CZ41897A3 - Structures of nucleic acids for controlled expression of genes, cells containing such structures and their use for preparing medicaments - Google Patents

Structures of nucleic acids for controlled expression of genes, cells containing such structures and their use for preparing medicaments Download PDF

Info

Publication number
CZ41897A3
CZ41897A3 CZ97418A CZ41897A CZ41897A3 CZ 41897 A3 CZ41897 A3 CZ 41897A3 CZ 97418 A CZ97418 A CZ 97418A CZ 41897 A CZ41897 A CZ 41897A CZ 41897 A3 CZ41897 A3 CZ 41897A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
nucleic acid
sequence
page
acid construct
cells
Prior art date
Application number
CZ97418A
Other languages
English (en)
Inventor
Rolf Prof Dr Muller
Jork Dr Zwicker
Hans Harald Prof Dr Sedlacek
Original Assignee
Hoechst Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hoechst Ag filed Critical Hoechst Ag
Publication of CZ41897A3 publication Critical patent/CZ41897A3/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/007—Vector systems having a special element relevant for transcription cell cycle specific enhancer/promoter combination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/80—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates
    • C12N2830/85—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates mammalian

Landscapes

  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Description

Vynález se týká přípravy konstruktů nukleových kyselin (NK) pro expresi genů regulovanou buněčným cyklem, buněk obsahujících takové konstrukty jakož i jejich využití pro výrobu léků.
Dosavadní stav techniky
Byly popsány konstrukty NK, které mohou být využívány v genově technologii a předevšímv genově terapii onemocnění. Při genové terapii se zavedou geny do organizmu, ve kterém se mají exprimovat. Regulace exprese takových genů je důležitá pro terapeutický efekt genové terapie.
Podstata vynálezu
Předmětem vynálezu jsou konstrukty nukleových kyselin, které mohou být využity v genové terapii. Konstrukty nukleových kyselin podle vynálezu pro buněčně nebo virově specifickou, jakož i pro buněčným cyklem regulovanou expresi nejméně jednoho z genů, obsahují následující komponenty:
a) aktivátorovou sekvenci, která může aktivovat buněčně nebo virově specifickou bazální transkripci.
b) promotorový modul obsahující nukleotidovou sekvenci, která váže alespoň jeden protein rodiny E2F a jinou nukleotidovou sekvenci, která váže nejméně jeden protein rodiny CHF, a která může dále obsahovat sekvenci iniciující transkripci.
-2c) strukturní gen kódující účinnou látku, která je exprimována jednak buněčně nebo virově specificky, jakož i v závislosti na buněčném cyklu. j
Promotorový modul konstruktu nukleových kyselin (b) podle vynálezu je nukleotidová sekvence, která váže alespoň jeden protein rodiny E2F. Tato sekvence ve výhodném provedení vynálezu obsahuje nukleotidovou sekvenci CTTGGCGGG nebo funkčně podobnou (analogickou) sekvenci, jako například TTTCGCGCC (E2F-vazebné místo pro DHFR gen) nebo TTTCGCGGC (E2F-1 vazebné místo).
Promotorový modul (b) podle vynálezu obsahuje také nukleotidovou sekvenci, která váže alespoň jeden protein rodiny CHF. Tato sekvence obsahuje ve výhodném provedení vynálezu nukleotidovou sekvenci TAGGAAA nebo funkčně podobnou (analogickou) sekvenci.
Promotorový modul (b) konstruktů nukleových kyselin podle vynálezu může brzdit účinek aktivátorově sekvence lokalizované proti směru transkripce (upstream sequence) v GO a Gl-fázi buněčného cyklu, a tak inhibovat expresi po směru transkripce lokalizovaných genů (c) (downstream sequence).
Ve výhodném provedení vynálezu jsou konstrukty nukleových kyselin aktivátorových sekvencí (a) buněčně nebo virově specifické.
Konstrukty nukleových kyselin se výhodně skládají z DNA. Pod pojmem konstrukty nukleových kyselin (NK) se rozumí umělé výtvory z nukleových kyselin, které se mohou transkribovat v cílových buňkách. Ve výhodném provedení vynálezu jsou vloženy do vektoru, přičemž jsou obzvláště výhodné plazmidové a virové vektory.
Podle vynálezu může být prostřednictvím konstruktů nukleových kyselin nějaký gen (c) exprimován jednak buněčně, nebo virově specificky, jakož i v závislosti na buněčném
-3cyklu, přičemž se výhodně jedná o gen, který kóduje farmakologicky aktivní látku nebo enzym, který štěpí inaktivní předstupeň léčiva v jeho aktivní formu.
Konstrukty nukleových kyselin podle vynálezu obsahují aktivační sekvenci (a) , která je výhodně vybrána ze skupiny promotorů nebo enhancerů (zesilovačů), které aktivují transkripci v endotheliálních buňkách, v buňkách hladkých svalů, v krvetvorných buňkách, lymfocytech, makrofázích, v tumorových buňkách nebo gliových buňkách, nebo z promotorových, eventuálně z enhancerových sekvencí virů HBV (virus hepatitidy Β) , HCV (virus hepatitidy C) , HSV (herpes simplex virus), HPV (lidský papilomavirus), EBV (virus Epsteina-Barrové), HTLV (lidský T-leukemický virus), HIV (virus lidské imunodeficiencie).
Předmětem předloženého vynálezu jsou také izolované buňky, které obsahují konstrukt nukleových kyselin podle vynálezu.
Ve výhodném provedení vynálezu se konstrukty nukleových kyselin podle vynálezu, nebo buňky, které je obsahují, využívají k výrobě léků pro léčbu nemoci, která se objevuje s nadměrným množením buněk, přičemž příprava léků zahrnuje zavedení konstruktu nukleových kyselin do cílové buňky a jeho expresi ve stadiu buněčné proliferace (dělení).
Konstrukty nukleových kyselin podle vynálezu se v této formě nevyskytují v přírodě, to znamená, že gen (c) konstruktu NK není přirozeně kombinovaný s aktivátorovou sekvencí (a) a promotorovým modulem (b).
Pod pojmem aktivační sekvence (a) se rozumí částečný úsek genu, na který se mohou vázat regulační proteiny, takzvané transkripční faktory, které jako celek aktivují geny lokalizované po směru transkripce.
-4Jako sekvence po směru transkripce (down stream sequence) se označují ty oblasti DNA, které le^í ve směru transkripce, naproti tomu sekvence, které jsou ^spořádané v opačném směru, se označují jako sekvence proti směru transkripce (up stream sequence).
Na promotorovy modul podle vynálezu, který je od aktivační sekvence lokalizovaný po směru transkripce, se vážou transkripční faktory rodiny E2F, jakož i transkripční faktory rodiny CHF.
K rodině E2F-molekul patří například molekuly E2F1, E2F2, E2F3, E2F4 a E2F5, které mohou být eventuálně v komplexu s DPI, DP2 nebo DP3. K E2F-molekulám patří aktivující dimerní komplexy, jako například E2F1-DP1 a trimerní komplexy jako například E2Fl-DPl-pRb (viz Bandara a další, Nátuře, 252, strana 249 (1991); Chellappan a další, Cell 65, strana 1053 (1991); Chittenden a další, Cell 65, strana 1073 (1991); Helin a další, Cell 70, strana 337 (1992); Kaelin a další, Cell 70, strana 351 (1992)). Komplexy E2F4-DP1 a E2F4-DPl-pl07 byly popsány například v publikaci Beijersbergen a další, Genes Dev. 8, strana 2680 (1994) a Ginsberg a další, Genes Dev. 8, 2665 (1994). Dále by byly popsány odpovídající komplexy obsahující E2F2, E2F3, DP2 a DP3.
Transkripční faktory, ke kterým patří E2F-molekuly, mají společnou vlastnost, že obstarávají vztah mezi expresí genů a stavem, ve kterém se buňka nachází. V klidových buňkách je transkripce genů velmi malá, naproti tomu v dělících se buňkách je transkripce zvýšená. V experimentu s kultivovanými buňkami může být stimulace exprese dosáhnuta přidáním séra, výhodně fetálního telecího séra, ke klidovým buňkám.
Buňky se množí buněčným dělením, přičemž se genom buňky před mitózou zreplikuje. Nedělící se, klidové buňky se nacházejí ve fázi označené jako G0 nebo jsou v buněčné progresi inhibované G1 fází. Když začne buněčné dělení,
-5opouštějí buňky GO fázi eventuálně Gl blok. G1 fáze je obvykle poměrně dlouhotrvající fáze. V GO a G1 fázi se obsah DNA buňky nachází v diploidním stavu. Na G1 fázi navazuje S-fáze, ve které probíhá syntéza DNA a ve které je genom duplikován. Na ni navazuje druhá G-fáze (G2-fáze), ve které je buňka v tetraploidním stavu. Poté probíhá mitóza a buňka se dostane opět do Gl- nebo GO fáze.
Gen B-myb participuje na buněčném dělení. Transkripce genů B-myb vzrůstá (například u myších fibroblastů) v pozdní Gl-fázi buněčného cyklu a je nejvýraznější v S-fázi, viz Lam a další, EMBO J. 12, strana 2705 (1993). Nukleotidová sekvence CTTGGCGGGAG je součástí promotorové sekvence genu B-myb a zúčastňuje se represe genů v GO a Gl fází (Lam a další, EMBO J. 12, strana 2705 (1993)) . Sekvence TTTCGCGC je součástí promotoru E2a adenoviru a reprezentuje zónu aktivujících E2F-vazebných míst, viz Mudryj a další, EMBO J. 9, strana 2179 (1990) .
Určitá oblast promotorové sekvence genu B-myb může řídit expresi jiného genu, který je součástí konstruktů nukleových kyselin podle vynálezu. Tato sekvence, podle vynálezu označená jako promotorový modul (b) , se podstatně účastní na regulaci především represe po směru transkripce lokalizované v genu v GO a v rané Gl fázi.
