>

<221>Misc_feature <222>(12)..(12)

<223> X en (Pos 12) es C, un residuo hidrófobo neutro, o un residuo básico (W,C, o R preferible);

<220>

<221>Misc_feature <222>(13)..(13)

<223> X en (Pos 13) es C, un residuo hidrófobo neutro, o está ausente (V preferible);

<220>

<221>Misc_feature <222>(14)..(14)

<223> X en (Pos 14) es cualquier residuo de aminoácido o está ausente;

<210> 110

<213> 5

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Moduladores de TALL-1

<210> 111

<213> 248

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Pepticuerpos inhibidores de TALL-1

<211> 248

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

5 <220>

<223> Moduladores de TALL-1

<220> 10 <223> Pepticuerpos inhibidores de TALL-1

<210> 113

<213> 248 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Pepticuerpos inhibidores de TALL-1

<210> 114

<213> 252

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Pepticuerpos inhibidores de TALL-1

<210> 115

<213> 252

<212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Pepticuerpos inhibidores de TALL-1

<210> 116

<213> 252 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Pepticuerpos inhibidores de TALL-1

<210> 117

<213> 252 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Pepticuerpos inhibidores de TALL-1

<210> 118

<213> 252

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Pepticuerpos inhibidores de TALL-1

<210> 119

<213> 252 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Pepticuerpos inhibidores de TALL-1

<210> 120

<213> 252 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Pepticuerpos inhibidores de TALL-1

<210> 121

<213> 252

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Pepticuerpos inhibidores de TALL-1

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Pepticuerpos inhibidores de TALL-1

<213> 293

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Pepticuerpos inhibidores de TALL-1

<210> 124

<213> 293 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Pepticuerpos inhibidores de TALL-1

<210> 125

<213> 14

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de consenso

<220>

<221> misc_feature <222>(1,2 y )…(3)

<223> X en (Pos,1,2,3) son residuos de aminoácidos o están ausentes (con uno de X1,X2, y X3 preferible para ser C cuando uno de x12,x13, y x14 es C);

<220>

<221> misc_feature <222>(7)…(7)

<223> X en (Pos 7) es un residuo de aminoácido (L preferible);

<220>

<221> misc_feature <222>(9)…(9)

<223> X en (Pos 9) es T o I (T preferible);

<220>

<221> misc_feature <222>(12)…(12)

<223> X en (Pos 12) es C, un residuo hidrófobo neutro o básico (preferible);

<220>

<221>

misc_feature 5 <222>(13)…(13)

<223> X en (Pos 13) es C, un residuo hidrófobo neutro, o está ausente (V preferible);

<220>

<221>

misc_feature 10 <222>(14)…(14)

<223> X en (Pos 14) es cualquier residuo de aminoácido o está ausente;

15

20

<210> 126 <213> 18 <212> PRT <213> Secuencia artificial

<220> <223> Dominios de modulación de TALL-1 preferibles

25

30

<210> 127

<213> 18

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

35

<220>

<223> Dominios de modulación de TALL-1 preferibles

<210> 128 5 <213> 18

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 10 <223> Dominios de modulación de TALL-1 preferibles

15 <210> 129

<213> 18

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

20 <220>

<223> Dominios de modulación de TALL-1 preferibles

<210> 130

<213> 18 30 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Dominios de modulación de TALL-1 preferibles

<210> 131

<213> 18

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Dominios de modulación de TALL-1 preferibles

<210> 132

<213> 18

<212> PRT 20 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Dominios de modulación de TALL-1 preferibles <210> 134

25

<210> 133

<213> 18

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

30

<220>

<223> Dominios de modulación de TALL-1 preferibles

<213> 18 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Dominios de modulación de TALL-1 preferibles

<210> 135

<213> 18

<212>

PRT 15 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Dominios de modulación de TALL-1 preferibles

<210> 136

<213> 18

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Dominios de modulación de TALL-1 preferibles

<210> 137

<213> 18

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Dominios de modulación de TALL-1 preferibles

