CZ390997A3 - Způsob kontroly sialyzace proteinů produkovaných savčími buněčnými kulturami - Google Patents

Způsob kontroly sialyzace proteinů produkovaných savčími buněčnými kulturami Download PDF

Info

Publication number
CZ390997A3
CZ390997A3 CZ973909A CZ390997A CZ390997A3 CZ 390997 A3 CZ390997 A3 CZ 390997A3 CZ 973909 A CZ973909 A CZ 973909A CZ 390997 A CZ390997 A CZ 390997A CZ 390997 A3 CZ390997 A3 CZ 390997A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
cell
tnfr1
igg1
sialic acid
culture
Prior art date
Application number
CZ973909A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ293719B6 (cs
Inventor
Tina Etcheverry
Thomas Ryll
Werner Lesslauer
Thomas Schreitmuller
Wolfgang Richter
Original Assignee
Genentech, Inc.
F. Hoffmann-La Roche Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=23863440&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CZ390997(A3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Genentech, Inc., F. Hoffmann-La Roche Ag filed Critical Genentech, Inc.
Publication of CZ390997A3 publication Critical patent/CZ390997A3/cs
Publication of CZ293719B6 publication Critical patent/CZ293719B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/005—Glycopeptides, glycoproteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • C07K14/7151—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for tumor necrosis factor [TNF], for lymphotoxin [LT]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/36—Lipids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/60—Buffer, e.g. pH regulation, osmotic pressure

