DD152580A1 - Verfahren zur herstellung von androst-4-en-3,17-dion aus sterinen - Google Patents

Abstract

Das mikrobiologische Verfahren zur Herstellung von Androstendion dient dem Ziel, diese Verbindung in oekonomisch einfacher Weise herzustellen unter Beachtung der Forderung nach kontinuierlicher Betriebsweise, Wiederverwendbarkeit der Biomasse unter Vereinfachung der Sterilitaetsbedingungen. Durch Abbau der C&ind17!-Seitenkette von Sterinen und deren Derivaten mit immobilisierten Mikroorganismen wird Androst-4-en-3,17-dion als alleiniges Endprodukt erhalten. Derivate von Cholesterin, Ergosterin oder Sitisterin werden beispielsweise mit Kulturen von Mycobacterium spec., die durch Adsorption an feste Traeger, durch Einpolymerisation in Polymergele und durch Vernetzung von Polyelektrolyten durch mehrwertige Kationen immobilisiert werden, nach einem kontinuierlichen bzw. diskontinuierlichen Batch-Verfahren fermentiert. Das Endprodukt kann sowohl in pharmazeutisch wertvolle Derivate der Androstanreihe als auch der Pregnanreihe mit einem grossen Anwendungsbereich ueberfuehrt werden.

Description

Dr. Peter Atrat

Dr. Cläre Hörhold

Dr· Michael Buchar

Dr. Kira A. Koschtschejenko

Titel der Erfindung

Verfahren zur Herstellung von Androst-4-en-3,17-dion aus Sterinen

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Androst-4—en-3|17-dion aus Sterinen durch mikrobiologische Umwandlung« Anärost-4-en-3,17~dion ist ein Schlüsselprodukt für die Herstellung von Steroidwirkstoffen. Durch bekannte Synthesen kann das Produkt sowohl in die pharmazeutisch wertvollen Derivate der Androstanreihe als auch der Pregnanreihe mit einem groben Anwendungsbereich überführt werden·

Charakteristik der bekannten technischen Lösung

Es sind Verfahren bekannt zur Herstellung von Androst~4~en-3f17~ dion aus Sterinen wie z· B. Cholesterin, Sitosterin, Stigmasterin, Campesterin und Ergosterin durch Fermentation mit Mikroorganismen der Gattungen Arthrobacter, Brevibacterium, Nocardia, Microbacterium, Protaminobacter, Bacillus, Streptomyces, Corynebacterium, Mycobacterium u· a.·

Hierbei besteht das Problem darin, die Verfahrensbedingungen so zu wählen, daß lediglich die Seitenkette der Sterine durch die Mikroorganismen abgebaut wird, der weiterführende Kingskelettabbau aber verhindert wird· Bei den bekannten Verfahren wird dieses Problem im wesentlichen durch drei Prinzipien gelöst. Erstens durch die Anwendung von Mutanten, die zum Ringskelettabbau nicht befähigt sind, zweitens durch Zusatz von geeigneten Enzymhemmern, wie z. B. Schwermetallverbindungen und Chelatbildnern, und drittens dadurch, daß entsprechend substituierte Sterine verwendet werden, die keine Substrate der Enzyme sind, die den Hingskelettabbau einleiten«

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Allen Verfahren gemeinsam ist, daß die als Ausgangsmaterial dienenden- Sterine einer wachsenden oder ruhenden diskontinuierlichen Kultur eines Mikroorganismus zugesetzt werden, dessen Zellen in nichtstabilisierter Form im Fermentationsmedium vorliegen.

