Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania pro¬ duktów cukrowych zawierajacych wiecej niz 50% wago¬ wych fruktozy, na drodze enzymatycznej przemiany sa¬ charozy.Produkty zawierajace fruktoze maja zastosowanie w wielu dziedzinach, zwlaszcza w przemysle srodków farmaceutycz¬ nych i w przemysle spozywczym, przy czym pozadane jest mozliwie wysokie stezenie fruktozy w tych produktach.Syropy o duzej zawartosci fruktozy, zawierajace zwykle okolo 46% wagowych fruktozy i okolo 54% wagowych glikozy, wytwarza sie znanym sposobem przez izomeryzacje dekstrozy, otrzymywanej zazwyczaj przez hydrolize skrobi.Izomeryzacja ta jest katalizowana przez enzym izomerazy.Znany sposób inwersji sacharozy droga hydrolizy w obec¬ nosci kwasu lub enzymu inwertazy umozliwia wytwarzanie mieszanin zawierajacych 50% wagowych fruktozy i 50% wagowych glikozy, przyczymnie ma praktycznie mozliwosci zwiekszenia zawartosci fruktozy w tym produkcie.Wynalazek umozliwia wytwarzanie z sacharozy pro¬ duktów zawierajacych wiecej niz 50 % wagowych fruktozy.Sposób ten polega na poddawaniu sacharozy przeróbce na mieszanine zawierajaca fruktoze, dekstroze i polisacharydy, a nastepnie izomeryzacji dekstrozy zawartej w tej miesza¬ ninie w fruktoze przez dzialanie enzymem izomerazy oraz na hydrolizie polisacharydów w nieobecnosci enzymu izo¬ merazy.Cecha sposobu wedlug wynalazku jest to, ze w pierwszym etapie procesu sacharoze poddaje sie dzialaniu nie znanego dotychczas enzymu transferazy fruktozylowej w tempera¬ turze 25—65°C i przy wartosci pH 4,5—6,5, po czym dek- 10 IB 20 JO troze zawarta w otrzymanym nowym produkcie, stanowia¬ cym mieszanine fruktozy, dekstrozy i polisacharydów zawierajacych co najmniej 66% wagowych grup fruktozy- lowych polaczonych wiazaniami (2-1)-/?, przeprowadza sie w fruktoze dzialajac enzymem izomerazy, a polisacharydy zawarte w tej mieszaninie poddaje sie hydrolizie w nie¬ obecnosci enzymu izomerazy.Sposobem wedlug wynalazku mozna wytwarzac syropy zawierajace nawet wiecej niz 90% wagowych fruktozy.Produkty wytwarzane sposobem wedlug wynalazku maja wlasciwosci zwyklych cukrów i syropów, totez moga byc stosowane np. jako srodki slodzace albo jako produkty wyjsciowe przy wytwarzaniu srodków farmaceutycznych.Mozna je tez stosowac do wytwarzania klejów, srodków pochlaniajacych wilgoc, papierów szklanych, srodków garbarskich, izolatorów elektrycznych, a takze jako srodki wiazace przy wytwarzaniu rdzeni odlewniczych, do wyrobu srodków owadobójczych, srodków zmiekczajacych i za* geszczaczy.Wspomniany wyzej nowy produkt, wytwarzany w pierw¬ szym etapie procesu prowadzonego sposobem wedlug wynalazku, zawiera okolo 70—82% wagowych suchej substancji, mianowicie frakcje monosacharydów, skladajaca sie glównie z dekstrozy oraz frakcje polimerów polisacha¬ rydów wyzszych od DP2, skladajaca sie glównie z DP»* Zawartosc DP4 i wyzszych polimerów wynosi najwyzej 4,1 % wagowych. Ma on konsystencje trwalego nie krysta¬ lizujacego syropu, jest odporny na dzialanie mikroorga-, nizmów i nie wytwarzaja sie w nim substancje barwne.; Moze on byc transportowany i/albo magazynowany jako 121 700121 700 3 produkt zawierajacy cukier w stezeniach dotychczas nie¬ osiagalnych przy opisanych wyzej wlasciwosciach, a pod¬ dawany izomeryzacji i hydrolizie zgodnie z wynalazkiem daje produkty o zawartosci fruktozy nieosiagalnej przy stosowaniu znanych sposobów.W dalszym opisie i zastrzezeniach patentowych stosuje sie okreslenia, które maja nizej podane znaczenie.Okreslenie „glikoza" czyli „dekstroza" oznacza ten cukier prosty w kazdej postaci, w roztworze lub w stanie suchym.Okreslenie „sacharoza" oznacza ten dwusacharyd ra¬ finowany lub surowy, w roztworze albo w stanie suchym, pochodzacy z dowolnego surowca, np. cukier trzcinowy lub buraczany. Przy stosowaniu sposobu wedlug wynalazku sach^z^uKa^ przewaznie stosuje sie w sriodowisku wddnym.3 / Okreslenie „fruktoza" czyli „lewuloza" oznacza izomer delastrozy-bedacy od niej bardziej slodkim. Oba te okresle¬ nia!ofcftaozaja ten.cukier forosty w roztworze lub w stanie suchym. " ' —~J Okreslenie „preparat enzymowy" oznacza kazdy pre¬ parat o zadanym dzialaniu enzymatycznym, np. cale zywe komórki, komórki suche, wyciagi z komórek, preparaty rafinowane i stezone, wytworzone z komórek albo z cieczy hodowlanych. Preparaty enzymowe mozna stosowac w po¬ staci roztworów lub osadzone na nosnikach.Okreslenie „enzym izomerazy" czyli „izomeraza" ozna¬ cza dowolne preparaty enzymowe powodujace izomeryza¬ cje dekstrozy w lewuloze. Enzymy takie sa znane pod na¬ zwami izomerazy dekstrozowej, izomerazy ksylozowej i izomerazy glikozowej i wytwarza sieje z róznego rodzaju mikroorganizmów, np. z rodzajów Stieptomyces, Bacillus, Arthrobacter, Actinoplares i Curtobacterium.Zgodnie z wynalazkiem korzystanie stosuje sie izomeraze pochodzaca z Streptomyces olivochromogenes