DD204267A5 - Verfahren zur intensivierung der mikrobiologischen umwandlung von steroidverbindungen - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur mikrobiologischen Umwandlung von Steroidverbindungen. Ziel der Erfindung ist es, die mikrobiologische Umwandlung von Steroidverbindungen zu intensivieren. Erfindungsgemaess wird in der Weise verfahren, dass man die mikrobiologische Reaktion des Steroid-Substrats in Gegenwart von Alpha-, Beta- oder Gamma-Cyclodextrin oder einem beliebigen Gemisch derselben durchfuehrt und das Cyclodextrin nach Beendigung der Umwandlung gegebenenfalls aus dem System zurueckgewinnt. Das Cyclodextrin wird dabei vor der mikrobiologischen Reaktion, bei deren Beginn oder waehrend der Reaktion in das System eingefuehrt, und zwar in einer Menge von 0,2 bis 3 Mol auf 1 Mol des Substrats.
Description
Berlin, 11. 2. 1983
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Verfahren zur Intensivierung der mikrobiologischen Umwandlung von Steroidverbindungen
Anwendungsgebiet der Erfindung
Der Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Inten~ eivierung der mikrobiologischen Umwandlung von Steroidverbindungen durch die Verwendung von Gyclodeztrin-Zusats·» stoff.
Gharakteristikf_der,bejcaira ten, t.echnischen Lb'sunken
Bei der Herstellung von Steroidverbindungen kommt es oft vor, daß man eine Stufe der mehrstufigen Synthese durch die Verwendung einer spezifischen Funktion eines Mikroorganismus löst. Die Mikroorganismus-Zellen, die aus de Zellen extrahierten Enzyme, die eventuell fixierten Zel·» len oder die fixierten Enzyme verwendenden Biokonversionsprozesse gehen in einem wäßrigen Medium vor« Obwohl die enzymatisch^ Reaktion in diesem Medium sicher abläuft, ist gleichzeitig ein Nachteil vorhanden im Vergleich mit den Reaktionen in organischen Lösungsmitteln derart, daß die Steroide in Wasser schlecht lösbar sind» Die Wasserlöslichkeit einer Reihe von Steroidverbindungen ist sehr schwach, also ist die Konzentration niedriger ale ale™ jenige Konzentration, bei welcher die Biokonversionsprozesse noch ökonomisch durchführbar sind«. Bei den bekannten Verfahren liegt ein bestimmter Seil des Substrats bzw© des Steroidproduktes während der Reaktion in fester Form vor* Die Auflösung des Substrats in der festen Phase kann
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die Reaktionsgeschwindigkeit bestimmen· Im Pall von heterogener Teilchengröße wird die Geschwindigkeit der Auflösung mit Erhöhung der Durchschnittsgröße der nicht aufgelösten Teilchen immer niedriger· Es kann vorkommen, daß wegen der Auflösungsprobleme die Reaktion vor dem Erreichen der gewUnschten Eonversion zum Stillstand kommt·
Mehrere Verfahren wurden zur Erhöhung der Wasserlöslichkeit des Substrat-Steroids oder der Auflösungsgeschwindigkeit des Produktes ausgearbeitet·
Gemäß GB-PS 1 211 356 wird zum Erreichen eines homogenen, zerkleinerten Substrats das in die Reaktion eingeführte Steroid vorher mechanisch despergiert. Nach US-PS 4 124 wird das Substrat von Peinkorngröße in einer separaten Stufe hergestellt, indem man die in einem organischen Lösungsmittel hergestellte Steroidlösung in Wasser emulgiert und das Lösungsmittel abdestilliert· In mehreren Verfahren wird das Steroid in einem organischen Lösungsmittel aufgelöst· Die Ausscheidung erfolgt unmittelbar in dem Biokonversionsprozeß· Nach HU-PS 149 678 wird das zur Eintragung des Substrats verwendete Lösungsmittel (Pyridin, Essigsäure) vor dem Anfang der Biokonversion neutralisiert· Die Löslichkeit wird bei Alkoholen durch die Zugabe von Alkalierdmetall-chloriden verbessert·
Gemäß GB-PS 1 083 204 wird die Löslichkeit des Steroid-Substrats in dem Reaktionsmedium durch die Zugabe eines organischen Lösungsmittels, zweckmäßig Dimethylsulfoxyd, verbessert, das schon bei dem Einsatz oder nach dem Ein-
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satz verwendet wird. Nach einer anderen Lösung wird die Wasserlöslichkeit des Steroidsubstrats mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel gesichert« In diesem Pail wird die schnelle Stofftibergabe durch die große Grenzenoberfläche der gebildeten Emulsion ermöglicht (s« Biotechn· Bioeng« 2M_, 39 /1979/)· In der pharmazeutischen Industrie verwendet man oft Solubilisierungsmittele So z. B. erhöht man, gemäß DE-PS 1 543 432, erheblich die Androstendion-Ausbeute durch die Zugabe von Solubilisierungsmitteln bei der Herateilung der Verbindung aus 4-Collesten-3-on«
Die bekannten Lösungen vermindern zwar die mit der schwachen Wasserlöslichkeit der Steroidsubstrate verbundenen Nachteile, sind aber nicht ökonomisch oder zeigen ungünstige Wirkungen auf das System; falls z* B· das Substrat in mikrokristalliner ΙΌπα hergestellt wird, dies bedeutet mehr Arbeitsvorgänge in der technologischen Reihe und verursacht einen Stoffverlust· lach anderen Beobachtungen wird der Mikroorganismus durch das organische Lösungsmittel in der zur bedeutenden Erhöhung der Wasserlöelichkeit der Steroide nötigen Menge beschädigt (Steroids9 .12,, 525 /1968/).
Wenn man Solubili sie rung smi tt el verwendet, steigert sich, nach Erfahrungen die Schaumbildung, und dies verhindert eine genügende Lüftung des Biokonversionssystems*
Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens, das einerseits die Nachteile der aus dem Stand der Technik
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bekannten Verfahren vermindert und gleichzeitig die Intensivierung der Reaktion bei der mikrobiologischen Umwandlung der Steroide sichert·
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein geeignetes Mittel zur Verbesserung der Wasserlöslichkeit der Steroidmoleküle aufzufinden·
Es wurde gefunden, daß die Cyclodextrine in Biokonversionssystemen eine Verbesserung der Wasserlöslichkeit der Steroidmoleküle bei festem Rücketand zur Erhöhung der Lösungsgeschwindigkeit und dadurch zur erheblichen Erhöhung der Biokonversionsreaktion bewirken· Weiterhin bewirken sie in einem gegebenen System eine Eliminierung der eine weitere Reaktion hemmenden Produkthemmung und in bestimmten Fällen eine Blockierung bestimmter Reaktionen durch die Deckung einiger sterischen Gruppen des Steroidmoleküls· Die oC - und ß-Cyclodextrine bzw« deren Gemische wirken katalytisch in einer Ester-Hydrolyse« Wenn die
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Mikroorganismen zwei oder mehrere Funktionen aufweisen, so können die selektiven Wirkungen das Verhältnis der Reaktionsprodukte beeinflussen. Die obigen Wirkungen werden weiterhin zusammenfassend als "Intensivierung" bezeichnet.
Erfindungsgemäß wird die Reaktion der mikrobiologischen Umwandlung der Steroide so intensiviert, daß man das Steroid-Substrat in Gegenwart von «c-, ß- oder Jf-Cyclodextrin oder deren Gemisch umsetzt und gegebenenfalls nach <Xev Umwandlung das Cyclodextrin aus dem Gemisch gewinnt. Unter "Cyclodextrin" versteht man weiterhin <*-, ß- oder T-Cyclodextrin oder ein beliebiges Gemisch derselben. Vor der mikrobiologischen Umwandlung .oder zu derm Beginn oder in einer bestimmten Phase der mikrobiologischen Konversion gibt man auf ein Mol Substrat 0,2-3 Mol Cyclodextrin zu.
Nach einer Ausführungsmethode wird das entsprechende Cyclodextrin vor dem Einsatz des Substrats in das Biokonversionsmedium geführt. Nach einer anderen Ausführungsmethode wird . das Substrat mit dem Cyclodextrin umgesetzt und der erhaltene Substrat-Inklusionskomplex, bzw. dessen wäßrige Lösung oder Suspension wird zum Biokonversionsmedium gegeben. Nach einer weiteren möglichen Ausführungsform wird das Cyclodextrin allein oder in Form eines mit dem Substrat gebildeten Inklusionskoraplexes, erwünschtenfalls eine5 wäßrige Lösung oder Suspension des Inklusionskomplexe's während der mikrobiologischen Reaktion, üblicherweise nach Erreichung von 30-50 # Konversion zugegeben. Die Lösung des Cyclodextrins oder des Cyclodextrins und des Substrat-Inklusionskomplexes können vor der Eintragung in das Biokonversionsmedium sterilisiert werden oder sie können mit dem Biokonversionsmedium zusammen sterilisiert werden. Cyclodextrin kann aus dem wäßrigen Biokonversionsmedium so
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zurückgewonnen werden, daß man das Steroid mit einem organischen Lösungsmittel extrahiert und das Cyclodextrin durch die Zugabe eines dessen Löslichkeit stark vermindernden Lösungsmittels, bevorzugt Hexan, aus dem Raffinat ausfällt und durch Filtrieren isoliert und das Cyclodextrin erwünscht enf alls trocknet·
Die Intensivierung der mikrobiologischen Umwandlung der Steroide gemäß der Erfindung ist sehr vorteilhaft, da diese Wirkung in der Erhöhung der Reaktionsgeschwindigkeit xmä. in der Verminderung der Reaktionszeit erkennbar wird, die Konzentration des Substrats in dem Medium kann erhöht werden, die Produkthemmung kann eliminiert werden, von den möglichen Reaktionen kann die gewünsohte Reaktion katalysiert werden, also die mikrobiologische Selektivität kann gesteigert werden·
Die Herstellung der Cyclodextrin-Steroidsubstrat-Inklusions« komplexe kann nach mehreren Varianten durchgeführt werden» Wach einer Variante ist das Medium der Biokonversion eine wäßrige Lösung entsprechender Konzentration des erwünschten Cyclodextrins, zu welcher das Substrat Steroid gegeben wird und der Inklusionskomplex wird der Gleichgewichtslage entsprechend gebildet (Variante 1)·
Nach einer anderen Methode wird, um den Einsatz des Steroids in das System zu vermeiden, in einem separaten Tank die wäßrige Lösung des Substrat-Cyclodextrin-Inklusionskomplexes hergestellt, die durch Filtrieren sterilisiert wird und so zum Biokonversionsmedium gegeben wird (Variante 2)· In Gegenwart von etwas Wasser ist nach der Erfahrung das Gemisch von Cyclodextrin und von Steroid umkristalliBierbar, ein Steroid-Cyclodextrin wird gebildet, das bei einem Biokonversionsprozeß, der keiner Sterilisierung bedarf, in fester Form verwendet werden kann (Variante 3)·
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Die Cyclodextrine sind Glucose-Polymere von natürlichem Ursprung, die aus 6, 7 oder 8 Glucose-Einheiten bestehende eingeschlossene Makroringe sind. Ihre Struktur wird durch die spezielle Anordnung der Hydroxylgruppen charakterisiert. Alle sekundäre Hydroxylgruppen sind an dem einen Rand des Ringes zu finden, wogegen die primären Hydroxylgruppen an dem anderen Rande des Ringes aufzufinden sind. Daraus folgt, daß die äußere Oberfläche des Ringes hydrophil ist, daher sind die Cyclodextrine wasserlös-
10 lieh.
Die innere Seite des Ringes ist hydrophob. Die Cyclodextrine bilden mit Molekülen von entsprechender Größe und Form Inklusionskomplexe. Das aus 6 Glucopyranose-Einheiten bestehende Cyclodextrin ist eC-Cyclodextrin, ß-CyclQ« dextrin wird aus 7 Glucopyranose-Einheiten aufgebaut und γ -Cyclodextrin besteht aus 8 Glucopyranose-Einheiten. Nach der Bindungsart werden Cyclodextrine auch Cycloamylose genannt. Komplexe von Steroidmolekülen mit Cyclodextrin wurden schon während des Studierens meherer pharmakologischen Wirkstoffe und mehrerer soiubilisierenden Stoffe unteraucht (Lech und Pauli: J. Pharm. Sei. JjjJ?, 32 /1966/). Im Pail von Testosteron und Cortisonacetat wurden die wahrscheinlichen stoechioraetrischen Verhältnisse der Komponenten festgestellt. Durch die Solubilisierung wollte man die Resorption der pharmazeutischen Wirkstoffe beeinflussen.
Die Cyclodextrine wurden aber nicht zur Intensivierung der Reaktion bei der mikrobiologischen Umwandlung der Steroid-Substrate verwendet. Bs wurde festgestellt, daß der Komplex von Steroid-Substrat mit Cyclodextrin in einem wäßrigen Medium gleich dissoziiert und der Komplex ist in einem Biokonversionssystem in einem dynamischen Gleichgewicht mit den freien Steroid- und Gyclodextrin-Molekülen.
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In einem festen, ein suspendiertes Steroid enthaltenden Biokonversionssystem ist die-jeweilige Konzentration des für das Enzym erreichbaren gelösten Anteils immer von der Lösungsgeschwindigkeit des die ETachfolge sichernden Substrats und der Geschwindigkeit der enzymatisehen Reaktion abhängig· Wenn die Auflösung ein langsamerer Prozeß ist, so bleibt während der Reaktion die Konzentration der Steroidlö'sung weit unter dem Sättigungswert und die Reaktion wird dadurch im Sinne des Grundgesetzes der enzymatisehen Reaktion wesentlich langsamer· Das Substrat setzt sich aus dem Cyclodextrin Inklusionskomplex praktisch äugen» blicklich frei. Die Menge des gelösten Substrats bleibt in diesem Pail während des ganzen Prozesses bis zum Ende des Prozesses auf dem Sättigungswert und so wird die maximale Konversionsgeschwindigkeit der gegebenen Enzymreaktion gesichert·
Bei anderen Steroid-Umwandlungsreaktionen kann das Produkt nach dem sog* Endprodukthemmungsmechanismus die Reaktion verlangsamen oder einstellen, wenn es an das Enzym oder die Oberfläche der Zelle gebunden ist* Wegen der unterschiedlichen Struktur des Substrats und der Endproduktmoleküle bilden diese mit dem Cyclodextrin Komplexe von mehr oder weniger verschiedener Stabilität« Gemäß unseren Untersuchungen wurden so günstige Reaktionsumstände gefunden, unter welchen das sonst eine Endpro duk themmung- verursachende Steroid in einem Cyclodextrin-Komplex übergeführt wurde, ohne daß die Zugänglichkeit des Substrat-Steroids verschlechtert wird· Wenn die Stabilität das Substrat-Cyclodextrin-Komplexes die Stabilität des End« produkt-Cyclodextrin-Komplexes übertrifft, dann kann durch die Verwertung der Komplexbildung die Endprodukthemmung so aufgehoben werden, daß man das Cyclodextrin nur nach einem gewissen Portschritt der Reaktion einsetzt, wenn der Überschuß des Produktes im System nachgewiesen werden kann»
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In weiteren Untersuchungen wurde auch festgestellt, daß die enzymatische Hydrolyse der veresterten Steroidmoleküle durch die Herstellung eines entsprechenden cC- und/oder ß-Cyclodextrin-Komplexes beschleunigt werden kann· Dies kann vermutlich durch die katalytisch^ Wirkung erklärt werden, die aus der Struktur des Cyclodextrins folgt· Bei verschiedenen Biokonversionsumwandlungen wurde auch beobachtet, daß die Cyclodextrin-Komplex-Bildung andere Verhältnisverschiebung verursachen kann, so kann im Pail eines entsprechend stabilen Komplexes durch die Verminderung der Zugänglichkeit des Moleküls die Geschwindigkeit einer Reaktion gegebener Konfiguration vermindert oder die Reaktion sogar eliminiert werden·
Diese Inklusionskomplex bildende Eigenschaft und deren Wirkung auf die Intensivierung der Biokonversionsreaktion ist auf die Steranverbindung allgemein gültig.
Nachstehend werden die Einzelheiten des Verfahrens an Beispielen von Oestran-, Androstan-, Pregnan-, Cholestan-, Stigmastan- und Nor-Verbindungen demonstriert, ohne den Schutzumfang auf die obigen Beispiele zu limitieren·
Substrat: Hydrocortison
Mikroorganismus Arthrobacter simplex (ATCC 6946) oC -Cyclodextrin, Geschwindigkeit se rhb'hung Substrateinführung: 1· Variante
Eine Agarkultur von Arthrobacter simplex (ATCC 6946) wird mit physiologischer Salzlösung gewaschen und man inokuliert mit 5 cm-* dieser Suspension den folgenden Nährboden:
O C O C O 61 452 18
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Glucoses 0,3 %» enzymatisch hydrolysiertes Kasein 0,5 %» Hefenextrakt: 0,1 %t pH β 6,7· Man ergänzt die Lösung mit Wasser auf 100 cnr und sterilisiert in einem 500 cm Erlenmeyer-Kolben· Man kultiviert bei 32 0C an einer Flach-Rüttelmaschine von einer Hubzahl von 230/18 Stunden, man
3 gibt 5 mg Hydrocortison in 0,5 cm Methanol gelöst zur Kultur und das erwünschte Enzym wird induziert· Die Induktion dauert 3 Stunden, die unter gleichen Umständen wie alle Kultivierung durchgeführt wird· 50 cnr der delta-1« -Dehydrogenas-Enzym enthaltenden Kultur wird in einen 950 cnr steriles Wasser enthaltenden 3 1 Erlenmeyer-Kolben vorgelegt und die Konversion wird mit der so erhaltenen 2Ofach verdünnten Aktivkultur durchgeführt· Das eingesetzt© Substrat beträgt 2 g Hydrocortison, der Einsatz erfolgt durch die Verwendung des obigen Zusatzes folgenderweise:
Man gibt 20 g oC -Cyclodextrin zur Kultur, nach deren Auflösung löst man das Hydrocortison in 20 cnr Methanol auf, wobei das Methanol 10 Gew#-# OaCl2 enthält. Die Lösung gibt man zu der das oC -Cyclodextrin enthaltenden Kultur· Die Umwandlung erfolgt bei 32 0C an der oben erwähnten Rüttelmaschine 5 Stunden lang. Die Gegenwart des oC -Cyclodextrins verhindert bei der Eintragung des Substrats in das wäßrige Medium dessen Ausscheidung» Die Umwandlung des< aufgelösten Substrats erfolgt mit einer größeren, durch die Enzymaktivität bestimmten größeren Geschwindigkeit als in dem System, das das Substrat in Form einer Suspension enthält« Die Konversionszeit des obigen Substrats ohne Cyclodextrin beträgt 8 Stunden. Am Ende der Konversion ist der Steroidgehalt der Fermentbrühe: 1920 /Ug/cnr Prednisolon, 40 /ug/cm3 20-ß-Hydroxy-prednisolon und 8 , Hydrocortison·
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Substrats .17 oC-Methyl-testosteron (Androstan-Derivat) Mikroorganismus,; Arthrobacter simplex (ATCC 6946) ß-Cyclodextrin, Aufhebung der Bndprodukthemmung Substrateinsatz: Variante 1
Die nach Beispiel 1 hergestellte und induzierte Kultur wird auf das Fünffache verdünnt und zur delta-1-Dehydrogenierung von Methyl-Testosteron verwendet, indem man zur Ingangsetzung der Biokonversion eine Lösung von 1,0 g Methyl-Testosteron in 10 cnr Methanol in das System führt· Die Umwandlung wird dünnschichtchromatographisch beobachtet· Das eingetragene Substrat scheidet sich im System aus und wird während kontinuierlicher Auflösung dehydrogenisiert· Bei Erreichung von ca· 400 /üg/ciir delta-1-Methyl-Testosteron gibt man zum System 6,0 g ß-Cyclodextrin* Der Zusatz bildet einen Komplex aus dem entstehenden Produkt, das ist deshalb wichtig, weil sonst die enzymatische Reaktion wegen des Übergewichts des Produktes aufgrund des bekannten Endprodukthemmungsmechanlsmus langsamer wäre und schließlich Überhaupt nicht fortgesetzt wäre· Die Komplexbildungsneigung des ß-Cyclodextrins gegenüber dem Produkt ist ca· fünffach so intensiv als die gegenüber dem Substrat· Der Einsatz erfolgt in der zweiten Stunde der Konversion und die Inkubation wird aufgrund von dünnschichtchromatographischen Untersuchungen in der 6. Stunde eingestellt·
Der Steroidgehalt der Permentbrühe am Ende der Umwandlung beträgt: 970 /Ug/cnr delta-1-methyl-Testosteron, 6/ug/cm^ Methyl-Testosteron· Ohne die Zugabe von Cyclodextrin wird die Reaktion bei einer Rückstand-Substrat-Konzentration von 100 - 120 /Ug/cnr unterbrochen·
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Substrat: 5-Pregnen-3ß,17c<: ,21-triol-20-on~21-acetat (acylierter Pregnen-Derivat)
Mikroorganismus: Plavobacterium lucecoloratum (NIB 9324) T'-Cyclodextrin: Variante 3
Mit einer schiefen Agarkultur von Plavobacterium lucecoloratum (NOIB 9324) inokuliert man 200 cm^ Nährboden im •S
750 cnr Erlenmeyer-Kolben· Die Kultivierung führt man bei 30 0C 20 Stunden an einer Plachrüttel-Maschine von einer Hubzahl von 230 durch· Mit der Kultur inokuliert man 5 1 sterilen Nährboden von gleicher Zusammensetzung in einem laboratorysehen Permentor· Die Zusammensetzung: 1,0 Gewe~$ Hefenextrakt, 0,1 Gew*-# Kaliumhydrogenphosphat, 0,4 Gewe-# Dikaliumhydrogenphosphat· Zum inokulierten Nährboden gibt man 250 mg Substrat aufgelöst in 1,5 cnr Dimethylformamid· Die Lösung wird steril-filtriert· Die Gegenwart des Substrats ermöglicht die Bildung der nötigen Enzyme während des Wachstums der Kultur· Nach 12 Stunden Kultivierung ist die Bakterienzahl und die Enzymaktivität zur Ingangsetzung der Biokonversion geeignet und man gibt nun 100 g Pregnen-3J3,i7oC,21-trihydroxy-20-21-acetat zur Kultur, das mit f-Cyclodextrin vorbehandelt wurde. Die Behandlung erfolgt folgenderweise:
Man homogenisiert 100 g Substrat mit gleicher Menge von ^Cyclodextrin und 200 ca? Wasser 20 Minuten« Während dieser Zeit bildet ein proportionaler Anteil des Substrats mit dem Cyclodextrin einen schnell löslichen Komplex· Die Suspension wird in den Permentor geführt und man inkubiert weitere 11 Stunden, bis das Substrat verbraucht wird· Bedingungen der Inkubation in dem laboratorischen Permentor: 30 0C, ßUhren mit 420 Drehzahl pro Minute, lüftung mit einer Ge-
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schwindigkeit von 0,5 l/l/Minute. Die Umwandlung wird durch Dünnschichtchromatographie beobachtet. Der Steroidgehalt der Fermentbrühe am Ende der Konversion: 9020 /Ug/cnr Reichstein S Verbindung: 4—Pregnen-17<*, 21-dihydroxy-3120- -dion, 30 /Ug/cnr Substrat. Ohne Cyclodextrin könnte die Biokonversion erst mit einer Menge von 10 g/l Substrat günstig durchgeführt werden.
Substrat: 4~Pregnen^l7 *· ,21-dihydroxy-3,20-dion-
-17-acetat /acyliertes Corticosteroid/ Mikroorganismus: Curvularia prasadii /IMI 714-75/ /3 -Cyclodextrin, Katalyse der Esterhydrolyse Substrateintragung: Variante 1. Mit einer Suspension von Sporen die von einer schiefen Agarkultur von Culvularia prasadii /IMI 714-75/ at>~ gewaschen wurden, inokuliert man 100 cnr Na'hrboden in einem
χ
500 cnr Erlenmeyer-Kolben. Die Zusammensetzung des Nährbodens: 1,0 Gew..# Sojamehl, 0,3 Gew.^ Maismarmelade, 0,3 Gew.% Maisstarke, 0,5 Gew.# Malzextrakt, pH=6,2. Die Kultur wird bei 26 C 24- Stunden hergestellt, 10 cm·^ der Kultur wird zur Inokulierung von 100 cnr Nährboden in einem gleich großen Kolben verwendet. Der Nährboden entha'lt keinen Malzextrakt aber hat sonst die gleiche Zusammen-
25/ setzung wie oben beschrieben. Der Mikroorganismus wird bei 26 0C geschüttelt und so propagiert. Zur noch wachsenden 16 Stunden alten Kultur gibt man das umzuwandelnde Substrat. Das Substrat ist 4—Pregnen-17«<,21-dihydroxy-3,20-dion- -acetat, aus welchem 0,12 g in 3 cnr Methanol gelöst zum System gegeben wird. Man inkubiert weiter, wonach die Kultur die Verbindung in 11/3-Stellung hydroxyliert, wobei Jiydrocortison-17-acetat entsteht. In der 20. Stunde der
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durch Dünnschichtchromatographie beobachtete Konversion betragt das Rückstand-Substrat 10 Gew«#. Man gibt dann 0,96 g /J-Cyclodextrin zur Umwandlung» Das Cyclodextrin wirkt katalytisch auf die enzymatische Hydrolysis der Ace tylgruppe des Steroidmoleküls, so wird während der '
übrigbleibenden Zeit der Biokonversion neben der langsam werdenden Hydroxylierung die Acetylgruppe abgespaltet. Na< weiteren ca. 3 Stunden kann der Ένοζeß unterbrochen werdei Der Steroidgehalt der Fermentbrühe am Ende der Ko] version: Hydrocortison /4-Pregnen~ll β -,17 cc 721-trihydrox; -3,20-dion/ 0,730 mg/cm , Hydrocortison-17-acetat 0,185 /Ug/cnr, Reichstein S-17-acetat 0,005 /ig/cm , Reicl stein S~Verbindung 0,040 ,ug/cirr.
Substrat: Hydrocortison
Mikroorganismus: Arthrobacter simplex /A/CC 694-6/ Λ-Cyclodextrin, Geschwindigkeitsteigerung Substrateingabe: Variante 2.
Eine auf festem Nährboden gewachsene Arthrobacter simplex /ATCC 694-6/ Kultur wird abgewaschen und man inokuliert 5 1 sterilen Nährboden mit ungefähr 30 cnr Suspensic in einem laboratorischen Fermentor.
Die Zusammensetzung des Nährbodens: 0,3 Gew.% GIu-'25 kose, 0,3 Gew.% Pepton, 0,1 Gew.# Hefenextrakt. pH=6,8« Die Kultur wird bei 35 0C 24-0 Drehzahl/Min. Rühren und 0,5 1/1/Min. Lüftung 20 Stunden hergestellt» Mit 1 1 der Kultur inokuliert man in einem laboratorischen Fermentor 9 1 sterilisierten Nährboden, deren Zusammensetzung folgen ^O de ist: 0,5 Gew.# Glucose, 0,5 Gew»^ Pepton, 0,4 Gew.# Hefenextrakt, pH=6,8. Die Kultur wird bei 35 0C, bei 600 Drehzahl/Min. Rühren, und 0,3 Liter/Liter/Min. Lüftung 18 Stunden lang hergestellt, wonach zur Induzierung der En
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zymbildung eine Lösung von 0,5 g Hydrocortison in 50 cm^ Methanol zugegeben wird· Man inkubiert weitere 4 Stunden, wonach die Aktivkultur in einen säurefesten Apparat gepreßt wird, wo das Medium der Biokonversion vorher vorbereitet wurde·
Mediums in die Vorrichtung gießt man 90 1 Leitungswasser, 1200 g ß-Cyclodextrin, die Vorrichtung erhitzt man auf 100 0C und das Medium wird bei dieser Temperatur 20 Minuten sterilisiert und dann auf 35 0C abgekühlt. Man löst 1,0 g 2-Methyl-1,4-naphtochinon und 400 g Hydrocortison in 4 1» 400 g OaOl2 enthaltenden Methanol auf, die Lösung wird auf steril filtriert und in den Apparat eingeführt· Die Kultur wird eingepreßt, worauf der Biokonversionsprozeß in Gang gesetzt wird· Während des Prozesses ist das Steroidsubstrat praktisch in Lösung, das ist deshalb wichtig, weil bei dem Anfang der Produktausscheidung die Gefahr der Gemischkristallbildung aus dem Substrat und aus dem Produkt eliminiert wird·
Umstände der Inkubation der Biokonversion: 35 0C, 180 Drehzahl/Min· Rühren und 0,6 1/1/min. Lüftung· Aufgrund der dünnschichtchromatographischen Analyse unterbricht man die Reaktion bei einer Substratmenge von 2 Gew.-SS, die Permentbrühe wird durch Gegenstromextraktion auf einem Apparat, der die Gegenwart von festem Stoff zuläßt (z· B· ein Drehscheiben-Extraktor), mit Ethylacetat zweimal extrahiert· Der Extrakt wird im Vakuum bei max« 40 0C zu einer Konzentration von 8 g/l eingeengt - ca· 50 1 erstes Konzentrat - mit einem Gemisch von 40 g Aktivkohle und 100 g Celite behandelt, und das Gemisch wird bis zur Kristallisierung - ca. 2 Liter - weiter eingeengt· Die Suspension wird auf 5 bis 10 0C gekühlt und nach einigen
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Stunden filtriert· Die Mutterlauge wird mit einer fünffachen Menge von Diisopropylether ausgefällt, gekühlt und filtriert. Das Produkt beträgt 375 g, dessen Qualität wie folgt charakterisiert werden kanns
Reinheit 98 Gewe~%
Trocknungsverlust 1 Gew<.~%
Sulfatasche 0,1 Gew«-%
Hydrocortison Rückstand 1,2 Gew„~%
andere Steroide 0,35 Gew.~%
Schmelzpunkt 234 bis 236 0C
^° = +98° (Dioxan, '
Um das ß-Cyclodextrin zurückzugewinnen, wird der Extrakt mit 1 Liter Cyclohexan 1 Stunde bei 18 bis 20 0C gerührt» Der gebildete Rückstand wird filtriert, in ungefähr 1 Liter Wasser suspendiert und das Cyclohexan unter Kochen (durch Wasserdampfdestillation) aus dem Gemisch ausgetrieben» Die wäßrige ß-Gyclodextrin-Suspension wird eine Nacht bei 5 bis 10 0O gehalten, die Kristalle werden filtriert und im Vakuum getrocknet· Man gewinnt 700 g ß-Cyclo« dextrin zurück, das wieder verwendet werden kann·
Beispiele 6 bis 11
Die folgenden milcrobiologischen Konversionen wurden analog mit den Beispielen 1 bis 5 unter den in den Beispielen angegebenen Umständen durchgeführt, man verwendet Cyclodextrin zur Intensivierung der erwünschten Reaktionen»
Substrat: Progesteron
Mikroorganismus: Mycobacterium sp* (HRRL B 3805) ß-Cyclodextrin, Konzentrationserhöhung Substrateinsatz: Variante 1
Endprodukt: Androstat-4-dien«4*17-dion
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Den Abbau der Seitenkette des Substrats führt man nach der Methode von Marscheck, W. J· Kraychi, S* und Muir Re D· (1972) Appl. Microbiol. 23, 72 durch (Steroid/Cyclodextrin Molverhältnis 1:0,2· Der Nährboden enthält 0,5 % Ua2HPO4. THpO· Infolge der Gegenwart von Cyclodextrin kann die ohne Cyclodextrin erreichbare 1 g/l Sitosterin Konzentration unter unveränderter Konversionszeit (ca· 170 Stunden) auf 2 g/l Sitosterin Konz ent ration erhöht werden«.
Substrat: Progesteron
Mikroorganismus: Ophiobolus herpotrichus ß-Cyclodextrin, vollständige Konversion Substrateinsatz: Variante 1 Endprodukt: 21~Dihydroxy-progesteron
Die Reaktion wird nach der Methode von Meyatre et al·, HeIv. Chim. Acta 21, 1548 (1954) durchgeführt. Steroid/Cyclodextrin Molverhältnis: 1:0,2· Der Nährboden ist Biermaische, an welcher der Mikroorganismus 3 Tage kultiviert wird, man gibt dann die acetonische Lösung von Progesteron-Substrat bis zur Erreichung einer Konzentration von 0,25 g/l Permentbrühe dazu. Ohne Verwendung von Cyclodextrin dauert die Konversion weitere 3 Tage und der Substratrückstand ist ungefähr 25 %» Wenn 24 bis 30 Stunden nach Anfang der Biokonversion Cyclodextrin zum Reaktionsgemisch gegeben wird, wird die Menge des Substratrückstandes wesentlich kleiner.
243525 2
Substrat: 4-Pregnen-l? oc ,21-dihydroxy»3s20~dion,
(Reichstein-S)
Mikroorganismus: Curvularia lunata (IFO 49) ß-Cyclodextrin, Beeinflussung des Verhältnisses der Reaktionsprodukte Substrateintragung: Variante 1. Hauptprodukt: Hydrocortison
Die Reaktion wird nach der Methode von Kondo, E. und Mitsugi, T., J. Agrc. Chem. Soc. Japan ^, 521 (1961) durchgeführt. Steroid/Cyclodextrin Molverhältnis: IsOS3. Ohne Zugabe von Cyclodextrin erhält man in der Biokonversion 35-^0 Gew.% 6-ß-Hydroxy-Reichstein S, 15-20 Gew.% <rt-Hydroxy-Reichstein-S und etwa 5 Gew.% 7,14«*-Di~ hydroxy- und 5 Gew.# 6-ß-14oc -Dihydroxy-Reichstein-S. Wenn in der 0. Stunde der Biokonversion in dem obigen Verhältnis ß-Cyclodextrin zu dem Gemisch gegeben wird kann das Verhältnis von 11 <K, -Hydroxy -R eich st ein-S (epi-Hydrocortison) im Produkt auf das Doppelte erhöht werden. 20
Substrat: 16 oC-Methyl-Reichstein-S Mikroorganismus: Curvularia lunata (ATGC 1201?) ß-Cyclodextrin, Verbesserung der Effektivität der Konversion
Substrateinsatz: Variante 1.
Endprodukt: llß-17 <* ,21-Trihydroxy-16 <*:-raethyl-preg] -4-en-3,20-dion (16e<.-Methyl-hydrocortison)
Die Reaktion wird nach der Methode von Canonica, L. et al. Gass. Chim. Ital. £3, 368 (1963) durchgeführt. Molverhältnis von Steroid/Cyclodextrin: 1:1. Ohne Verwendung
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von Cyclodextrin entsteht das Uauptprodukt in einer Menge von ca. 55 Gew.^. Wenn in der O. Stunde der Biokonversion in dem obigen Verhältnis ß-Cyclodextrin zu dem Reaktionsgemiseh gegeben wird, steigert sich die Proportion des Hauptproduktes um 5-10 #.
Substrat: 3ß t l?«c ? 21-Trihydroxy-pregn-5"-ßW-2Q«»Qn-21-
Mikroorganismus: Flavobacterium dehydrogenans
(ATTCC 13930)
ß-Cyclodextrin, Konzentrationserhöhung Substfcateinsatz: Variante 1 Endprodukt: Reichstein-S
Die Reaktion wird nach US-PS 3 009 936 durchgeführt. Steroid/Cyclodextrin Molverhältnis: 1:0,3. Mit Cyclodextrin kann die Konzentration auf das Doppelte gesteigert werden.
Substrat: Lanatozid-A (Digitalis Glucosid) Mikroorganismus: Streptomyces purpurascens ß-Cyclodextrin, Konzentrationserhöhung Substrateinsatz: Variante 1.
Die Reaktion wird nach der HU-PS 1?6 250 durchgeführt. Lanatosid-A/Cyclodextrin Mo!verhältnis: 1:1. Ohne Verwendung von Cyclodextrin gibt man zu einer 2-tägigen Kultur von Streptomyces purpurascens eine Lösung von Lanatosid-A in organischen Lösungsmitteln in einer Konzentration von 0,5 g/l· Wenn zu dem Reaktionsgemisch nach 2 Tage dauernder Kultivierung in der 0c Stunde der Biokonversion unter Einhaltung des obigen Verhältnisses ß-Cyclodextrin gegeben wird, kann die Konzentration des Substrats auf 2 g/l erhöht werden.
Claims (10)
1· Verfahren zur Intensivierung der mikrobiologischen Konversion von Steroiden, gekennzeichnet dadurch, daß man die mikrobiologische Reaktion des Steroid-Substrats in Gegenwart vonoC-, ß- oder "/^-Cyclodextrin oder einem beliebigen Gemisch derselben durchführt und das Cyclodextrin nach Beendigung der Umwandlung gegebenenfalls aus dem System zurückgewinnt*
2· Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß man das Cyclodextrin vor der mikrobiologischen Reak~> tion, bei deren Beginn oder während der Reaktion in das System führt.
3· Verfahren nach den Punkten 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß man das Cyclodextrin in einer Menge von 0,2 bis 3 Mol auf 1 Mol des Substrats berechnet verwendet·
4* Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 3, gekennzeichnet dadurch, daß man das entsprechende Cyclodextrin vor Eintragung des Substrats in das Biokonversionssystem einsetzt·
5· Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 3» gekennzeichnet dadurch, daß man den Inklusionskomplex dea Substrat-Cyclodextrins zur mikrobiologischen Konversion verwendet«
6· Verfahren nach Punkt 5» gekennzeichnet dadurch, daß man eine Lösung oder Suspension des Substrat-Cyclodextrin»· Inklusionskomplexes verwendet·
243525 2 w
7· Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 3» gekennzeichnet dadurch, daß man das Cyclodextrin nach Beendigung von 35 bis 50 % der mikrobiologischen Konversion in das System führt·
8· Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 3» gekennzeichnet dadurch, daß man das Cyclodextrin bzw· dessen mit dem Steroid-Substrat gebildeten Inklusionskomplex oder gegebenenfalls eine Lösung derselben vor dem Einsatz in das Biokonversionsmedium sterilisiert«
9· Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 3, gekennzeichnet dadurch, daß man das in das Biokonversionsmedium eingetragene Cyclodextrin samt dem Medium sterilisiert»
10· Verfahren nach Punkt Λ, gekennzeichnet dadurch, daß man das Steroid mit einem organischen Lösungsmittel aus dem wäßrigen Biokonversionsmedium extrahiert und das Cyclodextrin durch die Zugabe eines die Löslichkeit stark herabsetzenden Lösungsmittels, zweckmäßig Hexan, ausfällt, aus dem Raffinat durch Filtration isoliert und erwünschtenfalls trocknet»
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