Podle vynálezu má používaný promotorový modul (b) nukleotidovou sekvenci, na kterou se mohou vázat transkripční faktory E2F rodiny. Jedná se o následující sekvence:
CTTGGCGGG Sekvence Id. č. 1 nebo analogické varianty této sekvence jako například
TTTCGCGCC Sekvence Id. č. 2
TTTCGCGGC
Sekvence Id. č. 3
-6Dále má podle vynálezu promototový modul (b) sekvenci lokalizovanou od E2F místa na 3'-konci po směru i^ranskripce, na kterou se může vázat molekula rodiny CHF. Tato ňukleotidová sekvence je nutná pro represi a navíc kooperuje při represi s vazebným místem pro E2F. Tato sekvence obsahuje obsahuje sekvenci
TAGGAAA Sekvence Id. č. 4 nebo funkčně analogickou variantu této sekvence.
V genu B-myb leží sekvence 1 a sekvence 4 promotorového modulu podle vynálezu v následujícím uspořádání:
CTTGGCGGGAGATAGGAAAGT Sekvence Id. č. 5
Promotorový modul obsahuje tuto sekvenci ve zvláště výhodném provedení vynálezu.
Tento promotorový modul podle vynálezu má vysokoafinitní vazebné místo pro E2F. Dochází k překvapující vazbě molekul E2F na tuto sekvenci (především CTTGGCGGG) in vivo, tedy v živých buňkách (v protikladu k biochemickým (in vitro) vazebným datům, viz Lam a další, EMBO J. 12, strana 2705 (1993). Tato vazba je časově omezená na G0- a rannou Gl-fázi, zatímco v S, G2 a M fázi (to znamená při intenzivnější transkripci genu B-myb) není prokazatelná.
Dále nebylo známo, že pro účinnou represi je potřebný další vazebný region pro proteiny, lokalizovaný po směru transkripce od vazebného místa E2F z rodiny CHF (výhodně TAGGAAA).
Protože v okamžiku transkripce genu B-myb nebyla zjištěna žádná vazba proteinu E2F na nukleotidovou sekvenci CTTGGCGGGAG, nehrají aktivované E2F-dimery, které jsou v buňkách k dispozici, žádnou znatelnou roli. Tím jereprese zprostředkovaná molekulou E2F rozhodujícím mechanizmem v regulaci B-myb.
-7Uspořádání konstruktů nukleových kyselin podle vynálezu může být schématicky znázorněno následovně:
5'konec
Aktivátorova sekvence (výhodně buněčně nebo virově specifická
Promotorovy modul regulovaný buněčným cyklem a obsahující vazebné sekvence pro transkripční faktory rodin E2F a CHF
Stuktumí gen pro účinnou látku
3'konec
Aktivátorově sekvence a strukturní gen pro účinnou látku konstruktů nukleových kyselin se podle vynálezu volí dle účelu použití. Především jsou to následující možnosti použití:
1. Terapie tumorů a chronických zánětů inhibici proliferujících endotheliálních buněk
1.1.a. Aktivátorově sekvence aktivovaná v endotheliálních buňkách
Výhodné aktivátorové sekvence podle vynálezu jsou takové sekvence, které regulují gen, popřípadě elementy promotorů pro geny, které kódují proteiny vyskytující se především v buňkách endotélií, nebo v buňkách v bezprostředním sousedství s proliferujícími endotheliálními buňkami.
Některé z těchto proteinů byly popsány, viz Burrows a další, Pharmac. Therp. 64, strana 155, (1994) a Plate a další, Brain Pathol. 4, strana 207 (1994) . Především se k těmto endotheliálně-specifickým proteinům například počítají:
- mozkově-specifický, endotheliální glukóza-1 přenáseč, jeho promotorově sekvence byla popsána, viz Murakami a další (J. Biol. Chem. 267, strana 9300, (1992)).
- endoglin, jeho promotorově sekvence byla popsána, viz
Bellon a další (Eur. J. Immunol. 23, strana 2340 (1993)) a Ge a další (Gene 138, strana 201 (1994)) .
-8- receptory VEGF. Byly rozlišeny dva receptory, viz Plate a další, Int. J . Cancer 59, strana 520 (1994))
VEGF-receptor-1 (ftl-1), viz de Vries a další, Science 255, strana 989 (1992)) a
VEGF-receptor-2 (flk-1, KDR), viz Terman a další, BBRC 187, strana 1579 (1992)
Oba receptory jsou téměř výlučně exprimované na endotheliálních buňkách, viz Senger a další, Cancer Metast. Rev. 12, strana 303 (1993).
- ostatní endotheliálně specifické receptor-tyrozinkinázy til-1 nebo til-2, viz Partanen a další, Mol. Cell. Biol. 12, strana 1698 (1992), Schnůrch a Risau, Development
119, strana 957 (1993), Dumont a další, Oncogene 7, strana 1471 (1992)).
receptor pro B61 (Eck-receptor), viz Bartley a další, Nátuře 368, strana 558 (1994), Pandey a další, Science 268, strana 567 (1995) , van der Geer a další, Ann. Rev. Cell. Biol. 10, strana 251 (1994)).
- B61, molekula B61 je ligandem pro B61-receptor, viz Holzman a další, J. Am. Soc. Nephrol. 4, strana 466 (1993),
Bartley a další, Nátuře 368, strana 558 (1994)
- Endothelin, a to především
Endothelin B, jeho promotorova sekvence byla popsána, viz Benatti a další, J. Clin. Invest. 91, strana 1149 (1993) .
Endothelin-1, jeho promotorové sekvence byla popsána Wilsonem a dalšími, Mol. Cell. Biol. 10, strana 4654 (1990).
- Receptory pro endothelin, především receptor pro endothelin-B, viz Webb a další, Mol. Pharmacol. 47,
-9strana 730 (1995); Haendler a další, J. Cardiovasc.
Pharm. 20, strana 1(1992).
Receptor pro manóza-6-fosfát, jeho promotorova sekvence byla popsána, viz Ludwig a další (Gene, 142, strana 311 (1994)), Oshima a další ( J. Biol. Chem. 263, strana 2553 (1988)) a Pohlmann a další (PNAS USA 84, strana
5575, (1987) ) .
von Willebrandův faktor, jeho promotorova sekvence byla popsána v publikaci Jahroudi a Lynch, Mol. Cell. Biol. 14, strana 999 (1994) ; Ferreira a další, Biochem. J.
293, strana 641 (1993) a Aird a další, PNAS USA 92, strana 4567 (1995)) .
IL-la, IL-ΐβ (interleukin la a 1β), jejich promotorové
sekvence byly popsány v publikacích Hangen a další, Mol.
Carcinog. 2, strana 68, (1986); Turner a další. , J.
Immunol. 143, strana 3556 (1989); Fenton a další , J.
Immunol. 138, strana 3972 (1987); Bensi a i další, Cell
Growth Diff. 1 , strana 491 (1990); Hiscott a další, Mol.
Cell. Biol. 13 , strana 6231 (1993) a Moři a další, Blood
84, strana 1688 (1994) .
IL-l-receptor, promotorové sekvence byla popsána, viz Ye a další, PNAS USA 90, strana 2295 (1993) .
VCAM-1 (adhezivní molekula vaskulárních buněk), promotorové sekvence byla popsána, viz Neish a další, Mol. Cell.
Biol, • 15, strana 2558 (1995); Ahmad a další, J. Biol
Chem. . 270, strana 8976 (1995) ; Neish a další, J. Exp
Med. 176, strana 1583 (1992) , Iademarco a další, J
Biol. , Chem, . 267, strana 16323 (1992) a Cybulsky a další
PNAS USA 88, strana 7859 (1991)
syntetické aktivátorové sekvence, jako alternativa k přirozeným endotheliálnš specifickým promotorům se dají použít také syntetické aktivátorové sekvence, které se skládají z oligomérních vazebných míst pro transkripční
-10faktory, které jsou preferenčně nebo selektivně aktivní v endotheliálních buňkách. Příkladem je yranskripční faktor GATA-2, jehož vazebné místo v; genu pro endothelin-1 je 5-TTATCT-3' , viz Lee a další, J. Biol. Chem. 266, strana 16188 (1991); Dorfmann a další, J. Biol. Chem. 267, strana 1279 (1992) a Wilson a další, Mol. Cell. Biol. 10, strana 4854 (1990).
1.1b Aktivátorově sekvence aktivované v buňkách v sousedství aktivovaných endotheliálních buněk
U proliferujících endotheliálních buněk se stávají sousední buňky přístupné pro makromolekuly z krevního řečiště prostřednictvím otevřených těsných spojení (tight junctions) . Pro vzájemné funkční a anatomické vztahy jsou buňky v sousedství aktivovaných endotheliálních buněk cílovými buňkami v smyslu tohto vynálezu.
- VEGF, regulační sekvence genu VEGF jsou:
promotorové sekvence genu VEGF (5' hraniční oblast), viz Michenko a další, Cell. Mol. Biol. Res. 40, strana 35 (1994); Tischer a další, J. Biol. Chem. 266, strana 11947 (1991) nebo enhancerové sekvence genu VEGF (3' boční oblast), viz Michenko a další, Cell. Mol. Biol. Res. 40, strana 35 (1994) nebo gen c-Src, viz Mukhopadhyay a další, Nátuře 375, strana 557 (1995); Bonham a další, Oncogene 8, strana 1973 (1993); Parker a další, Mol. Cell. Biol. 5, strana 831 (1985); Anderson a další, Mol. Cell. Biol. 5, 1122 (1985) nebo gen V-Src, viz Mukhopadhyay a další, Nátuře 375, strana 557 (1995); Anderson a další, Mol. Cell. Biol. 5, 1122 (1985); Gibbs a další, J. Virol. 53, strana 19 (1985)
-11- receptory pro steroidní hormony a jejich promotorově elementy (Truss a Beato, Endocr. Rev. 14, strana 459 (1993)), především
- virový promotor tumoru myší prsní žlázy (mouše mammary tumor virus, MMTV), cDNA sekvence promotorové oblasti LTR (long terminál repeat, dlouhá koncová repetice) viru MMTV byla popsána, viz Chalepakis a další, Cell 53, strana 371 (1988) a Truss a Beato (Endocr. Rev. 14, strana 459 (1993) .
1.2 Strukturní geny pro protinádorové (nebo protizánětlivé) látky.
1.2.a Inhibitory proliferace.
Za protinádorové a protizánětlivé látky podle vynálezu jsou považované DNA sekvence kódující proteiny, které inhibují proliferaci endotheliálních buněk. Patří sem například sekvence DNA pro:
- retinoblastomový protein (pRb/pllO) a jeho analoga pl07 a pl20
- protein p53
- protein p21 (WAF-1)
- protein pl6
- CdK-inhibitory
- protein GADD45
- protein bak
Aby se zabránilo rychlé intracelulární inaktivaci těchto inhibitorů buněčného cyklu, jsou využívány výhodně takové geny, které vykazují mutace v inaktivačních místech exprimovaných proteinů, přičemž není nijak omezena jejich funkce.
-12Retinoblastomový protein (pRb) a jeho příbuzní pl07 a pl30 jsou inaktivovány prostřednictvím fosforylape. Výhodně jsou tudíž využívány sekvence cDNApro pRb/pllO-/ pl07- nebo pl30-protein, které mají takové bodové mutace, že místa, kde je původně kódovaný protein fosforylován, jsou zaměněna za nefosforylovatelné aminokyseliny.
1.2b) Inhibitory angiogeneze
Za protinádorové eventuálně protizánětlivé látky jsou považovány sekvence DNA kódující proteiny, které inhibují angiogenezi. K těmto proteinům se počítají například:
- tkáňový faktor (tissuefactor, TF) a jeho fragmenty schopné koagulace
- inhibitor-1 plasminogenového aktivátoru (PAI-1)
- PAI-2
- PAI-3
- angiostatin
- interferony
IFN-a
IFN-β
IFN-γ
- faktor krevních destiček 4 (platelet factor)
- IL-12 (interleukin-12)
- TIMP-1
- TIMP-2
- TIMP-3
- leukémii inhibující faktor (Leukemia Inhibitor Factor LIF)
-131.2c) cytostatické a cytotoxické proteiny
Za protinádorové eventuálně protizánětlivé látky se také považují sekvence DNA pro proteiny, které přímo nebo nepřímo vykazují cytostatické účinky na tumory. K nim počítáme především:
- protilátky a štěpné produkty protilátek
- perforin
- granzym
- IL-2
- IL-4
- IL-12
- interferony, jako například
IFN-a
IFN-β
IFN-γ
- TNF (faktor nekrotizujíci tumory)
- TNF-a
- TNF-β
- onkostatin M
- magainín a jeho deriváty, viz Cruciani a další, PNAS USA 88, strana 3792 (1991); Peck-Miller a další, Cancer
Chemoth. Pharmac. 32, strana 109 (1993)
- sfingomyelináza (1994) . (Jarvis a další, PNAS USA 91, strana 73
1.2d) Induktory zánětu
Za protinádorovou látku je dále považována sekvence DNA
proteinu, který přímo eventuálně dodatečně stimuluje k
-14protinádorovému účinku záněty a tím přispívá k eliminaci tumorových buněk. K nim jsou předevšímpočítány: j
- RANTES (MCP-2) '
- chemotaktický a aktivační faktor monocytů (monocyte chemotactic and activating factor MCAF)
- IL-8
- makrofágový protein-1 zánětu (macrophage inflammatory protein-1, ΜΙΡ-la, - β)
- neutrofily aktivující protein-2 (neutrophile activating protein-2, NAP-2)
- IL-3
- IL-5
- inhibiční faktor lidské leukémie (human leukemia inhibitory factor, LI?)
- IL-7
- IL-11
- IL-13
- GM-CSF
- G-CSF
- M-CSF
- bakteriální proteiny aktivující komplement
- faktor kobřího jedu (Cobra Venom Factor, CVF) a jeho částečné sekvence.
Jako účinné látky vynálezu podle vynálezu mohou být k použity také DNA sekvence kódující fúzní proteiny složené z vybraného cytokinů a Fc-části lidského imunoglobulinu. Takové sekvence DNA a jejich příprava byly popsány v EP 0464 633 Al.
1.2e) Enzymy aktivující prekurzory cytostatika
-15Za protinádorové eventuálně protizánětlivé látky je nutné také považovat sekvence DNA pro enzym, který je schopen převést prekurzor protinádorové účinné látky na aktivní protinádorovou látku.
Takové enzymy, které stepí inaktivní prekurzory (prodrugs) v aktivní cytostatika (drugs), jsou již dle příslušných prekurzorů i dle aktivních léků přehledně popsány, viz Deonarain a další, Br. J. Cancer 70, 786 (1994); Mullen,
Pharmac. Ther. 63, strana 199 (1994); Harris a další, Gene
Ther. 1, strana 170 (1994) .
Například je možné využít sekvence DNA pro následující enzymy:
- thymidinkináza viru Herpes Simplex, viz Garapin a další,
PNAS USA 76, strana 3755, (1979); Vile a další, Cancer
Res. 53, strana 3860 (1993); Wagner a další, PNAS USA
78, strana 1441 (1981); Moelten a další, Cancer Res. 46, strana 5276 (1986); J. Nati. Cancer Inst. 82, strana 297 (1990)) .
- thymidinkináza viru Varicella Zoster, viz Huber a další,
PNAS USA 88, strana 8039 (1991); Snoek, Int. J.
Antimicrob. Agents 4, strana 211(1994)
- bakteriální nitroreduktáza, viz Michael a další,· FEMS
Microbiol. Letters 124, strana 195 (1994); Bryant a další, J. Biol. Chem. 266, strana 4126 (1991); Watanabe a další, Nucleic Acids Res. 18, strana 1059 (1990))
- bakteriální β-glukuronidáza, viz Jefferson a dalsi, PNAS
USA 83, strana 8447, (1986)
- rostlinná β-glukuronidáza ze Secale cereale, viz Shulz a další, Phytochemistry 26, strana 933 (1987))
- lidská β-glukuronidáza, viz Bosslet a další, Br. J. Cancer
65, strana 234 (1992); Oshima a další, PNAS USA 84, strana 685 (1987)
-16lidská karboxypeptidáza (CB) například:
CB-A žírných buněk, viz Reynolds a dalšíl, J. Clin. Invest. 89, strana 273 (1992)
CB-B pankreasu, viz Yamamoto a další, J. Biol. Chem. 267, strana 2575 (1992); Catasus a další, J. Biol. Chem.
270, strana 6651 (1995)) bakteriální karboxypeptidáza, viz Hamilton a další, J. Bacteriol. 174, strana 1626 (1992); Osterman a další, J.
Protein Chem. 11, strana 561 (1992) bakteriální β-laktamáza, viz Rodrigues a další, Cancer Res. 55, strana 63, (1995); Hussain a další, J. Bacteriol.
164, strana 223 (1985) ; Coque a další, EMBO J. 12, strana 631 (1993)) bakteriální cytozindeamináza, viz Mullen a další, PNAS USA 89, strana 33 (1992); Austin a další, Mol. Pharmac. 43, strana 380 (1993); Danielson a další, Mol. Microbiol. 6, Strana 1335 (1992) lidská kataláza eventuálně peroxidáza, viz Ezurum a další, Nucl. Acids Res. 21, 1607 (1993) fosfatázy, především lidská alkalická fosfatáza, viz Gum a další, Cancer Res. 50, strana 1085 (1990) lidská kyselá fosfatáza, viz Sharieff a další, Am. J. Hum. Gen. 49, strana 412 (1991) ; Song a další, Gene 129, strana 291, (1993); Tailor a další, Nucl. Acids Res. 18, strana 4928 (1990)) kyselá fosfatáza typu 5, viz Gene 130, strana 201 (1993) oxidázy, především lidská lysyloxidáza, viz Kimi a další, J. Biol. Chem. 270, strana 7176 (1995)
-1Ίlidská kyselá D-aminooxidáza, viz Fukui a další, J.
Biol. Chem. 267, strana 18631 (1992)
- peroxidázy, obzvláště lidská glutation peroxidáza, viz Chada a další,
Genomicis 6, strana 268 (1990); Ishida a další, Nucl.
Acids Res. 15, strana 10051 (1987) lidská peroxidáza eosinofilů, viz Ten a další, J. Exp.
Med. 169, strana 1757 (1989); Sahamaki a další, J. Biol.
Chem. 264, strana 16828 (1989)) lidská peroxidáza štítné žlázy, viz Kimura, PNAS USA 84,
5555 (1997)
K usnadnění sekrece enzymu může být v DNA nahrazena homologní signální sekvence heterologní sekvencí, která zlepší sekreci proteinu do extracelulárního prostoru.
Tak může být například signální sekvence β-glukuronidázy (nukleotidy na pozici 27 až 93; viz Oshima a další, PNAS USA 84, strana 685 (1987)) nahrazena signální sekvencí pro imunoglobulin (nukleotidy na pozici 63 až 107; Riechmann a další, Nátuře 332, strana 323 (1988)).
Dále jsou výhodné DNA kódující takové enzymy, které jsou díky bodovým mutacím ve zmenšené míře uskladňovány v lyzozómech a více sekretovány.
1.3. Kombinace několika protinádorových nebo protizánětlivých látek
Předmětem vynálezu jsou dále konstrukty nukleových kyselin, ve kterých existuje kombinace DNA-sekvencí několika stejných protinádorových nebo protizánětlivých látek (A,A) nebo odlišných protinádorových substancií(A,B). Jako regulační element se k expresi dvou DNA-sekvencí mezi ně vsouvá cDNA
-18vnitrogenověho místa pro nasednutí ribosomu internal ribosome site (IRES).
Aktivátorova sekvence
Promotorový modul regulovaný buněčným cyklem
Protínádorová látka A
Interní místo pro navázání ribozómu (ribosomal entry site)
Protinádorovi látka A
Takové IRES regulační elementy byly popsány, viz například Mountford a Smith, TIG, 11, strana 179 (1995); Kaufman a další, Nucl. Acids Res. 19, strana 4485 (1991); Morgan a další, Nucl. Acids Res. 20, strana 1293 (1992); Dirks a další, Gene 128, strana 247 (1993); Pelletier a Sonenberg, Nátuře 334, strana 320 (1988); Sugitomo a další, BioTechn. 12, strana 694 (1994) .
Ke spojení DNA pro protizánétlivou látku A (na 3' konci) a DNA pro protizánétlivou látku B (na 5' konec) mohou být využity cDNA IRES-sekvence Polioviru (nukleotidy na pozici 140 až 630 5' nepřekládané terminální části (UTR); viz Pelletier a Sonenberg, Nátuře 334, strana 320 (1988)).
Taková účinná látka má podle kombinace aditivní (A+A, A+Bl) nebo synergické účinky podle vynálezu.
2. Účinné látky k odstranění nedostatku tvorby krevních buněk
2.1. Výběr aktivátorových sekvencí pro buňky krvetvorby
Aktivátorové sekvence podle regulační sekvence respektive protein exprimovaný zvláště vynálezu výhodně využívají elementy genu, který kóduje intenzívně nebo selektivně krvetvorných buňkách. K takovým regulačním sekvencím patří promotorové sekvence pro geny cytokinů nebo jeho receptorů, jejichž exprese v nezralých krvetvorných buňkách (nebo v okolních buňkách, jako například v buňkách stromatu) poskytuje