ATCC nr 21713, ATCC nr 21714 lub ATCC nr 21715 (pojedyncza kolonia wyizolowana ze szczepu ATCCnr 21713), znana np.Z opisu patentowego Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3813318, a zwlaszcza izomeraze wytworzona sposobami podanymi w opisach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki nr nr 3770589 i 3813318.Wiadomo równiez, ze enzym izomerazy mozna osadzac na obojetnych, nierozpuszczalnych w wodzie nosnikach i w tej postaci stosowac do prowadzonej systemem ciaglym przemiany glikozy w syrop o wysokiej zawartosci fruktozy.Sposoby takie sa znane np. z opisów patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki nr nr 3708397, 3788945, 3850751 i 3868304 oraz z belgijskich opisów patentowych nr nr 819859 i 810480.Okreslenie „jednostka izomerazy" oznacza taka ilosc tego enzymu, która jest niezbedna do wytworzenia w ciagu 1 minuty 1 mikromola fruktozy w warunkach podanych nizej przy omawianiu oznaczania aktywnosci izomerazy.Okreslenie „oznaczenie aktywnosci izomerazy" oznacza proces polegajacy na spektrofotometrycznej oznaczaniu ketozy wytworzonej z roztworu glikozy w nizej podanych, ustalonych warunkach. Roztwór podstawowy do tego oznaczania przygotowuje sie z nastepujacych skladników: Skladnik Ilosc roztwór 0,1 m MgSO<,7H20 1 ml roztwór 0,001 m CaCh 6H2O 1 ml roztwór 1 m fosforanowego buforu o wartosci pH7,5 0,5 ml bezwodnaD-glikoza 1,44 g woda destylowana do calkowitej objetosci 7,5 ml 4 Enzym poddawany badaniu rozciencza sie najpierw tak aby otrzymac preparat zawierajacy 1—6jednostek izomerazy w 1 ml. Proces enzymatycznej izomeryzacji prowadzi sie dodajac 1 ml preparatu do 3 ml podstawowego roztworu 5 i poddaje hodowli w temperaturze 60°C w ciagu 30 minut, po czym bierze sie po 1 ml roztworu, traktuje 9 ml 0,5 n kwasu nadchlorowego, a nastepnie rozciencza do objetosci 250 ml.W celach porównawczych wykonuje sie analogiczne 10 próby z glikoza, poddajac hodowli podstawowy roztwór, do którego zamiast 1 ml preparatu enzymowego dodano 1 ml wody. Nastepnie oznacza sie ketoze metoda cysteina — kwas siarkowy.Dla potrzeb opisywanego badania za jednostke izomerazy 15 uwaza sie taka ilosc enzymu, która w opisanych wyzej warunkach procesu izomeryzacji jest niezbedna dla wy¬ tworzenia w ciagu 1 minuty 1 mola lewulozy.Okreslenie „transfruktozylacja" oznacza przenoszenie grupy fruktozylowej z donora, np. z sacharozy, do akcep- 20 tora, np. polisacharydu.Okreslenie „enzym transferazy fruktozylowej" oznacza kazdy enzym, który katalizuje proces transfruktozylacji.Okreslenie to obejmuje stosowany zgodnie z wynalazkiem preparat enzymowy pochodzacy od Pullularia pullulans 25 ATCC 9348 (nazwa synonimowa Aureobasidium pullu¬ lans).Okreslenie „jednostka transferazy fruktozylowej" ozna¬ cza taka ilosc enzymu, która jest niezbedna do wytworzenia w ciagu 1 minuty 1 mikromola redukujacego cukru w pree- 30 liczeniu na glikoze przy wartosci pH 5,5, w temperaturze 55°C, przy zawartosci jadalnej sacharozy w produkcie wyjsciowym wynoszacej 60 g/100 ml wcdnej mieszaniny.Ilosc zredukowanego cukru w przeliczeniu na glikoze oznacza sie za pcmoca przyrzadu „TechnicumAutoanaly- 35 zer II" produkcji firmy Techniccn, Inc., Tarrytcwn, N. Y.Stany Zjednoczone Ameryki. Analize prowadzi sie znana metoda za pomoca alkalicznego zelazicyjanku, opisana w Analytical Biochemistry 45, nr 2, str. 517—524 (1972), przystosowana do stosowania wyzej podanego przyrzadu 40 analizujacego. O ile nie zaznaczono inaczej, podanej nizej oznaczanie aktywnosci enzymatycznej prowadzi sie w spo¬ sób ciagly, rejestrujac zmiany w mieszaninie reakcyjnej 0 nastepujacym skladzie: 7,5 ml wodnego roztworujadalnej sacharozy o stezeniu 80% wagowo/objetosciowych, 2,3 ml 45 cytrynianowego roztworu buforowego o stezeniu 0,1 m i wartosci pH 5t5 0,2 ml próbki enzymcwej zawierajacej taka ilosc enzymu transferazy fruktozylowej, która w ciagu 1 minuty powoduje wytwarzanie 5—25 mikrogramów redukujacego cukru (w przeliczeniu na glikoze) w 1 ml 50 mieszaniny reakcyjnej.Okreslenie „produkt wyjsciowy" oznacza sacharydy w postaci takiej, która umozliwia im branie udzialu w pro¬ cesie transfruktozylacji i zawierajace grupy fruktozylowe, korzystnie wodne roztwory sacharozy. 