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

1 f %
1>V • · ···· ···· ···· ·· · · · φ| ·· ··· φ · · ···· «
Způsob kontroly sialyzace proteinů produkovaných savčími buněčnými kulturami
Oblast techniky
Tento vynález se týká způsobů kontroly obsahu kyseliny sialové v glykoproteinech produkovaných v savčích buněčných » kulturách. Vynález poskytuje postupy pro zvýšení nebo pro snížení obsahu kyseliny sialové v glykoproteinech produkovaných v savčích buněčných kulturách. Vynález se dále týká postupů pro produkci tumor nekrosis faktor receptor (TNFR)-imunoglobulin (Ig) chimér, stejně jako nových TNFRl-IgGi přípravků a jejich použití v diagnostice a v léčbě různých zánětlivých a imunitních onemocnění.
Dosavadní stav techniky
Rozdíly v charakteru glykosylace rekombinantně produkovaných glykoproteinů byly nedávno tématem větší pozornosti vědecké komunity, protože rekombinantní proteiny jsou produkovány pro profylaktické a terapeutické přístupy v klinice. 01igosacharidové postranní řetězce glykoproteinů ovlivňují funkci proteinu (Wittwer A., and Howard. S.C. (1990), Biochem. 29:4175 - 4180) a intramolekulární interakce mezi částmi glykoproteinů, které vedou ke tvrobě a presentují trojrozměrnou povrchovou strukturu glykoproteinů (Hart. (1992) Curr. Op. Cell Biol., 4: 1017 - 1023; Goochee et al., (1991) Bio/Technology, 9: 1347 -1355; Parekh., R. B., (1991) Curr. Op. Struct. Biol., 1: 750 -754). Ol igosacharidy mohou také sloužit pro zaměření daného polypeptidu na jisté struktury založené na specifických buněčných receptorech pro uhlovodany (Belilaqua, Μ. P. and Nelson, R.M. (1993) J. Clin. Tnvest., 91: 379 - 387; Nelson, R.M. et al., (1993), J. Clin. Invest. 91: 1157 - 1166; Norgard,
I 2 • ♦ · ♦ · « • · · · ♦ • · ·· · · ι • · · · ···· ·· ·« K.E. et al., (1993) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 90: 1068 - 1072; Imai, Y. et al., (1993) Nátuře 361: 555 - 557). Terminální složka kyseliny sialové oligosacharidového postranního řetězce glykoproteinu ovlivňuje absorpci, sérový poločas, a clearens ze séra, stejně jako fyzikální, chemické a imunogenní vlastnosti glykoproteinu (Parekh, R.B. supra; Varki, A. (1993) Glycobiology 3: 97 - 100; Paulson J. (1989), TIBS. 14: 272 - 276; Goochee et al., (1991), Biotechnology 9: 1347 - 1355; Kobata, A., (1992) Eur. J. Biochem. 209: 483 - 501). Je proto významné udržovat obsah kyseliny sialové v glykoproteinech, zejména v těch proteinech, které jsou zamýšleny pro použití jako léčiva.
Velká pozornost byla věnována faktorům, které ovlivňují glykosylaci v průběhu produkce rekombinantních proteinů, jako je způsob růstu (adherentní nebo suspensní), fetální hovězí sérum ve formulaci, kultivační hustota, oxygenace, pH, purifikační schémata a podobně (Werner, R. and Noe, W. (1993), Drug Ees. 43: 1134 - 1249; Hayter et al., (1992) Biotech. and Bioeng. 39: 327 - 335; Borys et al., (1994) Biotech. and Bioeng., 43: 505 - 514; Borys et al., (1993) Bio/technology 11: 720 - 724; Hearing et al., (1989) J. Cell. Biol. 108: 339 - 353; Goochee et al., ve Frontiers in Bioprocessing II, Todd et al., eds. (1992) American Chemical Society str. 199 - 240; U.S. patent č. 5096816; Chotigeat W., (1994) Cytotech. 15: 217 - 221). Několik skupin studovalo parametry postupů, které souvisejí s produkcí rekombinantních proteinů a zejména účinek složení media v produkci rekombinantních proteinů (Park et al., (1992) Biotech. Bioeng. 40: 686 - 696; Cox and McClure, (1983) In Vitro, 19: 1 -6; Mizutani et al., (1992) Biochem. Biophys. Ees. Comm. 187: 664 - 669; Le Gros et al., (1985) Lymph. Res. 4(3): 221 - 227).
0 přidání alkanových kyselin jako je kyselina máslená je známo, že způsobuje transientní expresi cizorodé DNA i 3 • · · · v rekombinantní buněčné kultuře (Prasad and Sinha (1976) In Vitro 12: 125 - 132; japonská patentová přihláška č. 62-18935; Japonská patentová přihláška č. 55-150440; Rlehr et al., (1992) Biochem. 31: 3222 - 3229; Gorman a Hovard (1983) Nucleic Acids Res. 11: 7631 - 7648). Nicméně, butyrát sodný má rozsah účinků na genovou expresi u mnoha buněčných linií a složení medií (D'Anna et al., (1980) Biochem. 19: 2656 - 2671; Hogopian H.K. (1977) Cell 12: 855 - 860) a na produkci proteinu (Milhaud (1980) J. Cell Physiol. 104: 163 - 170; U.K. patentová přihláška č. GB 2 122 207 A) což naznačuje, že butyrát může modifikovat genovou expresi (Yuan et al., (1985) J. Biol. Chem. 3778 - 3783) nebo inhibovat expresi jistých genů (Yuan et al., supra) .
Evropský patent č. 0239292 B1 popisuje postup pro zvýšení Produkce proteinu za přítomnosti alkanových kyselin nebo jejich solí, jako je kyselina máselná. Publikace, nicméně, poskytuje nedostatečný návod v selekci vhodných koncentrací aditiv a dále se netýká účinků aditiv na glykosylaci proteinů. Jiní popsali, že přidání nízkých hladin (0 - 1,5 mM) butyrátu sodného do Produkčního media buněčné kultury pro zvýšení specifické Produktivity buněk vede ke konkomitantnímu zvýšení kyselých glykoforem (korespondujících zvýšenému obsahu kyseliny sialové) Produkovaných rekombinantních glykoproteinů (Chotigeat et al., (1994) Cytotech., 15: 217 - 221). Několik skupin studovalo účinky osmolality na růst buněk a na Produkci polypeptidů (Ozturk and Palsson (1991) Biotech. and Bioeng. 37: 989 - 993; Stubblefield et al., (1960) Cancer Research 20: 1646 - 1655; Garcia-Perez et al., (1989) Journal of Biological Chemistry. 264: 16815 - 16821; Miner et al., (1981) Invasion Metastasis. 1: 158 - 174; GB 2.251.249; EP 481.791; U.S: patent č. 5.151.359; U.S. patent č. 5.151.359; U.S. patent i 4
č. 4.724.206; U.S. patent č. 5.122.469; a WO 89/04867). Byly navrženy různé rozsahy osmolality pro růst buněk nebo pro produkci polypeptidů. Obecně, osmolalita buněčného kultivačního media je zvýšena cestou přidání NaCl nebo aminokyselin. Stresy z prostředí, jako je zvýšená koncentrace solí, vedou, v některých případech, ke zvýšené produkci buněčného produktu. Bylo popsáno, že zvýšená exprese savčích proteinových produktů může být dosažena v savčích buněčných kulturách pomocí stresu vycházejícíčího z roztoku, jako je např. přidání soli, kyseliny mléčné, amoniaku do kultivačního media (Mezinárodní přihláška č. WO 89/04867). Tyto stresy obecně inhibují růst, ale napomáhají specifické produktivitě buněk.
Jiní diskutovali účinek koncentrace glukosy na buněčný růst a/nebo produkci polypeptidů v rekombinantní buněčné kultuře. Viz např. Park et al., (1992) Biotechnology and Bioengineering, 40: 686 - 696; Huang et al., (1991) Journal of Biotechnology, 18: 161 - 162; EP 387,840; Keuveny et al., (1986) Journal of Immunolog i ca 1 Methods, 86: 53 - 59; Fine et al., (1976) In Vitro, 12(10): 693 - 701; Dircks et al., (1987) Exp. Eye Res., 44: 951 - 958; Mizutani et al., (1992) Biochemical and Biophysical Research Communications, 187(2): 664 - 669; Sugiura (1992) Biotechnology and Bioengineering, 39: 953 - 959; WO 88/01643; Graf et al., (1989) DECHEMA Biotechnol. Conf., 3: 615 - 618; japonská patentová přihláška č. JP 1-101882; U.S: patent č. 3.926.723; WO 87/00195; a Fleischaker, Jr., Ph.D. Thesis, Massachusetts Institute of Technology, str. 196 - 229 (6/1982). Nicméně, předchozí studie nestudovaly účinek různých parametrů procesu na obsah kyseliny sialové ve zralém proteinu, což je faktor v produkci glykoproteinů, který je rozhodující pro klinický úspěch. Předkládaný vynález poskytuje proces pro kontrolu obsahu i t 5 i t 5 ··· · *.·
·· ·· kyseliny sialové v glykoproteinech produkovaných savčí buněčnou kulturou.
Podstata vynálezu
Vynálezci tohoto vynálezu objevili, že jisté parametry kultivace savčích buněk ovlivňují specifickou produktivitu buněk, stejně jako rozsah a typ glykosylace produkovaných proteinu. Přesněji, vynálezci zjistili, že jisté faktory, které zvyšují specifickou produktivitu buněk, mají inversní účinek na obsah kyseliny sialové v produkovaných proteinech. Vynálezci proto vymysleli různé procesy pro kultivaci buněk pro obohacení jednotlivých glykoforem glykoproteinů produkovaných v savčí buněčné kultuře. V souladu s tím poskytuje vynález postup pro kontrolu obsahu kyseliny sialové v glykoproteinech produkovaných savčí buněčnou kulturou. Podle tohoto aspektu vynálezu vedou odlišnosti ve stupni produkce glykoproteinů v produkční fázi buněčné kultury k odlišnostem v obsahu kyseliny sialové ve zralém glykoproteinů. Přesněji, zvýšení specifické buněčné produktivity v průběhu produkční fáze glykoproteinů vede ke snížení obsahu kyseliny sialové ve zralém proteinu. Naopak, snížení specifické buněčné produktivity vede ke zvýšení obsahu kyseliny sialové ve zralém proteinu. Předkládaný vynález poskytuje, v jednotlivém provedení, lišící se specifickou buněčnou produktivitu savčí hostitelské buňky v průběhu proteinové produkční fáze savčí buněčné kultury kontrolováním faktorů, které ovlivňují specifickou produktivitu buněk. Podle jednoho aspektu vynálezu jsou kontrolovány koncentrace faktorů, které zvyšují transkripci DNA. V jiném provedení je specifická buněčná produktivita kontrolována ( 6 • · · · · I · ···· «··♦« ·# · ··«· • ·· · ♦ · · · · ···· « ♦ · · · · · · · · « ·· ·· ·· Μ·· «· ·« udržováním osmolality buněčné kultury v jistých mezích. Podle vynálezu jsou jakékoliv z výše uvedených faktorů kontrolovány, samotné nebo v kombinaci, pro ovlivnění obsahu kyseliny sialové ve zralém glykoproteinu. V jednotlivém provedení předkládaného vynálezu je faktorem, který zvyšuje DNA transkripci alkanová kyselina nebo její sůl jako je butyrát sodný v koncentraci od asi 0,1 mM do asi 20 mM. Podle druhého aspektu vynálezu je osmolalita buněčné kultury udržována mezi asi 250 - 600 mOsm. V ještě dalším aspektu je teplota buněčné kultury kontrolována mezi asi 30 °C a 37 °C. V preferovaném provedení poskytuje vynález proces pro zvýšení obsahu kyseliny sialové ve zralém glykoproteinu produkovaném savčí buněčnou kulturou, kde tento proces obsahuje udržování nízké specifické produktivity buněk kontrolováním jakéhokoliv nebo všech z výše identifikovaných parametrů procesu, volitelně spolu s jinými parametry, které jsou v oboru známé. Podle tohoto aspektu předkládaného vynálezu produkuje kultivování hostitelské buňky v koncentraci alkanové kyseliny nebo její soli asi 0,1 mM až asi 6 mM, a volitelně spolu s udržováním osmolality buněčné kultury okolo 300 - 450 mOsm produkuje protein se zvýšeným obsahem kyseliny sialové. V dalším preferovaném provedení poskytuje vynález proces pro snížení obsahu kyseliny sialové ve zralém glykoproteinu produkovaném savčí buněčnou kulturou, kde tento proces obsahuje zvýšení specifické produktivity buněčné kultury. Specifická produktivita buněk je zvýšena, v preferovaném provedení, poskytnutím procesu kultivace buněk, který obsahuje cokoliv z: kultivování hostitelské buňky v koncentraci alkanové kyseliny nebo její soli okolo 6 mM až asi 12 mM; a udržování osmolality buněčné kultury okolo 450 - 600 mOsm. 7 7 • · · • · · · ···· * · · · · · · * * · · ···· « • · · · · · • · « · · · · · o
Vynález dále poskytuje, v jednotlivém provedení, proces kultivace buněk se třemi fázemi buněčné kultury. Vynález proto poskytuje proces pro kontrolu obsahu kyseliny sialové v glykoproteinu produkovaném savčí buněčnou kulturou, který obsahuje kroky kultivování hostitelské buňky, která exprivuje protein v růstové fázi po takovou dobu a za takových podmínek, které maximalizují buněčný růst. Podle tohoto aspektu předkládaného vynálezu je růstová fáze následována přechodnou fází, ve které jsou parametry kultivace buněk pro požadovaný obsah kyseliny sialové ve zralém glykoproteinu vybrány a zjištěny. Přechodná fáze je následována produkční fází buněčné kultury, ve které jsou udržovány parametry vybrané v přechodné fázi a glykoproteinový produkt je produkován a získáván. Odlišnosti ve specifické produktivitě buněk v produkční fázi způsobené přidáním alkanové kyseliny nebo její soli do buněčné kultury v koncentraci okolo 0,1 mM až okolo 20 mM a zachovávání osmolality buněčné kultury okolo asi 250 a 600 mOsm, volitelně v kombinaci jeden s druhým, v přechodné fázi produkuje proteiny s různým množstvím kyseliny sialové. V dalším preferovaném provedení poskytuje předkládaný vynález způsob kontroly množství kyseliny sialové přítomné v solubilním typ 1 receptoru pro tumor nekrosis faktor (TNFP-1)-imunoglobul in G (IgGi) chimérickém proteinu. Vynálezci předkládaného vynálezu objevili, že, za určitých podmínek produkce, mohou být získány přípravky TNFRl-IgGi glykoformy, které vykazují požadované vlastnosti prodloužené clearens z krve a zachovávají si signifikantní funkční aktivitu. Dlouhý funkční poločas umožňuje zjednodušené, bolusové podávání a uděluje in vivo potenciál produkovanému glykoproteinu, což umožňuje nižší dávkové formy glykoproteinu.
Podle tohoto aspektu vynálezu je produkována TNFRl-IgGi glykoproteinová molekula, která obsahuje více zbytků kyseliny 8 • · · « · • · sialové. Parametry buněčné kultury pro produkční fázi TNFRl~IgQ jsou vybrány tak, aby byl získán požadovaný obsah kyseliny sialové. V preferovaném provedení je butyrát sodný přítomen v produkční fázi v koncentraci od asi 0,1 do asi 6 mM a osmolalí* °* i ta je udržována asi okolo 300 - 500 mOsm. Ve více preferovaném aspektu je koncentrace butyrátu sodného okolo 1 mM a osmolalita je udržována okolo 350 - 400 mOsm. V ještě jiném provedení poskytuje předkládaný vynález přípravu TNFRl-IgGi glykoproteinu produkovaného procesem podle předkládaného vynálezu. Podle tohoto aspektu vynálezu je poskytnut přípravek, který obsahuje TNFRl-IgGi, kde je rozmezí pí přípravku okolo asi 5,5 a 7,5. Dále je poskytnut TNFRl-IgGi přípravek, který má molární poměr kyseliny sialové ku proteinu od asi 4 do asi 7 a zejména od asi 5 do asi 6. V ještě jiném aspektu má TNFRl-IgGi přípravek od asi 1 do asi 2 molů odhalených N-acetylglukosaminových zbytků na mol proteinu. V ještě dalším aspektu má přípravek molární poměr kyseliny sialové k N-acetylglukosaminu od asi 0,35 do asi 0,5 a lépe okolo 0,4 až 0,45. předkládaný vynález také poskytuje terapeutické kompozice obsahující výše uvedené přípravky použitelné v léčbě TNF-zProstředkovaných patologických stavů.
Popis, obrázků na Připojených výkresech
Obrázek 1A a Obrázek 1B: Obrázky 1A a 1B ukazují metodu použitou pro počítání specifické produktivity typického procesu kultivace buněk v produkční fázi. Specifická produktivita může být vyjádřena jako funkce počtu živých buněk (dnů živých buněk) jak je ukázáno na obrázku 1A; nebo jako souhrny objem buněk (PCV) Jak ie ukázáno na obrázku 1B. Stupeň specifické produkce f 1 9 «·· · · · ♦ ··#· « # · ·· · · · « ··· • ·· ♦ · · · · · ·Μ « · «· ι· ·· ···· ·» «· je dán v rozsahu pro 90% interval spolehlivosti.
Obrázek 2A a Obrázek 2B: Obrázky 2A a 2B ukazují korelaci mezi specifickou produktivitou na základě dnů živých buněk (obrázek 2A) souhrným objemem buněk (PCV) (obrázek 2B) během produkční fáze a obsahem kyseliny sialové (NANA) získaného produktu. Jsou ukázány hodnoty pro 9 různých procesů (A—I). Data representují nezávislé procesy produkce jak jsou popsány v Tabulce 1. I. Definice
Uhlovodanové skupiny podle předkládaného vynálezu budou popsány s ohledem na běžně používanou nomenklaturu pro popis oligosacharidů. Přehled uhlovodanové chemie, který používá tuto nomenklaturu, je možné nalézt v Hubbard a Ivatt (1981) Ann.
Rev. Biochem. 50: 555 - 583. Tato nomenklatura zahrnuje například Man, což representuje mannosu, GlcNAc, což representuje 2-N-acety1glukosamin; Gal, což representuje galaktosu; a Glc, což representuje glukosu. Kyseliny sialové jsou popsány s odkazem na zkratky NeuNAc pro 5-N-acetylneuraminovou kyselinu a NeuNGc pro 5-glyconyIneuraminovou kyselinu (J. Biol. Chem., 1982, 257: 3347; J. Biol. Chem., 1982, 257: 3352). "Osmolali ta" je změřený osmotický tlak roztoku rozpuštěných částic ve vodném roztoku. Rozpuštěné částice zahrnují jak ionty, tak neionizované molekuly. Osmolalita je vyjádřena jako koncentrace osmotický aktivních částic (t.j. osmolů) rozpuštěných v 1 kg roztoku (1 mOsm/kg H20 při 38 °C je ekvivalentní osmotickému tlaku 19 mm Hg). "Osmolari ta" oproti tomu, označuje počet rozpuštěných částic v 1 litru roztoku. 10
• · · ··· ··· *· · · ·· «··· |« « ·
Pokud je zde použito, znamená zkratka "mOsm" "mi 1iosmoly/kg roztoku".
Jak je zde použito, označuje "glykoprotein" obecně peptidy a proteiny mající více než asi 10 aminokyselin a alespoň jeden postraní polysacharidový řetězec. Glykoproteiny mohou být homologní pro hostitelskou buňku, nebo preferovaně mohou být heterologní, t.j. cizorodé, pro hostitelskou buňku, kterou jsou využívány, jako je například lidský protein využívaný ovariálními buňkami čínského křečka. Preferovaně, jsou použity savčí glykoproteiny (glykoproteiny, které jsou původně odvozeny od savčího organismu), a lépe ty, které jsou přímo secernovány do media. Příklady savčích glykoproteinů zahrnují molekuly jako jsou cytokiny a jejich receptory, včetně, například, tumor nekrosis faktoru alfa a beta, jejich receptorů (TNFR-1; EP 417.563 publikovaná 20.3.1991; a TNFR-2, EP 417.014 publikovaná 20.3.1991) a jejich deriváty; renin; růstový hormon, včetně lidského růstového hormonu a hovězího růstového hormonu; růstový hormon uvolňující faktor; paratyreoidální hormon; hormon stimulující štítnou žlázu; 1 ipoproteiny; alfa-1-antitrypsin; A-řetězec insulinu, B-řetězec inzulínu; proinzulin; folikulární stimulační hormon; kalcitonin; luteinizační hormon; glukagon; srážlivé faktory jako je faktor VIIIC, faktor IX, tkáňový faktor a von Willebrandúv faktor; protisráž1ivé faktory jako je Protein C; atriální natriuretický faktor; plicní surfaktant; aktivátor plasminogenu, jako je urokinasa nebo lidský močový nebo tkáňový typ plasminogenového aktivátoru (t-PA); bombesin; trombin; hematopoetický růstový faktor; enkefalinasa; PANTES (regulovaný na aktivaci normálních T buněk exprivovaných a secernovaných); lidský makrofágový zánětlivý protein (MIP-1-alfa); sérový albumin jako je lidský sérový albumin; mu 1erian-inhibiční substance; A-řetězec relaxinu; B-řetězec relaxinu; prorelaxin; myší gonadotropin asociovaný peptid; mikrobiální protein, jako 11 ♦ · · · · · · • · ·«* · » * • ·· ··· · · • · · · · · · Μ ·* «· ···· je beta-laktamasa; DNasa; inhibin; aktivin; vaskulární endoteliální růstový faktor (VEGF); receptory pro hormony a růstové faktory; integrin; protein A nebo D; revmatoidní faktory; neurotrofní faktory jako je od kostí odvozený neurotrofní faktor (BDNF), neurotrofiny-3, -4, -5 nebo -6 (NT-3, NT-4, NT-5, nebo NT-6), nebo nervové růstové faktory jako je NGF-β; od destiček odvozený růstový faktor (PDGF); fibroblastový růstový faktor jako je aFGF a bFGF; epidermální růstový faktor (EGF); transformační růstový faktor (TGF) jako je TGF-α a TGF-β> včetně TGF-β1, TGF-02, TGF-03, TGF-04 nebo TGF-05; insulinu podobný růstový faktor-I a -II (IGF-I a IGF-II); des(1-3)-IGF-I (mozkový IGF-I), vazebné proteiny pro insulinu podobný růstový faktor; CD proteiny jako je CD-3, CD-4, CD-8 a CD-19; erythropoetin; osteoinduktivní faktory; imunotoxiny; kostní morfogenetický protein (BMP; interferon jako je interferon-alfa, -beta, a -gamma; kolonie stimulující faktory (CSFs). např. M-CSF, GM-CSF, a G-CSF; interleukiny (IL) např. IL-1 až IL-10; superoxid dismutasa; receptory T buněk; povrchové membránové proteiny; hnilobu akcelerující faktor; virové antigeny jako je například část AIDS obalu; transportní proteiny; "homing" receptory; adresiny; regulační proteiny; protilátky; chimérické proteiny, jako jsou imunoadhesiny; a fragmenty kteréhokoliv z výše uvedených polypeptidů.