-19jako účinnou látku žádaný cytokin, účinkující na krvetvorné buňky.
K takovým cytokinům působícím na nezralé buňky krvetvorby patří například:
- faktor kmenových buněk (Stem Cell Factor)
- IL-1
- IL-3
- IL-6
- GM-CSF
2.2. Výběr strukturních genů pro účinné látky použité v krvetvorných buňkách
Účinnou látkou podle vynálezu je sekvence DNA, jejíž protein po exprimaci způsobí proliferaci a/nebo diferenciaci krevních buněk.
3. Účinné látky pro terapii autoimunních onemocnění, alergií, zánětů a pro zamezení odhojení orgánů
3.1. Výběr aktivátorových sekvencí pro autoimunní onemocnění a j iné
Jakožto aktivátorové sekvence je možné využít promotorové sekvence genů pro proteiny, které jsou intenzivněji tvořené při imunitních reakcích v makrofázích a/nebo v lymfocytech. Takovými proteiny jsou například:
- IL-1
- IL-1 β
- receptor pro IL-1
- IL-2
- receptor pro IL-2
-20- IL-3
- receptor pro IL-3 (
I
- IFN-γ
- IL-4
- receptor pro IL-4
- IL-5
- IL-6
- LIF
- IL-7
- IL-10
- IL-11
- IL-12
- IL-13
- GM-CSF
- receptor pro GM-CSF
- proteiny integrin-β 2
3.2. Výběr genů pro účinné látky pro léčbu autoimunních onemocnění a jiných
Účinná látka podle vynálezu je sekvence DNA pro cytokin, chemokin, růstový faktor nebo jeden z jeho inhibitorů, protilátku, fragment protilátky, inhibitor enzymu nebo enzym. Výběr účinné látky se řídí podle léčeného základního onemocnění a vybrané promotorové sekvence.
4. Účinná látka k léčení artritidy
4.1. Výběr aktivátorové sekvence pro artritidu
Za aktivátorovou sekvenci podle vynálezu je považována nukleotidová sekvence (promotorově nebo enhancerová sekvence),
-21interagující s transkripčními faktory, která je tvořena nebo je aktivní v synoviálnich a zánětlivých buňkách. Výhodnými promotorovými sekvencemi podle vynálezu jsou regulační sekvence respektive elementy genů, které kódují proteiny exprimované obzvláště v synoviálnich buňkách a v buňkách zánětu.
4.2. Výběr strukturních genů účinných látek pro artritidu
Aktivní látkou podle vynálezu je sekvence DNA, která exprimuje protein inhibující přímo či nepřímo zánět například v kloubu a/nebo podporuje rekonstrukci extracelulární matrix (chrupavky, vazebné tkáně) v kloubu.
5. Příprava účinné látky proti původci infekce
Účinná látka může být připravená ve dvou základně rozdílných formách
- pro léčbu virových infekcí a parazitárních invazí nebo
- k ochraně před infekčními onemocněními způsobenými viry, bakteriemi, nebo parazity.
K ochraně před infekčními onemocněními slouží očkovací látky. Možnosti konvenčních cest výroby účinných očkovacích preparátů jsou vsak omezené, viz Brown, Int. J. Technol. Assessm. Health Care 10, strana 161 (1994); Ellis, Adv. Exp. Med. Biol. 327, strana 263 (1992) ; Arnon a další, FASEB J. 6, strana 3265 (1992) .
Důsledkem toho byl vývoj technologie DNA-vakcinace. DNA-vakcíny však kladou vysoké požadavky na bezpečnost a zamezení vedlejších účinků, viz Fynan a další, Int. J. Immunopharm. 17, strana 79 (1995). Donnelly a další, Immunol.
2, strana 20 (1994) .
-22Účinné látky k ochraně před infekčním onemocněním podle vynálezu vykazují vysokou mírou bezpečnosti s johledem na jejich buněčnou specifitu a regulaci buněčným cyklep.
5.1. Výběr aktivátorových sekvencí
a) k léčení infekčních onemocnění:
Za aktivátorové sekvence jsou zvoleny promotorové sekvence buněčných genů, jejichž aktivita se obzvláště mění ve spojení s bakteriální a parazitární infekcí nebo promotorové sekvence takových virů, které infikované buňky transformují a podnítí je k proliferaci.
K takovým virům patří například HBV, HCV, HSV, HPV, HIV, EBV a HTLV.
5.2. Výběr strukturních genů pro účinné látky a) pro léčení infekčních onemocnění
Za účinnou látku je zvolena taková DNA proteinu, který vykazuje cytostatické, cytotoxické, antibakteriální nebo antivirální účinky. Příklady pro cytotoxické a cytostatické proteiny byly uvedeny ji výše. Jako příklad pro nebo antivirální proteiny je možné vzít fragmenty protilátek. Při volbě enzymu je k tomu, zda enzym poskytuje ze stěpitelného antibakteriální, antivirální, cytotoxicky nebo antibakteriální protilátky nebo přihlíženo prekurzoru antiparazitárně účinnou látku.
Účinnými látkami podle vynálezu jsou antivirálně účinné cytokiny a růstové faktory. K nim se počítají například sekvence DNA kódující následující účinné látky:
- IFN-a
- IFN-β
- IFN-γ
-23- TNF-β
- TNF-α
- IL-1
- TGF-β
Jako účinné látky ve smyslu vynálezu mohou být využity také sekvence DNA fúzních proteinu mezi cytokinem, růstovým faktorem nebo extracelulární částí receptoru a Fc-částí lidského imunoglobulinu. Takové sekvence a jejich výroba byly popsány například v EPA 0464 633 Al.
b) k ochraně před infekčními onemocněními
Jako účinná látka je zvolena DNA pro protilátku nebo fragment protilátky se specifitou proti původci infekce, nebo DNA pro takový protein původce infekce, který imunitní reakcí (to znamená prostřednictvím vazby protilátky a/nebo prostřednictvím cytotoxických T-lymfocytů) způsobí neutralizaci a/nebo odstínění původce. Takové neutralizační antigeny se již používají jako očkovací antigeny, viz. přehled Ellis, Adv. Exp. Med. Biol. 327, strana 263 (1992).
6. Účinné látky k léčení leukémií a tumorů
6.1. Výběr aktivátorových sekvencí pro leukémie a tumory.
Za aktivátorovou sekvenci je považována nukleotidová sekvence (promotorové nebo enhancerové), která je vytvořena nebo je aktivní v leukemických nebo tumorových buňkách, a která interaguje s transkripčními faktory.
Výhodné aktivátorové sekvence podle vynálezu jsou regulační sekvence respektive elementy genů, které kódují proteiny tvořené předevšímv leukemických a tumorových buňkách.
-246.2. Výběr strukturního genu pro látky účinně v leukemických a nádorových buňkách j
Za účinnou látku ve smyslu vynálezu je považována sekvence DNA kódující protein, který po exprimaci inhibuje proliferaci buněk a to předevšímbuněk tumorových a leukemických. K těmto inhibitorům buněčného cyklu patří například sekvence DNA pro cytostatickě a cytotoxické proteiny a enzymy, jak již byly popsány.
Za inhibitor buněčného cyklu je dále považována sekvence DNA, která exprimuje protein vykazující přímý nebo nepřímý cytostatický nebo cytotoxický účinek na leukémie a tumory.
7. Látky účinné v inhibici proliferace buněk hladkých svalů při ucpání cév
7.1. Výběr aktivátorové sekvence pro buňky hladkého svalu
Jako aktivátorově sekvence podle vynálezu jsou výhodně využívány regulační sekvence respektive elementy genů, kódujících proteiny tvořené přednostně v buňkách hladkých svalů.
7.2. Výběr strukturních genů látek účinných v buňkách hladkého svalu
Za účinné látky podle vynálezu jsou považovány sekvence DNA, které exprimuji protein inhibující proliferaci buněk hladkého svalu. K těmto inhibitorům proliferace patří výše zmíněné proteiny.
Za účinnou látku je však také považována sekvence DNA kódující enzym, který mění inaktivní prekurzor cytostatika ve formu aktivní.
8. Účinné látky pro inhibici nebo aktivaci koagulace
8.1. Výběr aktivátorové sekvence k inhibici nebo aktivaci srážení
-25Jako aktivátorové sekvence podle vynálezu jsou výhodně využívány regulační sekvence respektive elementy genů, které kódují proteiny prokázané v buňkách hladkého svalu, v aktivovaných endotheliálních buňkách, v aktivovaných lymfocytech nebo v aktivovaných makrofázích.
a) buňky hladkého svalu
Příklady promotorových sekvencí genů exprimovaných v buňkách hladkého svalstva již byly uvedeny.
b) aktivované endotheliální buňky
Příklady proteinů, které jsou přednostně tvořeny v aktivovaných endotheliálních buňkách byly popsány, viz Burrows a další (Pharmac. Therp. 64, strana 155 (1994)). K těmto proteinům produkovaným intenzivněji v endotheliálních buňkách se počítají především proteiny, které již byly popsány výše a to i se svými promotorovými sekvencemi .
c) aktivované makrofágy a/nebo aktivované lymfocyty.
Za aktivátorové sekvence podle vynálezu jsou považovány promotorové sekvence genů pro proteiny, které jsou intenzívně tvořené při imunologické reakci v makrofázích a/nebo v lymfocytech.
8.2. Volba strukturního genu pro účinnou látku k inhibici nebo aktivaci srážení.
Jako účinná látka podle vynálezu je využívána sekvence DNA kódující protein, který přímo nebo nepřímo inhibuje agregaci trombocytů nebo některý krevní koagulační faktor nebo stimuluje fibrinolýzu.
Taková účinná látka je označovaná jako inhibitor koagulace. Jako inhibitory koagulace je možné použít například geny pro: aktivátory plasminogenu (PA), tkáňové aktivátory plasminogenu (tPA) nebo urokináze podobné PA (uPA), dále pak protein C, antitrombín-III, C-lS-inhibitor, μΐ-antitrypsín,
-26inhibitor dráhy tkáňového faktoru (Tissue Factor Pathway Inhibitor, TFPI) nebo hirudin. j
