CZ9801553A3 - Způsob určování nebo zjišťování poškození dárcovského orgánu po xenotransplantaci pomocí analýzy látek pocházejících z orgánu dárce - Google Patents
Způsob určování nebo zjišťování poškození dárcovského orgánu po xenotransplantaci pomocí analýzy látek pocházejících z orgánu dárce Download PDFInfo
- Publication number
- CZ9801553A3 CZ9801553A3 CZ19981553A CZ155398A CZ9801553A3 CZ 9801553 A3 CZ9801553 A3 CZ 9801553A3 CZ 19981553 A CZ19981553 A CZ 19981553A CZ 155398 A CZ155398 A CZ 155398A CZ 9801553 A3 CZ9801553 A3 CZ 9801553A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- agst
- donor
- human
- porcine
- organ
- Prior art date
Links
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 title claims abstract description 44
- 238000002689 xenotransplantation Methods 0.000 title claims abstract description 11
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 30
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 title description 10
- 230000008816 organ damage Effects 0.000 title description 5
- 239000012491 analyte Substances 0.000 claims abstract description 14
- 230000006378 damage Effects 0.000 claims abstract description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 24
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 24
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 claims description 20
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 claims description 14
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 claims description 11
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 9
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 claims description 8
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 claims description 8
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 8
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 claims description 7
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 claims description 5
- 230000035899 viability Effects 0.000 claims description 4
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 claims 1
- XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N hydrogen iodide Chemical compound I XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 abstract description 2
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 abstract 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 23
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 16
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 10
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 10
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 9
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 8
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 8
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 8
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 8
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 7
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 7
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 7
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 7
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 7
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 6
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 6
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 6
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 5
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 4
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 4
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 4
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 4
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 4
- AYXZIZMZXAORLO-UFLZEWODSA-N 5-[(3as,4s,6ar)-2-oxo-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]pentanoic acid;1-hydroxypyrrolidine-2,5-dione Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O.N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 AYXZIZMZXAORLO-UFLZEWODSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 3
- XINQFOMFQFGGCQ-UHFFFAOYSA-L (2-dodecoxy-2-oxoethyl)-[6-[(2-dodecoxy-2-oxoethyl)-dimethylazaniumyl]hexyl]-dimethylazanium;dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].CCCCCCCCCCCCOC(=O)C[N+](C)(C)CCCCCC[N+](C)(C)CC(=O)OCCCCCCCCCCCC XINQFOMFQFGGCQ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100036475 Alanine aminotransferase 1 Human genes 0.000 description 2
- 108010082126 Alanine transaminase Proteins 0.000 description 2
- 108010003415 Aspartate Aminotransferases Proteins 0.000 description 2
- 102000004625 Aspartate Aminotransferases Human genes 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- 108010044467 Isoenzymes Proteins 0.000 description 2
- 240000007711 Peperomia pellucida Species 0.000 description 2
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 2
- 108090000340 Transaminases Proteins 0.000 description 2
- 102000003929 Transaminases Human genes 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000011316 allogeneic transplantation Methods 0.000 description 2
- 210000000941 bile Anatomy 0.000 description 2
- 238000007413 biotinylation Methods 0.000 description 2
- 230000006287 biotinylation Effects 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 2
- 238000002967 competitive immunoassay Methods 0.000 description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 2
- 239000011539 homogenization buffer Substances 0.000 description 2
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 125000005439 maleimidyl group Chemical group C1(C=CC(N1*)=O)=O 0.000 description 2
- 210000000885 nephron Anatomy 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- JJAHTWIKCUJRDK-UHFFFAOYSA-N succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate Chemical compound C1CC(CN2C(C=CC2=O)=O)CCC1C(=O)ON1C(=O)CCC1=O JJAHTWIKCUJRDK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(dimethylamino)phenyl]-n,n-dimethylaniline Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1C1=CC=C(N(C)C)C=C1 YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N Cyclosporin A Chemical compound CC[C@@H]1NC(=O)[C@H]([C@H](O)[C@H](C)C\C=C\C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C1=O PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N 0.000 description 1
- 229930105110 Cyclosporin A Natural products 0.000 description 1
- 208000030453 Drug-Related Side Effects and Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010019663 Hepatic failure Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000945318 Homo sapiens Calponin-1 Proteins 0.000 description 1
- 101000652736 Homo sapiens Transgelin Proteins 0.000 description 1
- 108010058683 Immobilized Proteins Proteins 0.000 description 1
- GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N Leupeptin Natural products CC(C)CC(NC(C)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010067125 Liver injury Diseases 0.000 description 1
- PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N Maleimide Chemical compound O=C1NC(=O)C=C1 PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010029155 Nephropathy toxic Diseases 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 206010070863 Toxicity to various agents Diseases 0.000 description 1
- 102100031013 Transgelin Human genes 0.000 description 1
- 206010052779 Transplant rejections Diseases 0.000 description 1
- SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N [4-(4-hydrazinylphenyl)phenyl]hydrazine Chemical compound C1=CC(NN)=CC=C1C1=CC=C(NN)C=C1 SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 210000001557 animal structure Anatomy 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 210000000013 bile duct Anatomy 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000011098 chromatofocusing Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000012864 cross contamination Methods 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 231100000234 hepatic damage Toxicity 0.000 description 1
- 210000005161 hepatic lobe Anatomy 0.000 description 1
- 239000000710 homodimer Substances 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000006058 immune tolerance Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N leupeptin Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(C)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- 108010052968 leupeptin Proteins 0.000 description 1
- 230000008818 liver damage Effects 0.000 description 1
- 208000007903 liver failure Diseases 0.000 description 1
- 231100000835 liver failure Toxicity 0.000 description 1
- 230000003908 liver function Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 230000007694 nephrotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000417 nephrotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000011587 new zealand white rabbit Methods 0.000 description 1
- 229950000964 pepstatin Drugs 0.000 description 1
- 108010091212 pepstatin Proteins 0.000 description 1
- FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N pepstatin A Chemical compound OC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CC(C)C FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N 0.000 description 1
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 239000012474 protein marker Substances 0.000 description 1
- 210000000512 proximal kidney tubule Anatomy 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 210000005084 renal tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 125000000472 sulfonyl group Chemical group *S(*)(=O)=O 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 150000003568 thioethers Chemical class 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 231100000041 toxicology testing Toxicity 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 210000005239 tubule Anatomy 0.000 description 1
- 238000009827 uniform distribution Methods 0.000 description 1
- 239000002676 xenobiotic agent Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
Způsob určování nebo zjišťování poškozeni dárcovského orgánu po xenotransplantaci pomocí analýzy látek pocházejících z orgánu dárce
Oblast techniky
Vynález se týká způsobu zjišťováni poškozeni dárcovského orgánu po xenotransplantaci, a to určením nebo detekcí přítomnosti analyzovaného parametru dárcovského orgánu v biologické tekutině.