Die Fermentationsführung unter diesen Bedingungen ist mit folgenden Nachteilen behaftetг Gefahr der Unsterilität im nährstoffreichen Fermentationsmedium, Schwankungen im Gehalt und in der Aktivität der induzierten Enzymsysteme in Abhängigkeit von Veränderungen im Fermentationsmedium, z* B\ durch Abnahme der Konzentration des Induktors, durch Nähr stoff verbrauch, Erhöhung der lonenkonzentration bei der erforderlichen pH-Regulation, u. a· sowie durch altersbedingte Veränderungen im Zeil stoff wechsel. Durch die angegebenen Mängel sind die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse nach den bekannten Verfahren stark beeinträchtigt. Außerdem erschöpft sich in der Regel die Fähigkeit der Mikroorganismen, die Seitenkette von Sterinen abzubauen während der ersten Fermentation, so daß die angezüchtete Biomasse nur für eine oder höchstens für eine zweite Fermentation zu verwenden ist.

Ziel der Erfindung

Das Ziel der vorliegenden Erfindung ist die verbesserte Herstellung von Androst-4~en—3,17~*äion aus Sterinen, nach einem ökonomisch günstigen Verfahren,

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein technologisch einfaches mikrobiologisches Verfahren zur Herstellung von Androst— 4~en-3»17-clion aus leicht zugänglichen Sterinen anzugeben, weiches wesentliche Mängel der bekannten Verfahren, insbesondere die diskontinuierliche Betriebsweise, die stark eingeschränkte Wiederverwendbarkeit der Biomasse und Risikofaktoren wie Sterilitätsprobleme bei der Anzucht und Schwankungen in der Leistungsfähigkeit der zur Fermentation verwendeten Kultur einschränkt oder vermeidet.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe dadurch gelöst, daß man zum Seitenkettenabbau befähigte Mikroorganismen, wie z. B, aus den Gattungen Arthrobacter, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Microbacterium, Nocardia, Protaminobacter, Streptomyces und vorzugsweise aus der Gattung Mycobacterium nach ansich bekannten Methoden immobilisiert, indem man die Zellen an feste Träger, wie z. B. Zellulose und Zellulosederivate adsorbiert, durch Polymerisation in vernetzte Gele, wie z« B. Polyacrylamid oder durch Vernetzung von Polyelektrolyten, wie z. B. Alginaten mit mehr-

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wertigen Kationen, wie z· B₀ A1^J , einschließt und damit kontinuierlich bzw. diskontinuierlich, bei mehrfach wiederholtem Einsatz der immobilisierten Biomasse, Sterine bzw· Derivate von Sterinen fermentiert, die die folgende allgemeine Formel besitzen:;

worin E^ den 8 bis Ί0 Kohlenstoff atome enthaltenden Kohlenwasser—-Stoffrest eines Sterins darstellt und in 22-Stellung eine zusätzliche Doppelbindung besitzen kann, die Bindungen .»..«.« Einfach— oder Doppelbindungen sein können und E₂ Säuerstoffunktionen der allgemeinen Struktur

0, -OE bzw. <w J> CQE_o)_n oder H , ^O^ ^ ⁿ

Stickstof funkt ionen der allgemeinen Struktur = ЖХ mit X = -₂ COOH, -MH-COm₂ oder -KHCOCE₂IT(CH₃>₃ darstellen kann· Dieses Verfahren wird vorteilhaft wie folgt ausgeführt: Die für das Verfahren als Ausgangsstoffe dienenden Sterinderivate gehören zum Stand der Technik.

Die immobilisierten Zellen eines Bakterienstammes wie z. B. Mycobakterium phlei, der in der Hinterlegungsstelle im Zentralinstitut

für Mikrobiologie und experimentelle Therapie der Akademie der Wissenschaften der DDR, 69 Jena, Beutenbergstr. 11 unter der Hummer ШЕТ SG 1026 deponiert ist, oder Мус ob akter ium smegmatis, der in der gleichen Hinterlegungsstelle unter der Nummer IMET H 124 deponiert ist, werden im 500 ml Schüttelkolben in 50 ml 0,01 M !Phosphatpuffer pH 8 aufgenommen (Biomasse 3,5 g Feuchtgewicht) mit 25 mg des Sterinderivates, gelöst in Dimethylformamid, versetzt. Die Fermentation wird 24 h bei 37 ⁰G nach dem Prinzip eines Batch-Verfahrens unter Schütteln durchgeführt.

Die Aufarbeitung des Fermentationsansatzes geschieht in einfacher Weise wie folgt:

Die immobilisierten Zellen werden durch Filtrieren oder Dekantieren vom Fermentationsmedium abgetrennt, welches zur Gewinnung des Androst-4-en-3i17-<äions in bekannter Weise vor oder nach der Hydrolyse des entstandenen Derivates mit Chloroform extrahiert wird·

Die erzielten Ausbeuten liegen im Durchschnitt bei 70 % d. Th. · Die abgetrennten immobilisierten Zellen lassen sich ohne merklichen Aktivitätsverlust mehr als 15 mal im diskontinuierlichen Batch-Verfahren einsetzen·

Kontinuierliche Fermentation:

Xn einem thermostatierten 750 ml Batch-Gefäß werden 150 ml PoIy-.acrylamidgel, welches 13 g feuchte Biomasse einpolymerisiert enthält, mit 150 ml Puffer, der in einer Konzentration von 0_s5 mg/ml mit einem geeigneten Sterinderivat versetzt ist, an der Luft gerührt. Zur kontinuierlichen Fermentation werden mit konstanter Geschwindigkeit z. B. 10 bis 15 ml/Stunde der das Sterinderivat enthaltende Puffer zugepumpt und das Androstendionderivat enthaltende Reaktionsmedium abgezogen.

Die beim Start der kontinuierlichen Fermentation zu erzielende Umsatzrate von 60 bis 70 % d. Th., kann auch noch nach mehr als 14 Tagen Betriebszeit festgestellt werden. Das Androstendion wird in bekannter Weise durch Extraktion und Hydrolyse des Derivates gewonnen.

Für den Fachmann ist es überraschend, daß ein derart extrem sauerstoffbedürftiger komplexer enzymatischer Prozeß, wie es der Abbau der Seitenkette von Sterinen darstellt, mit Mikroorganismen, die sich im immobilisierten Zustand befinden, durchführbar ist, besonders deshalb, da auf dem Steroidgebiet nur einfache Transformationen wie Reduktion, Dehydrierung oder Hydroxylierung mit immobilisierten Mikroorganismen bekannt geworden sind·

Die Mikroorganismen können zum Zeitpunkt eines günstigen physiologischen Zustandes immobilisiert und damit stabilisiert werden· Ebenso wird die Stabilisierung eines bestimmten physikalischchemischen Zustandes begünstigt. Damit wird der mikrobielle Seiten* kettenabbau in einem kontinuierlich arbeitenden Reaktor möglich, wodurch die Biomasse ökonomisch vorteilhafter genutzt wird, Sterilitätsprobleme während der Fermentation gegenstandslos sind und die Reproduzierbarkeit des Verfahrens hinsichtlich Ausbeuten an Androst~4-en~3,17-dion über einen langen Zeitraum gewährleistet ist.

Ausführungsbe i spiele

1» 3»5 g Mycobacterium smegmatis IMET H 124 (feuchte Biomasse) werden in 150 ml 0,01 M Phosphatpuffer pH 8 mit 5 g DEAE-Zellulose 1h verrührt. Nach dein Absaugen und Waschen wird der gesamte feuchte Träger in 50 ml Phosphatpuffer suspendiert und in einen 500 ml Schüttelkolben überführt. Nach der Zugabe von 25 mg 3>3~Äthylendioxycholesi>-5~en· in 1 ml Dimethylformamid wird 24· h bei 37 °C unter Schütteln fermentiert. Nach Filtration des gesamten Kolbeninhaltes wird das 3»3-Äthylendioxyandrost~5«en-17-on durch Ansäuern mit HOl im Filtrat hydrolysiert und das entstandene Androst-4-en-3»17~ dion mit Chloroform extrahiert·

Ausbeute an Androst-4-en-3,17-dion: 50 % d. Th.· Die immobilisierten Zellen werden nach dem Waschen mit Puffer erneut zum Einsatz gebracht·

2. 5 g Mycobacterium smegmatis IMST H 124 (feuchte Biomasse) werden in 15 ml 2%igem NH^-Alginat aufge schlemmt und unter kräftigem Rühren in 100 ml 0,1 M Al₂(SO₄).. bei pH 5 bis 6 ausgefällt» Nach gründlichem Auswaschen der freien Zellen und

Abtrennen kleiner Partikel werden die immobilisierten Zellen, wie in Beispiel. 1 beschrieben, mit 25 mg 3j3-Ä'thylendioxycholest-5-en zum Einsatz gebracht

Ausbeute an Androst-4-en-3,17-dion: 55 % d· Th. ·

3· 3i5 S feuchte Biomasse von Mycobacterium phlei ШЕТ SG 1026 werden, wie in Beispiel 1 beschrieben, an DEAE-Zellulose adsorbiert und mit 3i3-Äthylendioxycholest-5-en als Substrat zum Einsatz gebracht· Ausbeute an Androst-4-en-3j17~dion: 50 % d· Th,·

4· Mycobacterium phlei ШЕТ SG 1026 wird entsprechend dem Beispiel 2 in Aluminiumalginat immobilisiert und mit 3,3-A" thylendioxycholest-5-en als Substrat zum Einsatz gebracht· Ausbeute an Androst-4-en-3,17-dion: 60 % d· Th.·

5· 3,5 g feuchte Biomasse von Mycobacterium phlei BIET SG 1026 worden nach Beispiel 1 an DEAE-Zellulose adsorbiert und nach dem Suspendieren des gesamten feuchten Trägers in 50 ml 0,01 M Phosphatpuffer pH 8 mit 25 mg Cholest-4~en-3-(0-Oarboxymethyl)oxim in 1 ml Dimethylformamid als Substrat versetzt und 24· h bei 37 ⁰C geschüttelt. Nach dem Abtrennen der immobilisierten Zellen wird das !Fermentationsmedium mit 1 N Salzsäure auf pH 2 bis 3 angesäuert und mit Chloroform extrahiert· Die weitere Aufarbeitung des Extraktes geschieht wie folgt: Nach Abdestillieren des Lösungsmittels wird der Rückstand in 25 ml Aceton gelöst, mit 2,5 ml 30%iger Schwefelsäure versetzt und 2 Stunden am Rückfluß gekocht. Nach Neutralisation des Reaktionsmediums mit ca. 2 ml 25%iger Ammoniaklösung und Vertreiben des Acetons im Vakuum wird mit 25 ml Wasser verdünnt und mit Chloroform extrahiert. Der Chloroformextrakt wird mit 1%iger Kaliumkarbonatlösung und Wasser nacheinander gewaschen und eingeengt. Der Rückstand wird in Äther gelöst und bis zur beginnenden Kristallisation eingeengt

Ausbeute an Androst-4-en-3,17-dion: 95 % d. Th..

6. 5 g Mycobacterium phlei TJJET SG 1026 (Feuchtmasse) werden wie in Beispiel 2 in Aluminiumalginat immobilisiert. Das gesarate Material wird in 50 ml 0,01 M Phosphatpuffer pH 8 suspendiert

~ 7 —

und mit 25 mg Cholest-4—en-3-(O-carboxymethyl)oxim versetzt·

Fermentation und Aufarbeitung erfolgen wie in Beispiel 5· Ausbeute an Androst-4-en~3»17-dion: 50 % d. Th..

7· 3,5 g Mycobacterium phlei ШЕТ SG 1026 (Feuchtmasse) werden in 20 ml 0,01 M Phosphatpuffer pH 8 suspendiert, mit 20 ml einer Monomerenlösung, die 2,8 g Acrylamid und 28 mg N,N¹Methylenbisacrylamid enthält, versetzt und unter Stickstoff in Gegenwart von 100 mg N₁N,N¹ ,^Tetramethyläthylendiamin und 50 mg Kaiiumpersulfat (jeweils in 1 ml Puffer gelöst) polymerisiert. Die Reaktion ist bei 10 ⁰C nach 5 bis 10 Minuten beendet·

Das Gel wird bis zu einer Partikelgröße von 0,25 bis 0,5 mm zerkleinert und nach gründlichem Waschen in 50 ml Puffer suspendiert, mit 25 mg Cholest-4— en-3-(0-carboxymethyl)-oxim in 1 ml Dimethylformamid versetzt und 24 h bei 37 ⁰C geschüttelt·

Die Aufarbeitung des Fermentationsmediums erfolgt wie in Beispiel 5 beschrieben

Ausbeute an Androst-4~en~3,17-dion: 70 % d. Th.·

8· Für die kontinuierliche Fermentation werden 13 g feuchte Biomasse Mycobacterium phlei IMST SG 1026 entsprechend dem Beispiel 7 in Polyacrylamid einpolymerisiert.

150 ml des zerkleinerten und gut gewaschenen Geles werden im thermostatierten 750 ml Batch-Gefäß mit 15O ml einer Stammlösung von 0,5 mg Cholest-^—en-3(0-carboxymethyl)-oxim/ml 0,01 M Phosphatpuffer pH 8 (Lösungsvermittler: 2 % Dimethylformamid) bei 37 ⁰C etwa 10 h bis zum Erreichen eines Sub— stratumsatzes von 70 % gerührt. Danach wird mit dem kontinuierlichen Betrieb begonnen, indem mit einer konstanten Geschwindigkeit von 10 bis 15 ml/h Sterinderivat-Stammlösung zugepumpt und die Produktlösung abgezogen werden.

Nach dem Sammeln der abgezogenen Produktlösung erfolgt eine analoge Aufarbeitung, wie im Beispiel 5 beschrieben» Ausbeute an Androst-4~en-3»17-dion: 60 bis 70 % d. Th», sowohl nach dem Start des kontinuierlichen Betriebes als auch nach mehr als 14 Tagen Fermentationszeit.

Claims (4)

Erf indung s ansprüche

1. Verfahren zur Herstellung von Androst—4—en-3*17--dion aus Sterinen durch mikrobiellen Seitenkette η abb au, dadurch gekennzeichnet, daß zum Seitenkettenabbau von Sterinen befähigte Mikroorganismen immobilisiert und damit Sterine bzw. Derivate von Sterinen kontinuierlich bzw. diskontinuierlich bei mehrfach wiederholtem Einsatz der immobilisierten Biomasse fermentiert werden.

2· Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Mikroorganismen aus den Gattungen Arthrobacter, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Microbacterium, Focardia, Protaminobacter, Streptomyces und Мусobacterium zum Einsatz bringt.

3· Verfahren nach Punkt 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß Mikroorganismen durch Adsorption an feste Träger, durch Einpolymerisation in Polymergele oder durch Vernetzung von Polyelektrolyten immobilisiert werden.

4· Verfahren nach Punkt 1 bis 3» dadurch gekennzeichnet, daß man Sterine bzw. Derivate von Sterinen der allgemeinen Formel

worin Ей den 8 bis 10 Kohlenstoff atome enthaltenden Kohlenwasser stoff rest eines Sterins darstellt und in 22-Stellung eine zusätzliche Doppelbindung besitzen kann, die Bindungen .«.... Einfach— oder Doppelbindungen sein können und Rp Säuerst of funkt ionen der allgemeinen Struktur

0, -OE bzw. V. 2PH_O)„ oder

^o— ^{d n}

Stickstoffunktionen der allgemeinen Struktur =*NX mit X = -.0-CH₂-CQOH, -HH-OOMH₂ oder

-KHOOOH₂N(OHo)₃
darstellen kann, zur Fermentation bringt.