DE68920656T2

DE68920656T2 - Verwendung vpn Adenosin-5'-phosphate in der Behandlung von Krebscachexia.

Info

Publication number: DE68920656T2
Application number: DE68920656T
Authority: DE
Inventors: Eliezer Rapaport
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1988-07-25
Filing date: 1989-06-22
Publication date: 1995-05-18
Anticipated expiration: 2009-06-23
Also published as: ATE117209T1; ES2066806T3; EP0352477A2; US5049372A; DE352477T1; EP0352477A3; EP0352477B1; DE68920656D1; JPH02111724A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Adenosin-5'-phosphat als Wirkstoff oder pharmazeutisch verträgliche Salze, Chelate oder Radionuklide davon zusammen mit üblichen Trägersubstanzen für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Krebskachexie.
Die Verwendung von Antimetaboliten (z. B. cytotoxische Nucleoside oder Basen), wie Purine und Pyrimidine, als Krebsmittel ist bekannt. Diese Antimetaboliten werden jedoch sowohl von normalen als auch Tumorzellen aufgenommen und können folglich nicht nur das Wachstum von Tumorzellen unterdrücken, sondern auch normale Zellen im Wirt nachteilig beeinflussen.
US-A-4 291 024 von Turcotte schlägt ein Verfahren zur Herstellung von Liponucleotid-Analoga von Nucleosiden oder Basen mit bekannter cytotoxischer Wirksamkeit vor (z. B. 1-β- D-Arabinofuranosylcytosin, das als Ara-C bekannt ist). Dieses Patent legt nahe, daß diese Liponucleotid-Analoga von Nucleosiden eine Möglichkeit bieten, cytotoxische Nucleoside in Tumorzellen zu bringen. Wenn sie einmal in diesen Zellen sind, können diese cytotoxischen Nucleoside in phosphorylierter Form freigesetzt werdend damit wird die Abhängigkeit des Nucleosids selbst von der Kinase-Aktivität umgangen. Dies ist von Vorteil, da cytotoxische Nucleoside oder Basen ihre Wirkungen gegen die Wucherung durch die Triphosphatform des Nucleosids ausüben. Die in US-A-4 291 024 aufgeführten Aufgaben erwähnen die Zufuhr von normalen zellulären Metaboliten (z. B. AMP, ADP oder ATP) über das Liponucleotid-Analog in Tumorzellen nicht ausdrücklich. Das von Turcotte genannte Liponucleotid-Analog betritt die Krebszelle durch ein Verfahren des Lysosomen-Tropismus oder eines verwandten Membranphänomens; diese Analoga können als solche auch in normale nicht krebsartige Zellen eindringen (z. B. Knochenmark, Lymphknoten oder intestinale Epithelzellen), dies führt zur Unterbrechung der normalen Entwicklung des Zellmetabolismus.
ATP ist ein bekannter Vasodilatator, der Veränderungen des Blutkreislaufs bei Menschen und Versuchstieren hervorrufen kann. Vergleiche Davies, et al., "Circulatory and Respiratory Effects of Adenosine Triphosphate in Man" in Circulation 3:543-550 (April 1951); Duff, et al., "A Quantitative Study of the Response of Adenosine Triphosphate of the Blood Vessels of the Human Hand and Forearm" in J. Physiol. 125:581-589 (1954); Rowe, et al., "The Systemic and Coronary Hemodynamic Effects of Adenosine Triphosphate and Adenosine" in American Heart J. 64: 228-234 (1962). Von Rapaport und Mitarbeitern wurde außerdem bereits nachgewiesen, daß Zellansammlungen von säurelöslichen Nucleotiden, insbesondere ADP und ATP, bei der Regelung der DNA-Replikation und dem Zellwachstum von Säugern wirken. Siehe Rapaport, et al., "Incorporation of Adenosine into ATP:Formation of Compartmentalized ATP" in Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 73, Nr. 9:3122-3125 (September 1976); Rapaport, et al., "Increased Incorporation of Adenosine into Adenine Nucleotide Pools in Serum-Deprived Mammalian Cells" in Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 75, Nr. 3:1145-1147 (März 1978); Rapaport, et al., "Elevated Nuclear ATP Pools and ATP/ADP Ratios Mediate Adenosine Toxicity in Fibroblasts" in Regulation of Macromolecular Synthesis by Low Molecular Weigth Mediators, Academic Press, 1979, S. 223-231; Rapaport, et al., "Regulation of DNA Replication in S Phase Nuclei by ATP and ADP Pools" in Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 76, Nr. 4:1643- 1647 (April 1979); Rapaport, et al., "Selective High Metabolic Lability of Uridine, Guanosine and Cytosine Triphosphates in Response to Glucose Deprivation and Refeeding of Untransformed and Polyoma Virus-transformed Hamster Fibroblasts" in J. Cell. Physiol., Bd. 101, Nr. 2:229-236 (November 1979); Rapaport, et al., "Selective High Metabolic Lability of Uridine Triphosphate in Response to Glucosamine Feeding of Untransformed and Polyoma Virus- transformed Hamster Fibroblasts" in J. Cell. Physiol., 104:253-259 (1980); Rapaport, "Compartmentalized ATP Pools Produced from Adenosine Are Nuclear Pools" in J. Cell. Physiol., 105:267-274 (1980); und Rapaport, et al., "Retinoic Acid-Promoted Expansion of Total Cellular ATP Pools in 3T3 Cells Can Mediate its Stimulatory and Growth Inhibitory Effects" in J. Cell. Physiol., 110:318-322 (1982).
Diese Entgegenhaltungen, die die Verwendung von ADP und ATP als Regulatoren der DNA-Replikation und des Zellwachstums von Säugern zeigen, beschreiben jedoch nicht, daß diese Materialien oder ein Verfahren der Verwendung dieser Materialien, Tumorzellen (z. B. Human-Tumorzellen) selektiv angreifen und normale Zellen nicht angreifen, wodurch das Wachstum der Tumorzellen aufgehalten wird und diese getötet werden, während im wesentlichen keine Unterbrechung des Wachstums oder das Töten normaler Zellen verursacht wird.
Kürzlich wurde in meiner gleichzeitig anhängigen US- Patentanmeldung 5er. Nr. 397 897, die am 13. Juli 1982 eingereicht wurden und in der entsprechenden EP-A-83106808.5 beschrieben, daß der Einfluß von geringen Dosen von ADP und/oder ATP auf eine Vielzahl von Tumorzellen (z. B. eine Vielzahl von Arten von Human-Tumorzellen) zu einer deutlichen Hemmung der DNA-Synthese und Unterbrechung signifikanter Zellpopulationen in der 5-Phase ihres Zyklus führt, und der weitere Einfluß dieser Dosen von ADP und/oder ATP zum Tod dieser Tumorzellen führt, wobei diese Wirkung auf die Tumorzellen im wesentlichen ohne Einfluß auf normale Zellen erfolgt. Die hier durchgeführten in vitro Versuche legen nahe, daß Adenosin-5'-monophosphat (AMP) das Zellwachstum nicht hemmt. Diese Beschreibung nimmt keine besondere Notiz vom Unterbrechungsmechanismus des Wachstums von Tumorzellen durch die Bildung erhöhter ATP-Werte in Blut und Plasma in einem tumortragenden Wirt.
Die in der US-Patentanmeldung 5er. Nr. 397 897 von Rapaport und in der entsprechenden EP-A-83106808.5 beschriebene Erfindung stellt das einleitende und grundsätzliche Fachgebiet für die Verwendung von Adenosin-5'-triphosphat (ATP) und Adenosin-5'-diphosphat (ADP) gegen Tumore dar. Diese beiden wissenschaftlichen Schriften, die die in der oben genannten Anmeldung beschriebenen Versuchsergebnisse herausstellen, wurden in stark beachteten wissenschaftlichen Zeitschriften veröffentlicht (von Rapaport, E., "Treatment of Human Tumor Cells with ADP or ATP Yields Arrest of Growth in the S Phase of the Cell Cycle", J. Cellular Physiol., 114, 279-283, 1983; Rapaport, et al., "Growth Inhibition of Human Tumor Cells in Soft-Agar Cultures by Treatment with Low Levels of Adenosine-5'-Triphosphate", Cancer Research, 43, 4402-4406, 1983). Diese beiden Schriften werden in der wissenschaftlichen Literatur von anderen als erster Nachweis der wachstumshemmenden Wirkungen von extrazellulärem ATP oder ADP gegen Tumorzellen beim Tier oder Menschen in in vitro Systemen zitiert, die üblicherweise für die Vorhersage der Empfindlichkeit von Tumoren beim Menschen gegen chemotherapeutische Mittel verwendet werden.