<210> 138

<213> 18

<212>

PRT 15 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Dominios de modulación de TALL-1 preferibles

<210> 139

<213> 18 25 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Dominios de modulación de TALL-1 preferibles

<210> 140

<213> 18

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Dominios de modulación de TALL-1 preferibles

<210> 141 10 <213> 18

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 15 <223> Dominios de modulación de TALL-1 preferibles

<210> 142

<213>

18 20 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Dominios de modulación de TALL-1 preferibles

<210> 143

<213>

18 30 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Dominios de modulación de TALL-1 preferibles

<210> 144

<213>

18 10 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Dominios de modulación de TALL-1 preferibles

<210> 145

<213> 18

<212> PRT 20 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Dominios de modulación de TALL-1 preferibles

<210> 146

<213> 18

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Dominios de modulación de TALL-1 preferibles

<210> 147

<213>

18 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Dominios de modulación de TALL-1 preferibles

<210> 148

<213>

18 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Dominios de modulación de TALL-1 preferibles

<210> 149

<213> 18

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Dominios de modulación de TALL-1 preferibles

<210> 150

<213> 18

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Dominios de modulación de TALL-1 preferibles

<210> 151

<213> 18

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Dominios de modulación de TALL-1 preferibles

<210> 152

<213> 18

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Dominios de modulación de TALL-1 preferibles

<210> 152

<213> 18

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Dominios de modulación de TALL-1 preferibles

10

<210> 153

<213> 18

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

15

<220>

<223> Dominios de modulación de TALL-1 preferibles

<210> 154

<213> 18

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Dominios de modulación de TALL-1 preferibles

<210> 155

<213> 18

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Dominios de modulación de TALL-1 preferibles

<210> 156

<213> 18

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Dominios de modulación de TALL-1 preferibles

20

<210> 157

<213> 18

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

25

<220>

<223> Dominios de modulación de TALL-1 preferibles

<210> 158

<213> 18

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Dominios de modulación de TALL-1 preferibles

<210> 159

<213> 18

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Dominios de modulación de TALL-1 preferibles

<210> 160 20 <213> 18

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 25 <223> Dominios de modulación de TALL-1 preferibles

<210> 161 <213> 18

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Dominios de modulación de TALL-1 preferibles

<210> 162 10 <213> 18

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 15 <223> Dominios de modulación de TALL-1 preferibles

<210> 163

<213> 18 20 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Dominios de modulación de TALL-1 preferibles

<210> 164

<213> 18

<212> PRT 30 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Dominios de modulación de TALL-1 preferibles

<210> 165 5 <213> 18

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 10 <223> Dominios de modulación de TALL-1 preferibles

<210> 166

<213>

18 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Dominios de modulación de TALL-1 preferibles

<210> 167

<213>

18 25 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Dominios de modulación de TALL-1 preferibles

<210> 168

<213>

18 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Dominios de modulación de TALL-1 preferibles

<210> 169

<213> 18

<212> PRT 15 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Dominios de modulación de TALL-1 preferibles

<210> 170

<213>

18 25 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Dominios de modulación de TALL-1 preferibles

<210> 171

<213> 18

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Dominios de modulación de TALL-1 preferibles

<210> 172

<213> 18

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Dominios de modulación de TALL-1 preferibles

<210> 173

<213> 18

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Dominios de modulación de TALL-1 preferibles

<210> 174

<213> 18

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Dominios de modulación de TALL-1 preferibles

<210> 175

<213> 18

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Dominios de modulación de TALL-1 preferibles

<210> 177

<213> 18

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Dominios de modulación de TALL-1 preferibles

<210> 178

<213>

18 10 <212> PRT

20

<210> 176

<213> 18

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

25

<220>

<223> Dominios de modulación de TALL-1 preferibles

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Dominios de modulación de TALL-1 preferibles

<210> 179

<213> 18

<212>

PRT 20 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Dominios de modulación de TALL-1 preferibles