x
Dosavadní stav techniky
V současné době se svět potýká s nedostatkem dárcovských orgánů pro alotransplantaci (např. jater, ledvin a srdcí). Objevily se návrhy, a bylo i prokázáno, že tento problém lze, byť dočasně, překonat použitím orgánů zvířat před vlastní ortotopickou transplantací. Chari, R.S., et al. (The New England Journál of Medicíně 1994; 33, č. 4, s. 234-237) řešili selhání funkce jater ex vivo perfúzí prasečích jater s následnou ortotopickou transplantací jater. Jeden pacient tak zůstal ve stabilizovaném stavu po dobu 10 dní a poté u něj byla úspěšně provedena ortotopická transplantace jater. Dřívější pokusy o transplantaci orgánů mezi různými živočišnými druhy (xenotransplantace) však dosud nebyly úspěšné kvůli jevu, označovaném jako hyperakutní rejekce, kdy dojde během několika hodin od implantace příjemci k odhojení (rejekci) nově transplantovaného orgánu, který není imunitním systémem hostitele přijat. Pokrok, dosažený v poslední době v oblasti molekulární genetiky, umožnil vývoj transgennich zvířat (hlavně vepřů), jejichž orgány jsou geneticky upraveny tak, aby byly po přenosu do orgánů jiných živočišných druhů méně imunogenní (např. člověk versus primát jiný než člověk) (Transplant News 1995; 5, č. 9) . V této zprávě se předpokládá možnost, že imunotolerance se zajistí expresí genu pro lidský faktor akcelerace rozkladu v transgenním orgánu, který zabráni aktivaci komponent komplementu hostitele (např. komplexu Cb3) a omezí tak hyperakutní rejekci na minimum. Stejně jako v případě transplantace orgánů stejných živočišných druhů (alotransplantace) však rejekce xenograftu stále ještě představuje problém, s nímž se musí transplantolog potýkat, a který je dále komplikován zjevnou skutečností, že u příjemce štěpu jsou přítomny tkáně různých živočišných druhů.
Klasické testy jaterni funkce nedokáži rozlišit mezi ^analyzovanými parametry dárcovského a přijemcovského (např. prasečího a lidského) orgánu. Například měření sérových hladin alaninaminotransferázy (ALT) a aspartátaminotransferázy (AST) nerozliší mezi prasečími a lidskými enzymy, takže jakákoli snaha o
Podobná situace existuje v případě analýzy parametrů renálního xenotransplantátu. Je třeba konstatovat, že v současnosti prostě neexistuje žádný obecně uznávaný proteinový markér zachovalosti (nepoškozeni) ledvin.
Glutathion S-transferázy (GSTs) představují multigenní rodinu proteinů, sestávající hlavně z isoforem třídy alfa (aGST) , «^^GST), pí (nGST) a theta (9GST), definovaných isoelektrickým bodem, které mají na starosti detoxifikaci řady xenobiotik hlavně prostřednictvím konjugace glutathionu (Beckett, G.J a Hayes, J.D., Advanes in Clinical Chemistry 1993; 30, s. 281-380). Vzhledem k jednotné distribuci aGST a k jeho relativně vysoké hladině v játrech člověka, a vzhledem ke krátkému plazmatickému poločasu (přibližně 1 hodina), je tento enzym jako ukazatel stavu jater po transplantaci a míry poškozeni jater léky citlivější, než jsou aminotransferázy.
V EP-A 0 640 145 je popsána pomocná metoda k časné diagnóze rejekce u příjemců jaterního štěpu, zahrnující měření zvýšeni plazmatických nebo sérových hladin aGST při nepřítomnosti jakékoli změny v plazmatických nebo sérových hladinách transamináz, nebo dříve, než k nějaké změně dojde.
Pí glutathion S-transferáza je umístěna v cytoplazmě epitelových buněk žlučovodu v játrech; předpokládá se, že existuje pouze ve formě homodimeru. Heterogenní intrahepatální distribuce GST naznačuje, že různé isoenzymy mají in vivo jedinečné funkce v různých oblastech jater, a lze tedy dospět k závěru, že měření plazmatických nebo jaterních hladin GST usnadni monitorování stavu jater jedince. Podobně jedinečná distribuce existuje i u tkáni ledvin, kde se aGST vyskytuje v oblasti proximálniho tubulu, a nGST se omezuje na oblast distálního tubulu nefronu (Campbell, et al., Cancer ' <^hiladelphia) 1991; 67, s. 1608-1613). V nedávno publikované zprávě se objevila myšlenka, že simultánních detekcí cc/kGST v lidské moči by bylo možno využít k rozlišení mezi nefrotoxicitou cyklosporinů A a rejekcí štěpu (v tomto pořadí), a to díky místně specifické povaze inzultú příslušných tkání (Sunberg, A.G.M. et al., Nephron 1994; 67, s. 308-316).
Při detekci poškození orgánového štěpu, nebo k rozpoznání poškození hostitelského a/nebo dárcovského orgánu, je tudíž zapotřebí vyvinout metodu pro odlišení analyzovaných parametrů hostitele a štěpu.
Podstata vynálezu
Vynález se týká způsobu určování nebo zjišťování přítomnosti analyzovaného parametru dárcovského orgánu ve v podstatě nedárcovské biologické tekutině za přítomnosti nebo nepřítomnosti -edj&ávuj analyzovaného parametru příjemce, který ukazuje na poškození dárcovského orgánu po xenotransplantaci, a který -usnadňuje OWfVt identifikaci poškození xenotransplantátu u příjemce, kde tento způsob je založený na zachycení nebo detekci uvedeného analyzovaného parametru dárce pomocí protilátky, která je:
a) specifická pro analyzovaný parametr dárcovského orgánu a nevykazuje zkříženou reakci s odpovídajícím homologickým analyzovaným parametrem příjemce; nebo
b) schopná zkřížené reakce s uvedeným analyzovaným parametrem dárcovského orgánu, kde reaktivity s analyzovaným parametrem
I“ F dárcovského orgánu a homologickým analyzovaným parametrem příjemce mohou být kvantitativně odlišeny, a na přímém nebo nepřímém stanovení analyzovaného parametru dárcovského orgánu.