Termíny "buněčné kultivační medium" a "kultivační medium" označují živný roztok použitý pro kultivaci savčích buněk, který typicky poskytuje alespoň jednu složku z jedné nebo více z následujících kategorií: 1) zdroj energie, obvykle ve formě uhlovodanu jako je glukosa; 2) všechny esenciální aminokyseliny, a obvykle sadu 12 12 • · · 0 · ·«·
• · · · · ·· · základních aminokyselin plus cystein; 3) vitaminy a/nebo jiné organické sloučeniny vyžadované v nízkých koncentracích; 4) volné mastné kyseliny; a 5) stopové prvky, kde stopové prvky jsou definovány jako anorganické sloučeniny nebo přirozeně se vyskytující prvky, které jsou typicky vyžadovány ve velmi nízkých koncentracích, obvykle v rozsahu mikromolú. Živný roztok muže být volitelně doplněn jednou nebo více složkami z kterékoliv z následujících kategorií; 1) hormony a růstové faktory jako je, například, insulin, transferin, a epidermální růstový faktor; 2) soli a pufry jako je, například, vápník, hořčík a fosfor; 3) nukleosidy a base, jako je například adenosin, thymidin a hypoxantin; a 4) proteiny a tkáňové hydrolyzáty.
Termíny "savčí hostitelská buňka", "hostitelská buňka", "savčí buňka" a podobně označují buněčné linie odvozené od savců, které jsou schopné růstu a přežívání, pokud jsou umístěny bud v monovrstevné kultuře, nebo v suspensní kultuře v mediu obsahujícím vhodné živiny a růstové faktory. Nezbytné růstové faktory pro určitou buněčnou linii je možné snadno určit empiricky bez zbytečného experimentování, jak je popsáno například v Mammalian Cell Culture (Mather, J.P. ed. Plenům 13 • ·
• IM
Press, N.Y. (1984)), a Barnes a Sáto (1980) Cell., 22: 649. Typicky jsou buňky schopné exprese a secernování velkých množství určitého požadovaného glykoproteinu do kultivačního media. Příklady vhodných savčích hostitelských buněk v kontextu předkládaného vynálezu mohou zahrnovat ovariální buňky čínského křečka(-DHFR (CHO, Urlaub a Chasin, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 77: 4216 (1980)); dpl2.CHO buňky (EP 307.247 publikovaná 15.3.1989); CV1 linie opičích ledvin transformovaná SV40 (COS-7, ATCC CEL 1651); lidská embryonální ledvinná linie (293 nebo 293 buňky subklonované pro růst v suspensní kultuře, Graham et al., J. Gen Virol., 36: 59 (1977); ledvinné buňky křeččích mlácfat (BHK, ATCC CCL 10); myší sertoliho buňky (TM4, Mather. Biol. Reprod., 23: 243 - 251 (1980)); opičí ledvině buňky (CV1 ATCC CCL 70); ledvinné buňky africké zelené opice (VERO-76, ATCC CRL 1587); lidské cervikální karcinomové buňky (HELA, ATCC CCL 2); psí ledvinné buňky (MDCK, ATCC CCL 34); jaterní buňky buffalo krysy (BRL 3A, ATCC CRL 1442); lidské plicní buňky (W138, ATCC CCL 75); lidské jaterní buňky (Hep G2, HB 8065); myší prsní tumor (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI buňky (Mather et al., Annals N.Y. Acad Sci. 383: 44 - 68 (1982)); MRC 5 buňky; FS4 buňky a lidská hepatomová linie (Hep G2).
Preferované hostitelské buňky zahrnují ovariální buňky čínského křečka (-DHFR (CHO Urlaub and Chasin, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 77: 4216 (1980)); dpl2.CHO buňky (EP 307.247 publikovaná 15.3.1989).
Termín "pepton" v kontextu předkládaného vynálezu označuje doplněk media, kterým je esenciálně hydrolyzovaný zvířecí protein. Zdrojem tohoto proteinu mohou být zvířecí produkty z jatek, purifikovaná želatina, nebo to muže být rostliný materiál. Protein je typicky hydrolyzován za použití kyseliny, tepla nebo různých enzymových přípravků. Preferovanými
• · ···· ·· Μ • · · • · · · · • · · · • · · · peptonovými směsemi jsou například "Primatone RL" a "Primatone HS", které jsou obě komerčně dostupné (Sheffield, England). "Buněčná specifická produktivita" nebo "buněčný specifický stupeň" a podobně jak jsou zde použity označují specifický stupeň exprese produktu měřený na buňku, nebo na buněčnou masu nebo objem. Buněčná specifická produktivita je měřena například v gramech proteinu produkovaných na buňku na den. Buněčná specifická produktivita může být vhodně měřena podle integrální metody: dP/dt = qPX nebo P = qP == Xdt kde qP je konstanta buněčné specifické produktivity, X je počet buněk nebo objem buněk, nebo ekvivalenty hmoty buněk a dP/dt je stupeň produkce proteinu. Proto, qP může být získáno z grafu koncentrace produktu versus časový integrál přežívajících buněk ( == Xdt "přežívajících buněk dní"). Podle tohoto vzorce, pokud je množství produkovaného glykoproteinového produktu vyneseno proti přežívajícím buňkám dním, pak je sklon ekvivalentní k buněčnému specifickému stupni.Přežívající buňky mohou být měřeny několika měřeními, například, biomasy, stupněm vychytávání O2, laktát dehydrogenasou (LDH), celkovým objemem buněk nebo zákalem. "Růstová fáze" buněčné kultury označuje periodu exponenciálního buněčného růstu (log fázi), ve které se buňky obecně rychle dělí. Během této fáze jsou buňky kultivovány po časovou periodu, obvykle mezi 1 - 4 dny, a za takových podmínek, že je buněčný růst maximalizován. Určení růstového cyklu pro vybranou hostitelskou buňku může být určeno bez zbytečného 15 • · · ···· ···· • · · · · · · · · ··· * · · · · · · · · · · · « « • · · · · · · · « β ·♦ *· Μ ··*· Φ· experimentování. "Časová perioda a takové podmínky, za kterých je buněčný růst maximalizován" a podobně označují takové kultivační podmínky, které jsou pro určitou buněčnou linii určeny jako optimální pro buněčný růst a dělení. Během růstové fáze jsou buňky kultivovány v živném mediu obsahujícím nezbytná aditiva obecně při 30 - 40 °C, ve zvlhčené, kontrolované atmosféře, takže je dosažen optimální růst pro určitou buněčnou linii. Buňky jsou udržovány v růstové fázi po dobu okolo jednoho a čtyř dní, obvykle mezi dvěma a třemi dny. "Přechodná fáze" buněčné kultury označuje časovou periodu, během které jsou zadány kultivační podmínky pro produkční fázi. Během přechodné fáze jsou faktory prostředí jako je teplota buněčné kultury, osmolalita media a podobně posunuty z růstových podmínek na produkční podmínky. "Produkční fáze" buněčné kultury označuje časovou periodu, během které je buněčný růst ve fázi plató. Během produkční fáze je logaritmický buněčný růst ukončen a primární je produkce proteinu. Během této časové periody je medium obecně doplňováno pro podporu trvalé produkce proteinu a pro dosažení požadovaného glykoproteinového produktu.
Termín "exprese" jak je zde použit označuje transkripci a translaci vyskytující se v hostitelské buňce. Hladina exprese genového produktu v hostitelských buňkách může být určena bud na základě korespondující mRNA, která je přítomna v buňce, nebo na základě množství proteinu kódovaného genovým produktem, který je produkován buňkou. Například, mRNA mRNA transkribovaná z genu pro produkt je vhodně kvantifikována northern hybridizací. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, str. 7.3. - 7.57 (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Protein kódovaný genem pro produkt může být vhodně kvantifikován bud 16 16 • · · · • · ··· · • · · · · · • · · · · ·* ·· • · · · · · • · · ·· • · · · · · · • · · · ···· ·· ·· testování na biologickou aktivitu proteinu, nebo za použiti testů, které jsou nezávislé na takové aktivitě, jako je western blotting nebo radioimunotest za použití protilátek, které jsou schopné reagovat s proteinem. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, str. 18.1 - 18.88 (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).
Alkanová kyselina nebo její solí je míněn přímý nebo větvený řetězec, saturovaný nebo nesaturovaný, alkanová kyselina nebo její soli. Alkanová kyselina má obecně od jednoho do deseti atomů uhlíku a lépe má tři až šest atomů uhlíku. Příkladem alkanová kyseliny je kyselina máselná a její korespondující solí je butyrát sodný. II. Postupy kultivace buněk
Vynálezci tohoto vynálezu zjistili, že faktory, které zvyšují buněčnou specifickou produktivitu v průběhu produkce glykoproteinu produkovaného kulturou savčích buněk mají opačný účinek na obsah kyseliny sialové v produkovaném glykoproteinu. Protože proteiny exprivující jeden nebo více residuí kyseliny sialové na komplex oligosacharidové struktury mají delší clearens stupeň in vivo, může být clearens produkovaného glykoproteinu být manipulována v širších limitech prostřednictvím celkového stupně sialyzace přípravku. Předkládaný vynález poskytuje procesy pro kontrolu rozsahu sialyzace glykoproteinu produkovaného kulturou savčích buněk. Podle metodologie, která je zde daná, je možné určit přesné parametry procesu, které poskytují požadovaný obsah kyseliny sialové v glykoproteinu produkovaném kulturou savčích buněk.
Podle předkládaného vynálezu je savčí hostitelská buňka kultivována pro produkci získatelného g1ykoprotei nového 17 • ·· · » ·· · ·· · · · ι · ·· • · · · · · ··· · · • · · · · · · *· ·· ·*·· |« produktu. Celkový obsah kyseliny sialové v glykoproteinu je kontrolován kontrolováním parametrů buněčné kultury, které ovlivňují buněčnou specifickou produktivitu. Faktory, které ovlivňují buněčnou specifickou produktivitu jsou v oboru dobře známy a zahrnují, ale nejsou omezeny na, faktory, které ovlivňují DNA/RNA počet kopií, faktory, které ovlivňují RNA, jako jsou faktory, které stabilizují RNA, živná media a jiné doplňkové látky, koncentrace enhancerú transkripce, osmolalita kultivačního prostředí, teplota a pH buněčné kultury a podobně. Podle předkládaného vynálezu úprava těchto faktorů, spolu nebo v kombinaci, ke zvýšení buněčné specifické produktivity generuje protein se sníženým obsahem kyseliny sialové. Úprava těchto faktorů, spolu nebo v kombinaci, ke snížení buněčné specifické produktivity generuje protein se zvýšeným obsahem kyseliny sialové.
Vynález bude nyní popsán s ohledem na různé, včetně dobře známých, techniky a principy kultivace buněk.
Podle předkládaného vynálezu jsou savčí buňky kultivovány pro produkci požadovaného glykoproteinového produktu. Při vybírání hostitelské buňky pro produkci glykoproteinu v kontextu předkládaného vynálezu je důležité rozpoznat ty hostitelské buňky, které mají charakteristické a specifické mechanismy pro translaci a post-trans1ační zpracování a modifikaci (např. glykosylaci, štěpení) exprivovaného proteinu. Vhodné buněčné linie by měly být vybrány tak, aby bylo zajištěno, že požadované post-translační modifikace jsou možné. Alternativně může být hostitelská buňka modifikována tak, aby exprivovala požadovaný genový produkt nutný pro specifické post —trans lační modifikace.
Jednotlivě, savci buňka, která exprivuje požadovaný protein by měla exprivovat, nebo by měla být manipulována tak, aby exprivovala, určité enzymy, takže za vhodných podmínek, které 18 ·· ··
jsou zde popsány, se vhodné post-translační modifikace vyskytují in vivo. Enzymy zahrnují ty enzymy, které jsou nezbytné Pro adici a kompletaci N- a 0- vázaných uhlovodanů jako jsou ty, které jsou popsány v Hubbard a Ivan supra pro N-vázané oligosacharidy. Tyto enzymy volitelně zahrnují oligosacharyltransferasu, alfa-gluykosidasu 1, alfa- glukosidasu II, ER alfa(l,2) manosidasu, Golgiho alfa manodasu I, N— acetylglukosaminy1transferasu I, Golgiho alfa-manodasu II» N-acetylglukosaminyltransferasu II, alfa(1,6)fukosyltransferasu a 3(1,4)galaktosyltransferasu. Kromě toho, hostitelská buňka exprivuje vhodnou sialyl trasferasu, o které se očekává, že připojuje terminální sialovou kyselinu ve vhodné, pozici a je vázána jako část genomu hostitele. Volitelně může být hostitel upraven tak, aby exprivoval vhodné sialyl transferasy, například, transfekcí hostitelské buňky DNA kódující sialyl t rasf erasu. U sialyl transferas popsaných výše je očekáváno, že přidávají terminální residuum kyseliny sialové na vhodný oligosacharid jáderné struktury jako je Gal31-4GlcNAc. Vhodné sialyl transferasy v kontextu předkládaného vynálezu zahrnují, ale nejsou omezeny na, ty sialyl transferasy, které katalyzují komplexní sialyzaci a větvení N- a 0- vázaných oligosacharidů.
Pro kultivování savčích buněk exprivujících požadovaný protein a schopných přidání požadovaných uhlovodanů ve specifické pozici a vazbě může být použito mnoha kultivačních podmínek s ohledem na kultivovanou hostitelskou buňku. Vhodné kultivační podmínky jsou dobře známy v oboru (J. Immunol.
Methods (1983) 56: 221 - 234) nebo mohou být odborníkem snadno určeny (viz například Animal Cell Culture: A Practical Approach 2. vydání, Rickwood, D a Hames, B.D. vyd. Oxford University Press, New York, (1992)), a liší se podle jednotlivé vybrané
• · · · • · · · • · · · · • · · *· ·· hostitelské buňky.
Savčí buněčná kultura podle předkládaného vynálezu je připravena v mediu, které je vhodné pro jednotlivou kultivovanou buňku. Komerčně dostupná media jako je Ham'F10 (Sigma),
Minimální Esenciální medium ((MEM) Sigma), RPMI-1640 (Sigma) a Dulbecovo modifikované Eaglovo medium ((DMEM) Sigma) jsou příklady živných roztoků. Kromě toho, jakékoliv medium popsané v Ham and Wallace, (1979), Meth. Enz. 58:44; Barnes and Sáto, (1980) Anal. Biochem., 102: 255; U.S. patenty č. 4.767.704; 4.657.866; 4.927.762; 5.122.469 nebo 4.560.655; mezinárodní přihlášky č. WO 90/03430 a WO 87/00195; jejich objevy jsou zde uvedeny jako odkazy, mohou být použity jako kultivační media. Jakékoliv z těchto medií může být doplněno podle potřeby hormony a/nebo jinými růstovými faktory (jako je inzulín, transferin nebo epidermální růstový faktor), solemi (jako je chlorid sodný, vápník, hořčík a fosfor), pufry (jako je HEPES), nukleosidy (jako je adenosin a thymidin), antibiotiky (jako je Gentamycin™), stopovými prvky (definovanými jako anorganické sloučeniny obvykle přítomné v konečných koncentracích v řádu mikromolú), lipidy (jako je kyselina linoleová nebo jiné mastné kyseliny) a jejich vhodnými nosiči, a glukosou nebo ekvivalentním zdrojem energie. Jakékoliv jiné nezbytné doplňky mohou být také zahrnuty ve vhodných koncentracích, které jsou odborníkům známy. V jednotlivém provedení je savčí hostitelskou buňkou CHO buňka, preferovaně dpl2.CHO buňka a vhodné medium obsahuje základní složku media jako je na DMEM/HAM F-12 založená formulace (pro složení DMEM a HAM F12 media viz formulace kultivačních medií v American Type Culture Collection Catalogue of CE11 Lines and Hybridomas, 6. vydání, 1988, str. 346 - 349) (formulace media popsané v U.S. patentu 5.122.469 jsou zejména 20
·· Μ • · · · • · «I • * · « « vhodné) s modifikovanými koncentracemi určitých složek jako jsou aminokyseliny, soli, cukry a vitamíny a volitelně obsahující glycin, hypoxantin a thymidin; rekombinantní lidský insulin, hydrolyzovaný pepton, jako je Primetone HS nebo Primatone RL (Sheffield, England), nebo jeho ekvivalent; buněčné ochranné agens jako je Pluronic F68 nebo ekvivalentní pluronický polyol; a stopové prvky.
Glykoproteiny podle předkládaného vynálezu mohou být produkovány kultivováním buněk, které exprivují požadovaný protein za různých kultivačních podmínek. Například, postupy kultivace buněk pro velké nebo pro malé rozsahy produkce proteinů jsou potenciálně užitečné v kontextu předkládaného vynálezu. Postupy zahrnují, ale nejsou omezeny na, bioreaktor, s fluidním ložem, bioreaktor s děrovanými vlákny, kulturu v otáčející se nádobě nebo míchací tankové bioreaktorové systémy a mohou být použity, v posledních dvou systémech, s nebo bez mikronosičů, a mohou operovat alternativně ve vsádkovém, napájeném-vsádkovém nebo kontinuálním způsobu. V preferovaném provedení je buněčná kultura podle předkládaného vynálezu provedena v míchacím tankovém bioreaktorovém systému a je využita napájená vsádková kultivační procedura. V preferované napájené vsádkové kultuře jsou savčí hostitelské buňky a kultivační medium doplňovány do kultivační nádoby na začátku a další kultivační živiny jsou přidávány, kontinuálně nebo v oddělených intervalech, do kultury během kultivování, s nebo bez periodického sklízení buněk a/nebo produktu před ukončením kultury. Napájená vsádková kultura může obsahovat, například, semikontinuální napájenou vsádkovou kulturu, kde je periodicky celá kultura (včetně buněk a media) odstrbaněna a nahrazena čerstvím mediem. Napájená vsádková kultura se liší od jednoduché vsádkové kultury, ve které jsou
• · · • · • · • · • · • · . • · · · • · *· • · · všechny složky pro kultivaci buněk (včetně buněk a kultivačních živin) doplněny do kultivační nádoby na začátku procesu kultivace. Napájená vsádková kultura může být dále odlišena od perfuzní kultury v tom, že supernatant není odstraněn k kultivační nádoby během procesu (v perfuzní kultuře zůstávají buňky v kultuře, např. filtrací, enkapsulací, zakotvením na mikročástice atd. a kultivační medium je kontinuálně nebo přerušovaně zaváděno a odváděno z kultivační nádoby). Dále buňky kultury mohou být propagovány podle jakéhokoliv schématu nebo zvyklosti, které jsou vhodné pro určitou hostitelskou buňku a předpokládaný plán určité produkce. Proto předpokládá předkládaný vynález jednokrokovou nebo mnohakrokovou kultivační proceduru. V jednokrokové proceduře jsou hostitelské buňky inokulovány do kultivačního prostředí a postupy podle předkládaného vynálezu jsou jsou využity během jedné produkční fáze buněčné kultury. Alternativně je uvažována mnohostadiová kultivace. V mnohostadiové kultuře mohou být buňky kultivovány v mnoha krocích nebo fázích. Například, buňky mohou být kultivovány v prvním kroku nebo růstové fázi kultury, kde jsou buňky, pravděpodobně odebrané ze zásobníku, inokulovány na medium vhodné pro navození růstu a vysoké životaschopnosti.
Buňky mohou být udržovány v růstové fázi po vhodnou časovou periodu přidáním čerstvého media do kultury hostitelských buněk.
Podle preferovaného aspektu vynálezu jsou vymyšleny podmínky Napájené vsádkové nebo kontinuální kultury pro posílení růstu savčích buněk v růstové fázi buněčné kultury. V růstové fázi jsou buňky kultivovány za takových podmínek a po takovou dobu, aby byl maximalizován růst. Kultivační podmínky, jako je teplota, pH, rozpuštěný kyslík (dO2) a podobně jsou ty, které jsou použity pro určitého hostitele a budou jasné odborníkům 22 22
·· ·· v oboru. Obecně, pH je upraveno na úroveň asi 6,5 a 7,5 za použití kyseliny (např. CO2) nebo báse (např. Na2C03 nebo NaOH). Vhodné rozmezí teplot pro kultivaci savčích buněk jako jsou CHO buňky je mezi asi 30 až 38 °C a vhodný d02 je asi od 5-90% saturace ve vzduchu. V určitém stadium mohou být buňky použity pro inokulaci produkční fáze nebo kroku kultury. Alternativně, jak je popsáno výše, produkční fáze nebo krok může pokračovat z inokulační nebo růstové fáze nebo kroku.
Podle předkládaného vynálezu je prostředí buněčné kultury během produkční fáze buněčné kultury kontrolováno. Podle postupu podle předkládaného vynálezu jsou ovlivňovány faktory ovlivňující specifickou produktivitu buněk savčích hostitelských buněk, takže je dosažen požadovaný obsah kyseliny sialové ve výsledném glykoproteinu. Jednotlivě, faktory, které zvyšují buněčnou specifickou produktivitu jsou kontrolovány během produkční fáze procesu kultivace buněk, takže vzniklý glykoproteinový produkt obsahuje požadované množství kyseliny sialové. V preferovaném provedení je produkční fáze procesu kultivace buněk předcházena přechodnou fází buněčné kultury, ve které jsou stanoveny parametry pro produkční fázi buněčné kultury.
Podle jednoho aspektu předkládaného vynálezu je manipulováno s koncentrací enhancerů transkripce jako je alkanová kyselina pro oovlivnění buněčné specifické produktivity a proto k ovlivnění výsledného obsahu kyseliny sialové v glykoproteinovém produktu savčích buněk. Alkanová kyselina může být jakákoliv z mnoha jednoduchých nebo rozvětvených alkanových kyselin, které zvyšují transkripci savčích proteinů. 23
• · · · • · • ♦
V preferovaném provedení je alkanová kyselina kyselina máselná a zejména její sůl, butyrát sodný.