<210> 180

<213> 18

<212>

PRT 30 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Dominios de modulación de TALL-1 preferibles

5 <210> 181

<213> 18

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

10 <220>

<223> Dominios de modulación de TALL-1 preferibles

<210> 182 15 <213> 18

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 20 <223> Dominios de modulación de TALL-1 preferibles

<210> 183

<213> 18

<212> PRT 25 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Dominios de modulación de TALL-1 preferibles

<210> 184 5 <213> 18

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 10 <223> Dominios de modulación de TALL-1 preferibles

<210> 185

<213> 18 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Dominios de modulación de TALL-1 preferibles

25 <210> 186

<213> 18

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

30 <220>

<223> Dominios de modulación de TALL-1 preferibles

<210> 187 5 <213> 18

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 10 <223> Dominios de modulación de TALL-1 preferibles

<210> 188

<213> 19 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Dominios de modulación de TALL-1 preferibles

<210> 189 25 <213> 882

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 30 <223> Dominios de modulación de TALL-1 preferibles

<210> 190

<213> 23 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Enlazador preferible

15 <210> 191

<213> 23

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Enlazador preferible

<210> 192

<213> 46

<212> PRT 10 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Enlazador preferible

<210> 193

<213> 23

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Enlazador preferible

<220> 25 <221>misc_feature

<222> (22)..(23)

<223> X en (Pos 22) es independientemente un residuo hidrófobo o básico, y X en (Pos 23) es independientemente un residuo hidrófobo.

<210> 191

<213> 23

<212> PRT 5 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Enlazador preferible

10 <220> <221>misc_feature

<222> (22, 23, 45 y)..(46)

<223> X en (Pos 22) y (pos 45) son, cada uno de ellos independientemente, residuos hidrófobos o básicos, y X en (Pos 23) y (Pos 46) son, cada uno de ellos independientemente, residuos hidrófobos.

<210> 195

<213> 38

<212> PRT 20 <213> Humano

<210> 196 25 <213> 23

<212> PRT

<213> Humano

<210> 197

<213> 42

<212> PRT

<213> Humano

Claims (29)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Una composición objeto del presente que comprende una secuencia de aminoácidos de la fórmula b1b2b3Cb5b6Db8Lb10b11b12b13b14Cb16b17b18 (SEC. ID. N.º: 104)

   donde: b1 y b2, cada uno de ellos independientemente, es un residuo de aminoácido o está ausente; b3 es D, Q o E; b5 es un residuo de aminoácido; b6 es W o Y; b8 es un residuo de aminoácido; b10 es T; b11 es K o R; b12 y b13, cada uno de ellos independientemente, es un residuo de aminoácido; b14 es V o L; y b16, b17 y b18, cada uno de ellos independientemente, es un residuo de aminoácido o está ausente.

2. 2.

   Una composición objeto del presente que comprende una secuencia de aminoácidos de la fórmula

   14Cc16

   ccc3Cc5Dc7Lc9ccccccc18 (SEC. ID. N.º: 105) donde:

   c1, c2 y c3, cada uno de ellos independientemente, es un residuo de aminoácido o está ausente;

   c5 es un residuo de aminoácido;

   c7 es un residuo de aminoácido;

   c9 es T;

   c10 es K o R;

   c11 y c12, cada uno de ellos independientemente, es un residuo de aminoácido;

   c13 es I, L o V;

   c14 es un residuo de aminoácido;

   c16 es un residuo de aminoácido;

   c17 es A o L; y

   c18 es un residuo de aminoácido o está ausente.

3. 3.

   Una composición objeto del presente que comprende una secuencia de aminoácidos de la fórmula d1d2d3Cd5d6d7WDd10Ld12d13d14Cd16d17d18 (SEC. ID. N.º: 106)

   donde: d1, d2 y d3, cada uno de ellos independientemente, es un residuo de aminoácido o está ausente; d5, d6 y d7, cada uno de ellos independientemente, es un residuo de aminoácido; d10 es T o I; d13 es un residuo de aminoácido; d14 es un residuo de aminoácido; y d16, d17 y d18, cada uno de ellos independientemente, es un residuo de aminoácido o está ausente.