Mit dem Krebs verbundene Kachexie führt zu ernsthaften anatomischen Veränderungen, die ihren Ursprung im Zusammenhang zwischen dem Tumor und den Geweben des Wirts, den Organen und deren Funktionen haben. Einer der schwerwiegendsten Leiden von Wirten mit Tumor ist der Gewebeschwund des Wirts, der zu einem schnellen Gewichtsverlust führt (einen Überblick findet man in Costa, G., "Cachexia, The Metabolic Component of Neoplastic Diseases", Cancer Research, 37, 2327-2335, 1977). Gegenwärtig haben sich die vollständige parenterale Ernährung oder das anabolische Hormon Insulin als gegen schnellen Gewichtsverlust bei Wirten mit Tumor wirksam erwiesen (Moley, J.F., et al., "Body Composition Changes in Rats with Experimental Cancer Cachexia: Improvement with Exogenous Insulin", Cancer Research, 48, 2784-2787, 1988). Diese beiden Behandlungen hemmen jedoch das Wachstum des Tumors selbst nicht, es gibt Hinweise darauf, daß die gesamte parenterale Ernährung das Tumorwachstum tatsächlich beschleunigt (Popp, M.B., et al., "Host and Tumor Responses to Increasing Levels of Intravenous Nutritional Support", Surgery, 94, 300-308, 1983).
Die vorliegende Anmeldung liefert die erste Beschreibung des Mechanismus, um die Krebskachexie in Wirten mit einem Tumor zu unterdrücken. Im Gegensatz zum Stand der Technik führt die Verabreichung von AMP und/oder ATP bei Wirten mit Tumor nicht nur zur Verzögerung des Gewichtsverlustes des Wirtes, sondern wirkt auch bei der Unterdrückung des Tumorwachstums. In dieser Beschreibung dargelegte Beweise durch Versuche zeigen, daß die Verzögerung des Gewichtsverlustes bei Wirten mit Tumor (der die ernsthafteste Folge der Krebskachexie darstellt) und die Unterdrückung des Tumorwachstums durch die Verabreichung von AMP und/oder ATP zwei getrennte Folgen dieser Behandlung sind und nicht voneinander abhängig sind oder miteinander in Zusammenhang stehen. Die Verzögerung des Gewichtsverlustes eines Wirtes mit Tumor ist nicht einfach das Ergebnis der Unterdrückung des Tumorwachstums nach der Verabreichung von AMP oder ATP. Beide Phänomene (Unterdrückung des Gewichtsverlustes bei Wirten mit Tumor und Verzögerung des Tumorwachstums) haben jedoch ihren Ursprung im gleichen physiologischen Mechanismus, der Vergrößerung der ATP-Werte des Blutes (gesamtzellulär) und des Blutplasmas (extrazellulär).
Ein Aspekt dieser Erfindung betrifft die Behandlung eines an Tumor leidenden Wirtes, bei dem sich das Leiden oder die Krankheit zu einem fortgeschrittenen Stadium entwickelt hat, wodurch es einen fortgeschrittenen Abbau der Gewebe des Wirtes oder der Organfunktionen gibt. Dieser Aspekt der vorliegenden Erfindung unterbricht das Wachstum der Tumorzellen in diesem Wirt, wobei der durch Krebskachexie hervorgerufene Gewichtsverlust des Wirtes im wesentlichen gehemmt wird. Die Behandlung beinhaltet die Erhöhung der ATP- Werte des Blutes und des Plasmas des Wirtes auf einen ausreichenden Wert, um dadurch das Wachstum des Tumors zu unterbrechen, wobei der durch Krebskachexie hervorgerufene Gewichtsverlust im wesentlichen gehemmt wird.
Erläuterungen, die die wissenschaftliche Basis dieser Erfindung betreffen, findet man in zwei Schriften, veröffentlicht werden sollen. Diese beiden Schriften sind von Rapaport, E. "Experimental Cancer Therapy in Mice by Adenine Nucleotides", European Journal of Cancer & Clinical Oncology, zur Veröffentlichung (in der Presse) 1988 angenommen; und Rapaport, E. und Fontaine, J., "Anticancer Activities of Adenine Nucleotides in Mice are Mediated Through Expansion of Red Blood Cell ATP Pools", Proceedings of the National Academy of Sciences USA, zur Veröffentlichung 1988 vorgelegt. Diese Schriften weisen deutlich nach, daß die drei grundsätzlichen Aspekte dieser Beschreibung keinen Stand der Technik beinhalten. Die wissenschaftlichen Erkenntnisse, die die Basis dieser Erfindung bilden, und die in den beiden oben genannten Schriften veröffentlicht werden, sind: 1) das Tumorwachstum im Wirt wird nach der Erhöhung der ATP-Werte des Blutes und des Plasmas wesentlich unterdrückt, 2) die Verabreichung von ATP und AMP bei einem Wirt mit Tumor führt zu erhöhten ATP-Werten des Blutes und des Plasmas, und 3) die Verabreichung von AMP oder ATP bei einem Wirt mit Tumor hemmt den Gewichtsverlust des Wirtes wesentlich, der das nachteilige Resultat der Krebskachexie ist.

Zusammenfassung der Zeichnungen

Fig. 1 zeigt die Verzögerung des Wachstums von CT26-Tumoren bei CB6F&sub1;-Mäusen und Veränderungen des Körpergewichtes des Wirtes während und nach der Behandlung mit Adenin-Nucleotiden;
Fig. 2 zeigt die Verzögerung des Tumorwachstums und des Gewichtsverlustes des Wirtes bei Mäusen mit Tumor durch Behandlung mit Adenin-Nucleotiden;
Fig. 3 zeigt die Verzögerung des Gewichtsverlustes des Wirtes bei Tieren mit Tumor durch Behandlung mit Adenin-Nucleotiden.

Beste Art und verschiedene Arten zur Durchführung dieser Erfindung

Gemäß dieser Erfindung hat sich gezeigt, daß ein an Tumor leidender Wirt, bei dem das Leiden oder die Krankheit ein fortgeschrittenes Stadium erreicht hat, wodurch es eine schädliche Wirkung auf die oder deutliche Änderung der Funktionen des Gewebes des Wirtes gibt, behandelt werden kann, wenn die ATP-Werte des Blutes und des Plasmas des Wirtes auf einen ausreichenden Wert erhöht werden, wodurch nicht nur das Wachstum der Tumorzellen unterbrochen, sondern auch der durch Kachexie hervorgerufene Gewichtsverlust wesentlich verzögert wird. Der hier verwendete Begriff "Tumor" betrifft Krebszellen, z. B. maligne Zellen.
Die ATP-Werte des Blutes und des Plasmas des Wirtes können erhöht werden, wenn dem Wirt Adenosin-5'-monophosphat (AMP) und/oder Adenosin-5'-diphosphat (ADP) und/oder Adenosin-5'- triphosphat (ATP) verabreicht werden.
Durch die vorliegende Erfindung hat sich auch gezeigt, daß ein Wirt mit Tumor, einschließlich eines Wirtes, bei dem die Krankheit nicht bis zum oben beschriebenen Ausmaß fortgeschritten ist, behandelt werden kann, wenn Adenosin-5'- monophosphat (AMP) in einer ausreichenden Menge verabreicht wird, damit die Blut- und Plasmawerte an Adenosin-5'- triphosphat (ATP) im Wirt ausreichend erhöht werden, wodurch das Wachstum der Tumorzellen unterbrochen wird.
Bei der vorliegenden Erfindung ist die Anwendung von AMP bevorzugt, da sie mögliche nachteilige Nebenwirkungen im Vergleich mit der Verwendung von ADP und ATP reduziert, insbesondere da ATP ein bekannter Vasodilatator ist.
Nichtbegrenzende Beispiele der Tumorzellen im Wirt, die nach der vorliegenden Erfindung behandelt werden können, sind CAPAN-1 und CT26.