Podle předkládaného vynálezu je koncentrace butyrátu sodného kontrolována pro kontrolu buněčné specifické produktivity. Koncentrace butyrátu sodného mezi 0,1 a 20 mM jsou pouižity a modifikovány podle určitého hostitele, který je kultivován a podle požadovaného obsahu kyseliny sialové v produkovaném glykoproteinu. Pro generování proteinu s požadovaným obsahem kyseliny sialové je vybrána koncentrace butyrátu sodného, která poskytuje nejvyšší buněčnou specifickou produktivitu s nejvíce akceptovatelným profilem kyseliny sialové. Proto je podle předkládaného vynálezu vybrána koncentrace enhanceru transkripce jako je butyrát sodný tak, aby byl získán požadovaný obsah kyseliny sialové.
Pro zvýšení obsahu kyseliny sialové ve zralém glykoproteinu jsou obecně vybrány nižší kocentrace enhanceru transkripce.
Nižší koncentrace umožňují posílení transkripce, ale uchovávají nižší buněčnou specifickou produktivitu za zachování životaschopnosti kultury hostitelských buněk. Obecně jsou použity koncentrace enhanceru transkripce jako je butyrát sodný mezi asi 0,1 a 8 mM. Lépe jsou použity koncentrace okolo asi 1,0 a 6,0 mM. V jednotlivém provedení je použito okolo 6 mM butyrátu sodného. V jiném provedení je použito okolo 1 mM butyrátu sodného. V jiném provedení je produkován glykoprotein se sníženou hladinou kyseliny sialové. Podle tohoto aspektu předkládaného vynálezu jsou savčí buňky kultivovány za takových podmínek, že buněčná specifická produktivita je zvýšena. Podle tohoto aspektu předkládaného vynálezu je koncentrace alkanové kyseliny nebo jiného vhodného enhanceru transkripce vybrána tak, že zvýšená 24 • · * • · · · · · specifická buněčná produktivita generuje protein s požadovaným profilem kyseliny sialové. V preferovaném provedení je koncentrace alkanové kyseliny nebo její soli asi okolo 5 až 20 mM a lépe mezi asi 6 mM a 12 mM. V určitém provedení je koncentrace butyrátu sodného okolo 12 mM. V určení vhodné koncentrace enhanceru transkripce jako je alkanová kyselina nebo její sůl, může být učiněn odkaz na obrázek 2, stejně jako na tabulku 1 dále v příkladu 1. Podle předkládaného vynálezu vedou obecně nižší koncentrace butyrátu sodného k nižší buněčné specifické produktivitě. Podle předkládaného vynálezu jsou koncentrace butyrátu sodného vybrány s ohledem na jiné parametry procesu jako je osmolalita produkční fáze. Jak je diskutováno dále, osmolalita může ovlivňovat buněčnou specifickou produktivitu. Koncentrace butyrátu jsou vybrány s ohledem na určitou osmolalitu, která je udržována během produkční fáze.
Alternativně, pro jiné savčí hostitelské buňky a pro jiné g1ykoproteiny mohou být připraveny malé testovací kultury a stupeň produkce glykoproteinového produktu, t.j. buněčná specifická produktivita, může být určena a výsledný obsah kyseliny sialové může být použit pro přípravu podobné tabulky a obrázku pro určitého hostitele, který je kultivován, s ohledem na to, že snížení buněčné specifické produktivity vede ke zvýšení obsahu kyseliny sialové v produkovaném glykoproteinu. Alkanová kyselina nebo její sole, jako je bxityrát sodný, nebo jiný vhodný enhancer transkripce je přidán do kultury hostitelských buněk asi v době, kdy je iniciována produkční fáze buněčné kultury. Vhodně je využita přechodná fáze během procesu kultivace buněk, která předchází produkční fázi, ve které jsou zajištěny kultivační podmínky jak byly uvedeny výše pro požadovanou buněčnou specifickou produktivitu a proto pro 25 • « · «··· ···· • ···· · · * · ··· w # t I · · · · · · · · · · ···· · · · ··· 9t ·· ·· ··*· ·· ·· požadovaný profil glykoforem.
Alkanová kyselina nebo její sůl je přidána jakýmikoliv prostředky, které jsou v oboru známé. V preferovaném provedeni je butyrát sodný přidán ve vsádce do napájeného vsádkového kultivačního systému s nebo bez vhodných živin jak jsou zde popsány nebo jak jsou známy v oboru savčích buněčných kultur.
Podle předkládaného vynálezu je dále, kromě faktorů uvedených výše, kontrolována osmolalita prostředí kultivace buněk pro regulaci rozsahu sialyzace zralého glykoproteinu. V jednom provedení je osmolalita kontrolována pro kontrolu obsahu kyseliny sialové ve zralém proteinu nezávisle na jiných faktorech, které ovlivňují buněčnou specifickou produktivitu. V jiném provedení je osmolalita kontrolována spolu s kontrolováním jiných faktorů, které ovlivňují buněčnou specifickou produktivitu. V preferovaném provedení jsou kontrolovány jak osmolalita, tak koncentrace alkanové kyseliny.
Osmolalita prostředí kultivace buněk je kontrolována pro produkci žádoucí rovnováhy mezi buněčnou specifickou produktivitou a profilem kyseliny sialové ve výsledném 81ykoprotei nu. Obecně, buněčná specifická produktivita je zvýšena, pokud je osmolalita zvýšena. Osmolalita, která Produkuje protein s požadovanou kyselinou sialovou je vybrána s ohledem na to, že zvýšení osmolality obecně vede ke zvýšení stupně produkce určitého proteinu. Pro snížení stupně produkce a pro zvýšení obsahu kyseliny sialové ve zralém glykoproteinu je osmolalita obecně udržován na nízkých hladinách pro určitý typ buněk, který je kultuvován.
Pro savčí buněčné kultury je osmolalita kultivačního media obecně udržována okolo 290 - 330 mOsm. Nicméně, zvýšení osmolality obecně vede ke zvýšení stupně produkce proteinu. Osmolalita je vybrána tak, aby stupeň produkce korespondoval s požadovaným profilem produktu. Pro zvýšení obsahu kyseliny sialové je stupeň produkce snížen a osmolalita je obecně udržována v nižších mezích s ohledem na určitou kultivovanou hostitelskou buňku. Osmolalita v mezích od asi 250 mOsm do asi 450 mOsm je vhodná pro zvýšený obsah kyseliny sialové. Lépe, osmolalita je udržována asi mezi 300 - 450 mOsm, v souladu s tímto aspektem předkládaného vynálezu, a lépe mezi 350 - 400 mOsm a nejlépe okolo 400 mOsm.
Pro nižší obsah kyseliny sialové je vybrána osmolalita, která poskytuje zvýšený stupeň produkce. Podle tohoto aspektu předkládaného vynálezu je osmolalita udržována asi okolo 350 -600 mOsm a lépe okolo 450 - 550 mOsm, podle tohoto aspektu předkládaného vynálezu.
Zkušení odborníci poznají, že osmolalita media je závislá na koncentraci osmoticky aktivních částic v kultivační tekutině a že mnoho proměnných, které vytvářejí kultivační medium savčích buněk, ovlivňuje osmolalitu. Počáteční osmolalita kultivačního media je určena složením kultivačního media. Osmolalita muže být měřena za použití osmometrujako je ten, který je dostupný od Fisher Scientific, Pittsburgh, PennsyIvan i a, pod názvem OSMETTE (nebo Osmette model 2007, dostupný od Precision Systems, lne., Natick, MA), například. Pro dosažení osmolality v požadovaném rozsahu musí být koncentrace různých konstituentů v kultivačním mediu upravena.
Roztoky, které mohou být přidány do kultivačního media tak, aby se zvýšila jeho osmolalita zahrnují proteiny, peptidy, aminokyseliny, hydro 1yzované zvířecí proteiny jako jsou peptony, nemetabo1 i zováte1né polymery, vitamíny, ionty, sole, cukry, metabolity, organické kyseliny, lipidy a podobně. V jednom provedení je osmolalita kontrolována přidáním peptonu do buněčné kultury spolu s jinými složkami kultivačního media během napájené vsádkové kultivační procedury.
Podle předkládaného vynálezu je osmolalita udržována nebo upravena na požadovaný rozsah přidáním například formulace základního media obsahující aminokyseliny, různé sole (např. NaCl) spolu s peptonem. V preferovaném provedení je medium doplněno, například, základním kultivačním mediem obsahujícím nadbytek aminokyselin (viz např. "Super" medium podle U.S. patentu č. 5.122.469), glukosu a pepton.
Bude nicméně oceněno, že koncentrace jiných složek kultivačního media mohou být modifikovány pro dosažení rozmezí osmolality jak je popsáno výše. Přerušovaným nebo kontinuálním kontrolováním koncentrace glukosy (primárního zdroje energie) například, v kultivačním mediu během kultivace, může být osmolalita media udržována okolo požadovaného určeného rozmezí. Kontrolování koncentrace glukosy slouží pro poskytnutí adekvátního zdroje uhlíku pro buňky a simultáně kontroluje produkci kyseliny mléčné hostitelskými buňkami. To je výhodné v tom, že to limituje pokles pH v kultivačním mediu, který vyžaduje přidání neutralizační látky (např. baze jako je Na2C03 nebo NaOH), což způsobuje zvýšení osmolality.
Medium může být doplněno pro udržování osmolality v jistých mezích podle jakéhokoliv schématu pro udržování buněčné kultury. V preferovaném provedení je kultivačním systémem napájený vsádkový kultivační systém a medium je doplněno ve vsádce živin během produkční fáze buněčné kultury. Dále může být medium doplněno během produkční fáze jak je popsáno dále. ··«* • ·
Alternativně může být provedeno off-line vzorkování kultivačního media. Osmolalita kultivačního media může potom být modifikována modulováním živného roztoku podle potřeby.
Odborníci pochopí, že postupy kultivace buněk podle předkládaného vynálezu jsou vybrány tak, aby bylo dosaženo požadované hladiny sialyzace produkovaného proteinu. Další parametry procesu kromě těch, které zde jsou popsány, které ovlivňují stupeň sialyzace, zahrnují hladinu kyslíku a hladinu glukosy. Kultivační hustota, doba a skladovací podmínky jako je teplota také ovlivňují sialyzaci. Předkládaný vynález je zamýšlen tak, aby obsahoval ty parametry procesu, které jsou dále nejvíce vhodné pro zvýšení sialyzace. III. Získání glykoproteinu
Po produkční fázi polypeptidu je požadovaný polypeptid odebrán z kultivačního media za použití technik, které jsou v oboru dobře známé.
Požadovaný polypeptid je preferovaně získán z kultivačního media jako secernovaný polypeptid, ačkoliv může také být získán z lyzátu hostitelských buněk.
Jako první krok je kultivační medium nebo lyzát centrifugován pro odstranění buněčné drti. Polypeptid je potom purifi^ován kontaminujících solubilních proteinů a polypeptidů, kde následující postupy mohou být příklady vhodných purifikačních postupů: frakcionace na imunoafi ni tnich nebo iontových výměnných kolonách; precipitace ethanolem; reversní fáze HPLC chromatografie na silikagelu nebo kat iontovýměnné pryskyřici jako je DEAE; chromatofokusování; SDS-PAGE; precipirace sírantm amonným; gelová filtrace za použití například Sephadex G a 29
·· ·· proten A Sepharosové kolony pro odstranění kontarainantů jako je IgG. Inhibitory proteas jako je feny1-methy1-sulfonyl fluorid (PMSF) mohou být také užitečné pro inhibici proteolytické degradace během purifikace. Odborník v oboru ocení, že metody purifikace pro požadovaný polypeptid mohou vyžadovat modifikace podle změn v charakteru polypeptidu během exprese v rekombinantní buněčné kultuře.
Zejména jsou v kontextu předkládaného vynálezu preferovány purifikační techniky a procesy, které selektují uhlovodany podle vynálezu. Požadované glykoformy podle předkládaného vynálezu mohou být obohaceny o kyselinu sialovou obsahující molekuly například iontovou výměnou chromatografií na měkkém gelu nebo HPLC za použití kat iontových- nebo aniontových výměnných pryskyřic, kde shromážděno více acidických frakcí. IV. Analysy glykoproteinu
Komplexní uhlovodanová část glykoproteinu produkovaného procesy podle předkládaného vynálezu může být snadno analyzována, pokud je to žádoucí, konvenčními technikami analýzy uhlovodanů. Tak například techniky jako je lectin-blotting, který je v oboru dobře znám, ukazují proporce terminální manosy nebo jiných cukrů jako je galaktosa. Ukončení mono-, bi-, tri-, nebo tetra-antenárních oligosacharidů sialovými kyselinami může být potvrzeno uvolněním cukrů z proteinu za použití anhydrického hydrazinu nebo enzymatických metod a frakcionací o 1 igosacharidůiontovou výměnou chromatografií nebo chromatografix s vylučováním podle velikosti nebo jinými v oboru dobře známými metodami. Také může být měřen pí glykoproteinu, před a po ošetření neuraminidasou pro odstranění sialových kyselin. Zvýšení v pí po ošetření neuraminidasou ukazuje na přítomnost sialových kyselin v glykoproteinu. 30
• « • · · • · • · ·· « · ff • · Μ· ·» ·· • · t
• Μ « ♦ ♦
Uhlovodanové struktury podle předkládaného vynálezu se vyskytují na proteinu jako N-vázané nebo 0-vázané uhlovodany. N-vázané a 0-vázané uhlovodany se liší primárně ve své jaderné struktuře. N-vázaná glykosylace označuje připojení uhlovodanové skupiny prostřednictvím GlcNAc na asparaginový zbytek v peptidovém řetězci. N-vázané uhlovodany všechny obsahují společnou Manl-6(Manl-3)Μ3ηβ1-4G1cNAcft1-4G1cNacp-P jadernou strukturu. Proto, v popsané jaderné struktuře representuje R asparaginový zbytek produkovaného proteinu. Peptidová sekvence produkovaného proteinu bude obsahovat asparagin-X-serin, asparagin-X-threonin a asparagin-X-cystein, kde X je jakákoliv aminokyselina kromě prolinu. 0-vázané uhlovodany, oproti tomu, jsou charakterizovány společnou jadernou strukturou, s GalNAc připojeným na hydroxylovou skupinu throninu nebo šeřinu. Z N-vázaných a O-vázaných uhlovodanů jsou nejdúleži tější komplexy N- a 0- vázaných uhlovodanů. Takové komplexy uhlovodanů budou obsahovat několik antenárních struktur. Mono-, bi-, tri-, a tetra- zevní struktury jsou důležité pro přidání terminálních sialových kyselin. Takové struktury zevního řetězce poskytují další místa pro specifické cukry a vazby, které obsahují uhlovodany podle předkládaného vynálezu.
Vzniklé uhlovodany mohou být analyzovány jakoukoliv metodou v oboru známou včetně těch, které jsou zde popsány. V oboru existuje několik metod pro glykosylační analýzy a jsou použitelné v kontextu předkládaného vynálezu. Takové metody poskytují informaci týkající se identity a složení ol igosac.haridů Připojených na peptid. Metody pro analýzu uhlovodanů použitelné v předkládaném vynálezu zahrnují, ale nejsou omezeny na, lektinovou chromatografi i; HPAEC-PAD, která využívá aniontové výměnné chromatografie s vyšším pH pro separování o 1 igosacharidů na základě náboje; NMP; hmotovou spektrometrii; HPLC; 31 • · « · · · · · • · 9 · · · • · · · · .· ·· ·· GPC; monosacharidové kompoziční analýzy; sekvenční enzymatické štěpení. Dále jsou známé metody pro uvolnění oligosacharidů. Tyto metody zahrnují: 1) enzymatickou, které je obvykle prováděna za použití pepti-N-glykosidasy F/endo-p-galaktosidasy; 2) β eliminace za použití tvrdého alkalického prostředí pro uvolnění zejména O-vázaných struktur; a 3) chemické metody za použití bezvodého hydrazinu pro uvolnění jak 0-, tak N- vázaných oligosacharidu.
Analýzy mohou být provedeny za použití následujících kroků: 1. Dialýzou vzorku proti deionizované vodě, pro odstranění všech pufrovacích solí, a potom lyofilizací. 2. Uvolněním intaktních oligosacharidových řetězců bezvodým hydrazinem. 3. Ošetřením intaktních oligosacharidových řetězců bezvodou methanolickou HC1 pro uvolnění jednotlivých monosacharidů jako 0-methyl derivátů. 4. N-acetylací jakýchkoliv primárních aminoskupin. 5. Derivatizací pro získání per-O-trimethy1sily1 methyl glykos idů. 6. Separací těchto derivátů kapilární GLC (plynově-kapalinovou chromatografií) na CP-SIL8 koloně. 7. Identifikací jednotlivých derivátů FID s vnitřním standardem (13-0-methy1-D-glukosa). 32 ♦ · » 4 ·· « · · · ·* 8.Neutrální a aminocukry mohou být identifikovány aniontovou výměnnou chromatografií s vysokou rozlišovací schopností kombinovanou s pulsní amperometrickou detekcí (HPAE-PAD Carbohydrate System, Dionex Corp.)· Například, cukry mohou být uvolněny hydrolýzou ve 20% (ob j em/obj eai) kyselině tri f luoroctové při 100 °C po 6 hodin. Hydrolyzáty jsou potom sušeny lyofilizací nebo na Speed-Vac (Savant Instruments). Zbytky jsou potom rozpuštěny v 1% roztoku trihydrátu octanu sodného a jsou analyzovány na HPLC-AS6 koloně jak je popsáno Anumula et al . , (Anal. Biochem. 195: 269 - 280 (1991).
Kyselina sialová může být určena separátně podle přímé kolorimetrické metody podle Yao et al., (Anal. Biochem. 179: 332 - 335 (1989)) ve trojích vzorcích. V preferovaném provedení je použita kyselina thiobarbiturová (TBA) podle Wareena, L., J. Biol. Chem. 238: (8) (1959).
Alternativně může být provedena imunoblotová analýza uhlovodanů. Podle tohoto postupu jsou na proteiny navázané uhlovodany detekovány za použití komerčního glykanového detekčního systému (Boehringer), který je založen na oxidativním imunoblotovém postupu, který popsal Haselbeck and Hosel (Haselbeck et al., Glycoconjugate J., 7: 63 (1990)). Je postupováno podle protokolu barvení doporučeného výrobcem s výjimkou toho, že protein je přenesen do plyvinyldifluoridové membrány místo do nitrocelulosové membrány a že blokující pufr obsahuje 5% hovězí sérový albumin v 10 mM tris pufru, pH 7,4 s 0,9% chloridem sodným. Detekce je provedena konjugátem anti-digoxigeninových protilátek navázaných na alkalickou fosfatasu (Boehringer), 1:1000 ředění ve tris pufrovaném salinickém roztoku za použití fosfatasových substrátů. 4- nitroblue tetrazolium chlorid, 0,03% (hmotnost/objem) a 5- bromo-4-chloro-3-indoyl"fosfát 0,03% (hmotnost/objem) ve 100 33 »» ·· ► · · « • ·« • · •· ···· • · mM tris pufru, pH 9,5, obsahující 100 mM chloridu sodného a 50 mM chloridu horečnatého. Proteinové proužky obsahující uhlovodan jsou obvykle vizualizovány asi 10 až 15 minut.
Uhlovodany mohou být také analyzovány štěpením peptid—N-g1ykosidasou F. Podle tohoto postupu je zbytek suspendován ve 14 μΐ pufru obsahujícího 0,18% SDS., 18 mM beta-merkaptoethanolu, 90 mM fosfátu, 3,6 mM EDTA při pH 8,6 a zahřáto na 100 °C po 3 minuty. Po ochlazení na pokojovou teplotu je vzorek rozdělen do dvou stejných částí. Jedna aliquota není dále ošetřena a slouží jako kontrola. Druhá frakce je upravena na asi 1% NP-40 detergentem a potom následuje ošetření 0,2 jednotkami peptid-N-glykosidasy F (Boehringer). Oba vzorky jsou zahřátý na 37 °C po dobu 2 hodin a potom jsou analyzovány SDS-polyakrylamidovou gelovou elektroforesou V. Chiméry receptoru pro tumor nekrosis faktor -imunog1obu1 inu. V preferované provedení jsou postupy podle předkládaného vynálezu použity pro produkci tumor nekrosis faktor receptor (TNFK) - Imunog1obu1in (Ig) chimér. Zejména je v této třídě chimérických proteinu preferován solubilní typ 1 TNFR IgGi. TNFRl-IgGi produkované chiméry jsou užitečné v léčbě nebo v diagnostice TNF-zprostředkovaných nebo s TNF souvisejících onemocnění a poruch. Termín "léčba" v tomto kontextu zahrnuje jak profylaxi (prevenci), supresi (např. symptomů) i léčbu existujících stavů. Patologické stavy asociované s TNF zahrnují, ale nejsou omezeny na, gram negativní a gram pozitivní bakterie, endotoxický šok, fenomén rejekce štěpu, revmatoidní artritidu, systémový lupus, Crohnovu chorobu a jiné autoimunitní a zánětlivé choroby asociované s TNF. 34
• « · · · ·· · • · · · · ·· • · · · ···· · • · · · · · «· ···· ·· · · TNFF1-IgGi přípravky podle předkládaného vynálezu jsou obecně užitečné v těch indikacích, kde byl zjištěn užitek monoklonálních protilátek proti TNF. Například, bylo zjištěno, že monoklonální protilátky proti TNF-alfa mají ochranný účinek, pokud jsou podány profylakticky (Tracey, K.J. et al., (1987), Nátuře 330: 662). Ve fázi I klinické studie popsal Exley, A. F. et al., (1990) Lancet 335: 1275 myší monoklonální protilátku k lidskému TNF-alfa jako bezpečnou, pokud je podána pacientům se závažným septickým šokem. TNFR1—IgGi je vhodně používán v léčbě revmatoidní artritidy, stejně jako septického šoku. V metodě léčby onemocnění nebo poruch asociovaných s TNF je terapeuticky aktivní množství TNFFl-IgGi přípravku podáno subjektu, který potřebuje takovou léčbu. Preferovaným subjektem je člověk. Účinné množství TNFFl-IgGi glykoformového přípravku podle předkládaného vynálezu pro léčbu chorob nebo poruch je v dávkovém rozsahu 0,01 - 100 mg/pacienta; lépe 1 mg - 75 mg/pacienta a nejlépe okolo 10 a okolo 50 mg/pacienta.
