DD140415A5 - Verfahren zur herstellung von sirup mit hohem fruchtzuckergehalt aus rohrzucker - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren für die Herstellung von Sirup_β Die Erfindung, betrifft allgemein die ensymatischo Transfructosylierung von Saccharose,, Die Erfindung betrifft iriötteoondere ein außergewöhnliches Verfahren für die Herntelltmg von Pruotofjo aus Saccharose mit Hilfe eines ein Fruotoeepolymer enthaltenden Substrates* Dieser Prozeß stellt ein neues en2yrn.atisch.es Verfahren für die Herstellung von Sirupen mit hohem Fruotosegeha.lt dar_f deren Pruotosegehalt wesentlich höher ist als er sur Zeit durch Gluooseißoraerisierung von Stärkehydrolysaton erzielbar ist, wobei eine physikalische Trennung des entst8.nde.nc5n Pruotose-Endproduktes nicht erforderlich ist„ Die Erfindung betrifft außerdem ein neuartiges Trane-fruotosylierungsensym aus Kulturen von Hefe,·. Pallularia pallulansj das sich bei einer derartigen Produktion ala nützlich erwiesen hat*,

Durch die. Erfindung.können eine Reihe von Produkten gewonnen werdenc Dazu gehören die fertige'Fructose oder ein stark fructosehaltiger Sirup, some zahlreiche Zwischenprodukte wie Fr.uo'tosepolymor.s <3bs das anfängliche Fructosepolymer (oder Pülvsaccharid) enthaltende Substrat, Substrat, aus dem .das Polymer entfernt wurde und Substrat (mit oder ohne Polymer) nach, der Isomerisierung, Jedes dieser Produkte ist an sich unmittelbar wertvolle · .

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Ci

Jedes dieser Produkte hat die Eigenschaften herkömmlicher Zuokerarten und Sirupe und kann für deren übliche Zwecke verwendet werden» Dazu gehören beispielsweise die Verwendung als Süßstoffe und als Rohstoffe für die übliche Darstellung von Pharinazeutika_e Darüber hinaus können diese Produkte in der industriellen Verwendung für Zuckerarten und Sirupe eingesetzt werden« Sie können daher für die Herstellung von Klebstoff en, 3?euehthaltemitteln_$ 3?ergäminpapie3?₉ Gerbstoffe? elektrische Isolatoren Gießerei^Kernbindemittel, Inaektiaido, Farbstoffe und dergleichen oder ganz allgemein ale Plastifikator en _f Eindickungsmittel usw« Anwendung findene

Kurz geaagt-j sie Bind auf dem breiten Gebiet von Anwendungen Möglichkeiten zu gebrauchen^ auf dem analoge Produkte bereits verwendet worden sind«,

Kürzlich haben Fachleute Verfahren gefunden, bei denen das iBomerasee.iisyra auf einem wasserunlöslichen inerten Träger immobilisiert wird* Das immobilisierte Enzym eignet sich dann für die Verwendung bei der kontinuierlichen Umwandlung von Glucose in einen Sirup mit hohem -Fruotosegehalt« Beispiele derartiger.Verfahren werden in den US-PS 3«7O8_e397s 3*788* 945? 3*850,751? 3*868304? dem BB-FS 8.19.859 und dem US-PS 3'96O-663(BE-PS Ir* 810.480) beschrieben.

Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines einfachen und wirtschaftlichen Verfahrens für die Herstellung von Sirup mit einem über 55 % betragenden Fructoseanteil«.

Bevor das Wesen dei- Erfindung näher erläutert wird_s sollen die Bezeichnungen, die in der Erfindungsbeschreibung ver-»

Berlin, dV8.2.'1979

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WGndet .werden und die auf dein Fachgebiet allgemein üblich sind* definiert .werden* -- .,- ^! ,.- -

Die Bezeichnungen "Glucose" und "Dextrose" werden in diesem Anwendungsfall austauschbar verwendet ₉ um dieses Mono s acc ha» rid in ;Jeder Form, in Lösung oder trocken_s au kennzeichnen«.

Die Bezeichnung "Saccharose" besieht sich auf ein Disaccharide in gereinigter oder in roher Formeln Lösung oder trocken, aus einer beliebigen Saccharose-Rohstoffquelle, 2*B_S Zuckerrohr oder Zuckerrüben* Bei der praktischen Ausführung der Erfindung wird das Saocharose~Ausgangsmat©rial allgemein in einem wäßrigen Medium verwendet«,

Fructose und Lävulose

Die Bezeichnungen "Fructose" und "Lävulose" werden im Fachgebiet im allgemeinen austauschbar angewandt und betreffen das Isomer von Destro.se_y das eiißer als Dextrose ist«, Fructose kommt in Honig und, in. Invertzucker- zusammen mit Dextrose vor und ist wegen seiner Süße wertvolle Die Bezeichnungen .Lävuloee und Fructose werden in dieser Patentschrift austauschbar verwendet und beziehen'sich auf dieses Monosaccharid in beliebiger Form, in Lösung oder trocken«.

Dio Bezeichnung "Enzympräparat^t! wird hier als Begriff, für eine beliebige Stoffzusammensetzung verwendet, die die er«·' wünschte-enzymatische Aktivität besitzt« Die Bezeichnung wird beispielsweise in bezug auf lebende ganze Zollen,, ^rI'reckende 1-lon, Zellextrakte ₉ gereinigte Lind konzentrierte-von den Zellen

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und'von Währ flüssigkeit en gewonnene Zellen angewendet. Die Enzympräparate können entweder als Lösung oder in einer immobilisierten Form bei der Durchführung der Erfindung verwendet werden«, . -

Isomeraseens

Jedes Enzympräparat $ das Dextrose zu. Lävulose isomerisiort₉ wird hier als "Isomeraseenzym** bezeichnet« Diese Enzyme sind im Fachgebiet allgemein bekannt und werden als Dextroseiso·» merase^ Xyloseisoiaerase und Gluooseisomerase bezeichnete Derartige Bnsyme können von einer Vielzahl geeigneter Mikroorganismen gewonnen werden« Beispiele für derartige Mikroorganismen sind solche der Gattung Streptomyces, Bacillus, Artnrobac« ter_s. Aotinoplanes j Curtobaoeterium und andere „

Ein bevorzugtes Isomeraseenzym, das für die Praxis der Erfindung geeignet ist, wurde von Streptomyoes olivochromogenes ATCC Nr₆ 21, 713_S ATCC Kr· 21,714 oder ATCC Hr· 21,715 (wovon das Letztere ein einziges 'Kolonieisolat von ATCC Nr_s 21,713 ist ) gewonnen, wie in der US-PS 3·813·318 und der US-PS 3 957 587-offenbart, wird, vor allem., wenn es nach dem in der US-PS-3·770ο589 oder US-PS 3*813*318 beschriebenen Prozeß hergestellt wurde_ß

Isoiaerase-Einheit .