Die Behandlung mit AMP und/oder ADP und/oder ATP wird in Form eines pharmazeutisch verträglichen Salzes und in einer Vielzahl herkömmlicher pharmazeutischer Präparate angewendet. Diese Präparate können ein organisches oder anorganisches Material enthalten, das für die innere Verabreichung geeignet ist. Die starke Löslichkeit der Salze von AMP und/oder ADP und/oder ATP in isotonischen wäßrigen Natriumchloridlösungen ermöglichen die Verabreichung dieser Mittel in Form einer Injektion oder Infusion in einer einzelnen oder in mehrfachen Dosen. Die Injektion oder Infusion kann intraperitoneal, intravenös oder intraarteriell erfolgen. AMP und/oder ADP und/oder ATP sind auch für die orale, enterale oder örtliche Anwendung geeignet, wenn sie mit herkömmlichen organischen oder anorganischen Trägersubstanzen verwendet werden. Die wirksamen Dosen sollten bei der oralen oder örtlichen Verabreichung im Bereich von etwa 1-1000 mg/kg und bei Injektionen etwa bei 1-1000 mg/kg des Körpergewichtes liegen. Die intravenösen, intraperitonealen oder intraarteriellen Infusionen von AMP und/oder ADP und/oder ATP in Form eines geeigneten Salzes werden vorzugsweise in einer Menge von 0,001-15 mg/kg des Körpergewichtes pro Minute verabreicht.
Die Verabreichung dieser Mittel kann unter Anwendung einer Vielzahl von Systemen zur Verabreichung von Medikamenten durchgeführt werden, diese umfassen Pumpen oder Liposome, sind jedoch nicht darauf begrenzt. AMP oder ADP oder ATP können nicht nur als pharmazeutisch verträgliche Salze, sondern auch als Chelate für Radionuclide angewendet werden, z. B. Tc-99m, In-111 oder Ga-67, sie sind jedoch nicht darauf begrenzt. In diesem Fall können die AMP- oder ADP- oder ATP- Chelate dieser Mittel zur Behandlung und auch zur Diagnose von Tumoren beim Menschen verwendet werden.
Für die Infusionsgeschwindigkeit von AMP und/oder ADP und/oder ATP wird auf die verschiedenen Entgegenhaltungen verwiesen, die bereits genannt wurden und die beschreiben, daß ATP ein bekannter Vasodilatator ist. Durch diese Entgegenhaltungen kann eingeschätzt werden, daß einzelne schnelle Injektionen von 40 mg des Natriumsalzes von ATP, entweder intravenös oder intraarteriell, geringe subjektive und physiologische Änderungen beim Menschen hervorrufen. Langsame Injektionen oder Infusionen der gleichen Dosis von ATP erzeugten eine viel geringere oder überhaupt keine Reaktion (siehe oben, Davies et al.).
Derartige Vorsichtsmaßnahmen werden jedoch bei der Anwendung von AMP nicht als notwendig erachtet, wie es bei der vorliegenden Erfindung bevorzugt ist.
Die folgenden Untersuchungen zeigen die vorliegende Erfindung in nicht einschränkender Weise. Z. B. Adenosin-5'-triphosphat (ATP) und Adenosin-5'-monophosphat (AMP) zeigen deutliche Wirkungen gegen Krebs, z. B. das im Fußballen von CB6F&sub1;- Mäusen eingeführte CT26-Colon-Adenokarzinom. Adenosin, anorganisches Phosphat oder anorganisches Pyrophosphat hatten jedoch diese Wirkungen bei identischen Bedingungen nicht.
Tägliche intraperitoneale (i.p.) Injektionen von Adenin- Nucleotiden in großen Volumina einer Kochsalzlösung, die begannen, nachdem der Tumor fühlbar war, führten zur Verzögerung des Tumorwachstums und geringfügigen "Heilungen". Die Behandlung war für den Wirt nicht toxisch, dies wurde durch Änderungen des Körpergewichtes festgestellt. Der im Verlauf von schnellwachsenden CT26-Tumoren bei Tieren beobachtete Gewichtsverlust wurde bei mit Adenin-Nucleotid behandelten Mäusen merklich verlangsamt. Es zeigte sich, daß die Verzögerung des Gewichtsverlustes bei Mäusen mit Tumor weder die Ursache noch die Wirkung der Verzögerung des Tumorwachstums war.
Intraperitoneale Injektionen von AMP oder ATP führten zu Vergrößerungen der ATP-Pools von roten Blutzellen (RBC) in den Wirtstieren, Adenosin jedoch nicht. Diese vergrößerten ATP Pools der RBC sind über einen Zeitraum von Stunden stabil, wobei eine mikromolare Menge von ATP langsam in das Kompartiment des Blutplasmas freigesetzt wird, dies führt zur mehrfachen Erhöhung der (extrazellulären) ATP-Werte im Plasma.
Die angewendeten Tumorzellinien waren CT26, ein nichtdifferenziertes aggressives Colon-Karzinom der Maus und CAPAN-1, ein gutdifferenziertes Adenokarzinom der Bauchspeicheldrüse vom Menschen. Diese zwei Tumore stellen ein breites Spektrum akzeptierter Tumormodelle dar und sind folglich zum Nachweis der klinischen Wirksamkeit von therapeutischen Mitteln für Krebs geeignet, sie sind im allgemeinen nicht auf die bestimmten geprüften Tumore beschränkt. Es wurde nachgewiesen, daß die Zellen frei von einer Verunreinigung mit Mycoplasma sind. Die Zellen werden bei 37ºC in einer befeuchteten Atmosphäre aus 5% CO&sub2;/95% Luft in MEM, das mit Antibiotika ergänzt ist (100 Einheiten Penicillin pro ml und 100 ug Streptomycin pro ml), L-Glutamin (2 mM), nichtessentielle Aminosäuren (0,1 mM), Natriumpyruvat (1 mM) und 10% fötales Kälberserum kultiviert.
Bei diesen Versuchen wurden weibliche und männliche CB6F&sub1;- Mäuse (ein F&sub1;-Standardhybrid von BALB/C und C57BL/6), die von Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine, erhalten wurden, und athymische, herausgezüchtete NCr nu/nu Mäuse (männliche und weibliche) vom Department of Radiation Medicine, Massachusetts General Hospital, Boston, Massachusetts 02114, verwendet. Alle Mäuse wurden vor der Beimpfung mit den Tumoren und dem Beginn der Behandlung mindestens zwei Wochen gehalten, sie sind zu Beginn des Verfahrens 7-9 Wochen alt (CB6F&sub1;) oder 6-7 Wochen alt (athymisch nu/nu). Die Tiere wogen 20-25 g (weibliche) oder 23-28 g (männliche), sie werden mit 5-12 Tieren pro Käfig gehalten und haben ad libitum Zutritt zu Nahrung und Wasser.
Die Tumorzellen werden durch milde Behandlung mit Tryptisin- EDTA aus subkonfluenten Kulturen entnommen, das Zellpellet wird einmal ohne Serum mit MEM gewaschen, und die Zellen werden mit mit der gewüschten Anzahl der Zellen in PBS (mit Phosphat gepufferte Kochsalzlösung, 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,15 g Na&sub2;HPO&sub4; 7H&sub2;O und 0,2 g KH&sub2;PO&sub4; pro Liter) suspendiert. Durch Trypanblau-Ausschluß zeigte sich, daß diese Zellsuspensionen zu mindestens 90% lebensfähig waren. Den Mäusen wurden die in 50 ul PBS suspendierten Tumorzellen subkutan in den rechten hinteren Fußballen injiziert. Das reguläre Protokoll (wenn es nicht anders festgestellt ist) bestand aus täglichen i.p. Injektionen von 1 ml einer 0,85%-igen NaCl-Lösung oder 1 ml 50 mM AMP, ADP oder ATP in 0,85% NaCl (aus Stammlösungen, die auf pH = 6,2 eingestellt worden waren), sie begannen einen Tag nach der Beimpfung mit dem Tumor und wurden an zehn aufeinanderfolgenden Tagen verabreicht.