Jako účinné látky podle vynálezu jsou také využívány sekvence DNA, které kódují protein podporující srážení krve. Příklady takových proteinů jsou například proteiny krevní plazmy jako je faktor VIII nebo faktor IX.
9. Účinné látky k ochraně poškození CNS (poškození centrální nervové soustavy)
9.1. Aktivátorové sekvence pro účinnou látku vhodnou ochraně před poškozeními CNS
9.1a) Aktivátorové sekvence aktivované v endotheliálních buňkách
Předevšímse mezi takové aktivátorově sekvence počítají promotorové sekvence pro geny endotheliálně specifických proteinu.
9.1b) Aktivátorové sekvence aktivované v gliových buňkách
Za preferovanou aktivátorovou sekvenci je dále považováná nukleotidové sekvence (promotorové nebo enhancerová), která interaguje s transkripčními faktory a je tvořená nebo je aktivní zvláštní mírou v gliových buňkách.
9.2. Volba strukturního genu pro neurospecifické faktory.
Za neurospecifický faktor podle vynálezu je považována DNA sekvence, která kóduje neuronální růstový faktor. Vynález je blíže popsán v následujících příkladech.
-27Příkadv provedení vynálezu
Příklad 1: Biochemické experimenty
Vzájemný účinek mezi nukleotidovou sekvencí CTTGCGGGAG B-myb promotoru a E2F-komplexy byl zkoumán pomocí změny elektroforetické mobility (electrophoretic mobility shift assay) (EMSA) a otiskem baží chráněných břed methylací (methylation protection footprinting, MPF).
EMSA byla provedena podle publikace Barberis a další, Cell 50, strana 347 (1987).
Následující fúzní proteiny GST byly exprimovány v E. coli a přečištěny afinitní chromatografií:
- E2F1, aminokyseliny 87 až 1398, viz Helin a další, Cell 70, strana 337 (1992); Kaelin a další, Genes Dev. 8, strana
2665 (1994)
- E2F4, celý protein, viz Beijersbergen a další, Genes Dev.
8, strana 2680 (1994); Ginsberg a další, Genes Dev. 8, strana 2665 (1994)
- protein pRb, aminokyseliny 300 až 928, Bernards a další,
Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86, strana 6474 (1989)
- protein pl07, aminokyseliny 744-2460 (Ewen a další, Cell
66, strana 1155 (1991)
Purifikované proteiny (asi 100 ng) byly inkubovány s 0.5 pmol 32P-značené sondou 3 0 minut při 22°C v 15 μΐ pufru obsahujícího 50 mM Tris/HCl pH 8.0, 50 mM NaCl, 10% v/v glycerol, 0.2 mM EDTA, 1 mM DTT a 67 μg póly [dA/dT] /μΐ. Sondy byly značeny zavedením 4 až 6 bází na 5' přesahující konec. Sondy byly rozděleny ve 4% nedenaturujícím polyakrylamidovém gelu s 0.5 x TBE při 4°C a 10 V/cm. Gely byly exponovány s filmem citlivým na rentgenové záření a kvantitativně
-28analyzovány s pomocí zařízení Phosphor-Imager.
Molecular Dynamics
I i
Byly použity následující sondy:
- B myb, viz Lam a další, EMBO J. 12, strana 2705, (1993)
5'-GGCGCCGACGCACTTGGCGGGAGATAGGAAAGTGGTTCTGTG
Sekvence Id. č. S (E2F vazebné místo je podtržené)
- mutovaný B-myb ' -GGCGCCGACGCACTTGGCTGGAGATAGGAAAGTGGTTCTGTG
Sekvence Id. č. 7
- E2a promotor adenoviru ' -gatcGACTAGTTTCGCGCCCTTTCTActag
Sekvence Id. č. 8 (malá písmena znázorňují nedůležité sekvence, které byly použity pro doplňovací reakci (fill-in labelling reaction))
- kontrolní sonda:
5-GATCCTCTCACCTGCTGCTAG
Sekvence Id. č. 9
MPF byla provedena následujícím způsobem:
oligonukleotid kódující B-myb byl označen na konci, přečištěn a spojen s antikódujícím řetězcem. Vazba proteinů byla provedena tak, jak u bylo popsáno u metody EMSA. Bylo přidány dva mikrolitry 2% dimethylsulfátu (DMS) a methylační reakce byla zastavena po 3 minutách přidáním 2 μΐ 60mM β-merkaptoethanolu. Sondy byly rozděleny ve 4% gelu a přeneseny na iontoměničový papír. Pruhy byly vystřiženy, promyty v TE pufru a eluovány při 65°C s TE pufrem, který obsahoval 1,5 M NaCl. Eluovaná DNA byla extrahována chloroformem, precipitována a rozpuštěna ve vodě. Stejná
-29množství radioaktivně značených pruhů, které zůstaly na místě nanesení (volná sonda) a které odputovaly (komplex), byla štěpena 10% piperidinem při 95°C po dobu 30 minut. DNA byla precipitována a nanesena na 15% denaturující akrylamidový gel.
Jak ukazuje obrázek 1, vážou se proteiny E2F1-DP1, E2Fl-DPl-pRb, E2F4-DP1 a E2F4-DPl-plO7 na vazebné místo pro E2F B-myb promotoru se srovnatelnou silou a s podobnou afinitou jako k vysokoafinitnímu E2a-promotor-vazebnému místu adenoviru, viz Mudryj a další, EMBO J. 9, strana 2179 (1990)).
Kvantifikace vazby E2F-komplexu na E2F-vazebně místo B-myb promotoru byla stanovena pomocí zařízení Phosphor-Imager, přičemž se ukázalo množství vázané sondy.
Byly získaný následující výsledky (podíl vázané sondy) .- E2F-vazebné místo E2a-promotoru: 1.0%( E2F1-DP1) respektive
0.8% (E2F4-DP1)
- B-myb: 0.7% (E2F1-DP1) eventuálně 2.0% ( E2F1-DP1) eventuálně 2.0% (E2F4-DP1).
- mutovaný B-myb: < 0.01%
- negativní kontrolní sonda: <0.002%.
E2F4 komplexy byly vybrány pro protection footprinting analýzu s dimethylsulfátem (DMS), protože protein pl07 byl prokázán jako důležitý vazebný protein E2F komplexu, který reaguje s vazebnou strukturou, viz Lam a další, EMBO J. 13, strana 871 (1994)) a E2F4 je jediný známý člen Rodiny E2F, který reaguje s pl07, viz Beijersbergen a další, Genes Dev. 8, strana 2680 (1994); Ginsberg a další,
Genes Dev. 8, strana 2665 (1994)).
Jako ukazuje obrázek 2, byly nukleotidy v oblasti E2F-vazebného místa chráněny (CTTGGCGGGAG, chráněné guaniny jádra E2F-vazebného místa jsou podtržené, přičemž dva nej krajnější guaniny lokalizované na 3' konci po směru
-30transkripce vykazují jenom částečnou ochranu). Výsledky dále ukazují, že nebyly prokázány žádné rozdíly ryezi otisky E2F4-Dpl (volný E2F) a E2F4-DPI-pl07. Tato pozorování jasně ukazují, že se E2F-komplexy vážou na DNA nezávisle' na proteinu pl07 a že tyto vazby na DNA mohou být prokázány metodou MPF. Ve shodě je taky zjištění, že asociační a disociační poměr pro E2F4-DP1 a E2F4-DPl-pl07 komplexy si je velmi podobný.
Příklad 2; Výzkum na živých buňkách.
Aby byla prokázaná vazba E2F na B-myb promotor nejen v biochemických testech, ale také v živých buňkách, byly NIH3T3 fibroblasty synchronizovány odejmutím séra a následně stimulovány 10% FKS. V různých časech po stimulaci byla in vivo zkoumána progrese buněčného cyklu (obsah DNA), exprese mRNA B-myb a vazba E2F-komplexů na E2F-vazebné místo (ochrana před methylací). Jako ukazuje obrázek 3A, vede stimulace klidových buněk asi po 12 hodinách ke vstupu do S-fáze.
Jak již bylo prokázáno, viz Lam a další, EMBO J. 12, strana 2705 (1993)), vzrůstá exprese B-myb mRNA 8 hodin po stimulaci (to znamená v pozdní Gl-fázi) a dosahuje nejvyšší hodnoty po asi 12 hodinách, to znamená v čase vstupu do
S-fáze.
Pro analýzu role E2F-vazebného místa v buňce, byl proveden genomický DMS footprinting, viz Lucibell a další EMBO J. 14, strana 132 (1995) ; Pfeifer a další, Science 246, strana 810 (1989) .
Byly použity následující primery:
1. primer: 5'-TCAGGACTCAGGCTGCT Sekvence Id. č. 10
2. primer: 5'-CGAGCCGCTCCGGGCCCCAGG Sekvence Id. č. 11
3. primer: 5'-GGCCCCAGGCGGTGCTCTCAGGCG Sekvence Id. č. 12
-31Analýza buněk v GO fázi prostřednictvím genomického footprintingu (obrázek 3C) ukazuje zřetelné obsazení E2F-vazebného místa, a to jak jádra elementu tak také dvou guaninů bezprostředně lokalizovaných po směru trankripce. c?6 guaninú v pozicích -209, -208, -206, -205, -204 a -202 (vztaženo na ATG start kodón (Lam a další, EMBO J. 12, strana 2705, (1993)) bylo jednoznačně chráněno, přičemž poslední dva vykazovaly jenom částečnou ochranu. Tato ochrana proti methylaci byla podobná ochraně pozorované při biochemických výzkumech. Z toho vyplývá, že proteinový intracelulárně chánící komplex je E2F.
Podobné výsledky by byly dosaženy s komplexy, které obsahovaly E2F2, E2F3, E2F5, DP2 a DP3. Podle očekávání nebyla zjištěna ždná vazba, když do E2F-vazebněho místa byla vložená bodová mutace (CTTGGCGG -> CTTGGCTG).
Analýza buněk stimulovaných sérem ukázala podobnou ochranu E2F-vazebně sekvence po 4 hodinách. Po 8 hodinách byla tato ochrana však značně snížená a později nebyla pozorována žádná signifikantní ochrana. Tento úbytek ochrany probíhal současně se vzrůstem B-myb transkripce. V protikladu k ochraně E2F-vazebné sekvence před methylaci, která je regulována buněčným cyklem, byl například guanin v poloze -223 po celý cyklus hypermethylován.
Výsledky dokazují, že E2F-komplexy nebyly v živých buňkách (in šitu) vázány na E2F-vazebnou sekvenci B-myb, přestože byly objeveny při analýze buněčných extraktů v pozdní G1 a S fázi, například jako volné E2F a E2F-komplexy.
Tyto výsledky dále dokládají, že vazba E2F na E2F-vazebnou sekvenci nehraje rozhodující roli v aktivaci transkripce genu B-myb, protože tato sekvence není obsažena faktorem E2F v okamžiku vzrůstu transkripce. Naopak: principiální mechanizmus účinku E2F například v regulaci B-myb
-32exprese po dobu buněčného cyklu je inhibice exprese v GO- a Gl-fázi.