4. 4.

   Una composición objeto del presente que comprende una secuencia de aminoácidos de la fórmula

   eee3Ce5ee7De9Le11Ke13Ce15eee18 (SEC. ID. N.º: 107)

   donde: e1, e2 y e3, cada uno de ellos independientemente, es un residuo de aminoácido o está ausente; e5, e6, e7, e9 y e13, cada uno de ellos independientemente, es un residuo de aminoácido; e11 es T o I; y

   e, e, ey e18, cada uno de ellos independientemente, es un residuo de aminoácido o está ausente.

5. 5.

   Una composición objeto del presente que comprende una secuencia de aminoácidos de la fórmula g1g2g3Cg5PFg8Wg10Cg12g13g14 (SEC. ID. N.º: 101)

   donde: g1 y g3, cada uno de ellos independientemente, es un residuo de aminoácido o está ausente; g2 es G; g5 es W; g8 es P; g10 es E; g12 es un residuo de aminoácido; g13 es un residuo básico; y g14 es un residuo de aminoácido o está ausente.

6. 6.

   Una composición objeto del presente que comprende una secuencia de aminoácidos de la fórmula h1h2h3CWh6h7WGh10Ch12h13h14 (SEC. ID. N.º: 102)

   donde: h1, h2 y h3, cada uno de ellos independientemente, es un residuo de aminoácido o está ausente; h6 es un residuo hidrófobo; h7 es un residuo hidrófobo; h10 es un residuo hidrófobo ácido o polar; y h12, h13 y h14, cada uno de ellos independientemente, es un residuo de aminoácido o está ausente.

7. 7.

   La composición objeto de la reivindicación 6, donde: h1 es G; h6 es A; h7 es un residuo hidrófobo neutro; y h10 es un residuo ácido.

8. 8.

   Una composición objeto del presente que comprende una secuencia de aminoácidos de la fórmula i1i2i3Ci5i6i7i8i9i10Ci12i13i14 (SEC. ID. N.º: 103)

   donde: i1 está ausente o es un residuo de aminoácido; i2 es residuo W;

   i3 es un residuo de aminoácido; i5, i6, i7 e i8, cada uno de ellos independientemente, es un residuo de aminoácido; i9 es un residuo ácido; i10 es un residuo de aminoácido; i12 e i13, cada uno de ellos independientemente, es un residuo de aminoácido; y i14 es residuo W.
9. 9. Una composición objeto del presente que tiene la fórmula (X1)a-V1-(X2)b y multímeros de la misma, donde:

   V1 es una molécula que evita la degradación y/o aumenta la vida media, reduce la toxicidad, reduce la inmunogenicidad, o aumenta la actividad biológica de una proteína terapéutica; X1 y X2 se seleccionan, cada uno de ellos independientemente, de entre -(L1)c -P1, -(L1)c -P1-(L2)d-P2, -(L1)c -

   P1, -(L2)d-P2-(L3)e-P3, -(L1)c -P1, -(L2)d -P2-(L3)e-P3, -(L4)f -P4, uno o varios de P1, P2, P3 y P4 comprenden, cada uno de ellos independientemente, una secuencia seleccionada de entre

   10Ca12

   aaa3CDa6La8aaaa14 (SEC. ID. N.º: 100),

   b1b2b3Cb5b6Db8Lb10b11b12b13b14Cb16b17b18 (SEC. ID. N.º: 104), 121011121317

   14Cc16

   ccc3Cc5Dc7Lc9ccccccc18 (SEC. ID. N.º: 105),

   d1d2d3Cd5d6d7WDd10Ld12d13d14Cd16d17d18 (SEC. ID. N.º: 106), 1261617

   eee3Ce5ee7De9Le11Ke13Ce15eee18 (SEC. ID. N.º: 107), g1g2g3Cg5PFg8Wg10Cg12g13g14 (SEC. ID. N.º: 101), h1h2h3CWh6h7WGh10Ch12h13h14 (SEC. ID. N.º: 102) y i1i2i3Ci5i6i7i8i9i10Ci12i13i14 (SEC. ID. N.º: 103)