Die Injektionen wurden mit Nadeln mit dem Maß 30 verabreicht, und die Mäuse wurden leicht mit Äther anästhesiert. Die Mäuse wurden vor Beginn der Behandlung und eine Woche während und nach der Behandlung gewogen. Nachdem die Tumore fühlbar geworden waren, wurde die Größe der Tumore aller drei Tage bestimmt. Die Tiere wurden getötet, die Tumore wurden herausgeschnitten und gewogen, bevor sie 10% des Gewichtes des Tieres erreichten.
Nach i.p. Injektionen von 1 ml Kochsalzlösung oder 1 ml 50 mM Adenin-Nucleotide in Kochsalzlösung wurde das Blut aus der tiefergelegenen Hohlvene (0,25 ml) in Spritzen aufgefangen (Nadel mit dem Maß 25), die Citrat enthielten (0,05 ml 93 mM Natriumcitrat, 7 mM Zitronensäure, 140 mM Dextrose, pH = 6,5). Die Mäuse wurden bei diesem Verfahren anästhesiert. Das Plasma wird durch sofortiges Zentrifugieren des Bluts in einer Beckman-Mikrozentrifuge hergestellt (30 s bei 8000 G).
Aliquote Mengen von Blut (20 ml) oder Plasma (100 ml) werden zu 1 ml kalter 7%-iger Trichloressigsäure gegeben. Die säurelöslichen Nucleotide werden 30 Minuten lang auf Eis extrahiert, und nach der Entfernung des gefällten Materials durch Zentrifugieren wird die Trichloressigsäure aus der wäßrigen Phase entfernt. Dies erfolgt durch kräftige Extraktion der wäßrigen Lösung mit 2 ml 0,5 m Tri-n-octylamin in Freon-113 (siehe Rapaport, "Compartmentalized ATP Pools Produced from Adenosine are Nuclear Pools", J. Cell Physiol., 1980, 105, 267-274). Die Bestimmung der ATP-Werte in den Extrakten erfolgt durch Bioluminometrie (Luciferin- Luciferase), wobei ein Biolumineszenz-Photometer von Turner Designs verwendet wird. Dies erfolgt nach dem Verfahren, von dem Karl DM, Holm-Hansen O. berichten: "Effects of Luciferin Concentration on the Quantitative Assay of ATP Using Crude Luciferase Preparations", Anal. Biiochem., 1976, 75, 100-112.
Die Behandung der CB6F&sub1;-Mäuse und der athymischen nu/nu-Mäuse mit täglichen i.p. Injektionen von 1 ml 50 mM Adenin- Nucleotiden in Kochsalzlösung (während 10 aufeinanderfolgenden Tagen) rief während oder nach dem Behandlungszeitraum keine Gewichtsverluste hervor, dies wird durch die in Figur 1 gezeigten Ergebnisse erläutert.
Figur 1 zeigt die Unterdrückung des Wachstums von CT26- Tumoren in CB6F&sub1;-Mäusen und Veränderungen des Körpergewichts der Wirte während und nach der Behandlung mit Adenin- Nucleotiden. Die Mäuse mit Tumor wurden mit Kochsalzlösung ( ), AMP (o), ADP (Δ) oder ATP ( ) behandelt, dies erfolgte nach den oben beschriebenen Verfahren. Figur 1 zeigt die Werte des Versuchs Nummer 4 der folgenden Tabelle 1. Die Werte sind der Durchschnitt von 11 Tieren (pro Gruppe). Bei allen gezeigten Werten überstiegen die Standardabweichungen 30% des Durchschnitts nicht.
Gelegentlich starb ein mit ATP oder ADP behandeltes Tier einige Stunden nach der Injektion. Gesunde, nicht belastete Tiere tolerieren diese Dosen jedoch und erholen sich wenige Stunden nach der Behandlung vollständig. Die Injektionen von AMP führten nicht zum Tod.
Die wachstumshemmenden Eigenschaften der Adenin-Nucleotide gegen murine CT26 Colon-Karzinome, die s.c. in den hinteren Fußballen von CB6F1-Mäusen geimpft wurden, sind in der folgenden Tabelle 1 gezeigt. Die Wirksamkeit von Adenin- Nucleotiden wird gegen starke, mittlere und geringe Tumorbelastungen nachgewiesen. Weder bei der Geschwindigkeit des Tumorwachstums noch bei der Reaktion des Tumors auf die Behandlung mit Adenin-Nucleotiden werden deutliche Unterschiede zwischen männlichen und weiblichen beobachtet. Tabelle 1. Wirkungen der Behandlungen mit Adenin-Nucleotiden auf das Wachstum von CT26-Tumoren in CB6F&sub1;-Mäusen Versuch (Anzahl der Tierepro Gruppe, Geschlecht) Behandlunga Anzahl der beimpften Tumorzellen Analysezeit (Tage nach der Beimpfung) Tumordurchmesser b cm Tumorgewichtc g Unterdrückung des Tumorwachstums (% der mit Kochsalz behandelten)d Kochsalzlösg. Keine
a Die Behandlung erfolgt wie oben beschrieben. In den Versuchen 1 und 2 wurden die Tiere mit 1 ml 25 mM ATP-MgCl&sub2; oder 1 ml 25 mM ATP behandelt. In den Versuchen 3-7 wurden die Tiere mit 1 ml 50 mM AMP, ADP oder ATP behandelt.
b Der Tumordurchmesser wurde aus L+W/2 berechnet. Durchschnittswert ± S .D. (Standardabweichung).
c Das Gewicht der Tumore im Fußballen unmittelbar nach dem Herausschneiden. Durchschnitt ± S.D.
d Die Verzögerung basierte auf den Gewichten des Tumors.
e-j Statistisch signifikante Unterschiede aus der mit Kochsalzlösung behandelten Gruppe nach dem t-Student-Test.
e P< 0,1
f P< 0,05
g P< 0,025
h P< 0,01
i P< 0,005
j P< 0,001
k AP4A, ein Nucleotid, das durch ektoenzymatische Phosphodiesterasen zu AtP und AMP abgebaut wird, wurde mit einer Konzentration von 10 mM injiziert.
l umfaßt eine vollständige Heilung.
Die folgende Tabelle 2 zeigt die Wirkungen von Adenin- Nucleotiden bei der Unterbrechung von CT26-Tumoren bei CB6F&sub1;- Mäusen und CAPAN-1 Xenotransplantaten bei athymischen nackten Mäusen. Tabelle 2. Unterbrechung des Wachstums von CT26-Tumoren in CB6F&sub1;-Mäusen und CAPAN-1 Xenotransplantation in athymischen nu/nu-Mäusen durch Brehandlung mit Adenin-Nucleotiden Versuch (Wirt, Anzahl der Tiere pro Gruppe, Geschlecht) Behandlunga Anzahl der beimpften Tumorzellen Analysezeit (Wochen nach der Beimpfung) Unterbrochene Tumore/Implantatierte Tumore (athymisch, nu/nu ,F) Kochsalzlösg.
a Die Behandlung erfolgte wie oben beschrieben. Die intraperitoneale Injektion besteht aus der Verabreichung von 1 ml Kochsalzlösung oder 1 ml 50 mM Adenin-Nucleotiden.
b-e Unterschiede zwischen diesen Gruppen und den mit Kochsalzlösungen behandelten Gruppen des gleichen Versuchs werden durch den χ²-Versuch deutlich.
b P< 0,5
c P< 0,25
d P< 0,1
e P< 0,05
Die in Tabelle 1 und 2 aufgeführten Werte legen nahe, daß die Wirksamkeit der Adenin-Nucleotide bei der Verzögerung des Wachstums von CT26-Tumoren zunimmt, wenn die Belastung mit dem beimpften Tumor mittelmäßig oder gering ist. Wenn 10&sup4; oder 5 x 10³ Tumorzellen implantiert wurden, führte die Behandlung mit Adenin-Nucleotiden zu wenig "Heilungen". "Geheilte" Mäuse bleiben vier Monate lang am Leben, ohne daß ein Tumor auftritt.
