MC1423A1

MC1423A1 - Production microbienne d'interferon de fibroplaste humain

Info

Publication number: MC1423A1
Application number: MC811542A
Authority: MC
Inventors: Roberto Crea; Goeddel David Van Norman
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 1980-09-25
Filing date: 1981-09-24
Publication date: 1982-10-18
Also published as: MY8600634A; IE812224L; NZ198445A; DD202085A5; SE8105657L; ES505742A0; ES515033A0; PT73728B; ES8307297A1; EP0048970A2; IT8124109A0; FR2490675A1; DK423381A; FI812993L; DD209477A5; ES8306325A1; CH656388A5; ATA410381A; ZW23981A1; DE3138096A1

Description

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5 La présente invention concerne le domains d3

la technologie de l'ADN recombinant, c'est-à-dire les procédés utilisés dans la technologie de 1'ADN recombinant et les produits obtenus par ces procédés.

Dans un aspect plus détaillé, l'invention concerne des poly-peptides, en particulier de 1'interféron de Fibroblaste humain mûr, les compositions pharmaceutiques qui les contiennent et un procédé pour leur préparation qui implique de Faire croître une culture d'un micro-organisme traasformé par un véhicule d'expression microbienne réplicable capable 1a d'exprimer lesdits polypeptides, et d'exprimer lesdits polypeptides. L'invention comprend également les véhicules d'expression utilisés dans ce pr.océdé et les nouveaux micro-organismes contenant ces véhicules d'expression ainsi que les procédés pour leur préparation, tnfin, l'invention 20 concerne des séquences d'ADN comprenant des séquences codant pour la séquence d'acides aminés d'un interféron de Fibroblaste humain mûr.

L'interFéron de Fibroblaste humain [FIF] est une protéine qui présente une activité antivirale ainsi qu'un 25 large éventail d'autres activités biologiques [on en trouvera une étude dans W.E. Stewart II, The InterFeron System, Springer-Verlag, New York-Wien, Il a été signalé qu'il a été puriFié jusqu'à homogénéité sous la Forme d'un seul polypeptide avec un poids moléculaire de 13DL)Q-cdQUDQ ayant 3D une activité spéciFique de d-10 x 10 unités/mg [£. Knight,

Proc. Natl. Acad. Sci . USA 73, 52D-5iï:3 C1^7ô3; W. Uerthold et col., J. Biol. Chem. <^53, i5c20i5-L5ci îd Cly7b]]. On a déter-

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miné que la séquence des treize acides aminés NH-j-terminaux de FIF est Met-Ser-Tyr-Asn-Leu-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln-Arg-Ser-Ser- CE. Knight et col., Science 207, 525-526 [198033. Houghton et col. [Nucleic Acides Fies. 8, 1913-1331 [198033 5 ont'utilisé des désoxyoligonucléotides de synthèse

[prédits à partir de cette séquence d'acides aminés} pour déterminer l'a séquence des 27S nucléotides 5'-terminaux de l'ARNm de FIF. Taniguchi et col. [Nature 2B5, 547-549 [19803; Gene 10, 11-15 [1980} et Derynck et col. [Nature 10 285, 542-547 [19803 3 ont pu récemment identifier la séquence de nucléotides de copies d'ADNc clonées d'ARNm de FIF chez E. coli et en ont déduit la séquence complète d'acides aminés du FIF humain y compris une séquence signal de 21 acides aminés. Le peptide mûr a 166 acides aminés de 15 long. Enfin, Taniguchi et col. [Proc. Natl Acad Sci. USA 77, 5230-5233 C198033 ont construit un plasmide qui dirige l'expression chez E. coli du gène de FIF humain donnant le FIF mûr.

Avec l'avènement de la technologie de l'AON 20 recombinant, la production microbienne modulée d'une énorme variété de polypeptides utiles est devenue possible. On dispose déjà de bactéries modifiées par cette technique pour permettre la production de produits polypeptidiques tels que la somatostatine, les chaînes A et B de l'insuline 25 humaine, l'hormone de croissance humaine [Itakura et col., Science 198, 1056-1063 C19773; Goeddel et col., Nature 281, 544-548 ["137933 . PÎUS récemment, on a utilisé les techniques de l'AON recombinant pour occasionner la production bactérienne de proinsuline, de thymosine et d'interféron de 30 leucocyte.