   donde a1, a2y a3, cada uno de ellos independientemente, es un residuo de aminoácido o está ausente; a6 es un residuo de aminoácido; a9 es un residuo básico o hidrófobo; a8 es treonilo o isoleucilo; a10 es un residuo de aminoácido; a12 es un residuo hidrófobo neutro; a13 y a14, cada uno de ellos independientemente, es un residuo de aminoácido o está ausente; b1 y b2, cada uno de ellos independientemente, es un residuo de aminoácido o está ausente; b3 es un residuo ácido o de amida; b5 es un residuo de aminoácido; b6 es un residuo aromático; b8 es un residuo de aminoácido; b10 es T o I; b11 es un residuo básico; b12 y b13, cada uno de ellos independientemente, es un residuo de aminoácido; b14 es un residuo hidrófobo neutro; b16, b17 y b18, cada uno de ellos independientemente, es un residuo de aminoácido o está ausente; c1, c2 y c3, cada uno de ellos independientemente, es un residuo de aminoácido o está ausente;

   c5 es un residuo de aminoácido; c7 es un residuo de aminoácido; c9 es T o I; c10 es un residuo básico; c11 y c12, cada uno de ellos independientemente, es un residuo de aminoácido; c13 es un residuo hidrófobo neutro; c14 es un residuo de aminoácido; c16 es un residuo de aminoácido; c17 es un residuo hidrófobo neutro; c18 es un residuo de aminoácido o está ausente; d1, d2 y d3, cada uno de ellos independientemente, es un residuo de aminoácido o está ausente; d5, d6 y d7, cada uno de ellos independientemente, es un residuo de aminoácido; d10 es un residuo de aminoácido; d12 es T o I; d13 es un residuo de aminoácido; d16, d17 y d18, cada uno de ellos independientemente, es un residuo de aminoácido o está ausente. e1, e2 y e3, cada uno de ellos independientemente, es un residuo de aminoácido o está ausente; e5, e6, e7, e9 y e13, cada uno de ellos independientemente, es un residuo de aminoácido; e11 es T o I;

   e, e, ey e18, cada uno de ellos independientemente, es un residuo de aminoácido o está ausente; g1, g2 y g3, cada uno de ellos independientemente, es un residuo de aminoácido o está ausente; g5 es un residuo hidrófobo neutro; g8 es un residuo hidrófobo neutro; g10 es un residuo ácido; g12 y g13, cada uno de ellos independientemente, es un residuo de aminoácido; y g14 es un residuo de aminoácido o está ausente. h1, h2 y h3, cada uno de ellos independientemente, es un residuo de aminoácido o está ausente; h6 es un residuo hidrófobo; h7 es un residuo hidrófobo; h10 es un residuo hidrófobo ácido o polar; h12, h13 y h14, cada uno de ellos independientemente, es un residuo de aminoácido o está ausente; i1 está ausente o es un residuo de aminoácido; i2 es un residuo hidrófobo neutro; i3 es un residuo de aminoácido; i5, i6, i7 e i8, cada uno de ellos independientemente, es un residuo de aminoácido; i9 es un residuo ácido; i10 es un residuo de aminoácido; i12 e i3, cada uno de ellos independientemente, es un residuo de aminoácido; y i14 es un residuo hidrófobo neutro; L1, L2, L3 y L4 son cada uno de ellos independientemente, enlazadores; y a, b, c, d, e y f son, cada uno de ellos independientemente, 0 o 1, siempre que al menos uno de a o b

   sea 1.

10. 10.

    La composición objeto de la reivindicación 9 de la fórmula P1-(L1)c-P2-(L2)d-V1.

11. 11.

    La composición objeto de la reivindicación 9 de la fórmula V1-(L1)c-P1-(L2)d-P2.