Die Konzentrationen von AMP und ATP, die geringer als 50 mM sind, sind gegen CT26-Tumore im Fußballen von CB6F&sub1;-Mäusen genauso effektiv, wenn sie durch tägliche intraperitoneale Injektion in Volumina der Kochsalzlösung von 1,4-1,8 ml verabreicht werden. Der Beginn des Behandlungschemas kann verzögert werden, bis die Tumore fühlbar sind (6-10 Tage nach der Beimpfung mit dem Tumor, wobei dies von der Anzahl der implantierten Tumorzellen abhängt), ohne daß es deutliche Einflüsse auf die Größenordnung der Verzögerung des Tumorwachstums gibt. Die Wirksamkeit der Verzögerung des Tumorwachstums hängt auch bis zu einem geringen Ausmaß vom pH-Wert der AMP- und ATP-Lösungen ab, die i.p. verabreicht werden, wobei pH-Werte von 5,5-6,2 am wirksamsten sind.
Die Wirkungen von AMP, ADP und ATP auf Human-Tumor- Xenotransplantate in nackten Mäusen wurden mit dem Adenokarzinom CAPAN-1 des Pankreaskanals ausgewertet (siehe Kyriazis AP, Kyriazis AA, Scarpelli DG, Fogh J, Rao SM, Lepera R., "Human Pancreatic Adenocarcinoma Line CAPAN-1 in Tissue Culture and the Nude Mouse", Am. J. Pathol., 1982, 106, 250-250).
Die Behandlungsschemata bestanden aus einzelnen täglichen i.p. Injektionen an 10 aufeinanderfolgenden Tagen, sie begannen einen Tag nach der Beimpfung mit dem Tumor. Die Tumorbelastung ist relativ gering (0,5-1 x 10&sup5; implantierte Zellen), und das Tumorwachstum ist gering (die Tumore wurden 4-6 Wochen nach der Beimpfung fühlbar). Die Wirkungen von AMP, ADP und ATP wurden durch die vollständige Unterbrechung des Tumorwachstums während eines Zeitraums von 6-10 Wochen ausgewertet (das Fehlen fühlbarer Tumore im Fußballen), und in allen Fällen entwickelten die tumorfreien Mäuse innerhalb eines Zeitraums von 4 Monaten keinerlei Tumore. Die in Tabelle 2 gezeigten Werte weisen die Wirkungen von Adenin- Nucleotiden auf die Unterbrechung von CAPAN-1- Xenotransplantaten bei athymischen nackten Mäusen nach.
Zum Nachweis, daß die intraperitoneal eingeführten Adenin- Nucleotide nach dem Eintritt in den systemischen Blutkreislauf die ATP-Werte im Blut und Plasma erhöhen können, wurden zu verschiedenen Zeitpunkten nach den i.p. Injektionen Blutproben aus der tiefergelegenen Hohlvene entnommen. Die in der folgenden Tabelle 3 aufgeführten Werte zeigen, daß die Verabreichung von AMP, ADP und ATP erhöhte ATP-Werte im Blut und Plasma ergab, und daß die gesamten zellulären als auch extrazellulären ATP-Konzentrationen im Blutkreislauf während eines Zeitraums von einigen Tagen höher als deren Werte in normalen Kontrollen blieben.
Die in Tabelle 3 aufgeführten Werte zeigen, daß die Größenordnung der Zunahme der ATP-Konzentrationen im Plasma mit der Zunahme der ATP-Konzentrationen im Blut (gesamtzellulär) verbunden ist. Die Zunahme der gesamten ATP- Werte im Blut nach den i.p. Injektionen von AMP oder ATP dauerte mehr als 5 Stunden und weniger als 18 Stunden an, zu diesem Zeitpunkt fielen die ATP-Pools des Gesamtblutes auf die Normalwerte zurück. Alle vergrößerten ATP-Pools werden den roten Blutzellen zugeschrieben und sind nach intensivem Waschen der abgetrennten roten Blutzellen in ausgeglichener Hanks-Salzlösung stabil. Eine langsame Freisetzung des ATP aus den roten Blutzellen, die vergrößerte ATP-Pools enthalten, ist für die Zunahmen der ATP-Werte im Plasma verantwortlich.
Die Verwendung von Citrat-Dextrose als Antikoagulans führt im Vergleich mit Heparin zu höheren Werten der ATP-Pools im Plasma (die Werte für Heparin sind nicht gezeigt). Es wurde kürzlich gezeigt, daß Citrat, jedoch nicht Heparin, die Aktivität der Phosphodiesterase des Blutplasmas hemmt, die bei der Katalyse des Abbaus von ATP wirksam ist, indem eine Chelatbildung mit zweiwertigen Kationen erfolgt, die für diese enzymatische Aktivität erforderlich sind (Luthje J. Ogilvie A., "Catabolism of Ap&sub3;A und Ap&sub4;A in Human Plasma. Purification and Characterization of Glycoprotein Complex with 5'-Nucleotide Phosphodiesterase Activity", Eur. J. Biochem., 1985, 149, 119-127). Die Unterdrückung dieser Phosphodiesterase-Aktivität während der kurzen Zeit der Plasmapräparation ist vermutlich für die höheren ATP-Werte des Plasmas verantwortlich, die durch Verwendung dieses Antikoagulans erhalten werden. Tabelle 3. ATP-Werte im Blut (gesamtzellulär) und Plasma der Maus nach i.p. Injektionen von Adenin-Nucleotiden Wirt Behandlunga ATP-Werte des Blutsb (Stunden nach der Behandlung) mM ATP-Werte des Plasmasb (Stunden nach der Behandlung) uM athymisch nu/nu Kochsalzlösg.
a Jede Maus (7-9 Wochen alt, weiblich) empfing i.p. Injektionen von 1 ml Kochsalzlösung oder 1 ml 50 mM AMP, ADP oder ATP in Kochsalzlösung, und die Verfahren erfolgten wie oben beschrieben.
b Jede Gruppe bestand aus drei Mäusen und die Werte werden als Durchschnitt ± S.D. ausgedrückt. Die Blutentnahme erfolgte innerhalb von 15 Minuten zu den Zeitpunkten von 1 Stunde und innerhalb von 30 Minuten zu den Zeitpunkten von 4 und 5 Stunden. Die entsprechenden ATP-Werte des Blutes und des Plasmas wurden in allen Fällen bei den gleichen Blutproben bestimmt.
Es wurden weitere Versuchsreihen durchgeführt, wobei Tumore geimpft wurden. Dies erfolgte durch Injektionen von 2,5 x 10&sup5; CT26-Zellen (Lebensfähigkeit über 90%) in 50 ul einer mit Phosphat gepufferte Kochsalzlösung in den rechten hinteren Fußballen von CB6F&sub1;-Mäusen. Die Behandlungen wurden nach der Beimpfung mit den Tumoren zu verschiedenen Zeitpunkten eingeleitet. Die Injektionsschemata begannen entweder 1 oder 5 Tage nach der Beimpfung mit dem Tumor, wenn keiner der Tumore fühlbar war, oder wenn die Tumore deutlich fühlbar waren (durchschnittliches berechnetes Gewicht 100 mg), dies trat nach 8-11 Tagen bei 100% der beimpften Mäuse auf. Die Mäuse wurden regellos in Gruppen eingeteilt, und es wurden täglich 2,2 ml Kochsalzlösung, Adenosin, AMP oder ATP injiziert (die Verbindungen liegen in sterilen Kochsalzlösungen bei Konzentrationen von 25 mM vor, wobei die AMP und ATP-Lösungen auf pH = 6,2 eingestellt worden waren). Die Injektionen wurden intraperitoneal mit Nadeln mit dem Maß 30 verabreicht, und die Mäuse wurden leicht mit Äther anästhesiert. Vor Beginn des Behandlungschemas und aller drei Tage während und nach dem Behandlungsschema wurden die Mäuse gewogen und die Größen der Tumore gemessen. Diese Bestimmungen wurden während des Behandlungszeitraums vor den Injektionen durchgeführt.
