DD152581A1

DD152581A1 - Verfahren zur herstellung von 20-carboxypregna-1,4-dien-3-on

Info

Publication number: DD152581A1
Application number: DD21121779A
Authority: DD
Inventors: Peter Atrat; Claere Hoerhold; Michael Buchar; Kira A Koschtschejenke
Original assignee: Peter Atrat; Claere Hoerhold; Michael Buchar; Kira A Koschtschejenke
Priority date: 1979-02-26
Filing date: 1979-02-26
Publication date: 1981-12-02

Abstract

Das mikrobiologische Verfahren zur Herstellung von 20-Carboxypregna-1, 4-dien-3-on dient dem Ziel,diese Verbindung in oekonomisch einfacher Weise herzustellen unter Beachtung der Forderungen nach Wiederverwendbarkeit der Biomasse unter Vereinfachung der Sterilitaetsbedingungen. Durch Abbau der C&ind17!-Seitenkette von Sterinen und deren Derivaten mit immobilisierten Mikroorganismen wird 20-Carboxypregna-1,4-dien-3-on als Endprodukt erhalten.Cholesterin,Ergosterin o.Sitosterin werden beispielsw.mit einer Kultur von Nocardia erythropolis,die durch Adsorption an Feste Traeger,durch Vernetzung von Polyelektrolyten durch mehrwertige Kationen oder durch kombinierte Verfahren immobilisiert wird,nach einem Bath-Verfahren als Voraussetzung fuer einen Reaktor fermentiert. Hierbei wird besonders vorteilhaft der fuer den selektiven Abbau der Seitenkette erforderliche Hemmstoff als Bestandteil der Matrix eingesetzt. Das Endprodukt ist fuer die Synthese pharmazeutisch wertvoller Steroide der C&ind21!-Reihe wie beispielsweise der Kortikoide geeignet und besitzt selbst pharmakologisch interessante Eigenschaften.

Description

Dr^ Peter Atrat

Dr· Cläre Hörhold

Dr« Michael Buchar

Dr · Kira A© Koschtschejenko

Titel der Erfindung

Verfahren zur Herstellung von 20-Carboxypregna-1,4-dien-»3-*on

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von 20** Carboxypregna-1,4-dien«*3**on aus Sterinen durch raikrobielle Um-» Wandlung, 20-Carboxypregna-i,4™dien-3-On kann durch bekannte Verfahren in die pharmazeutisch wertvollen Steroide der Gpi~ Reihe mit einem großen Anwendungsbereich, überführt werden* Die Substanz selbst bewirkt eine Hemmung der Östrogenbiosynthese» Derartige Hemmer kommen in Betracht beispielsweise bei Gymnäkomastiej bei Brustkrebs und für die Pertilitätskontrolle.

Charakteristik der bekannten technischen Lösung

Is ist bekanntj daß Sterine wie z· B* Cholesterin, Sitosterin, Stigmasterin, Campesterin und Ergosterin sowie Derivate dieser Substanzklasse durch Mikro.organismen der Gattungen Arthrobacter, Brevibacterium, Noeardia_f Myoobaoterium, Gorynebacteriuin u· a· unter geeigneten Bedingungen in 20—Carbcxypregna—1,4—dien-3*-On überführt werden» Hierbei besteht das Problem darin, die Verfahrensbedingungen so zu wählen, daß lediglich die Seitenkette der Sterine durch die Mikroorganismen abgebaut wird, der weiterführende Ringskelettabbau aber verhindert wird. Bei den bekannten Verfahren wird dieses Problem im wesentlichen durch drei Prinzipien gelöst« Erstens durch die Anwendung von Mutanten, die zum liiiigskeIettabbau nicht befähigt sind, zweitens durch Zusatz von geeigneten Bnsymhemmern, wie z* B«. Schwermetallverbindungen und Clislaibilcmex'n und drittens dadurch, daß entsprechend substituierte Sterine verwendet v?eruen, die keine Substrate der L?n~ S^iTiO sind, die den. Ringskelettabbau einleiten* Allan Verfahren

gemeinsam ist, daß die als Ausgangsmaterial dienenden Sterine einer wachsenden oder ruhenden diskontinuierlichen Kultur eines Mikroorganismus zugesetzt werden, dessen Zellen in nichtstabilisierter Form im Fermentationsmedium vorliegen*

Die Fermentationsführung unter diesen Bedingungen ist mit folgenden Nachteilen behaftet: Notwendigkeit der sterilen Fermentationsführung im nährstoffreichen Fermentationsmedium, Schwankungen im Gehalt und in der Aktivität der induktiven Enzymsysteme in Abhängigkeit von Veränderungen im Fermentationsmedium, 2. B« durch Abnahme der Konzentration von Hemmer oder Induktor, durch Nährstoffverbrauch, Erhöhung der Ionenkonzentration bei der erforderlichen pH-Regulation u. a«, sowie durch altersbedingte Veränderungen im Zellstoffwechsel, Durch die angegebenen Mängel ist die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse nach den bekannten Verfahren stark beeinträchtigt. Außerdem ist in der Regel die Fähigkeit der Mikroorganismen, die Seitenkette von Sterinen abzubauen, nach der ersten Fermentation stark vermindert, so daß die angezüchtete Biomasse praktisch nur für eine oder höchstens für eine zweite Fermentation genutzt werden kann.

Ziel der Erfindung

Das Ziel der vorliegenden Erfindung ist die verbesserte Herstellung von 20-Carboxypregna—1,4—dien-3-on aus Sterinen nach einem ökonomisch günstigen Verfahren·

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein technologisch einfaches mikrobielles Verfahren zur Herstellung von 20-Carboxypregna-1,4-dien-3—on aus leicht zugänglichen Sterinen anzugeben, welches wesentliche Mängel der bekannten Verfahren, insbesondere die diskontinuierliche Betriebsweise, die starke Erschöpfung der Biomasse nach einer. Fermentation und Risikofaktoren wie Sterilität sprobleme bei der Anzucht und Schwankungen in der Leistungsfähigkeit der zur Fermentation verwendeten Kultur einschränkt oder vermeidet·

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe dadurch gelöst, daß man

Seitenkettenabbau befähigte Mikroorganismen, wie z. B. aus den Gattungen Arthrobacter, Brevibaterium, Corynebacterium und vorzugsweise aus der Gattung Nocardia nach ansich bekannten Methoden immobilisiert, indem man die Zellen an feste Träger, wie z. B. Zellulose und Zellulosederivate adsorbiert oder durch Vernetzung von Polyelektrolyten, wie z· B· Alginaten mit mehr-

wertigen Kationen, wie z, B. Al oder Co einschließt, und damit bei mehrfach wiederholtem Einsatz der immobilisierten Biomasse, Sterine bzw,, Derivate von Sterinen fermentiert, die die folgende allgemeine Formel besitzen:

*4

worin R. für den 8 bis 10 Kohlenstoffatome enthaltenden Kohlenwasserstoffrest eines Sterins steht, der in 22-Stellung eine zusätzliche Doppelbindung besitzen kann, die Bindung . » . о eine Einfach"-»-oder Doppelbindung sein kann und E₂ für Wasserstoff bzw» einen organischen oder anorganischen Säurerest steht·

Das Verfahren wird vorteilhaft wie folgt ausgeführt: Die immobilisierten Zellen eines Bakterienstammes, wie z» B. Nocardia erythropolis, der in der Hinterlegungsstelle im Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie der Akademie der Wissenschaften der DDR, 69 Jena, Beutenbergstr» 11, unter der Nummer IbCET 7185 deponiert ist, wird im 500 ml Schüttelkolben in 50 ml 0,01 M Phosphatpuffer pH 8 aufgenommen (Biomasse 3,5 g Peuchtgewicht) mit 25 mg des Sterins bzw'» eines Sterinderivates, gelöst in Dimethylformamid, versetzt© Gleich-

2+

zeitig wird ein geeigneter Hemmstoff, vorzugsweise Cc -Ionen in einer Konzentration zugesetzt, die so gewählt wird, daß nicht der Seitenkettenabbau, wohl aber der Abbau des Ringskeletts verhindert wird« Dieses geschieht, indem in bekannter Weise eine Kobaltsalslösung zugesetzt wird, besonders vorteilhaft aber da™

2+

durch, indem Co z» B. als Kobaltalginat bzw» —polyacrylat direkt als Bestandteil der Matrix eingesetzt wir.d« Die Fermentation wird 24 h bei 28 ⁰O nach dem Prinzip eines

ma unter Schütteln durchgeführt· Die Aufarbeitung

des Fermentationsansatzes geschieht in einfacher Weise wie folgt: Die immobilisierten Zellen werden durch Filtrieren oder Dekantieren vom Fermentationsmedium abgetrennt_t welches zur Gewinnung des 20—Carboxypregna-1 ,4-dien—3-on- in bekannter V/eise mit verdünnter Mineralsäure angesäuert und mit einem geeigneten Lösungsmittel, wie Äthylacetat oder Chloroform extrahiert wird. Aus dem eingeen^en Extrakt ist nach bekannten Verfahren ein reines Produkt erhältlich.

Die abgetrennten immobilisierten Zellen lassen sich ohne merklichen Aktivitätsverlust mehrfach wiederholt im diskontinuierlichen Batsch-Verfahren einsetzen, womit die wichtigste Voraussetzung für den kontinuierlichen Betrieb im Reaktor erfüllt ist. Pur den Fachmann ist es überraschend, daß ein derart extrem sauerstoffbedürftiger komplexer enzymatischer Prozeß, wie es der Abbau der Seitenkette von Sterinen darstellt, mit Mikroorganismen, die sich im immobilisierten Zustand befinden, durchführbar ist, besonders deshalb, da auf dem Steroidgebiet bisher nur einfache Transformationen, wie Reduktion, Dehydrierung oder Hydroxylierung mit immobilisierten Mikroorganismen bekannt geworden sind«

Durch die Immobilisierung der Mikroorganismen wird es nun möglich, die Nachteile der bekannten Verfahren zu vermeiden. Die Mikroorganismen können zum Zeitpunkt eines günstigen physiologischen Zustandes immobilisiert und damit stabilisiert werden. Ebenso wird die Stabilisierung eines bestimmten physikalischchemischen Zustandes begünstigt· Damit sind Voraussetzungen gegeben, den mikrobiellen Seitenketuenabbau in einem kontinuierlich arbeitenden Reaktor durchzuführen, wodurch die Biomasse ökonomisch vorteilhafter genutzt wird, Sterilitätsprobleme während der Fermentation gegenstandslos sind und die Reproduzierbarkeit des Verfahrens hinsichtlich Ausbeuten an 20-Carboxypregna-1,4-dien-3«on über einen langen Zeitraum gewährleistet ist.

Ausführungsbeispiele

1.2g Foeardia erythropolis, IMET 7185 (feuchte Biomasse), werden in 200 ml Phosphatpuffer. 0,01 M, pH 8 bei Raumtemperatur 1 h mit 4 g DEAE-Zellulose gerührt· Nach wiederholtem Dekantieren und Absaugen baw» Zentrifugieren wird der gesamte Ansatz in 50 ml Phosphatpuffer 0,01 M, pH 8 aufgenommen und mit 25 mg Cholesterin, welches in 1 ml Dimethylformamid gelöst ist soY/ie mit 3 ml 0,1 M Co(HO₃)₂ bei pH 8 versetzt. Die Fermentation wird 24 h bei 28 ⁰C unter Schütteln in einem 50fr ml Kolben durchgeführt· Nach der Umwandlung wird die Fermentationslösung durch Filtration bzw· Zentrifugation von den- immobilisierten Zellen abgetrennt und mit HCl auf pH 2 bis 3 angesäuert· Das 20-Carboxypregna-1,4-dien«3-on wird in bekannter Weise mit Chloroform extrahiert und aufgearbeitet··

Ausbeute: 60 bis 70 # d» Cn· Die adsorbierten Zellen werden ohne merklichen Aktivitätsverlust mehrfach zum Einsatz gebracht·

2* 2 g feuchte Biomasse Noeardiiä erythropolis, IME3? 7185, werden in 5 ml Phosphatpuffer·0,01 M, pH 8 suspendiert und mit 5 ml einer 2 #igen NH.««Alginatlösung in Phosphatpuffer vermischt» Unter kräftigem Rühren wird die Suspension in eine auf pH 5-7 eingestellte Mischung von 20 ml 0,1 M Al₂(S(O, und 20 ml 0,1 M' Co(NOo)₂ eingetropft» Die entstandenen Partikel werden durch wiederholtes Waschen und Dekantieren bzw Absaugen von freien Zellen abgetrennt und wie im Beispiel 1

24·

beschrieben, jedoch ohne weitere Zugabe von Co , zum Einsatz gebracht. Ausbeute an 20-Carboxypregna~1,4—dien-3~On: 10 bis 20 <f> d. lh·

3· Die nach Beispiel 1 an DEAS-Zellulose adsorbierte Biomasse wird in 5 ml Phosphatpuffer suspendiert, mit 10 ml 2 SSiger NHj,-Alginatlösung verrührt und bei pH 5"·7 in ein Gemisch von 20'ml 0,1 M Al₂(SO₄),. und 20 mi 0,1 M Co(N0₃)_? unter intensivem Rühren eingetropft« "Die entstandenen Partikel v/erden in gleicher ?/eise, ѵтіе in Beispiel 2 beschrieben, zum Ein--

satz gebracht.

Ausbeute an 20~Carboxypregna-1^-dien-O-on: 40 bis 50 % d.Th,

4« 2 g feuchte Biomasse Nocardia erythropolis, IMET 7185, werden mit 1 ml Phosphatpuffer 0,01 M, pH 8 verrührt und 10 ml 2 #iges Жа-Polyacrylat suspendierte Die entstandene Mischung wird unter kräftigem Rühren in eine Lösung von 20 ml 0,1 M Al₂(SO.) und 20 ml 0,1 M Co(NO₃) eingetropft· Die Partikel werden, wie in Beispiel 2 beschrieben, behandelt und zum Einsatz gebracht« Ausbeute an 20-Carboxypregna-1,4~dien~3-on: 5 bis 10 $ d» Th.

Claims

Er f i ndung s an s pr ü ehe

ie Verfahren zur Herstellung von 20~Carboxypregna«1,4-аіеп-З-оп aus. Sterinen durch mikrobielle Umwandlung? gekennzeichnet da-* durch,daß zum Seitenkettenabbau'von Sterinen befähigte Mikroorganismen nach ansich bekannten Verfahren immobilisiert und damit Sterine bzw* berivate von Sterinen bei mehrfach wiederholtem Einsatz der immobilisierten Biomasse in Gegen— wart eines Hemmers, vde Co*" fermentiert werden»
2* Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß man Mikroorganismen aus den Gattungen Arthrobacter, Bacillus, Bre·· vibaeterium, Corynebaeteriuin, Mierobacteriuio, Hocardiaj Protaminba-cter und Mycobacterium zum Einsatz bringt*
3» Verfahren nach den Punkten 1 und 2_t gekennzeichnet dadurch, dsß Mikroorganismen durch Adsorption an feste 'Träger= durch Vernetzimg von Polyelektrolyten oder anderen Methoden immobilisiert werden*
4* Verfahren nach den Punkten 1 bis 3, gekennzeichnet dadurch^, daß der Hemmer,, z· B. Co « direkter Bestandteil des Trägers istj z· B* als Co-Alginat, Co-Pölyacrylat usw*«
5* Verfahren nach Punkt 1 bis 4$ gekennzeichnet dadurch, daß Sterine bzw« deren Derivate der allgemeinen lormel eingesetzt werden« J**?

worin R. den 8 bis 10 Kohlenstoffatome enthaltenden Kohlenwasserstoffrest eines Stering darstellt und in 22«Stellung eine zusätzliche Doppelbindung besitzen kann, die Bindung £__»__·—& eine Einfach— oder Doppelbindung sein kann und Rg für Wasserstoff bzw« einen anorganischen bzw« organischen Saarereot steht«