Způsob podle vynálezu umožňuje odlišit analyzované parametry hostitele od parametrů dárce, a tím získat informace o stavu xenotransplantátu a případné rejekci, aby bylo dle potřeby možno zahájit odpovídající terapii co nejdříve po zjištění analyzovaného parametru dárcovského orgánu v biologické tekutině příjemce, jak je podrobněji popsáno dále.
Biologickou tekutinou jsou zde míněny tělesné tekutiny jako je např. žluč, plazma, sérum a moč, jakož i tkáňová podpůrná média a perfuzáty. Tyto biologické tekutiny jsou také obecně označovány jako matrix.
Termínem dárcovský orgán se mini orgán jako takový, a také tkáně a buňky, které představují jeho nedílnou součást nebo z něj pocházej i.
Podobně se termínu dárcovský materiál používá k označeni samotného orgánu i tkání a buněk, které představují nedílnou součást tohoto orgánu nebo z něj pocházejí.
Tak například mohou být dárcovským materiálem játra, jaterní lalok jako jejich část, nebo hepatocyty. Obyčejně se v případě hepatocytů používá termínu zásobník hepatocytú (hepatocyte cartridge).
Příjemcem v obecném slova smyslu může být člověk nebo primát jiný než člověk.
Vhodný dárcovský materiál tedy může pocházet z jiného primáta, než z člověka, nebo ze zvířete, jako je např. vepř, který je fyziologicky a biochemicky podobný člověku.
Dárcovským zvířetem může být transgenní zvíře.
Xenotransplantaci lze provést in vivo nebo ex vivo.
Orgánem vhodným pro xenotransplantaci je srdce, ledviny nebo játra,
Dárcovským analyzovaným parametrem je s výhodou protein, zejména enzym.
Ve výhodném provedeni bude dárcovský analyzovaný parametr dárce-specifický. Je-li přítomen odpovídající analyzovaný parametr příjemce, je výhodou, má-li tento analyzovaný parametr příjemce nižší stupeň homologie s uvedeným analyzovaným parametrem dárcovského orgánu. Analyzovaný parametr dárcovského orgánu může mít i vyšší oty^eň homologie {např. větší než 80% homologii) s odpovídajícím analyzovaným parametrem příjemce, a přesto jej lze stále ještě detekovat způsobem podle dále popsaného vynálezu.
Výhodným enzymem je glutathion S-transferáza, zejména aGST.
Výhodně se zachycený analyzovaný parametr dárcovského orgánu určuje pomoci imunoanalýzy. Mezi vhodné typy imunoanalýzy patři enzymoimunoeseje.
Tak lze v případě prasečí aGST v lidské biologické tekutině zachytit prasečí aGST pomocí IgG [protilátky proti prasečí aGST], která se váže přímo nebo nepřímo na pevnou část, případně pomoci IgG[protilátky proti lidské aGST], která vykazuje zkříženou reaktivitu.
Získali jsme králičí polyklonální IgG [protilátku proti prasečí aGST], která je vysoce specifická vůči prasečí aGST. V případě, že tato protilátka také vykáže nižší stupeň (^5-10 %) zkřížené reaktivity s lidskou aGST, zejména při vysokých koncentracích lidské aGST, pak lze lidskou aGST stanovit samostatně, a může být správně vypočteno množství prasečí aGST, což je popsáno dále.
Identifikovali jsme monoklonální protilátku proti lidské aGST s téměř 100% zkříženou reaktivitou vůči prasečí aGST, což je popsáno dále v přikladu 3.
Enzymoimunoesej může být sendvičového nebo semikompetitivního typu, jak popsáno dále v příkladech 1 a 2.
Jedním z aspektů vynálezu je testování dárcovského materiálu na viabilitu před xenotransplantací.
Způsob podle vynálezu rovněž umožňuje testovat viabilitu dárcovského materiálu měřením analyzovaného parametru dárcovského orgánu v biologické tekutině, která protéká dárcovským materiálem.
Lze tak detekovat, kromě způsobu podle tohoto vynálezu^ analyzovaný parametr pomocí kterékoli známé metody. Pokud je / χ například analyzovaným parametrem orgánu enzym, pak lze uvedený / ' orgánový parametr analyzovat a detekovat enzymovou eseji s použitím
..v .
'«ufestrátu pro tento enzym.
obrázků
Na obr. 1 je schéma sendvičové enzymoimuneseje z příkladu 1.
Na obr. 2 jsou vynesené hodnoty absorbance při 450/630 nm versus koncentrace aGST (p.g/1) při použití imunometrické enzymoimunoeseje sendvičového typu pro prasečí aGST z příkladu 1.
Na obr. 3 je schéma kompetitivní enzymoimunoeseje z příkladu 2.
Na obr. 4 jsou vynesené hodnoty absorbance při 540/630 nm versus koncentrace aGST ^g/l) při použití imunometrické enzymoimunoeseje kompetitivního typu pro prasečí aGST z příkladu 2.
Na obr. 5 je analýza SDS-PAGE lidské a prasečí aGST.
Na obr. 6 je analýza imnunoblot lidské a prasečí aGST pomoci
IgG[protilátky proti lidské aGST] a konjugátu kozí IgG[protilátky proti králičímu IgG]-HRP.
Na obr. 7 je analýza imunoblot lidské a prasečí aGST pomocí IgGfprotilátky proti prasecí aGST] a konjugátu kozí IgG[protilátky proti králičímu IgG]-HRP.
Ί r- r · e r I· *
Na obr. 8 je analýza imunoblot lidské a prasečí aGST pomocí IgG[protilátky proti lidské aGST] a konjugátu kozí IgG[protilátky proti myšÍHfti' IgG]-HRP.
Příklady provedeni vynálezu
Vynález bude blíže vysvětlen v následujících příkladech.