Als ⁿIsomerase-Einheit^iS wird das Auamaß der Enzymaktivität bezeichnet» das zur Erzeugung eines Mikromol Lävulose pro Minute unter den Isomerisierungs'bedingungen gebrauohlt wird, die anschließend· unter der Überschrift ^t?Analyse der leomerase»Aktivität" beschrieben werden_β

Die Bezeichnung betrifft in der hier angewandten Bedeutung

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das Analyseverfahren, das eine spektrofotometrische Bestimmung, der aus einer Glucose-Lösung unter einer Reihe'standardisierter Bedingungen erzeugten Ketose umfaßt»

Eine 'Stannnlösuhg wird in der folgenden Weise hergestellt %

Bestandteil

O₅1M MgSO₄,7H₂O' 1 ml

O₉OOiM CuCl₂₀GH₂O ^: 1 ml

1M Natriumphosphat-Puffer, pH-Wert 7_S5 0_?S ml

Wasserfreie D-Glncοbq ' 1_$44 g

Zugabe von destilliertem Wasser bis zu einem Gesamtvolumen von 7j5 ml*

Das KU analysierende Enzympräparat wird zunächst verdünnt_f damit es 1 bis 6 Isomorase-Einheiten pro ml enthält«

'Eine enzymatisch^ Isomerisierung wird in der Form durchgeführt _s daß 1 ml Enzympräparat zu. 3 ml Stammlösung' gegeben wird und 30 Minuten lang bei 60⁰C inlcubiert wir-d* lach Ab- ' lauf der Inkubationszeit wird ein aliquoter Teil von 1 ml entnoMTien und in 9 ml 0_?5ίϊ Perchlorsäure abgeschreckt« Der abgeschreckte aliquote Teil· wird anschließend bis auf ein Gesamtvolumen von 250 ml verdünnte Als Kontrolle, für Yergleichs-zwecke wird eine Glucosofclinaprobe ebenfalla untersuoht, indem 1 ml Wasser, anstelle von 1 ml Enzympräparat in der Lösungzu Beginn der Inkubationszeit 'verwendet'wird«

Die Ketose wird .danach mit Hilfe einer Oyetein-Schwefelsäure-Methode bestimmt* Für die Durchführung dieser Analyse wird

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eine Isomerase-Einheit als der Umfang der Enzymaktivität de finiert? der zur Erzeugung' eines Mikromols Lävulose pro Minute unter den beschriebenen Isomerisiertmgsbedingungen·gebraucht wird«

Dieser hier verwendete Begriff bezieht sich auf den Übergang eines Fructosyletnteils vom Donator_? S₀B₀ Saccharose_s zu einein Akzeptors z*B*. Polysaccharide

In der vorgesehenen Bedeutung bezieht sich dieser Begriff auf jedes Enzym_? das Transfructosylierung katalysiert und das von Pullularia pullulans ATCC 9348 (Synonym für Aureobaeidiurn pullulane) gewonnene Enzympräparat enthält«

Eine S'ructosyltransferase-Einheit wird hier als die Menge Enzymaktivität spezifiziert, die zur Erzeugung eines Mikromols reduzierender Zucker5, berechnet in Form ron Glucose, pro Minute unter folgenden Bedingungen erforderlich ists (a) pH-Wert 5,.5_S (b) Temperatur 55°C und (c) Substratkonaentration.60 g Saccharose in Lebensmittelqualität pro 100 ml eines wäßrigen Reaktionsgemischo«

Bestimmungen reduzierender Zucker (berechnet in Form von Glucose) werden unter Einsatz eines "Technicon Autoanalyzer II" (Te-chnicon, Ine*, Tarrytown, Uew York) ausgeführt. Die Analyse värd nach·der üblichen Alkali^Perrocyanid-Methode, Ana*- lytical Biochemistry·, 45* Nr. 2_S S_e 517 bis 524 (1972), durch= geführt« die für die Anwendung im'^silutoanalyser II" geeignet ist· Wenn nichts anderes angegeben ist,' wird die Bestimmung

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der Ensymaktivität durch die kontinuierliche Überwachung eines Reaktionsgemisohes ausgeführt _f aas folgende Zusammensetzung aufweist? .

7_S5 in! 80 %ige (Gew/Vol) wäßrige Lösung von Saccharose in

Lebensmittelqualität . .

2_r3 ml O_?1M Citratpuffer mit einem pH-Wert von 3%5

0j2 ml Enzymprqbe_s die die Menge Fructosyltransferaseenzym enthält, die 5 bis 25 Mikrogramm reduzierenden Zucker-(be» rechnet in Form von Glucose) pro Minute pro ml Reaktionsge-

mieoh errseugen vri.rd)· .

Pr imär s ub.s t r a t

Der Begriff "Primärsubstrat" wird hier zur BezeichD.ung solcher Saccharide beiuitst_? die für die Transfructosylierung geeignet sind und einen Pructosyl-Anteil aufv/eisenj der für die Beteiligung f,n der Transfruotosylierung zur Verfügung steht, wie' zum Beispiel wäßrige Lösungen von Saccharose«

Der Begriff "Sekundärsubstrat^ίΓ wird hier zur Bezeichnung des Reaktioneproduktes verwendet_f das entsteht, wenn das Primär·«· eu.bstrat der Wirkung eines Pructosyltransferase-Enzympräpa« rats naoh der hier gegebenen Definition ausgesetzt wird_e

Teile und Prosentanteile-

In dieser Patentschrift werden alle Teile nach Gewicht und · alle Prozentanteile nach Gewicht zu Volumen (Gewe/Vol) an-· gegeben,, wenn nicht ausdrücklich andere Angaben gemacht-werden«

Mit dieser Bezeichnung wird das Verfahren genannt_¥ mit dessen

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Hilfe die erfindungsgemäßen Sirupe unter Anwendung der Hoch-' druck-Flüssigkeits-Chromatografie gemäß folgender Technik be~ stimmt werden«. Die. Bestandteile werden durch. Eluieren mit Wasser aus einem Kationen-Austauscherharz in der.Calcium-Form chromatografiort· Die eluierten Bestandteile werden mit Hilfe eines Differentialrefraktometers nachgewiesen« Nicht-Dextrose-Kohlehydrate werden unter Verwendung eines elektronischen Integrators mengenmäßig bestimmt, und die Dextrose wird aus der Differenz ermittelt«, Die allgemeine Verfahrensweise, entspricht der in "Analysis of Carbohydrate Mixtures by Liquid Chromatography", Anu Soc« Brew* Chem. Proc<,_s 1373_S S_e 43 bis 46 beschriebenen. Bei dem verwendeten Harz handelt es sich um "Aminex -Q" 15-5 in der Calciumform, Bio-Bad-Laboratories, Richmond,. Kalifornien« ·

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde _t geeignete Bedingungen aufzufinden für die Umwandlung von Saccharose in ein Pro-, das aus Dextrose und Fructosepolysaccharid besteht_β

Erfindungsgemäß wird die Saccharose der Wirkung einer wirksamen Menge eines Fruotoeyltransferase-Snzympräparates zur Erzeugung eines aus Fruotosepolysaccharid- und Dextrose beste» . henden Reaktionsproduktes ausgesetzt^

Dabei ist es zweckmäßig_? daß di© der Wirkung eines Enzyms ausgesetzte Saccharose eine Konzentration von mindestens 20 % aufweist»und das Fructosyltransferase-Enzympräparat von Pullularia pullulans stammt«

Erfindungsgemäß wird die Dextrose des Reaktionsproduktes zur Erzeugung von Fructose isomerisiert, beispielsweise unter Verwendung eines immobilisierten Glucoseisomeraseenzyms oder

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in Gegenwart des Polysaccharide«

Erfindungsgemäß wird das Polysaccharid physikalisch, beispielsweise durch ultrafiltration von der Dextrose getrennt·