Porovnání proximální promotorové sekvente CDC25C, cyklinu A a CDC2-genu s B-myb-promotorem ukazuje na zřetelnou podobnost nejen mezi CDE a E2F-vazebným místem, ale i v oblasti CHR (obrázek 4) . Vazebné pokusy EMSA in vitro s jadernými extrakty HeLa buněk ukazují na skutečnost, že B-myb-CHR je rozpoznáno nukleárním(i) proteinem(y). Na základě tohoto nálezu byly připraveny konstrukty, ve kterých byl B-myb promotor, viz Lam a další, EMBO J. 12, strana 2705, (1993) spojen s luciferázovým reportérovým genem (ρ x P2-vektor, viz Nordeen BioTechnnigues 6, strana 454, (1988)). Tento konstrukt vykazuje, jak bylo popsáno Lam a dalšími (1993), asi 15 násobnou represi v klidových buňkách oproti přoliferujícím. Tato represe byla prakticky úplně eliminovaná (asi 2 násobná represe) protřednictvím mutace v CHR-sekvenci (TAGGAAAG->TAGGCCTG). V dalších pokusech byly vyrobeny konstrukty, ve kterých byl CDC25C-promotor spojen s Luciferázovým reportérovým genem. Mimoto byl v tomto konstruktu vyměněn CHR-element CDC25C-genu za CHR-element B-myb-genu (obrázek 5) . Tento chimérický konstrukt nebyl regulován buněčným cyklem. Tato data jednoznačně dokládají, že B-myb-CHR a CHR z CDC25C-genu nejsou funkčně ekvivalentní.
Nukleotidové sekvence, na které se vážou transkripční faktory rodiny E2F a CHF, jako například nukleotidová sekvence CTTGGCGGGAGATAGGAAAGT musí být považovány za nové promotorové moduly, které vazbou E2F- a CHF-komplexú v GO a Gl fázi inhibují transkripci genů lokalizovaných po směru transkripce. Výsledky pokusů blíže vysvětlují předložené obrázky.
-33Popis obrázků
Obrázek 1:
Vzájemný účinek B-myb E2F-vazebného místa s různými E2F-DP1 a E2F-DPl-plO7 komplexy. Komplexy byly připraveny jako rekombinantní GST-fúzní proteiny a analyzovány EMSA metodou, viz Barberis a další, Cell 50, strana 347 (1987) s pomocí syntetických oligonukleotidů, které obsahovaly buď B-myb E2F-vazebné místo, viz Lam a další, EMBO J. 12, strana 2705, (1993) nebo vazebné místo E2F promotoru E2a adenoviru, viz Mudryj a další, EMBO J. 9, strana 2179 (1990) . Rozdíly v intenzitě, které jsou pozorovány mezi E2F1 a E2F4 komplexy, odrážejí rozdíly v různých purifikátech proteinu E2F a méně rozdíly ve vazebných afinitách. Symbol A značí hybridizační sondu, symbol B pak jednotlivé proteiny
Obrázek 2
Methylation protéction fooprints E2F2-DP1 (a) a E2F4-DPl-plO7 (d) komplexů. Methylovaně komplexy byly rozděleny pomocí EMSA (obrázek 1) a chráněně guaniny byly analyzovány (viz text). b, c: volná sonda; f: sekvence E2F-vazebného místa; plné body symbolizují plnou ochranu, částečně vyplněné body pak částečnou ochranu.
Obrázek 3
Kinetika exprese mRNA B-myb a obsazení vazebného místa E2F v buňce.
3A) Analýza buněčného cyklu buněk NIH3T3, synchronizovaných v G0 fázi odebráním séra a stimulovaných 10% FKS. Buňky byly barveny na důkaz DNA barvivém Hoechst 33258 a analyzovány pomocí FACS, viz Luzibello a další, EMBO J. 14, strana 132 (1995); osa y: relativní aktivita.
-343B) Exprese mRNA B-myb po dobu buněčného cyklu měřené RT-PCR. Izolování RNA a RT-PCR bylo provedeno podle Luzibello a další, EMBO J. 14, strana 132 (1995) . Oblast B-myb cDN^ od pozice
I +1630 do +2228 byla arnplifikována pomocí následujících primerů: 5'-GACACCCCTGCACCAGAAGTATC a 5'-GGCTGGACTTCAGGCGGCT. GPDH sloužilo jako kontrola; časové údaje (0 až 20 hodin) udávají dobu od stimulace tkáňové kultury.
3C) Genomický DMS footprinting, viz Luzibello a další, EMBO J. 14, strana 132 (1995) ; Pfeiffer a další, Science 256, strana 810 (1989) jádra B-myb promotorové oblasti v odlišných stádiích buněčného cyklu. E2F-vazebné místo a potenciální Spi-vazebné místo jsou označeny. Symbol A značí dobu od stimulace tkáňové kultury, v první stopě z leva je vzorek z nestimulovaných buněk pěstovaných in vitro; plné kruhy v sekvenci: silná ochrana (> 80 %, podle phosphor-imaging analýzy; z poloviny vybarvené kruhy : částečná ochrana (asi 50%) .
Analýza na obrázcích 3A, 3B a 3C byla provedena s totožnými buněčnými populacemi.
Obrázek 4
Sekvenční srovnání proximální promotorové sekvence cdc25C, cyklinu A, cdc2 a genu B-myb. Údaje pozic jsou převzáné z literatury, viz Zwicker a další, EMBO J. 14, strana 132 (1995) respektive vztahují se k počátku transkripce, (B-myb, Lam a další, EMBO J. 12, strana 2705 (1993)).
Obrázek 5
Analýza reporterového konstruktu cdc25C-promotor-luciferáza v klidových (G0) a v rostoucích NIH3T3 buňkách. Divoký typ Cdc29C konstruktu (sekvence A, viz Zwicker a další,(1995) byl v CHR, mutovaný (sekvence B, báze podtrhnuté), takže vznikla CHR oblast B-myb. Analýza byla provedena jako u Luzibello a
-35dalších, EMBO J. 14, strana 132 (1995) a Zwicker a další, EMBO J. 14, strana 132 (1995); šrafovaně - klidové (GO) buňky, plně rostoucí buňky; osa x vyznačuje relativní aktivitu luciferázy.
-36INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 1:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 9 párů basí (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (ix) CHARAKTERISTICKÉ RYSY:
(A) JMENO/KLÍČ: exon (B) UMÍSTĚNÍ:1 až 9 (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 1:
CTTGGCGGG
INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 2:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 9 párů basí (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (ix) CHARAKTERISTICKÉ RYSY:
(A) JMÉNO/KLÍČ: exon (B) UMÍSTĚNÍ:! až 9
TTTCGCGCC (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 2:
INFORMACE 0 SEKVENCI ID. Č. 3:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 9 párů basí
(B) TYP: nukleová kyselina
(C) POČET VLÁKEN: jedno
(D) TOPOLOGIE: lineární
(ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (ix) CHARAKTERISTICKÉ RYSY:
(A) JMÉNO/KLÍČ: exon (B) UMÍSTĚNÍ:1 až 9 (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 3:
TTTCGCGGC
INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 4:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 7 párů basí (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (ix) CHARAKTERISTICKÉ RYSY:
(A) JMĚNO/KLÍČ: exon (B) UMÍSTĚNÍ:1 až 7 (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 4:
TAGGAAA
-38INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 5:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 21 párů basí (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (ix) CHARAKTERISTICKÉ RYSY:
(A) JMÉNO/KLÍČ: exon (B) UMÍSTĚNÍ:1 až 21 (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 5:
CTTGG CGGGA GATAG GAAAG T
INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 6:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 42 párů basí (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (ix) CHARAKTERISTICKÉ RYSY:
(A) JMÉNO/KLÍČ: exon (B) UMÍSTĚNÍ:1 až 42 (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 6:
GGCGC CGACG CACTT GGCGG GAGAT AGGAA AGTGG TTCTG TG
-39INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 7:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 42 párů basí (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (ix) CHARAKTERISTICKÉ RYSY:
(A) JMÉNO/KLÍČ: exon (B) UMÍSTĚNÍ:1 až 42 (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 4:
GGCGC CGACG CACTT GGCTG GAGAT AGGAA AGTGG TTCTG TG
INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 8:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 30 párů basí (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (ix) CHARAKTERISTICKÉ RYSY:
(A) JMÉNO/KLÍČ: exon (B) UMÍSTĚNÍ:1 až 30 (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 8:
GATCG ACTAG TTTCG CGCCC TTTCT ACTAG
-40INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 9:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 21 párů basí (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (ix) CHARAKTERISTICKÉ RYSY:
(A) JMÉNO/KLÍČ: exon (B) UMÍSTĚNÍ:1 až 21 (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 9:
GATCCTCTCACCTGCTGCTAG
INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 10:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 17 párů basí (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (ix) CHARAKTERISTICKÉ RYSY:
(A) JMÉNO/KLÍČ: exon (B) UMÍSTĚNÍ:1 až 17 (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 10:
TCAGG ACTCA GGCTG CT
-41INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 11:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 21 páru basí (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (ix) CHARAKTERISTICKÉ RYSY:
(A) JMÉNO/KLÍČ: exon (B) UMÍSTĚNÍ:1 až 21 (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 11:
CGAGC CGCTC CGC-GC CCCAG G
INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 12:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 24 párů basí (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (ix) CHARAKTERISTICKÉ RYSY:
(A) JMÉNO/KLÍČ: exon (B) UMÍSTĚNÍ:1 až 24 (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 12:
GGCCC CAGGC GGTGC TCTCA GGCG