Pro podání by TNFFl-IgGi přípravek měl být formulován do vhodné farmaceutické nebo terapeutické kompozice. Takové kompozice typicky obsahují terapeuticky aktivní množství TNFPl-IgGi přípravku a farmaceuticky akceptovatelný excipient nebo nosič jako je salinický roztok, pufrovaný salinický roztok, dextrosa nebo voda. Kompozice mohou tako obsahovat specifická stabilizační činidla jako jsou cukry, včetně manosy a manitolu, a lokální anestetika pro injikovatelné kompozice, včetně, například, lidocainu. Předkládaný vynález poskytuje kompozice, které dále obsahují terapeuticky aktivní množství dalších aktivních přísad jako jsou 35 ·· ··
• · < monoklonální protilátky /např. anti-TNF protilátky, protilátky k Mac 1 nebo LFA 1) nebo jiné receptory asociované s produkcí TNF, např. IL-1 nebo IL-2 receptory, atd.
Preferovaná terapeutická kompozice pro mono- nebo pro kombinovanou terapii jak je uvedeno výše obsahuje nový TNFRl-IgGi přípravek podle předkládaného vynálezu, který vykazuje prodlouženou clearens z krve a zachovává si signifikantní funkční aktivitu. Takový prodloužený funkční poločas umožňuje zjednodušené, bolusové podávání a udílí potenciál in vivo. Preferované TNFRl-IgGi chiméry v terapeutických kompozicicích obsahují TNFRl-IgGi a přípravky zde popsané, například: 1) TNFRl-IgGi přípravky obsahující komplex o 1igosacharidu ukončený jedním nebo více zbytky kyseliny sialové; 2) TNFFl-IgGi přípravky, kde rozmezí izoelektrického bodu pí přípravku je mezi 5,5 a 7,5 jak je určeno chromatofokusováním, ve kterém je pí sensitivní na ošetření neuraminidasou; 3) TNFRl-IgGi přípravky mající okolo 1 - 2 molů exponovaných N-acetylglukosaminových zbytku na mol proteinu; 4) TNFRl-IgGi přípravky mající molárni poměr kyseliny sialové ku proteinu okolo 4-7, zejména okolo 5 - 6; 5) TNFRl-IgGi přípravky mající molárni poměr kyseliny sialové ku proteinu okolo 0,35 - 0,5, zejména okolo 0,4 - 0,45.
Způsoby podání pro jednotlivé nebo pro kombinované terapeutické kompozice podle předkládaného vynálezu zahrnují standardní způsoby, jako je například intravenosní infuse nebo 36 bolusová injekce.
Také je poskytnuto použití TNFBl-IgGi přípravku podle předkládaného vynálezu ve výrobě léčiv pro léčbu zvířat a lidí.
Po obecném popisu vynálezu bude tentýž lépe pochopitelný pomocí následujících příkladů, které jsou poskytnuty pro ilustraci a neomezují předkládaný vynález, pokud není jinak uvedeno. Příklady provedení vynálezu Příklad 1
Biologické účinky TNF-alfa a TNF-beta jsou zprostředkovány přes specifické receptory (Dembic et al., (1990), Cytokines, 2: 231). Molekulární klonování ukázalo na existenci dvou různých typů TNF receptorů (TNFK) se zřetelnou molekulovou hmotností 55 kDa (typ I) (Schall et al., (1990) Cell 61: 361) a 75 kDa (typ II) (Smith et al., (1990), Science, 248: 1019), kde se každý přirozeně váže jak na TNF-alfa, tak na TNF-beta (Loetscher et al., (1990) Cell, 61: 351; Shall et al., (1990) Cell, 61: 361; Kohno et al., (1990), Proč. Nati. Acad. Sci. USA 87: 8331). Extracelulární části obou receptorů jsou přirozeně nacházeny jako solubilní TNF vazebné proteiny (Kohno et al., výše). Byly vytvořeny TNF agonisté, které blokují škodlivé účinky TNF v různých imunitních a zánětlivých dějích (Peppel et al., (1991) J. Exp. Med., 174: 1483 - 1489; Ulich (1993) Am. J. Path., 142: 1335 - 1338; Howard, 0. M. Z. (1993) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 90: 2335 " 2339; Wooley, P.H. (1993), J. Immunol. 151: 6602 -6607). Jeden takový agonista (Werner et al., (1991) J. Cell Biochem., Abstracts, 20 th annual meeting, str. 115) kombinuje extracelulární doménu 1idkého 55 kDa typu 1 TNFR s částí 37 ·· ·· ♦· • · · · · · · • · * · ·· • · · ··♦ · · • · · · · ···♦ ·· ·· spojovacího a Fc regionů těžkého řetězce lidského imunoglobuli nu G1 . V tomto příkladu byly kultivovány savčí buňky transfektované vektorem obsahujícím cDNA kódující TNFRl-IgGi chiméru.
Metody A. Buněčná linie
Ovariální buněčná linie čínského křečka (CHO) použitá jako savčí hostitelská buněčná linie byla odvozena od CH0-K1 (ATCC č. CCL6 CHO Kl). Mutantní CH0-K1 dihydrofolát reduktasa (DHFR) deficientní buněčná linie označená CH0-K1 DUX-B11 (DHFR-) (získaná od Dr. L. Chasina z Columbia University; Simonsen, C.C. and Levinson, A.D. (1983), Proč. Nati. Acad. Sci. USA 80: 2495 -2499; Urlaub G., and Chasin, L. (1980), Proč. Nati. Acad. Sci. USA 77; 4216 - 4220) byla potom použita pro získání buněčné linie s redukovaným požada/vkem na inzulín transfekcí vektorem obsahujícím cDNA pro preproinsulin (Sures et al., (1980)
Science, 208: 57 - 59). Selektovaný klon označený dpl2.CH0 vyžaduje glycin, hypoxantin a thymidin pro růst, což potvrzuje jeho DHFR" genotyp. B. Konstrukce solubilní typ I TNFR-IgGi chiméry
Solubilní typ 1 TNFR-IgGi chiméra byla konstruována genovou fúsí extracelulární domény lidského typu 1 TNFR se spojovacím regionem a Ch2 a Ch3 doménami těžkého řetězce IgGi dále je označována TNFRl-IgGi). DNA sekvence kódující lidský typ 1 TNFR (viz Loetscher et al., výše) byla získána z plasmidu pRK-TNF-R (Schall et al., 38 ·· ·· ♦·
Cell 61: 361 (1990)). Pro konstrukci tohoto počátečního plasmidu byl 2,1 kb placentální cDNA klon (Schall et al., výše) insertován do savčího expresního vektoru pRR5, jehož konstrukce je popsána v EP přihlášce č. 307.247 publikované 15.3.1989. Tato cDNA začíná v nukleotidové pozici 64 sekvence popsané Loetscherem et al., s iniciálním methioninem 118 bp downstream.
Zdrojem IgGi kódující sekvence byl CD4-IgG expresní plasmid pRKCD42Fcl (Capon, D..J. et al., Nátuře 337: 525 (1989); Byrn et al., Nátuře 344: 667 (1990)) obsahující cDNA sekvenci kódující hubridní polypeptid skládající se ze zbytků 1 - 180 zralého lidského CD4 proteinu (dvě N-terminální CD4 variabilní domény) fušovaných na lidské IgGi sekvence začínající kyselinou aspartátovou 216 (kde aminokyselina 114 je prvním zbytkem konstantního regionu těžkého řetězce (Rabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4. vydání, (1987)), která je prvním zbytkem v IgGi pantu po cysteinovém zbytku obsaženém ve spojení těžkého a lehkého řetězce), a končící zbytkem 441 pro obsažení Ch2 a Ch3 Fc domén IgGi. TNFRl-IgGi byl konstruován generováním restrikčních fragmentů plasmidů pRR-TNF-R a pRKCD42Fci a jejich ligací, za použití deleční mutagenese, takže threoninový zbytek 171 zralého TNFR je juxtaponován aspartátovému zbytku 216 IgGi těžkého řetězce (Rabat et al., výše). Vzniklý plasmid pRKTNFR-IgG obsahoval kompletní kódující sekvenci pro TNFRiIgGi. C. Buněčná kultura
Gen kódující solubilní typ 1 TNFR-IgGi byl zaveden do dp12.CHO buněk transfekcí. Toto bylo provedeno za použití techniky fosforečnanu vápenatého pro zavedení DNA do savčích buněk. Dva dny po transfekci byly buňky trypsi nizovány a umístěny na selektivní medium (glycin - hypoxantin a thymidin 39
*· ···· ··
·« ·· prosté Hamovo F-12 DMEM, 1:1 objem/objem s 2% dialyzovaným sérem). Vzniklé izoláty byly vyšetřovány na sekreci TNFRl-IgGi. Klony exprivující TNFRl-IgGi byly amplifikovány v methotrexátu, což dávalo vysoký výnos exprivujících klonů a následně byly adaptovány na séram prosté medium. Tyto buňky byly pod trvalým selekčním tlakem, dokud nebyly přeneseny do neselektivního media pro růst a expansi inokula.
Pro poskytnutí TNFRl-IgGi produkčních kultur byla buněčná populace popsaná výše expandována z media obsahujícího methotrexat sériovými subkultivacemi v nádobách se zvyšujícím se objemem do kultivačního media neobsahujícího methotrexat. Pro tyto kroky kultivace bylo neselektivní růstové medium na DMEM/HAM F-12 založená formulace (viz U.S. patent č. 5.122.469, například) s modifikovanými koncentracemi některých složek, jako je glukosa, aminokyseliny, sole, cukry, vitamíny, glycin, hypoxantin a thymidin; rekombinantní lidský insulin, hydro 1yzovaný pepton (Primaton HS nebo Primaton RL), buněčná protektivní agens jako je Pluronic F68 (pluronový polyol) nebo ekvivalent; Gentamycin; lipidy, a stopové prvky.
Kultury byly kontrolovány při pH 7,2 +/- 0,4 použitím CO2 (kyselina) a/nebo Na2CC>3 (báze). Teplota byla kontrolována okolo 37 °C během růstové periody. Rozpuštěný kyslík byl udržován okolo 5% saturace vzduchu přímým přístupem vzduchem a/nebo kyslíkem.
Osmolalita byla během expansní fáze inokula udržována okolo 250 mOsm a 350 mOsm.
Po růstové fázi každé kultury následovala druhá fáze neboli přechodná fáze, kdy byly kultivační parametry změněny z optimálního růstu na produkční podmínky. Během této přechodné 40
40 ·· Μ » · · I I · Μ • · · · I ·« «« • · · • · * · · • · · • · · «· ·· fáze byla teplota kultivačního systému snížena, obecně na asi mezi 30 a 35 °C. Byl přidán butyrát a byl udržován jistý stupeň osmolality. Produkt akumulovaný během této produkční fáze byl analyzován na obsah kyseliny sialové. V typickém produkčním vzorci bylo asi 1,2 x 106 buněk odvozeno od expanse inokula ze selektivního stadia, kde byly kultivovány v růstové fázi s počáteční osmolalitou 300 mOsm. Růstové medium bylo doplňováno stopovými prvky, rekombinantním lidským inzulínem a hydrolyzovaným peptonem. Buňky byly kultivovány za těchto podmínek po 2 dny. Na začátku třetího dne byla teplota buněčné kultury snížena. Simultáně nebo po posunu teploty byl přidán k buněčné kultuře butyrát sodný a byla zajištěna požadovaná produkční osmolalita přidáním různých složek media. Buňky byly kultivovány za těchto podmínek s přidáváním živin po 9 - 10 dní. Buňkám byly krmeny pokud to bylo nutné různými složkami media.
Tabulka T popisuje produkční podmínky pro různé produkční procesy.
41 ·· Μ • * ♦ • · «·· • · · ♦ · I ·· ·· Μ ·· • · · · • · * • · · · • · · ·♦ #·** Μ ·♦ • · ··
Tabulka 1
Verse koncentrace osmolali ta buněčná obsah kys. procesu butyrátu v produkční specif ická sialové v (mmol/1) fázi produkt ivi ta TNFRl-IgGi v (mOsmol/kg) mezi dny 5 den 10 - 10 (pg/d) (mol/mo1) A 1 360 - 420 0,6 - 1,5 6,4 - 7,2 N=4 B 1 480 - 510 1,7 - 2,2 6,0 - 6,3 N=3 C 6 460 4,8 4,7 N= 1 D 6 370 - 420 2,4 - 2,8 5,5 - 5,6 N=3 E 6 350 - 370 1,4 - 2,3 5,4 - 6,3 N=3 F 12 390 4,0 5,3 N=1 G 12 490 - 510 2,9 - 5,2 4,0 - 5,2 N=4 H 12 400 - 430 2,0 - 2,8 5,8 - 6,0 N=3 I 12 370 - 380 2,0 - 2,2 5,5 - 5,9 N=3
D. Získání TNFR-IgG TNFRl-IgGi chiméra byla purifikována do více než 95% homogenity afinitní chromatografií na imobi1 izovaném Staphylococcus aureus Proteinu A jak popsal Capon et al. , výše. E. Analýza uhlovodanu
Obsah kyseliny sialové byl analyzován metodou podle Warrena, L. (1959) J. B i o 1. Chem. 234: 1971 - 1975. Výs1edky
Buněčná specifická produktivita pro každou produkční kulturu 42 • · • ··· • · • · Μ ·· • · • · · t • · · • · · • * · ·· *»·· • · · • · »·· « • · • · ·· »·
Popsanou v tabulce I byla zakreslena proti obsahu kyseliny sialové v získaném produktu. Výsledky jsou presentovány na obrázku 1. Nejvyšší obsah kyseliny sialové byl pozorován, pokud byly parametry procesu udržovány při produkční osmolalitě mezi asi 360 a 420 mOsm a koncentrací butyrátu okolo 1 mM. Obsah kyseliny sialové mohl být kontrolován v širokém rozsahu úpravou těchto parametrů procesu. Příklad 2
Byly určeny plasmatické farmakokinetické poločasy a/nebo stupně klearens různých přípravků. Přípravky obsahující vyšší obsah kyseliny sialové obecně vykazovaly vyšší plasmatický poločas a/nebo nižší celkovou klearens ve srovnání s přípravky obsahujícími nižší obsah kyseliny sialové.
Metody
Sedmnáct od Sprague-Dawley odvozených samců krys vážících 272 - 315 g bylo náhodně rozděleno do jedné ze tří skupin ošetřených TNFBl-IgGi fúsním proteinem (N=5 nebo 6 na skupinu). Zvířatům byla injikována intravenosně nominální dávka 5 mg/kg testovaného materiálu cestou femorální venosní kanyly. Vybraný testovaný materiál zahrnoval dva TNFRl-IgGi přípravky z procesu, ve kterém byla koncentrace butyrátu během produkční fáze 6 mM a osmolalita během produkční fáze byla udržována okolo 400 mOsm, proces I a třetí TNFPl-IgGi přípravek z procesu, ve kterém byla koncentrace butyrátu během produkční fáze 12 mM a osmolalita během produkční fáze byla udržována okolo 500 mOsm, proces 2. Dva ml krevních vzorků byly odebrány do EDTA (8,5%) před dávkou, a v 5 minutě, a 2, 6, 10, 24, 34, 48, 56, 72, 96 a 120 hodin po dávce. Krevní vzorky byly centrifugovány, plasma byla odebrána a vzorky byly analyzovány na koncentraci TNFRl-IgGi fúsního proteinu.
Enzymově vázaný imunologický a biologický vazebný test (ELIBA) byl použit pro kvantifikaci TNFRl-IgGi v plasmě krys. Tento test je založen na schopnosti TNF-alfa navázaného na křenovou peroxidasu (TNF-alfa-HRP) vázat se na receptorovou část TNFRl-IgGi fúsního proteinu. V tomto testu byly Fab fragmenty kozího antilidského IgGFc potažené na jamky mikrotitrační plotny použity pro zachycení TNFRl-IgGi interakcí s Fc částí molekuly. TNF-alfa-HRP byl přidán do jamek a byla umožněna vazba na receptorovou část zachyceného TNFRl-IgGi. Kvantifikace byla určena měřením barvy produkované reakcí peroxidasy s ortho-fenylendiaminovým (OPD) substrátem. Rozsah testu je 0,003 až 0,02 mg/ml. Přítomnost EDTA ve vzorcích plasmy neměla žádný účinek na provedení testu. Dávka byla normalizována s ohledem rozdíly v koncentraci pro dávkování roztoku. Všechny výpočty byly založeny na datech koncentrace versus čas v průběhu 120 hodin. Ohraničená plocha pod křivkou (AUC0-120) byla počítána za použití lichoběžníkového pravidla a na hmotnost normalizovaná zkrácená clearens (CL0-120/W) byla počítána jako dávka/AUCo- 12o. Výsledky
Clearens se lišila v závislosti na využité versi procesu (proces 1 ve srovnání s procesem 2) a množství kyseliny sialové Přítomné v produktu. Clearens od jednotlivých zvířat a výsledný průměr a standardní odchylky z této studie jsou Presentovány v tabulce II, níže. Proces 1 vykazuje nižší a vhodnější clearens. 44 ·· ·· Μ ·· ·· ··
Tabulka II
Clearence O - 120 ml/h/kg průměr
STDEV
Proces 1 Proces 1 Proces 2,12 2,08 2, 144 2,03 2,31 2,99 1,63 2,20 2,61 1,89 2,22 3,27 1 ,85 1,99 2,82 1,66 3,42 1,91 2,08 2,88 0,02 0,23 0,45 Příklad 3
Monosacharidová kompozice TNFRl-IgGi
Určení ol igosacharidové ulilovodanové struktury TNFRl-IgGi připraveného jak je popsáno v příkladu 1 ukázalo, že obsah kyseliny sialové se v různých versích procesu liší. Rychlá plasmatická clearens byla asociována s vysokou expozicí GlcNAc, menším množství kyseliny sialové v oligosacharidových řetězcích a (interferenčně) dostupností proteinu pro manosové nebo galaktosové receptory. Pomalá plasmatická clearens byla asociována s více terminálními residui kyseliny sialové.. A. Zdroje testovaného materiálu TNFRl-IgGi byl produkován podle metody popsané v příkladu 1 výše. Materiál z procesu 1 byl získán z buněčné kultury za 45
·#· * I
• · I • · · · použití 6 mM butyrátu a osmolality 400 mOsm. v průběhu produkční fáze. Materiál z procesu 2 byl získán z buněčné kultury za použití 12 mM butyrátu a osmolality 500 mOsm. v průběhu produkční fáze. B. Metody
Uvolnění intaktních neutrálních a aminocukrů bylo určeno aniontovou výměnou chromatografií při vysokém pH kombinovanou s pulsní amperometrickou detekcí. Analýza byla provedena za použití následujících kroků: 1. Výměna pufru byla provedena s TNFRl-IgGi (přibližně 50 pg/ml) a vhodnými referenčními vzorky tak, že konečný vzorek byl obsažen v 1% kyselině octové. 2. Přibližně 90 pg TNFRl-IgGi, stejně jako vzorku referenčního materiálu bylo zmraženo v lázni suchého ledu a alkoholu a zmražený vzorek byl lyofilizován přes noc. 3. Mrazem vysušené vzorky byly rekonstituovány v 500 μΐ kyseliny trifluoroctové a inkubovány při 120 °C po 1 hodinu. 4. Po kyselé hydrolýze byly TNFRl-IgGi a referenční vzorky ochlazeny a odpařeny do sucha. 5. Vzorky byly rekonstituovány vodou do konečné koncentrace asi 0,6 mg/ml.
6. Separace monosacharidú byla provedena při okolní teplotě aniontovou výměnou chromatografií při vysokém pH s pulsní amperometrickou detekcí za použití Dionex CarboPac PA1 (4 x 250 mm) kolony (Dionex Corp., Sunnyavale, CA). 46 46 ·· ·· ·# ♦· ·* ·· • * é · · · · • ···· · · · • « t ··· · ·
* · #» · · ···· 7. Kvantifikace jednotlivých roonosacharidů byla provedena srovnáním s referenčními monosacharidy. C. Výsledky
Relativní molární obsahy každého monosacharidu jsou ukázány v tabulce III, dále.
Tabulka III
Relativní molární obsah monosacharidů ve dvou TNFRl-IgGi přípravc í ch
Monosacharid Proces I Proces Fukosa 4,3 + 0,2 4,4 Galaktosa 6,5 ± 0,0 4,7 Mannosa 12,2 ± 0,6 12,5 N-acetylglukosamin 14,1 + 0,6 14,3 Kyselina sialová 4,9 + 0,3 3,7 ± N-acetylgalaktosamin 0,5 ± 0,1 0,3 Poměr k . s ialová/GlcNAc 0,35 0,26 Výše uvedené výsledky ukazují, že parametry procesu vybrané pro produkční fázi glykoproteinu ovlivňují složení uhlovodanů zralého glykoproteinu. Přípravky vykazující vyšší obsah kyseliny sialové obecně vykazují prodloužený sérový poločas.
Tabulky IV a V presentované dále demonstrují složení uhlovodanů oligosacharidových postraních řetězců TNFRl-IgGi chimérických přípravku produkovaných v podmínkách procesu I a 47 ·· ·· ·· ·· • · · · · · • · · · · · · • · · · · · · • · · · · · Μ Μ ·· ···· procesu II. Tabulka V presentuje data pro uhlovodany na receptorové části chimérické molekuly, odečítající Fc glykosylační místo.
Tabulka IV PI PI PI PI PII PII Kyselina sialová 5,8 5,8 5,7 5,8 3,7 3,5 Fukosa 4,0 4,0 3,6 4,1 4,4 4,3 GalNAc 0,3 0,2 0,2 0,4 0,3 0,4 GINAc 12,9 15,0 14,8 14,3 14,3 14,4 Gal 7,4 7,6 7,1 7,0 4,7 4,1 Man 12,0 12,0 10,0 12,0 12,5 11,9 Poměr SA/GlcNAc 0,45 0,39 0,39 0,41 0,26 0,24
Tabulka V PII PII PI PI moly exponované GlcNAc na mol 3,18 3,2 1,11 1,32 moly exponované Gal na mol 0,97 -0,08 1 ,45 -0,26 Gal anténa 4,47 4,72 6,45 6,24 K.s i alová na mo 1 3,5 4,8 5,00 6,5
Výsledky presentované v tabulkách IV a V demonstrují, že kompozice TNFRl-IgGi jsou typicky sialové kyseliny ukončené mono-, bi-, a triantenární komplexy oligosacharidú. Může být usouzeno, že TNFRl-IgGi připravený procesem I obsahuje signifikantně vyšší část kyseliny sialové a signifikantně nižší část exponované GlcNAc.Kyselina sialová na mol proteinu ukazuje, že tento materiál bude mít nižší izoe1ektrický bod než materiál produkovaný procesem II. Při srovnání s výsledky v tabulce II tyto výsledky také ukazují, že nižší plasmatická clearens materiálu z procesu I koreluje s nižším exponovaným GlcNAc a obecně s vyšším obsahem kyseliny sialové.
Tabulky IV a V ukazují TNFRl-IgGi přípravky obsahující komplex oligosacharidú ukončených jedním nebo více zbytky kyseliny sialové. Preferované TNFRl-IgGi přípravky obsahují TNFRl-IgGi molekuly mající okolo 1-2 molů exponovaných N-acetylglukosaminových zbytků na mol proteinu. Molární poměr kyseliny sialové ku proteinu je okolo 4-7. TNFEl-IgGi přípravky mají molární poměr kyseliny sialové ku proteiu od asi 0,4 do asi 0,45. Příklad 4 pí silně sialyzovaných přípravků je nižší než pí slabě sialyzovaných přípravků
Metody
Izoe1ektrické fokusování bylo provedeno pro různé přípravky popsané v příkladu 2. Izoelektrický fokusační gel separuje glykoproteiny podle jejich izoe1ektrického bodu, pí, za použití pH gradientu vytvořeného amfolyty o různém pH. V této studii byla analýza přípravků provedena za použití pH gradientu od 10 do 4 . Výsledky TNFRí-IgGi přípravky vykazují rozmezí izoelektrického bodu od asi 5,5 do asi 7,5 jak je určeno chromatofokusováním, kde pí je sensitivní na ošetření neuraminidasou.
Zde citované odkazy jsou zde uvedeny jako odkazy, ať jsou specificky uvedeny či nikoliv. Ačkoliv byl vynález popsán v souvislosti s jeho specifickými provedeními, je zřejmé, že jsou možné jeho další modifikace.
Tato přihláška je míněna tak, aby pokryla jakékoliv variace, použití nebo adaptace vynálezu, které obecně následují principy vynálezu a obsahují takové odchylky od předkládaného vynálezu, které jsou v oboru, kterého se vynález týká, známé, a které mohou být aplikovány na základní rysy které jsou zde dané v rozsahu připojených patentových nároků.