La cheville ouvrière de la technologie de 1 * ADN recombinant est le plasmide, boucle non chromosomique d'ADN à deux brins que l'on trouve chez les bactéries et d'autres microbes, souvent à de multiples exemplaires par 35 cellule. Dans l'information encodée dans l'ADN du plasmide

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est incluse celle qui est nécessaire pour reproduire le plasmide dans les cellules Filles [c'est-à-dire un "réplicon"] et, ordinairement, une ou plusieurs caractéristiques de sélection comme, dans le cas des bactéries, la ^ résistance aux antibiotiques qui permet à des clones de la' cellul e-hôte contenant le plasmide intéressant d'etre reconnus et cultivés de Façon préférentielle dans des milieux sélectifs. L'utilité des plasmides tient au fait qu'on peut les cliver de façon spécifique par l'tune ou -JO l'autre des endonucléases de restriction ou "enzymes de restriction", dont chacune reconnaît un site différent sur l'ADN plasmidique. On peut ensuite insérer des gènes ou fragments de gènes hétérologues dans le plasmide en les adjoignant à la suite au site de clivage ou aux extrémités 15 reconstruites adjacentes au site de clivage. La recombinaison de l'ADN s'effectue à l'extérieur de ia cellule, mais le plasmide "recombinant" qui en résulte peut y être introduit par un processus connu sous le.nom de transformation et l'on obtient de grandes quantités de plasmide recombi-20 nant contenant le.gène hétérologue en cultivant le transformant. De plus lorsque le gène est correctement inséré par rapport aux Fractions du plasmide qui gouvernent la transcription et de traduction du message le véhicule d'expression obtenu peut être utilisé pour produire effectivement 25 la séquence polypeptidique pour laquelle le gène inséré code, processus appelé expression.

L'expression est amorcée dans une ré.gion connue sous le nom de promoteur qui est reconnue par et liée par l'iARN polymérase. Dans certains cas, comme dans le promo-30 teur de tryptophane du "trp" préféré dans la pratique de l'invention, les régions promotrices se chevauchent avec des régions "opératrices" pour former un promoteur-opérateur combiné. Les opérateurs sont des séquences d'ADN qui sont reconnues par ce qu'on appelle des protéines répresseurs 35 servant à régler la fréquence d'initiation de transcription

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à un promoteur particulier. La polymérase se Replace le long de l'ADN, transcrivant l'information contenue dans les brins d'encodage de son extrémité 5' à son extrémité 3' dans un AFIN messager qui est à son tour traduit en un polypepti-5 de ayant la séquence d'acides aminés pour laquelle l'ADN code. Chaque acide aminé est encodé par un triplet de nucléotides ou "codon" au sein de ce qu'on peut appeler dans l'optique présente le "gène de structure", c'est-à-dire la partie qui encode la séquence d'acides aminés du 10 produit exprimé. Après s'être liée au promoteur, l'ARN polymérase commence par transcrire les nucléotides qui encodent un site . de liaison ribosomique, puis un signal d'initiation de traduction ou signal "départ" [ordinairement ATG, qui dans l'ARN messager résultant devient AUG], 15 puis les codons de nucléotides dans le gène de structure lui-même. Ce qu'on appelle des codons d'arrêt sont transcrits à l'extrémité du gène de structure, après quoi la polymérase peut former une séquence additionnelle d'ARN messager qui, à cause de la présence du signal 20 d'arrêt, restera non traduite par les ribosomes. Les ribo-somes se fixent au site de liaison ménagé sur l'ARN messager, chez les bactéries ordinairement au fur et à mesure que 1'ARNm est formé, et produisent eux-mêmes le polypeptide encodé, commençant au signal de départ de 25 traduction et finissant au signal d'arrêt mentionné ci-

dessus. Le produit désiré est produit si les séquences qui encodent le site de liaison ribosomique sont positionnées correctement vis-à-vis du codon d'initiation AUG et si tous les codons restants suivent le codon d'initiation en 30 phase. Le produit résultant peut être obtenu en lysant la cellule-hôte et en recueillant le produit par une purification appropriée à partir d'autres protéines bac tér i ennes.

Bien que l'isolement à partir de fibroblastes 35 de donneurs ait fourni suffisamment de matière pour une h

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1 D

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oaractérisation partielle et des études cliniques limitées avec de l'interféron de leucocyte homogène, c'est une source totalement inadaptée aux quantités d'interféron nécessaires pour des essais cliniques à grande échelle et pour une utilisation prophylactique et/ou thérapeutique à grande échelle ultérieurement. De fait, les recherches cliniques employant des interférons humains dérivés de fibroblastes dans des essais antitumoraux et antiviraux se sont principalement limitées jusqu'ici à des préparations brutes Cpures à moins de 1%] de la matière, et de longs délais de fabrication de quantités suffisantes, sans même tenir compte du prix, ont retardé de façon critique les recherches sur un front étendu.