Claims (11)

1. Konstrukt nukleové kyseliny vyznačuj«ící se tím, že umožňuje buněčným cyklem regulovanou expresi alespoň jednoho genu a obsahuje následující komponenty:
a) aktivátorovou sekvenci
b) promotorový modul obsahující nukleotidovou sekvenci, která váže alespoň jeden protein rodiny E2F a jinou nukleotidovou sekvenci, která váže nejméně jeden protein rodiny CHF a
c) strukturní gen kódující účinnou látku, která je exprimována v závislosti na buněčném cyklu.
2. Konstrukt nukleové kyseliny podle nároku 1 vyznačující se tím, že promotorový modul (b) obsahuje nukleotidovou sekvenci, která váže alespoň jeden protein rodiny E2F, která a obsahuje alespoň jednu sekvenci obsahující oligonukleotid vybraný ze skupiny
t$vořené oligonukleotidy TTŤCGCGGC. CTTGGCGGG, TTTCGCGCC a 3 . Konstrukt nukleové kyseliny podle nároku 1 nebo 2 vyznačující se tím, že promotorový modul (b) obsahuje nukleotidovou sekvenci, která váže alespoň jeden protein rodiny CHF, a která obsahuje alespoň jednu sekvenci, ve které je obsažen oligonukleotid TAGGAAA. 4 . Konstrukt nukleové kyseliny podle nároku 2 nebo 3 vyznačující se tím, že nukleotidové sekvence, která váže protein CHF leží po směru
transkripce od nukleotidové sekvence pro vazbu proteinu E2F a mezi oběma sekvencemi se nachází triplet AGA (CTTGGCGGGAGATAGGAAA).
-435. Konstrukt nukleová kyseliny podle libovolného z nároků 1 až 4 vyznačující se tím, že promotorovy modul (b) může interagovat s aktivátorovou sekvencí (a) ležící proti směru transkripce a tím ovlivňovat po směru transkripce položené geny (c), zvlášt^pak tyto geny inhibovat.
6. Konstrukt nukleové kyseliny podle libovolného z nároků 1 až 5 vyznačující se tím, že aktivátorové sekvence je buněčně specifická.
7. Konstrukt nukleové kyseliny podle libovolného z nároků 1 až 6 vyznačující se tím, že aktivátorové sekvence je virově specifická.
8. Konstrukt nukleové kyseliny podle libovolného z nároků 1 až 7 vyznačující se tím, že nukleovou kyselinou je DNA.
9. Konstrukt nukleové kyseliny podle libovolného z nároků 1
až 8 vyznaču konstruktem je vektor. jící se t í m , že tímto 1 10 . Konstrukt nukleové vyznačuj ící je plazmidový vektor. kyseliny se t í podle m , že nároku 9 tímto konstruktem k 11. Konstrukt nukleové kyseliny podle nároku 9
vyznačující se tím, že jde o nevirový vektor.
Konstrukt nukleové kyseliny podle libovolného z nároků 1 až 11 vyznačující se tím, že gen (c)
-44kóduje účinnou látku, která je vybrána ze skupiny tvořené cytokiny, růstovými faktory, receptory pro cytokiny a růstové faktory, antiproliferativně nebo cytostaticky účinkujícími proteiny, protilátkami, fragmenty protilátek, inhibitory angiogeneze, koagulačními faktory a faktory inhibujícími koagulaci.
13. Konstrukt nukleové kyseliny podle libovolného z nároků 1 až 12 vyznačující se tím, že aktivátorové sekvence (a) je vybrána ze skupiny promotorů, které aktivují transkripci v endotheliálních buňkách, v£ buňkách hladkých svalů, lymfocytech, makrofázích, v leukemických nebo tumorových buňkách nebo v gliových buňkách, nebo z promotorových sekvencí virů HBV, HCV, HSV, HPV, EBV, HTLV nebo HIV.
14. Konstrukt nukleové kyseliny podle libovolného z nároků 1 až 13 vyznačující se tím, že gen (c) kóduje enzym, který štěpí prekurzor léčiva na jeho aktivní formu.
15. Izolované buňky vyznačující se tím, že obsahují konstrukt nukleové kyseliny podle libovolného z nároků 1 až 14.
16. Použití konstruktu nukleové kyseliny podle libovolného z nároků 1 až 14 nebo buňky podle nároku 15 pro výrobu léčiva k léčbě nemoci, která je spojena s nadměrnou proliferací buněk vyznačující se tím, že je dosaženo vložení konstruktu nukleové kyseliny do cílové buňky.
-4517. Použití podle nároku 16 vyznačující se tím, že onemocněním spojeným s nadměrnou proliferací buněk je tumor.
18. Použití podle nároku 16 nebo 17 vyznačující se .tím, že výroba léčiva zahrnuje převedení konstruktu nukleová kyseliny podle libovolného z nároků 1 až 14 do takové formy, která umožní vložení tohoto konstruktu do cílové buňky.
CZ97418A 1996-02-13 1997-02-11 Structures of nucleic acids for controlled expression of genes, cells containing such structures and their use for preparing medicaments CZ41897A3 (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19605274A DE19605274A1 (de) 1996-02-13 1996-02-13 Nukleinsäurekonstrukte für die zellzyklusregulierte Expression von Genen, derartige Konstrukte enthaltende Zellen sowie deren Verwendung zur Herstellung von Heilmitteln