12. 12.

    La composición objeto de la reivindicación 9, donde V1 es un dominio Fc.

13. 13.

    La composición objeto de la reivindicación 9, donde V1 es un dominio Fc de IgG.

14. 14.

    La composición objeto de la reivindicación 9, donde V1 es un dominio Fc de IgGl.

15. 15.

    La composición objeto de la reivindicación 9, donde V1 comprende la secuencia de SEC. ID. N.º: 2.

16. 16.

    La composición objeto de la reivindicación 9, donde: a9 es un residuo básico. b3 es D, QW o E; b6 es W o Y; b11 es K o R; b14 es V o L; c10 es K o R; c13 es I, L o V; y c17 es A o L.

17. 17.

    La composición objeto de la reivindicación 9, donde L2 es mayor que 5 aminoácidos.

18. 18.

    La composición objeto de la reivindicación 17, donde L2 se selecciona de entre GSGSATGGSGSTASSGSGSATx1x2 (SEC. ID. N.º: 193) y GSGSATGGSGSTASSGSGSATx1x2GSGSATGGSGSTASSGSGSATx3x4 (SEC. ID. N.º: 194)

    donde x1 y x3 son, cada uno de ellos independientemente, un residuo básico o hidrófobo y x2 y x4 son, cada uno de ellos independientemente, un residuo hidrófobo.

19. 19.

    La composición objeto de la reivindicación 17, donde L2 se selecciona de entre GSGSATGGSGSTASSGSGSATH (SEC. ID. N.º: 59), GSGSATGGSGSTASSGSGSATGM (SEC. ID. N.º: 190), GSGSATGGSGSTASSGSGSATGS (SEC. ID. N.º: 191), y GSGSATGGSGSTASSGSGSATHMGSGSATGGSGSTASSGSGSATHM (SEC. ID. N.º: 192).

20. 20.

    La composición objeto de la reivindicación 9 que comprende una secuencia seleccionada de la tabla 2 (SEC. ID. N.º: 29-39, 60-70 y 126-188).

21. 21.

    La composición objeto de la reivindicación 9 que comprende una secuencia seleccionada de la tabla 4 (SEC. ID. N.º: 44-55).

22. 22.

    Un ADN que codifica una composición objeto de la reivindicación 9.

23. 23.

    Un vector de expresión que comprende el ADN de la reivindicación 22.

24. 24.

    Una célula hospedadora que comprende el vector de expresión de la reivindicación 23.

25. 25.

    La célula de la reivindicación 24, donde la célula es una célula de E. coli.

26. 26.

    Una composición objeto de cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 8 para el uso en un método de tratamiento de una enfermedad autoinmune mediada por células B, que comprende la administración de dicha composición.

27. 27.

    Una composición objeto de la reivindicación 26 para el uso en un método de tratamiento del lupus, que comprende la administración de dicha composición.

28. 28.

    Una composición objeto de cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 8 para el uso en un método de tratamiento de un cáncer mediado por células B, que comprende la administración de dicha composición.

29. 29.

    Una composición objeto de la reivindicación 28 para el uso en un método de tratamiento de linfoma de células B, que comprende la administración de dicha composición.

    FIG. 1

    FIG. 2

    FIG. 3

    FIG. 4A

    FIG. 4B

    FIG. 4C

    FIG. 4D

    FIG. 4E

    FIG. 4F

    FIG. 5A

    FIG. 5B

    FIG. 5C

    FIG. 5D

    FIG. 5E

    FIG. 5F

    FIG. 5G

    FIG. 5H

    FIG. 5I

    FIG. 5J

    FIG. 5K

    FIG. 5L

    FIG. 6A

    FIG. 6B

    FIG. 7

    226

    FIG. 9

    FIG.10A

    FIG. 10B

    FIG. 11A

    FIG. 11B

    FIG. 12A

    FIG. 12B

    control no tratadoAGP3 (1 mg/kg)

    FIG. 13

    FIG. 16A

    FIG. 16B