Claims (23)

  1. 50 ·· ·· 9 9 9 99 9 9 9 · · • · · · • · · · ,· · · ·· ·· • · · · · · · • · · « Μ • · # ···· ♦ • · · · · I · ···· ·· ·· Patent ové nároky 1. Způsob kontroly množství kyseliny sialové přítomné na oligosacharidovém postraním řetězci glykoproteinu produkovaného savčí buněčnou kulturou vyznačující se tím, že obsahuje: kultivování savčí hostitelské buňky v produkční fázi kultury, které je charakterizováno: i) přidáním alkanové kyseliny nebo její soli do buněčné kultury v koncentraci od asi 0,1 mM do asi 20 mM; a ii) udržováním osmolality buněčné kultury asi okolo 250 do asi 600 mOsm.
  2. 2. Způsob podle nároku lvyznačující se tím, že množství kyseliny sialové přítomné v o 1 igosacharidovém postranním řetězci glykoproteinu je zvýšeno a kde: buněčná specifická produktivita buněčné kultury je snížena kultivováním hostitelské buňky v koncentraci alkanové kyseliny nebo její soli okolo 0,1 až 6 mM a udržováním osmolality okolo 300 - 450 mOsm.
  3. 3. Způsob podle nároku 2vyznačující se tím, že hostitelskou buňkou je CHO buňka.
  4. 4. Způsob podle nároku 3vyznačující se tím, že alkanová kyselina nebo její sůl je butyrát sodný.
  5. 5. Způsob podle nároku 4vyznačující se tím, že produkovaným glykoproteinem je savčí glykoprotein.
  6. 6. Způsob podle nároku 5vyznačující se tím, že glykoproteinem je tumor nekrosis faktor receptor -imunoglobulin chiméra.
  7. 7. Způsob podle nároku 6 vyznačující se tím, že hostitelská buňka je dpl2.CH0 buněčná linie transfektovaná vektorem nesoucím cDNA kódující solubilní typ 1 tumor nekrosis faktor imunoglobulin Gi chiméru.
  8. 8. Způsob podle nároku lvyznačující se tím, že množství kyseliny sialové přítomné v oligosacharidovém postraním řetězci glykoproteinu je sníženo a kde: buněčná specifická produktivita buněčné kultury je zvýšena kultivováním hostitelské buňky v koncentraci alkanové kyseliny nebo její soli okolo 6 mM až 12 mM a udržováním osmolality okolo 450 - 600 mOsm.
  9. 9. Způsob podle nároku 8 vyznačující se tím, že hostitelskou buňkou je CHO buňka.
  10. 10. Způsob podle nároku 9vyznačující se tím, že alkanová kyselina nebo její sůl je butyrát sodný.
  11. 11. Způsob podle nároku lOvyznačující se tím, že produkovaným glykoproteinem je savčí glykoprotein.
  12. 12. Způsob podle nároku llvyznačující se tím, že glykoproteinem je tumor nekrosis faktor receptor - imunog1obu1in chiméra.
    «· · ·
  13. 13. Způsob podle nároku 14vyznačující se tím, že hostitelská buňka je dpl2.CH0 buněčná linie transfektovaná vektorem nesoucím cDNA kódující solubilní typ 1 tumor nekrosis faktor imunoglobulin Gi,TNFRl-IgGi, chiméru.
  14. 14. Způsob produkce tumor nekrosis faktor receptor -imunoglobuli, TNFRl-IgGi, chimérického proteinu vyznačující se tím,že obsahuje: a) kultivaci savčí hostitelské buňky, která exprivuje TNFR-IG chiméru v růstové fázi za takových podmínek a po takovou dobu, že je dosažen maximální buněčný růst; b) kultivaci hostitelské buňky v produkční fázi za přítomnosti butyrátu sodného v koncentraci od asi 6 mM do asi 12 mM; c) udržování osmolality produkční fáze okolo 450 - 600 mOsm.
  15. 15. Způsob produkce tumor nekrosis faktor receptor -imunoglobulin, TNFRl-IgGi, chimérického proteinu vyznačující se t í m, ž e obsahuje: a) kultivaci savčí hostitelské buňky, která exprivuje TNFR-IG chiméru v růstové fázi za takových podmínek a po takovou dobu, že je dosažen maximální buněčný růst; b) kultivaci hostitelské buňky v produkční fázi za přítomnosti butyrátu sodného v koncentraci od asi 1 mM do asi 6 mM; c) udržování osmolality produkční fáze okolo 300 - 450 mOsm. 53 • · *
  16. 16. Způsob podle nároku 15 vyznačující se tím, že hostitelská buňka je CHO buňka.
  17. 17. Způsob podle nároku 16vyznačující se tím, že hostitelská buňka je dpl2.CH0 linie.
  18. 18. Přípravek, obsahující TNFRl-IgGi produkovaný procesem podle nároku 17.
  19. 19. Terapeutická kompozice obsahující TNFRl-IgGi produkovaný způsobem podle nároku 15 a farmaceuticky akceptovatelný exc ipi ent.
  20. 20. TNFRl-IgGi přípravek obsahující TNFRl-IgGi molekuly, kde TNFRl-IgGi molekuly mají molární poměr kyseliny sialové ku proteinu okolo 4-7.
  21. 21. TNFRl-IgGi přípravek obsahující TNFRl-IgGi molekuly, kde TNFRl-IgGi molekuly mají okolo 1 - 2 molů exponovaných N-acetylglukosaminových zbytků na mol TNFRl-IgGi proteinu.
  22. 22. TNFRl-IgGi přípravek obsahující TNFR1-IgGi molekuly, kde TNFRl-lgGj molekuly mají molární poměr kyseliny sialové ku N acetylgiukosaminu od asi 0,35 do asi 0,5.
  23. 23. TNFR1 IgGi přípravek podle nároku 22, kde as i molární poměr kyseliny sialové ku N-acetylglukosaminu od 0,39 d0 asj 0,45. i
CZ19973909A 1995-06-06 1996-06-06 Způsob řízení obsahu kyseliny sialové v savčím glykoproteinu produkovaném savčí buněčnou kulturou CZ293719B6 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/469,348 US5705364A (en) 1995-06-06 1995-06-06 Mammalian cell culture process

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ390997A3 true CZ390997A3 (cs) 1998-06-17
CZ293719B6 CZ293719B6 (cs) 2004-07-14

Family

ID=23863440

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ19973909A CZ293719B6 (cs) 1995-06-06 1996-06-06 Způsob řízení obsahu kyseliny sialové v savčím glykoproteinu produkovaném savčí buněčnou kulturou

Country Status (35)

Country Link
US (1) US5705364A (cs)
EP (2) EP0832189B2 (cs)
JP (2) JPH11507523A (cs)
KR (1) KR100496356B1 (cs)
CN (1) CN1166772C (cs)
AR (2) AR004940A1 (cs)
AT (2) ATE425245T2 (cs)
AU (1) AU717847B2 (cs)
BG (1) BG63213B1 (cs)
BR (1) BR9609150A (cs)
CA (1) CA2220684C (cs)
CZ (1) CZ293719B6 (cs)
DE (2) DE69635076T3 (cs)
DK (2) DK0832189T4 (cs)
EA (1) EA001215B1 (cs)
ES (2) ES2248812T5 (cs)
GE (1) GEP20012519B (cs)
HU (1) HU226420B1 (cs)
IL (1) IL122398A (cs)
IS (1) IS2614B (cs)
MY (1) MY113496A (cs)
NO (1) NO322276B1 (cs)
NZ (1) NZ310202A (cs)
OA (1) OA10753A (cs)
PL (1) PL185484B1 (cs)
PT (1) PT1609853E (cs)
RO (1) RO120267B1 (cs)
SA (1) SA96170351B1 (cs)
SI (2) SI0832189T2 (cs)
SK (1) SK282658B6 (cs)
TR (1) TR199701543T1 (cs)
TW (2) TW516962B (cs)
UA (1) UA47428C2 (cs)
WO (1) WO1996039488A1 (cs)
ZA (1) ZA964776B (cs)

Families Citing this family (116)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10399023I2 (de) 1989-09-12 2006-11-23 Ahp Mfg B V TFN-bindende Proteine
US6656466B1 (en) * 1995-06-06 2003-12-02 Genetech, Inc. Human tumor necrosis factor—immunoglobulin(TNFR1-IgG1) chimera composition
US5705364A (en) † 1995-06-06 1998-01-06 Genentech, Inc. Mammalian cell culture process
JP4306813B2 (ja) 1995-09-19 2009-08-05 アスビオファーマ株式会社 動物細胞の新規培養方法
AU725408B2 (en) * 1996-05-08 2000-10-12 F. Hoffmann-La Roche Ag Treatment of asthma with TNFR-Ig
JP3394240B2 (ja) * 1997-12-03 2003-04-07 ロシュ ダイアグノスティックス ゲーエムベーハー 適当にグリコシル化されたポリペプチドの製造方法
US6140445A (en) * 1998-04-17 2000-10-31 Crompton Corporation Silane functional oligomer
US6528286B1 (en) * 1998-05-29 2003-03-04 Genentech, Inc. Mammalian cell culture process for producing glycoproteins
AU4314299A (en) * 1998-05-29 1999-12-13 Genentech Inc. Cell culture process for producing glycoproteins
TR200504220T2 (tr) * 1998-12-17 2007-04-24 Biogen Idec Ma Inc. Aktif limfotoksin-beta reseptör imunoglobülin şimeAktif limfotoksin-beta reseptör imunoglobülin şimerik proteinlerinin yüksek düzey ifadesi ve saflaştrik proteinlerinin yüksek düzey ifadesi ve saflaştırılması için bir yöntem.ırılması için bir yöntem.
GB9828624D0 (en) * 1998-12-23 1999-02-17 Glaxo Group Ltd Production of proteins
KR100475417B1 (ko) * 1998-12-30 2005-07-18 씨제이 주식회사 시알산 함량이 높은 재조합 당단백질의 제조방법
US7294481B1 (en) * 1999-01-05 2007-11-13 Immunex Corporation Method for producing recombinant proteins
DE60032349T2 (de) 1999-04-26 2007-07-12 Genentech, Inc., South San Francisco Zellenzuchtverfahren für glycoproteine
US6261805B1 (en) * 1999-07-15 2001-07-17 Boyce Thompson Institute For Plant Research, Inc. Sialyiation of N-linked glycoproteins in the baculovirus expression vector system
KR100394474B1 (ko) * 1999-12-18 2003-08-09 동아제약 주식회사 동물세포에서 재조합 당단백질의 연속식 대량생산 방법
JP2003533537A (ja) * 2000-05-16 2003-11-11 リポクセン テクノロジーズ リミテッド タンパク質の誘導体化
AU2001271021A1 (en) * 2000-07-05 2002-01-14 Japan As Represented By Secretary Of Osaka University Process for producing glycoprotein
US20030040095A1 (en) * 2001-03-16 2003-02-27 Achille Arini Method for the production of pharmaceutically active recombinant proteins
JP2004532642A (ja) * 2001-06-13 2004-10-28 ジェネンテック・インコーポレーテッド 動物細胞の培養方法と動物細胞でのポリペプチド産生
WO2003083066A2 (en) 2002-03-27 2003-10-09 Immunex Corporation Methods for increasing polypeptide production
US20030190710A1 (en) * 2002-03-28 2003-10-09 Devries Ruth L. Control of glycoforms in IgG
US7067279B1 (en) * 2002-08-23 2006-06-27 Immunex Corporation Cell culture performance with betaine
US6924124B1 (en) * 2002-08-23 2005-08-02 Immunex Corporation Feeding strategies for cell culture
US6974681B1 (en) 2002-08-23 2005-12-13 Immunex Corporation Cell culture performance with vanadate
US7285269B2 (en) * 2002-12-02 2007-10-23 Amgen Fremont, Inc. Antibodies directed to tumor necrosis factor
DE60335024D1 (de) * 2002-12-23 2010-12-30 Bristol Myers Squibb Co Produktqualitätsverbesserung in säugerzellkulturverfahrenzur proteinproduktion
JP4541157B2 (ja) * 2002-12-23 2010-09-08 ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニー タンパク質を製造するための哺乳類細胞培養法
JP2007525176A (ja) * 2003-04-25 2007-09-06 イミュネックス・コーポレーション 組換えタンパク質発現の誘導剤
EP1959011B1 (en) 2003-10-24 2012-03-28 Selexis S.A. High efficiency gene transfer and expression in mammalian cells by a multiple transfection procedure of matrix attachment region sequences
JP2008504009A (ja) * 2003-12-23 2008-02-14 アプライド リサーチ システムズ エーアールエス ホールディング ナームロゼ フェンノートシャップ 腫瘍壊死因子結合蛋白質を生産する方法
WO2005064002A1 (en) * 2003-12-31 2005-07-14 Samyang Genex Corporation Method for mass production of secondary metabolites in plant cell culture by treatment of an alkanoic acid or salt thereof
US8609370B2 (en) * 2004-02-13 2013-12-17 Glycotope Gmbh Highly active glycoproteins-process conditions and an efficient method for their production
TWI364458B (en) * 2004-08-27 2012-05-21 Wyeth Res Ireland Ltd Production of tnfr-lg
TWI374935B (en) * 2004-08-27 2012-10-21 Pfizer Ireland Pharmaceuticals Production of α-abeta
TWI384069B (zh) * 2004-08-27 2013-02-01 Pfizer Ireland Pharmaceuticals 多胜肽之製法
AU2006247039B2 (en) * 2005-05-19 2011-03-03 Amgen Inc. Compositions and methods for increasing the stability of antibodies
EP1891207A2 (en) * 2005-06-03 2008-02-27 Biovitrum AB Process for cultivating animal cells comprising the feeding of plant-derived peptones
KR100670105B1 (ko) 2005-06-29 2007-01-17 주식회사 셀트리온 콩가수분해물의 저분자량 분획을 이용하여 시알산 함량이증가된 에리스로포이에틴을 생산하는 방법 및 그에 의하여생산된 시알산 함량이 증가된 에리스로포이에틴
US8470318B2 (en) 2005-11-07 2013-06-25 The Rockefeller University Polypeptides with enhanced anti-inflammatory and decreased cytotoxic properties and relating methods
AU2006330922B2 (en) 2005-12-20 2012-07-26 Bristol-Myers Squibb Company Compositions and methods for producing a composition
AR058568A1 (es) 2005-12-20 2008-02-13 Bristol Myers Squibb Co Metodos para producir una composicion con moleculas ctla4-ig a partir de un medio de cultivo
US20070190057A1 (en) 2006-01-23 2007-08-16 Jian Wu Methods for modulating mannose content of recombinant proteins
ES2502966T3 (es) * 2006-01-26 2014-10-06 Recopharma Ab Composiciones y métodos para inhibir la adhesión viral
NZ572379A (en) * 2006-04-05 2012-06-29 Univ Rockefeller Polypeptides with enhanced anti-inflammatory and decreased cytotoxic properties and relating methods
DK3255141T3 (da) * 2006-07-13 2022-01-31 Wyeth Llc Fremstilling af antistoffer med forbedret glycosyleringsmønster
BRPI0716762A2 (pt) 2006-09-13 2013-09-24 Abbott Lab melhorias da cultura celular
US8911964B2 (en) 2006-09-13 2014-12-16 Abbvie Inc. Fed-batch method of making human anti-TNF-alpha antibody
US20080145893A1 (en) * 2006-09-17 2008-06-19 Excellegene Sa Method for producing a recombinant protein at high specific productivity, high batch yield and high volumetric yield by means of transient transfection
EP2091969A4 (en) * 2006-10-27 2010-05-12 Univ Rockefeller POLYPEPTIDES WITH IMPROVED INFLAMMATORY INHIBITION AND REDUCED CYTOTOXIC PROPERTIES AND RELATED METHODS THEREFOR
WO2008069244A1 (ja) * 2006-12-05 2008-06-12 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. 糖蛋白質組成物の製造方法
CA2682744C (en) * 2007-04-16 2015-10-06 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Methods related to cell surface glyosylation
TW200902708A (en) 2007-04-23 2009-01-16 Wyeth Corp Methods of protein production using anti-senescence compounds
US20090023186A1 (en) * 2007-07-22 2009-01-22 Excellgene Sa Use of valproic acid for enhancing production of recombinant proteins in mammalian cells
ES2657055T3 (es) * 2007-08-09 2018-03-01 Wyeth Llc Uso de perfusión para mejorar la producción de un cultivo de células alimentado por lotes en biorreactores
EP4269578B8 (en) * 2008-03-06 2024-07-17 Halozyme, Inc. Soluble hyaluronidase composition
TWI395593B (zh) * 2008-03-06 2013-05-11 Halozyme Inc 可活化的基質降解酵素之活體內暫時性控制
CA2720610C (en) 2008-04-07 2016-08-23 Bayer Healthcare Llc Methods of recombinant production of glycoproteins
EA201001678A1 (ru) 2008-04-22 2011-06-30 Те Рокфеллер Юниверсити Способы идентификации противовоспалительных соединений
CA2734922C (en) 2008-09-15 2020-01-14 Genentech, Inc. Compositions comprising polynucleotides comprising hybrid osmo-responsive transcriptional regulatory elements and methods for producing a protein under conditions of hyperosmolarity
TW201028433A (en) 2008-10-20 2010-08-01 Abbott Lab Viral inactivation during purification of antibodies
TWI610936B (zh) * 2008-10-20 2018-01-11 艾伯維有限公司 使用蛋白質ａ親和性層析進行抗體之分離及純化
EA036569B1 (ru) * 2008-12-09 2020-11-24 Галозим, Инк. Способ получения полипептида гиалуронидазы ph20
EP2403523A1 (en) * 2009-03-06 2012-01-11 Halozyme, Inc. Temperature sensitive mutants of matrix metalloprotease 1 und uses thereof
US9540426B2 (en) 2009-10-06 2017-01-10 Bristol-Myers Squibb Company Mammalian cell culture processes for protein production
EP4406615A3 (en) 2009-10-26 2024-12-11 F. Hoffmann-La Roche AG Method for the production of a glycosylated immunoglobulin
SMT201700529T1 (it) 2009-11-17 2018-01-11 Squibb & Sons Llc Metodi per un'aumentata produzione di proteine
US8722615B2 (en) * 2009-12-02 2014-05-13 Acceleron Pharma, Inc. Compositions and methods for increasing serum half-life
EP2538968B1 (en) * 2010-02-24 2017-11-01 Chiesi Farmaceutici S.p.A. Process for production and purification of recombinant lysosomal alpha-mannosidase
JPWO2012017925A1 (ja) 2010-08-02 2013-10-03 協和発酵キリン株式会社 物質の製造方法
CA2829774C (en) 2011-03-14 2019-09-24 National Research Council Of Canada Method of viral production in cells
EP2702077A2 (en) 2011-04-27 2014-03-05 AbbVie Inc. Methods for controlling the galactosylation profile of recombinantly-expressed proteins
ES2560470T3 (es) 2011-04-29 2016-02-19 Biocon Research Limited Un método para reducir la heterogeneidad de anticuerpos y un proceso de producción de dichos anticuerpos
US8883982B2 (en) 2011-06-08 2014-11-11 Acceleron Pharma, Inc. Compositions and methods for increasing serum half-life
US9334319B2 (en) 2012-04-20 2016-05-10 Abbvie Inc. Low acidic species compositions
US9505833B2 (en) 2012-04-20 2016-11-29 Abbvie Inc. Human antibodies that bind human TNF-alpha and methods of preparing the same
US9181572B2 (en) 2012-04-20 2015-11-10 Abbvie, Inc. Methods to modulate lysine variant distribution
US9067990B2 (en) 2013-03-14 2015-06-30 Abbvie, Inc. Protein purification using displacement chromatography
WO2013176754A1 (en) 2012-05-24 2013-11-28 Abbvie Inc. Novel purification of antibodies using hydrophobic interaction chromatography
CN102839157A (zh) * 2012-07-12 2012-12-26 扬州大学 稳定共表达hST3GalIV和β1-4GalT1的MDCK细胞系及构建方法和应用
HK1211981A1 (en) 2012-09-02 2016-06-03 Abbvie Inc. Methods to control protein heterogeneity
US9512214B2 (en) 2012-09-02 2016-12-06 Abbvie, Inc. Methods to control protein heterogeneity
NO2760138T3 (cs) 2012-10-01 2018-08-04
US20140106405A1 (en) * 2012-10-15 2014-04-17 Bristol-Myers Squibb Company Mammalian cell culture processes for protein production
CN104822826B (zh) 2012-10-15 2019-04-30 百时美施贵宝公司 用于蛋白产生的哺乳动物细胞培养过程
US9217168B2 (en) 2013-03-14 2015-12-22 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Methods of cell culture
US9017687B1 (en) 2013-10-18 2015-04-28 Abbvie, Inc. Low acidic species compositions and methods for producing and using the same using displacement chromatography
WO2014151878A2 (en) 2013-03-14 2014-09-25 Abbvie Inc. Methods for modulating protein glycosylation profiles of recombinant protein therapeutics using monosaccharides and oligosacharides
WO2014159579A1 (en) 2013-03-14 2014-10-02 Abbvie Inc. MUTATED ANTI-TNFα ANTIBODIES AND METHODS OF THEIR USE
AR095196A1 (es) 2013-03-15 2015-09-30 Regeneron Pharma Medio de cultivo celular libre de suero
KR102248581B1 (ko) 2013-07-04 2021-05-06 에프. 호프만-라 로슈 아게 혈청 샘플 중 항-약물 항체를 검출하기 위한 간섭-억제된 면역분석
EP3019528A1 (en) 2013-07-06 2016-05-18 Cadila Healthcare Limited Improved process for production of monoclonal antibodies
WO2015051293A2 (en) 2013-10-04 2015-04-09 Abbvie, Inc. Use of metal ions for modulation of protein glycosylation profiles of recombinant proteins
US8946395B1 (en) 2013-10-18 2015-02-03 Abbvie Inc. Purification of proteins using hydrophobic interaction chromatography
US9085618B2 (en) 2013-10-18 2015-07-21 Abbvie, Inc. Low acidic species compositions and methods for producing and using the same
US9181337B2 (en) 2013-10-18 2015-11-10 Abbvie, Inc. Modulated lysine variant species compositions and methods for producing and using the same
US20150139988A1 (en) 2013-11-15 2015-05-21 Abbvie, Inc. Glycoengineered binding protein compositions
RU2712562C2 (ru) * 2014-02-27 2020-01-29 Ф.Хоффманн-Ля Рош Аг Модулирование клеточного роста и гликозилирования при производстве рекомбинантных гликопротеинов
JP6652334B2 (ja) 2014-05-31 2020-02-19 Ｊｃｒファーマ株式会社 ウリジンとｎ−アセチル−ｄ−マンノサミンとを含有する培地
CN106536746A (zh) * 2014-06-03 2017-03-22 鲁宾有限公司 用于生产蛋白的细胞培养方法
US20160130324A1 (en) 2014-10-31 2016-05-12 Shire Human Genetic Therapies, Inc. C1 Inhibitor Fusion Proteins and Uses Thereof
KR102007930B1 (ko) 2014-12-31 2019-08-06 주식회사 엘지화학 재조합 당단백질의 글리코실화 조절 방법
TWI899515B (zh) 2015-08-04 2025-10-01 美商再生元醫藥公司 補充牛磺酸之細胞培養基及用法
JP7189767B2 (ja) 2015-11-19 2022-12-14 武田薬品工業株式会社 組換えヒトｃ１エステラーゼインヒビター及びその使用
BR112018013501B1 (pt) * 2015-12-29 2022-12-20 N.V. Nutricia Uso de um ingrediente fermentado e oligossacarídeo não digerível
JP7471220B2 (ja) * 2017-11-30 2024-04-19 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 哺乳動物細胞の培養方法
MA54248A (fr) 2018-11-13 2021-09-22 Janssen Biotech Inc Régulation de métaux traces pendant la production d'anticorps anti-cd38
US12297451B1 (en) 2019-10-25 2025-05-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Cell culture medium
EP3931303A1 (en) 2019-12-06 2022-01-05 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-vegf protein compositions and methods for producing the same
WO2021226444A2 (en) 2020-05-08 2021-11-11 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Vegf traps and mini-traps and methods for treating ocular disorders and cancer
CA3192999A1 (en) 2020-08-31 2022-03-03 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Asparagine feed strategies to improve cell culture performance and mitigate asparagine sequence variants
CN116761880A (zh) 2021-01-20 2023-09-15 瑞泽恩制药公司 改进细胞培养物中的蛋白质滴度的方法
CN118076894A (zh) 2021-10-07 2024-05-24 里珍纳龙药品有限公司 pH建模和控制的系统及方法
KR20240090312A (ko) 2021-10-07 2024-06-21 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. Ph 미터 보정 및 교정
AU2023228815A1 (en) 2022-03-02 2024-09-12 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Manufacturing process for high titer antibody
WO2025219232A1 (en) 2024-04-15 2025-10-23 Evonik Operations Gmbh Application of small peptides supplemented cell culture media for improved cell performance

