DD202168A5 - Verfahren zur herstellung eines glycoproteins - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft d. Herstellung eines Glycoproteins mit einem Molekulargewicht von 5000 bis 300000, bestimmt durch Ultrazentrifugieren; einem Gewichtsverhaeltnis des Proteinteiles, bestimmt durch Lowry-Folin-Methode, zum Saccharidteil, bestimmt durch Phenol-Schwefelsaeure-Methode, im Bereich von 50/50 bis 80/20; einer Aminosaeure am N-Ende, bestehend im wesentlichen aus Tyrosin, Leucin oder Alanin; einer Aminosaeurerequenz Leucin-Phenylalanin-Valin am C-Ende; einer Elementzusammensetzung von im wesentlichen 35,2 bis 49,3 % C, 4,8 bis 8,0 % H, 4,3 bis 12,3 % N, Spuren bis 2,5 % S, Spuren bis 1,2 % P und dem Rest an 0; einem isoelektrischen Punkt im Bereich von pH 2,5 bis 5,0 und Nukleinsaeure als eine Komponente. Das neue Glycoprotein kann in der Medizin als Anti-Tumormittel eingesetzt werden.

Description

Die Erfindu ig betrifft neue Glycoproteine mit Anti-Tumorwirksamkeit und Lectin-ähnlicher Wirksamkeit.

Der hier benutzte Begriff "Lectin-ähnliche Wirksamkeit" umfaßt generell krebszellspezifische zellagglutinierende und Blast-umwandelnde Wirksamkeit für Lymphozyten, die den hierbeachriebenen Substanzen als Lecitin plus unspezifiache Inhibierungsfunkt ion innewohnt bei (gleichzeitiger) Antigenspezifiacher Erythrozytenagglutination, Affinität zur Oberfläche von LympJbLozyten und Aktivität gegenüber Makrophagen.

Bekannte techniache Lösungen

Durch die Erfinder ist bereits eine Substanz mit Anti-Tumor-

bekannt geworden, die durch Extraktion eines basidiotnyzetischen Furxgus der Gattung Coriolus mit heißem Wasser oder einer wäßrigen Alkalilösung erfolgt und anschließender Isolierung eines proteinhalt igen Polysaccharide aus der Substanz. Sie bestätigten, daß das stickstoffhaltige Polysaccharid ein aKtiver Bestandteil der Substanz ist (siehe US-PS 4 051 3H und 4 202 969).

Weiterhin ist aus der DD-PS 126 818 bekannt, daß aus einem basidiomyzetischen Fungus hergestellte Substanzen "Lectinwirksamkeit" aufweisen (siehe auch unter dem Abschnitt "Lectin-ähnliche Wirksamkeit").

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AP C 07 G/237 287/2 60 399/12

Ziel der Erfindung

Es ist Ziel der Erfindung, neue wirksame Antitumorinittel bereitzustellen.

»Veaen der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstelluug eines neuen Glycoproteins zu entwiciceln, das ein höheres Gewichtsverhältnis von seinem Protein-teil zu seinem Saccharidteil aufweist und eine spezifische .bindungsart an Aminosäuren in seinem Proteinteil besitzt, sowie Lectin-ähnliche, physiologische Wirksamkeiten und ebenso Anti-Tumor-nVirksamkeit zeigt, nämlich völlig verschieden von den bekannten Stickstoff-enthaltenden Polysacchariden«,

Erfindungsgemäß hergestellt wird ein Glycoprotein mit einem Molekulargewicht von 5000 bis 300 000, bestimmt nach

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dem Ultrazentrifugenverfahren, wobei das Gewichtsverhältnis von dessen Proteinteil, bestimmt nach dem Lowry-Fölin-Verfahren, zu dessen Saccharidteil, bestimmt nach dem Phenol-Schwefelsäure-Verfahren, im Bereich von 50 : 50 bis 80 : liegt; die Aminosäure an seinem !Wände im wesentlichen aus Tyrosin, Leucin oder Alanin besteht; die Aminosäuresequenz an seinem C-Ende Leucin-Phenylalanin-Valin ist; seine Elementzusammensetzung im wesentlichen zwischen 35,2 bis 49,3 % C, 4,8 bis 8,0 % H, 4,3 bis 12,3 # N, Spuren bis 2,5 % S, Spuren bis 1,2 % P und dem Ausgleich an 0 liegt; der isoelektrische Punkt zwischen pH 2,5 und pH 5 liegt und das eine Nukleinsäure als Komponente enthält»

In zweiter Linie betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Glycoproteins, gekennzeichnet durch die Schritte:

Extrahieren von Fruchtkörpern, Myzelien oder kultivierten Mycelien eines basidiomycetischen Fungus der Gattung Coriolus mit heißem Wasser oder einer wäßrigen 0,01 N bis 2,0 N Alkalilösung, Dialyse und/oder Ultrafiltration des erhaltenen Extraktes unter Entfernung der Substanzen mit niedrigem Molekulargewicht, d.h. mit einem Molekulargewicht von unter 5000, und fraktionsweises Sammeln der an ihrem isoelektrischen Punkt im pH-Bereich 2,5 bis 5,0 nach dem Verfahren der fraktionierten Fällung am isoelektrischen Punkt ausgefällten Fraktionen.

In dritter Linie betrifft die vorliegende Erfindung ein Antitumormittel, das zur Wachstumsinhibierung .von Krebszellen bei einem davon.betroffenen Patienten geeignet ist," und ein Glycoprotein enthält, das ein Molekulargewicht von 5000 bis 300 aufweist, bestimmt mit dem Ultrazentrifugen-Verfahren;

ein Gewichtsverhältnis seines Proteinteiles, bestimmt nach dem Lowry-Folin-Verfahren, zum Saccharidteil, bestimmt nach dem Phenpl-Schwefelsäure-Verfahren, von 50 : 50 bis 80 : 20 aufweist;

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eine Aminosäure an seinem N-Ende hat, die im wesentlichen aus Tyrosin, Leucin oder Alanin besteht;

die Aminosäuresequenz Leucin-Phenylalanin-Valin an seinem C-Bnde;

eine Elementzusammensetzung, die im wesentlichen 35,2 bis 49,3 # C, 4,8 bis 8,0 % H, 4,3 bis 12,3 * N, Spuren bis 2,5 % S, Spuren bis 1,2 % P und dem Ausgleich an 0 liegt;

einen isoelektrischen Punkt im Bereich von pH 2,5 bis 5,0 hat; und Nukleinsäure als eine Komponente enthält.

In vierter Linie betrifft die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung in einer Dosierungsform, die als aktiven Bestandteil ein Glycoprotein enthält, das ein Molekulargewicht von 5000 bis 300 000 aufweist, bestimmt mit dem Ultrazentrifugen-Verfahren;

ein Gewichtsverhältnis seines Proteinteiles, bestimmt nach dem Lowry-Folin-Verfahren, zum Saccharidteil, bestimmt nach dem Phenol-Schwefelsäure-Verfahren, von 50 : 50 bis 80 : 20 aufweist;

eine Aminosäure an seinem li-Ende hat, die im wesentlichen aus Tyrosin, Leucin oder Alanin besteht;

die Aminosäuresequenz Leucin-Phenylalanin-Valin an seinem C-Ende;

eine Elementzusammensetzung, die im wesentlichen 35,2 bis 49,3 * C, 4,8 bis 8,0 $ H, 4,3 bis 12,3 * N, Spuren bis 2,5 % S, Spuren bis 1,2 % P und dem Ausgleich an 0 liegt;

einen isoelektrischen Punkt im Bereich von pH 2,5 bis 5,0 hat;

und Nukleinsäure als eine Komponente enthält.

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Pig. 1 zeigt die Titrationskurve (Konzentration von H⁺ und OH" gegenüber dem pH-Wert der Lösung der erfindungsgemäßen Substanz) des erfindungsgemäßen Glycoproteins mittels wäßriger 0,02 N Salzsäurelösung und wäßriger 0,02 Natriumhydroxidlösung;

Pig. 2—19 sind InfrarotSpektren des erfindungsgemäß hergestellten Glycoproteins der Beispiele 1-18; Pig. 20 zeigt die Chemotaxonomie der Makrophagen des erfindungsgemäß hergestellten Glycoproteins, basierend auf den Ergebnissen der Bestimmung der abgestoßenen Zellen gegen die Konzentration der vorhandenen Substanz im peritonealen Hohlraum mittels eines Blutzählgerätes.

Das neue Glycoprotein der vorliegenden Erfindung kann allgemein dadurch gekennzeichnet und spezifiziert werden,daß

(1) es ein Molekulargewicht, bestimmt nach dem Ultrazentrifuge η verfahr en, zwischen 5000 und 300 000. aufweist;

(2) das Gewichtsverhältnis seines Proteinteiles, bestimmt nach dem Lowry-Polin-Verfahren, zum Saccharidteil, bestimmt nach dem Phenol-Schwefelsäure-Verfahren, von 50 : 50 bis

80 : 20 beträgt;

(3) die Aminosäure am U-Ende (Terminal) seines Proteinteiles im wesentlichen aus Tyrosin, Leucin oder Alanin besteht;

(4) die Aminosäuresequenz am C-Ende (Terminal) seines Proteinteiles in der Reihe Leucin zu Phenylalanin zu Valin ist;

(5) seine Elementzusammensetzung im wesentlichen 35,2 bis 49,3 % C, 4,8 bis 8,0 # H, 4,3 bis 12,3 # N, Spuren bis 2,5 % S, Spuren bis 1,2 # P und dem Rest an 0 besteht

(6) sein isoelektrischer Punkt zwischen pH 2,5 und 5,0 liegt und

(7) ITiikleinsäure als Komponente enthalten ist.

Das neue Glycoprotein der vorliegenden Erfindung (nachfolgend

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auch als "erfindungsgemäße Substanz" bezeichnet) wird nach dem folgenden Verfahren hergestellt:

Fruchtkörper, Myzelien oder künstlich kultivierte Myzelien eines basidiomycetischen Fungus, beispielsweise Coriolus versicolor (Fr.) Quel, Coriolus hirsutus (Fr.) Quel., Coriolus pargamenus (Fr.) Pat., Coriolus consors (Fr.) Quel und Coriolus sonchifer (Schw.) Pat. werden als Ausgangsgiaterial mit einem wäßrigen Lösungsmittel, wie heißem Wasser oder wäßriger 0,01 bis 2,0 N Alkalilösung bei einer Temperatur von 80 bis 100° C, 1 bis 8 Stunden lang extrahiert. Nach Entfernung des Extraktionsrestes wird der wäßrige Extrakt mit einer Säure neutralisiert und kondensiert. Nach dem Entsalzen des Kondensats wird es erforderlichenfalls einer Dialyse und/ oder Ultrazentrifugierung unterworfen, um die Substanz mit niederem Molekulargewicht, d.h. einem Molekulargewicht unter 5000 zu entfernen. Das auf diese Weise erhaltene Produkt wird kondensiert und erforderlichenfalls bis zu pulverförmiger Konsistenz getrocknet. Anschließend wird das Produkt oder die pulverförmige Substanz nach einem Verfahren der fraktionierten Fällung am isoelektrischen Punkt' bei pH 2,5 bis 5,0 behandelt. Dabei werden folgende Bedingungen eingehalten: pH-Wert 2,5 bis 5,0, Ionenstärke 0,1 bis 3,1M bei einer Temperatur von 5 bis 25° C des das Produkt enthaltenden Mediums Über mehr als 0,5 Stunden.

DarUberhinaus erhält man das künstlich kultivierte Myzelium, indem jeder der basidiomycetischen Fungi in einem Kulturmedium kultiviert wird, das auf diese Weise durch Proliferation erhaltene Myzelium auf dem Kulturmedium in Anwesenheit einer wäßrigen, physiologischen Salzlösung homogenisiert und das so homogenisierte Kulturmedium als Ausgangskultur in einem stationären Kulturmedium oder in einer Submerskultur inokuliert wird. Vom Standpunkt der Produktivität ist der Einsatz von künstlich kultivierten Myzelien vorzuziehen.

Aus Tabelle 1 sind die hinterlegten basidiomycetischen Fungi zu entnehmen, die beim erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt

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worden sind. Vom Standpunkt der Produktivität ist die Verwendung des hinterlegten Stammes CM-101 Coriolus versicolor (Pr.) Quel· ertragreich (IEBM-P 2412).

Die Eigenschaften der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Substanz, die diese näher charakterisieren und spezifizieren, werden nachfolgend beschrieben.

(1) Molekulargewicht 5000 bis 300 000

In der vorliegenden Erfindung wurde der Wert des Molekulargewichtes nach dem Verfahren des Ultrazentrifugierens bestimmt, eine Methode, die generell zur Bestimmung des Molekulargewichts von hochpolymeren Substanzen dient.

(2) Farbreaktion

Das Vorhandensein einer Proteinstruktur in der erfindungsgemäßen Substanz wurde durch die Blaufärbung bei der Lowry-Folin-Eeaktion bestätigt, sowie durch die purpurne Blaufärbung der Nlnhydrinreaktion beim Hydrolysat der erfindungsgemäßen Substanz mit Salzsäure.

Das Vorhandensein einer Saccharidstruktur in der Substanz wurde über die Purpurfärbung der o^-Naphtholsäurereaktion, die Braunfärbung der Indol-Schwefelsäurereaktion, die GrUnfärbung der Anthron-Schwefelsäure-Eeaktion, die Purpur-Braunfärbung der Tryptpphan-Schwefelsäure-Beaktion, die grünliche Braunfärbung sowohl der Thioglykolsäure-Schwefelsäure-Eeaktion als auch der Orcin-Salzsäure-Reaktion.

(3) Gewichtsverhältnis des Proteinteiles zum Saccharidteil 50 : 50 bis 80 ; 20

Die entsprechenden Gehalte des Proteinteiles und des Saccharidteiles der Substanz waren quantitativ über das lowry-Folin-Verfahren und das Phenol-Schwefelsäure-Verfahren bestimmbar. Das Gewichtsverhältnis beider Teile konnte aus de» Gehalten berechnet werden. Da weiterhin sowohl beim Sevagtest als auch fee beim Trifluormethantest keine Bildung von Niederschlägen beobachtet werden konnte, wurde bestätigt, daß Proteinteil und

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und Saocharidteil der Substanz chemisch aneinander gebunden sind·

(4) Art der Bindung zwischen Protein- und Saofcharidteil Hinsichtlich der Bindungsart zwischen dem Saccharidteil und dem Proteinteil der Substanz wurde angenommen, daß von den allgemein bekannten Bindungsarten zwischen Saccharid und Protein, wie beispielsweise der N-Acylglycosylamin-Typ, der C-Glycosid-Typ und der Glycosidester-Typ usw., in der erfindungsgemäßen Substanz der N-Acylglyeosylamin-Typ vorherrscht wegen der Schwierigkeit der Zerstörung der Bindung durch schwaches Alkali und der Bestätigung von Glucosamin bei der Aminosäureanalyse des Hydrolysates der erfindungsgemäßen Substanz·

(5) Zusammensetzung der Aminosäuren des Proteinteiles

Die Zusammensetzung dör Aminosäuren im Proteinteil der Substanz wurde durch übliche Verfahren bestimmt. Eine Übersicht gibt die Tabelle 2.

Wie aus Tabelle 2 hervorgeht, nimmt von diesen Aminosäuren die Gesamtsumme der Anteile von Asparaginsäure, Threonin, Serin, Glutaminsäure, Phenylalanin, Isoleucin, Glycin, Alanin, Valin und Leucin mehr als 75 Gew.-% aller Aminosäuren in Anspruch· ·

(6) Art der Aminosäure am Η-Ende des Proteinteiles und die Aminosäuresequenz am C-Ende des Proteinteiles

Die Arten der Aminosäuren am M-Ende des Proteinteiles der Substanz wurden Über bekannte Verfahren bestimmt, wobei die Aminogruppe dinitrophenyliert wurde und nach dem Hydrolysieren des Produktes mit einer Säure die so gebildetete Dinitro- ) phenylaminosäure Über Dünnschichtchromatografie und Sehne11-Plüssigchromatografie als Tyrosin, Leucin oder Alanin identifiziert wurde

Die Aminosäuresequenz am C-Ende des Proteinteiles der Substanz

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wurde über ein Verfahren bestimmt, bei dem Carboxypeptidase eingesetzt wurde und wo die nach Hydrolyse der erfindungsgemäßen Substanz mit Carboxypeptidase erhaltenen Aminosäuren durch Dünnschichtchromatografie analysiert wurden in der Reihenfolge leucin-Phenylalanin-Valin.

(7) Isoelektrischer Punkt der Substanz pH 2,5 bis 5,0

Um die physikalischen Besonderheiten des Proteinteiles der Substanz zu prüfen, wurde die erfindungsgemäße Substanz einer Elektrophorese unter Anwendung der Säulenampholinmethode unterworfen. Unter Berücksichtigung des isoelektrischen Punktes der Substanz bei pH 2,5 bis 5,0 wurde bestätigt, daß die erfindungsgemäße Substanz ein saurer, glycoproteinhaltiger Komplex ist. In diesem Zusammenhang wird auf die in Pig. 1 gezeigte Titrationskurve der Substanz verwiesen. Die Kurve ergibt sich aus der Titration einer wäßrigen 1 Gew.-%igen lösung der erfindungsgemäßen Substanz mit wäßriger 0,02 W Salz säure lösung und wäßriger 0,02 IT Schwefelsäurelösung.

(8) Konstitution des Saccharidteiles der Substanz

Die Konstitution des Saccharidteiles der Substanz wurde nach der üblichen Methode bestimmt, bei der das Hydrolysat der Substanz reduziert und anschließend acetyliert wurde und das erhaltene Produkt gaschromatografisch analysiert wurde. Die Ergebnisse sind aus Tabelle 3 zu entnehmen. Wie aus der Tabelle 3 hervorgeht, enthält der Saccharidteil der erfindungsgemäßen Substanz acht Arten von Monosacchariden und obgleich Glucose vorherrschend ist, sind Xylose und Mannose in relativ großer Menge vorhanden. Der Saccharidteil der erfindungsgemäßen Substanz ist somit ein Heteroglycan, gekennzeichnet dadurch, daß die Summe der Gewichtsprozente an Glucose, Mannose und Xylose mehr als 85 % in Anspruch'nimmt.

(9) Vorhandensein von iiukleinsäure als Komponente: Gehalt von 0,01 bis 0,50 Gew.-% Uracil als Base der Nukleinsäure

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Nach Umwandlung der organischen Phosphorkomponente der erfindungsgemäßen Substanz in anorganische Orthophosphorsäure durch Peuchtveraschung, wurde die Orthophosphorsäure nach dem Fiske-Subbarow-Verfahren bestimmt, und nachdem das SaIzsäure-Hydrolysat der erfindungsgemäßen Substanz einer Schnell-FlüssigchrEmatografie mit ultraviolettem Licht bei 254 mn unterworfen wurde, konnte die Anwesenheit von Uracil als Base der Nukleinsäure bestätigt werden. Die Bestätigung der Anwesenheit von Nukleinsäure in der erfindungsgemäßen Substanz erfolgte über UV-Absorptionsspektroskopie der Substanz, wobei Peaks bei 260 nm und 280 nm mit einem Extinktionskoeffizientenverhältnis von 0,75 bis 0,95 gefunden wurden.

Darliberhinaus erfolgte nach der Schmidt-Thannhauser-Schneider-Methode, die normalerweise für die Fraktionierung von Nukleinsäuren eingesefet wird, eine versuchsweise Fraktionierung der in der erfindungsgemäßen Substanz enthaltenen Nukleinsäure. Da jedoch keine Nukleinsäure fraktioniert werden konnte, wurde daraus geschlossen, daß die in der Substanz vorhandene Nukleinsäure in gebundenem Zustand vorliegt.

(10) Infrarot-Absorptionsspektrum - Bezugnahme auf Fig. 2-19

Die Infrarot-Absorptionsspektren der in den Beispielen 1 bis 18 erhaltenen entsprechenden Proben der erfindungsgemäßen Substanz sind in den Figuren 2 bis 19 dargestellt. In diesen Spektren mußte der breite Ab sorption speak bei 3600 bis 3200cm"* auf OH-Grupperi zurückzuführen sein, die als Wasserstoffbindung verschiedenen Grades vorliegen wegen des VerSchwindens oder der Verringerung ihrer Intensität nach O-Methylierung der OH-Gruppen in dem Sacchariäteil der erfindungsgemäßen Substanz. Der Absorptionspeak bei 1530 cm ist der Deformierungsschwingung der NH-Gruppe im Proteinteil der Substanz zuzuordnen, und der breite Absorptionspeak bei 120 bis 1000 cm"¹ müßte auf die asymmetrische Dehnungsschwingung der C-0-C-Bindung im Pyranosering des Saccharidteiles der Substanz zurückzuführen sein.

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(11) Aussehen und Löslichkeit in Lösungsmitteln .

Die erfindungsgemäß hergestellte Substanz ist ein pulverförmiges Material mit blaßbrauner bis brauner Farbe, geruch- und geschmacklos, löslich in Wasser, schwerlöslich in Methanol, Pyridin, Chloroform, Benzol und Hexan.

Die physiologischen Wirksamkeiten der erfindungsgemäßen Substanz werden nachfolgend dargestellt.

(1) Akute Toxizität: Akute Toxizität gegenüber life,us und Ratte Die akute Toxizität der Substanz wurde geprtiftJ'gegenüber ICR-ICL-Mäusen, 4 bis 5 Wochen alt, Körpergewicht 21 bis 24 g und gegenüber Donryu-Ratten, 4 bis 5 Wochen alt, Körpergewicht 100 bis 150 g, wobei die Verabreichung intravenös, subkutan, intrapercloneal oder oral erfolgte, die allgemeinen Symptome beobachtet wurden, die Mortalität und das Körpergewicht über 7 Tage nach Verabreichung aufgezeichnet und danach das Töten und die Autopsie erfolgte.

Die Ergebnisse sind aus Tabelle 4 zu entnehmen und zeigen, daß weder Ratte noch Maus nach der Verabreichung starben, selbst bei der höchsten verabreichten Menge der Substanz nicht, wodurch eine Berechnung der ^Bcq unmöglich wurde.

(2) Lectin-ähnliche Wirksamkeit

Die Substanzen mit einer sogenannten "Lectinwirksamkeit" wurden kürzlich in Pflanzensamen gefunden, und "Lectinwirksamkeit" einer aus einem basidiomycetischen Fungus hergestellten Substanz ist in der DD-PS 126 818 offenbart worden. Allerdings bezieht sich diese Patentschrift überhaupt nicht auf die Lectinwirksamkeit einer von dem basidiomycetischen Fungus der Gattung Coriolus abgeleiteten Substanz. Die in Pflanzensamen gefundene "Lectinwirksamkeit" zeigende Substanz, beispielsweise Concanavalin A aus dem Samen von Canavalia ensiformis und Erdnußlecitin aus dem Samen von Arachis hypogaea unterscheidet sich von der erfindungsgemäß hergestellten Substanz in der Struktur der Aminosäuren im Proteinteil sowie im Gewichtsverhältnis von Proteinteil zu Saccharidteil.

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Im Zusammenhang mit der jüngsten Erkenntnis über die Bedeutung der "Leetinwirksamkeit" in physiologisch wirksamen Mitteln, beispielsweise bei Antitumormitteln (.Anti-Krebspharmaka.) kann es als bedeutsam bezeichnet werden, daß die erfindungsgemäße Substanz die folgenden ^wLeetin-ähnlionen Wirksamkeiten" aufweist:

Das Folgende ist das Ergebnis der überprüfung spezifischer Erscheinungsformen der "Lectin-ähnlichen Wirksamkeit" der vorliegenden Substanz, insbesondere solcher, die für den Einsatz als physiologisch wirksames Mittel als wesentlich erscheinen.

1. Versuch zur Agglutinierungswirksamkeit bei Sarcom-180 Zellen

Aus den Ergebnissen des Tests mit der folgenden Verfahrensweise konnte bestätigt werden, daü die erfindungsgemäüe Substanz Sarcom-180 Zellen agglutiniert.

Versuchsablauf ·

Zellen von Sarcom-180 wurden intrapertoneal bei einer ICR-JL'L-Maus mit 1 χ 10 Zellen/Tier transplantiert, und am siebenten Tag der Transplantation wurde Aszites von der Maus abgenommen«,

Nachdem die zwei- bis fünffache Volumenmenge von Hank-Lösung zur Aszites hinzugegeben wurde, erfolgte das Zentrifugieren des Gemisches über 2 min bei 300 G, wobei die überschüssige Lösung verworfen wurde. Nach dem Sammeln des Niederschlages und nachdem dem Niederschlag Hank-Lösung hinzugesetzt worden war, wurde das Gemisch noch einmal 2 min bei 300 G zentrifugiert und die überschüssige Lösung verworfen. Der Niederschlag wurde gesammelt. Dann setzte man ihm Hank-Lösung zu zwecks Einstellung der Anzahl an proliferierten Zellen des Sarcom-180 in der erhaltenen Lösung auf 1 χ 10 /ml» Nach dem Einbringen von 0,5 ml ider so eingestellten Lösung mit den darin suspendierten Zellen sowie 0,5 ml wäßriger, physiologischer Kochsalzlösung, in der 3 mg der erfindungsgemäßen Substanz gelöst waren, in eine Kulturflasche und

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gutem Vermischen der Lösungen, ließ man das Gemisch eine Stunde Sei 37° C stehen. Dann wurde die überstehende Lösung verworfen und der in der Hauptsache aus Sarcom-180 Zellen bestehende Niederschlag einmal mit Hank-Lösung gewaschen. Ein Teil der so gewaschenen Zellen wurde zwecks Auszählung der Anzahl an agglutinierten Sarcom-180 Zellen mikroskopisch untersucht.

Als Kontrolle wurde der gleiche Versuch durchgeführt unter Verwendung von 0,5 ml wäßriger, physiologischer Lösung ohne die erfindungsgemäße Substanz.

Versuohsergebnis

Es wurde ein signifikanter Unterschied zwischen der Anzahl an agglutinierten Klumpen durch die erfindungsgemäße Substanz (120) gegenüber denen des Kontrollversuchs (20) festgestellt.

2. Versuch zur Inhibierung durch Monosaccharid der durch die erfindungsgemäße Substanz hervorgerufenen Agglutination von Sarcom—180 Zellen

Die gleichen Sarcom-180 Zellen, suspendiert in 0,5 ml Hank- , Lösung in einer Menge von 1 χ 10 Zellen pro ml wie in Versuch 1, sowie jeweils 0,5 ml der gleichen physiologischen Salzlösung mit 3 mg erfindungsgemäßer Substanz und 1,5 mg der entsprechenden Monosaccharide, die 30 min langbei 37° C inkubiert worden waren, wurden in eine Gewebskulturkammer gegeben und darin miteiander vermischt. Nach dem Stehenlassen des Gemisches für eine Stunde bei 37° C, dem Verwerfen des überstehenden Mediums und Waschen des Restes mit Hank-Lösung, wurde der verbliebene Rest unter dem Mikroskop untersucht, um die Anzahl der agglutinierten Klumpen der Zellen auszuzählen» -

Versuchsergebnis

Von den untersuchten Monosacchariden inhibierten L-Pucose und Methyl-o^ -mannosid die durch die erfindungsgemäße Substanz hervorgeworfene Agglutination von Sarcom-180 Zellen,

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wie dies aus der Tabelle 6 ersichtlich ist·

3. Versuch zur Inhibierung der Erythrocyten-Agglutination

Auf einer U-förmigen Mikroplatte mit 96 Vertiefungen wurden 25 Mikroliter eines verdünnten Anti-Human-A-Erythrozyten-Serums oder Anti-human-B-Erythrozyten-Serums mit dem 16-fachen Volumen an wäßriger, physiologischer Kochsalzlösung und 25 Mikroliter einer Lösung der erfindungsgemäßen Substanz in wäßriger physiologischer Kochsalzlösung gegeben. Nachdem das Gemisch über 30 min bei Zimmertemperatur zur Reaktion gebracht worden war, wurde 25 Mikroliter einer 4 Neigen Suspension menschlicher A-Erythrozyten oder menschlicher B-Erythrozyten in wäßriger physiologischer Kochsalzlösung dem Reaktionsgemisch zugegeben, u m sie 3 Stunden bei Zimmertemperatur miteinander reagieren zu lassen. Anschließend wurde die Mikroplatte unter dem Mikroskop untersucht, um den Stand der lirythrocytenagglut inat ion festzustellen. Als Ergebnis wurde eine Inhibirung von Blutart-spezifischer Erythrozytenagglutination mittels der erfindungsgemäßen Substanz festgestellt mit einer minimalen Inhibierungslconzen— trat ion von 0,48 rag/ml.

4. Versuch zur Blastumwandlung

a) Blastumwandlung von Human-Lymphozyten

Lymphozyten aus periplierem Blut eines gesunden erwachsenen Menschen wurden 5 Tage nach der Methode der Lymphozytenkultur kultiviert und das durch die Lymphozyten in den letzten 24 ICulturstunden aufgenommene "TI-Thymidin wurde gemessen. Die" Blastumwandlung wurde aus dem Gehalt des aufgenommenen H-Thymidins nach der unten genannten Methode bestimmt. Venöses Blut eines gesunden Erwachsenen wurde auf Picoll-Conray-Flüssigkeit geschichtet zwecks Trennung durch die spezifische Dichte, und die übereinanderliegenden Schichten wurden 30 min lang bei 400 G zentrifugiert. Man erhielt die Lymphozyten, die in eine RPMI-1640 Kulturmedium gegeben und mit 20 tigern frischen Human-AB-Serum bei einer Konzentration

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von 7,5 χ 10⁵ Zellen/ml versetzt wurden. In jede Vertiefung der Mikroplatte (Modell Microtest II, Falcon Comp.) wurden 0,2 ml der so hergestellten Lymphozytensuspension gegeben und dazu in jede Vertiefung wäßrige physiologische Kochsalzlösung mit der erfindungsgemäßen Substanz, um so zu einer Endkonzentration der erfindungsgemäßen Substanz von 0,1 mg/ml in jeder Vertiefung zu gelangen. Nachdem die Mikroplatte 4 Tage lang bei 37° C und atmosphärischer Luft mit 5 %> Kohlendioxid darin in einem Inkubator gehalten wurde, gab man in jede Vertiefung der Mikroplatte 0,05 Mikro-Ci ³H-Thymldin, und die Mikroplatte wurde weitere 24 Stunden unter den gleichen Bedingungen wie zuvor im Inkubator gehalten. Die derart behandelten Lymphozyten wurden dann gesammelt unter Verwendung eines Zellsammlers (Modell Mash II, Labo Science Co.) auf Glasfaser. Nach gutem Trocknen der Gä^sfaser wurde sie in eine Zählampulle gegeben und nach Zusatz von 3 ml Zählflüssigkeit (PCS) in jade Vertiefung, wurde die in den Lymphozyten aufgenommene Radioaktivität im Scintillationszähler unter Messung der Zählungen pro Minute (c.p.m) bestimmt.

Versuchsergebnisse

Die Ergebnisse der Versuche zeigten, daß die Wirkung der erfindungsgemäßen Verbindungen, Blastumwandlung hervorgerufen, 8000 bis 10000 c.p.m. der Aufnahme von ^H-Thyraidin durch Zusatz von 0,-Ί mg der erfindungsgemäßen Substanz pro ml entspricht, zu vergleichsweise 100 bis 2000 c.p.m. bei Aufnahme von ^H-Thymidin im Kontroliversuch (physiologische Kochsalzlösung ohne erfindungsgemäße Substanz). Somit liegt die Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Substanz signifikant über der Kontrolle beim Wert P<0,01.

b) Blastübertragung bei Guineaschwein-Lymphozyten

Milzlymphozyten des Guineaschweines (1x1O⁶ Zellen/ml) wurden zusammen mit der erfindungsgemäßen Substanz (50 Mikrogramm pro ml) 4 Tage lang bei 37° C unter atmosphärisches? Luft

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mit 5 ν» Kohlendioxid gehalten und nach dem Zusatz von 0,5 Mikro-Ci %-Thymidin wurde das Gemisch weitere 24 Stunden unter Bön gleichen Bedingungen wie vorher gehalten. Durch Bestimmung der %-Thymidinaufnähme wie bei a) wurde der Stimulierungsindex (S.I.) der erfindungsgemäßen Substanz nach der folgenden Gleichung berechnetS

c.p.m der Versuchsgruppe Stimulierungsindex (S.I) =

c.p.m der Kontrollgruppe .' 'ohne die erfindungsgemäße Substanz

Als Ergebnis wurde gefunden, daß der Stimulierungsindex der erfindungsgemäßen Substanz signifikant größer als 1 war, was darauf hindeutet, daß die erfindungsgemäße Substanz Blast-Ubertragende Wirksamkeit aufweist. Das oben gezeigte Phänomen der Blastübertragung durch die erfindungsgemäße Substanz ist ein notwendigerweise auftretendes Phänomen, wenn Lymphozyten durch ein Antigen stimuliert werden, in diejfunktioneilen Zellen, wie Antikörperproduzierende Zellen usw. zu differenzieren. Darüberhinaus wurde als Ergebnis der Blastumwandlung, beispielsweise als Ergebnis der Zellteilungsaktivität, die Zunahme der Zellen der Zellgruppe, die eine Reaktivität zum Antigen aufweist, verursacht (klonale Expansion). Ein Teil der vermehrten Zellen wurden erneuert zu Zellen im originalen Ruhezustand, und diese Ruhezellen stellen den Hauptteil des "immunologischen Effektas" in dem Falle dar, wo sie wiederum der Stimulierung desselben Antikörpers ausgesetzt waren, denen sie im Falle der ersten Stimulierung gegenüberstanden. Daher ist das Phänomen der Blastumwandlung eine Erscheinung mit sehr großer Bedeutung bei den Immunreaktionen. Insbesondere ist die Wirkung der Stimulierung von Blastumwandlung durch die erfindungsgemäßen Substanzen nicht spezifisch, d.h., nicht nur eine spezifische Zellgruppe, sondern auch eine Reihe weiterer Zellgruppen wird durch die erfindungsgemäße Substanz

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stimuliert. Vermutlich verursacht eine derartige Wirksamkeit den nichtspezifischen immun-aktivierenden Effekt un führt zur Verstärkung der Wirkresistenz gegen mikrobielle Infektion und Krebs. Tatsächlich ist bekannt geworden, daß die Wirkung der Verursachung von Blastumwandlung bei Immuntherapeutika wie BCG, OK-432 usw. gegen Krebs beobachtet wurde, die über eine nichtspezifische immunaktivierende Punktion wirkt. Als Ergebnis der überprüfung der Anti-Tumorwirksamkeit von oral verabreichtem Phytohämagglutinin, Concanavalin Λ, das alo ein repräsentatives Lectin bekannt ist, gegen Sarcom-180, wurden 30 bis bO % Anti-Tumorwirksamkeit bestätigt. Diese Entdeckung läßt auf die Verbindung von 31astübertragung horvorrufender Y/irkung und Anti—Tumörwirkung schließen.

5. Affinität der erfindungsgemäßen Substanz 'zur Lymphosytenoberfläche

Die spezifische 'Wirkung der erfindungsgemäßen Substanz, sich an die Lymphozyten zu binden, wurde durch folgendes experimentelles Ergebnis bestätigt, bei dem ein Lesegerät für Fluoreszenzaktivierte Zellen (PACS II; Beston-Dickinson Comp.) eingesetzt wurde.

Der Thymus einer C 57 BL/6-Mau wurde in einem Phosphatpuffer gut geöffnet, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten, die mit Tris-Salzsäure-Puffer behandelt wurde, der 0,83 Gew,-# gelöstes Ammoniumchiorid enthielt, um die Erythrozyten aus der Suspension zu entfernen und eine wäßrige Suspension von Thymozyten zu erhalten. Daneben wurde in 0,4 ml 5 Gew,-#iger Lösung der erfindungsgemäßen Substanz in Phosphatpuffer von pH 7,0 eine Menge von 0,6 mg Fluoreseein-iso-thiocyanat (PITC) gegeben und nach dem Rühren des Gemisches über Nacht bei 4° C wurde das Gemisch auf ein Dextran-Gel gegeben, um das nicht gebundene PITC von der erfindungsgemäßen Substanz (im Phosphatpuffer) markiert mit PITC zu gelangen.

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Nachdem 1x10⁷ Zellen C 57 BL/6-Mausthymozyten und 0,1 ml Phosphatpufferlösung mit der mit PITG markierten, erfindungsgemäßen Substanz bei 4° C Über 20 Minuten zur Reaktion gebracht worden waren,wurden die so umgesetzten Lymphozyten durch FACS (zit. ebenda) analysiert. Als Ergebnis wurde, entsprechend der beobachteten starken Fluoreszenz der Lymphozyten nach der Reaktion mit der FItC-markierten, erfindungsgemäßen Substanz, bestätigt, daß die erfindungsgemäße Substanz Lymphozyten bindet.

Weiterhin wurde noch bestätigt, daß ein immunsuppressiver Faktor, der von den Asciten einer ICR-ICL-Maus mit Ehrlichkarzinom gemäß der Methode von Motoki et al. erhalten wurde (Gann, Vol. 66(5), 569-572, 1975), die Lymphozyten bindet.

Wenn die erfindungsgemäße Substanz ohne FITC-Markierung mit dem Lymphozyten bei 4⁰C, über 20 Minuten zur Reaktion gebracht wurde, und das Reaktionsgemisch später mit dem oben genannten FITC-markierten immunsuppressiven Faktor umgesetzt würde, war die Fluoreszenzstärke der auf diese Weise umgesetzten Lymphozyten schwächer als die der Lymphozyten, mit denen die erfindungsgemäße Substanz nicht umgesetzt wurde. Aus diesen Ergebnissen ist ersichtlich, daß die erfindungsgemäße Substanz die Bindung des immunsuppressiven Faktors an Lymphozyten inhibiert. Die Tatsache, daß die erfindungsgemäße Substanz sich an Lymphozyten bindet, wurde auch durch elektronenmikrospkopische Untersuchung wie folgt bestätigt.

Nachdem 25 mg der erfindungsgämäßen Substanz mit 25 mg Ferritin umgesetzt wurden, brachte man das Reaktionsprodukt mit Thymocyten einer C 57 BL/6-Maus in vitro zur Reaktion.

In dem Fall, wo man nur Ferritin mit Thymocyten umsetzte, wurde Ferritin nicht an die Oberfläche der Thymozyten gebunden. In dem Falle, wo die erfindungsgemäße Substanz mit Ferritin umgesetzt worden war, konnte eine Bindung der erfindungsgemäßen Substanz an die Oberfläche der Thymozyten unter dem Rasterelektronenmikroskop beobachtet werden.

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Unter Berücksichtigung dessen korrespondiert eine derartige Bindung der erfindungsgemäßen Substanz an die Thymozyten mit dem Anti-Tumoreffekt„und der Immunreaktion der erfindungsgemäßen Substanz gemäß der folgenden Überlegung: Wenn eine Anti-Tumorsubstanz Lymphozyten zur Blastübertragung stimuliert, ist die Bindung der Substanz an Lymphozyten als erste Stufe der Blastübertragung einzuschätzen, allerdings nicht nur als Mechanismus, bei dem der Anti-Tumoreffekt der Substanz gezeigt wird über die Aktivierung der Lymphpzyten, sondern auch als ein anderer Mechanismus, bei dem die Substanz die Bindung eines Grundstoffes hemmt, der die Aktivierung von Lymphozyten zu Lymphozyten inhibiert.

Wie bereits vorher ausgeführt, ist die Gegenwart eines immunsuppressiven Faktors im Asziten von Krebs—befallenen Individuen bekannt, beispielsweise von ICR-JCL-Mäusen mit Ehrlich-Krebs, und es wurde gefunden, daß die erfindungsgemäße Substanz die die Bindung dieses immunsuppressiven Paktors an Lymphozyten inhibiert und damit dazu führt, daß die Hemmung der Lymphοzytenfunktion durch den immunsuppressiven Faktor aufgegeben wird.

Ks wird daher eingeschätzt, daß die erfindungsgemäße Substanz einerseits die Lymphozyten direkt aktiviert, und andererseits die Bindung des immunsuppressiven Faktors an die Lymphozyten inhibiert, woraus der Anti-Tumoreffekt und der die Anti-Infektionswirkung zu entnehmen ist.

6. Über Chemotaxonomie von Makrophagen zur erfindungsgemäßen Substanz

Jeder Gruppe von weiblichen C 57 BL/6-Mäusen wurden 1 ml pro Tier wäßriger physiologischer Kochsalzlösung mit jeweils 0,03; 0,1; 1,0 oder 10 mg an erfindungsgemäßer Substanz pro ml gegeben. Die Verabreichung erfolgte intraperitoneal. Eine Konjtrollgruppe erhielt nur 1 ml wäßrige physiologische

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Kochsalzlösung. 48 Stunden nach der Verabreichung wurden alle Mäuse unter Ethernarkose zur Ader gelassen, und es wurden 4 ml Hank-Lösung mit Heparin intraperitoneal jeder Maus injiziert. Nachdem die abdominale Höhle der Maus gut massiert wurden war, wurde die injizierte Lösung mit einer Komagom-Pipette gesammelt, und die abgesonderten Zellen der Makrophagen in der gesammelten Lösung wurden mittels eines Hämozytometers (Blutzellenzählgerät) gezählt. Das Zählergebnis ist in Pig. 20 dargestellt, wobei die Anzahl der abgesonderten Makrophagen-Zellen auf der Ordinate und die Konze»- tration der erfindungsgemäßen Substanz auf der Abszisse aufgetragen ist. Wie aus Fig. 20 ersichtlich, weisen die Makrophagenzellen eine ansteigende Tendenz mit dem Konzentrationsanstieg der erfindungsgemäßen Substanz auf. Diese Erscheinung ist darauf zurückzuführen, daß die erfindungsgemäße Substanz eine bemerkenswerte Aktivität auf die Chemo— taxonomie der Makrophagen ausübt.

Es ist bekannt, daß Makrophagen zur Wiiferesistenz gegen Krebs und Infektionen beitragen durch die den Makrophagen eigene Phagozytose und Antikörper-abhängige zytotoxische Punktion, und daß der Makrophage eng mit dem sogenannten Immunsystem verbunden ist, mit dem Ergebnis äer Antigen-Dars-tellung und Einstellung der Imraunreaktion· Darüberhinaus wurde die Punktion des Makrophagen in dem durch die erfindungsgemäße Substanz stimulierten Makrophagen verstärkt, was bereits weiter vorher gezeigt werden konnte. Da die erhöhte Chemotaxonomie ein Index der Aktivierung des Makrophagen ist, ist daraus zu schließen, daß die erfindungsgemäße Substanz die Wirtsresistenz durch den Makrophagen über die Aktivierung des Makrophagen erhöht.

(3) Anti-Tumorwirkung der erfindungsgemäßen Substanz

(a) Anti-Tumorwirkung bei festem Sarcom-180 Tumor

Durch Übliche Methoden vermehrte Sarcom-180 Zellen wurden in die Abdominalhöhle von vier Gruppen ICR-JCL-Mäusen in

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einer Anzahl von 1x1O⁶ Zellen/Tier transplantiert. 24 Stunden nach der Transplantation wurde jeder Maus in jeder der drei Gruppen die erfindungsgemäße Substanz intraperitoneal einmal jeden zweiten Tag verabreicht, insgesamt zehnmal mit der entsprechenden Dosierung von 1, 10 und 100 mg/kg pro Mal. 25 Tage nach der Transplantation wurden alle in den Mäusen aufgetretenen Tumore ausgeschnitten, und das Durchschnittsgewicht der Tumore jeder mit der erfindurigsgemäßen Substanz behandelten Gruppe (T) mit dem Durchschnittsgewicht der Tumore der vierten Gruppe Mäuse (C) verglichen, die nicht mit der erfindungsgemäßen Substanz behandelt worden waren. Die entsprechend der folgenden Formel ermittelten Ergebnisse wurden durch den Tumor-Inhibierungsgrad ausgedrückt.

Tumor-Inhibierungsgrad (#) » (1 - _ ) χ 100,

C . !

Weiterhin wurde in einem anderen Versuch die erfindurigsgemäße Substanz oral anstatt intraperitoneal den zwei Gruppen Tumortransplantierten Mäusen verabreicht. Die Dosis betrug 50, und 250 mg/kg/Mal entsprechend, und die Tumorinhibierung wurde in gleicher Weise wie zuvor untersucht.

(b) Anti-Tumoraktivität gegenüber iihrlich-Aszitestumor Nach Inkubation von 1x10 Zellen Ehrlich-Aszitestumor (weiterhin als fiC-Zellen bezeichnet) in Hank-iösung mit jeweils 5 mg der erfindungsgemäßen Substanz über 3 Stunden bei 37° C, wurden die so inkubierten Zellen in die Abdominalhöhle von ICfi-JCL-Mäusen (10 Tiere pro Gruppe) mit 1 χ 10⁶Zällen pro Tier transplantiert. Die Mortalität der behandelten Mäuse wurde über 20 Tage nach der Transplantation beobachtet, um die Überlebensrate der Mäuse und die Anti-Tumorwirksamkeit der erfindungsgemäßen Substanz festzustellen, die mit 50 mg/kg wie vorher verabreicht wurde. Das Körpergewicht der Mäuse lag im Durchschnitt bei 20 g. Alle Mäuse der Kontrollgruppe, denen zwar die Tumorzellen transplantiert wurden, nicht jedoch die

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erfindungsgemäße Substanz verabreicht worden war, starben innerhalb der 20 !Tage nach Transplantation an den Polgen des Tumors.

Die Ergebnisse der Versuche a) und b) bestätigen die ausgezeichnete Anti-Tumorwirksamkeit der erfindungsgemäßen Substanz, was aus Tabelle 5 hervorgeht.

Da die erfindungsgemäße Substanz eine ausgezeichnete Anti-Tumorwirksamkeit zeigt, ist sie als Anti-Tumormittel einsetzbar, insbesondere als oral zu verabreichendes Anti-Tumormittel. DarUberhinaus hat die erfindungsgemäße Substanz, da sie Lectinähnllcjie, physiologische Wirksamkeit aufweist, eine immunmodulierende Wirksamkeit gegenüber dem Wirt, und nicht nur bei krebsbefallenen Patienten, sondern bei allen Patienten zeigt sie hervorstechende Wirksamkeit bei der Aktivierung der Immunität und bei der Verhütung von Infektionskrankheiten durch Viren und Bakterien.

Obgleich die erfindungsgemäße Substanz den Patienten gewöhnlich in pulverförmigem Zustand oral verabreicht wird, entsprechend dem Zustand des Patienten, kann sie auch als Injektion intraperitoneal gegeben werden. Die orale Dosis der Substanz liegt üblicherweise bei 1 bis 100 mg/kg Körpergewicht/ Tag, wodurch ein ausgezeichneter Tumorinhibierungseffekt bei sehr geringer, verabreichter Dosis erreicht wird im Vergleich zu der eingangs erwähnten Glycoproteinsubstanz oder dem aus einem basidiomycetischen Fungus hergestellten Polysaccharid.

Die Erfindung wird unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele näher erläutert·

Die Erfindung wird jedoch nicht auf die genannten Beispiele beschränkt. Aus der bisherigen Beschreibung kann der Fachmann leicht das Wesentliche und Charakteristische dieser Erfindung entnehmen und ohne den Schutzumfang zu verlassen, verschiedene Varianten und #nderungen vornehmen, um sie den unterschiedlichen Bedingungen und Verwendungszwecken anzupassen,

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Beispiel 1

Herstellung der erfindungsgemäßen Substanz

Ein Stamm CM-101 von Coriolus versicolor (Pr.) Quel. /FERM-P 2412, ATCC 20547_7 wurde in einem Kulturmedium, das 5 Gew.-# Glucose, 0,2 Gew.-* Pepton, 0,3 Gew.-^ Hefe-Extrakt, 0,1 Gew.-* KG₂PO. und 0,1 Gew.-* MgSO^. 7H₃O enthält, 10 Tage kultiviert. Bas auf der Oberfläche des Kulturmediums ausgebildete Myzel wurde mit einer wäßrigen physiologischen Kochsalzlösung homogenisiert und stelle die Impfkultur zur Bebrütung dar. Die Impfkultur wurde in je 200 ml des gleichen Kulturmediums wie oben in 100 Kulturflaschen von 1 Liter Inhalt inokuliert und 25 Tage bei 25 bis 27° C, kultiviert. Man erhielt das vermehrte Myzel mit einer Ausbeute von 2,0 bis 4,5 g pro Kulturflasche.

100 g des so erhaltenen Mycels wurden mit 3 1 wäßriger 0,1 N Natriumhydroxidlösung bei 97° C eine Stunde extrahiert, und nach der Entfernung des Extraktionsrestes wurde der so erhaltene Extrakt mit Säure neutralisiert und kondensiert. Anschließend wurde das Kondensat durch Dialyse und Ultrafiltration behandelt, um die Substanzen mit niederem Molekulargewicht, d.h· mit Molekulargewichten unter 5000 zu entfernen. Vor der Dialyse und Ultrafiltration erfolgte eine Entsalzung. Die so behandelten Kondensate, aus denen die Substanzen mit niederem Molekulargewicht entfernt worden waren (bzw. die pulverförmige Substanz, erhalten durch Trocknen der Kondensate), wurde mit einem Phosphatpuffer vermischt, um den pH-Wert des Gemisches auf 3,5 zu halten. Nach dem Neutralisieren der überstehenden Lösung, die durch Zentrifugieren* des Gemisches erhalten wurde, unterwarf man das neutralisierte Überstehende einer Ultrafiltration unter 1,5 kg/cm Druck und bei einer Temperatur von 10° C unter Rühren und Kühlen in einem Ultrafiltrationsgerät (Modell Highflow. - 2000 mit DM-5 Diaphragma), wodurch die Salze im Überstehenden entfernt wurden. Nach dem Kondensieren des entsalzten Überstehenden wurde dem Kondensat ein Phosphatpuffer hinzugesetzt, um das erhaltene Gemisch auf

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pH 3 einzustellen. Dann wurde das Gemisch zentrifugiert, um den Niederschlag zu sammeln·

Die oben genannte Reihe von Verfahrensschritten, durch die der gefällte Niederschlag der Fraktionen bei einem stabilen pH-Wert von 3,5, einer Ionenstärke von 0,30/ύ , einer Temperatur von 5° C über 2 Stunden abgetrennt worden war, und allein dieser Niederschlag aus der verbliebenen Lösung nach Aufrechterhaltung des pH-Wertes von 3>0 unter den gleichen Bedingungen gesammelt wurde, stellt ein Praktionierverfahren durch Fällung am isoelektrischen Punkt im Bereich von 3>0 bis 3,5 dar.;

Der auf diese Weise erhaltene Niederschlag wurde in Wasser wieder aufgelöst, der pH-Wert der erhaltenen Lösung auf 7 eingestellt, durch die bereits genannte, gleiche Entsalzungsmethode entsalzen, um die Lösung zu reinigen, und schließlich getrocknet, um die erfindungsgemäße Substanz in pulverförmigem Zustand zu erhalten«

Aus der Tabelle 5 sind Molekulargewicht, elementaranalytische Ergebnisse, Parbreaktionen der Zucker und Proteine, spezifi- , scher Drehwert, Infrarot-Absorptionsspektrum, Ergebnisse der AminoSäureanalyse, analytische Daten der Aminosäuren, entsprechende Zuckerkomponenten an dem N-Ende und C—Ende des Saccharidteiles, entsprechende Gehalte des Protein- und Zuckerteiles, Ultraviolett-Absorptionsspektrum entsprechende Gehalte an Uracil und organischem Phosphor, die beide die Anwesenheit von Nukleinsäure anzeigen, sowie spezifische physiologische Eigenschaften der erfindungsgemäßen Substanz zu entnehmen, die durch die Erfinder ermittelt wurden· In der Tabelle bedeutet ⁿtⁿ β Spuren. Die Methoden zur Bestimmung der oben konkret genannten Eigenschaften der erfindungsgemäßen Substanz waren folgende:

Molekulargewicht; _;

Nach Herstellung einer 0,3 Gew,-#igen Lösung der erfindungsgemäßen Substanz durch Lösen in einer wäßrigen 0,1 M

237287 2 ... """'

Kaliumchloridlösung wurde die Absetzgeschwindigkeit der erfindungsgemäßen Substanz bei 25° C über 5 Stunden bei einer Flüssigkeit ssäulenhöhe von 1,7 mm in der Ultrazentrifuge bei 22000 U/min bestimmt. Das Molekulargewicht der erindungsgemäßen Substanz erhielt man durch Übliche Berechnung nach dem Ultrazentrifugenverfahren zur Bestimmung des Molekulargewichtes.

Spezifischer Drehwert

Es wurde der spezifische Drehwert einer wäßrigen 0,1 Gew.-* #igen Lösung der erfindungsgemäßen Substanz zur D-Linie des Natriums (589 mn) in einem 5 cm langen Gefäß bestimmt. Nach Berechnung erhielt man den spezifischen Drehwert der erfindungsgemäßen Substanz. '

Aminosäureanalyse

Als Untersuchungsgegenstand wurden 10 mg der erfindungsgemäßen Substanz in einem Glasrlihrchen plaziert· !fach Zusatz von 4 ml 6 If Salzsäure und Einfrieren des Inhalts mit einem Azeton-Trockeneis-Gemisch wurde das Eöhrchen unter vermindertem Druck verschlossen und anschließend 24 Stunden bei 110° C zwecks Hydrolysieren der Substanz erhitzt. Nach dem Sammeln und Trocknen des Reaktionsproduktes wurde der getrocknete Stoff in 30 bis 40 ml Zitratpuffer von pH 2,2 gelöst und die Lösung in ein Gerät zur Aminosäureanalyse zwecks Erhalt der Daten gegeben.

Analytische Daten über die Aminosäure am N-Ende

Unter Einsatz einer Probe von 7 mg erfindungsgemäßer Substanz wurden die analytischen Daten über die Aminosäure am N-Ende mittels des DNP (Dinitrofluorbenzol)-Verfahrens mit Trimethylamiit wie folgt bestimmt:

Naoh dem Lösen der Untersuchungsmenge von 7 mg in 0,7 ml Wasser wurden 0,14 ml wäßriger 5 Gew.-#iger Trimethylaminlösung und 0,7 ml 5 Gew,-#iger ethanolischer Dinitrofluorbenzol-Lösung hinzugesetzt und die Lösung 3 Stunden bei 28° C im Dunkeln

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gerührt. Nach Zugabe einiger Tropfen Wasser und einer geringen Menge wäßriger Trimethylaminlösung zu dem Gemisch und viermaligem Waschen des Gemisches mit Diethylether gab man einige Tropfen konzentrierte Salzsäure zur wäßrigen Schicht hinzu. Nach weiterem dreimaligen Waschen der wäßrigen, sauren Schicht mit Ether wurde die Azidität der wäßrigen Schicht auf die von 6 Ii Salzsäure eingestellt und 20 Stunden bei 110° C erhitzt, um eine Hydrolyse zu bewirken. Dem auf diese Weise erhaltenen Hydrolysat wurde Wasser zugesetzt, um die Azidität auf die von 1 Ii Salzsäure einzustellen. Anschließend wurde das Gemisch dreimal mit Diethylether extrahiert, die etherische Schicht getrocknet und mittels Sehne 111-Flüssigchromat ograf ie (mit einer Zorbax ODS-Säule von 4,6 mm Durchmesser und 250 mm Länge) untersucht unter Bluierung mit Acetonitril-Natriumdihydrogenphosphat bei UV-Licht von 254 nm.

Analyse der Aminosäure am C-Bnde ^;

In eine Lösung, die man durch Lösen von 250 mg erfindungsgemäßer Substanz als Untersuchungsprobe in 9,46 ml 0,0025 Tris-Puffer erhielt, wurden 0,54 ml wäßrige Lösung von 0,3 Einheiten Carboxypeptidase-DIT zur Erreichung des Gesamtvolumens der Mischung von 10 ml gegeben. Während der Erwärmung des so erhaltenen Gemisches auf eine konstante Temperatur von 30° C, wurden jeweils 1 ml der entsprechenden Untersuchungsprobe zu jedem vorherbestimmten Intervall fraktioniert gesammelt. Zu jeder Probe wurden 1,5 ml wäßrige 50 Gew.-#ige Salzsäurelösung hinzugesetzt, um die enzymatisch^ Heaktion bei pH 2 zu beenden. Der abgesetzte niederschlag wurde durch Zentrifugieren abgetrennt· Das resultierende Überstehende wurde gesammelt, getrocknet und in einem Puffer von pH 2,2 gelöst und dann zwecks Bestimmung der freien Aminosäure in einen automatischen Aminosäureanalysator gegeben.

Analyse der Zuokerkomponenten des Saocharidteiles

In einer Glasampulle wurden 10 mg erfindungsgemäße Substanz als Untersuchsngsprobe gegeben, dann 1,0 ml wäßrige 1N

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Schwefelsäurelösung dazugegeben und das Gemisch bei 100 C 16 Stunden lang erhitzt, um die Hydrolyse zu bewirken. Nach Neutralisation des Hydrolats bei Zimmertemperatur mit Bariumkarbonat und Abtrennung des abgesetzten Niederschlages durch Filtration, wurde da# Filkrat durch Zugabe von Natriumborhydrid reduziert und das erhaltene Produkt Über ein Ionenaustauschharz entsalzt. Im Anschluß an das Kondensieren der entsalzten Lösung bis zur Trockne und Entfernen der restlichen Borkomponente unter vermindertem Druck mit Methanol durch azeotrope Destillation, wurde der Rest bis zum Erhalt eines Peststoffes getrocknet. Der erhaltene Feststoff wurde in Pyridin gelöst und dann mit Essigsäureanhydrid bei 100° C acetyliert. Das so erhaltene Reaktionsgemisch wurde unter mindertem Druck gehalten, um das im Reaktionsgemisch der acetylierten Produkte verbliebene Reagens zu entfernen. Darech wurde der Rest in Kohlenstofftetrachlorid einer Gaschromatografie unterworfen, um die acetylierten Zucker fraktioniert zu erhalten.

Bestimmung von Uracil als Base der NukIeinsäure

Nach Hydrolyse der erfindungsgemäßen Substanz mit Salzsäure, wurde das Hydrolysat einer Sehne11-FlUssigchromatografie mit einer Solvacks-CN Säule unter Benutzung von wäßriger 6 Gew.-VÜger Essigsäure als bewegliche Phase unterworfen und das Eluat mit UV-Licht.von 254 nm untersucht, um den Peak von Uracil festzustellen.

Quantitative Bestimmung von organischem Phosphor zweck Bestätigung; der Anwesenheit von Nukleinsäure in der ..erfindungs^e*» mäßen Substanz

Nach Zersetzung der Organophosphorkomponenten der erfindungsgemäßen Substanz in anorganische Orthophosphorsäure mittels der Naßveraschungsmethode, wurde die resultierende Phosphorsäure quantitativ bestimmt. 2 ml wäßriger Lösung, enthaltend 20 mg erfindungsgemäßer Substanz und 2 ml wäßriger 5 N

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Schwefelsäure, wurden in einem Kieldahl-Kolben erhitzt bis der Inhalt braun wurde. Nach dem Abkühlen wurden dem Kolbeninhalt ein bis zwei Tropfen wäßriger 30 Gew.-'&iger Wasserstoffperoxidlösung hinzugesetzt und der Kolben nochmals erhitzt, bis der Kolbeninhalt farblos wurde. Nach Abkühlung des Kolbens wurde 1 ml destilliertes Wasser dem Kolbeninhalt zugegeben und nach weiterer Erwärmung des Kolbens für 5 Minuten in einem Heißwasserbad und Einstellen des Volumeninhaltes des Kolbens auf einen vorherbestimmten Wert, wurde ein Teil des Kolbeninhaltes dazu verwendet, nach den Fiske**Subbrow-Verfahren die Menge an Orthophosphorsäure in der zersetzen Untersuchungsprobe der erfindungsgemäßen Substanz zu bestimmen.

Beispiele 2 bis 18

Anstelle des Stammes CM-101 Coriolus versicolor (Fr)Quel. (PEBM-P 2412, ATCC 20547) wurden die entsprechenden Stämme der in Tabelle 1 aufgeführten Fungi als Ausgangsmaterial zur Erhaltung der erfindungsgemäßön Substanz eingesetzt mittels der gleichen Verfahrensschritte wie im Beispiel 1, ausgenommen die Fraktionierung durch Fällung an einem isoelektrischen Punkt in dem in Tabelle 5 aufgefühxten Bereich, der anders als pH 3,0 bis 3,5 ist. Die Eigenschaften der so

erhaltenen Substanzen der vorliegenden Erfindung in den Beispielen 2 bis 18 wurden durch die gleichen Verfahren be stimmt und sind in Tabelle 5 genannt. In der Tabelle 5 bedeutet "t" = Spuren.

Darüberhinaus zeigte jede der in den Beispielen 1 bis 18 erhaltenen Substanzen die folgenden entsprechenden Färb-

reaKtionen des Saccharide und des Proteins:

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- 28 -

O) Farbreaktion des Saccharide

Ok-Naphthol-Schwefelsäurereaktion Indol - Schwefelsäurereaküon Anthron - Schwefelsäurereaktion Phenol - Schwefelsäurereaktion Tryptophan - Schwefelsaurereaktion

Thioglykolsäure-SchwefelSäurereaktion Orcinol - Salzsäurereaktion Farbe

purpur braun grünlich-blau braun

purpurfarben braun grünlich-braun grünlich-braun

(2) Farbreaktion des Proteins

Lowry - Polin — Reaktion Ninhydrinreaktion des Hydrolysates der erfindungsgemäßen Substanz durch Salzsäure

blau

purpurfarben blau

Nach der Infrarot-Absorptionsspektroskopie zeigte jede der

erfindungsgemäßen Substanzen Absorptionsmaxima im Bereich vnn 3600 bis 3200 cm"¹ und 1200 bis 1000 cm""¹ und bei 1600 und

cm'

-1

Art

Coriolus versicolor (Fr.J Coriolus versicolor (Fr.) Goriolus versicolor (Fr.) Coriolus versicolor (Fr.) Coriolus versicolor (Fr.) Coriolus versicolor (Fr.) Coriolus versicolor (Fr.) Coriolus versicolor (Fr.) Coriolus versicolor (Fr.) Boriolus versicolor (Fr.) Coriolus versicolor (Fr.) Coriolus versicolor (Fr.) Coriolus versicolor (Fr.) Coriolus versicolor (Fr.) Coriolus versicolor (Fr.) Coriolus hirsutus (Fr.) Coriolus pargemenus (Fr.) Coriolus versicolor (Fr.) Coriolus consors (Berk.)

	Tabelle 1
	Stamm
Quel.	CM-101
QuSl	CM-102
Quel	CM-103
Quel	CM-104
Quel.	CM-105
Quel.	CM-106
QuIl.	CM-107
Quel.	CM-108
Quol.	CM-109
Quel.	CM-11.0
Quel.	CM-111
Quel.	CM-112
Quel.	CM-113
Quol.	CM-114
Quol.	CM-115
Quel.	CM-15.1
Pat.	CM-161
Quel.	GX-101-3
Imaz.	CM-I66

Hinterlegungs-nummer des Stammes

FEM-P 2412 (.ATCC 20547;

FERM-P 2413 (ATCC 20548)

FEE-M-P 2414- (ATCC 20545)

FEHM-P 2425 (ATCC 2) 549)

FEPIi-P 2416 (ATCC 20550)

FERM-P 2417 (ATCC 20551)

F.3EM-P 2418 (ATCC 20552)

FSBM-P 2419 (ATCC 20553)

PBEM-P 2420 (ATCC 20554)

FEM-P 2421 (ATCC 20555)

PEEM-P 2422 (ATCC 20556)

FEM-P 2423 (ATCC 20557)

FEEM-P 2424 (ATCC 20558)

FEBIVI-P 2425 (ATCC 20559)

FEM-P 2426 (ATCC 20560)

FEEEi-P 2711 (ATCC 20561)

FEEHi-P 2712 (ATCC 20 562) FjSBM-P 3686 (ATCC'20564)

PBHM-P 988 (ATCC 20565)

-UJ

FEEId: Fermentation Eesearcn Institute, Agency of IndiEfcriäl Science and Technology (Japan) ATCC: American Type Culture Collection (U.S.A.)

237 287 2 ^6O39912

Tabelle 2 Aminosäure Gehalt in Gewients-

Asparaginsäure Threonin Serin

Glutaminsäure Prolin Glycin Alanin Cyotin V al in Methionin Cyctathionin Isoleucin Leucin Tyrosin Phenylalanin Tryptophan Ornithin Lysin ' Histidin Arginin (Amaoniak) (1 bi·.? 7)

10	bis	bis	20
4	bis	bis	6
3	bis	bis	β
10	bis	bis	16
Spuren	bis	bis	8
6	bis	bis	10
6	bis	bis	13
Spuren	bis
c;	bis	1?
Spuren	b i ΰ
Spuren	bis	3
3	bir	8
8	13
Spuren	5
3	9
Spuren	1
Spuren	2
1	]
Spuren	O
1	; t·

237287 2

?99

!1 -

Tabelle

(Mono) Saccharic!	Akute Toxizität	Ge wicht s-iiö
!''ucose	Verabrei- LD	0.5 bis 4.0
Liibose	chungsart	Spuren bis 2.0
Arabinose	i.v.	0.3 bis 6.0
Xylose	S.C.	2.0 bis 40.0
Mannose	i.p.	5.0 bis 20.0
Galactose	p.o.	0.5 bis 8.0
Glucose	i.v.	30.Obis' 80.0
	S.C.	Spuren bis 3.0
	i.p.	bei Maus und Hatte
	p.o.	5Q (ftig/kg Körpergewicht) weiblich männlich
	>1300 >1300
	>5000 75000
	>5000 ^5000
	> 20000 ^20000
Glucosamine	> 600 -j 600
Tabelle 4:	>5000 > 5000
Tierart	y 5000 7 5000
	y 20000 >20000
Maus
Ratte

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Tabelle 6

Versuchsergebnis zur Inhibierungsfunktion des Monosaccharids zur Agglutination von Sarcom-380 Zellen der erfindungsgemäßen Substanz

Srfindungsgemäße Substanz mit dem Monosaccharid:	Anzahl der agglutinierten Klumpen	Inhibierungswir- lcung bei Agglu tination
L - Fucose	27	+
D - Galactose	118	-
Methyl - Ά -glucose	115	-
Methyl - c6 -mannosid	35	+
N-Acetylglucosamine c	85	+
L - Rhamnose	25	+
erfindungsgeraäße Substanz allein	124
Kontrollversuch	18

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Tabelle 5 (Fortsetzung)

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Saccha- ridkom- ponente und derer Gehalt	Riböse	1.1	3.9	2.1	0.6	1.8	2.3	2.7	2.6	2.9
(Gew.-*)	Arab inose	1.0	t	t	1.8	1.5	0.8	t	0.9	1.6
	XyloseO)	5.3	1.9	2o3	0.3	0.5	2.6	0.9	4.7	1.5
	Mae»Dse(2)	13.5	34.9	19.5	23.8	23.5	31.0	30.0	32.4	22.6
I	Galaktose	10.6	13.2	17.0	16.3	11.3	12.4	13.9	13.6	15.1
	Glukose (3)	2.0	4.1	6.2	3.5	3.1	2.9	2.8	2.0	2.6
CSI	Glukose- amin	66.5	42.0	52.9	53.7	58.3	48.0	49.7	43.6	53.7
Summe von O)- (2) und (3)	t	t	t	t	t	t	t	0.2	t
90.6	90.1	89.4	93.8	93.1	91.4	93.6	89.6	91.4

60 399

Tabelle 5 (Fortsetzung)

\ Beispiel Daten\. Nr.	Fucose	10	11	1	2	1	3	1	4	1	VJl	16	V	18
Sa c charId- komponente und deren Gehalt	Riböse	2.0	1.2	2	.8	2	.0	2	.7	1	.8	3.6	28	1.5
	Arab inose	1.1	t		t	1	.3	1	.0	1	.2	t	1.0	1.3
	XyloseO)	0.8	0.5	1	.9	3	.4	0	.6	0	.4	1.8	1.6	1.9
I	Maisipse(2)	20.2	19.8	21	.7	31	.6	28	.3	22	.5	18.2	19.3	16.5
t	Galalrfcooe	14.1	12.3	11	.4	10	.9	12	.5	U	.0	13*5	11.5	15.0
CsJ	Glukose	2.4	5.3	4	.1	3			.0	2	,5	2.6	2.7	4,0
OO	Glulcos- amin	59.6	61.4	58	.1	46	.3	5 ?	.1	57		61.3	61.0	6o. a
Summe von (D, (2) und (3)	t	' t		t	1	.0	t			t	t	t	t
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Claims (5)

237287 2 -« 6°3"" Erfindungsanspruch

1. Verfahren zur Herstellung eines Glycoproteins, gekennzeichnet dadurch, daß man Fruchtkörper, Mycelien oder kultivierte Mycelien eines basidiomycetischen Fungus der Gattung Coriolus mit heißem <Vasser oder einer wäßrigen 0,01 bis 2,0 N alkalischen Lösung extrahiert; den erhaltenen Extrakt einer Dialyse und/oder Ultrafiltration zur Entfernung von Produkten mit geringem Molekulargewicht unterwirft, wobei dies Molekulargewichte von unter 5000 sind; die erhaltene Substanz durch fraktionierte Fällung am isoelektrischen Punkt behandelt, um die am isoelektrischen Punkt im Bereich von pH 2,5 bis 5,0 gefällten Fraktionen zu sammeln, um zu einem Glycoprotein mit einem nach dem Ültrazentrifugen-Verfahren bestimmten Molekulargewicht von 5000 bis 300 000, einem Gewichtsverhältnis des nach der Lowry-Folin-Methode .bestimmten Proteinanteils zum Saccharidanteil, der nach der Phenol-Schwefelsäure-Methode bestimmt wurde, von 50/50 bis 80/20 zu gelangen; mit einer Aminosäure an seinem N-ünde, die im wesentlichen aus Tyrosin, Leucin oder Alanin besteht; Leucin-Phenylalanin-Valin als Aminosäuresequenz an des» sen C-ünde; einer Clementzusammensetzung von im wesentlichen 3^,2 bis 49,3% G, 4,8 bis 8,0% H, 4,3 bis 12,3% N, Spuren bis 2,5% S, Spuren bis 1,2% P und dem Gleichgewicht an 0; einem isoelektrischen Punkt im Bereich von pH 2,5 bis 5,0; und Nukleinsäure als Komponente,

2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß der basidiomycetische Fungus aus -der folgenden Gruppe ausgewählt ist Coriolus versicolor (Fr.)Quel., Goriolus hirsutus (Fr.)Quel., Coiriolus pergamenus (Fr. )Pat·, Coriolus consors (Berk. )Imaz., Coriolus pubescens (Fr.)Quel., Coriolus biformis (Klotz.)Pat. und Coriolus conchifer (Schw.)Pat·

3. Verfahren nach Punkt 2, gekennzeichnet dadurch, daß der basidiomycetische Fungus Coriolus versicolor (Fr.)Quel. ist.

4· Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch;, daß die traktionsstufe bei eil
1 bis 8 Stunden läuft,

traktionsstufe bei einer Temperatur von 80 bis 100 ⁰C über

237287 2

60 399 12

5β Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß das Verfahren der fraktionierten Fällung während des jiinstellens des pH-Wertes einer Lösung im Bereich von 2,5 bis 5,0 durchgeführt wird» "

6. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die nach der fraktionierten Fällung erhaltene η Fraktionen neutralisiert und der Dialyse oder Ultrafiltration unterworfen werden·

7. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die fraktionierte Fällung am isoelektrischen Punkt bei einer Ionenstärke von 0,1 bis 3,1 p. der Lösung bei einer Temperatur von

5 bis 25 ⁰G über mehr als o,5 Stunden durchgeführt wird»

Hierzu ΛΛ Blatt Zeichnungen (Diagramme)