55 Okreslenie „produkt wtórny" oznacza produkt wytwa¬ rzany w wyniku dzialania preparatu enzymu transferazy fruktozylowej na produkt wyjsciowy.W dalszym opisie, jezeli nie zaznaczono inaczej, czesci oznaczaja czesci wagowe, a procenty oznaczaja procenty 60 wagowo/objetosciowe.Okreslenie „analiza metoda chromatografii cieczowej pod cisnieniem", w skrócie HPLC, oznacza metode po¬ legajaca na tym, ze skladniki chrcmatcgrafuje sie przez' eluowanie pod zwiekszonym cisnieniem woda z kationowego (5 wymieniacza zywicznego w postaci wapniowej. ^121 700 5 Eluowane skladniki identyfikuje sie za pomoca róznico¬ wego refraktometru. Za pomoca elektronicznego integra¬ tora okresla sie ilosc weglowodanów nie-dekstrozowych i ilosc dekstrozy oblicza z róznicy. Metoda ta jest opisana ogólnie w Analysis of Carbohydrate Mixtures by Liquid Chromatography, Am. Soc. Brew. Chem. Proc, 1973, strony 43—46. Jako zywice stosuje sie preparat o nazwie ,,Aminex Q" 15—5 w postaci wapniowej, produkowany przez Bio-Rad Laboratories, Richmond, Kalifornia, Stany Zjednoczone Ameryki.Zgodnie z wynalazkiem, produkt wyjsciowy, korzystnie zawierajacy co najmniej 20 % wagowych sacharoze, poddaje sie dzialaniu preparatu enzymu, transferazy fruktozylowej, majacego zdolnpsc powodowania przemiany sacharozy w produkt skladajacy sie z frakcji monosacharydowej, za¬ wierajacej glówna czesc glikozy i mala ilosc fruktozy oraz z polisacharydów, zawierajacych co najmniej 66% wago¬ wych grup fruktozylowych. Wytwarzany w ten sposób produkt zawiera nie znany dotychczas produkt polisacha- rydowy.Polisacharydy zawarte w produkcie wtórnym obejmuja wszystkie polimery zawierajace fruktoze (oprócz sacharozy) i majace co najmniej dwie grupy monosacharydowe. Poli¬ mery te mozna tez okreslic jako polisacharydy zawierajace grupy fruktozylowe polaczone wiazaniami (2 ? 1)-/?.Jak opisano nizej, w zaleznosci od warunków procesu transfruktozylacji mozna wytwarzac polisacharydy znaj¬ dujace sie glównie w zakresie z góry okreslonym. Tak na przyklad, mozna wytwarzac produkt wtórny, w którym glówna czesc (np. co najmniej 60 % molowych) polisacha¬ rydu stanowi oligomery o 2—10 (to jest DP2-10), a prze¬ waznie o 3—6 (to jest DP 3—6) grupach monosacharydo- wych. Nastepnie, glikoze zawarta w otrzymanym pro¬ dukcie reakcji izomeryzuje sie do fruktozy przez dzialanie enzymem izomerazy w obecnosci tych plisacharydów, po czym polisacharydy te poddaje sie hydrolizie w nieobec¬ nosci aktywnego enzymu izomerazy. Hydrolize te mozna prowadzic znanymi sposobami, to jest enzymatycznie, stosujac inwertaze, albo za pomoca kwasu w lagodnych warunkach.Zgodnie z wynalazkiem, polisacharydy mozna tez od¬ dzielac od glikozy i fruktozy i poddawac opisanej wyzej hydrolizie, wytwarzajac syrop o bardzo wysokiej zawartosci fruktozy, wynoszacej powyzej 66%, a nawet powyzej 90% wagowych. Proces oddzielania mozna prowadzic bezpo¬ srednio, bez koniecznosci izomeryzacji glikozy zawartej w produkcie reakcji, przy czym proces ten mozna korzyst¬ nie prowadzic na drodze zwyklego oddzielania metodami fizycznymi, opartymi na róznicy wielkosci czasteczek, np. stosujac przepony, tak jak w metodach ultrafiltracji i dia¬ lizy, albo za pomoca wytracania rozpuszczalnikowego czy absorpcji weglem.Metody rozdzielania przy uzyciu przepon sa znane np. z opisów patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki nr nr 3173867, Re 26097, 3541006 i 3691068.Proces wytwarzania syropów o duzej zawartosci fruktozy zgodnie z wynalazkiem korzystnie prowadzi sie podddajac sacharoze dzialaniu preparatu enzymu transferazy frakto- zylowej pochodzacego od szczepów Pullularia pullulans, takich jak ATCC 9348, ATCG 12538, NRRL 1673, NRRL Y231, NRRL YB3892 i NRRL YB3861. Wytworzony produkt drugorzedowy poddaje sie dalej dzialaniu enzymu izomerazy, po czym zizomeryzowany produkt hydrolizuje sie w nieobecnosci aktywnego enzymu i izomerazy. 6 Wtórny produkt, wytwarzany w pierwszym etapie procesu prowadzonego sposobem wedlug wynalazku, jest produktem nowym, nadajacym sie szczególnie dobrze do izomeryzacji i nastepnie hydrolizy, przy czym stosujac jako 5 wyjsciowy produkt sacharoze i dzialajac enzymem trans¬ ferazy fruktozowej otrzymuje sie syropy o zawartosci fruktozy powyzej 55% wagowych. Produkty nadajace sie do enzymatycznej izomeryzacji i nastepnie dajace w wyniku hydrolizy syropy o zawartosci fruktozy powyzej 55% wa- io gowych, zawieraja okolo 20% — 60% wagowych mono- sacharydów, glównie glikczy i o malej zawartosci fruktozy oraz odokolo 70 % do okolo 40 % wagowych polisacharydów zawierajacych wiecej niz 66% wagowych grup fruktozy¬ lowych. 15 Szczególnie cenne produkty wtórne wytwarza sie zgodnie z wynalazkiem z sacharozy droga transfruktozylacji w obec¬ nosci dostatecznej ilosci preparatu enzymu transferazy fruktozylowej pochodzacego od szczepu Pullularia pullu¬ lans ATCC 9348, przy prowadzeniu procesu w tempera- 20 turze okolo 25°C — 65 °C, a zwlaszcza 50—60 °C, przy wartosci pH okolo 4,5—6,5, korzy, tnie 5,4—5,6. W tych warunkach stezenie sacharozy w wyjsciowym produkcie moze byc male i wynosic 10 g na 100 ml wody, ale korzyst¬ niej jest stosowac roztwory o mozliwie najwyzszym steze- 25 niu, to jest okolo 30—60 g na 100 ml wody, a nawet na¬ sycone roztwory sacharozy, gdyz wówczas predkosc reakcji jest wyzsza, jak to opisano nizej szczególowo.Przy prowadzeniu procesu sposobem wedlug wynalazku najmniejsza ilosc transferazy fruktozylowej wynosi 0,5 50 jednostki na 1 g sacharozy, przy czym ze wzgledów ekono¬ micznych nie stosuje sie wiecej niz 50 jednostek transferazy na 1 g sacharozy.Nowy preparat transferazy fruktozylowej stosowany zgodnie z wynalazkiem mozna wytwarzac znanymi sposo- 35 bami, podanymi np. w opisach patentowych Stanów Zjed¬ noczonych Ameryki nr nr 3565756, 3806419, 3535123 i w publikacji S, Ueda i wspólpracowników w Applied Microbiology, II, 211-215 (1963). W tych znanych sposobach korzystnie wprowadza sie jednak pewne nowe 40 zabiewi oddzielania i oczyszczania, opisane ponizej.Wytwarzanie preparatu enzymu transferazy fruktozylo¬ wej z Pullularia pullulans ATCC 9348 na nosniku celito- wym.A. Proces fermentacji w celu wytwarzania enzymu. 45 Srodowisko dla rozwoju szczepionki i procesu fermentacji w celu wytworzenia enzymu zawiera nastepujace skladniki: 0,5% dwzasadowego fosforanu potasowego, 0,1% chlorku sodowego, 0,02% MgS04.7H20, 0,06% siarczanu dwu- amonowego, 0,3 % wyciagu z drozdzy (Difco Laboratories), 53 7,5% sacharozy nadajacej sie do celów spozywczych wartosc pH doprowadza sie do 6,8.W stozkowych kolbach hodowlanych o pojemnosci 500 ml umieszcza sie po 100 ml wyjalowionego srodowiska i zaszczepia skosna kultura czarnych drozdzy Pullularia 55 pullulans ATCC 9348^ po czym wytrzasa w temperaturze 32 °C w ciagu 48 godzin. Zawartosc kazdej z kolb stosuje sie do zaszczepienia 200 ml podanej wyztj pozywki w stoz¬ kowych kolbach o pojemnosci 1 litra. Stosuje sie szczepionke o stezeniu 0,5% wagowo/objetosciowych i fermentacje 10 prowadzi wytrzasajac kolby w temperaturze 32°C w ciagu 7 dni.B. Wyosobnianie enzymu z brzeczki fermentacyjnej.Brzeczkez 40 kolb zlewa sie razem i kolby poplukuje woda, dolewajac popluczyny do brzeczki. Objetosc samej brzeczki 65 wynosi okolo 8 litrów, a po rozcienczeniu popluczynami121700 Wzrasta do okolo 12 litrów. Rozcienczona brzeczke odwiro¬ wuje sie w wirówce Sharples o ciaglym dzialaniu, w celu usuniecia komórek drozdzy ! resztek komórek. Ciecz w po¬ staci lepkiego roztworu o barwie czarnej traktuje sie chlor¬ kiem wapnia az do uzyskania stezenia 0,5 % wagowo/obje¬ tosciowych i zobojetnia wodorotlenkiem sodowym do wartosci pH 7,0. Nastepnie otrzymana ciecz przepuszcza sie ponownie przez wirówke, otrzymujac lepki cdciek o niklym zabarwieniu. Odciek ten zakwasza sie kwasem solnym do wartosci pH 5,5 i dodaje 1000 jednostek pullu- lanazy (okreslenie stosoware w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3806419). W celu zakonserwo¬ wania do brzeczki dodaje sie toluen w ilosci niezbednej do nasycenia i pozostawia na noc w temperaturze pokojo¬ wej. Nastepnie do brzeczki dodaje sie celitu (preparat Grefco nr 503 Celite produkcji Johns-Manville Products Corporation, Lompoe, Kalifornia, Stany Zjednoczone Ameryki) w takiej ilosci, aby jego stezenie wynosilo 1 %.Celit dodaje sie w postaci zawiesiny w 24 litrach acetonu i miesza, po czym odsacza osad, przemywa go acetonem i suszy w powietrzu o temperaturze pokojowej. Osad ten zawiera enzym transferazy fruktozylowej osadzony na celi- cie jako nosniku.Stosowany w tym procesie dodatek chlorku wapnia oraz regulowaniu wartosci pH ma na celu usuniecie pigmentu o czarnej barwie oraz kwasnych polisacharydów. [Omówie¬ nie tych kwasnych polisacharydów patrz Acta Chem. Scand 16, 615—622 (1962)]. Otrzymany produkt jest preparatem stosunkowo czystym, bezbarwnym i opisany wyzej zabieg rafinowania, polegajacy na zwyklym odwirowywaniu lub odsaczaniu osadu, umozliwia wytwarzanie preparatu enzy- mowego nie zawierajacego niepozadanego pigmentu i kwas¬ nych plisacharydów, bedacych ubocznymi produktami w procesie fermentacji prowadzonej przy uzyciu Pullu- laria pullulans.Pozadane jest równiez usuwanie polisacharydu pul lu¬ lanowego, który równiez wytraca sie razem z enzymem tran¬ sferazy fruktozylowej po dodaniu rozpuszczalnika do brzecz¬ ki. W tym celu, odciek otrzymany po traktowaniu chlorkiem wapnia i po uregulowaniu wartosci pH mozna zgodnie z wynalazkiem poddawac dzialaniu enzymu znanego pod nazwa pullulanazy. Pullulanaza hydrolizuje pullulan bez wzgledu na jego charakter, rozkladajac go na polimer o mniejszych czasteczkach, który nie wytraca sie i tym samym nie zanieczyszcza preparatu enzymowego podczas dodawania rozpuszczalnika, np. acetonu lub alkoholu.Ten dodatkowy zabieg oczyszczania równiez jest zabiegiem nowym, stosowanym w procesie wedlug wynalazku. 8 Enzymowe preparaty transferyzy fruktozylowej stoso¬ wane w procesie wedlug wynalazku mozna tez stosowac bez oddzielania pullulanu, to jest bez hydrolizowania pullulanu za pomoca pullulanazy i wówczas pullulan sta- 5 nowi nosnik dla enzymu transferazy fruktozylowej, jak to opisano nizej.Wytwarzanie produktu wtórnego przy uzyciu enzymu transferazy fruktozylowej na nosniku pullulanowym. Do 20% roztwcru sacharozy, którego wartosc pH doprowa- io dzono do 5,5 za pomoca 0,05 m buforowego roztworu cytrynianowego, dodaje sie 1% bezwodnego pullulanu, wytworzonego w sposób wyzej opisany, ale nie poddawane¬ go hydrolizie za pomoca pullulanazy. Pullulan stanowi tu nosnik i celitujako nosnika nie stosuje sie. Na 1 g pullulanu 15 stosuje sie 677 jednostek transferazy fruktozylowej i reakcje prowadzi sie az do zmetnienia mieszaniny. Próbke tej mieszaniny analizuje sie metoda chromatografii cieczowej pod cisnieniem, otrzymujac nastepujace wyniki: Fruktoza Dekstroza DP2 DP3 DP4+ 20 6,9 40,6 6,2 11,1 35,2 W próbach 1, 2 i 3 omówiono dalsze cechy enzymu wy¬ tworzonego sposobem opisanym powyzej.Próba 1. Produkty enzymatycznego dzialania i odpornosc enzymu na dzialanie ciepla. 25 W kolbach wyposazonych w nakretki umieszcza sie po 60 g sacharozy jadalnej oraz preparat enzymu transferazy fruktozylowej, wytworzony z produktu otrzymanego w spo¬ sób opisany wyzej przez zdyspergowanie odpowiednich ilosci enzymu osadzonego na celicit w odmierzonych ilos- so ciach wody tak, aby otrzymac odpowiednio rózne stezenia roztworu enzymu. Nastepnie odsacza sie celit i przesacz dodaje do mieszaniny reakcyjnej w ilosciach 10, 20 i 30 jednostek enzymu na 1 g sacharozy, stanowiacej produkt wyjsciowy. Kazda z tych mieszanin rozciencza sie nastepnie 35 woda do objetosci 100 ml i prowadzi reakcje przy wartosci pH 5,5 w ciagu 66 godzin w temperaturze 55°C i oddziel¬ nie w temperaturze 60°C. Po uplywie 24, 43 i 66 godzin pobiera sie próbki i oznacza w nich zawartosc redukujacego cukru, swiadczaca o wystepowaniu aktywnosci enzymatycz- 40 nej. Po wykonaniu tych analiz mieszaniny reakcyjne za¬ mraza sie w celu zatrzymania enzymatycznego dzialania i metoda chromatografii cieczowej pod cisnieniem okresla sie w próbkach mieszanin sklad weglowodanów. Wyniki podano w tablicach 1 i 2. 45 Wyniki podane w tablicy 1 uzyskano metoda opisana wyzej przy omawianiu oznaczania aktywnosci izomerazy, a liczba jednostek enzymu podana w rubryce 2 tablicy 1 oznacza liczbe tych jednostek na 1 g sacharozy.Tablica 1 Oznaczanie redukujacego cukru Temperatura 55°C 60°C Liczba jednostek enzymu 0 10 20 30 0 10 20 30 Zawartosc redukujacego cukru mg/ml po 24 go¬ dzinach 191 192 246 0,7 200 219 282 PH 5,80 5,40 5,40 5,35 5,75 5,10 5,15 5,20 Zawartosc redukujacego cukru mg/ml po 43 go¬ dzinach 231 270 334 1,5 243 288 360 PH 5,80 5,25 5,25 5,15 5,80 470 1 4,90 4,95 Zawartosc redukujacego cukru mg ml po 66 go¬ dzinach 268 301 390 2,1 270 346 420121 700 10 Tablica 2 Analiza zawartosci weglowodanów Proces w temperaturze 55 °C Dawka enzymu jednostek'1 g | ^acra^ozy 1 10 20 30 Czas trwania reakcji 1 godziny 2 24 43 66 24 43 66 24 43 66 Zawartosc dekstrozy % 1 3 31,7 34,5 36,7 33,9 37,4 40,5 37,4 41,8 46,1 Zawartosc lewulozy % 4 2,3 1 3,2 3,9 2,8 4,2 4,9 4,0 5,9 7,5 Zawartosc DP2 % | 5 10,0 9,4 8,6 8,8 7,9 7,4 7,1 6,8 7,0 Zawartosc DP3 % 6 25,0 17,9 15,0 19,7 12,1 10,8 12,5 11,4 11,5 DP4+ i wyzszych % 1 7 1 31,0 35,0 35,8 | 34,8 38,4 96,4 39,0 34,1 27,9 1 1 Proces w temperaturze 60°C 1 10 20 30 24 43 66 24 43 66 24 43 66 32,2 35,0 36,7 35,5 38,4 41,3 39,0 43,7 47,8 2,8 4,0 5,4 3,8 5,0 1 6,0 5,5 7,1 9,2 | 6,1 1 9,8 9,4 8,4 8,0 7,9 7,1 7,3 7,4 24,3 18,2 16,0 17,1 12,3 11,1 12,1 11,0 11,1 30,6 1 33,0 32,5 1 35,2 36,3 33,1 | 36,3 30,9 24,5 | Wyniki podane w tablicach 1 i 2 swiadcza o tym, ze enzym jest w obecnosci produktu wyjsciowego i przy wartosci pH 5,5 w temperaturze 55 °C i 60°C trwaly w ciagu 66 godzin, co dowodzi, ze jest on przydatny w pro¬ cesach na skaletechniczna. 30 Próba 1 wykazuje takze, ze wtórny produkt wytworzony zgodnie z wynalazkiem przez przemiane sacharozy za pomoca nowego pieparatu transferazy fruktozylowej sta¬ nowi cenne zródlo, nadajace sie do wytwarzania z sacharozy syropów o duzej zawartosci fruktozy. Dowodza tego wy- 35 niki podane w tablicy 2, zgodnie z którymi glównymi skladnikami produktu reakcji sa dekstroza i polimery, które po hydrolizie daja jako glówny produkt fruktoze.Swiadczy to równiez o tym, ze enzym wytwarzany sposobem wyzej opLanym dziala skutecznie przy stezeniu sacharozy 4° wynoszacym 60% wagowo/objetosciowych, jak równiez przy wysokich stezeniach glikozy.Próba 2. Wplyw temperatury na aktywnosc enzymu.Wplyw temperatury na predkosc reakcji z udzialem 4$ enzymu transferazy fruktozylowej oznacza sie za pomoca analizatora Technicon Autoanalyzer II w nastepujacy sposób. Mieszanina reakcyjna zawiera 7,5 ml roztworu sacharozy o stezeniu 80% wagowo/objetosciowych, 2,3 ml 0,1 m roztworu buforowego cytrynianu o wartosci pH 5,5 50 i 0,2 ml roztworu enzymu pullulanowego o stezeniu 2% wagowo/objetosciowych (preparat enzymowy wytwarzany sposobem opisanym wyzej). Koncowe stezenie sacharozy wynosi 60% wagowo/objetosciowych. Próbki utrzymuje sie w temperaturze 30 °C, 40°C, 50 °C i 60 °C i bada w ciagu 55 10 minut za pomoca analizatora. Wyniki swiadcza o tym, ze predkosc enzymatycznej reakcji w temperaturze 40°C jest 1,89 raza wieksza niz w temperaturze 30CC, w tempera¬ turze 50°C 1,29 raza wieksza niz w temperaturze 40°C, a w temperaturze 60°C 1,48 raza wieksza niz w tempera- 65 turze 50°C. Swiadczy to o wzroscie predkosci reakcji ze wzrostem temperatury.Próba 3. Oznaczanie wartosci Km Michaelis-Menten dla enzymu transferazy fruktozylowej.Wartosc Km oznacza stezenie produktu wyjsciowego, przy którym predkosc enzymatycznej reakcji wynosi po¬ lowe predkosci maksymalnej Vmaks. Wartosc te dla enzymu transferazy fruktozylowej oblicza sie w nastepujacy sposób.Podstawowy roztwór sacharozy o stezeniu 90% wagowo/ /objetosciowych doprowadza sie za pomoca buforowego roztworu cytrynianu o stezeniu 0,1 m do wartosci pH 5,5 i przygotowuje próbki po 9,8 ml, w których stezenie sa¬ charozy po uzupelnieniu do 10 ml wynosi 5%, 10%, 30%, 40%, 50%, 60% i 70%. Do próbek tych dodaje sie w tem¬ peraturze 55 CC po 0,2 ml roztworu zawierajacego 1,1 jednostki enzymu transferazy fruktozylowej i niezwlocznie analizuje, jak opisano wyzej za pomoca analizatora Techni¬ con Autoanalyzer II. Jako próby porównawcze stosuje sie typowe roztwory glikozy, wycechowane w mikrogra- mach/ml.W tablicy 3 podano predkosc wytwarzania glikozy w mikrogramach/ml/minute przy róznych stezeniach sacharozy, stosujac stala dawke 1,1 jednostki preparatu enzymowego transferazy fruktozylowej, opisanego wyzej.W trzeciej kolumnie tej tablicy podano predkosc procesu prowadzonego ponownie w ciagu nastepnego dnia dla roz¬ tworu o zawartosci 60% sacharozy, wytworzonego z roz¬ tworu podstawowego.Wartosc Km wynosi 0,27 molowego stezenia sacharozy, a najwyzsza predkosc reakcji jest przy stezeniu sacharozy wynoszacym 1,374 m, przy wartosci pH 5,5 i w tempera¬ turze 55 °C, Wynalazek zilustrowano ponizej w przykladach.* Pro¬ centy podane w przykladach, o ile nie zaznaczono inaczej, oznaczaja procenty wagowe.121 700 11 Tablica 3 Zawartosc 1 sacharozy w % 5 10 20 30 40 . 50 60 70 Predkosc reakcji ^g/ml/minute 8,0 11,8 15,7 18,0 18,6 19,2 17,8 15,6 Predkosc reakcji //g/ml/minute 8,0 11,6 15,2 17,6 18,2 17,2 18,2 — Przyklad I. A. Wytwarzanie wtórnego produktu- 600 g jadalnej sacharozy rozpuszcza sie w wodzie tak, aby otrzymac 800 ml roztworu, który nastepnie zakwasza sie rozcienczonym kwasem solnym do wartosci pH 5,5.Oddzielnie przygotowuje sie zawiesine w 100 ml wody lig bezwodnego preparatu enzymu osadzonego na celicie, wytworzonego w sposób opisany wyzej i zawierajacego 550 jednostek enzymu na 1 g. Zawiesine odsacza sie na lejku Btichnera przez bibule filtracyjna Whatman nr 1, po czym osad przemywa sie 100 ml wody. Przesacz o objetosci 200 ml dodaje sie do roztworu sacharozy w kolbie o po¬ jemnosci 2 litry, wyposazonej w zamkniecie. Kolbe umiesz¬ cza sie w kapieli wodnej o temperaturze i prowadzi reakcje w ciagu 20 godzin, po czym pobiera próbke i oznacza w niej zawartosc weglowodanów metoda chromatografii cieczowej pod cisnieniem. Wyniki podano w tablicy 4^ Tablica 4 | Weglowodan 1 Fruktoza Dekstroza DPa DP, | DP4 i wyzsze Zawartosc w % 2,4 32,8 10,6 22,9 31,3 Do otrzymanego produktu reakcji dodaje sie taka ilosc Chlorku magnezu, aby otrzymac jego stezenie wynoszace 5 inm, po czym roztwór alkalizuje sie rozcienczonym roz¬ tworem wodorotlenku sodowego do wartosci pH 8,4.B. Izomeryzacja wtórnego produktu metoda ciagla.Izomeraze glikozy otrzymana z Streptomyces elivo- chromogenes ATCC 21715 (patrz opis patentowy Stanów ^jednoczonych Ameryki nr Re 29152) osadza sie na po¬ rowatym tlenku glinowym (nosnik o regulowanych porach wytwarzany przez Corning Glass Co., Corning, N. Y., Stany Zjednoczone Ameryki, patrz opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3992329) stosujac nastepujace zabiegi. Nosnik przemywa Sie dwukrotnie woda, dodaje do niego 0,1 m roztworu cytrynianu sodowego i miesza w ciagu 1 godziny, po czym wymywa sie cytrynian sodowy z nos¬ nika az do chwili, gdy przewodnictwo popluczyn wyniesie 1000 mikroomów. Nastepnie nosnik traktuje sie w ciapu 1 godziny 0,05 m roztworem chlorku magnezu, po czym dekantuje sie roztwór chlorku magnezu i dodaje tyle 0,05 m roztworu chlorku magnezu, aby otrzymac ostatecznie stezenie enzymu wynoszace 400 jednostek na 1 ml. Do nosnika dodaje sie nastepnie koncentrat enzymu izomerazy W takiej ilosci, aby uzyskac stezenie 495000 jednostek na 1 litr, po czym enzym kontaktuje sie z nosnikiem w ciagu 22—24 godzin i nastepnie splukuje sie zwiazany enzym z nosnika woda destylowana. 12 W szklanej kolumnie 3 cm x 18 cm, wyposazonej w plaszcz i polaczonej przewodem z pompa ze zbiornikiem zawierajacym produkt wyjsciowy, umieszcza sie enzym osadzony na nosniku tak, aby objetosc zloza wynosila 45 ml. 5 We wszystkich próbach izomeryzacji temperatura w kolum¬ nie wynosi 60°C. Do kolumny doprowadza sie syrop dek- strozy o stezeniu 50 % wagowo/objetosciowych, zawierajacy roztwór chlorku magnezu o stezeniu 5 mm zalkalizowany do wartosci pH 8,4. Po wypróbowaniu dzialania kolumny 10 reguluje sie przeplyw przez nia do 292 ml/godzine i odpro¬ wadza z kolumny ciecz do poziomu zloza. Nastepnie roz¬ poczyna sie doprowadzanie wtórnego produktu A o skla¬ dzie podanym w tablicy 5, przy czym poczatkowo reguluje sie recznie przeplyw i odebraniu 20 ml cieczy nastawia sie 15 przeplyw 292 ml/godzine. Pierwsze 100 ml otrzymanego syropu odrzuca sie jako produkt niejednolity i nastepnie prowadzi przez kolumne reszte wtórnego produktu, to jest okolo 850 ml. Po uplywie 1 godziny predkosc prze¬ plywu wzrasta do 570 ml/godzine i wówczas reguluje sie 20 ja tak, aby do konca próby wynosila 300 ml/godzine. Po wprowadzeniu calej ilosci wtórnego produktu na kolumne kieruje sie ponownie roztwór dekstrozy, w celu wykazania, ze izomeraza nadal dziala. W tablicy 5 podano sklad pro¬ duktu wtórnego poddawanego reakcji oraz sklad ostatecz- 25 nego produktu B. Analize prowadzono metoda chromato¬ grafii cieczowej pod cisnieniem.Tablica 5 Skladnik Fruktoza Dekstroza DP2 DP3 | DP4 i wyzsze Sklad produktu wtórnego A % 2,4 32,8 10,6 22,9 31,3 Sklad produktu koncowego B % 15,7 18,9 11,0 22,9 31,5 | Wyniki podane w tablicy 5 swiadcza o tym, ze 42,38 % 40 wolnej dekstrozy zawartej w produkcie wtórnym ulega przy przejsciu przez kolumne izomeryzacji, dajac fruktoze.Polimery fruktozy zawarte w produkcie wtórnym nie ulegaja w tym czasie przeksztalceniu ani tez nie maja wplywu na proces izomeryzacji dekstrozy. Nalezy pod- 45 kreslic, ze w koncowym produkcie 45 % monosacharydów stanowi fruktoza i 55 % dekstroza.C. Hydroliza enzymatyczna.Do 100 ml produktu otrzymanego w sposób opisany w ustepie B dodaje sie 10 mg oczyszczonej inwertazy 50 otrzymanej z Candida utilis. Mieszanine zabezpieczona toluenem pozostawia sie na noc w temperaturze pokojowej, po czym pobiera sie próbke otrzymanej mieszaniny i ana¬ lizuje metoda cisnieniowej chromatografii cieczowej. Na¬ stepnie kontynuuje sie reakcje w ciagu 6 dni, po uplywie 55 których ponownie pobiera sie próbke mieszaniny i anali¬ zuje. Wyniki analiz podano w tablicy 6. Swiadcza one 0 tym, ze wzrasta przede wszystkim zawartosc fruktozy i w mniejszym stopniu zawartosc glikozy, a zawartosc innych cukrów maleje. 10 W próbach tych stosowano preparat inwertazy produkcji firmy Siekagaku Kogyo Co., Ltd., Tokio,Japonia, o aktyw¬ nosci 123 jednostek/mg. Aktywnosc te okresla sie w ten sposób, ze 1 jednostka inwertazy katalizuje rozszczepianie 1 mikromola glikozy dajac 1 mikromol fruktozy w ciagu 65 1 minuty i w okreslonych warunkach.121 700 13 14 W przykladach I i II stosowano produkt wyjsciowy, w którym stezenie sacharozy nie bylo wyzsze od stezenia odpowiadajacego stanowi nasycenia. W przykladzie III opisano natomiast proces, w którym stezenie sacharozy 5 w produkcie wyjsciowym, poddawanym dzialaniu trans- ferazy fruktozylowej jest wyzsze od stezenia w stanie na¬ syconym. Próby te wykazuja, ze w takich warunkach otrzy¬ muje sie produkt o zwiekszonej zawartosci DPa (to jest fruktozylosacharoze), a mniej produktu DP4 i wyzszych 10 polimerów. W tych warunkach otrzymuje sie tez wtórny produkt o zawartosci suchej substancji wyzszej niz w przy¬ padku prowadzenia procesu bez udzialu enzymu trans- ferazy fruktozylowej. Poza tym, przyklad ten wykazuje, ze w miare wzrostu zawartosci suchej substancji w wyjscio- 15 wym produkcie maleje stopien polimeryzacji polimeru fruktozy we wtórnym produkcie, totez polimer DP4 i poli¬ mery wyzsze wystepuja tylko w malych ilosciach. Wyniki te róznia sie wiec od wyników uzyskiwanych przy stosowa¬ niu wyjsciowych produktów o stezeniu sacharozy mniej- 20 szym od stezenia odpowiadajacego stanowi nasycenia, gdyz w przypadku tych nizszych stezen glównym sklad¬ nikiem jest DP4 i wyzsze polimery.Przyklad III. Po 200 g jadalnej sacharozy umieszcza sie w slojach o pojemnosci po 0,5 litra, wyposazonych 25 w zamkniecia. Do jednego ze slojów dodaje sie 50 ml wody i traktuje te próbe jako kontrolna. Do pozostalych slojów dodaje preparat enzymu transferazy fruktozylowej na celicie taki,jak stosowany w przykladach I i II, ale stosujac ilosci preparatu podane w tablicy 8. Sloje zamyka si? 30 i umieszcza w wytrzasanej kapieli wodnej o temperaturze 54—55 °C. Wytrzasa sie w ciagu 24 godzin, poruszaja^ sloje co pewien czas reka. Nastepnie z kazdego sloja po biera sie próbke do zamykanej probówki i umieszcza w e wrzacej wodzie w celu zdezaktywowania enzymu, po czym 35 analizuje sie metoda cisnieniowej chromatografii cieczowej i oznacza metoda K. Fischera zawartosc substancji sta¬ lych w roztworze. Wyniki podano w tablicy 8, przy czym w kolumnie 3 tablicy podano calkowita liczbe jednostek enzymu transferazy fruktozylowej, a skrót NW oznacza, 40 ze danego skladnika nie wykryto.Nalezy podkreslic, ze w przykladzie tym ciecz w próbie kontrolnej krystalizowala po ochlodzeniu jej do tempera¬ tury pokojowej, podczas gdy wytworzone enzymatyczne roztwory wtórnego produktu pozostawaly ciekle i nie 45 krystalizowaly podczas magnezowania. Otrzymany w wy¬ niku dzialania enzymu transferazy fruktozylowej produkt Tablica 8 Numer próby 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 kontrolna Zawartosc sacharozy (g) 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 Liczba jednostek enzymu 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 Zawartosc suchej substancji w roztworze (%) 1 74,5 75,6 76,3 77,1 77,1 78,1 78,1 80,0 79,0 79,6 72,7 Zawartosc weglowodanów w roztworze oznaczona chromatograficznie (%) | fruktoza | dekstroza 0,6 0,7 1,0 1 0,9 1,1 1,3 1,1 1,0 1,3 1,3 0,3 0,6 12,7 14,5 15,7 17,3 18,0 18,8 19,3 19,9 20,6 NW dp2 |dp3 |dp4+ 1 80,9 72,2 66,8 62,6 58,5 56,0 53,9 52,2 50,0 48,6 99,7 8,9 13,7 16,6 19,0 21,0 21,9 23,1 24,1 25,0 25,4 NW NW I 0,7 1,1 1,8 2,1 2,8 3,0 3,4 3,7 4,1 NW | Tablica 6 Skladnik 1 Fruktoza Dekstroza DP2 DPs DP4 i wyz- 1 sze Produkt wyjsciowy (produkt B) % 15,7 18,9 11,0 22,9 31,5 Sklad mie¬ szaniny po dzialaniu inwertazy w ciagu 1 dnia (%) 41,9 29,4 1,9 12,9 13,9 Sklad mie- szaniny po dzialaniu inwertazy w ciagu 7dni(%) 62,4 36,2 0 0,5 0,9 Przyklad II. Z jadalnej sacharozy wytwarza sie produkt wtórny w sposób identyczny z opisanym w przy¬ kladzie I A, po czym otrzymany produkt o skladzie takim, jak podany w tablicy 4 poddaje sie procesowi izomeryzacji sposobem opisanym w przykladzieI B, otrzymujac produkt o skladzie podanym w tablicy 5 (produkt B). Otrzymany produkt poddaje sie hydrolizie dzialajac kwasem siarkowym 0 stezeniu 0,05 n w temperaturze 75—80°C. Po uplywie 1 i 2 godzin pobiera sie próbki mieszaniny reakcyjnej i ana¬ lizuje je metoda cisnieniowej chromatografii cieczowej.Wyniki podano w tablicy 7. Swiadcza one o tym, ze przy stosowaniu hydrolizy za pomoca kwasu, tak jak i w przy¬ padku hydrolizy enzymatycznej opisanej w przykladzie I, wzrasta glównie zawartosc fruktozy, a zawartosc glikozy wzrasta w mniejszym stopniu i równoczesnie maleje za¬ wartosc polimerów DP2, DP3 i DP4 oraz wyzszych, co wskazuje na to, ze polimery te zawieraja fruktoze.Tablica 7 Skladnik 1 Fruktoza Dektroza DP2 DPs DP4 i wyz- | sze Sklad produktu wyjsciowego (produkt B) % 1 15,7 18,9 11,0 22,9 31,5 Sklad otrzymanego produktu po uplywie 1 godziny (%) 60,3 38,7 1,9 0,4 0 2 godzin (%) 59,1 i 37,9 2,6 0,3 0,2121 700 15 wtórny poddaje sie nastepnie procesowi izomeryzacji i hy¬ drolizy, jak opisano w przykladach I lub II.W przykladzie III stosowano 200 g sacharozy na 50 ml wody, czyli produkt wyjsciowy o zawartosci suchej sub¬ stancji wynoszacej 80%, ale mozna równiez stosowac pro¬ dukty wyjsciowe o jeszcze wyzszej zawartosci suchej sub¬ stancji.W przykladach opisano zabieg transfruktozylacji pro¬ wadzony sposobem nieciaglym, ale zabieg ten mozna zgod¬ nie z wynalazkiem prowadzic równiez systemem ciaglym, korzystnie stosujac enzym transferazy fruktozylowej osa¬ dzony na nosniku sposobami wyzej opisanymi.Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania produktów cukrowych zawieraja¬ cych wiecej niz 50 % wagowych fruktozy, polegajacy na pod¬ dawaniu sacharozy przeróbce na mieszanine zawierajaca dekstroze, fruktoze i polisacharydy oraz na izomeryzacji dekstrozy zawartej w tej mieszaninie w fruktoze przez dzialanie enzymem izomerazy, a nastepnie na hydrolizie polisacharydów w nieobecnosci enzymu izomerazy, zna¬ mienny tym, ze w pierwszym etapie procesu sacharoze poddaje sie dzialaniu nowego enzymu transferazy frukto¬ zylowej w temperaturze 25—65°C i przy wartosci pH 16 4,5—6,5, po czym dekstroze, zawarta w otrzymanym no¬ wym produkcie, stanowiacym mieszanine dekstrozy, fruk¬ tozy i polisacharydów zawierajacych co najmniej 66 % wa- gowch grup fruktozylowych polaczonych wiazaniami 5 (2 ? l)-fi9 przeprowadza sie w fruktoze dzialajac enzymem izomerazy, a polisacharydy zawarte w tej mie¬ szaninie poddaje sie hydrolizie w nieobecnosci enzymu izomerazy. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze dziala- 0 niu enzymu transferazy fruktozylowej poddaje sie produkt wyjsciowy zawierajacy co najmniej 20% wagowych sacha¬ rozy. 3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze stosuje sie enzym transferazy fruktozylowej pochodzacy od Pullu- laria pullulans. 4. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze izome¬ ryzacje dekstrozy prowadzi sie stosujac enzym izomerazy glikozy osadzony na nosniku. 0 5. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze polisa¬ charydy poddaje sie hydrolizie po oddzieleniu ich od deks¬ trozy metodami fizycznymi. 6. Sposób wedlug zastrz. 5, znamienny tym, ze poli¬ sacharydy oddziela sie od dekstrozy droga ultrafiltracji.LDD Z-d 2, z. 713/1400/83, n. 80+20 egz.Cena 100 zl PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL