DD204945A5

DD204945A5 - Verfahren zur herstellung eines komplexes fuer die hemmung der proliferation und migration von tomorzellen

Info

Publication number: DD204945A5
Application number: DD82245159A
Authority: DD
Inventors: Richard J Douthart; Walter J Kleinschmidt; Richard M Schultz
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 1981-11-23
Filing date: 1982-11-23
Publication date: 1983-12-14
Also published as: DK519682A; RO85130A; BG37077A3; ES517581A0; PL239178A1; AR229715A1; CA1190492A; GB2110220B; IL67316A0; RO85130B; CS836982A2; GR77032B; AU9036082A; EP0080357A1; GB2110220A; PT75879B; PT75879A; ES8401986A1; NZ202454A

Abstract

Beschrieben wird ein Verfahren zur Herstellung eines Komplexes fuer die Hemmung der Proliferation und Migration von Tumorzellen, das darin besteht, dass man eine doppelstraengige RNA mit einem Aminoglycosid, das kein Neomycin ist und das wenigstens fuenf ionisierbare Stickstoffatome enthaelt, in solchen Mengen verbindet, dass sich ein Molverhaeltnis aus Aminoglycosid und doppelstraengigem RNA Phosphor von wenigstens 1 : 1 ergibt. Als Aminoglycosid wird vorzugsweise Apramycin oder insbesondere Tobramycin verwendet. Die doppelstraengige RNA stammt vorzugsweise von Penicillium chrysogenum.

Description

Titel der Erfindung

Verfahren zur Herstellung eines Komplexes für die Hemmung der Proliferation und Migration von Tumorzellen.

Anwendungsgebiete der Erfindung

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von Komplexen aus bestimmten Aminoglycosiden und natürlicher oder synthetischer doppelsträngiger RNA , die sich zur Hemmung der Proliferation und Migration von ^Δ-' Tumor zellen eignen..

Die Komplexe enthalten eine natürliche oder synthetische doppelsträngige RNA (dsRNA) und ein Aminoglycosid mit wenigstens 5 ionisierbaren Stickstoffatomen, wobei das

Aminoglycosid und die doppelsträngige RNA in einem Molverhältnis von Aminoglycosid zu doppelsträngiger Phosphor RNA von wenigstens 1:1 vorhanden ist.

Die Herstellung dieser Komplexe erfolgt durch Vermischen von dsRNA und Aminoglycosid in Mengen, die einen Komplex mit dem gewünschten Molverhältnis ergeben.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Interferon ist ein in der Natur vorkommendes antivirales Protein, das von den meisten Zellen nach Stimulation durch eine Virusinfektion oder durch sonstige Substanzen gebildet wird, die als sogenannte Interferoneinleiter bekannt sind. Es ist seit langem bekannt, daß Interferon ein antivirales und/oder antitumorales Mittel mit breitem Wirkungsspektrum ist.

Doppelsträngige RNA (dsRNA)ist unabhängig davon, ob es sich hierbei um ein Naturprodukt oder ein Syntheseprodukt, wie Polyriboinosinsäure-Polyribocytidilsäure (Poly I : Poly C), handelt, als hervorragender Einleiter von Interferon bekannt. Leider sind der Anwendung von sowohl natürlicher als auch synthetischer dsRNA starke Grenzen gesetzt, weil diese Säure durch die in den Seren verschiedener Tiere, insbsondere der Primaten, vor-λλ handenen Nucieasen rasch abgebaut wird. Dieser enzymatische Abbau von dsRNA tritt besonders in Humanserum auf, und hierzu wird beispielsweise auf Biochem. and Biophys. Res. Comm. 84, (1978), 809 bis 815 hingewiesen,

Qc Der rasche enzymatische Abbau von dsRNA muß daher verhindert oder wesentlich verringert werden, wenn man dsRNA als Einleiter von Interferon bei Primaten, insbesondere beim Menschen, verwenden möchte.

3Q Es ist bereits versucht werden, die interferoninduzierende Wirksamkeit von dsRNA beispielsweise durch Stabilisierung gegenüber einem enzymatischen Abbau nach verschiedenen Methoden zu verbessern.

So wird beispielsweise in Infection and Immunity 14, (1976), 318 bis 319 eine Stabilisierung von Poly I:poly C gegenüber einem enzymatischen Abbau unter Verwendung von Poly-L-lysin und Carboxymethylcellulose beschrieben.

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In Ann. N.Y Acad. Sei 173 (1970) 657 bis 667 wird berichtet, daß sich die Stimulierung des Interferonmechanismus in Gewebekulturen mittels Poly I:Poly C durch Zusatz von Substanzen verbessern läßt wie Neomycin, Streptomycin, Diethylaminoethyldextran (DEAE-Dextran),methyliertem Albumin, Protamin, Histon und Collistin. Neomycin und Protamin haben jeweils bei Verabreichung an Mäuse in Verbindung mit Poly I:Poly C keinen Einfluß auf die Menge an zirkulierendem Interferon. DEAE-Dextran ergibt dagegen eine eindeutige Verbesserung der Interferonaktivität bei getrennter Verabreichung von Poly I:Poly C.

Aus Proc. Soc. Exp_. Bio!., and Med. 132 (1969) 212 bis '5 218 gehen Messungen über den Einfluß mehrerer Polyamine in Verbindung mit Poly I:Poly C hervor. Von den insgesamt untersuchten zehn Polyaminen haben fünf eine gewisse Wirksamkeit bei der Stabilisierung von Poly I:Poly C in Gegenwart von RNase gezeigt. Beim Großteil der Untersuchungen wurde Neomycin verwendet, wobei hier dann als Schlußfolgerung angegeben wurde, daß der "Einfluß von Neomycin" vollständig auf eine in vitro Aktivität bei einer bestimmten Zellart beschränkt war und daß diese Verbindung für eine praktische Anwendung bei Mensch oder

^ΔΌ Tier weder zur Verstärkung von Poly I:C noch zur Reduktion von dessen Toxizität in Frage kommt ("effect of neomycin was entirely limited to in vitro activity in one particular kind of cell and showed no potential for practical utilization in human and animal application

either in potentiation of poly I:C activity or in reduction of its toxicity") (Seite 217).

Aus Proc. Soc. Exp. Biol and Med. 133, (1970) 439 bis 444 qeht hervor, daß Humanplasma zu einem raschen enzy-

matischen Abbau von Poly IrPoIyC befähigt ist, was im Gegensatz zum entsprechenden Verhalten von Hasenserum steht. Weiter wird darin angegeben, daß das Abbauverhalten von verdünntem (15%igem) Humanplasma durch Neomycin

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eliminiert werden kann

Es ist weiter auch bereits bekannt, daß sich dsRNA als Antitumormittel verwenden läßt. Gemäß Proc. Nat. Acad.Sci. 62 (1969), 357 bis 362 hemmt synthetisch hergestellte dsRNA das Tumorwachstum bei Mäusen Mach Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 130, 126 bis 128 (1969)ist synthetisch erzeugte dsRNA wirksam bei der Behandlung von Leukämie bei Mäusen. Gemäß Science 167, 205 bis 207 (1970) hemmt synthetisch hergestellte dsRNA eine chemisch hervorgerufene Tumorbildung auf der Haut von Mäusen.

Aufgabe der Erfindung

Wie obige Ausführungen zeigen, sind dem Einsatz von dsRNA, sei es in natürlicher Form oder in synthetisch hergestellter Form, infolge des raschen Abbaus durch Nucleasen starke Grenzen gesetzt, und Aufgabe der Erfindung ist daher die Schaffung von Möglichkeiten durch die

sich dsRNA wirksam stabilisieren läßt.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Die obige Aufgabe wird nun erfindungsgemäß durch Komplexe nc aus bestimmten Aminoglycosiden und natürlicher oder synthetischer dsRNA gelöst, die sich durch die besonders vorteilhaften Eigenschaften auszeichnen, daß sie (1) peritoneale Makrophage activieren können und (2) die Wirksamkeit von dsRNA gegenüber Tumorsystemen unter Einschluß hochrefraktärer Tumore, wie des Madison Lungentumors, verbessern. Diese Komplexe ergeben eine Potenzierung der Beeinflussung des Tumors gegenüber der Verwendung von dsRNA allein. Dieser Potenzierungseffekt ist völlig überraschend, da er anscheinend überhaupt nicht in Beziehung steht zu einer Hemmung des durch Nuclease vermittelten Abbaus von dsRNA. Dies zeigt sich an der

4 5 15 9

Tatsache, daß die Potenzierung sogar in Systemen mit niedrigem Gehalt an dsKNase auftritt, nämlich in Systemen bei denen kein darstellbarer Unterschied zwischen dem Maximum an durch dsRNA allein hervorgerufenen Interferontitern und dem Maximum an Titern besteht, das von einem Komplex aus Amxnoglycosiden und dsRNA erzeugt wird. Die in den vorliegenden Komplexen verwendete dsRNA kann synthetisch hergestellt sein, und es kann sich hierbei daher beispielsweise um Poly I:Poly C, Poly A: Poly U oder Poly G:Poly C handeln. Genausogut kann die dsRNA jedoch auch natürlichen Ursprungs sein, und eine solche dsRNa wird bevorzugt. Zu den besonderen Quellen für natürliche dsRNA gehören Virenteilchen, wie sie in bestimmten Stämmen von Peniciliium chrysogenum, Penicillium funiculosum, Peniciliium stoloniferum, Aspergillus niger, Aspergillus foetidus oder 06 Bacteriophag zu finden sind.

Ein zur Herstellung von dsRNA bevorzugter Stamm ist Peniciliium chrysogenum. dsRNA läßt sich unter Anwendung bekannter Methoden herstellen und isolieren, und in diesem Zusammenhang wird beispielsweise lediglich hingewiesen auf US-PS 3-597 318 und US-PS 3 582 469.

Die zur Hemmung der Proliferation und Migration von Tumorzellen geeigneten Komplexe enthalten dsRNA und wenigstens ein Aminoglycosid. Die verwendbaren Aminoglycoside haben wenigstens fünf .ionisierbare Stickstoffatome in ihrer Struktur. Zu Beispielen für solche Aminoglycoside, die die erforderliche Anzahl an ionisierbaren Stickstoffatomen enthalten, gehören Neomycin (6), Tobramycin (5), Kanamycin B (5),Gentamycin {5) oder Apramycin (5). Vorzugsweise werden Aminoglycoside verwendet, die fünf ionisierbare Stickstoffatome enthalten, und von diesen sind Tobramycin und Apramycin besonders bevorzugt, wobei wiederum Tobramycin ganz besonders

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bevorzugt ist.

-6-

Die Verhältnismengen, in denen dsRNA und Aminoglycosidin den erfindungsgemäßen Komplexen vorhanden sind, werden durch die Verhältnisse B/P bestimmt, worin B die Molmenge an Aminoglycosid bedeutet und P der Molmenge an dsRNA Phosphor entspricht. Zur Erzielung der gewünschten Wirksamkeit gibt es zwar keinen oberen Grenzwert für das Verhältnis B/P, doch muß dieses Verhältnis wenigstens etwa 1:1 ausmachen,

Das bevorzugte Verhältnis B/P beträgt etwa 12:1 bis etwa 1:1, und dieses Verhältnis liegt insbesondere zwischen etwa 9,1 und etwa 6:1.

Im folgenden wird ein allgemeines Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Komplexes beschrieben. Zu diesem Zweck löst man lyophilisierte dsRNA in einer Pufferlösung, die 0,02 molar an Tris und 0,1 molar an NaCl ist und einen pH-Wert von 7,0 hat. Die Lösung wird über Nacht gegen das gleiche Puffersystem dialysiert. Beim gesamten Verfahren werden durch Ausheizen steril gemachte Glasgefäße verwendet,, und alle verwendeten Puffer werden zur Sterilisation durch einen 4 5 μ-,großen Filter aus Polyethylen und Polypropylen (Nalgene) filtriert. Für alle Lösungen verwendet man pyrogenfreies doppelt destilliertes Wasser, um jede mögliche Endotoxinkontaminierung möglichst gering zu halten.

Die Konzentration der dsRNA Lösung wird aufgrund ihres UV-Spektrums auf folgender Basis bestimmt: 44,7 χ OD₂₆₀ = Microgramm dsRNA/ml.

_Für penicillium chrysogenum dsENA wird die Molmenge an RNA Phosphor beispielsweise anhand der optischen Dichte (OD) bei 260: nur unter Anwendung eines Extinktionskoeffizienten von 7200 bestimmt. Die Extinktionskoeffizienten anderer

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' natürlicher oder synthetischer doppelsträngiger RNA können der Literatur entnommen werden oder lassen sich unter Anwendung üblicher Verfahren bestimmen, und anhand dieser Extinktionskoeffizienten bestimmt man dann die Molkonzentration an Phosphor dsRNA.

Erforderlichenfalls läßt sich die dsRNA Lösung mit py-

rogenfreiem Puffer verdünnen, um hierdurch die Bildung

eines Komplexes mit dem gewünschten Verhältnis B/P zu '" . erleichtern.

Unter Verwendung des gleichen Puffers, wie er auch zur Bildung der dsRNA Lösung eingesetzt wird, stellt man eine Vorratslösung des jeweiligen Aminoglycosids her. Man '^ berechnet die Molkonzentration des Aminoglycosids in Form der freien Base. Für diese Bestimmung läßt sich (a) der bekannte Wert für die Wirkungsstärke oder (b) die chemische Struktur des jeweiligen Aminoglycosids heranziehen.

Im Anschluß daran stellt man den pH-Wert der Vorratslösung on

des Aminoglycosids unter Verwendung von 1 η Chlorwasserstoff säure sorgfältig auf 7,0 ein.

Anteile der in obiger Weise gebildeten Lösungen von dsRNA und Aminoglycosid vermischt man in solchen Mengen mit-

einander, daß sich ein Komplex mit dem gewünschten Verhältnis von B/P ergibt.

Der erhaltene Komplex kann als solcher verwendet werden, und in einem solchen Fall wird er vor seinem eigentlichen

Einsatz etwa eine Stunde inkubiert. Wahlweise kann man

. den Komplex auch isolieren und in einem anderen geeigneten Träger rekonstituieren. Der Komplex ist in jedem physiologisch unbedenklichen Träger stabil, und hierbei handelt es sich im allgemeinen um eine Kombination, die durch einwertige Ionen in einer etwa 0,1 molaren Menge so gepuffert ist, daß sich ein pH-Wert von etwa 6,8 bis

7,2 ergibt. Ein bevorzugter Träger besteht aus einer physiologischen Kochsalzlösung in einem Puffer aus Bicarbonat oder Phosphat.

Die erfindungsgemäßen Komplexe sind breit anwendbar. dsRNA wird in Humanserum in Folge der Gegenwart von abbauender RNase rasch zerstört, so daß dsRNA in dieser Umgebung nur gering oder überhaupt nicht biologisch wirksam ist.. D.ie erfindungsgemäßen Komplexe verfügen dagegen über eine ausgezeichnete interferoninduzierende und makrophagaktivierende Eigenschaften in Verbindung mit ihrer Antitumorwirksamkeit sogar in Anwesenheit von dsRNA abbauender RNase. Diese Komplexe eignen sich daher besonders für die Behandlung entsprechender Erkrankungen beim Menschen in Gegenwart von Humanserum RNase.

Die vorliegenden Komplexe ergeben eine Potenzierung der „~ Beinflussung von Tumoren gegenüber der Verwendung von dsRNA allein. Diese Potenzierung ist äußerst überraschend, da sie sogar in Abwesenheit von Humanserum RNase auftritt, welche dsRNA bekanntlich abbaut, nicht jedoch die erfindungsgemäßen Komplexe. Die vorliegende Komplexe nr eignen sich vor allem zur unterstützenden Krebstherapie, um die Entwicklung von Metastasen zu hemmen.

Die Komplexe können zu den verschiedensten pharmazeutischen Zusammensetzungen und Formulierung verarbeitet 2Q werden, und sie lassen sich in herkömmlicher Weise verabreichen, beispielsweise intramuskulär, intravenös, subkutan, topisch oder intraperitoneal.

Entsprechende pharmazeutische Zusammensetzungen können parenteral oder intraperitoneal verabfolgt werden.. Zu injizierbaren pharmazeutischen Formen gehören sterile

— Q —

wässrige Lösungen oder Dispersionen oder auch sterile Pulver, die sich in sterile injizierbare Lösungen oder Dispersionen rekonstituieren lassen. Der jeweilige Träger kann ein Lösungsmittel oder ein Dispergiermittel sein, beispielsweise Wasser, Ethanol, Polyol (wie Glycerin, Propylenglykol oder flüssiges Polyethyiengiykol), Mischungen hiervon oder Pflanzenöle. Für eine ausreichende Fließfähigkeit oder Gleitfähigkeit kann beispielsweise gesorgt werden durch Verwendung eines Überzugs aus beispielsweise Lecithin, durch Aufrechterhaltung der erforderlichen Teilchengröße im Falle einer Dispersion oder durch Einsatz oberflächenaktiver Mittel. Der Einfluß von Microorganismen kann durch Verwendung verschiedener antibakterieller und antifungaler Mittel unterbunden werden, beispielsweise durch Verwendung von Parabenen, Chlorbutanol, Phenol oder Sorbinsäure. Gelegentlich kann auch die Mitverwendung isotonischer Mittel·wünschenswert sein,.wie beispielsweise von Zuckern oder Natriumchlorid. Für eine verlängerte Absorption injizierbarer pharmazeutischer Formen, läßt sich durch Verwendung absorptionsverzögernder Mittel sorgen, und hierzu gehören beispielsweise Aluminiummonostearat oder Gelatine.

zur Herstellung steriler injizierbarer. Lösungen arbeitet man den jeweiligen Komplex,. gegebenenfalls zusammen mit verschiedenen anderen Bestandteilen, in die jeweils erforderliche Menge des jeweils gewünschten Lösungsmittels

ein

30

Für eine wirksamere Verteilung kann man den Komplex in den Wirkstoff nur langsam freigebende oder, diesen schützende Spendersysteme einarbeiten, beispielsweise in Polymermatrices, Liposomen oder Microkügelchen.

Die vorliegenden Komplexe können ferner auch topisch angewandt werden, nämlich beispielsweise zur Behandlung

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von Hautkrebs. Für diesen Zweck lassen sie sich zu Salben, Cremes oder Lotionen formulieren.

Zur. Formulierung einer Salbe wird der jeweilige Komplex beispielsweise fein in Paraffin verteilt. Die hierzu zu verwendende Salbengrundlage kann flüssiges Paraffin, Hart- paraffin oder Wollfett enthalten. .Zur Bildung einer mit.. Wasser mischbaren Salbengrundlage kann man ein Polyethylenglykol verwenden. . . .

Der erfindungsgemäße Komplex kann auch als Creme formuliert werden, und hierbei kann es sich um eine Creme vom Typ Öl-in-Wasser oder vom Typ Wasser-in-Öl handeln. Im erstgenannten Fall werden als Emulgiermittel beispiels--. weise Natrium-,Kalium-,Ammonium- oder Triethanolseifen, Polysorbate und kationische, anionische oder nichtionische emulgierende Wachse verwendet. Im letztgenannten Fall verwendet man als Emulgiermittel Calciumseifen, Wollfett, Wollalkohole, Bienenwachs und bestimmte Sorbitanester. Normalerweise wird bei einer Creme auch ein Konservierungsmittel verwendet, und dies gilt insbesondere für eine wasserhaltige Creme. Zu Beispielen für Konservierungsmittel, die allein oder in Kombination verwendet werden können, gehören Chlorkresole oder p-Hydroxybenzoate. . .... ,.,...

Der vorliegende Komplex kann auch als Lotion formuliert werden, indem man ihn in einer wässrigen oder öligen

Grundlage löst oder dispergiert. Die wässrige Grundlage kann Ethanol und/oder Glycerin enthalten. Beispiele für geeignete ölgrundlagen sind Rhizinusöl oder Pflanzenöle. Auch Lotionen können wiederum geeignete Konservierungs- ^~> mittel enthalten.

Unter pharmazeutisch unbedenklichen Trägern versteht man

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vorliegend irgendwelche Lösungsmittel, Dispergiermittel, Beschichtungsmittel, antibakterielle Mittel, antifungale . Mittel, isotonische Mittel, absorptionsverzögernde Mittel und dergleichen. Solche Medien und Mittel sind zur Formulierung pharmazeutischer Wirkstoffe üblich. Es lasseh sich daher alle herkömmlichen Medien oder Mittel zur For-.mulierung pharmazeutischer Formen verwenden, die mit der jeweiligen Zusammensetzung verträglich sind. Ferner kön-'" nen auch ergänzende Wirkstoffe mitverwendet werden.

Parenteral verabreichbare Zusammensetzungen werden am besten als Einheitsdosierungsformen formuliert, da sie sich in einer solchen Form leicht verabreichen und gleichför-'^ mig dosieren lassen. Unter solchen Einheitsdosierungsformen werden alle physikalisch getrennten Einheiten verstanden, die für das jeweils zu behandelnde Subjekt geeignet sind. Jede Dosierungseinheit 'enthält eine vorgegebene Menge des jeweiligen Komplexes, die so berechnet

ist, daß sich der gewünschte therapeutische Effekt ergibt, in Verbindung mit dem jeweiligen pharmazeutisch unbedenklichen Träger. Die jeweilige Einheitsdosierungsform ist direkt abhängig und wird bestimmt von (a) den besonderen Eigenschaften der jeweiligen Zusammensetzung und (b) dem

jeweils gewünschten therapeutischen Effekt.

Die oben beschriebenen Zusammensetzungen werden im allgemeinen in einer solchen Menge verabreicht, daß sich die gewünschte Unterstützung der Tumorchemotherapie, Tuirior-

bestrahlungsthereapie und/oder Tumorexzision ergibt. Die Zusammensetzungen können gleichzeitig mit einer solchen Therapie oder während einer bestimmten Zeit vor oder nach einer solchen Therapie verabreicht werden.

Die vorliegenden Zusammensetzungen können, wie bereits erwähnt, parenteral verabfolgt werden. Die Dosierungs-

J ι 33 U -12-

mengen liegen dabei im allgemeinen zwischen etwa 5 und 500 μg dsRNA pro kg Körpergewicht. Sie machen vorzugsweise etwa 5 bis 100 μg pro kg Körpergewicht aus und betragen

insbesondere etwa 20 ug bis 60 μg pro kg Körpergewicht. 5

Ausführungsbeispiele

Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele weiter erläutert. . . .

Beispiel 1

Tobramycin-Penicillium Chrysogenum dsRNA (PCMdsRNA) Komplex, B/P = 7.

J5 Man ermittelt zuerst die Absorptionsspektren des Vorrats an PCMdsRNA. Zur Bestimmung der Konzentration an RNA Phosphor verwendet man einen «Jp-Wert von 7200. 4 ml einer . T,24 x 10 millimolaren Lösung von Phosphor (OD250 ⁼,Q'ß95) PCMdsRNA in einem Puffer aus 0,02 molarem Tris und 0,1 molarem NaCl mit. einem pH-Wert ,von 7,0 versetzt man. mit 4 ml einer Lösung, die 0,436 mg/ml Tobramycin im gleichen Puffer enthält und mit.0,1 η HCl auf einen pH-Wert von 7,0 gebracht ist. Die Stärke der Tobramycinprobe beträgt 0,93 mg freie Base pro mg Probe. Die Endkonzentrationen betragen 4,35 χ 10~^ mMol Tobramycin in Form der freien. Base und 6,21 χ 10~⁵ mMol PCMdsRNA Phosphor, wodurch sich . ein Verhältnis B/P von 7,0 ergibt. Die in obiger Weise gebildete Lösung läßt man vor ihrer Verwendung eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren.

Beispiel 2

Tobramycin-Penicillium Chrysogenum dsRNA {PCMdsRNA} Komplex, B/P = 2.

4 ml einer Lösung, die 1,24 χ 10 mMol Phosphor (CC^gQ = 0,895) PCMdsRNA in einer Pufferlösung enthält, die 0,02

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molar an Tris und 0., 1 molar an NaCl ist und einen pH-Wert von 7,0 hat, versetzt man mit 4 ml einer Lösung, die 0,125 mg/ml Tobramycin im gleichen Puffer enthält und die mit 0,1n HCl auf einen pH-Wert von 7,0 gebracht ist, Die Stärke der Tobramycinprobe beträgt 0,932 mg freie Base pro mg Probe. Die Endkonzentrationen betragen 0,124 χ 10"⁴ mi-tol Tobramycin, in Form der freien Base und 6,21 χ 10~⁵ mMol PCMdsKNA. Phosphor, wodurch sich ein Verhältnis B/P von 2,0 ergibt. Die in obiger Weise gebildete Lösung läßt man vor ihrer Verwendung eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren.

Beispiel 3

Tobramycin-Poly I-Poly C Komplex, B/P =7

10 mg lyophilisiertes salzfreies Poly I-Poly C (P. L.

Biochemicals, Charge 547261) versetzt man mit 10 ml einer Pufferlösung, die 0,02 molar an Tris und 0,1 molar an NaCl ist und einen pH-Wert von 7,0 hat. Die erhaltenen Proben läßt man zuerst 1~Stunde bei 50⁰C äquilibrieren

und dann über Nacht langsam auf Raumtemperatur abkühlen. Zur Bestimmung der Konzentration an Poly I-Poly C Phosphor geht man von einem £p-Wert von 52 00 aus.

4 ml der in obiger Weise erhaltenen Doppellösung von Poly I-Poly C (OD₀,. = 0,64, Konzentration an Phosphor =

-4 1,2 3 χ 10 mMol) versetzt man mit 4 ml einer Lösung, die 0,436 mg/ml Tobramycin im gleichen Puffer enthält und die mit 0,1n HCl auf einen pH-Wert von 7,0 gebracht ist. Die Stärke des Tobramycins beträgt 0,93 mg freie Base pro

mg Probe. Die Stärke der Tobramycinprobe beträgt 0,93 mg freie Base pro mg Probe. Die Endkonzentrationen betragen

-4 4,35 χ 10 mMol.Tobramycin in Form der freien Base und 6,15 χ 10 inMfol Poly I-Poly C Phosphor, wodurch sich ein

4Γ 1 Γ Λ A ο 1 5 9 U

Verhältnis Β/Ρ von 7,0 ergibt. Die in obiger Weise gebildete Lösung läßt man vor ihrer Verwendung eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren. ^v

Beispiel 4

Streptomycin-Penicillium Chrysogenum dsRNA (PCMdsRNA) Komplex, B/P = 7,0

_4 4 ml einer Lösimg, die 1,24 χ 10 mMol Phosphor (OD„_fin =

0,895) PCMdsRNA in einer Pufferlösung enthält, die 0,02 molar an Tris und 0,1 molar an NaCl ist und einen pH-Wert von 7,0 hat, versetzt man mit 4,0 ml einer Lösung, die 0,844 mg/ml Streptomycin im gleichen Puffer enthält und die mit 0,1η HCl auf einen pH-Wert von 7,0 gebracht ist. Die Stärke der Streptomycinprobe beträgt 0,750 mg freie 2" Base pro mg Probe.

-4 Die Endkonzentrationen betragen 4,35 χ 10 mMol Streptomy-

-4 ein in Form der freien Base und 6,22 χ 10 mMol PCMdsRNA Phosphor, wodurch sich ein Verhältnis B/P" von

7,0 ergibt. Die in oBiger Weise gebildete Lösung läßt man vor ihrer Verwendung eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren, um eine Komplexbildung sicherzustellen.

Beispiel 5

Neomycin-Penicillium Chrysogenum dsRNA (PCMdsRNA) Komplex, B/P =7,0

-4

4 ml einer Lösung, die 1,24 χ 10 mMol Phosphor (OD _fi = 0,895) PCMdsRNA in einer Pufferlösung enthält, die 0,02 molar an Tris und 0,1 molar an NaCl ist und einen pH-Wert von 7,0 hat, versetzt man mit 4,0 ml einer Lösung_? die

0,77 mg/ml Neomycinsulfat im gleichen Puffer enthält und die mit 0,1η HCl auf einen pH-Wert von 7,0 gebracht ist. Die Stärke der Neomycinsulfatprobe beträgt 0,70 mg freie Base pro mg Probe. '

-4 Die Endkonzentrationen betragen 4,35 χ 10 mMol Neomycin

-4 in Form der freien Base und 6,215 χ 10 rciMol PCMdsRNA Phos-

'^ phor, wodurch sich ein Verhältnis B/P von 7,0 ergibt. Die in obiger Weise gebildete Lösung läßt man vor ihrer Verwendung eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren, um eine Komplexbildung sicherzustellen.

Beispiel 6

Apramycin-Penicillium Chrysogenum dsRNA (PCMdsRNA) Komplex, B/P =7,0

-4

4 ml einer Lösung die 1,24 χ 10 mMol Phosphor (OD_n _c=

A b U

0,895) PCMdsRNA in einer Pufferlösung enthält, die 0,02 molar an Tris und 0,1 molar an NaCl ist und einen pH-Wert von 7,0 hat, versetzt man mit 4,0 ml einer Lösung, die

0,57 mg/ml Apramycin im gleichen Puffer enthält und die mit 0,1η HCl auf einen pH-Wert von 7,0 gebracht ist. Die Stärke der Apramycinprobe beträgt 0,92 mg freie' Base pro mg Probe.

_4

Die Endkonzentrationen betragen 4,35 χ 10 mMol Apramycin in Form der freien Base und 6,21 χ 10~ mMol PCMdsRNA Phosphor, wodurch sich ein Verhältnis B/P von 7,0 ergibt. Die in obiger Weise gebildete Lösung läßt man vor ihrer Verwendung eine Stunde bei Raumtemperatur inhibieren, um eine Komplexbildung sicherzustellen.

Beispiel 7 Neomycin-Poly I-Poly C Komplex, B/P = 7,0

4,0 ml einer-Lösung von Poly I-Poly C in einer Puffer-lösung aus 0,02 Mol Tris und 0,1 Mol NaCl mit einem pH-Wert von 7,0 (OD_n^_n = 0,64, Konzentration an Phosphor =

A 1,23 χ 10 mMol) versetzt man mit 4,0 ml einer Lösung, die 0,77 mg/ml Neomycinsulfat in der gleichen Pufferlösung enthält und die mit 0,1n HCl auf einen pH-wert von 7,0 gebracht wird. Die Stärke der Neomycinsulfatprobe beträgt 0,70 mg freie. Base pro mg Probe.

-4 Die Endkonzentrationen betragen 4,35 χ 10 mMol Neomycin

in Form der freien Base und 6,15 χ 10 mMol Poly I-Poly 'C Phosphor, wodurch sich ein Verhältnis'B/P von 7,0 ergibt.

Die in obiger Weise gebildete Lösung läßt man vor ihrer Verwendung eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren, urn eine Komplexbildung sicherzustellen.

Die Wirksamkeit der obigen Komplexe gegenüber dem Einfluß einer Metastase von Tumorzellen wird unter Verwendung ^ZD von Madison (M109) Lungenkarzinom gezeigt, bei dem es sich um ein hochrefraktäres Tumorsystem zur herkömmlichen cytoreduktiven Therapie handelt (Cancer Treatment Reports 61, 1459 bis 147 0 (1977)). Dieses Karzinom kann als transplantierbare Linie in syngenetischen BALB/C-Mäusen ge-

tragen werden. Die Tumorlinie ist von der Tumorbank des Mason Research Institute erhältlich.

• Das Interferoninduktionsvermögen der Komplexe wird unter Anwendung eines ebenfalls bekannten Verfahrens gezeigt.

Hierzu löst: man dsRNA in einer für eine Verabreichung geeigneten Konzentration, beispielsweise im allgemeinen in einer Menge von etwa 2 0 μg/ml, in einer Pufferlösung, die 0,15 molar an Kochsalz und 0,02 molar an Tris ist.

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Zur Bildung des dsRNA-Tobramycinkomplexes versetzt man die Lösung von dsRNA mit soviel Tobramycin, daß sich das gewünschte Verhältnis von B/P ergibt. Das erhaltene Gemisch wird dann etwa eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert, um so für eine optimale Bindung zwischen Tobramycin und dsRNA zu sorgen.

Vier Mäuse spritzt man intraperitoneal (ip) mit der Lösung (im allgemeinen mit 0,5 ml), die insgesamt 10 μ9 dsRNA entweder allein oder als Komplex aus Tobramycin und dsRNA enthält. 16 Stunden nach erfolgter Injektion läßt man die Mäuse ausbluten, worauf man das Blut der Mäuse sammelt und zur Gewinnung des Serums zentrifugiert- Unter Verwendung von Medium M199 macht man dann halblogerithrnische Verdünnungen des Serums, woraiaf man die jeweiligen Verdünnungen (2,5 ml) auf zusammengewachsene L-Zellkulturen von Mäusen gibt, die sich in 25 cm³ großen Gewebekulturkolben (Falcon) befinden, und darin 20 Stunden inkubieren läßt. Sodann beimpft man die Kulturen mit vesikularem Stomatitisvirus in 2,5 ml Medium MT99 unter einer Virenkonzentration, die 60 bis 100 Flecken pro Kolben ergibt. Nach einer Virenadsorption von zwei Stunden entfernt man die Flüssigkeit, versetzt das Ganze mit M199 Agar (65 %) und läßt das Ganze zum Härten stehen. Nach drei Tagen behandelt man die Kolben zur Fixierung der Zellen'mit 2 % Natriumacetat und 3,7 % Formaldehyd. Sodann zählt man die Flecken aus und bestimmt die Menge an

Interferon auf Basis der Erniedrigung der Flecken im Verhältnis zu entsprechenden Kontrollplatten, die kein Interferon enthalten. Eine Einheit an Interferon ist definiert als der Reziprokwert aus der Verdünnung der Interferonlösung (Mäuseserum) , die zu einer 5.0%-igen

Hemmung der Bildung an Virenflecker, führt. Sodann berechnet man die Menge an Interferon aus dem Produkt dieser Bestimmung, und der Gesamtverdünnung.

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Der abbauende Einfluß von Humanserum dsRNAse auf das Interferoninduktionsvermögen von dsRNA oder dsRNA-Tobramycin wird bestimmt durch Zugabe von Humanserum zur Lösung von dsRNA oder des Komplexes aus Tobramycin und dsRNA. Durch entsprechende Herabsetzung der Menge an Puffer,wird die Menge an zugesetztem Humanserum ausgeglichen und für eine konstante Konzentration an dsRNA gesorgt. Das erhaltene Gemisch wird eine Stunde bei 37⁰C inkubiert und dann auf Eis gegeben. Die Lösungen werden innerhalb von 15 Minuten nach Entnahme aus dem auf 37⁰C gehaltenen Bad verwendet.

In der folgenden Tabelle I sind die Wirkungen von Tobramycin allein, dsRNA allein und eines Komplexes aus Tobramycin und dsRNA zur Einleitung von Interferon nach erfolgter Behandlung mit Humanserum vergleichsweise zusammengestellt.

· · -

	Tabelle I	Interferon, Einheiten
Verbindung	Humanserum	35
Tobramycin	Ja	1050
ds RNA	nein	3200
dsRNA + Tobramycin	nein	447
ds RNA	ja	3470
dsRNA + Tobramycin	ja

a) Dosis — 0,5 ml, dsRNA-Konzentration — 20 Tobramycinkonzentration — 14,5 μg/ml (B/P = 1)

b) 1,2 μΐ/ml Probe

λ λ .ι mi λ η η η ... CXJi

Die folgende Tabelle II zeigt die Wirkungen auf die Interferoninduktion unter einer Veränderung von (a) dem Verhältnis B/P von Tobramycin und dsRNA und (b) der Konzentration an Humanserum.

Verbindung¹¹

Tabelle II

B/P Humanserum, ml je 3 ml Probe

Interferon, Einheiten

15 Kontrolle (Puffer)	—	—
dsRNä	-	-
dsENA	-	1,0
dsSNA-Tobramycin	4	-
dsENA-Tobramycin	4	1,0
20 dsRNA-Tobramycin' ·	4	2,0
dsRNA-Tobramycin	4	2,5
dsRNA.-Tobramycin	6	1,0
dsFNA-Ibbramycin	6	2,0
dsRJSIA-Tobramycin	6	2,5

< 31

3160

<31

2570

1479

1230

346

2042

891

447

a) Dosis — 0,5 ml, dsRNA-Konzentration — 20

Aus der folgenden Tabelle III geht der Einfluß verschie-3Q dener Verhältnisse B/P von Tobramycin-dsRNA auf die Interferoninduktion nach Einwirkung von 83%-igem Humanserum (2,5 ml pro 3,0 ml Probe) hervor.

\in\i

/. it I L- S I Γ% _ Ο O —

	Tabelle III	Einleitung durch Interferon, Einheiten
Tobramycin-dsRNA, B/P	110
4	234
8	310
12	310
16	417
20	316
40	1667
16^a

a = Versuch ohne Einwirkung von Humanserum

Die Wirksamkeit der vorliegenden Komplexe auf die Aktivierung von Makrophagen -wird ebenfalls unter Anwendung eines bekannten Verfahrens ermittelt. Zu diesem Zweck erntet man peritoneale Makrophagen fünf Tage nach erfolgter Behandlung von Mäusen mit der jeweiligen Zusammensetzung durch Waschen des Peritoneums und anschließende Reinigung durch Adsorption an Kunststoff. Man überdeckt

5 ·

etwa 4x10 Makrophagen 'in 16 mm Röhrchen mit 4x10 Zellen P815, die in 2 ml Medium 1640 von Roswell Park Memorial Institute enthalten sind, das mit 20 % Kälberfötenserum: . ergänzt ist. Alle Kulturen hält man bei einer Temperatur von 3 7°C in einem Inkubator unter feuchter und 5 % Kohlendioxid enthaltender Luft, wobei man jeweils nach 48 Stunden die Cytotoxizität auf Basis der Auszählungen der lebenden Zellen in einem Hämocytometer bestimmt. Von jeder Gruppe werden Dreifachkulturen gehalten. Man berechnet den Mittelwert der Zellauszählung und die Standardfehlergrenze. Unter diesen Bedingungen führen peritoneale Makrophagen der normalen BALB/C-Maus, die mit trisgepufferter Kochsalzlösung behandelt worden sind,

zu keiner Beeinflussung des Wachstums der Zielzellen P815, wie sich sowohl durch Messung der Anzahl der lebenden Zellen als auch durch DNA-Synthese der Leukämiezellen ergibt. Das Verhältnis aus den Makrophagen und den Zielzellen beträgt zu Beginn eines jeden Versuchs etwa 10:1. Die prozentuale Hemmung des Wachstums der Zellen P815, die eine Folge der Aktivierung der Makrophagen durch die erfindungsgemäße Zusammensetzung ist, berechnet man durch Vergleich mit dem Wachstum der Zellen P815 in Gegenwart von Makrophagen bei nur mit dem Puffer behandelten Tieren. Die dabei erhaltenen Ergebnisse gehen aus der folgenden Tabelle IV hervor.

Tabelle IV

in vivo Makrophagen Aktivierung unter Verwendung des Komplexes aus dsKNA und Tobramycin

	Verbindung	Menge an Verbindung	Menge an Humanserum	Prozentuale Makrophagen- Cytotoxizität	1 Versuch 2
				Versuch	70 ~~~-
	dsRNA	' 10 μg	—	91	58
	dsRNA	10 μg .	0,002 ml	78	6
25	dsKNA	10 μg	0,42 ml	30	81
	dsRNA-Tobramycin	10 μg + 100 μg	—	89	69
	dsRNA-Tobramycin	10 μg + 100 μg	0,42 ml	74	0
	Tobramycin	100 μg	—	-1	0
30	Nichts			0 ·

a = Man verabreicht insgesamt 0,5 ml Ihkubationsgemisch intraperitoneal fünf Tage vor dem Ernten der peritonealen Makrophagen. Bei der angegebenen Dosis handelt es sich um die Menge, die jeder Maus gespritzt worden ist.

Zur Durchführung der Untersuchungen über die Metastase von Tumoren wird ein subkutan gewachsener Tumor aseptisch exzisiert, mit einer Schere zerkleinert und bei Raumtemperatur schwach trypsinisiert, wodurch man zu einer einzelligen Suspension gelangt. Die erhaltenen Zellen werden dann in RPMI-1640 Medium (M. A. Bioproducts, Walkersviile, Maryland) suspendiert. Durch Ausschluß mit Trypanblau ermittelt man die lebenden Zellen Ml09, und die Zellkonzentration wird mit einem Hämocytometer bestimmt. Die Zellkonzentration wird auf 1x10 lebende Zellen pro ml Medium eingestellt. Das die Zellen M109 enthaltende Medium spritzt man einer normalen männlichen BALB/C-Maus in einer Menge, die die gewünschte Anzahl an lebenden Zellen ergibt. Die zu untersuchenden Zusammensetzungen verarbreicht man intraperitoneal willkürlich ausgewählten Gruppen aus jeweils 10 Mäusen, und zwar jeweils zwei Tage vor der Beimpfung mit Tumorzellen, falls diese Beimpfung intravenös durchgeführt wird, und fünf Tage nach der Beimpfung mit Tumorzellen, falls man diese Beimpfung subkutan vornimmt. Entsprechende Kontrollen erhalten lediglich Scheininjektionen aus 0,5 ml Träger. Man überwacht die Mortalität, um hierdurch die prozentuale

" Erhöhung der Überlebenszeit (ILS-Wert) im Verhältnis zu den Kontrollen zu bestimmen, wobei man auch die mittlere Überlebenszeit (MST-Wert) einer jeden Tiergruppe ermittelt. Beide Berechnungen gehen jeweils von der Zeit, der Verabreichung der Tumorzelien aus.

Die unter Verwendung von Komplexen aus mehreren Aminoglycosiden und aus von Penicillium chrysogenum abgeleiteter dsRNA erhaltenen Ergebnisse gehen aus der folgenden Tabelle V hervor. Zur Durchführung dieser Untersuchungen

4

verabreicht man 2x10 monodisperse Zellen M109 intravenös jeweils zwei Tage nach Verabfolgung des zu untersuchenden Komplexes.

	Tabelle V	Dosis	MST	ILS
5 Verbindung	Ionisierbare	(ng)	(Tage)	(%)
(Tag -2, i.p.)	Stickstoffatome	101,5	32,5	0
Kontrollen	—	167,5	33,5	3
Tobramycin	5	133,0	33,0	1
Streptomycin	3	130,5	34,0	5
10 Neomycin	6	10,0	34,5	6
Apramycin	5	10+101,5	39,0	20
dsENA	-	10+167,5	52,0	60
dssENA-Tobramycin	5	10+133,0	38,5	18
ds !^-Streptomycin	3	10+130,5	50,0	5.4
15 dsRNA-Neomycin	6		41,0	26
dsENA-Apramyc in	5

Die folgende Tabelle VI zeigt die Wirksamkeit erfindungs-20 "gemäße Komplexe auf Basis natürlicher dsRNA (abgeleitet von Penicillium chrysogenum) und synthetischer dsRNA.

	Verbindung (Tag -2, i.p.)	Tabelle VI	MST (Tage)	HS
25	Kontrolle	Dosis (pg·)	47	0
	Tobramycin	—	50	6
	dsENA.	197	56	19
	dsENA-Tobramyc in	10,1	66	40
	Poly I-Poly C	10,1+197	65	38
30	Poly I-Poly C-Tobramycin	10,1	77	64
	10,1+197

Aus der folgenden Tabelle VII geht der Einfluß verschiedener Verhältnisse B/P aus Aminoglycosid und von Penicillium chrysogenum abgeleiteter dsRNA auf die Antitumorwirksamkeit hervor.

	Verbindung (Tag -2, i.p.)	Tabelle	VII	MST (Tage)	ILS (%)
10	Kontrolle	Dosis (μς)	B/P	34,5	0,0
	dsRNA	—		37,5	8,7
	dsRNA-Tobramycin	10		45,5	31,9
	dsRNA-Tobramycin	10+101,5	7	42,5	23,2
15	dsENA-Tobramycin	10+14,5	1	35,0	1,4
	Tobramycin	10+1,4	0,1	34,5	0,0
	Tobramycin	101,5		37,5	8,7·
	Tobramycin	- 14,5 -		37,5	8,7
		1,4
20

a = Die Mäuse erhalten 2 χ 10 monodisperse Zellen M109 intravenös am Tag 0.

Der folgenden Tabelle VIII sind Dosis-Wirkungs-Werte der Antitumoraktivität eines Komplexes aus einem Aminoglycosid und einer von Penicillium chrysogenum abgeleiteten 30 dsRNA zu entnehmen, der über ein Verhältnis B/P von 7 verfügt.

	Tabelle VIII	MST	ILS	—
5 Verbindung^a	Dosis	(Tage)	(%)	7
(Tag -2, i.p.)	(ng)	32	14
Kontrolle	-	34	7
dsRNA	40	37	41
dsHSa	10,45	34	50
0 dsKSB.	2,5	45	9
dsENa-Tobramycin	40+405	48	0
dsRNA-Tobramycin	10+101,5	35
dsKNA-Tobramycin	2,5+25	32
Tobramycin 5	405

4 a = Die Mäuse erhalten 2 χ 10 monodisperse Zellen

M109 intravenös am Tag 0. ; 20

Claims

Erfindunqsansprüche

1· Verfahren zur Herstellung eines Komplexes für die Hemmung der Proliferation und Migration von Tumorzellen, dadurch. gekennzeichnet , daß man eine . doppelsträngige RNA mit einem Aminoglycosid, das kein Neomycin ist und das wenigstens fünf ionisierbare Stickstoffatome enthält, in solchen Mengen verbindet, daß sich ein Molverhältnis aus Aminoglycosid und doppelsträngigem RNA Phosphor von wenigstens 1:1 ergibt.
2. Verfahren nach Punkt 1 , dadurch gekennzeichnet, daß man eine Lösung aus lyophilisierter doppelsträngiger RNA in einem sterilisierten neutralen Puffer zu einer Lösung des Aminoglycosids in diesen Puffer gibt.
3. Verfahren nach Punkt 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet,' daß man die Kombination aus doppelsträngiger RNA und Aminoglycosid zur Sicherung einer optimalen Bindung eine Stunde inkubiert.
4. Verfahren nach Punkt 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Aminoglycosid verwendet, das fünf ionisierbare Stickstoffatome enthält.
5. Verfahren nach Punkt 4, dadurch gekennzeichnet, daß man Tobramycin oder Apramycin als Aminoglycosid verwendet.
6. Verfahren nach Punkt 5, dadurch gekennzeichnet, daß man Tobramycin als Aminoglycosid verwendet.
7. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 6, dadurch

gekennzeichnet, daß man eine doppelsträngige RNA natürlicher Herkunft verwendet.

- 27 -
8. Verfahren nach Punkt 7, dadurch gekennzeichnet, daß man eine von Penicillium chrvsogenum abstammende doppel-

5 strängige RNA verwendet,
9. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß man unter einem Molverhältnis aus Aminoglycosid und doppelsträngigem RNA Phosphor von etwa

10 12:1 bis etv/a 1:1, vorzugsweise von etwa 9:1 bis etwa 6:1, arbeitet.