Příprava A
Čištění prasečí aGST aGST byla získána z prasečích jater pomocí afinitni chromatografie a chromatofokusace (pH 9,5-6,0). Přesné podrobnosti postupu při čištění jsou následující:
a. 30 g prasečích jater bylo homogenizováno po dobu 2 minut v homogenizačním pufru v poměru jeden díl ke třem dílům pufru za použití Waringova mísidla (Waring je ochranná známka). Homogenizační pufr měl následující složení:
mM Tris-HCl
250 mM glukózy
5mM EDTA pH 7,8 pg/l leupeptinu pg/l pepstatinu
b. Jaterní homogenát byl centrifugován při 10000 g po dobu 60 minut.
c. Supernatant byl poté separován na koloně s afinitou pro glutathion (GSH)-Sepharosu, která byla předem ekvilibrována 10 mM Tris pH 9,1. Ekvilibrační pufr se znovu použil k eluci nenavázaného proteinu. Nakonec se k eluci nevázané GST z afinitni kolony použilo 50 mM Tris pH 9,1 s obsahem 5 mM GSH.
d. Eluovaný materiál byl poté dialyzován proti 25 mM ethanolaminu pH 9,5 a aplikován na chromofokusační kolonu (PBE94, dodala firma Pharmacia). Elučnim pufrem byl Polybuffer 96 (Polybuffer 96 je ochranná známka), připravený podle pokynů výrobce.
Příprava B
Výroba a čištění protilátek
Vyčištěná prasečí aGST se subkutánně (s.c.) injikovala novozélandským bílým králíkům podle dále uvedeného časového harmonogramu a sérum bylo hodnoceno na reaktivitu proti aGST. Titr IgG[protilátky proti prasečí aGST] byl určován semikvantitativni dot blot analýzou, a jakmile byl dostatečný, byli králíci usmrceni vykrvácením a z krve získáno sérum. Protein A afinitní chromatografií bylo z králičího séra odděleno celkové množství IgG, který byl použit jak k potaženi mikrotitračni destičky (semikompetitivni EIA - přiklad 2), tak i k biotinylaci (sendvičová EIA - přiklad 1). Monoklonální IgGfprotilátky proti lidské aGST] byly získány z fakultní nemocnice v Nijmegen (Nizozemí) jako ascites, a před použitím nebyly vyčištěny.
Harmonogram imunizace (obecně):
1. den*. Byl proveden zkušební odběr 5 ml preséra z ucha králíka a poté se 0,5 ml prasečího antigenu aGST (100 gg) smíchalo se stejným objemem Freundova úplného adjuvans. Antigen a adjuvans byly homogenizovány tak, aby vznikla dokonalá emulze. Tato směs byla poté injikována s.c. na několika místech do zad králíka, kterému byla předtím vyholena srst.
28. den: Byl proveden zkušební odběr 5 ml séra z ucha králíka a poté se 0,5 ml antigenu (100 μς) smíchalo se stejným objemem Freundova úplného adjuvans. Antigen a adjuvans byly homogenizovány tak, aby vznikla dokonalá emulze. Tato směs byla poté injikována s.c. na několika místech do zad králíka.
42. den·. Byl proveden zkušební odběr 10 ml krve z ucha králíka.
56. den: Králíkovi byla podána druhá boost, jak uvedeno pro
28. den.
70. den: Byl proveden zkušební odběr 10 ml krve z ucha králíka. Když byl titr dostatečně vysoký, byl králík utracen a bylo odebráno co nejvíce krve.
Příprava C
Imunoblotting
Všechny polyklonální a monoklonální IgG použité v následujících příkladech byly zkontrolovány na reaktivitu a zkříženou reaktivitu proti lidské a prasečí aGST (v tomto pořadí) pomoci následujících kombinaci imunoblotů:
(a) králičí IgG[protilátka proti lidské aGST] byla použita k testování nitrocelulózových membrán, obsahujících imobilizovanou lidskou a prasečí aGST.
(b) králičí IgG[protilátka proti prasečí aGST] byla použita k testování nitrocelulózových membrán obsahujících imobilizovanou lidskou a prasečí aGST.
(c) myši IgG[protilátka proti lidské aGST] byla použita k testování nitrocelulózových membrán obsahujících imobilizovanou lidskou a prasečí aGST.
Detekce imunoblot byla provedena následujícím způsobem:
c r e
1. U lidské i prasečí aGST (0,5 gg/dráha) byla provedena elektroforéza na 15 % SDS-PAGE a byly včleněny markéry molekulární hmotnosti.
2. Po elektroforéze se polyakrylamidový gel odřízl a jedna polovina byla obarvena, zatímco zbytek byl použit k elektroforetickému transferu na nitrocelulózu.
3. Po elektroforetickém transferu byly nitrocelulózové membrány blokovány po dobu 1 hodiny 5% (w/v) činidlem Marvel (Marvel je ochranná známka) v blokačním pufru PBST (fosfátem pufrovaný fyziologický roztok obsahující 0,05 % (w/v) TWEEN-20(^>) .
4. Poté byly připraveny následující roztoky:
(i) králičí IgG[protilátka proti lidské aGST] v 1% (w/v)
Marvel v PBST (ii) králičí IgG[protilátka proti prasečí aGST] v 1% (w/v)
Marvel v PBST (iii) myší IgG[protilátka proti lidské aGST] v 1% (w/v) Marvel v PBST a přidány do membrán ihned po odlití blokačního pufru. Inkubace s roztoky protilátek se nechala probíhat po dobu jedné hodiny.
5. Nitrocelulózové membrány byly poté promyty v PBST (2x vždy po dobu 5 minut).
6. Poté by připraven konjugát anti-králiči IgG-HRP (1/1000 v 1% (w/v) Marvel v PBST) a přidán do roztoků uvedených výše pod bodem 4 (i) a (ii). Rovněž byl připraven konjugát anti-myši IgGHRP (1/1000) a přidán do roztoku uvedeného výše pod bodem 4 (iii). Konjugáty protilátek různých živočišných druhů (králík/myš), použité k imunodetekci, byly získány od společnosti Bio-Rad Laboratories Limited.
7. Po jednohodinové inkubaci s konjugáty protilátek různých živočišných druhů byla reagencia zlikvidována a membrány byly promyty, jak uvedeno výše v bodě 5.
8. Poté byl připraven substrát diaminobenzidinu a přidán do membrán. Hnědý precipitát na nitrocelulózové membráně znamenal pozitivní reakci.
Příprava D
Syntéza konjugátu prasečí aGST-křenová peroxidáza (horseradish peroxidase, HRP)
Konjugáty aGST-HRP byly syntetizovány za použití metodologie konjugace thioetheru. Pomocí SMCC (sukcinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyklohexan 1-karboxylát) byly do molekul aGST zavedeny reaktivní maleimidové skupiny a na HRP byly navázány maskované sulphydrylové skupiny (Dunanc, R.J.S., et al., Anal. Biochem, 1983; 132, 68-73). Po odmaskování za účelem vytvoření reaktivních sulphydrylových skupin se maleimidem aktivované aGST a HRP-SH smíchaly dohromady a nechaly se reagovat po dobu 4,5 hodiny. Výsledný konjugát aGST-HRP, vzniklý kovalentni thioetherovou vazbou, byl přenesen do 50% (v/v)· glycerolu a uchováván při teplotě -20° C pro použití při semikompetitivní EIA v příkladu 2.