Das Blut (0,25 ml) wurde aus der tiefergelegenen Hohlvene in 1 ml Spritzen aufgefangen (Nadeln mit dem Maß 26), die entweder Citrat-Dextrose (0,05 ml 93 mM Natriumcitrat, 7 mM Zitronensäure, 140 mM Dextrose, pH = 6,5) oder Natriumheparin (0,05 ml von 3 Einheiten Natriumheparin in Kochsalzlösung) enthielten. Die Mäuse wurden bei diesem Verfahren mit Äther anästhesiert. Plasma oder Hanks gepuffertes Kochsalzlösungsmedium BSS (ausgeglichene Salzlösung) von beimpften isolierten RBC (roten Blutzellen) werden durch Zentrifugieren des Gesamtblutes oder der RBC in einer Bechman-Mikrozentrifuge hergestellt (30 s bei 8000 G), und Proben mit 100 ul werden zu 1 ml eisgekühlter 7%-iger Trichloressigsäure gegeben. Die roten Blutzellen werden durch Zentrifugieren des Gesamtbluts (1500 G, 5 Minuten lang bei 4ºC) hergestellt, und der Entfernung des Plasmas und der Leukozytenmanschette folgt das Waschen mit pelletierten RBC (aus 250 ul des Gesamtblutes) in 5 ml eisgekühlter Hanks-BSS. Nach dem Zentrifugierverfahren wird das RBC-Pellet erneut in Hanks-BSS suspendiert, so daß mit dem ursprünglichen Hämatokrit das Gesamtvolumen erreicht wird (Prozent des RBC- Volumens im Gesamtblut). Aliquote Mengen von 20 ul RBC- Suspensionen oder Gesamtblut werden zu 1 ml eisgekühlter 7 %iger Trichloressigsäure gegeben. Die Extraktion der säurelöslichen Nucleotide und die Bestimmungen der ATP-Werte durch Luminometrie folgte den bereits beschriebenen Verfahren. Die Werte von [³H]ATP im Gesamtblut, RBC, Plasma oder RBC-Inkubationsmedium (Hanks-BSS) wurden nach der Einführung von 250 uCi [³H]Adenosin mit der bestimmten Radioaktivität von 30 Ci/mMol (1 Ci = 3,7 x 10¹&sup0; Becquerel) in das Gesamtblut oder die RBC-Suspensionen (gesamt 250 ul) und anschließende sofortige Extraktionen mit Trichloressigsäure bestimmt, wie es oben beschrieben ist. Es wurde eine zweidimensionale Dünnschichtchromatographie auf Poly(ethylen) imincellulose mit einem nichtmarkierten ATP- Träger durchgeführt, dies erfolgte nach Bochner und Ames, J. Biol. Chem., 257, S. 9759-9769, 1982. Zur Bestimmung der [³H]ATP-Pools im Gesamtblut oder den abgetrennten RBC werden 10 ul 1 ml Trichloressigsäure-Anfangsextrakt chromatographiert. Die Bestimmungen der [³H]ATP-Werte im Blutplasma oder im RBC-Inkubationsmedium erfolgten auf 300 ul des ersten 1 ml Trichloressigsäureextraktes, die gefriergetrocknet und erneut in 15 ul Wasser gelöst worden waren. Nach der Chromatographie werden die Spots, die dem ATP-Träger entsprechen, herausgetrennt, mit 0,5 ml 4n Ammoniumhydroxid eluiert, und die Radioaktivität wird in 10 ml eines Szintillationsfluids bestimmt.
Die therapeutische Wirksamkeit der Adenon-Nucleotide wird gegen das murine CT26-Colon-Adenokarzinom im Fußballen nachgewiesen, das in CB6F&sub1;-Mäusen gewachsen war. Siehe insbesondere Figur 2. Figur 2 zeigt die Verzögerung des Tumorwachstums (---) und den Gewichtsverlust des Wirtes ( ) bei Mäusen mit Tumor durch die Behandlung mit Adenin- Nucleotiden. Mäuse (CB6F&sub1;, 8 Wochen alt, männlich), die fühlbare CT26-Tumore im Fußballen hatten (am Tage 9 nach der Beimpfung mit dem Tumor) wurden mit Kochsalzlösung ( ), Adenosin (o), AMP (Δ) oder ATP ( ) behandelt, wie es hier beschrieben ist. Es ist auch eine unbehandelte Gruppe enthalten (x). Die Pfeile zeigen die Tage der Injektion. Dieser repräsentative Versuch beinhaltete 10 Tiere pro Behandlungsgruppe und die Werte werden als Durchschnittswerte ± S.D. ausgedrückt. Vor dem Tag 22 nach der Beimpfung mit dem Tumor trat kein Tod auf.
Die tägliche i.p. Verabreichung von AMP und ATP in 2,2 ml Kochsalzlösung (bei pH = 6,2) während eines Zeitraums von 12 Tagen, die begann, nachdem die Tumore fühlbar waren, verzögerte das Wachstum dieses schnellwachsenden Tumors deutlich. Äquimolare Mengen Adenosin (siehe Figur 2) zeigten viel geringere Wirkungen gegen Krebs, wohingegen äquimolare Mengen von entweder anorganischem Phosphat oder anorganischem Pyrophosphat in einer Kochsalzlösung mit pH = 6,2 bei identischen Bedingungen ohne jegliche Wirkungen auf das Wachstum von CT26-Tumoren in CB6F&sub1;-Mäusen sind. Die Größenordnung der Wirkungen von AMP und ATP gegen Tumore hängt in einem geringen Ausmaß vom pH-Wert der intraperitoneal verabreichten Lösung ab. Diese Eigenschaft hängt möglicherweise mit der Anzahl der negativen Ladungen auf den Phosphatgruppen ab (der pKS-Wert des sekundären Phosphats beträgt etwa 6,6). AMP und insbesondere ATP haben eine gewisse Pufferkapazität, und bei einem pH-Wert von weniger als 6,6 tragen sie eine geringere Nettoladung als beim physiologischen pH-Wert. Die geringere Ladung dieser Moleküle verbessert den anfänglichen Transport (erste Stunde) von AMP und ATP durch die peritoneale Membran und in den Körperkreislauf (siehe Torres et al., 1978, Pharmacol., 17, 330-340). Es zeigt sich keine Verzögerung des Tumorwachstums, wenn entweder AMP oder ATP nach dem gleichen Schema der 12 aufeinanderfolgenden Tage verabreicht wird, das einen Tag vor der Beimpfung mit dem Tumor endet. Das Behandlungschema der fühlbaren CT26-Tumore, das in Figur 2 gezeigt ist, ergibt beständig 10-20% "Heilungen". Diese Mäuse bleiben mindestens zwei Monate lang tumorfrei. Bei der Anwendung bei fühlbaren Tumoren ist die Verzögerung des Tumorwachstums durch ATP stärker, als sie mit AMP erhalten wird (Figur 2). AMP ist jedoch bei der Verzögerung des Tumorwachstums beim gleichen Modellsystem genauso wirksam, wenn das Behandlungsschema einen Tag nach der Beimpfung mit dem Tumor beginnt.
Figur 3 zeigt außerdem die Verzögerung des Gewichtsverlustes des Wirtes bei Tieren mit Tumor durch die Behandlung mit Adenin-Nucleotiden. Mäuse (CB6F&sub1;, männlich, bei A 7 Wochen alt, bei B, C 10 Wochen alt) werden mit CT26-Tumoren beimpft und die täglichen Behandlungen (während 10 aufeinanderfolgenden Tagen) mit Kochsalzlösung ( ), Adenosin (o), AMP (Δ) oder ATP ( ) begannen 1 Tag (A), 5 Tage (B) oder 9 Tage nach der Beimpfung mit dem Tumor (wenn alle Tumore fühlbar waren) (C). Die Pfeile zeigen die Tage der Injektion. Die Versuchsverfahren sind im Text aufgeführt. Jede Behandlungsgruppe umfaßte 10 Tiere, und die Werte sind als Durchschnitt ± S.D. ausgedrückt. Vor dem Tag 19 (A) oder 25 (B, C) trat kein Tod auf.
Wenn die Behandlungschemen lange vorher enden, ehe die Tumore relativ groß werden, kann die Verzögerung der Geschwindigkeit des Gewichtsverlustes mit der Verzögerung des Tumorwachstums in Zusammenhang gebracht werden, wobei Adenosin nur einen geringen Einfluß auf jedes dieser beiden Phänomene hat (Figuren 3A und 3B). Wenn Adenin-Nucleotide nur dann verabreicht werden, nachdem die Tumore fühlbar wurden, wurden die CT26-Tumore während des Behandlungsschemas immer größer (Figuren 2 und 3C). In diesem Fall kann die Verzögerung des Tumorwachstums von der Verzögerung des Gewichtsverlustes getrennt werden. Beim Vergleich von Tumoren mit ähnlichen Größen zeigen die Werte in Figur 2, daß Adenosin - und in einem etwas größeren Ausmaß AMP und ATP - den Gewichtsverlust in einer Weise verzögert, die von deren verzögernden Wirkungen auf die Größen der Tumore getrennt werden kann. Ein weiterer Weg zum Nachweis des gleichen Phänomens besteht in der Anwendung einer Vielzahl von Behandlungsschemen, wobei eines beendet ist, ehe der Gewichtsverlust auftritt (Figur 3A), während das andere Behandlungsschema zu dem Zeitpunkt abgeschlossen ist, wenn eine Beobachtung der Gewichtsverluste beginnt (Figur 3B) und das dritte Behandlungsschema während des Zeitraums der Gewichtsverluste der Mäuse mit Tumor angewendet wird (Figur 3C). Es wird hier festgestellt, daß die stärkste Verzögerung des Gewichtsverlustes des Tieres auftritt, wenn ein 10-tägiges tägliches Injektionsschema einen Tag nach der Beimpfung mit den Tumoren eingeleitet wird, wenn diese fühlbar sind (Figur 3C). Der frühere Beginn des gleichen Injektionsschemas am Tag 1 oder am Tag 5 nach der Beimpfung mit dem Tumor führte zu geringeren Werten der Verzögerung des Gewichtsverlustes (Tag 5) oder einer Verzögerung des Gewichtsverlustes, die nur das Ergebnis von kleineren Tumoren in den behandelten Tieren ist (Tag 1) (Figuren 3A und 3B).
Die Vergrößerung der ATP-Pools in RBC nach den intraperitonealen Injektionen und die langsame Freisetzung von ATP aus den RBC ist in der folgenden Tabelle 4 gezeigt.
Einzelne intraperitoneale Injektionen von 2 ml 35 mM AMP oder ATP in Kochsalzlösung bei einem pH-Wert von 6,2 bei CB6F&sub1;- Mäusen führte zu Vergrößerungen der ATP-Pools in den RBC dieser Mäuse (siehe Figur 4). Tabelle 4. Vergrößerung der RBC ATP-Pools und der ATP-Werte im Blutplasma 5 Stunden nach intraperitonealen Injektionen von AMP und ATP bei Mäusen* Verabreichte Verbindung RBC ATP-Pools&spplus; mM ATP-Werte im Plasma&spplus; uM [³H]ATP-Werte im Plasma unmittelbar nach der Einführung von [³H]Adenosin in das Gesamtblut, uM Kochsalzlösg. Adenosin * Das Blut wurde in eine Spritze entnommen, die als Antikoagolans Citrat-Dextrose enthielt. [³H]Adenosin wurde 10 Sekunden lang durch das Gesamtblut aufgenommen, und die Hälfte der Blutprobe ließ man sofort absetzen, um das Plasma abzutrennen. Die andere Hälfte wurde zur Abtrennung der gewaschenen RBC verwendet, die erneut in einem Volumen von Hanks-BSS suspendiert wurden, um das ursprüngliche Hämatokrit zu erhalten, ehe eine aliquote Menge für die ATP-Bestimmung entnommen wurde. Die [³H]ATP-Werte des Plasmas wurden aus der Radioaktivität des [³H]ATP des Plasmas berechnet, nachdem sie mit der spezifischen Radioaktivität der [³H]ATP-Pools der RBC in Zusammenhang gebracht worden waren, die wiederum durch Bioluminometrie und zweidimensionale Dünnschichtchromatographie bestimmt worden war. Die Werte zeigen die Durchschnittswerte ± S.D. von drei getrennten Versuchen. + Durch Bioluminometrie bestimmt.
Die Vergrößerungen der ATP-Pools der RBC nach i.p. Injektionen von AMP oder ATP konnte 30 Minuten nach den Injektionen nachgewiesen werden und dauerte etwa 6-8 Stunden, nachdem die Nucleotide vollständig durch die periotoneale Membran und in den Körperkreislauf adsorbiert worden waren. Die Adsorbtionsgeschwindigkeit der intraperitonealen AMP- oder ATP-Lösungen schwankte bei unterschiedlichen Stämmen der Mäuse. Die Vergrößerungen der ATP-Pools der RBC sind mit den Zunahmen vergleichbar, die bei den ATP-Werten des Gesamtblutes nach ähnlichen i.p. Injektionen von AMP oder ATP beobachtet wurden, wie es oben in Tabelle 3 gezeigt ist. Bei ähnlichen Werten wie von AMP oder ATP ist Adenosin bei der Vergrößerung der ATP-Pools der RBC der Maus nur wenig effektiv (Tabelle 4). Die ATP-Werte im Plasma (extrazellulär) sind nach der i.p. Verabreichung von AMP oder ATP deutlich gestiegen. Diese ATP-Werte des Plasmas stammen von RBC, da sie durch [³H]Adenosin metabolisch markiert werden können. Die ATP-Pools des Plasmas, die von den dichten Granula der Blutplättchen stammen, würden bei den gleichen Bedingungen nicht radioaktiv markiert (z. B. Holmsen, 1985, Seminars in Hematol, 22, 219-240). Die in Tabellen 4 und 5 beschriebenen Versuche umfassen die Aufnahme von [³H]Adenosin durch das Gesamtblut (Tabelle 4) oder abgetrennte gewaschene RBC (nachfolgende Tabelle 5) in beiden Fällen wird das gesamte extrazelluläre ATP, das Sekunden nach der Aufnahme von [³H]Adenosin bestimmt wird, metabolisch markiert. Tabelle 5. Stabilität der vergrößerten ATP-Pools der RBC nach intraperitonealen Injektionen von AMP und ATP bei Mäusen* Verabreichte Verbindung RBC ATP-Pools&spplus; mM (37ºC) ATP-Werte im Medium (Hanks-BSS) uM [³H]ATP-Werte im Medium(Hanks-BSS) unmittelbar nach der Einführung von [³H]Adenosin in abgetrennte gewaschene RBC (zum Zeitpunkt 0); uM Kochsalzlösg. Adenosin * Das Blut wird in eine Spritze abgezogen, die Citrat- Dextrose enthält. Das Plasma und die Leukozytenmanschette wurden nach dem Zentrifugieren entfernt, und die RBC wurden mit 5 ml Hanks-BSS gewaschen. Die RBC wurden erneut in einem Volumen der Hanks-BSS suspendiert, um das ursprüngliche Hämatokrit zu erhalten, und [³H]Adenosin wurde 10 Sekunden lang von den Zellen aufgenommen. Eine aliguote Menge der qesamtem Zellsuspension wurde in 1 ml Trichloressigsäure fixiert, und die restliche RBC-Suspension wurde für die Bestimmung des Zeitpunktes von 120 Minuten verwendet oder wurde für die Abtrennung des Mediums zentrifugiert. Die ATP- Werte im Medium wurden zum Zeitpunkt 0 bestimmt. Die Bestimmungen der [³H]ATP-Werte im Hanks-BSS-Inkubationsmedium waren mit den Bestimmungen identisch, die im Blutplasma vorgenommen wurden, diese sind in der Fußnote zur Tabelle 4 beschrieben. Die Werte zeigen den Durchschnitt von zwei getrennten Versuchen. + Durch Bioluminometrie bestimmt.
Das radioaktiv markierte [³H]ATP im Blutplasma (Tabelle 4) oder in dem Medium, in dem die gewaschenen RBC suspendiert sind (Tabelle 5) zeigen gute Zusammenhänge zu den tatsächlichen ATP-Werten, die durch Bioluminometrie bestimmt wurden. Deshalb wird die Schlußfolgerung gezogen, daß der Ursprung für die ATP-Werte des Plasmas in den ATP-Pools der RBC liegt. Die Erkenntnisse, daß die Verhältnisse der ATP- Werte des Plasmas oder des Mediums zu den zellulären (RBC) ATP-Pools zunehmen, wenn die ATP-Pools der RBC größer werden, legen nahe, daß die Freisetzung von ATP aus den RBC in das extrazelluläre Kompartiment ein spezifisches Verfahren darstellt, das möglicherweise nicht mit der Hämolyse der RBC in Zusammenhang steht. Ein ähnlicher Hämolysegrad der RBC während der 40 Sekunden (10 Sekunden der Markierung und 30 Sekunden der Zentrifugierung), die vom Zeitpunkt der Aufnahme des [³H]Adenosins bis zum Zeitpunkt der Abtrennung und Fixierung des extrazellulären Mediums vergingen, führte zu ähnlichen Verhältnissen der ATP-Werte der RBC zu den extrazellulären Werten bei allen Behandlungsformen. Mäuse, denen AMP oder ATP injiziert worden war, zeigen nicht nur größere ATP-Pools der RBC im Vergleich mit mit Kochsalzlösung oder Adenosin behandelten Mäusen, sondern auch höhere ATP- Werte des Plasmas im Verhältnis zu ihren (vergrößerten) ATP- Pools der RBC (Tabelle 4).