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ41897A3 true CZ41897A3 (en) 1997-09-17

Family

ID=7785276

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ97418A CZ41897A3 (en) 1996-02-13 1997-02-11 Structures of nucleic acids for controlled expression of genes, cells containing such structures and their use for preparing medicaments

Country Status (9)

Country Link
US (1) US5885833A (cs)
EP (1) EP0790313A3 (cs)
JP (1) JPH104980A (cs)
AU (1) AU716500B2 (cs)
CA (1) CA2197286A1 (cs)
CZ (1) CZ41897A3 (cs)
DE (1) DE19605274A1 (cs)
HU (1) HUP9700429A3 (cs)
ZA (1) ZA971158B (cs)

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9506466D0 (en) 1994-08-26 1995-05-17 Prolifix Ltd Cell cycle regulated repressor and dna element
DK0807183T3 (da) 1994-08-26 2001-03-05 Aventis Pharma Gmbh Genterapi af sygdomme, der fremkaldes af immunsystemet, ved hjælp af et cellespecifikt aktivt stof, der reguleres af cellec
DE19605279A1 (de) 1996-02-13 1997-08-14 Hoechst Ag Zielzellspezifische Vektoren für die Einschleusung von Genen in Zellen, Arzneimittel enthaltend derartige Vektoren und deren Verwendung
DE19617851A1 (de) 1996-05-03 1997-11-13 Hoechst Ag Nukleinsäurekonstrukte mit Genen kodierend für Transportsignale
AU4592697A (en) * 1996-09-24 1998-04-17 Dana-Farber Cancer Institute Method of targeting malignant cells using an e2f responsive promoter
DE19639103A1 (de) 1996-09-24 1998-03-26 Hoechst Ag Nukleinsäurekonstrukte mit Hybridpromotoren für gentherapeutische Maßnahmen
DE19651443A1 (de) 1996-12-11 1998-06-18 Hoechst Ag Selbstverstärkende, pharmakologisch kontrollierbare Expressionssysteme
DE19701141C1 (de) * 1997-01-16 1998-04-09 Hoechst Ag Genkonstrukte für durch Proteasen aktivierbare Wirksubstanzen
EP0860445A1 (en) 1997-02-18 1998-08-26 Hoechst Aktiengesellschaft New nucleotide sequences for the cell cycle regulated expression of structural genes
US7112338B2 (en) * 1997-03-12 2006-09-26 The Regents Of The University Of California Cationic liposome delivery of taxanes to angiogenic blood vessels
US5837283A (en) * 1997-03-12 1998-11-17 The Regents Of The University Of California Cationic lipid compositions targeting angiogenic endothelial cells
DE19751587A1 (de) 1997-11-21 1999-07-29 Hoechst Marion Roussel De Gmbh Onkogen- oder virusgesteuerte Expressionssysteme
DE19756975A1 (de) 1997-12-20 1999-06-24 Hoechst Marion Roussel De Gmbh Bindungspartner für Inhibitoren von cyclinabhängigen Kinasen und ihre Verwendung zur Suche nach Inhibitoren, zur Diagnose oder zur Therapie einer Erkrankung
HUP9900956A2 (hu) 1998-04-09 2002-04-29 Aventis Pharma Deutschland Gmbh. Egyláncú, több antigéntkötőhely kialakítására képes molekulák, előállításuk és alkalmazásuk
DE19831420A1 (de) * 1998-07-14 2000-01-20 Hoechst Marion Roussel De Gmbh Expressionssysteme enthaltend chimäre Promotoren mit Bindungsstellen für rekombinante Transkriptionsfaktoren
DE19900743A1 (de) 1999-01-12 2000-07-13 Aventis Pharma Gmbh Neue komplexbildende Proteine
DE60027730T2 (de) * 1999-09-09 2007-03-29 The Regents Of The University Of California, Oakland Verabreichung von taxanen an angiogene blutgefässe mittels kationischer liposomen
US6864355B1 (en) 2000-05-02 2005-03-08 Yale University Inhibition of NF-κB activation by blockade of IKKβ-NEMO interactions at the NEMO binding domain
WO2001032222A1 (en) * 1999-11-03 2001-05-10 Mbt Munich Biotechnology Gmbh Selective toxin expression in angiogenic endothelial cells
US7396679B2 (en) * 1999-11-15 2008-07-08 Onyx Pharmaceuticals, Inc. Oncolytic adenovirus
WO2001036650A2 (en) * 1999-11-15 2001-05-25 Onyx Pharmaceuticals, Inc. An oncolytic adenovirus
WO2001049868A1 (en) * 1999-12-31 2001-07-12 Korea Research Institute Of Bioscience And Biotechnology Cancer cell-specific gene expression system
WO2005085455A1 (en) * 2004-03-09 2005-09-15 Kam Man Hui Compositions and methods for treating disease

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE69101032T2 (de) 1990-07-03 1994-08-11 Kuraray Co Katalysator und Verfahren zur Herstellung von ungesättigten Estern.
WO1996006938A1 (de) * 1994-08-26 1996-03-07 Hoechst Aktiengesellschaft Gentherapeutische behandlung von gefässerkrankungen durch einen zellspezifischen, zellzyklusabhängigen wirkstoff

Also Published As

Publication number Publication date
AU1265097A (en) 1997-08-21
DE19605274A1 (de) 1997-08-14
HUP9700429A3 (en) 2001-10-29
JPH104980A (ja) 1998-01-13
HUP9700429A2 (en) 1997-10-28
ZA971158B (en) 1997-11-13
EP0790313A2 (de) 1997-08-20
US5885833A (en) 1999-03-23
HU9700429D0 (en) 1997-03-28
AU716500B2 (en) 2000-02-24
CA2197286A1 (en) 1997-08-14
EP0790313A3 (de) 1998-12-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ41897A3 (en) Structures of nucleic acids for controlled expression of genes, cells containing such structures and their use for preparing medicaments
Wu et al. The E1A 13S product of adenovirus 5 activates transcription of the cellular human HSP70 gene
US6214614B1 (en) Cell cycle regulated repressor and DNA element
Birchenall-Roberts et al. Transcriptional regulation of the transforming growth factor β1 promotor by v-src gene products is mediated through the AP-1 complex
Karin et al. Metal-responsive elements act as positive modulators of human metallothionein-IIA enhancer activity
Shaw et al. A conserved AU sequence from the 3′ untranslated region of GM-CSF mRNA mediates selective mRNA degradation
CA2206179C (en) Vectors for tissue-specific replication
Wu et al. Negative regulation of the human ε-globin gene by transcriptional interference: role of an Alu repetitive element
Speck et al. Point mutations in the Moloney murine leukemia virus enhancer identify a lymphoid-specific viral core motif and 1, 3-phorbol myristate acetate-inducible element
Kim et al. Specific stimulation of simian virus 40 late transcription in vitro by a cellular factor binding the simian virus 40 21-base-pair repeat promoter element.
Salomon et al. A truncated herpes simplex virus thymidine kinase phosphorylates thymidine and nucleoside analogs and does not cause sterility in transgenic mice
LIU et al. Binding of the ubiquitous cellular transcription factors Sp1 and Sp3 to the ZI domains in the Epstein–Barr virus lytic switch BZLF1 gene promoter
Sergeant et al. A transcription enhancer acts in vitro over distances of hundreds of base-pairs on both circular and linear templates but not on chromatin-reconstituted DNA
WO2000046355B1 (en) Telomerase reverse transcriptase transcriptional regulatory sequences
KR19990014681A (ko) Ｉｌ－６활성 저해물질
AU735514B2 (en) Nucleic acid construct for the cell cycle regulated expression of structural genes
Garcia et al. Upstream regulatory regions required to stabilize binding to the TATA sequence in an adesovirus early promoter
De Benedetti et al. RETRACTED: Loss of (2'-5') oligoadenylate synthetase activity by production of antisense RNA results in lack of protection by interferon from viral infections.
CA2211008A1 (en) Nucleic acid constructs containing hybrid promoters for use in gene therapy
US6201115B1 (en) Amplifying sequences, vectors comprising these sequences and their uses in compositions for the expression of nucleotide sequences in transfected cells therapeutic and vaccine applications
Thatikunta et al. Identification of a cellular protein that binds to tat‐responsive element of TGFβ‐1 promoter in glial cells
Cereghini et al. Structure and function of the promoter-enhancer region of polyoma and SV40
Jüttermann et al. Adenovirus type 2 VAI RNA transcription by polymerase III is blocked by sequence-specific methylation
Lacoste et al. NF-κB activity in T cells stably expressing the Tax protein of human T cell lymphotropic virus type I
Larsson et al. Characterization of a low-molecular-weight virus-associated (VA) RNA encoded by simian adenovirus type 7 which functionally can substitute for adenovirus type 5 VA RNAI

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic