DD156189A5

DD156189A5 - Verfahren zur herstellung von mutterkornalkaloiden,insbesondere ergokornin und beta-ergokryptin

Info

Publication number: DD156189A5
Application number: DD81227468A
Authority: DD
Inventors: Geza Wack; Janos Kiss; Zsuzsa Lengyel; Lajos Nagy; Nagy Eva Udvardy; Karoly Zalai; Erzsebet Zsoka
Original assignee: Richter Gedeon Vegyeszet
Priority date: 1980-02-08
Filing date: 1981-02-06
Publication date: 1982-08-04
Also published as: CH648846A5; DE3104151C2; GB2071651B; YU27881A; HU178405B; IL62079A0; FR2475573B1; SU1119609A3; US4369252A; DK151274C; NL8100567A; IT8119586A0; DK151274B; FR2475573A1; BE887391A; CA1154699A; DE3104151A1; DK52581A; IT1135359B; JPS56158094A

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Mutterkornalkaloiden,insbesondere Ergokornin und beta-Ergokryptin durch unter aeroben Bedingungen vorgenommene Fermentierung von Claviceps purpurea in einem Kohlenstoff-und Stickstoffquellen, Mineralsalzen und gegebenenfalls sonstige Zusaetze enthaltenden Naehrmedium. Fuer das Verfahren ist kennzeichnend, dass man als Produzentenstamm den Variantenstamm Claviceps purpurea MNG 00186 verwendet. Dieser Stamm wurde in der Ungarischen Nationalen Stammsammlung hinterlegt.

Description

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Verfahren zur Herstellung von Mutterkornalkaloide^ insbesondere Ergokornin und /o-Ergokryptin

Anwendungsgebiet der Erfindung:

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von" Mutterkornalkaloide^ insbesondere Ergokornin und β -JSrgokryptin, durch Verwendung eines neuen Stammes von Olaviceps purpurea·

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen:

Es ist bekannt, daß der durch Hydrieren des Ergotoxins erhaltene Arzneimittelwirkstoff Dihydroergotoxin ein Gemisch aus Dihydroergokristin, Dihydroergokornin und Dihydroergo-? kryptin ist (HU-PS Nr, 129 061),

1967 wurde bekannt, daß das Ergokryptin in zwei Formen exi-. stiert:

neben dem bereits früher identifizierten <X -Ergokryptin kann auch p -Ergokryptin aus der Mutterkorndroge isoliert werden (W. Schlier U₀ a„: Experientia 23,991 /1967/)* Das mittels Drogenextraktion beziehungsweise halbsynthetisch hergestellte P³ -Ergokryptin wurde pharmakologisch untersucht und er-

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wies sich als geeignet zur Beeinflussung der andronolytischen Aktivität, des Serotonin«Antagonismus, der Uterusmotilität und des vasoculären Tonus«

In der BE-PS Nr₀ 824 987 ist der erste Claviceps purpurea Stamm beschrieben, der hauptsächlich p «Ergokryptin produziert«, Dieser Stamm trägt in der Sammlung der Farmitalia die Bezeichnung FI 7374*

Wird dieser Stamm in einem als Kohlenstoffquelle zum Beispiel Saccharose, Glucose, Mannit, als Stickstoff quelle zum Beispiel Asparagin^ Peptone₈ hydrolysiertes Casein und Ammoniumsalze enthaltenden Nährmedium unter Belüftung bei 24 ⁰O ge·· züchtet, so ist innerhalb von 10 bis 16 Tagen ein Gesamtalkaloidspiegel von 950 bis 1240 Gamma/ml erreichbar* Das hauptsächlich p-Ergokryptin enthaltende Alkaloidgemisch ist jedoch reich an Ergosin und kann deshalb nicht unmittelbar (ohne die Abtrennung des Ergosins) zur Ergosins) zur Ergoto« xinherstellung verwendet werden₀

Bei Versuchen wurde aus dem in eineai nicht künstlich inokulierten Roggenfeld wachsenden Claviceps-Sklerotium der Pilz gezüchtet und aus diesem gemäß der HÜ«PS 151 7-24 durch wieder« holte Selektion unter abwechselnder Isolierung der Kolonien und Anreicherung in der flüssigen Kultur eine stabile Variante des Stammes Claviceps purpurea erhalten·

Die Grundlage der Selektion besteht darin, daß auf dem in der genannten Patentschrift beschriebenen Nährboden der alkaloidproduzie.rende Stamm farbige Kolonien bildet, die von den weissen Kolonien der nicht produzierenden Stämme gut unterschieden werden können_o · ·

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Die Kolonien des alkaloidproduzierenden neuen Stammes werden isoliert und zum Zwecke der Anreicherung auf ein sog„ differenzierendes Nährmedium überimpft. Das differenzierende Nährmedium enthält nehen anorganischen Phosphaten und anderen Mineralsalzen in erster Linie Saccharose, Bernstein- . , säure und Glycin»

Durch mehrfaches Wiederholen der Schritte Isolierung und Anreicherung wird die neue Variante des Stammes erhalten« Die Variante (Hausbezeichnung: CLY) wächst langsamer als die Kultur des Feldstammes Claviceps, sie erzeugt keine Konidien und ist in sämtlichen Nährmedien morphologisch der Hefe ähnlich, d.h. die für die Mycelform charakteristischen fadenartigen Hyphen fehlen·

Makroskopische Beschreibung des Stammes

Auf dem zum Selektieren verwendeten, Stärke und Tryptophan enthaltenden Agarmedien sind nach 10 Tagen die Kolonien von gerunzelter Oberfläche und orange-rosa Färbung, sie sind scharf abgegrenzt, ihr Durchmesser beträgt 6 bis 8 mm. Nach 20 Tagen haben die Kolonien einen Durchmesser von 20 bis 25 mm, weisen in der Mitte eine Erhebung auf und sind radial gerunzelt, ihre Farbe ist rosa-lila. Die Unterseite der Kolonien ist dunkelbraun, der Nährboden in ihrer Umgebung ist lila verfärbtο

Auf Malzagar bildet der Stamm im Alter von 10 Tagen hellbeigefafbene Kolonien von 1 bis 2 mm Durchmesser und regelmäßiger Halbkugelgestalt· Im Alter von 20 Tagen haben die Kolonien einen Durchmesser von 2 bis 4- mm, ihr Wachstum ist schwach ihre -^arbe hat sich nach bräunlich vertieft.

Auf St-Agar sind die Kolonien des Stammes im Alter von 10 Tagen scharf umgrenzt, in Richtung auf die Mitte zu gerun~ zeItj haben in der Mitte eine spitze Erhebung und weisen •einen Durchmesser von 8-12 mm auf» Die Spitze ist 3 bis 5 mm hoch. Die Farbe der Kolonien ist beige bis hellbraun. Nach 20 Tagen ist die Oberfläche der Kolonien stark und zum Rande hin sich verzweigend gefurcht, di'e Spitze ist kraterförmig« Die Kolonien sind von heilbrauner Farbe, mit einer kakaoähnlichen Schattierung, ihr Durchmesser ist verschieden und liegt zwischen 25 bis 40 mm, die Höhe beträgt 6 bis 8 mm« Die Kolonien lassen sich schlecht von der Oberfläche des Agars ablösen. Sie bilden keine Sporen»

Mikroskopische Charakterisierung'des Stammes in flüssiger Kultur

Im, Nährmedium GK nach 40 Stunden Kultivie3?ung: Kolonien aus wenigen Zellen beziehungsweise-zum großen Teil einzelne Zellen» Die Zellen sind 4 bis 8x8 bis 20 um groß, zylindrisch, abgerundet oder von unregelmäßiger Form. Teilung am Zellende oder durch Seitenverzweigung kann gleichermaßen häufig beobachtet werden₀ Die Zellenreihen sind kurz und bestehen aus einigen ZeIlen_β Unter dem Phasenkontrastmikroskop erscheinen die Zellen stark gekörnt, die älteren Zellen enthalten Vakuolen«, Keine Sporenbildung»

Im St-Nährmedium nach 40 Stunden Kultivierung: Das mikroskopische Bild ist mit dem bereits beschriebenen identisch mit dem Unterschied, daß auf diesem Nährmedium die Bildung von Kolonien beziehungsweise Zellenreihen häufiger ist« Die einzelnen Zellen sind'größer, die größeren, älteren Zellen enthalten keine Vakuolen* . .

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Die bei der Untersuchung der makroskopischen und mikroskopischen Erscheinung verwendeten Nährmedien werden zum Teil nachfolgend angegeben, während die Nährmedien St-Nährmedium, St-Agar und Nährmedium GK im Beispielteil beschrieb;^ werden«

Stärke-Tryptophan-Agar

Stärke 20 g

Tryptophan 1 g

Kaliumchlorid Ig

Diammoniumhydrogenphosphat 2g

Der pH-Wert wird auf 6,6 bis 6,8 eingestellt und das Volumen mit Wasser auf 1000 ml aufgefüllt; zu der Flüssigkeit werden 25 g Agarpulver (Difco) gegeben, das Nährmedium wird aufgekocht, zu je 150 ml in Flaschen gefüllt und sterilisiert.

Malzagar-Nährmedium

Malzextrakt	ad	60	g
Wasser		1000	g
Agarpulver (Di£co)	25	g

Das Nährmedium wird aufgekocht, zu je 150 ml in Flaschen gefüllt und. sterilisierte .

Biochemische Charakteristika des Stammes

Zersetzt mit dem Enzym /2 -Fructo-f uranosidase Saccharose und bild.et Transfer-Oligosaccharidei verwertet Citronensäure gut; produziert ein in erster Linie aus Hydroxyanthrachinonen bestehendes Pigment von Anthrachinoncharakter.

Wird der neue Stamm auf das der Literatur bekannten, Zucker und das Ammoniumsälz einer organischen Säure enthaltenden Nährmedien gezüchtet, so produziert er Alkaloide, 25 bis 30 %

des entstehenden Alkaloidgemisch.es sindp-Ergokryptin, die Hauptmenge, 55-60 %₉ ist Ergokornin, der verbleibende Anteil c{ -Ergokryptin« Außer den charakteristischen Peptidalkaloiden bildet der Staiam nur Ergometrin«

Der oben beschriebene neue Variantenstaiam von Claviceps purpurea wurde am 9o Mai 1979 unter der Bezeichnung 00186 MNG in der ungarischen Nationalstammsammlung deponierte

Bei der Untersuchung der Anwendungsgebiete des unter der Bezeichnung FiNG 00186 deponierten Stammes wurde gefunden, daß der Stamm bei einer unter aeroben Bedingungen vorgenommenen Fermentierung auf einem Kohlenstoff- und Stickstoffquellen Mineralsalze und gegebenenfalls weitere Zusätze enthaltenden Nährmedium gewisse Komponenten des Ergotoxins, nämlich Ergokornin, o( - und fi> «Ergokryptin, produziert,»

Ferner wurde gefunden, daß die Menge der produzierten Alkaloide in der Fermentierungsflüssigkeit ansteigt, wenn man wäh~ rend der Fermentierung als Präkursor der entstehenden Verbindungen Valin und/oder Isoleucin zu der Fermentierungsflüs-» sigkeit gibtβ

Ziel der Erfindimgs

Ziel der Erfindung ist die Schaffung eines Verfahrens zur Herstellung von Mutterkornalkaloiden, insbesondere Ergokornin und β «Ergokryptin durch unter aeroben Bedingungen vorgenommene Fermentierung von Claviceps purpurea auf einem Kohlenstoff-= und Stickstoffquellen, Mineralsalze und gegebenenfalls sonstige Zusätze enthaltenden Währmediume

Darlegung des Wesens der Erfindung:

Erfindungsgemäß wird hierbei als gezüchteter Stamm die Vari«

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ante Claviceps purpurea MNG 00186 verwendet.

Erfindungsgemäß wird die Fermentierung in einer submersen Kultur unter aeroben Bedingungen in einem Kohlenstoff« und Stickstoffquellen, Mineralsalze und gegebenenfalls sonstige Zusätze enthaltenden flüssigen Nährmedium, vorgenommene

Fermentiert wird bei Temperaturen zwischen 20 und 26 ⁰O, bei einem pH-Wert von 5»2 bis 6,8 und zwar vier bis acht Tage

lang, . . ν

Bei der Fermentierung werden gegebenenfalls die Menge der gebildeten Alkaloide steigernde Zusätze (Präkursoren), zum Beispiel Valin und/oder Isoleucin verwendet.

Der Präkursor wird der Kulturbrühe in einer Menge von 0,05 bis 0,5 g/100 ml, vorzugsweise 0,1 bis 0,3 g/100 ml, in Form einer wäßrigen, eventuell schwach sauren Lösung nach dem Sterilisieren des Nährmediums zugesetzt· Der Pfäkursor kann auf einmal, in mehreren Portionen oder auch in einer Periode der Fermentierung kontinuierlich zugesetzt werden·

In der Literatur wird die Produktion häufig 'durch die spektrophotometrisch gewonnenen Werte des Gesamtalkaloidgehaltes charakterisiert. Auch bei den hier beschriebenen Versuchen wurden auf der Grundlage von Farbreaktion die Gesamtalkaloidwerte photometrisch gemessen; sie erwiesen' sich jedoch als unspezifisch*

Zur Charakterisierung der Fermentation wurden die einzelnen Brgotoxin-Komponenten durch Elutionschromatographie oder quantitative Flüssigkeitschromatographie'bestimmt· Die Verwendung

des Stammes hat gegenüber den bisher bekannten Verfahren folgende Vorteile:

1. Die Produktion durch fermentierung ist moderner als die Verfahren der Drogenexbraktion« Die allgemeinen Nachteile der Zusammenarbeit mit der Landwirtschaft fallen fort, und das Verfahren kann, durch unmittelbares technisches Eingreifen bei jeder Charge gesteuert werden*

2«, Verglichen mit den aus einer langen Reihe von Reaktionen aufgebauten halbsynthetischen Verfahren wird im Falle der Fermentierung das komplizierte Molekül aus einfachen, leicht zugänglichen Stoffen (Saccharose, Ammoniumsalze) mit Hilfe der lebenden Zelle bei 24 ⁰G unter Zuführung von Luft hergestellt« Auch hat das halbsynthetische Verfahren nur die Synthese des Peptidteiles gelöst, der Lysergsäureteil muß unverändert durch Fermentierung aufgebaut werden«

3o Der Stamm produziert praktisch nur die Komponenten des ErgotoxinSe, Die geringe Menge Ergometrin kann, da Ergometrin wasserlöslich ist, leicht von den für die Ergotoxinherstellung in Frage kommenden Peptidalkaloiden abgetrennt werden«

Augf ühr ungsbe'ispie le S₁

Die Erfindung wird an Hand, der folgenden Beispiele näher erläutert,, ist jedoch nicht auf die Beispiele bschränkt_e

Die auf St-Agar-Nährboden. gewachsene Kultur von Claviceps purpurea MNG 00186 wird auf 100 ml in einem 500 ml~Erlenmeyer-» kolben befindliches Nährmedium GK geimpft und bei 24 ⁰C auf einem Schütteltisch (Frequenz? 300/min) 4 Tage lang inkubiert«'

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Je 10 ml der erhaltenen Kultur werden auf insgesamt acht weitere, je 100 ml St-Nährmedium enthaltende Kolben überimpft» Diese Kulturen werden bei 24 ⁰O auf dem Schütteltisch 7 Tage lang fermentiert» Zu vier Kolben wird kein Präkursor gegeben, dem Inhalt der übrigen vier Kolben werden zu Beginn der Fermentation je 2 g Valin als Präkursor zugegebene Am 7< Tag wird die Fermentation unterbrochen» Die Kulturbrühen ohne Präkursor werden vereinigt, ihr Alkaloidgehalt wird bestimmt. Der Ergokorningehalt beträgt 80tfv/ml, der <X -Ergokryptingehalt 15/Y¹Ml und der fi> -iErgokryptingehalt 30^VmI.

Die mit Präkursor bereiteten Kulturbrühen werden ebenfalls vereinigt, ihr Alkaloidgehalt wird bestimmt. Sie enthalten

Ergokornin, 25r^/ml c{ -Ergokryptin und 30^YmI -Ergokryptin

Es wurden folgende Nährböden verwendet:

Nährmedium GK

Trypcasin 7,0 g

Citronensäure 4,1 g

Kaliumdihydrogenphosphat 0,3 g

Magnesiumsulfat 0,3 S

Ammoniumhydroxyd ad pH 5|7-5j8 .

..Wasser ad 840 ml

Je 84 oder 840 ml des Nährmediums werden in Kolben gefüllt

und unter sterilen Bedingungen mit je 16 beziehungsweise 160 ml %iger Glucoselösung versetzt«,

S(P-Nährmedium

Saccharose 100,0 g

Bernsteinsäure 10,0 g

Kaliumdihydrogenphosphat 0,25 g

Magnesiumsulfat . 0,25 g

Ammoniumnitrat ." " 1,0 g

Calciumchlorid 1,0 g

Aramojiiumhydroxyd ad pH 5»2-5?3 Wasser.ad 1000 ml·

Das Nährmedium wird in Portionen zu. 100 ml in Erlenmeyerkol« ben oder in einer Menge von 1Ö0 Liter in einem halbtechniä sehen Fermentor sterilisiert«

Das St~Agar-»Nährmedium (Blake) unterscheidet sich dadurch von dem flüssigen St-Nahrmedium,, daß ihm pro Liter 25 g Agarpulver zugesetzt werden» Nach dem Zusatz des Agars wird das Nährmedium aufgekocht, in Portionen von je 150 ml in Flaschen gefüllt und sterilisierte

Beispiel 2

Die typische^ auf St~Agar~Nährmedium gewachsenen, 20 Tage alten Kolonien von Olaviceps purpurea MNG 00186 werden von der Fläche des Agar abgelöst und in 20 ml steriler physiologischer Kochsalzlösung homogenisiert und 10 ml der Suspension werden zu 100 ml vorsterilisiertem, in einem 500 ml-Erlenmey-» erkolben befindlichem St~Nährmedium gegeben«, Die Kultur wird 6 Tage lang bei 24 ⁰G auf dem Schütteltisch gezüchtet und dann auf 100 ml in einem 500 ml-Erlenmeyerkolben befindliches Nährmedium Τσ~54- überimpft« Nach 3 Tagen Fermentierung auf dem Schütteltisch werden 10 ml der Kultur auf 100 ml in einem 500 ml-lrlenmeyerkolben befindliches, sterilisiertes St-Nährmedi«· um überimpftö Diese Kultur wird unter den genannten Bedingungen auf dem Schütteltisch 7 Tage lang gezüchtet,» Danach ent-, hält sie folgende Alkaloidmengem

Ergokornin 150 ^ZmI₁, oC -Ergokryptin MOJ^/ml und β -Srgokryptin 90 J^/ml_&

Die Zusammensetzung des St-Nährmediums und des St-Agar-Nährmediums (Blake) wurde bereits in Beispiel 1 angegebene Das Nährmedium TC-54 hat folgende Zusammensetzung:

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Saccharose 100,0 g

Natriumchlorid 10,0 g

Citronensäure 10,0g

Kaliumdihydrogenphosphat 0,5 g

Magnesiumsulfat 0,5 g Ammoni irmhy dr oxy d ad pH 5i7-5»8

Wasser ad 1000 ml '

Das Nährmedium wird in Mengen von o'e 100 ml in Erlenmeyer-. kolben von 500 ml Volumen oder in Mengen von Je 10 Liter in Laborfermentoren von 15 Liter Volumen sterilisiert*

Beispiel 3

Eine 25 Tage alte Kultur von Olaviceps purpurea MNG 00186 auf St-Agar-Nährboden wird durch Abkratzen von der Oberfläche des Agars entfernt und in 100 ml physiologischer Kochsalzlösung homogenisiert« Mit der erhaltenen Suspension wird 1 Liter Nährmedium GK (vorsterilisiert in einem Erlenmeyerkolben von 3 Liter Volumen) beimpft. Die Kultur wird bei 24 ⁰C 44 Stunden lang geschüttelt. Dann wird die Kultur in einen Fermentor von 15 Liter Volumen eingebracht, in dem sich 10 Liter Nährmedium TC-54 befinden» Fermentiert wird bei 24 ⁰C unter Zuführung von 0,25 Liter/liter min Luft und einer Drehzahl von

••1

240 min <, Nach drei Tagen wird die Kultur in einen säurefesten Laborfermentor (150 1) überführt, in dem sich 100 Liter St-^ährmedium befinden. Diese Kultur wird bei 22 ⁰C, einer

—1

Drehzahl von 150 min und einer zugeführten Luftmenge von 0,35 Liter/Liter min 6 Tage lang gezüchtet. Am 2., 3.- und 5* Tag werden Je 100 g Valin und 20 g Isoleucin zu der Kulturbrühe gegeben.

Nach sechstätiger Fermentierung enthält die Kulturbrühe 320A/ ml Ergokornin, 60 A/ml <Ä -JSrgokryptin und 160J^/ml /3 -Ergo- ' kryptin.

Claims

«- Ί2 — Erfindungsanspruch;

1, Verfahren, zur Herstellung von. Mutterkornalkaloide]!, insbesondere Ergokornin und r -JSrgokryptin durch unter.aerob en Bedingungen vorgenonimene Fermentier ung von Olaviceps purpurea in einem Kohlenstoff- und Stickstoffquellen, Mineralsalze und gegebenenfalls sonstige Zusätze enthaltenden Nährmedium, gekennzeichnet dadurch, daß man als gezüchteten Stamm die Variante Claviceps purpurea MNG 00186 verwendet.

2· Verfahren'nach Punkt 1_S gekennzeichnet dadurch, daß Feraientie:
vornimmt»

man die Fermentierung bei 20 bis 26⁰O und einem pH«Wert von

3· Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß man als Zusatz die Präkursorverbindungen der produzierten Alkaloide der Fermentierungsflüssigkeit zugibt,,