PL180437B1

PL180437B1 - Method of determining or detecting donor's organis injuries after a xenotransplantation on the basis of analytes taken from donor's organs

Info

Publication number: PL180437B1
Application number: PL95328156A
Authority: PL
Inventors: John Martin Doyle; Cormac Gerard Kilty
Original assignee: Biotrin Intellectual Properties Limited; Biotrin Intellectual Properties Ltd; Biotrin Intellectual Pty Ltd
Priority date: 1995-12-08
Filing date: 1995-12-08
Publication date: 2001-02-28
Also published as: DE69525661T2; CZ288968B6; CZ9801553A3; AU710668B2; AU4122996A; EP0871881B1; DE69525661D1; ES2172601T3; EP0871881A1; PL328156A1; CA2239882A1; ATE213835T1; HUT78056A; WO1997022003A1; JP2000502182A; BR9510669A; CA2239882C

Abstract

1. Sposób oznaczania lub wykrywania S-transferazy glutationowej, a zwlaszcza S-transferazy a-glutationowej, jako markera uszkodzenia narzadu dawcy po przeszczepie poprzez oznaczenie jej ilosci lub wykrycie jej obecnosci, posrednio lub bezposrednio, w plynie biologicznym biorcy lub preparacie tego plynu, znamienny tym, ze S-transferaze glutationowa pochodzaca z narzadu dawcy gatunku innego niz biorca wychwytuje sie lub wykrywa przez dzialanie na nia przeciwcialem IgG specyficznym dla tej S-transferazy glutationowej pochodzacej z narzadu dawcy lub zdolnym do reakcji krzyzowej z ta S-transferaza glutationowa pochodzaca z narzadu dawcy. PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób oznaczania lub wykrywania S-transferazy glutationowej, a zwłaszcza S-transferazy glptationoweji jako markera uszkodzenia narządu dawcy po przeszczepie.

Na całym świecie występuje niedobór narządów do alloprzeszczepów (przeszczepów wewnątrzgatunkowych), np. wątroby, nerek i serca, toteż ten problem usiłuje się rozwiązać, przynajmniej tymczasowo, przez użycie narządów zwierzęcych przed ortotopowym zabiegiem operacyjnym. Chari, R.S. i inni (The New England łournal of Medicine (1994); tom 33, nr 4, str. 234 - 237) zastosowali w leczeniu niewydolności wątroby perfuzję wątroby świni ex vivo, a następnie ortotopowy przeszczep wątroby. Jednego pacjenta stabilizowano przez 10 dni, po czym przeszedł on udany ertotopowy przeszczep wątroby. Jednakże wcześniejsze próby ksenoprzeszczepów narządów (przeszczepów międzygatunkowych) nie były pomyślne z powodu występowania zjawiska zwanego odrzuceniem nadostrym, które objawia się tym, iż nowo przeszczepiony narząd jest uszkadzany i odrzucany przez układ immunologiczny gospodarza w ciągu kilku godzin po przeszczepieniu go biorcy. Rozwój, jaki nastąpił w ostatnich latach

180 437 w dziedzinie genetyki molekularnej, pozwolił stworzyć zwierzęta transgeniczne (głownie świnie), których narządy zostały zmienione technikami inżynierii genetycznej w taki sposób, że są. one mniej immunogenne po przeniesieniu do organizmów innych gatunków (np. człowieka i innych naczelnych) (Transplant News (1995); tom 5, nr 9). W pracy tej postuluje się osiąganie tolerancji immunologicznej poprzez ekspresję w narządzie transgenicznym ludzkiego genu „czynnika przyspieszającego rozkład”, który przeciwdziała aktywacji składników dopełniacza (np. kompleksu Cb3), a zatem minimalizuje odrzucenie nadostre. Jednakże, tak jak w przypadku alloprzeszczepów, odrzucenie ksenoprzeszczepu jest w dalszym ciągu problemem, z którym musi zmagać się lekarz transplantolog, dodatkowo komplikowanym przez fakt, iż tkanki pochodzące od dawcy innego gatunku są obecne w organizmie biorcy przeszczepu.

W standardowo stosowanych testach na funkcyjonowanie wątroby nie można odróżnić analitów pochodzących od biorców i od dawców (np. świńskich i ludzkich). Przykładowo w pomiarach prowadzonych w przypadku surowiczej aminotransferazy alaninowej (ALT)/aminotransferazy asparaginianowej nie są rozróżniane enzymy pochodzenia ludzkiego i świńskiego, dlatego te pomiary nie nadają się do identyfikacji pochodzenia enzymu po przeszczepie. Podobna sytuacja występuje w przypadku analizy po ksenoprzeszczepie nerek. Nie ma obecnie powszechnie zaakceptowanego białkowego markera integralności nerek.

S-transferazy glutationowe (GST) stanowią, wielogenową rodzinę białek składającą się głownie z izoform klasy alfa (αGST), mi, (pGST), pi (nGST), teta (0GST), definiowanych w zależności od ich punktu izoelektrycznego, i są one odpowiedzialne za detoksykacje wielu ksenobiotyków, głównie przez związanie z glutationem (Beckett, G. J. i Hayes, J.D. Advences in Clinical Chemistry (1993); 30, 281 - 380). U ludzi dystrybucja aGST w wątrobie jest równomierna, a przy tym poziom α GST w wątrobie jest stosunkowo wysoki, a okres jej półtrwania w osoczu jest dość krótki (około 1 godziny), co oznacza, iż ten enzym jest bardziej czuły niż aminotransferazy jako wskaźnik stanu wątroby po przeszczepie i uszkodzenia wątroby wywołanego lekami.

EP-A 0 640 145 ujawnia sposób ułatwiający wczesną diagnozę odrzucenia alloprzeszczepu wątroby przez biorcę, polegający na pomiarze wzrostu poziomu aGST w osoczu lub surowicy biorący przy braku zmiany lub przed wystąpieniem zmiany poziomu transaminazy w osoczu lub surowicy.

S-Transferaza π-glutationowa występuje w cytoplazmie komórek nabłonka dróg żółciowych w wątrobie, przypuszczalnie tylko w formie homodimetrycznej. Nierównomierna dystrybucja GST wewnątrz wątroby sugeruje, iż rożne izoenzymy mają in vivo unikalne funkcje w różnych obszarach wątroby, a tym samym ' można przypuszczać, iż pomiary poziomu GST w osoczu lub żółci pomogą w monitorowaniu stanu wątroby osobnika. Podobnie unikalna dystrybucja występuje w tkance nerek, gdzie aGST występuje w części bliższej, a nGST tylko w części dalszej kanalika nerkowego (Campbell, J.A.H. i inni, Cancer (Filadelfia) (1991); 67, 1608 - 1613). W najnowszym doniesieniu zaproponowano stosowanie jednoczesnego wykrywania α/nGST w ludzkim moczu do rozróżnienia odpowiednio nefrotoksyczności spowodowanej cyklosporyną A i odrzucenia przeszczepu, -a to dzięki specyficzności tych uszkodzeń tkanek względem miejsca ich wystąpienia (Sundberg, A.G.M i inni, Nephron, (1994): 67,308 - 316).

Istnieje zatem zapotrzebowanie na opracowanie metody pozwalającej rozróżnić anality pochodzące od biorcy i dawcy przeszczepu w celu wykrycia uszkodzenia przeszczepionego narządu lub rozróżnienia uszkodzenia narządów biorcy i/lub przeszczepionego narządu dawcy. Taką właśnie metodę stanowi sposób według wynalazku.

Zgodnie ze sposobem według wynalazku S-transferazę glutationową, a zwłaszcza S-transferazę α-glutationową, oznacza się lub wykrywa poprzez oznaczenie jej ilości lub wykrycie jej obecności, pośrednio lub bezpośrednio, w płynie biologicznym biorcy lub preparacie tego płynu, przy czym ten sposób charakteryzuje się tym, że S-transferazę glutationową pochodzącą z narządu dawcy gatunku innego niż biorca wychwytuje się lub wykrywa przez działanie na nią przeciwciałem IgG specyficznym dla tej S-transferazy glutationowej pochodzącej z narządu dawcy lub zdolnym do reakcji krzyżowej z tą S-transferazą glutationową pochodzącą z narządu dawcy.

180 437

Tak więc sposób według wynalazku stanowi prostą i skuteczną metodę umożliwiającą identyfikację uszkodzenia ksenoprzeszczepu, czyli narządu pochodzącego od dawcy innego gatunku niż biorca, w organizmie biorcy. Oznaczenie i wykrywanie można prowadzić w próbce zawierającej lub nie zawierającej GST biorcy. Dzięki możliwości odróżnienia GST pochodzących od biorcy od pochodzących z narządu dawcy uzyskuje się wskazówkę na temat stanu ksenoprzeszczepu i możliwości jego odrzucenia, tak więc możliwe jest podjęcie odpowiedniego leczenia korygującego zaraz po zidentyfikowaniu w płynach biologicznych biorcy takiego GST pochodzącego z narządu dawcy, jak to przedstawiono bardziej szczegółowo poniżej.

Przez określenie „płyn biologiczny lub jego preparat” rozumie się tu płyny ustrojowe, takie jak żółć, osocze, surowica i mocz i ich preparaty, jak również pożywki tkankowe i perfuzaty, zwłaszcza w przypadku badania żywotności przeszczepianych narządów przed ich przeszczepieniem. Wszystkie te płyny i ich preparaty zwane są także macierzami.

Przez określenie „pochodzące z narządu dawcy” rozumie się same narządy, jak również tkanki i komórki, które są trwałymi ich częściami lub z nich pochodzą

Podobnie, przez określenie „materiał dawcy” rozumie się same narządy, jak również tkanki i komórki, które są ich trwałymi częściami lub z nich pochodzą

Tak więc np. materiałem dawcy może być wątroba, część wątroby, taka jak płat, lub komórki wątrobowe. W przypadku komórek wątrobowych standardowo używa się nabojów z komórkami wątrobowymi.

Na ogół biorcąjest człowiek lub inne naczelne.

Korzystne jest stosowanie materiału dawcy pochodzącego od naczelnych, z wyłączeniem człowieka, lub od zwierzęcia, takiego jak świnia, które jest fizjologicznie i biochemicznie podobne do człowieka.

Zwierzę-dawca może być zwierzęciem transgenicznym.

Ksenoprzeszczep może zostać wykonany in vivo lub ex vivo.

Narządem, którego ksenoprzeszczep wykonuje się, jest korzystnie serce, nerka lub wątroba.

Korzystnie GST pochodząca z narządu dawcy jest specyficzna dla dawcy. W przypadku obecności odpowiadającej jej GST biorcy, korzystne jest, by GST biorcy miała niski stopień homologii z GST pochodzącą z narządu dawcy. Jednak GST pochodząca z narządu dawcy może mieć wysoki stopień homologii (np. ponad 80% homologii) z odpowiednią GST biorcy i pomimo tego może być wykryta sposobem według wynalazku, jak to opisano poniżej.

Korzystnie oznaczanie wychwyconej GST pochodzącej z narządu dawcy prowadzi się drogą testu immunologicznego. Odpowiednie formy testów immunologicznych stanowią testy immunoenzymatyczne.

Tak więc w przypadku świńskiej aGST w płynach biologicznych człowieka świńska aGST może zostać wychwycona przez IgG przeciw świńskiej aGST związaną bezpośrednio lub pośrednio z fazą stałą, lub, alternatywnie, przez IgG przeciw ludzkiej α GST wykazującą reaktywność krzyżową.

Otrzymano królicze poliklonalne IgG przeciw świńskiej α GST, które wykazuje wysoką specyficzność względem świńskiej aGST. Gdy to przeciwciało wykazuje także niski stopień (około 5 -10%) reaktywności krzyżowej z ludzką α GST, jak to dzieje się w obecności wysokiego stężenia ludzkiej aGST, to wówczas ludzką aGST można oznaczyć osobno i można poprawnie wyliczyć zawartość świńskiej α GST, co opisano poniżej.

Zidentyfikowano także monoklonalne przeciwciało IgG przeciw ludzkiej αGST wykazujące prawie 100% · reaktywności krzyżowej ze świńską α GST, co opisano szczegółowo w przykładzie 8.

Test immunoenzymatyczny może być testem kanapkowym lub półkompetycyjnym testem immunoenzymatycznym, jak to opisano w przykładach 6 i 7.

Zgodnie z innym'aspektem wynalazku, materiał dawcy bada się pod względem żywoności przed ksenoprzeszczepem.

Zatem wynalazek umożliwia także zbadanie żywotności materiału dawcy przez pomiar GST pochodzącego z narządu dawcy w płynie biologicznym, który perfunduje materiał dawcy, z użyciem adaptacji opisanego tu sposobu.

180 437

Zgodnie z tym aspektem wynalazku GST można wykryć sposobem według wynalazku lub dowolnym znanym sposobem. Przykładowo można przeprowadzić test enzymatyczny oparty na użyciu substratu dla enzymu.

Na załączonym rysunku, fig. 1 przedstawia schematyczny diagram enzymatycznego testu kanapkowego z przykładu 6; fig. 2 przedstawia wykres zależności absorbancji przy 450/630 nm od stężenia aGST (pg/litr) według kanapkowego immunometrycznego testu immunoenzymatycznego dla świńskiej aGST z przykładu 6; fig. 3 przedstawia schematyczny diagram półompetycyjnego testu immunoenzymatycznego z przykładu 7; fig. 4 przedstawia wykres zależności absorbancji przy 450/630 nm od stężenia aGST (pg/litr) według kompetycyjnego immunometrycznego testu immunoenzymatycznego dla świńskiej aGST z przykładu 7; fig. 5 przedstawia wyniki analizy SDS-PAGE ludzkiej i świńskiej aGST; fig. 6 przedstawia wyniki analizy techniką immunoblottingu ludzkiej i świńskiej aGST z użyciem IgG [przeciw-ludzkiej aGST] i koziej IgG [przeciw-króliczej IgG], sprzężonych z HRP; fig. 7 przedstawia analizę techniką immunoblottingu ludzkiej i świńskiej aGST z użyciem IgG [przeciw-świńskiej aGST] i koziej IgG [przeciw-króliczej IgG] sprzężonych z HRP; a fig. 8 przedstawia analizę techniką immunoblottingu ludzkiej i świńskiej aGST z użyciem IgG [przeciw-ludzkiej aGST] i koziej IgG [przeciw-mysiej IgG] sprzężonych z HRP.

Sposób według wynalazku ilustru_^ią następujące przykłady.