Příprava E
Biotinylace IgG(protilátky proti prasečí aGST]
Biotinylovaná IgG[protilátka proti prasečí aGST] byla připravena navázáním vyčištěné polyklonální IgG(protilátky proti prasečí aGST], která byla získána imunizací králíků vyčištěnou aGST (příprava B), na N-hydroxysukcinimid-Biotin (NHS-Biotin) v zásaditém prostředí. Reakcí nespotřebovaný NHS-Biotin by poté odstraněn extenzivní dialýzou, biotinylovaný IgG byl rozdělen na alikvoty a uchováván ve zmrazeném stavu při teplotě -20° C až do použiti.
Příklad 1
Sendvičová enzymoimunoesej
Postup je schematicky znázorněn na obr. 1.
a. Mikrotitrační deska Nunc Maxisorp (Nunc Maxisorp je ochranná známka) byla potažena myší monoklonální IgG[protilátkou proti lidské aGST] (viz příprava B) imobilizovanou pomocí kozích fragmentů F(ab)2 (protilátky proti myšímu IgG]. Takový způsob potažení protilátek slouží k orientaci vazebných míst Mab a zlepšuje i citlivost eseje tím, že omezuje na minimum adherencí indukovanou denaturaci zachycovací protilátky. Mikrotitrační desky byly blokovány roztokem proteinu/glukózy.
b. Jako kalibrátor eseje byla použita prasečí aGST, která byla purífikována z jater (příprava A) okamžitě po exspiraci a uchovávaná při teplotě 2-8° C nebo -20° C.
c. K usnadnění detekce zachycené/imobilizované aGST byly použity biotinylované konjugáty IgG[protilátky proti prasečí aGST].
d. Poté byl k detekci celého sendvičového komplexu antigenu použit konjugát Streptavidinu a křenové peroxidázy (HRP) ve spojení s užitím substrátu tetramethylbenzidinu (TMB).
e. Enzymová reakce byla ukončena přidáním 1 N H2SO4 a byla e
zmerena absorbance při 450 nm, jako referenční vlnová d^lka byla použita vlnová délka 630 nm. Intenzita barev odpovídá koncentraci aGST a po vynesení Α15ο/63θ nm versus koncentrace (μς/l) lze stanovit koncentraci neznámých vzorku (viz obr. 2). Celková doba trváni eseje byla kratší než 3,5 hodiny.
Přiklad 2
Semikompetitivní enzymoimunoesej
Postup je schematicky znázorněn na obr. 3.
a. V tomto případě byly desky Nunc Maxisorp potaženy polyklonálni IgGfprotilátkou proti prasečí aGST] zmobilizovanou pomoci proteinu A, protože bylo zjištěno, že potažení přímo polyklonálním igG neusnadnilo zachyceni aGST, nejspíše v důsledku denaturace IgG při navázání na mikrotitračni desku.
b. aGST, značená HRP, byla v tomto případě použita jako konjugát a byla přidána do mikrojamky k neznačenému kalibračnímu vzorku. Tak se spustila reakce kompetičniho typu mezi HRP značenou aGST a neznačenou aGST.
c. Po uplynutí dostatečné inkubační doby, za normálních okolností 60 minut, byla mikrotitračni deska promyta a přidal se substrát TMB.
d. Enzymová reakce byla zastavena přidáním 1 N H2SO4 a byla změřena absorbance při 450 nm s použitím 630 nm jako referenční vlnové délky. Intenzita barev je v inverzním vztahu ke koncentraci aGST a po vynesení Α4$Ο/63ο m versus koncentrace (μ5/1) lze kvantifikovat neznámé vzorky (viz obr. 4).
Přiklad 3 ♦
Hodnocení čistoty reagencií imunoeseje
Imunoblotting se prováděl postupem popsaným v přípravě C. Výsledky jsou uvedeny na obr. 5 až 8.
Klíč k drahám na obr. 5 až 8.
Dráha 1: markéry molekulární hmotnosti.
Dráha 2: lidská aGST (0,5 pg).
Dráha 3: prasečí aGST (0,5 pg).
Obr. 5 ilustruje čistotu lidské a prasečí aGST před použitím k imunizaci králíků (v obou případech ji indikuje jednoduchý pás) a potvrzuje absenci jakýchkoli jiných lidských nebo prasečích proteinů, které by jinak mohly přispívat k nižší specificitě analýzy. Analýza typu immunoblot reaktivity protilátek ukazuje, že igG[protilátka proti lidské aGST] je vysoce specifická vůči lidské aGST a nevykazuje významnou zkříženou reaktivitu vůči prasečí aGST (obr. 6), což bylo prokázáno silnou intenzitou signálu lidské aGST ve srovnání se slabou intenzitou signálu prasečí aGST. Tento nález je podepřen nepřítomností reaktivity prasečí aGST ([aGST]p), je-li zkoumána enzymoimunoeseji se specifitou na lidskou aGST ([aGST]h). Tento test je pod názvem HEPKIT dodáván společností Biotrin International Limited, Mount Merrion, County Dublin, Irsko. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 1, která představuje hodnocení reaktivity (aGST]p pomocí HEPKITu společnosti Biotrin. Je zřejmé, že při stanovení [aGST]p pomoci HEPKITu ke zkřížené reaktivitě nedochází.
Tabulka 1 [aGST]h (μς/1) A450/630 nr.
0,00
1,25
2,50
0,069
0,156
0,332
| 5,00 | 0,627 |
| 10,0 | 1,088 |
| 20,0 | 1,495 |
| 40,0 | 1,762 |
| PC | 0,839 (6,9 pg/l) |
| [aGST]p (pg/l) | A45Q/63Q nm |
| 8 | 0,012 |
| 40 | 0,010 |
| 200 | 0,012 |
| 1000 | 0,014 |
PC = pozitivní kontrola
Významnost této maximálně důležité skutečnosti spočívá v tom, že enzymoímunoesej ke stanovení lidské aGST je pro detekci lidské aGST specifická. Jakoukoliv přítomnost lidské aGST ve vzorcích, v nichž se bude měřit i prasečí aGST, lze tudíž detekovat specificky, bez zkřížené kontaminace prasečím antigenem. Nepřítomnost zkřížené reaktivity v enzymoímunoeseji lidské aGST a nález přibližně 5-10¾ zkřížené reaktivity mezi IgG[protilátkou proti prasečí aGST] a lidskou aGST {obr. 7), což indikuje slabá intenzita signálu lidské aGST ve srovnání se silnou intenzitou signálu prasečí aGST, znamená, že výsledky imunoeseje na prasečí aGST mohou být korigovány s ohledem na možný příspěvek lidské aGST, provede-li se současně s enzymoímunoeseji pro zjištěni prasečí aGST také kvantifikace lidské aGST enzymoímunoeseji HEPKIT.
r r
Pokud se například ve vzorku zjisti hodnoty:
esej aGST (gg/l) prasečí EIA (prasečí aGST)
10000
HEPKIT EIA (lidská aGST) 1000 znamená to, je-li předpokládána přibližně 7% zkřížená reaktivita lidské aGST v prasečí EIA, že příspěvek lidské aGST k hodnotám prasečí aGST činí
1000/100 x 7 = 70 gg/l.
Je tedy přítomno 10000 - 70 = 9930 μς/1 prasečí aGST.
Dále k výše uvedenému je na obr. 8 ilustrována rozsáhlá zkřížená reaktivita mezi myší IgG[protilátkou proti lidské aGST] a prasečí aGST, kterou indikuje srovnatelná intenzita příslušných pásů/signálů. Pro tento jev bylo této protilátky výhodně použito v sendvičové imunoeseji pro prasečí aGST v příkladu 1 jako zachycovací protilátky, nebo jako protilátky k potažení desek.
Přiklad 4
Specificita eseji
Protože se eseje v příkladech 1 a 2 budou používat přednostně k detekování prasečí aGST v neprasečích biologických tekutinách, je třeba zhodnotit citlivost a specificitu těchto eseji pomocí prasečí aGST přítomné v následujících matrix:
- lidská moč
- lidské sérum ~ lidská plazma
- lidská žluč
- tkáňově podpůrná média r r
K provedeni této analýzy byla prasečí aGST nasazena do všech výše uvedených matrix a následně analyzována použitím imunoeseji uvedených v příkladech 1 a 2. Kromě kvantitativní detekce aGST byla hodnocena i linearita eseje (paralelismus), a tím provedena zkouška citlivosti. Protože je nutné, aby esej svou specificitou zajistila detekci pouze prasečí aGST, a aby jakákoli výskyt lidské aGST nezpůsobil významnou interferenci, byla ve vzorcích prasečí aGST, porušených různým množstvím lidské aGST, zjišťována a měřena potenciální zkřížená reaktivita lidské aGST. Pokud existuje významná sekvenční homologie mezi oběma isoenzymy, nejedná se o pouhý triviální problém, a případ musí být řešen extenzivním testováním antiséra [protilátky proti prasečí aGST] na potenciální zkříženou reaktivitu s Lidskou aGST.
Výsledky měření prasečí aGST v různých vzorových matrix, zjištěné pomocí enzymoimunoeseji sendvičového a semikompetitivního typu, jsou uvedeny v tabulce 2.
Tabulka 2
Hodnoty prasečí aGST v upravených vzorcích, zjištěné sendvičovou a semikompetitivní imunoeseji
| Oček. hodn. (gg/D | Ředidlo vzorku (μς/ι) | Plazma- lidská (ng/i) | MEM (kompl.) (μ^/Ι) | TC-100 (kompl.) íHg/l) | Moč-lidská (μ9/1) | |||||
| s | K | S | K | S | K | S | K | S | K | |
| 0 | 61,4 | 19,4 | 0 | - | 0 | 46, 8 | 0 | 73 | 0 | 84 |
| 4000 | 4530 | 3853 | 4299 | Neměř. | 4135 | 3643 | 4754 | 3889 | 4189,5 | 3936 |
| 2000 | 2980 | 2699 | 2500 | Neměř. | 2262 | 2420 | 2059 | 2071 | 2165,2 | 1912 |
| 1000 | - | - | 1041 | Neměř. | 1180 | 1247 | 983 | 953 | 844,5 | 857 |
| 500 | 507 | 446 | 249 | Neměř. | 512 | 485 | 540 | 562 | 392,8 | 454 |
| 250 | 279 | 260 | 85 | Neměř. | 290 | 211 | 273 | 266 | 151,9 | 218 |
| 125 | 128 | 140 | 0 | Neměř. | 136 | 188 | 197 | 163 | 17,9 | 126 |
Klič:
l.S: Sendvičová enzymoimunoesej
2. K: Semikompetitivní enzymoimunoesej
3. Vzorky naředěny v poměru 1/5 pro kompetitivní esej (v rozmezí 0-
1000 pg/l), poté dále naředěny do poměru 1/100 pro sendvičovou esej (v rozmezí 0-40 pg/l)
4. MEM a TC-100: tkáňově podpůrná média
Pozn. překl.: neměř. = neměřitelné
Z tabulky 2 je zřejmé, že prasečí aGST lze zachytit a kvantifikovat ve v že prasečí všech testovaných matrix. Bylo prokázáno, podstatné, aGST je možno detekovat jak v lidské plazmě, tak i v lidské moči, a je tedy možno usnadnit posouzení stavu jaterního a ledvinného xenotransplantátu (v tomto pořadí). Za zmínku stojí, že se matrix plazmy ukázal jako neslučitelný se semikompetitivní imunoeseji, snad v důsledku interakce IgG s imobilizovaným proteinem A, což vedlo k hodnotovým anomáliím. Jinak se zdá, že všechny další tekutiny jsou slučitelné s oběma typy eseji. Zvláště významná je možnost detekce prasečí aGST v tkáňově podpůrných médiích, což by mělo zajistit možnost hodnocení xenotransplantátu ještě před vlastním výkonem, nebo umožnit analýzu viability izolovaných prasečích hepatocytů (přítomných v zásobnicích), neboť tyto systémy jsou obvykle uchovávány v klasických podpůrných médiích. Dále může zjištěná kompatibilita vzorových matrix značně usnadnit detekci aGST v médiích, která jsou používána k udržování dárcovských orgánů (např. jater) ex vivo, kdy je orgán extrakorporálné v kontaktu s kultivačním médiem.
Přiklad 5
Hodnoceni interference lidské aGST v sendvičové enzymoimunoeseji prasečí aGST
V sendvičové enzymoimunoeseji prasečí aGST z příkladu 1 byla vyhodnocována interference lidské aGST. Interference byla zjišťována jako zvýšené hodnoty absorbance. Byla-li koncentrace lidské aGST v mikrojamce nižší než 25 pg/1 (ekvivalent koncentrace vzorku 125 μς/l při zředěni ředidlem v poměru 1/5), nebyla v eseji pozorována žádná interference. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 3.
Tabulka 3
| [aGST ]p [aGST ]h (pg/i) | Absorbance 450/630 r.m. | |
| 20 | - | 0,869 |
| 20 | 6 | 0,875 |
| 20 | 12 | 0,875 |
| 20 | 25 | 0,881 |
| 20 | 50 | 0,975 |
Klíc:
aGST p - prasečí aGST aGST h - lidská aGST
Výsledky uvedené v tabulce 3 demonstrují specificitu imunoesejí k detekci prasečí aGST. Z uvedených dat je zřejmé, že lidská aGST v prováděné enzymoimunoeseji neinterferuje ani při tak vysokých koncentracích vzorku jako je 125 pg/l (25 μg/l· x 5), což představuje hodnotu 15krát a 6krát vyšší, než je horní hranice normálních hodnot pro lidskou aGST v séru a v moči (v tomto pořadí). Je patrné, že při vyšších hladinách lidské aGST (> 250 gg/l, 50 pg/l x 5) k jisté interferenci dochází. Bylo vypočítáno, že existuje 5-10% zkřížená reaktivita mezi lidskou aGST a IgG[protilátkou proti prasečí aGST]. Souběžné stanoveni hladin aGST kvantitativní imunoesejí pro lidskou i pro prasečí aGST však umožní přesně vypočíst množství přítomné lidské aGST, a toto množství pak vzít v úvahu při kvantifikaci prasečí aGST v lidských biologických tekutinách.
Je třeba dále poznamenat, že imunoesejí podle vynálezu lze použit rovněž k detekci prasečí aGST v prasečích biologických tekutinách, jak by tomu bylo v případě provádění in vitro nebo in vivo toxikologických studií s vepři nebo prasečími orgány. Toto zjištění je významné, protože je známo, že prasečí a lidská fyziologie a biochemie jsou poměrně podobné, a proto se vepři často používají jako zvířecí modely k predikci lékové toxicity u člověka.
Claims (10)
- PATENTOVÉ NÁROKY1.Způsob určování nebo zjišťováni přítomnosti anal.yzovaftóhe· parametru dárcovského orgánu ve v podstatě nedárcovské biologické tekutině, za přítomnosti nebo nepřítomnosti odpovídajícího tcv analyzovaného parametru příjemce, který ukazuje na poškození .λ· orní, dárcovského orgánu po xenotransplantaci* usnadňující identifikacipoškozeni xenotransplantátu u příjemce, kde tento způsob zahrnuje z zachycení nebo detekování uvedeného analyzovaného-parametru dárc$ pomocí protilátky, vyznačující se tím, že tato protilátka je buďtoa)b)v.t specifická pro analyzovaný parame-fe-g dárcovského orgánu a nevykazuje zkříženou reakci s odpovídajícím homologickým ana1yaevaným paramotrom- příjemce;schopná zkřížené reakce s uvedeným *dárcovského orgánu, -kde reaktivity dárcovského orgánu a homologickým analyzovaným· parametrem, příjemce jsoío -Htehe-tr-být kvantitativně odlišeny?- / na přímém nebo nepřímém dárcovského orgánu.nebo j b&nva na1y zovaným parametrem s analyzovaným puramet-f-cm stanovení analyzovaného ttv pciťometru·
- 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že příjemcem je člověk.
- 3. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že příjemcem je primát jiný než člověk.
4. Způsob podle některého z nároků 1 až 3, vyznačuj ící se tím, že dárcovský orgán pochází z vepře. 5. Způsob podle některého z nároků 1 až 4, vyznačuj ící se tím, že orgánem je ledvina. 6. Způsob podle některého z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že orgánem jsou játra. 7. Způsob podle některého z nároků 1 až 6, vyznačuj ící se tím, že analyzovaným- parametrem dárcovského orgánu je protein. • rr •re »r rr r f' r r vyznačující se tím, orgánu je enzym.vyznačující se tím, že analyzovaným že enzymem je vyznačující se tím, že enzymem je z nároků 1 až 10, vyznačující se tím, z vepře a protilátkou je polyklonální - 8. Způsob podle nároku 7, parametrem- dárcovského
- 9. Způsob podle nároku 8, glutathion S-transferáza (GST).
- 10. Způsob podle nároku 9,OfCST ~·
- 11. Způsob podle některého že dárcovský orgán pochází protilátka proti prasečí<vú 44
- 12. Způsob podle některého z předcházejících nároků,—a-ávlalého · fta nároku 2, vyznačující se tím, že protilátkou je protilátka proti lidské p/GST, která vykazuje v podstatě 100% zkříženou reaktivitu vůči praseči^GST.
- 13. Způsob podle nároku 11, vyznačující se tím, že jakákoli přítomná lidská V^ST se detekuje s využitím specifické protilidské ipGST v odděleném systému vzorků.
- 14. Způsob podle některého z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že dárcovský materiál se testuje na viabilitu před xenotransplantací.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CA002239882A CA2239882C (en) | 1995-12-08 | 1995-12-08 | Method of determining or detecting donor organ damage following xenotransplantation based on donor organ-derived analytes |
| PCT/IE1995/000061 WO1997022003A1 (en) | 1995-12-08 | 1995-12-08 | Method of determining or detecting donor organ damage following xenotransplantation based on donor organ-derived analytes |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ9801553A3 true CZ9801553A3 (cs) | 2001-08-15 |
| CZ288968B6 CZ288968B6 (cs) | 2001-10-17 |
Family
ID=25680286
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ19981553A CZ288968B6 (cs) | 1995-12-08 | 1995-12-08 | Způsob určování nebo zjią»ování poąkození dárcovského orgánu po xenotransplantaci pomocí analýzy látek pocházejících z orgánu dárce |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0871881B1 (cs) |
| JP (1) | JP2000502182A (cs) |
| AT (1) | ATE213835T1 (cs) |
| AU (1) | AU710668B2 (cs) |
| BR (1) | BR9510669A (cs) |
| CA (1) | CA2239882C (cs) |
| CZ (1) | CZ288968B6 (cs) |
| DE (1) | DE69525661T2 (cs) |
| ES (1) | ES2172601T3 (cs) |
| HU (1) | HUT78056A (cs) |
| PL (1) | PL180437B1 (cs) |
| WO (1) | WO1997022003A1 (cs) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6977140B1 (en) | 1998-09-29 | 2005-12-20 | Organ Recovery Systems, Inc. | Method for maintaining and/or restoring viability of organs |
| US6492103B1 (en) | 2000-01-31 | 2002-12-10 | Organ Recovery Systems, Inc. | System for organ and tissue preservation and hypothermic blood substitution |
| US9420770B2 (en) | 2009-12-01 | 2016-08-23 | Indiana University Research & Technology Corporation | Methods of modulating thrombocytopenia and modified transgenic pigs |
| US20260079165A1 (en) * | 2024-09-13 | 2026-03-19 | Immucor Gti Diagnostics, Inc. | Detecting xenotransplant organ rejection |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5217868A (en) * | 1992-05-01 | 1993-06-08 | Syncor Limited | Measurement of an enzyme marker as an aid to diagnosis of liver transplant rejection |
| EP0692716A1 (en) * | 1994-07-12 | 1996-01-17 | Bayer Ag | Method of assaying for glutathione- S-transferase and diagnostic test therefrom |
| AU2147295A (en) * | 1995-04-03 | 1996-10-23 | Syncor Intellectual Properties Limited | Rapid assays for the detection of glutathione s-transferases |
-
1995
- 1995-12-08 PL PL95328156A patent/PL180437B1/pl unknown
- 1995-12-08 ES ES95939377T patent/ES2172601T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-12-08 CZ CZ19981553A patent/CZ288968B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1995-12-08 AT AT95939377T patent/ATE213835T1/de not_active IP Right Cessation
- 1995-12-08 DE DE69525661T patent/DE69525661T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1995-12-08 AU AU41229/96A patent/AU710668B2/en not_active Ceased
- 1995-12-08 HU HU9901060A patent/HUT78056A/hu unknown
- 1995-12-08 JP JP09521902A patent/JP2000502182A/ja active Pending
- 1995-12-08 WO PCT/IE1995/000061 patent/WO1997022003A1/en not_active Ceased
- 1995-12-08 CA CA002239882A patent/CA2239882C/en not_active Expired - Fee Related
- 1995-12-08 EP EP95939377A patent/EP0871881B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-12-08 BR BR9510669A patent/BR9510669A/pt not_active Application Discontinuation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CZ288968B6 (cs) | 2001-10-17 |
| EP0871881B1 (en) | 2002-02-27 |
| PL180437B1 (en) | 2001-02-28 |
| ATE213835T1 (de) | 2002-03-15 |
| PL328156A1 (en) | 1999-01-18 |
| CA2239882A1 (en) | 1997-06-19 |
| CA2239882C (en) | 2003-07-29 |
| AU710668B2 (en) | 1999-09-23 |
| DE69525661T2 (de) | 2002-09-12 |
| EP0871881A1 (en) | 1998-10-21 |
| JP2000502182A (ja) | 2000-02-22 |
| HUT78056A (hu) | 1999-07-28 |
| BR9510669A (pt) | 1999-05-04 |
| DE69525661D1 (de) | 2002-04-04 |
| WO1997022003A1 (en) | 1997-06-19 |
| ES2172601T3 (es) | 2002-10-01 |
| AU4122996A (en) | 1997-07-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ300997A3 (cs) | Způsob rychlého zjištění stavu orgánu, založený na detekci jednoho nebo více izoenzymů glutathion S-transferázy | |
| Stange et al. | Immunoelectron microscopic single and double labelling of aminopeptidase N (CD 13) and dipeptidyl peptidase IV (CD 26) | |
| CN115184620B (zh) | 一种pla2r抗体的量子点荧光检测试纸条、试剂盒及其应用 | |
| ES2262153T3 (es) | Metodo para determinar el estado hepatico de un receptor de transplante de higado. | |
| US20040248216A1 (en) | Method of examining cancer by assaying autoantibody against mdm2 and reagent therefor | |
| CA2366651C (en) | A method for detecting megsin protein and use thereof | |
| EP0871881B1 (en) | Method of determining or detecting donor organ damage following xenotransplantation based on donor organ-derived analytes | |
| EP0931094A1 (en) | Methods for determining the presence of brain protein s-100 | |
| Sundberg et al. | ELISA procedures for the quantitation of glutathione transferases in the urine | |
| CN106537147A (zh) | 通过测定ast的含量诊断、预后或监测肝脏疾病的试剂盒和方法 | |
| US8426180B2 (en) | Use of carbamoyl phosphate synthetase 1 (CPS) as a humoral biomarker for the diagnosis of tumour diseases and chronic inflammatory intestinal diseases | |
| RU2157540C2 (ru) | Способ определения или обнаружения повреждения органа-донора после ксенотрансплантации на основе анализа веществ, полученных из органа-донора | |
| Yoshida et al. | Changes of sinusoidal basement membrane collagens in early hepatic fibrosis induced with CCl4 in cynomolgus monkeys | |
| RU2164027C2 (ru) | Способ определения состояния печени | |
| KR20100060897A (ko) | 에틸벤젠 독성 중독 진단용 바이오마커 | |
| JP4172777B2 (ja) | 外リンパ瘻の検出方法 | |
| JP2878317B2 (ja) | ラミニン測定試薬 | |
| WO2004003020A1 (ja) | 外リンパ瘻の検出方法 | |
| PT1272525E (pt) | Anticorpo que reconhece especificamente o psa livre inactivo, e sua aplicações | |
| JPH0694708A (ja) | 抗グルタミン酸デカルボキシラーゼ抗体の検出方法 | |
| Lilley | Characterisation of a calcium dependent transglutaminate in Pisum sativum leaf and root tissue. | |
| CA2481114A1 (en) | Cardiovascular disease and thrombotic risk diagnostic tests | |
| JPH06249852A (ja) | Ｄ−アミノ酸酸化酵素ポリクローナル抗体ならびに該抗体を使用するｄ−アミノ酸酸化酵素の測定方法 | |
| JP2000065838A (ja) | 臓器移植後の慢性拒絶反応の検査法 | |
| CA2381613A1 (en) | Cardiovascular disease and thrombotic risk diagnostic tests |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20041208 |