Die Stabilität der vergrößerten ATP-Pools der RBC in vitro wurde ebenfalls nachgewiesen. Zweistündige Inkubationen der gewaschenen, abgetrennten RBC, die normale und vergrößerte ATP-Pools enthielten, in Hanks-BSS führten zu einer relativ geringen Abnahme der ATP-Pools der RBC, wobei die vergrößerten Pools ausreichend über den Normalwerten gehalten wurden (Tabelle 5). Die Vergrößerungen der ATP-Pools der RBC nach der i.p. Verabreichung von AMP oder ATP in vivo ist wahrscheinlich das Ergebnis ihrer Dephosphorylierung, gefolgt von der Adenosinaufnahme der RBC, die in situ entsteht. Die in vitro Behandlung des Gesamtblutes der Maus mit AMP oder ATP führte zu unwesentlichen Zunahmen der ATP-Pools der RBC (siehe folgende Tabelle 6). Tabelle 6. Geschwindigkeiten des Abbaus von 1 mM ATP durch Blut der Maus oder des Menschen in vitro in Gegenwart von Heparin oder Citrat als Antikoagulans. Fehlende Vergrößerung der ATP- Pools der RBC bei den gleichen Bedingungen* Geschwindigkeit des extrazellulären ATP-Abbaus Blut der Maus pmol/ul min Humanblut pmol/ul min Citrat Heparin Zugesetztes Nucleotid (1 mM) RBC ATP-Pools&spplus; (nach 30-minütigen Inkubationen in heparinisiertem Blut der Maus) Adenosin Kochsalzlösung *Blut (450 ul) wurde in eine Spritze abgezogen, die entweder 50 ml Citrat-Dextrose oder 50 ml Heparin (100 E/ml) enthielt. Das gesamte Blut wurde dann zu 1 mM [³H]ATP in Kochsalzlösung (25 ml) gegeben, und zu unterschiedlichen Zeitpunkten wurden aliquote Mengen des Bluts (90 ul) entnommen und zentrifugiert. Das Plasma (20 ul) wurde abgezogen und zu 1 ml eisgekühlter Trichloressigsäure gegeben. Die Dünnschichtchromatographie auf Poly(ethyen)imincelullose erfolgte nach veröffentlichten Verfahren. Die Geschwindigkeit des Abbaus von 1 mM [³H]ATP war während der ersten 30-minütigen Inkubation bei 37ºC für das Blut der Maus oder des Menschen linear. + Nach Beimpfungen des Gesamtblutes mit 1 mM der beschriebenen Verbindung wurden die ATP-Pools der RBC in isolierten gewaschenen RBC durch Bioluminometrie bestimmt. Die Werte sind Durchschnittswerte ± S.D. von drei getrennten Versuchen.
Der in vitro Abbau von ATP verläuft in heparinisiertem Blut im Vergleich zu citriertem Blut schneller, dies bestätigt erneut die Rolle der Phosphodiesterase(n) des Plasmas bei der Katalyse dieser Abbaureaktion (siehe Luthje, 1985, Eur. J. Biochem., 149, 119-127). Es hat sich gezeigt, daß Citrat eine Chelatbindung mit den Metallkationen zeigt, die für diese Aktivität erforderlich ist (siehe Luthje, vorstehend). Deshalb wird die Schlußfolgerung gezogen, daß die in vivo Bildung von Adenosin durch die in situ Dephosphorylierung von AMP oder ATP ektoenzymatische Aktivitäten erfordert, die im Gefäßbett vorhanden sind. Es muß darauf hingewiesen werden, daß der Abbau von ATP durch Humanblut bei identischen Bedingungen in vitro langsamer verläuft als der Abbau von ATP durch das Blut der Maus (Tabelle 6).
Normale Werte von ATP im Humanplasma sind submikromolar, z. B. etwa 0,1-0,5 uM. Die für die Zwecke dieser Erfindung erforderlichen höheren Werte müssen nur eine Größenordnung größer sein, z. B. etwa 1 bis etwa 5 uM.
Die vorstehend erläuterten Werte führen zu folgenden Schlußfolgerungen:
1. Adenin-Nucleotide können verwendet werden, um die gesamtzellulären ATP-Pools (Werte des stabilen Zustands) von pathologisch normalen RBC zu vergrößern und damit diese RBC ihre vergrößerten ATP-Pools langsam in das Kompartiment des extrazellulären Blutplasmas abgeben.
2. Das Verhältnis der extrazellulären ATP-Pools zu den gesamten ATP-Pools der RBC nimmt in der folgenden Reihenfolge der Behandlung zu: Kochsalzlösung < Adenosin < AMP < ATP (Tabelle 4); und deshalb hat die Freisetzung der ATP-Pools der RBC wahrscheinlich ihren Ursprung in einem (mehreren) Mechanismus (Mechanismen), die von der Hämolyse verschieden sind (oder zusätzlich dazu auftreten), die bei allen Behandlungsgruppen zu ähnlichen Verhältnissen der extrazellulären ATP-Werte zu den ATP- Pools der gesamten RBC führen würde.
3. Endotheliale Zellen oder Blutplättchen stellen bei den oben aufgeführten Werten nicht die in vivo Quelle des ATP des extrazellulären Blutplasmas dar. Die in vivo Quelle der erhöhten ATP-Werte des Blutplasmas (extrazellulär) sind die RBC.
4. Behandlungen mit Adenin-Nucleotid sind vorteilhaft, damit eine deutliche Verzögerungswirkung des Tumorwachstums erreicht wird, dies wird durch die Ergebnisse nachgewiesen, die nach täglichen i.p. Injektionen von AMP oder ATP erreicht wurden, die zu dem Zeitpunkt begannen, wenn der aggressive schnellwachsende CT26-Tumor bei syngenen Mäusen fühlbar war. Der Nachweis der wesentlichen Verzögerung des Tumorwachstums nach Verabreichung von AMP oder ATP an Wirte mit Tumor erfolgte in nichtbegrenzender Weise bei murinen (Maus-)Modellen. Dieses Modell wird üblicherweise bei der Auswertung der therapeutischen Wirksamkeit und der Toxizität von chemotherapeutischen Krebsmitteln für den Wirt verwendet.
5. Die klinische Anwendbarkeit dieser Antikrebsbehandlung mit Adenin-Nucleotiden wird nach dieser Erfindung durch ihre nachgewiesene Verzögerung des Gewichtsverlustes des Wirtes bei Tieren mit Tumor verbessert, wenn die Tumore immer größer werden. Zu diesem Zeitpunkt werden die Wirkungen der Krebskachexie im Wirt offensichtlich. Die Verabreichung von AMP oder ATP an Wirte mit Kachexie ergibt eine Behandlung, die sowohl das Tumorwachstum als auch die schädlichen Wirkungen der Kachexie auf das Körpergewicht des Wirtes durch Verfahren verzögert, die kein Verhältnis von Ursache-Wirkung haben.
6. Die Anwendung von AMP für die Behandlungen von Wirten mit Tumor kann für die gleichen Zwecke gegenüber der Verwendung von ATP bevorzugt sein, da AMP in diesen Wirtstieren weniger Nebenwirkungen als ATP hervorruft.

Claims

1. Verwendung von Adenosin-5'-phosphat als wirksame Substanz oder pharmazeutisch verträgliche Salze, Chelate oder Radionuclide davon, zusammen mit üblichen Trägersubstanzen für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung der Krebskachexie.

2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß diese wirksame Substanz Adenosin-5'-triphosphat ist.

3. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß diese wirksame Substanz Adenosin-5'-diphosphat ist.

4. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß diese wirksame Substanz Adenosin-5'-monophosphat ist.