Przykład 1

Oczyszczanie świńskiej aGST aGST z wątroby świni oczyszczono za pomocą chromatografii powinowactwa i chromatoogniskowania (pH 9,5 - 6,0). Szczegóły procedury oczyszczania są następujące:

a. 30 g świńskiej wątroby homogenizowano przez 2 minuty w buforze do homogenizacji, w stosunku jedna część wątroby na trzy części buforu, z użyciem miksera Waring (Waring jest znakiem towarowym). Bufor do homogenizacji miał następujący skład:

mM tris-HCl

250 mM sacharoza 5 mM EDTA o pH 7,8 2 pg/nd leupeptynn 2 pg/πύρ epetatyny

b. Homogenizat wątroby wirowano przy 10000 g przez 60 minut.

c. Supernatant naniesiono następnie na kolumnę do chromatografii powinowactwa Glutathione (GSH)-Sepharose, równoważonej wcześniej 10 mM Tris o pH 9,1. Bufor do równoważenia zastosowano ponownie w celu wypłukania nie związanych białek. Kolumnę przemyto następnie 50 mM Tris o pH 9,1 zawierającym 5 mM GSH w celu wypłukania związanej GST z kolumny powinowactwa.

d. Wypłukany materiał poddano dializie wobec 25 mM etanoloaminy o pH 9,5 i naniesiono na kolumnę do chromatoogniskowania (PBE94 dostarczonej przez Pharmacia). Jako buforu do elucji użyto Polybuffer 96 (Polybuffer 96 jest znakiem towarowym) przygotowanego według instrukcji producenta.

Przykład 2

Wytwarzanie i oczyszczanie przeciwciał

Oczyszczoną świńską aGST wstrzyknięto podskórnie (s.c.) królikom New Zealand White, według harmonogramu czasowego podanego poniżej, i oceniono surowicę pod względem reaktywności przeciw a GST. Gdy miano IgG [przeciw świńskiej a GST] było wystarczające, co stwierdzono drogą półdościowej analizy techniką blottingu punktowego (dot blot), zwierzętom upuszczono krew i zebrano surowicę. Całkowitą IgG oczyszczono z surowicy króliczej metodą chromatografii powinowactwa do białka A i użyto do powleczenia płytek do mikromiareczkowania (półkompetycyjny EIA - przykład 7) i biotynylacji (kanapkowy ELA - przykład 6). Monoklonalne IgG [przeciw ludzkiej aGST] (puchlina), otrzymano z The University Hospital, Nijmegen, Holandia i nie oczyszczano go dalej przed użyciem.

Harmonogram immunizacji (ogólny):

Dzień 1: Pobrano do badań 5 ml przedsurowicy z ucha królika, po czym zmieszano 0,5 ml świńskiego antygenu a GST (100 pg) z równą objętością pełnego adiuwantu Freunda.

180 437

Antygen i adiuwant zhomogenizowano, aby uzyskać dobrą emulsję. Następnie tę mieszaninę wstrzyknięto podskórnie w szereg miejsc na boku królika, wcześniej ogolonym.

Dzień 28: Pobrano do badań 5 ml surowicy z ucha królika, po czym zmieszano 0,5 ml antygenu (100 pg) z równą objętością pełnego adiuwantu Freunda. Antygen i adiuwant zhomogenizowano, aby uzyskać dobrą emulsję. Następnie tę mieszaninę wstrzyknięto podskórnie w szereg miejsc na boku królika.

Dzień 42: Pobrano 10 ml krwi z ucha królika.

Dzień 56: Powtórnie wykonano zastrzyk królikowi, jak opisano dla dnia 28.

Dzień 70: Pobrano do badań 10 ml krwi z ucha królika. Gdy miano było wystarczająco wysokie, królika uśmiercano i zbierano możliwie jak najwięcej krwi.

Przykład 3

Analiza techniką immunoblottingu

Wszystkie poliklonalne i monoklonalne IgG użyte w poniższych przykładach sprawdzono pod względem reaktywności i reaktywności krzyżowej względem ludzkich i świńskich αGST, odpowiednio przez następujące kombinacje analizy techniką immunoblottingu:

(a) Króliczą IgG [przeciw ludzkiej aGST] zastosowano jako sondę do sprawdzenia nitrocelulozowych błon zawierających unieruchomione ludzkie i świńskie α GST.

(b) Króliczą IgG [przeciw świńskiej aGST] zastosowano jako sondę do sprawdzenia nitrocelulozowych błon zawierających unieruchomione ludzkie i świńskie α GST.

(c) Mysią IgG [przeciw ludzkiej α GST] zastosowano jako sondę do sprawdzenia nitrocelulozowych błon zawierających unieruchomione ludzkie i świńskie αGST.

Zastosowano następującą metodę wykrywania drogą analizy techniką immunoblottingu:

1. Ludzkie i świńskie αGST (0,5 pg/ścieżkę) poddano elektroforezie w 15% SDS-PAGE razem ze znacznikami masy cząsteczkowej.

2. Po elektroforezie żel poliaryloamidowy rozcięto i na jednej jego połowie wybarwiono białka, a drugiej użyto do elektroforetycznego przeniesienia na nitrocelulozę.

3. Po przeniesieniu elektroforetycznym błony nitrocelulozowe wysycano przez 1 godzinę 5% (wag./obj.) Marvel (Marvel; jest znakiem towarowym) w roztworze solanki buforowanym fosforanem zawierającym 0,05% (wag./obj.) buforu blokującego TWEEN-20 (PBST).

4. Przygotowano następujące roztwory':

(i) Królicza IgG [przeciw ludzkiej α GST] w 1% (wag./obj.) Marvel w PBST (ii) Królicza IgG [przeciw świńskiej α GST] w 1% (wag./obj.) Marvel w PBST (iii) Mysia IgG [przeciw świńskiej α GST] w 1% (wag./obj.) Marvel w PBST i dodano je do błon, po zdekantowaniu buforu blokującego. Inkubację z roztworami przeciwciał prowadzono przez 1 godzinę.

5. Następnie błony nitrocelulozowe przemyto PBST (2 x po 5 minut):

6. Przygotowano koniugat HRP-IgG przeciw-króliczej α GST (1/1000) w 1% (wag./obj.) Marvel w PBST i dodano do powyższych roztworów 4(i) i (ii). Przygotowano także koniugat HRP-IgG przeciw-mysiej αGSτ, (1/1000) i dodano do powyższego roztworu4(iii).-Koniugaty przeciw-gatunkowe (królicze/mysie) użyte do immunodetekcji, otrzymano z Bio-Rad Laboratories Limited.

7. Po 1 godzinie inkubacji z koniugatami przeciw-gatunkowymi reagenty usunięto i błony przemyto jak w punkcie 5.

8. Następnie przygotowano substrat, diaminobenzydynę, i dodano do błony. Dodatnia reakcja była widoczna jako brązowy osad na błonie nitrocelulozowej.

Przykład 4

Synteza koniugatów świńska α GST-peroksydaza chrzanowa (HRP):

Koniugaty świńskie αGST-HRP zsyntetyzowano z użyciem metody sprzęgania tioeterowego. Reaktywne grupy maleimidowe wprowadzono na cząsteczki αGST z użyciem SMCC (1-karboksylanu sukcynimidylo-4-(N-maleimido-metylo)cykloheksanu), a zabezpieczone grupy sulfhydrylowe związano z HRP (Duncan, R. J. S. i inni (1983); Anal. Biochem. 132, 68-73). Po etapie odblokowania uwalniającym reaktywne grupy sulfhydrylowe, zmieszano aktywowaną maleimidem αGST i HRS-SH i prowadzono reakcję przez 4,5 godziny. Koniugat αGST-HRP, po

180 437 wstały w wyniku wytworzenia kowalencyjnego wiązania tioeterowego, przeniesiono do 50% (obj.) gliceryny i przechowywano w -20° do użycia w półkompetycyjnym EIA z przykładu 7.

Przykład 5

Biotynylacja IgG [przeciw świńskiej α GST]

Biotynylowaną. IgG [przeciw świńskiej α GST] przygotowano przez sprzęganie oczyszczonej poliklonalnej IgG [przeciw świńskiej aGST], wcześniej otrzymanej przez immunizację królików oczyszczoną α GST (jak opisano w przykładzie 2), z N-hydroksysukcynimidobiotyną (NHS-biotyną) w warunkach zasadowych. Następnie NHS-biotynę, która nie przereagowała, usunięto na drodze wyczerpującej dializy i biotynylowaną IgG podzielono na porcje i przechowywano w stanie zamrożonym w - 20°C do chwili jej użycia.

Przykład 6

Immunoenzymatyczny test kanapkowy

Zastosowaną procedurę przedstawiono schematycznie na fig. 1.

a. Na płytkę do mikromiareczkowania Nunc Maxisorp (Nunc Maxisorp jest znakiem towarowym) nawarstwiono mysiią monoklonalną IgG [przeciw ludzkiej α GST] (patrz przykład 2) immobilizowaną kozimi fragmentami F(ab)2 [przeciw mysiej IgG].Taka metoda nawarstwiania przeciwciał ma na celu zorientowania miejsc wiązania Mab, a także zwiększa czułość testu przez ograniczenie do minimum indukowanej przez przyleganie denaturacji wychwytywanego przeciwciała. Płytki do mikromiareczkowania zablokowano roztworem białko/sacharoza.

b. Świńską α GST, oczyszczoną z wątroby, jak to opisano w przykładzie 1, uzyskaną bezpośrednio po uśmierceniu zwierząt i przechowywaną w 2 - 8°C lub w -20°C, zastosowano do skalowania testu.

c. Koniugaty biotynylowanej IgG [przeciw świńskiej αGST] zastosowano do wykrycia wychwyconej/immobilizowanej α GST.

d. Koniugat peroksydaza chrzanowa (HRP)-streptawidyna zastosowano do wykrycia pełnego kanapkowego kompleksu antygenowego w połączeniu z użyciem substratu w postaci tetrametylobenzydyny (TMB).

e. Reakcję enzymatyczną przerwano dodając 1N H2SO4 i zmierzono absorbcję przy 450 nm i z użyciem fali 630 nm jako wzorca. Intensywność zabarwienia była proporcjonalna do stężenia świńskiej α GST i po wykreśleniu zależności A450/630 nm względem stężenia (ag/litr) można wyznaczyć stężenie w nieznanych próbkach (patrz fig. 2). Całkowity czas testu wynosił mniej niż 3,5 godziny.

