DK159277B - Analogifremgangsmaade til fremstilling af produkter, der er anvendelige til behandling af melanomer - Google Patents

Description

O

DK 159277 B

Den foreliggende opfindelse angår en analogifremgangsmåde til fremstilling af produkter, der er anvendelige til behandling af melanomer.

I de ældre franske ansøgninger nr. 78/27838 og 79/24655 5 (tillæg til førstnævnte) beskrives fremstillingen af anti-can-cer-produkter, de såkaldte konjugater, der fås ved kobling ved covalent binding af A-kæden i ricin til en proteinstruktur, såsom et antistof, et immunoglobulin eller et immunoglobulin-fragment, der selektivt kan genkende et bestemt antigen på overfla-10 den af celler, som man ønsker at nå, såsom cancerceller. Den væsentligste egenskab af disse konjugater er at være specifikke cytotoksiske midler over for tilsigtede mål-celler... .

Anvendelsen af antistoffer rettet mod differentiations--antigener hos cancerceller har allerede gjort det muligt at 15 fremstille konjugater med en betydelig specificitet over for mål-cellerne. Karakteriseringen af antigener knyttet til cancerceller og fremstillingen af monoklone antistoffer rettet mod disse antigener muliggør udvikling af konjugater, der har en forøget specificitet overfor celler, der bærer disse antigener.

20 Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af produkter, der kan anvendes som medikamenter, nemlig såkaldte konjugerede produkter fremstillet ud fra A-kæ-den i ricin og et humant monoklont antistof mod melanomer.

Ved konjugater forstås syntetiske blandingsmolekyler, 25 hvori A-kæden af ricin via en covalent binding af disulfidty-pen er knyttet til et humant antistof mod melanomer, som selektivt kan genkende et antigen, som er knyttet til cancerceller.

Fremstilling af A-kæden af ricin i ren form er beskrevet i ældre patentskrifter. Fremstillingen af monoklone anti-30 stoffer rettet mod humane melanomer er omtalt i den videnskabelige litteratur (der kan især henvises til Proceedings of the National Academy of Sciences, ]Ί_(Α) , 2183-2187, 1980).

Til fremstilling af konjugaterne er det nødvendigt, at koblingsproteinerne hver især bærer mindst ét svovlatom, som 35 naturligt er i stand til eller kunstigt er bragt i stand til

O

2 DK 159277 B

at danne den ønskede disulfidbinding.

A-kæden af ricin indeholder naturligt et enkelt svovlatom, der muliggør den ønskede kobling. Det er svovlatomet i thiolfunktionen i cysteinresten, der findes i A-kæden og 5 sikrer bindingen af denne A-kæde til B-kæden i det komplette toksin.

Antistoffet mod melanomer indeholder hverken en fri thiolfunktion eller andre svovlatomer, der kan anvendes til koblingen. I immunoglobulinmolekylet må der derfor kunstigt 10 indføres et eller flere svovlatomer, som senere kan bringes til at indgå i den disulfidbinding, der skal etableres med et eller flere molekyler af A-kæden af ricin.

Ifølge opfindelsen gennemføres fremstillingen af konju-gatet ved at bringe A-kæden af ricin, der bærer sin frie 15 SH-gruppe, i nærværelse af antistoffet, hvori gruppen SH kunstigt er indført i aktiveret form, især i form af et blandet disulfid med en egnet svovlholdig organisk gruppe.

Fremstillingen af konjugatet kan gengives ved følgende reaktionsskema:

20 RA-SH + AC-S-S-X -> RA-S-S-AC + XSH

hvori RA betyder A-kæden i ricin, AC betyder antistoffet, og X betyder den aktiverende gruppe.

Antistoffet substitueret med et aktiveret svovlatom fremstilles ud fra antistoffet selv ved substitution ved hjælp 25 af en reaktionsdygtig forbindelse, der selv bærer et aktiveret svovlatom, ifølge følgende reaktionsskema:

AC + Y-R-S-S-X -> AC-R-S-S-X

hvori AC betyder antistoffet, Y betyder en funktion, der muliggør covalent fiksering af den reaktionsdygtige forbindelse til 30 proteinet, R betyder en gruppe, der samtidig kan bære substi-tuenterne Y og -S-S-X, og X betyder den aktiverende gruppe.

Den funktionelle gruppe Y er en funktion, der kan bindes covalent til en af de funktioner, der bæres af sidekæderne af de aminosyrer, der danner det protein, som skal substitue-35 res·. På tale blandt disse kommer især de terminale aminfunktio-ner i ly sylgrupperne, der findes i proteinet.' I dette'tilfælde kan Y især betyde: 3

O

DK 159277 B

- en carboxylgruppe, der kan bindes til aminfunktio-nerne i proteinet i nærværelse af et koblingsmiddel, såsom et carbodiimid og især et vandopløseligt derivat som l-ethyl-3--(3-diethylamino-propyl)-carbodiimid, 5 - et carboxylsyrechlorid, der kan reagere direkte med aminfurktionerne til acylering af disse, - en såkaldt aktiveret ester, såsom en ortho- eller para-nitro- eller -dinitrophenylester eller også en N-hydroxy-succinimidester, der reagerer direkte med aminfunktionerne til 10 acylering af disse, - et indre anhydrid af en dicarboxylsyre, f.eks. rav-syreanhydrid, der reagerer spontant med aminfunktionerne til dannelse af amidbindinger, rø rt 1 i - en iirtide s ter gruppe -C-OR , hvori R betyder en alkyl-15 gruppe, der reagerer med amingrupperne i proteinet ifølge følgende reaktionsskema:

NH NH

Prot-NH2 + R10-C-R2 -> Prot-NH-C-R2 + R1OH

20 X betyder en funktionel gruppe, der kan reagere med en fri thiolgruppe. X kan især betyde en 2-pyridyl- eller 4-py-ridylgruppe, der eventuelt er substitueret med en eller flere alkylgrupper, halogenatomer eller carboxylgrupper. X kan også betyde en phenylgruppe, der fortrinsvis er substitueret med en 25 eller flere nitro- eller carboxylgrupper. X kan endvidere betyde en alkoxycarbonylgruppe, såsom en methoxycarbonylgruppe.

R betyder enhver gruppe, der samtidig kan bære substi-tuenterne Y og S-S-X. Den bør vælges således, at den ikke indeholder funktioner, der under de senere reaktioner kan interfe-30 rere med de anvendte reaktanter og de syntetiserede produkter.

Især kan gruppen R være en gruppe -(CH9) -, hvor n ligger mellem

3 1 ' λ Δ n A

1 og 10, eller en gruppe R -CH-CH-R , hvori R4 betyder hydrogen eller en alkylgruppe med 1-8 carbonatomer, og R3 betyder en substituent, der er indifferent over for de senere anvendte 5 5 35 reaktanter, såsom en carbamatgruppe -NH-CO-OR , hvori R betyder en ligekædet eller forgrenet alkylgruppe med 1-5 carbona-tomer og især en tert.butylgruppe.

O

4 DK 159277 B

Omsætningen af forbindelsen Y-R-S-S-X med immunoglo-bulinet gennemføres i flydende homogen fase, oftest i vand eller en pufferopløsning. Når opløseligheden af reaktanterne kræver det, er det muligt at sætte indtil 20 vol.-% af et 5 vandblandbart organisk opløsningsmiddel, såsom en alkohol og især tert.butanol, til reaktionsmediet.

Omsætningen gennemføres ved omgivelsestemperatur i et tidsrum, der varierer fra nogle timer til 24 timer, hvorefter man ved en dialyse kan fjerne stoffer med lav molekylvægt, især 10 overskuddene af reaktanter. Denne fremgangsmåde gør det muligt at indføre et antal substituerende grupper pr. mol protein på mellem 1 og 5, hvis proteinet er et immunoglobulin af klassen G, og på mellem 1 og 15, hvis immunoglobulinet er af klassen M.

15 Ved at anvende sådanne forbindelser realiseres koblin gen med A-kæden af ricin ved at bringe de to proteiner sammen i vandig opløsning ved en temperatur, der ikke overskrider 30°C, i et tidsrum, der varierer fra nogle timer til et døgn. Den fremkomne opløsning dialyseres til fjernelse af stoffer 20 med lav molekylvægt, hvorefter konjugatet kan renses ved forskellige kendte metoder.

Opfindelsen illustreres nærmere ved det følgende eksempel.

25 Eksempel 1.

Konjugat fremstillet ud fra et humant antistof mod melanomer (antistof rettet mod antigenet P 97), der er substitueret med en aktiveret disulfidgruppe, og A-kæden af ricin. a) Humant_antistof_mod_melanomer__(anti-P_97)__ 30

Dette antistof fremstilles ifølge metoden, der beskrives i Proceedings of the National Academy of Sciences, 77(4), 2183-2187.

Det underkastes en slutrensning ved dialyse mod PBS- -puffer (10· mMphosphat, 140 mM natriumchlorid, pH-værdi 7,4).

35 A-kæden af ricin fremstilles og renses som anført i de

O

5 DK 159277 B

ovennævnte ældre franske ansøgninger (nr. 78/27838 og dens tillæg nr. 79/24655).

c) ålSiiY®l!=t_i}™32£_å£tistof_mod_melanomer_

Til 0,5 ml af en opløsning på 20 mg/ml af 3-(2-pyridyl-5 -disulfanyl)-propionsyre i tert.butanol sættes 0,2 ml af en opløsning på 60 mg/ml af l-ethyl-3-(3-dimethylamino-propyl)--carbodiimid, og blandingen henstilles i 3 minutter ved omgivelsestemperatur .

30 yuliter af den således fremkomne opløsning sættes til 1,66 ml af en opløsning på 2,4 mg/ml af antistof mod melanom i PBS-puffer. Der inkuberes i 20 timer ved 30°C.

Derefter dialyseres opløsningen kontinuerligt i 3 dage mod 21 liter PBS-puffer ved 4°C. Der fås på denne måde 4 mg aktiveret antistof ved en koncentration på 2,3 mg/ml.

15

Ved spektrofotometrisk titrering ved 343 nm af pyri-din-2-thionet, der frigøres ved udveksling med det reducerede glutathion konstateres, at der er fremkommet et antistof, der bærer 2,6 aktiverende grupper pr. mol antistof.

20 Kon^ugat

Til 1,3 ml af en opløsning af aktiveret antistof i PBS-puffer (koncentration 2,3 mg/ml, dvs. 3 mg aktiveret antistof) sættes 0,52 ml af en opløsning af A-kæden af ricin i den samme puffer (koncentration 5,8 mg/ml), og der inkuberes ved 25 25°C i 20 timer.

Reaktionsblandingen chromatograferes på en søjle af "Sephade^Sb 100"-gel. I hver fraktion bestemmes koncentrationen af antistof ved spektrofotometri ved 280 nm og koncentrationen af A-kæde ved dens evne til at inhibere proteinsyntese 30 målt på et acellulært system. De identiske fraktioner, som indeholder konjugatet, forenes, og der fås på denne måde ca.

1 mg konjugat ved en koncentration på 0,2 mg/ml.

Analytiske bestemmelser viser, at opløsningen indeholder 50 yug/ml af biologisk aktiv A-kæde, dvs. ca. 1,4 mol 35 A-kæde pr. mol antistof.

En undersøgelse gennemført ved cytofluorometri har desuden vist, at det anvendte antistof mod melanomer, det

O

6 DK 159277 B

tilsvarende aktiverede antistof og konjugatet af dette antistof med A-kæden af ricin udviser meget nærliggende fluorescens-histogrammer, som bekræfter, at antistoffet ikke har undergået nogen væsentlig ændring under de aktiverings- og 5 koblingsreaktioner, som det er blevet underkastet, og især at det i konjugatet forbliver i stand til at genkende antigenet P 97, som det er rettet mod.

Konjugatet ifølge opfindelsen, som er fremstillet som beskrevet ovenfor, er blevet undersøgt for sine biologiske 10 egenskaber og især sin virkning mod cancer.

1) Inhibering af proteinsyntese

Den fundamentale biologiske egenskab af A-kæden af ricin er at inhibere den cellulære proteinsyntese ved at ændre ribosom-underenheden 60 S.

15 Der er her anvendt en cellulær model. Ved denne prøve måles virkningen af de undersøgte stoffer på inkorporeringen 14 af C-leucin i cancerceller i kultur.

De anvendte celler tilhører cellelinien M 1477, der hidrører fra et humant melanom, som bærer antigenet P 97.

2o Efter trypsinering præinkuberes disse celler i mindst 24 timer for at tillade gendannelse af de overflade-antigener, som eventuelt er blevet ændret. Efter tilsætning af stoffet, der skal undersøges, gennemføres en ny inkubering. Efter inkube- 14 ringen måles graden af inkorporering af C-leucin i de således 25 behandlede celler.

Denne måling gennemføres ifølge en metode, der svarer til den teknik, der beskrives i Journal of Biological Chemistry 249(11), 3557-3562, 1974, idet sporstoffet "^C-leu-cin anvendes til at bestemme omfanget af proteinsyntesen. Be-30 stemmeisen af den inkorporerede radioaktivitet udføres her på hele celler isoleret ved filtrering.

Ud fra disse bestemmelser kan der optegnes dosis/virk-nings-kurver, idet der ad abscissen afsættes koncentrationen af de undersøgte stoffer og ad ordinaten inkorporeringen af 14 35 C-leucin udtrykt i procent af kontrolcellers inkorporering i fraværelse af det undersøgte stof.

7 DK 159277 B

O

På denne måde kan der for hvert stof bestemmes den 14 koncentration, der inhiberer inkorporeringen af C-leucin 50% (CI50).

Resultaterne, der opnås med konjugatet, der er frem-5 stillet ifølge eksemplet ovenfor, (ITHM) er vist i fig. 1 på den vedføjede tegning. I denne figur er der ligeledes vist de kurver, der fås med henholdsvis ricin (R), A-kæden af ri-cin (AR) og et konjugat af A-kæden af ricin og dinitrophenyl-gruppeholdigt antistof (DS 10), hvilket konjugat ikke ud-10 viser nogen affinitet til de undersøgte celler.

Det fremgår af denne figur, at det undersøgte konjugat (ITHM) har en kraftig cytotoksisk aktivitet (CI^q=. 5 x 10 %i) , der er ca. 400 gange større end aktiviteten af A-kæden af ricin.

15 Desuden har anti-DNP-konjugatet (DS 10) ingen virkning på cellerne M 1477 indtil den højeste anvendte koncentration — fi (10 M) . Derimod viser det samme konjugat DS 10 sig at være cyto- -9 toksisk med en CI^Q-værdi nær 10 M, hvis det bringes i kontakt med de samme celler M 1477, som i forvejen kunstigt er 20 blevet bragt til at bære DNP-grupper. Disse to sidstnævnte resultater viser den specifikke karakter af den cytotoksi-ske aktivitet af konjugatet ITHM.

2) Inhibering af dannelsen af kolonier

Cellerne fra en kultur af melanom M 1477 fjernes fra 25 deres underlag med en opløsning af Versene (PBS-puffer indeholdende ethylendiamintetraeddikesyre) eller ved trypsinering.

4

Disse celler podes i en mængde på 2 x 10 celler pr. petriskål med en diameter på 5 cm, der indeholder følgende kulturmedium: i

Medium RPMI 1640 (Merieux), hvortil der er sat 2mM glu-30 tamin, 2 g/liter natriumhydrogencarbonat, 15% inaktiveret kalvefosterserum (Seromed) og antibiotika (penicillin, streptomycin og amphotericin B).

Efter 24 timer behandles cellerne med forskellige koncentrationer af konjugatet, der skal undersøges.

35 Til sammenligning gennemføres den samme forsøgsrække med dels ricin, dels A-kæden af ricin og endelig med et konjugat, der er uspecifikt over for denne cellelinie (konjugat 8

O

DK 159277 B

mellem A-kæden af ricin og et anti-DNP-antistof (DS 10).

Efter yderligere 24 timer fjernes kulturmediet og erstattes med frisk medium med samme sammensætning, men uden cytotoksisk stof.

5 10-15 dage senere bestemmes antallet af udviklede ko lonier efter farvning med en opløsning af krystalviolet ved hjælp af en automatisk kolonitæller (system Artek 880).

Denne metode tillader påvisning af en så ringe mængde som 10 levedygtige celler pr. skål, således som det har kunnet 10 fastslås ved anvendelse af kontrolkulturer. Det er ligeledes blevet påvist, at dannelsen af kolonier er strengt proportional med begyndelseskoncentrationen af celler, i det mindste i området 10^-10^ celler pr. ml.

De opnåede resultater er vist i fig. 2, hvor der ad 15 ordinaten og i logaritmiske koordinater er afsat antallet af kolonier pr. skål og ad abscissen koncentrationen af tilsat stof. Forsøgene er gennemført med ricin (R), A-kæden af ricin (AR) og konjugatet ifølge opfindelsen (ITHM).

Konjugatet ITHM udviser en høj aktivitet, eftersom 20 den sidste melanomcelle dræbes ved en koncentration på ca.

-9 2 x 10 M af konjugatet. Denne koncentration er helt sammenlig- -9 nelig med koncentrationen af ricin (1 x 10 M), medens man skal — 6 op på 10 M for A-kæden af ricin for at opnå den samme virkning. Det kan ligeledes bemærkes, at konjugatet DS 10 ikke

O

25 har nogen aktivitet indtil en koncentration på 2 x 10 M,.som er den højeste, ved hvilken det er blevet undersøgt.

Resultaterne af dette forsøg bekræfter fuldstændig resultaterne af forsøget med inhibering af proteinsyntese.

Konjugaterne fremstillet ifølge opfindelsen udviser 30 således en kraftig specificitet af virkningen over for cellelinier af humant melanom. De kan derfor anvendes inden for humanterapien til behandling af melanomer og eventuelt andre sygdomstilstande, eventuelt cancersygdomme, som er følsomme over for det anvendte antistof.

35 Disse konjugater formuleres således, at de kan anvendes til injektion. De kan enten anvendes alene eller i forbindelse

9 DK 159277 B

O

med en anden behandling af den pågældende cancersygdom og især sammen med andre medikamenter, der er immunitetsundertrykkende med det formål at forsinke og svække patientens naturlige immunreaktion over for det fremmed-protein, som konjugatet 5 udgør.

Med henblik på at eliminere alle cancerceller bør behandlingen gennemføres med en tilstrækkelig dosis af konjugatet, og behandlingens varighed bør bestemmes i hvert enkelt tilfælde i afhængighed af patienten og naturen af den sygdoms-10 tilstand, der skal behandles.

15 20 25 30 35

Claims (2)

1. Analogifremgangsmåde til fremstilling af produkter, der især er nyttige i medikamenter, som er anvendelige til behandling af melanomer, og indeholder et aktivt stof, som er et mo- 5 lekyle, hvori A-kæden af ricin ved en covalent binding af di-sulfidtypen er knyttet til det humane antistof anti-P97 mod melanomer, kendetegnet ved, at man omsætter A-kæden af ricin, hvilken kæde kan gengives ved formlen RA-SH, med et derivat af antistoffet AC med formlen AC-S-S-X, hvori X betyder 10 en aktiverende gruppe..

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at X betyder en gruppe, der kan reagere med en fri thiol-gruppe, især en eventuelt substitueret 2-pyridyl- eller 4-pyri-dylgruppe, en phenylgruppe eller en alkoxycarbonylgruppe. 15 20 25 30 35