Family Cites Families (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3926723A (en) 1974-08-08 1975-12-16 Massachusetts Inst Technology Method of controllably releasing glucose to a cell culture medium
JPS5938488B2 (ja) 1979-05-07 1984-09-17 株式会社東芝 空気調和機
IL69027A (en) * 1982-06-21 1988-08-31 Wellcome Found Process for the production of interferon
US4560655A (en) 1982-12-16 1985-12-24 Immunex Corporation Serum-free cell culture medium and process for making same
US4657866A (en) 1982-12-21 1987-04-14 Sudhir Kumar Serum-free, synthetic, completely chemically defined tissue culture media
US4767704A (en) 1983-10-07 1988-08-30 Columbia University In The City Of New York Protein-free culture medium
US4724206A (en) * 1984-02-13 1988-02-09 Damon Biotech, Inc. Protein production using hypertonic media
GB8516415D0 (en) 1985-06-28 1985-07-31 Celltech Ltd Culture of animal cells
JPH0639919B2 (ja) 1985-08-29 1994-05-25 トヨタ自動車株式会社 過給機付き内燃機関の異常判別装置
GB8606386D0 (en) * 1986-03-14 1986-04-23 Celltech Ltd Production of protein
US4927762A (en) 1986-04-01 1990-05-22 Cell Enterprises, Inc. Cell culture medium with antioxidant
WO1988001643A1 (en) 1986-08-29 1988-03-10 Endotronics, Inc. Method of culturing cells
JPH01257492A (ja) * 1987-03-05 1989-10-13 Green Cross Corp:The 異種蛋白質の生産増強方法
IL87737A (en) * 1987-09-11 1993-08-18 Genentech Inc Method for culturing polypeptide factor dependent vertebrate recombinant cells
JPH066054B2 (ja) 1987-10-15 1994-01-26 帝人株式会社 動物細胞の培養方法
CA1312030C (en) * 1987-11-18 1992-12-29 Brian Maiorella Method to increase antibody titer
US5151359A (en) * 1988-05-19 1992-09-29 Mitsui Toatsu Chemicals Incorporated Method for producing of human tissue type plasminogen activator
DE68925971T2 (de) 1988-09-23 1996-09-05 Cetus Oncology Corp Zellenzuchtmedium für erhöhtes zellenwachstum, zur erhöhung der langlebigkeit und expression der produkte
KR0132666B1 (en) * 1989-03-14 1998-04-14 Hitachi Kk Method for controlling cultivation conditions for animal cells
JPH0396383A (ja) 1989-09-08 1991-04-22 Riso Kagaku Corp 画像形成装置
DE10399023I2 (de) 1989-09-12 2006-11-23 Ahp Mfg B V TFN-bindende Proteine
US5096816A (en) * 1990-06-05 1992-03-17 Cetus Corporation In vitro management of ammonia's effect on glycosylation of cell products through pH control
US5122469A (en) * 1990-10-03 1992-06-16 Genentech, Inc. Method for culturing Chinese hamster ovary cells to improve production of recombinant proteins
GB9022545D0 (en) * 1990-10-17 1990-11-28 Wellcome Found Culture medium
GB2251249B (en) * 1990-12-28 1995-06-21 Mogam Biotech Res Inst High-density medium for animal cell culture
AU3144193A (en) * 1991-11-21 1993-06-15 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Controlling degradation of glycoprotein oligosaccharides by extracellular glycosisases
US5447851B1 (en) * 1992-04-02 1999-07-06 Univ Texas System Board Of Dna encoding a chimeric polypeptide comprising the extracellular domain of tnf receptor fused to igg vectors and host cells
JPH07504203A (ja) * 1992-09-15 1995-05-11 イミュネックス・コーポレーション 腫瘍壊死因子アンタゴニストを用いるｔｎｆ−依存性炎症の治療方法
JP3523293B2 (ja) † 1993-07-19 2004-04-26 住友製薬株式会社 インターフェロンの産生増強法
US5705364A (en) † 1995-06-06 1998-01-06 Genentech, Inc. Mammalian cell culture process
JP5515221B2 (ja) † 2008-01-28 2014-06-11 日油株式会社 ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルの製造方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN1166772C (zh) 2004-09-15
ES2324046T5 (es) 2020-09-14
ATE425245T2 (de) 2009-03-15
EP0832189B1 (en) 2005-08-17
SI1609853T1 (sl) 2009-08-31
IL122398A0 (en) 1998-06-15
DE69635076T2 (de) 2006-06-01
ATE302266T1 (de) 2005-09-15
PL185484B1 (pl) 2003-05-30
EP1609853B1 (en) 2009-03-11
PL323737A1 (en) 1998-04-14
JP2007190024A (ja) 2007-08-02
DE69635076T3 (de) 2009-01-15
CA2220684C (en) 2002-11-12
SA96170351B1 (ar) 2006-07-04
EP1609853A1 (en) 2005-12-28
KR100496356B1 (ko) 2005-11-25
SI0832189T2 (sl) 2008-12-31
SK282658B6 (sk) 2002-11-06
SI0832189T1 (sl) 2006-02-28
TR199701543T1 (xx) 1998-05-21
AR004940A1 (es) 1999-04-07
WO1996039488A1 (en) 1996-12-12
DE69635076D1 (de) 2005-09-22
EA001215B1 (ru) 2000-12-25
BR9609150A (pt) 1999-02-23
EP0832189A1 (en) 1998-04-01
HUP9900920A3 (en) 2001-06-28
BG102101A (en) 1998-07-31
DE69637867D1 (de) 2009-04-23
EP1609853B2 (en) 2020-01-22
UA47428C2 (uk) 2002-07-15
JPH11507523A (ja) 1999-07-06
CZ293719B6 (cs) 2004-07-14
CA2220684A1 (en) 1996-12-12
ES2248812T3 (es) 2006-03-16
IS2614B (is) 2010-04-15
KR19990022473A (ko) 1999-03-25
EP0832189B2 (en) 2008-07-09
NO975674L (no) 1998-02-06
DK0832189T4 (da) 2008-10-27
NO322276B1 (no) 2006-09-04
US5705364A (en) 1998-01-06
EA199700364A1 (ru) 1998-04-30
NO975674D0 (no) 1997-12-05
CN1186514A (zh) 1998-07-01
MX9709452A (es) 1998-06-30
JP4348376B2 (ja) 2009-10-21
TW516962B (en) 2003-01-11
AU6095296A (en) 1996-12-24
DK1609853T3 (da) 2009-06-02
DK0832189T3 (da) 2005-11-21
IL122398A (en) 2001-12-23
SI1609853T2 (sl) 2020-07-31
NZ310202A (en) 1999-10-28
GEP20012519B (en) 2001-08-27
SK167097A3 (en) 1998-07-08
ES2324046T3 (es) 2009-07-29
IS4626A (is) 1997-12-03
AR011439A2 (es) 2000-08-16
HK1087151A1 (en) 2006-10-06
PT1609853E (pt) 2009-06-09
ES2248812T5 (es) 2008-12-16
BG63213B1 (bg) 2001-06-29
AU717847B2 (en) 2000-04-06
HU226420B1 (en) 2008-12-29
MY113496A (en) 2002-03-30
HUP9900920A2 (hu) 1999-07-28
HK1017903A1 (en) 1999-12-03
RO120267B1 (ro) 2005-11-30
OA10753A (en) 2002-12-11
ZA964776B (en) 1997-12-08
DK1609853T4 (da) 2020-04-06
TW426734B (en) 2001-03-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ390997A3 (cs) Způsob kontroly sialyzace proteinů produkovaných savčími buněčnými kulturami
US5721121A (en) Mammalian cell culture process for producing a tumor necrosis factor receptor immunoglobulin chimeric protein
US7666416B2 (en) Mammalian cell culture process
JP5557736B2 (ja) 細胞培養における低温および低ｐＨの使用
JP2024517711A (ja) 高シアル酸付加細胞
HK1087151B (en) Process for controlling sialylation of proteins produced by mammalian cell culture
MXPA97009452A (en) Process to control the sialilation of proteins produced by cultivation of mamife cells
CN117242175A (zh) 超唾液酸化细胞
HK1017903B (en) Process for controlling sialylation of proteins produced by mammalian cell culture

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic
MK4A Patent expired

Effective date: 20160606