Przykład 7

Półkompetycyjny test immunoenzymatyczny

Procedurę przedstawiono schematycznie na fig. 3.

a. W tym przypadku na płytkę do mikromiareczkowania Nunc Maxisorp nawarstwiono poliklonalną IgG [przeciw świńskiej αGST] immobilizowaną białkiem A, gdyż stwierdzono, że bezpośrednie nawarstwianie poliklonalnej IgG nie ułatwia wychwytywania αGST, prawdopodobnie z powodu denaturacji pod wpływem związania z płytką do mikromiareczkowmtia.

b. Zastosowano α GST znakowaną HRP jako koniugat i dodano do mikrostudzienki zaraz po nie znaczonym kalibratorze/próbce. W tym przypadku reakcję typu kompetycyjnego wywołano pomiędzy α GST znakowaną HRP i nie znakowaną α GST.

c. Po odpowiednim czasie inkubacji, zazwyczaj po 60 minutach, płytki do mikromiareczkowania przemywano i dodawano substratu TMb.

d. Reakcję enzymatyczną zatrzymano przez dodanie 1N H2SO4 i zmierzono absorbancję przy 450 nm z użyciem fali 630 nm jako wzorca. Intensywność zabarwienia była proporcjonalna do stężenia świńskiej α GST i po wykreśleniu zależności A450/630 nm względem stężenia (pg/L) wyznaczyć można stężenie w nieznanych próbkach (patrz fig. 4).

Przykład 8

Ocena czystości odczynników testu immunologicznego

Analizę techniką immunoblottingu przeprowadzono zgodnie z procedurą opisaną w przykładzie 3. Wyniki przedstawiono na fig. 5-8.

Klucz do ścieżek w fig. 5-8

Ścieżka 1: Znacznik masy cząsteczkowej

180 437

Ścieżka 2 : Ludzka α GST (0,5 pg)

Ścieżka 3 : Świńska aGST (0,5 pg)

Figura 5 ilustruje czystość (na co wskazuje pojedynczy prążek w każdym z przypadków) ludzkiej i świńskiej aGST przed immunizacją królików i potwierdza brak innych białek ludzkich lub świńskich, które mogłyby przyczynić się do zmniejszenia specyficzności testu. Analiza reaktywności przeciwciała techniką, immunoblottingu ujawnia, że IgG [przeciw ludzkiej aGST] wskazuje wysoką specyficzność w stosunku do ludzkiej α GST i nie wykazuje żadnej znaczącej reaktywności krzyżowej w stosunku do świńskiej aGST (fig. 6), na co wskazuje duża intensywność sygnału pochodzącego od ludzkiej α GST i stosunkowo mała intensywność sygnału pochodzącego od świńskiej aGST. Wynik ten został potwierdzony przez brak reaktywności świńskiej aGST (a GST)p w specyficznym względem ludzkiej aGST (a GST)h teście immunoenzymatycznym dostępnym z Biotrin International Limited - Mount Merrion, Country Dublin, Irlandia, pod nazwą HEPKIT. Wyniki zestawiono w •tabeli 1, która przedstawia ocenę reaktywności aGSTp w teście HEPKIT firmy Biotrin. Widoczne jest, że aGSTp nie wykazuje żadnej reaktywności krzyżowej w teście HEPKIT,

Tabela 1

[aGST]h (pg/litr)	A450/630 nm
0,00	0,069
1,25	0,156
2,50	0,332
5,00	0,627
10,0	1,088
20,0	1,495
40,0	1,762
PC	0,839 (6,9 pg/litr)
[aGST]p (pg/litr)	A450/630 nm
8	0,012
40	0,010
200	0,012
1000	0,014

PC = dodatnia· próba kontrolna

Wynik ' ten ma bardzo duże znaczenie, gdyż ukazuje on, iż ilościowy test immunoenzymatyczny dla ludzkiej aGST jest specyficzny do wykrywania ludzkiej aGST. Tak więc jakakolwiek ludzka aGST, obecna w próbkach ze świńską a GST, zostanie oznaczona i przez to specyficznie wykryta, bez krzyżowego zanieczyszczenia świńskim antygenem. Brak reaktywności krzyżowej w teście immunoenzymatycznym dla ludzkiej aGST i fakt, iż około 5 - 10% reaktywności krzyżowej występuje pomiędzy IgG [przeciw świńskiej aGST] i ludzkiej aGST (fig. 7), na co wskazuje słaba intensywność sygnału pochodzącego od ludzkiej aGST w porównaniu z dużą intensywnością sygnału pochodzącego od świńskiej aGST, oznacza, że równoczesna ocena ilości ludzkiej aGST w teście immunoenzymatycznym HEPKIT i świńskiej aGST w teście immunoenzymatycznym dla świńskiej aGST może zostać użyta do uwzględnienia poprawki na obecność jakiejkolwiek ludzkiej aGST w teście immunoenzymatycznym dla świńskiej aGST.

Przykładowo jeżeli próbka daje następujące odczyty:

Test a GST (mg/litr)

Świński EIA (świńska a GST) 10(000

Hepkit EIA (ludzka a GST) 1000

180 437 to wówczas, przy złożeniu około 7% reaktywności krzyżowej ludzkiej αGST w świńskim EIA, oznaczono to, iż ludzka oGST odpowiada 1000/100 x 7 = 70 pg/litr w odczycie dla świńskiej oGST. Zatem zawartość świńskiej αGST wynosi 1000 - 70 = 9930 pg/litr.