Bas~ Polysaccharid des Reaktionsproduktes wird .erfindungsgemäß zur Erzeugung von Fructose hydrolysiert, vorzugsweise nach der physikalischen Trennung von der Dextrose und vorzugsweise ohne aktives Isomeraseenzynu

Erfindungsgemäß wird ein Verfahren für die Herstellung von Sirupen zur Verfügung gestellt, das darin besteht, daß ein Primärsubstrat, z_eB«, Saccharose, der Wirkung eines Fructosyltransferase-Enzympräparates ausgesetzt 'wird, das die Saccharose in ein Produkt umwandeln kann, das aus" einem Monosaccharide anteil, der eine Hauptmenge Glucose und eine geringe Menge Fructose enthält, und Polysacchariden, die mindestens 66 Gew« % Fructosylkomponenten enthalten, besteht«, Ein derartiges Produkt enthält ein erfindungsgemäßes Sekundärsubstrate Diese Polysaccharide' des Sekundärsubstrates umfassen alle fructosehalt ige η Polymere (außer Saccharose) mit zwei oder mehr Mono« ßaccharidkomponentene Diese Polymere können weiter dadurch gekennzeichnet werden„ daß sie Polysaccharide umfassen, die Fructosylkoffiponenten, die durch (2""^M)-Beta-Bindungen verkettet sind, enthalten« Wie später beschrieben wird, liegen dia aus den gegebenen Bedingungen der Transfructosylierung gewonnenen Polysaccharide innerhalb eines voraus bestimmbaren Bereichee». Beispielsweise kann Sekundärsubstrat erzeugt v/erden, in dem der größte Teil (z_eB* zumindest 60 Mol?S) dee Polysac·» charids Oligoraere mit 2 bis 10 (d_eh« DP 2-10) meist .jedoch·3 bis 6 (dehe DP 3-6) Monosaccharidkomponenten eind_e. Anschliessend vdrd die Glucose in Gegenwart der Polysaccharide (über die Wirkung des .Isomeraseenzyms) zu Fructose isomerisiert,

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worauf die Hydrolyse der Polysaccharide ohne aktives Isomeraseenzym folgt« Die Hydrolyse kann enzymatisch unter Verwendung von Invertase oder durch Säurehydrolyse unter milden Bedingungen durchgeführt werden«.

Bei einer anderen Ausfuhrungsform der Erfindung können die Polysaccharide von der Glucose und der Fructose getrennt und anschließend wie oben beschrieben hydrolysiert werden^ um einen ultra-hochwertigen Fmctosesirup, z^B« mit einem Fr uotosegehalt von über 66 Gew_e# und vorzugsweise von über 90 Qqvt₉% direkt aus dem erfindungsgemäßen Sekundärsubstrat zu erzeugen^ ohne daß Isomerisierung der Dextrose in dem Substrat erforderlich wäre'»'Eine solche Trennung kann in herkömmlicher Form, mi-t Hilfe der üblichen physikalischen Trennverfahren auf der Basis der Molekülgröße vorgenommen werden, wie beispielsweise durch'herkömmliche Membrantechnik (z< >B* Ultrafiltration, Dialyse)., Lösungsmittelpräzipitation. Kohlenstoffabsorption und dergleichen» Beispiele für diese Membrantechnik enthalten die US-PS 3.173.867; Re 26097s '3.54.1.006 und 3*691 «068,

Eine bevorzugte Ausführungsform ist ein Verfahren für die Herstellung hochgradiger Fructose sir upe, der darin besteht,, daß die Saccharose der Wirkung eines Fructosy!transferase-Ensym-Präparates j wie zum Beispiel dem von Pullularia pullulejas stammenden wie ATCC 9348? ATCC 12535? IiERL 1673? NRRLY2311; IREL ΪΒ3892;' und HERL YB3861 UERL 3937 und ATCC 15223 ausge-. setzt wirde Das entstandene Produkt oder Sekundärsubstrat wird dem Einfluß eines Isomeraseenzyms ausgesetzt. Danach wird das isomerisierte Produkt ohne aktives Isomeraseenzym hydrolysiert„

Von dem nach dein erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Sekundärsubstrat wird angenommen, daß es neuartig ist.- Dieses

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Substrat ist einzigartig für die Isomerisierung und anschliessende Hydrolyse zur Herstellung eines Sirups mit mehr als 55 % Fructose geeignet und wird dadurch hergestellt, daß Saccharose der Wirkung eines Fructosyltransferase-Enzyinpräpa·*· rates ausgesetzt wird« Daher betrifft eine- andere Ausführungsform der Erfindung Substrates die für die enzymatisch^ Isomerisierung und anschließende Hydrolyse zu Sirupen mit einem Gehalt von über·55 % Fructosesirup geeignet sind und bestehen aus (1) etwa 20 bis etwa-60 Gew_s% Monosacchariden_s die eine größere Menge Glucose und eine kleinere Menge Fructose enthalten, und (2) etwa 70 bis etwa 40 % Polysacchariden, die mehr als 66 Gew*% Fructosylkomponenten enthalten«

Besonders, bevorzugt v/erden Sekundärsubstrate, die von Saccharose durch Transfruotosylierung in Gegenwart einer wirksamen Menge eines von einem Stamm von Pullularia pullulans ATCC · 3348 gewonnenen FruGtosyltransferase-Enzympräparates bei einer zwischen etwa 25 C und etwa 65 C und vorzugsweise zwischen etwa 5O⁰C und etwa 6O⁰C liegenden Temperatur und einem im Bereich von etwa 4$5 bis etwa 6,5 vorzugsweise zwischen etwa 5j4 und 5§6 liegenden pH-Wert gewonnen wurden« Die angewendete Ausgangokonzentration der Saccharose braucht nur 10 g pro 100 ml Wasser betragen«. Es wird jedoch bevorzugt; eine möglichst hohe Konzentration/der Trockensubstanz anzuwenden, die vorzugsweise zwischen etwa 30 g bis etwa 60 g pro 100 ml (für eine maximale Reaktionsgeschwindigkeit) bis sum Sätti«» . .gungspunkt von Saccharose '(und' mehr ₉ "wie anschließend noch· ausführlicher beschrieben wird) betragen kann©

Mit einem Minimum von 0$5 Einheiten Fructoeyltransferase pro Gramm Saccharose kann zur Erzeugung des neuartigen erfindungsgemäßen Substrates gearbeitet werden*' Im allgemeinen wird die verwendete Enzymmenge nicht über 50-Einheiten pro Gramm

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Saccharose betragen^ und zwar aas wirtschaftlichen Gründen* Besonders bevorzugt wird für die Gewinnung des vorgesehenen Sekundärsubstrates in einer wirtschaftlich vertretbaren Zeit und im Rahmen der oben beschriebenen Verfahrensparameter eine Menge von etwa 2 bis etwa 30 Einheiten pro Gramm Saccharose»

Für das "Verfahren zur-Herstellung der neuartigen erfindungs** gemäßen Fructosyltransferase können herkömmliche Fermentationstechniken Anwendung finden_s z«B_e siehe US-PS Ur. 3«565*756? 3*806*4191 3e535«123i S. Uedati.a. Applied Microbiology, 11, 211 - 215 (1963)« Es werden vor allem bestimmte neue Trenn- und Reinigungsmöglichkeiten angewandt, dia anschließend noch ausführlicher beschrieben werden. Das folgende Beispiel" ist ein typisches Fermentationsverfahren für die Herstellung des Enzyms aus Pullularia pullulans ATOC 9348«

Ausführungsbeispiel

Die Erfindung wird nachstehend an einigen Ausführungsbeispie.-len näher erläutert«

Träger

verfahren

Als Medium für die Impfstoffentwicklung und die Fermentation Kur Erzeugung des Snayms wurde folgendes benutzt;

Oy5 % zweibasisches Kaliumphosphat 0*1 % üTatri.umchlorid, 0,02 % MagnesiumsLilfatheptahydrat 0,06 % Diammoniumsulfat 0_?3 % Hefeextrakt (Difco' Laboratories) 7,5 % Saccharose (Lebensmittelqualität) aus 6₉8 eingestellter pH-»Wert des Mediums.

«73 -

Die Impf kolben (500 ml Erlenmeyer), die 3.00 nil steriles Medium enthalten* werden mit einer Schrägagarkultur der schwar zen Hefe, Pullularia ptsllulans* geimpfte Der jeweilige Stamm der verwendeten Hefe ist in dem Katalog der American Type Culture Collection (Rockville, Maryland) als ATCC 9348 verzeichnet;» Die Irnpfkolberf werden nach einer Entwicklungsdauer von 48 Stunden bei 32 ⁰C auf einem Vibrafcionsschüttler zur Impfung von !«•Liter^Erlenmeyer^Fermentationskolben, die je 200 ml des oben beschriebenen Mediums enthalten; verwendet» Die Konzentration des verwendeten Impfstoffes beträgt 0^5 Die Fermentation wird auf einem Vibrationsschutt«·

ler 7 Tage lang bei 32 ⁰C fortgesetzt Entfernung dee En?.yras aus der Fertnentationsbröhe

Die Fermentationsbrühen aus vierzig I-Liter-Schüttelkolben werden zusammengenommen,- und die Kolben werden mit Wasser ausgespült* des ebenfalls zu der vereinigten Brühe gegeben wird· Das endgültige Volumen oer Brühe nach dem Verdünnen betragt 12 Liter_e Dos ursprüngliche Volumen der Brühe war etwa 8 Liter» Die 12 Liter Fermentationsbrühe werden durch eine kontinuierlich laufende Sharples^Zentrifuge zur Entfernung UQP Hefezellen und von Zellenteilchen geleitete Die überstehende Flüssigkeit, bei der es sich urn eine schwarze viskose Lösung handelt, wird danach mit Calciumchlorid auf eine Konzentration von 0_f5 Ge\v_e%/Vol_e dosiert, und der pH·» Wert der entstandenen Lösung wird mit Natriumhydroxid auf 7,0 eingestellt«, Es folgt ein zweiter Durchlauf durch die Sharples-Zentrifuge zur Erzeugung einer viskosen überstehenden Flüssigkeit, die schwach gefärbt ist» Der pH-Wert uev entfärbten überstehenden Flüssigkeit wird mit Chlorwasserstoff säure auf 5,5 eingestellt, worauf die Dosierung mit 1000 Einheiten (nach der Definition in der US»PS 3.806.419) Pullulanase'folgt» Die entstandene Brühe wird mit Toluol konserviert (Zugabe bis zur Sättigung), und die Pullulanase laßt man bei Umgebungstemperatur über Nacht reagieren» Nach uev Digerierung mit Pullulanase über Nacht Wird eine Menge von 1 % Grefco Celit Np. 503 (Oohno-Manville Products Corporation,

Lonipoc, Kalifornien) in der Brühe auf geschlämmt.» worauf die Zugabe von 2 Volumen (24 Liter) Aceton folgt» Es bildet sich ein Niederschlag, der durch Filtration gesammelt wird, der Filterkuchen wird mit Aceton gewaschen und bei Umgebungstemperatur getrocknete Der gesammelte Filterkuchen enthält das insolubilisierte Fructosyltransferaseenzyrn_e

In Beispiel 1 ist zu beachten^ daß die Zugabe von Calciumchlorid zu der Fernientationsbrühe unter Einstellung des pH-' Wertes der Brühe.zum-Verschwinden des schwarzen Pigmentes und der vorhandenen sauren Polysaccharide; fuhrtV ^f Hinsichtlich einer Diskussion dieser sauren Polysaccharide siehe Acta_c Chem« Scand· 16/ 615 - 622 (1962)J7_O Das endgültige . Enzymprodukt liegt somit in Form eines relativ reinen^ färb-» losen Präparates vor_e Dieser Reinigungsprozeß stellt eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung dar und ermöglicht die Anwendung einfacher Reinigungsverfahren, d„h_e Zentrifugieren, Filtration oder Ausfällung, um das Endprodukt zu gewinnen«, Gemäß dieser Ausföhrüngs.form wird daher ein Prozeß fur die Trennung saurer Polysaccharide und schwarz gefärbter Nebenprodukte von der fertigen Fermentationsbröhe oer schwarzen Hefe. Pullularia pullulans, zur Verfugung gestellte Durch diese Methode entsteht ein fertiges Enzympräparat, das frei von unerwünschtem Farbstoff und sauren Polysaccharid-Nebenprodukten ist, die im Laufe des Fermentationsprozesses gebildet werdene Diese Nebenprodukte werden, wenn sie nicht entfernt werden, mit dem Enzym nach der Lösungsmittelzugabe zur Fermentationsbruhe ausgefällt»

Als weitere Verbesserung zur Gewinnung gereinigter erfindungsgeraäßer Enzyrapräparete empfiehlt es sich, das unweigerlich in der Ferraentationsbröhe vorhandene Piillulan-Polysaccharid zu entfernen, weil es ebenfalls mit dem Fructosyltransferaseenzym nach der Lösungsmittelzugabe zur Fermentationsbruhe ausgefällt würde» Daher kann die durch die Behandlung mit Calciumchlorid und die Einstellung des pH-Wertes gewonnene überstehende Flüssigkeit weiter mit dem allgemein bekannten Hydrolysierenzyra Pullulanase behandelt werden* Das Pullulan

nase-Enzym hydrolysiert wahllos das Pullulan und erzeugt ein Polymer mit niedrigerem Molekulargewicht* wodurch die Mitausfällung und die daraus folgende Verunreinigung des Fructosyltransferase-Enzyrapräparates während der Behandlung suit Lösungsmittel (z_eB_e Aceton* Alkohol und dergleichen) vermieden wird« Die Reinigung des vorgesehenen Fructosyltransfera-» seenzyms in dieser Weise stellt ein weiteres neuartiges er·» findungsgeniäßes Ausföhrungsbeispiel dar«,

Die erfindungsgemäßen Fructosyltransferase^Enzympraparate können ohne Entfernung des Pullulans verwendet werden· Daher kann die Erfindung ohne Hydrolyse des Pullulans durch Pulluianase durchgeführt werden* wobei das Pullulan in diesem Fall als Träger for das Fructosyltransferaseenzym dienen würde«,

Das folgende Beispiel erläutert die Verwendung von Pullulan als Trägermittel«,

Beispiel 2?

Sekundoroubstrot unter Verwendung von Fructo=*

Zu einer 20 %igen Saccharose-Losung^ mit 0,5M Citratpuffer auf einen pH-Wert von 5_f5 gepuffert* wird eine Menge von 1 % trockenem Pullulan gegeben* das nach der Verfahrensweise von Beispiel 1 hergestellt wurde* allerdings vmrde das Pullulan nicht mit Pullulanase hydrolysiert und dient daher als Trä« germittelf so daß kein Celit.verwendet wurde* Die Fructosyltransferase-Aktivität beträgt 677 Einheiten/Graratr) Pullulan* Die Reaktion wird bei Umgebungstemperatur so lange durchge·» . führt* bis das Gemisch trübe wird» Eine Probe dieses Mate» rials wird mit Hilfe der Hochdruck-Flössigkeits^ChrOraatografie analysiert und zeigt folgende Ergebnisse:

Sacchß'rid-Aufteilunq nach HPLC-Analyse

Fructose ' Dextrose DP₂ DP₃ ^Di>4$ 6,9 40,6 6,2 H₁I 35,2

Die folgenden Beispiele erläutern weiterhin das in Beispiel 1 erzeugte Enzym«,

In mit Schraubkappen versehene Reaktionsflaschen werden 60 g Saccharose in Lebensmittelqualität und ein Fructosyltrans«* ferase~Enzympräparat gegeben_e Das Enzympräparat wird aus dem Enzyraprodukt von Beispiel 1 durch Dispergieren geeigneter aliquoter Mengen des festen Celit-Enzyrnproduktes in abgemessene Wasserniengen_# um eine geeignete Konzentration einer Enzymlosung herzustellen, gewonnen« Das Celit wird später durch Filtration entfernt» Das Filtrat wird für die Dosierung des Reaktionsgemische auf 10, 20 und 30 Einheiten Enzym pro Gramm Saccharose-Substrat verwendet«. Diese Gemische v/erden dann je auf ein endgültiges Volumen von 100 ml mit Wasser verdünnte Umwandlungen werden 66 Stunden lang bei einem . pH-Wert von 5_s-5 und bei 55 ⁰C bzw_e 60 ⁰C durchgeführte Nach 24_f 43 und 66 Stunden werden Proben für die Bestimmung reduzierender Zucker entnommen, um den Nachweis enzymatischer Aktivität zu bringen« Nachdem an den Proben die reduzierenden Zucker bestimmt worden'sind* wird das übrige Reaktionsgemisch eingefroren* um die enzymatiache Tätigkeit abzustoppen^ und die Proben werden zur Bestimmung der Kohlehydratzusammensetzung der Hoch· druck-FIüssigkeits-Chromatografie unterzogen» Es wurden folgende Ergebnisse erzielt;

Analysen reduzierender Zucker*

!»ml ι in mil nun ι i IWIi-IIi iBiBiiiBiWi »ini r ι iii ι ii

Temp«,

Einheiten Jl

Reduzierender

Zucker

mg/ml

pH Reduzierender

Zucker mg/ml

pH Reduzierender

Zucker

pg/raX

24 Stunden

43 Stunden

66 Stunden

0	—-	,7	200	5,80	231 "	5,80	268
10	191	219	5,40	270 .	5,25	301
20	192	282	5,40	334	5,25	390
30	246	5, 35	1,5	5,15	2,1
0	5,75	243	5,80	270
10	.5,10 ·	288	4,70	346
20	5,15	360	4,90	420
30	5,20	4,95

Das angewandte Verfahren wurde bei der Definition der Fructosyltransferase-Einheit

erläutert, · .

Einheiten Enzym pro Gramm Saccharose

Kohlehydrat'-'Zusamtne.neetzunc;.. anhand

	Reaktionsteraperatur 55 C	Dextrose \/o)	Lävulose	DP	DP α)	DP/ (JK)
Enzym-Dosis Einneit/g Saccharose	Reaktionszeit Stunden	31,7	2,3	10,0	25,0	31,0
	24	34,5	3,2	9,4	17,9	35,0
10	43	36,7	3,9	8,6	15,0	35,8
	66	33,9	2,8	8,8	19/7	34,8
	24	37,4	4,2	7,9	12,1	38,4
20	43	40,5	4,9	7,4	10,8	36,4
	66	37,4	4,0	7,1	12,5	39,0
	24	41, 8	5,9	6,8	11,4	34,1
30	43	46,1	7,5	7,0		27,9
	66

Reaktipnstemperatur 60 °C

Enzym-Dosis Einneit/g Saccharose	Reaktionszeit Stunden	Dextrose (%)	Lävulose GS)	DP \7oJ	DP (%)	DP + (%)
	24		" 2,8	' 6,1	24,3	30,6
10	43	35,0	4,0	9,8	18,2	33,0
	66	36,7	, 5*4	9,4	16,0	32,5
	24	35,5	3,8	8,4	17,1	35,2
20 *	43	38,4 .	5,0	8,0	12,3	36,3
	66	41,3	6,6	7,9	11,1	33,1
	24	39,0	5,5	7,1	12,1	36,3
30	43	43,7	7,1	7,3	11,0	30,9
	66	47,8	9,2	7,4	11/1	24,5

Beispiel 3 zeigt die Wärmebeständigkeit in Gegenwart von Enzymsubstrat bei 55 ⁰C und 60 ⁰C während einer Zeitspanne von 66 Stunden bei einem pH-Wert von 5,5, wodurch das wirtschaftliche Potential des Enzyms demonstriert wird· Dar» überninaus wird von dem durch enzymatische Umwandlung von Saccharose mit dem neuartigen erfindungsgernäßen Fructosyltransferase-Präparat erzeugten Sekundärsubstrat anhand der Kohlehydratanalyse gezeigte daß es ein besonders wertvolles •Produkt für die Herstellung von hochwertigen Fructosesirupen aus Saccharose ist/ da die Hauptbestandteile Dextrose und Polymere sind, die bei der nachfolgenden Hydrolyse Fructose als das vorherrschende Monosaccharid ergeben* Dieses Bei·« spiel zeigt gleichfalls, daß das neuartige erfindungsgemaße Enzym bei einer Saccharosekonzentration von 60 % (Gew„% VoI) wirksam ist« Auch die Funktionalität des Enzyms in Gegenwart hoher Glucosekonzentrationen wird gleichfalls demonstriert*

Beispiel 4i

JEinf lufi ßer_T Ten^eratur auf die Enzymaktiyitat

Der Einfluß der Temperatur auf die Reaktionsgeschwindigkeit des Fructosyltransferaseenzyms wird unter Anwendung des "Technicon Autoanalyzer II" folgendermaßen bestimmt:

Das Reaktionsgemisch besteht aus 7,5 ml 80 %iger (Gew/Vol) Sacehoroselösung, 2/3 ml eines O,IM Citratpuffers mit einem pH-Wert von 5,5 und 0,2 ml einer 2 %igen (Gew/Vol) Pullulan-Enzyrolösung. (Enzympräparat von Beispiel 2)_β Der endgültige Saccharose-Gehalt beträgt 60 % (Gew/Vol)_ö Die Proben -werden bei den folgenden Temperaturen gehalten und 10 Minuten lang im "Technicon Autoanalyzer II" analysierte Die Ergebnisse zeigen, daß die Geschwindigkeit der enzymatischen Reaktion bei 40 ⁰C das l,89~fache der bei 30 ⁰C betragt, bei 50 °C das l/29»fache gegenüber 40 ⁰C beträgt und bei 60 ⁰C das l_f48-fache der bei 50 °c_e Dadurch wird eine zunehmende Reaktionsgeschwindigkeit mit steigender Temperatur .deutlich*

Demonstration der Michaelie-Menten-Kpnstanten (K ) des

Die K eines Enzyms gibt die Substratkonzentration an, bei der die Geschwindigkeit der Produktbildung die Hälfte von V beträgt* Für die Ermittlung der K des Fructosyltransferaseenzyras wurde folgendes Verfahren angewandt.

Unter Verwendung einer 90%igen (Gew/Vol) Saccharose-Stamm·» lösung^ deren'pH-Wert mit O,1M Citratpuffer auf 5,5 eingestellt wirdf werden die richtigen Konzentrationen von Saccha= rose in 9,8 ml Aliquoten so hergestellt, daß folgende Konzen» trationen der Saccharose in einem Endvolumen von IO ml erzielt werden: 5, 10, 30, 40, 50, 60 und.70 %_e Zu den gekühlten Proben werden 0,2 ml Enzymlösung mit einem Gehalt von 1,1 Einhe'iten Fructosyltransferaseenzym gegeben« Danach wer» den aie Proben sofort bei 55 ⁰C in dem oben beschriebenen "Technicon Autoanalyzer II" analysiert (siehe Fructosyltransferase-Einheit)· Als Kontrolle wird ein Glucose-Standsrd (in ,ug/ml geeicht) mit einbezogen_o

Anschließend wird die Geschwindigkeit der Glucosebildung, ausgedrückt in >ug/ml/Minute, bei den verschiedenen Substrat* Konzentrationen unter Verwendung einer konstanten Dosis (1,1 Einheiten) des FructQsyltransferase-Enzyrnpräparates von Beispiel 1 aufgeführt*

% Substrat	/Ug/ral/niin
5	8,0
10	11,8
20	15,7
30	18,0
40	18,6
50	19,2
60	17/8
70	15,6

8,0

11,6 15_f2 17,6 18,2 17,2 18,2

a) Nochmaligerj" Versuch am nächsten Tag mit einer 60 %igen

Sucrose-Stammlosung,

Der K -Wert beträqt 0,27 Mol Saccharose, Die höchste Reak-

m . .

tionsgeschwindigkeit trat bei einer Substratkonzentration von 1,374 Mol Saccharose bei einem pH-Wert-.von 5,5 bei 55 C auf.

Da rs teilung, up.d leomerisierunc! von

Sacchjros^

Y9ⁿ

600 g Saccharose in Lebensmittelqualität werden in Wasser bis zu einem Volumen von 800 ml aufgelöste Der pH-Wert dieser Lösung wird rait verdünnter Chlorwasserstoffsäure auf 5,5 eingestellt« 11 g eines trockenen Celit-Enzympräparates mit einer Aktivität von 500 Einheiten/g, das wie in Beispiel hergestellt wurde, werden in 100 ml Wasser aufgeschlätnmt. Die Aufschlämmung wird unter Vakuum auf Whatman-Filterpapier Nr, 1 auf einem Büchner-Trichter filtriert«, Der Filterkuchen wird mit weiteren 100 ml Wasser gewaschen. Die 200 ml FiI-trat werden danach zu der Saccharoselösung gegeben, die in einer 0,5-Gallonen-Flasche mit Schraubverschluß enthalten ist. Die Flasche wird anschließend in ein Wasserbad mit einer Temperatur von 58 ⁰C gesetzt, und die Reaktion läßt man 20 Stunden lang laufen, worauf eine Probe des Reaktions» Produktes mit Hilfe der Hochdruck^Flössigkeits-Chromatografie zur Bestimmung der KohlehydratztJsammensetzung mit folgen« den Ergebnissen analysiert wurde:

Fructose 2,4 %

Dextrose 32,8 %

OP₂ 10,6 %

22,9 % . 31,3 %

Zu dem übrigen Reaktionsprodukt (d«h. dem Sekundärsubstrat) wird Magnesiumchlorid bis zu einer Menge von 5 Millimol ge~ geben, und der pH-Wert wird mit verdünntem Natriumhydroxid auf 8,4 eingestellt.

V°ⁿ Strep torn yc es oliyochromogenes/"ATCC 21,715 (Siehe US»PS Nr. Re: 29..152) gewonnene Glucoseisomerase wird auf poröser Tonerde (ein regulierter Porenträger, hergestellt von Corning Glass Co₈, Corning, New York, z.B. siehe US-PS Nr. 3.992.329) folgendermaßen immobilisiert:

Ι« Der Träger wird zweimal mit Wasser gewaschen;

2* Der Träger wird 1 Stunde lang unter Rühren mit O,IM Natriumcitrat inkubiert;

Se Das Natriumeitrat wird von dem Träger abgewaschen, bis die Leitfähigkeit der Waschlösung 1000 Mikroohm beträgt;

4. Der Träger wird eine Stunde lang mit 0,05M Magnesiumchlorid inkubiert, und die Magnesiunichloridlösung wird dekantiert;

5» Dann wird eine Menge von 0,05M Magnesiumchlorid zugesetzt, um eine endgültige Enzymkonzentration von 400 Einheiten/ ml zu erhalten;

6. Das Isomeraseenzyrakonzentrat wird dem Träger in einer Menge von 14 Millionen Einheiten pro Kubikfuß zugesetzt;

7. Der Träger und das Enzym werden 22 bis 24 Stunden lang miteinander in Kontakt gehalten, und danach wird das ungebundene Enzym mit destilliertem Wasser von dem Träger abgewaschen.

Eine ummantelte Glaskolonne (3 cm χ 18 cm), die mit einer mit einem Speisebehälter verbundenen Pumpe ausgestattet ist, wird dann mit dem auf diese Weise vorbereiteten immobilisierten Enzym gefüllt. Das Bettvolumen der Kolonne beträgt nach dem Füllen 45 ml. Bei allen Isomerisierungen wird die Kolonne bei 60 C betrieben. Die gefüllte Kolonne wird mit einem Dextrosesirup (50 Gew.%/Vol« Konzentration) mit 5 Millimol Magnesiumchlorid und einem auf 8,4 eingestellten pH-Wert ge»

startet, um zu beweisen, daß die Kolonne aktiv ist« Die Durchlaufgeschwindigkeit der Kolonne beträgt 292 ml/h_e Die Kolonne wird dann bis zur Betthöhe entleert* Das Einfüllen des Sekundärsubstrates erfolgt mit der Hand bis 20ml Ablaufflüssigkeit gesammelt sind, und dann wird die Durch laufgeschwindigkeit für das Sekundärsubstrat auf 292 ml/h eingestellt. Die ersten 100 ml aufgefangener Sirup werden weggegossen, um eine Veränderung des Substrates zu berücksichtigen«. Das übrige Sekundärsubstrat (etwa 850 ml) wird dann durch die Kolonne geleitet* Nach einer Stunde steigt die Durchlaufgeschwindigkeit auf 570 ml/h« Die Durchlaufgeschwindigkeit wird auf 300 ml/h eingestellt und bis zum Ende des Versuches auf diesem Wert gehalten. Nach Beendigung des Versuches mit dem Sekundärsubstrat wird die Kolonne wieder auf Dextrose umgestellt, um zu zeigen, daß die Isomeraseaktivität noch vorhanden ist« In der folgenden Tabelle· werden die Hochdruck-Flüssigkeits-Chromato» grafieanalysen des Ausgangssekundärsubstrates und des Endproduktes aus der Isomerisierungskolonne verglichen:

Sekundärsubstrat (A) Endprodukt (B)

Fructose	2,4	15,7
Dextrose	32,8	18,9
DP2	10,6	11,0
DP3	22,9	22,9
DP,,	. 31,3	31,5

Diese Ergebnisse zeigen, daß 42,38 % der freien Dextrose in dem Sekundärsubstrat in der Kolonne zu Fructose isomerisiert wurden« Auch die in dem Sekundärsubstrat vorhandenen Fructo« sepolyraere schienen nicht beeinträchtigt zu sein oder die Isomerisierung von Dextrose zu Fructose beeinflußt zu haben» Erwähnenswert ist, daß die Gesamtzusamtnensetzung des Monosaccharids etwa 45 % Fructose und 55 % Dextrose aufweist,,

Im folgenden Beispiel werden zwei Möglichkeiten für die Spal· tung dar im Sekundärsubstrat vorhandenen Polysaccharide und auch des daraus entstandenen Isoraerisationsproduktes angewendet» Der eine Vtleg ist enzymatisch und bei dem anderen wird

eine schwach saure Hydrolyse angewandt»

Beispiel 7:

——im. inn "f ' ' ΊΐΐΜΐίιιιι

100 (TiI Produkt B von Beispiel 6 werden mit 10 mg einer gereinigten, von Caindjuja H^lJ₁Q, gewonnenen Invertase dosiert« Dieses Gemisch (mit Toluol konserviert) läßt man über Nacht bei Umgebungstemperatur reagieren, worauf eine Probe entnommen und mit Hilfe der Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatogra« fie analysiert wird. Das übrige Produkt B läßt man weitere . 6 Tage lang reagieren, und danach wird eine zweite Probe mit Hilfe des gleichen Verfahrens untersucht mit folgenden Ergebnissen: ·

Ausgangsmaterial Nach der In=« Nach weiteren (Produkt B) vertasewirkung 6 Tagen

Fructose	15,7 %	4.1 ,-9 %	62,4	0/ /0
Dextrose	18,9 %	29,4 %	36,2	0/ /Ü
DP2	11,0 ^j	1#9 %	O
DP3	22,9 %	12,9 %	0,5	Cj/ /O
DP4,		13,9 %	0,9	%

Bei der verwendeten Invertase handelt es sich um ein Enzympräparat, hergestellt von Siekagaku Kogyo Co_e, Ltd», Tokyo, Oapan, Kiit einer Aktivität von 123 Einheiten/rag, wobei 1 Einheit Invertase die Spaltung von Saccharose zur Bildung von 1 tnMol Glucose und 1 mfviol Fructose pro Minute unter spezifizierten Bedingungen katalysierte

B_e Saure Hydrolyse von Produkt B

^lfclllll I Hill ll* I lllBJlfc ! /mm\ ! !! Ι Λ !! >" I ill *— ! I I J M ! BI fcll »If! M^-J^l I ^l TlI 1 l 1I¹IlII

Die saure Hydrolyse einer Probe von Produkt.B aus Beispiel 6 wunde durch die Zugabe von 0,05N Schwefelsäure und Erhitzen auf 75 bis 80 C durchgeführt· Nach einer Hydrolysedauer von einer und von zwei Stunden wurden Proben entnommen und mit

Hilfe der Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatografie analysiert» Es wurden folgende Ergebnisse erzielt:

	Ausgangsmaterial (Produkt B)	1 Stunde	2 Stunden
Fructose	15,7	60,3	59,1
Dextrose	18,9	38,7	37,9
DP2	11,0	1,9	2,6
DP3	22,9	0,4	Q, 3
4+	31,5	0	0,2

Die obigen Ergebnisse von Schritt A zeigen, daß eine erhebliche Steigerung bei der Fructoseausbeute und eine geringere Zunahme der Glucoseausbeute bei einer entsprechenden Verringerung bei den DPo-* DPo- und ΟΡ^,,-Fraktionen auftraten, wodurch die Anwesenheit eines Fructosepolymers bestätigt wird«

Die Ergebnisse der sauren Hydrolyse in Schritt B stimmen mit denen von Schritt A Oberein und zeigen somit auch die Spaltung von Fructosepolymeren»

Die vorstehende Diskussion betrifft die Transfructosylierung unter Verwendung eines Primarsubstrates, wobei der Trocken« substanzgehalt der Ausgangssaccharose unter bestimmten Reaktionsbedingungen den Sättigungspunkt nicht überschreitet. Das folgende Beispiel zeigt die Anwendung eines Primärsubstra" tes mit einer über der Sättigung liegenden anfänglichen Saccharosekonzentration, das unter Einwirkung des Fructosyltransferaseenzyms ein Produkt ergibt, das erhöhte Mengen DP„-Material (d«h_e Fructosyl-Saccharose) und eine verringerte Konzentration von DP. -Produkten aufweist· Es hat sich

4+

gleichfalls eine Erhöhung der Trockensubstanzkonzentration (Gewe/Gew.,) des Sekundärsubstrates gegenüber der Tpockensubstanzkonzentration ergeben, die ohne die Wirkung des Fructosyltransferaseenzyms entstanden ist* Außerdem wird gezeigt, daß mit steigender Trockensubstanzkonzentration des Primärsubstrates der Polymerisationsgrad des Fructosepoiymers im

Sekundärsubstrat abnimmt und das D?₄₊-Material in geringfügigen Mengen vorhanden ist.

Das steht in krassem Widerspruch zu den in den vorhergehenden Beispielen erzielten Ergebnissen, bei denen Saccharosesubstrate unter dem Sättigungswert verwendet wurden. In den Beispielen ist das DP. -Material das Primärprodukte

Beispiel 8; '

ÜHH ι «mm ι mir min ι in» ι ι n mli <

Darstellung von Sekuno'ä'rsubstrat aus Fructoseaufechlamtnunqen

Saccharose in Lebensmittelqualität wird in Mengen von 200 g in I-Pint-Glaskolben mit Schraubdeckeln gegeben,, Als Kontrol« Ie werden in einen Glaskolben 50 ml Wasser eingefüllt und in die arideren 50 ml Wässer, das steigende Mengen Fructosyltransferaseenzym-Ceiitpräparat (hergestellt wie in Beispiel 1) enthält, wie die folgende Tabelle angibt,, Oeder Kolben wird verschlossen und in ein auf 54 bis 55 ⁰C eingestelltes Schüttelvvasserbad gesetzt» Die Kolben werden 24 Stunden lang mit gelegentlichem manuellem Vermischen geschüttelt« Eine Probe der überstehenden Flüssigkeit wird aus jedem Kolben entnommen und in einem verschraubten Reagenzglas in ein siedendee Wasserbad zur Inaktivierung des Enzyms gestellt«, Diese Proben werden dann mit Hilfe der Hophdruck-Flüssigkeits*» Chroraatografie analysiert* und es werden Bestimmungen der überstehenden Trockensubstanz (nach der K₀ Fischer-Methode) mit folgenden Ergebnissen gemacht:

Kolben- ί	Saccharose Enzym- * (g) einheiten	100	Trockensub stanz im Oberstehenden (Gew./Gew.)	Zusammensetzung der in Lösung durch HPLC	Dex*	DP2	Kohlehydrate (JK).	DP4*
	200	200	74,5	Fruc,	9,6	80,9		ND2
1	200	300	75,6	0,6	12,7	72, 2	8,9	0,7
2	200	400	76,3	0,7	14,5	66,8	13,7	1,1
3	200	500	77,1	1>	15,7	62,6	16,6	1/8
4	200	600	77,7	, 0,9	17,3	•58,5	19,0	2,1
5	200	700	78, 1	1/1	18,0	56,0	21,0	2,8
6	200	800	78,1	Ii3	18,8	53,9	21,9	3,0
7	200	900	80,0	1/1	19,3	52,2	23,1	3,4
8.	200	1000	79,0	1,0	19,9	50,0	24,1	3,7
9	200	keine	79,6	1,3	20,6	48,6	25,0	4,1
10	200	72,7	1/3	ND2	99,7	25,4	ND2 ·
Kontrolle	0,3	ND2

Gesamteinheiten von Fructosyltransferaseenzytn in 50 ml Wasser ND β nicht nachgewiesen

Erwähnenswert ist die Tatsache* daß bei dem obigen Beispiel die Kontrollprobe bei Abkühlung auf die Umgebungstemperatur (etwa 25 ⁰C) kristallisierte, während die enzymatisch erzeugten Sekundärsubstrate in Lösung bleiben und ausgezeichnete Haltbarkeit bei der Lagerung ohne Kristallisation zeigen.

Wenn auch in Beispiel 8 200 g Saccharose pro 50 ml Wasser angegeben sind. d.h_e 80 % Ge\v»/Gew_e/ so kann doch die Trockensubstanzkonzentration des Saccharose-Ausgangsmaterials erhöht werden«

Das neuartige Sekundärsubstrat dieses Ausfuhrungsbeispiels kann als ein sehr haltbarer nicht-krxstallisierender Sirup für Nahrungsmittel verwendet werden. Es besitzt auch einen einzigartigen hohen Trockensubstanzanteil, der gegenüber mikrobieller Verunreinigung und Farbkörperbildung beständig ist, wodurch es für den Versand oder die Lagerung von Zucker in Konzentrationen, die bisher in einer Form mit den oben be~ schriebenen Eigenschaften nicht erreichbar waren, eingesetzt werden kann_e Außerdem kann dieses neuartige Sekündärsubstrat mit dem hohen Trockensubstanzgehalt der Hydrolyse wie in Beispiel 7 erläutert unterzogen werden, um ein Invertzucker"-gemisch mit einem wünschenswerten Süßegrad zu gewinnen« Das neue Sekundärsubstrat dieses Ausführungsbeispiels hat einen Trockensubstanzgehalt (Gew«/Gew.) zwischen etwa 70 % und etwa 82 % und enthält einen f.ionosaccharidanteil, der im wesentlichen aus Dextrose und Polysaccharidpolymeren besteht, außer DP₂, das vorwiegend aus DP^-Produkt zusammengesetzt ist* Es ist auch eine geringe Menge (4,1 % und weniger) DP₄^PoIyHIere vorhanden«

Obwohl der erfindungsgemäße Transfructosylierungsachritt anhand von chargenweisen Betriebsverfahren beschrieben worden ist, wird es Fachleuten klar sein, daß Durchlaufverfahren gleichfalls eingesetzt werden können» Bei der Durchführung uer kontinuierlichen Fructosylierung wird das Transfructolyseenzym am besten unter Anwendung des Verfahrens immobilisiert,

das im Rahmen der Definition des immobilisierten Enzyms und der hier beschriebenen kontinuierlichen Verfahrensweise erläutert wurde.

Claims (15)

Erfindungsanspruoh ·

1« Verfahren für die Herstellung von Sirap, gekennzeichnet dadurch, daß Saccharose der Wirkung einer wirksamen Menge eines Fructosyltransferase-Ensympräparates zur Erzeugung eines aus Fructosepolysaccharid und Dextrose bestehenden Beaktionsproduktes ausgesetzt wird.

2» Verfahren nach Punkt 1« gekennzeichnet dadurch, daß die der Wirkung eines Enzyms ausgesetzte Saccharose eine -Kon« zentration von mindestens 20% aufweist«, · _;

3# Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß das Fructosyltransferase-Enzympräparat von Pullularia pullu-, lans stammt,

4· Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Saccharose der Wirkung eines Pructosyltransferaseenzyms bei einer Temperatur von etwa 25⁰C bis etwa 65°C, einem pH~Wert von etwa 4»5 bis etwa 6,5 und mit einer anfänglichen Saccharosekonzentration von mindestens 10$ (Gew«/Vol_e) ausgesetzt wird. '

5. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 4, gekennzeichnet dadurch, daß die Dextrose des Reaktionsproduktes zur Er~ zeugung von Fructose isomerisiert wird.

6, Verfahren nach Punkt 5» gekennzeichnet dadurch, daß die Isomerisierung unter Verwendung eines immobilisierten . Glucoseisomeraseensyms ausgeführt wird*

7· Verfahren nach Punkt 5» gekennzeichnet dadurch, daß die . Dextrose in Gegenwart des Polysaccharide zu Fructose isomerisiert wird«,

3a- Berlin,d.8.2.1979 JlP A 23G/206 023

8, Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 6,.gekennzeichnet dadurch, daß das Polysaccharid physikalisch von der Dex~ trose getrennt wird.

9« Verfahren nach Punkt 8, gekennzeichnet dadurch, daß die· Trennung mit Hilfe der Ultrafiltration erfolgt,

10« Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 9$ gekennzeichnet dadurch^ daß das Polysaccharid des Reaktionsproduktes zur Erzeugung von Fructose hydrolysiert wird.

11«. Verfahren nach Punkt 10, gekennzeichnet dadurch, daß das Polysadcharid ohne aktives Isomeraseenzym hydrolysiert 'wird*

12» Verfahren nach Punkt 10, gekennzeichnet dadurch, daß das Polysaccharid nach der physikalischen Trennung von der Dextrose hydrolysiert wird*

13· Substrat, hergestellt gemäß einem der Punkte 1 bis 4 und für die enzymatisch^ Isomerisierung und die Hydrolyse zu Sirupen mit mehr als 55 % Fructose geeignet, gekennzeichnet dadurch, daß es (1) von etwa 20 % bis etwa 60 % Monosaccharid, das vorwiegend aus Dextrose und Fructose besteht, und (2) von etwa 70 %. bis' etwa 40 % Polysaccharides die vorwiegend aus Eructosylkomponenten bestehen, enthält, wobei es sich dabei um Gewichtsprozente des Substrates handelt.

14« Substrat nach Punkt 13» gekennzeichnet dadurch, daß das Polysaccharid mindestens 66 Gew»% Fructosy.lkomponenten enthält· .

-33- Berlin,d.8.2,1979 AP-A 23G/206 028

15» Substrat, gekennzeichnet durch die Herstellung gemäß einem der Punkte 1 bis 4 mit einem Troclcensubstanzgehalt (Gew./Gewe) von etwa 70 % bis etwa 82 % und einem darin •enthaltenen Monosaccharidanteil, der vorwiegend aus Dex~ trose besteht, und einem Polysaccharidanteil (außer Saccharose) der vorwiegend aus DP^-Produkt besteht, .