Ponadto, jak wspomniano powyżej, występuje rozległa reaktywność krzyżowa pomiędzy mysią IgG [przeciw ludzkiej o.GST] i świńską αGST, uwidoczniona na fig. 8, na co wskazuje porównywalna intensywność odpowiednich prążków/sygnałów. Zjawisko to wykorzystano stosując te przeciwciała w kanapkowym teście immunologicznym z przykładu 6 dla świńskiej «GST jako przeciwciała wychwytującego lub nawarstwionego na płytkę.

Przykład 9

Specyficzność testu

W związku z tym, że testy z przykładów 6 i 7 będą używane przede wszystkim do wykrycia świńskiej α GST w nieświńskich płynach biologicznych, ważne jest, aby czułość i specyficzność testów była oceniona przy użyciu ciGST obecnej w następujących macierzach:

- ludzki mocz

- ludzka surowica

- ludzkie osocze

- ludzka żółć

- pożywki tkankowe.

Aby przeprowadzić tę analizę, świńską «GST dodano do wszystkich powyższych macierzy, po czym przeprowadzono testy immunologiczne z przykładów 6 i 7. Oprócz ilościowego wykrywania «GST oceniono również liniowość (równoległość), oraz czułość testu. Ponadto konieczne jest, aby specyficzność testu ułatwiała wykrywanie tylko świńskiej «GST i aby jakakolwiek ludzka α GST nie wpływała znacząco na wynik testu immunologicznego. W tym celu przebadano potencjalną reaktywność krzyżową ludzkiej <xGST przez zafałszowanie próbek zawierających świńską α GST w wyniku dodania różnych ilości ludzkiej «GST, by ocenić potencjalną reaktywność krzyżową. Zważywszy, że istnieje znacząca homologia sekwencji pomiędzy oboma izoenzymami, nie jest to błahy problem i może zostać przezwyciężony jedynie przez rozszerzoną analizę potencjalnej reaktywności krzyżowej przeciwsurowic [przeciw świńskiej α GST] z ludzką, α GST.

W tabeli 2 zestawiono wyniki oceny ilościowej świńskiej «GST w różnych przykładowych macierzach, uzyskane w testach immunoenzymatycznych, kanapkowym i półkompetycyjnym.

Tabela 2

Oczekiwana wartość	Rozcieńczenie próbki (pg/litr)	Osocze ludzkie (pg/litr)	MEM (całkowite) (pg/litr)	TC-100 (całkowite) (pg/litr)	Mocz ludzki ⁽pg^/l^itr)
(pg/litr)	kan.	kom.	kan.	kom.	kan.	kom.	kan.	kom.	kan.	kom.
0	61,4	19,4	0	-	0	46,8	0	73	0	84
4000	4530	3853	4299	ponad	4135	3643	4754	3889	4189,5	3936
2000	2980	2699	2500	ponad	2262	2420	2059	2071	2165,5	1912
1000	-	-	1041	ponad	1180	1247	983	953	944,5	857
500	507	446	249	ponad	512	485	540	562	392,8	454
250	279	260	85	ponad	290	211	273	266	151,9	218
125	128	140	0	ponad	136	188	197	163	17,9	126

Klucz:

1. kan.: Kanapkowy test immunoenzymatyczny

2. kom.: Półkompetycyjny test immunoenzymatyczny

3. Próbki rozcieńczono 1/5 do testu kompetycyjnego (zakres 0 - 1000 og/litr), a następnie dalej rozcieńczono do 1/100 dla potrzeb testu kanapkowego (zakres 0-40 og/litr).

4. MEM i TC-100: Pożywki tkankowe.

180 437

Z tabeli 2 wynika, że ilościowe odzyskanie świńskiej aGST jest osiągalne we wszystkich typach badanych macierzy. Oczywiście istotne jest to, iż aGST jest wykrywana zarówno w ludzkim osoczu, jak i w moczu, co ułatwia odpowiednio ocenę stanu ksenoprzeszczepu wątroby i nerki, co rzeczywiście ma istotne znaczenie. Jednakże można zauważyć, iż osocze wydaje się wykazywać niezgodność z formą testu półkompetyoyjnegOi prawdopodobnie z powodu wzajemnego oddziaływania IgG z immobilizowanym białkiem A, co powoduje anomalne wyniki. Z tym wyjątkiem, wszystkie pozostałe płyny wydają się wykazywać zgodność z formami obu testów. Szczególnie interesująca jest możliwość wykrycia świńskiej aGST w pożywkach tkankowych, co powinno ułatwić przedprzeszczepo'^^ ocenę ksenoprzeszczepu lub analizę żywotności izolowanych świńskich komórek wątrobowych (obecnych w nabojach), ponieważ są one zazwyczaj utrzymywane w pożywkach tkankowych. Ponadto taka zgodność macierzy z próbką powinna ogólnie ułatwić wykrycie aGST w pożywce użytej do utrzymania narządów dawcy ex vivo, gdy narządy dawcy (np. wątroba) jest utrzymywany poza ciałem w kontakcie z pożywką hodowlaną.

Przykład 10

Ocena działania zakłócającego ludzkiej aGST w kanapkowym teście immunoenzymatycznym ze świńską aGST

Oceniono zakłócające oddziaływanie ludzkiej aGST w kanapkowym teście immunoenzymatycznym z przykładu 6. Nie stwierdzono żadnych widocznych zakłóceń, czego oznaką byłby wzrost wartości absorbancji, przy stężeniu w mlkrostpSziznkach mniejszym niż 25 pg/litr (odpowiadającym stężeniu próbek 125 pg/litr rozcieńczonych w stosunku 1/5 rozcieńczalnikiem do próbek). Wyniki zestawiono w tabeli 3.

Tabela 3

[aGST]p [aGST]h	Absorbancja 450/630 nm
(pg/Htr)
20	-	0,869
20	6	0,875
20	12	0,875
20	25	0,881
20	50	0,975

Klucz:

aGSTp - świńska aGST aGSTh - ludzka aGST

Wyniki zestawione w tabeli 3 ukazują specyficzność testów immunologicznych dla wykrywania świńskiej aGST. Wyniki te uwidaczniają, iż ludzka aGST nie zakłóca testu immunologicznego nawet jeżeli stężenie próbki wynosi 125 pg/L(25 pg/litr x 5), co jest wartością 15 i 6 razy większą od górnej granicy aGST odpowiednio w normalnym ludzkim osoczu i moczu. Oczywiste jest, iż przy wyższych poziomach ludzkiej aGST (>250 pg/litr; 50 pg/litr x 5) obserwuje się pewne zakłócenia, przy czym wyliczono, iż występuje około 5 - 10%o reaktywności krzyżowej pomiędzy ludzka aGST i IgG [przeciw świńskiej aGST]. Jednak równoczesny pomiar aGST w ilościowych testach immunologicznych, zarówno dla ludzkiej, jak i dla świńskiej aGST, powinien umożliwić dokładnie wyliczenie ilości obecnej ludzkiej aGST i dzięki temu wzięcie jej pod uwagę podczas oznaczania ilościowego świńskiej aGST w ludzkich płynach biologicznych.

Należy ponadto zauważyć, że testy immunologiczne według wynalazku mogą być użyte także do wykrycia świńskiej GST w płynach biologicznych świni, co będzie konieczne w przypadku badań toksykologicznych in vivo i in vitro dotyczących świń i ich narządów. Fakt ten jest szczególnie istotny, gdyż wiadomo, że świnie i ludzie wykazują znaczne podobieństwo fizjologicznie/biochemicznie, w związku z czym świnie są często używane jako modele zwierzęce przy przewidywaniu skutków toksyczności leków u ludzi.

180 437

A 450/630 nm

FIG. 2

180 437

il pTD
	Dodawanie ccGST
IgG 1	60min
¹¹ _lgc- o	-HRP	Dodawanie koniuoatu
1	60min
il
h<o>	HRP	• * ·Dodawanie substratu
IgG

FIG. 3

180 437

A 450/630nm

(aGST) (pg/L)

FIG. 4

180 437

FIG. 5

180 437

I» i

f.

FIG. 6

180 437

2 3 i

I ί

t

Iz

I ł

I . »· · i ♦ Ϊ*

FIG. 7

180 437 .12 3

FIG. 8

180 437

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz.

Cena 4,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób oznaczania lub wykrywania S-transferazy glutationowej, a zwłaszcza S-transferazy α-glutationowej, jako markera uszkodzenia narządu dawcy po przeszczepie poprzez oznaczenie jej ilości lub wykrycie jej obecności, pośrednio lub bezpośrednio, w płynie biologicznym biorcy lub preparacie tego płynu, znamienny tym, że S-transferazę glutationową pochodzącą z narządu dawcy gatunku innego niż biorca wychwytuje się lub wykrywa przez działanie na nią przeciwciałem IgG specyficznym dla tej S-transferazy glutationowej pochodzącej z narządu dawcy lub zdolnym do reakcji krzyżowej z tą S-transferazą glutationową pochodzącą z narządu dawcy.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że S-transferazę glutationową pochodzącą od dawcy wychwytuje się lub wykrywa w płynie biologicznym, lub preparacie płynu biologicznego człowieka.
3. Sposób według zesta. z, znamiennv tym,żestosuje się przeciwcizlo IgGprzeciw ludzkiej aGST wykazującej 100% reaktywność krzyżową ze świńską aGST.
4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wychwytuje się lub wykrywa S-transferazę glutationową pochodzącą od dawcy w płynie biologicznym lub preparacie płynu biologicznego naczelnego innego niż człowiek.
5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wychwytuje się lub wykrywa S-transferazę glutationową pochodzącą z narządu świni jako dawcy.
6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że stosuje się poligonalne przeciwciało IgG przeciw świńskiej α GST.
7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że odrębnym układzie testowym wykrywa się wszelką obecną ludzką aGST działaniem przeciwciała IgG specyficznego przeciw ludzkiej aGST.
8. Sposób według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, albo 5, albo 6, albo 7, znamienny tym, że wychwytuje się lub wykrywa S-transferazę glutationową pochodzącą z nerki dawcy.
9. Sposób według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, albo 5, albo 6, albo 7, znamienny tym, że wychwytuje się lub wykrywa S-transferazę glutationową pochodzącą z wątroby dawcy.
10. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że przed ksznopnzeszczeczm bada się żywotność materiału dawcy.