Cn s'est apperçu que 1'-.application de la technologie de l'ADN recombinant serait la manière la plus efficace de fournir de grandes quantités d'interféron de fibroblaste qui, en dépit de l'absence dans la matière ainsi produite de la glycosylation caractéristique de la matière d'origine humaine, pourrait être employé clinique-ment dans le traitement d'une large gamme de maladies virales et néoplasiques, et on a réussi à produire de l'interféron de fibroblaste humain mûr par un moyen microbien, en construisant un gène à cet effet susceptible d'être alors inséré dans des véhicules d'expression microbienne- et exprimé sous le contrôle de commandes régulatrices des gènes microbiens.

L'approche adoptée pour obtenir un gène de Fibroblaste comprend les travaux suivants:

1. On utilise des séquences partielles d'acides aminés d'interféron de fibroblaste humain pour construire des ensembles d'échantillons d'ADN de synthèse dont les codons, dans l'agrégat représentent toutes les combinaisons possibles capables d'encoder les séquences partielles d'acides aminés.

2. On prépare des banques de colonies bactériennes

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contenant de l'ADN complémentaire CADNc] à partir d'ARN messager induit. On utilise les échantillons de C"1 3 pour amorcer la synthèse d'ADNc à un seul brin à marquage radioactif aux fins d'utilisation comme échantillons d'hybrida-5 tion. Les échantillons de synthèse doivent s'hybrider avec l'ARNm induit comme modèle, et être étendus par transcription inverse pour former de l'ADNc induit radiomarqué. On a poursuivi les recherches sur des clones de la banque de colonie hybridée à de l'ADNc radiomarqué obtenu de 1D cette manière pour confirmer la présence d'un gène encodeur d'interféron dans toute sa longueur. Tout fragment obtenu dont on pense qu'il s'agit d'une partie de la longueur du gène est lui-même utilisé comme échantillon du gène entier.

3. On adapte le gène entier obtenu, en utilisant 15 de l'ADN de synthèse, pour éliminer toute séquence dirigeante susceptible d'empêcher l'expression microbienne du polypeptide mûr et pour permettre un ps-sitionnement approprié dans un véhicule d'expression par rapport aux signaux de départ et au site de liaison ribosomique d'un 20 promoteur microbien. On a purifié l'interféron exprimé

à un point permettant la confirmation de son caractère et la détermination de son activité.

En appliquant les procédés de la technologie de l'ADN recombinant tels qu'exposés ci-dessus, on a cons-25 truit une série de véhicules d'expression plasmidique réplicables qui dirigent la synthèse de haut niveau dans des micro-organismes -transformants d'un polypeptide mûr ayant les propriétés de l'interféron de fibroblaste humain authentique. Le polypeptide produit présente la séquence 30 d'.acides aminés d'un tel interféron et est actif dans des expériences in vitro en dépit du manque de glycosyla-tion caractéristique de la matière d'origine humaine. La référence ici faite à 1'"expression de l'interféron de Fibroblaste mûr" implique la production bactérienne ou 35 par un autre moyen microbien d'une molécule d'interféron

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ne contenant pas de groupes glycosyle ou d'une préséquence qui se met immédiatement au service de la traduction par l'ARNm du génome de l'interféron de fibroblaste humain. L'interféron de fibroblaste mûr, selon l'invention, est 5 immédiatement exprimé à partir d'un signal de début de traduction [ATG] qui encode également le premier codon acide aminé du produit naturel. La présence ou l'absence du premier acide aminé méthionine dans le produit exprimé par voie microbienne est gouvernée par un phénomène cinétique 10 dépendant des conditions de croissance fermentatives et/ou des niveaux d'expression chez l'hôte transformant. On a pu exprimer l'interféron de fibroblaste mûr avec une protéine conjuguée autre que la protéine dirigeante classique,le conjugué étant spécifiquement clivable dans 15 un environnement,intra- ou extra-cellulaire [voir brevet anglais nD 2 0D7 67o A]. Enfin, on a pu produire l'interféron mûr en conjonction avec un peptide "signal" microbien qui transporte le conjugué vers la paroi cellulaire, où le signal est prélévé et traité et où le polypeptide 20 mûr est sécrété.

Les Figures.j.1 à 5 ci-jointes sont décrites en détail dans le texte qui suit. La figure B représente de façon schématique la construction de plasmides donnant le code de l'expression directe de l'interféron de fibroblaste 25 mûr. Les sites de restriction et les résidus sont tels que le montre la figure C"Pst I", etc}. "Ap^" et "Tc^" représentent des fractions du plasmide qui expriment, respectivement, la résistance à 1'ampicilline et à la tétracycline. La légende "p o" est l'abréviation de 30 "opérateur de promoteur".

B

A". Micro-organismes employés

Les travaux décrits impliquent d'utiliser le micro-organisme E. coli K-12 souche 294 [extrémité A, thi , hsr. , hsn^ ], tel que décrit dans le brevet anglais 5 n° 2 D55 382 A. Cette souche a été déposée à 1'American Type Culture Collection, ATCC n° 31445. Tous les travaux sur l'ADN recombinant ont été effectués en accord avec les directives applicables des Instituts Nationaux de la Santé.

10 L'invention, bien que décrite dans ses modes de réalisation les plus appréciés avec référence à E. coli K-12 souche 294 définie ci-dessus, comprend également toutes les autres souches connues d'£. coli comme E. coli B E. coli x 177S et E. coli W 3110, ou d'autres souches micro 15 biennes dont beaucoup sont déposées dans des institutions reconnues de dépôt de micro-organismes, comme 1'American Type Culture Collection [ATCC], et y sont [potentiellement] disponibles. Voir également la demande de brevet publiée en Allemagne sous le n° 2 644 432. Ces autres 2D micro-organismes comprennent, par exemple, des bacilles comme Bacillus subtilis et d'autres entérobactériacées parmi lesquelles on peut mentionner comme exemples Salmonella typhimurium et Serratia marcescens, utilisant des plasmides qui peuvent répliquer et exprimer les 25 séquences de gènes hétérologues qui s'y trouvent. Il peut être également intéressant d'employer une levure, comme Saccharomyces cerevisiae, comme organisme hôte dans la préparation de la présente protéine d'interféron par expression de gènes qui en donnent le code sous la commande 30 d'un promoteur de levure.

B. Procédés généraux

Les enzymes de restriction sont fournis par New England Biolabs et utilisés selon leurs directives. On

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prépare l'ADN du plasmide par un procédé classique de libération de lysat [D.B. Clewell, J. Bacteriol. 110, S67-o76 [197233 et on purifie par chromatographie sur colonne sur Biogel A-50M. La détermination des séquences 5 de l'ADN s'effectue en utilisant le procédé de Maxam et Gilbert [Methods Enzymol. 65, 499-5SQ [198033- On isole des fragments de restriction d'ADN à partir de gels de polyacrylamide par électroélution. On attache un marqueur radioactif à des fragments d'ADN aux fins d'utilisation 10 comme échantillons d'hybridation par le procédé d'amorçage au hasard de l'-ADN de thymus de veau de Taylor et col. [Biochim. Biophys. Acta 442, 324-330 [19763 3- Les hybridations de colonies in situ sont effectuées selon le procédé de Grunstein-Hogness [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72, 15 3961-19E5 [197533.

C. Synthèse chimique des désoxyoligonucléotides procédé du phophotriester modifié en solution [Créa et col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 5765-5769 [197833» en utili— 20 ssnt des tridésoxynucléotides comme constituants [Hirose et col., Tetrahedron Letters 2E3, 2449-ci452 [19783 3- Les matériaux et les procédés généraux sont semblables à ceux qui sont décrits par Cre et col-, Nucleic Acids Res. 8, 2331-2348 [19803. Les six lots d'amorces [figure 13 conte-25 nant quatre dodéoanucléotides chacun sont obtenus en couplant séparément deux lots d'hexamères [de deux séquences 5'-terminales différentes chacune3 avec trois lots d'hexamères différents [de deux séquences 3-terminales différentes chacune3.

30 D. Induction des fibroblastes

On cultive des fibroblastes humains [lignée cellulaire GM-2504A3 selon la description antérieure de

On synthétise les désoxyoligonucléotides par le

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Pastha et col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 7fi> 3B9B-3901 [1975]. On retire du milieu de culture [milieu essentiel minimum d'Eagle contenant 10% de sérum de foetus de veau]

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de rouleaux [850 cm ] et on le remplace par 50 ml de milieu de culture contenant 50 microgrammes/ml de poly[I]: poly[C] et 10 microgrammes/ml de cycloheximide. On retire ce milieu d'induction au bout de 4 heures à 37°C et on lave les couches monocellulaires avec du sel physiologique tamponné au phosphate [STP; NaCl 0,14 M, KC1 3 mM, KH^PO^ 1,5 mM, Na^HPO^ 8 mM]. On fait incuber toutes les bouteilles à 37°C avec 10 ml d'une solution de trypsine-EDTA [Gibco 610-5305] jusqu'à ce que des cellules se détachent, et on ajoute du sérum de foetus de veau jusqu'à une concentration de 10%. On centrifuge les cellules pendant 15 minutes à 500 g et on remet les pastilles en suspension dans le STP, on rassemble et on resédimente. On congèle les cellules dans l'azote liquide. On obtient environ 0,17 g de cellules par rouleau.

E. Préparation et dosage de l'ARNm d'interféron

On prépare de l'ARNm contenant du poly[A] à partir de fibroblastes humains par des extractions au phénol et par chromatographie sur oligo[dT]-cellulose comme il est dit dans Green et cqI. CArch. Biochem. Biophys. 172, 74-89 [1975]]. On enrichit l'ARN contenant du poly[A] en un ARNm d'iinterféron par centrifugation sur un gradient linéaire de saccharose 5-20% [p/v]. On chauffe les échantillons d'iARN à 80°C pendant 2 minutes, on refroidit rapidement, on stratifié selon le gradient, et on centrifuge pendant 20 heures à 30 000 tpm à 4°C dans un rotor Beckman SW-40. On recueille les fractions, on les précipite à l'éthanol, et on dissout dans H^O.

On injecte des échantillons d'un microgramme d'ARNm dans des. oocytes de Xenopus laevis comme il est dit dans Cavalieri et col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74,

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3287-3231 [1977]]. On Fait incuber les oocytes injectés pendant 24 heures à 21DC, en homogénéise, et on centrifuge pendant 5 minutes à 10 000 g. On détermine l'interféron dans le surnageant par le dosage de l'inhibition de l'effet cytopathique [CPE] [Stewart, The Interferon System, Springer-Verlag, New-York-Wien, 1973] en utilisant le virus Sindbis et des cellules diploïdes humaines [WISH], On obtient communément des titres d'interféron de 1000 à 6000 unités recueillies [norme de référence NIH] par microgramme d'ARN injecté pour l'espèce 12S d'ARNm.

F. Synthèse et clonage de l'ADNc

On prépare de l'ADNc à un seul brin dans des réactions de 100 microlitres contenant 5 microgrammes d'ARNm fraction 12S, 20 mM de Tris-HCl [pH 8,3], 20 mM de KC1, 8 mM de Mgcl^ , 30 mM de (3-mercaptoéthanol, 100 jjCi de COC32P]dCTP et 1 mM de dATP, dCTP, dGTP, dTTP. L'amorce est le décamère HindIII de synthèse dCCAAGCTTGG [Scheller et col., Science 196, 177-180 C1977]], agrandi à l'extrémité 3' avec d'environ 20 à 30 résidus désoxythymidine en utilisant la désoxynucléotidyle transférase terminale [Chang et col., Nature 275, 617-624 [1378]]. On ajoute 100 unités de transcriptase inverse et on fait incuber le mélange réactionnel à 42DC pendant 30 minutes. On procède à la synthèse du second brin d'ADN comme il est dit ci-dessus [Goeddel et col., Nature 281, 544-548 [1979]]. On traite l'ADNc.à deux brins avec 1200 unités de nucléase S1 pendant 2 heures à 37°C dans 25 mM d'acétate de sodium [pH 4,5], 1 mM de ZnCl^ , 0,3 M de NaCl. Après extraction au phénol, on sépare le mélange par électrophorèse sur un gel de polyacrylamide à 8%. On recueille par électro-élution de l'ADNc [0,5 |jg] de taille comprise entre 550 et 1500 paires de bases. On agrandit une fraction de 20 ng avec des résidus de désoxyC en utilisant la désoxynucléoti-dyl-transférase terminale [Chang et col., supra], et on

cyclise avec 100 ng de pBR322 préalablement clivé avec PstI et à la queue duquel on accroche des résidus désoxyG [Chang et col., supra]. On utilise le mélange cyclisé pour transformer E. coli K-12 souche £94 par un procédé publié [Hershfield et col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 71, 3455-3453 [1974] ].

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B. Préparation d'échantillons de P-ADNc induits et non-indui ts

On combine 5 microgrammes d'ARNm 125 avec soit 2 microgrammes d'oligo [dT]^ -jq soit 5 microgrammes de chaque lot d'amorce5 de synthèse [figure 1] dans 60 microlitres de Tris-HCl 10 mM [pH 8], EDTA 1 mM. On fait bouill les mélanges pendant 3 minutes, et on les éteint sur de la glace. On ajoute à chaque mélange modèle-amorce à 0°C 60 microlitres de Tris-HCl 40 mM [pH 8,3], KC1 40 mM,

MgCl^ 1B mM, -mercaptoéthanol 60 mM, 1 mM dATP, dGTP, dTTP et 5 x 10~7 M de [CX-32P] dCTP [2000 - 3000 Ci/mM] . Après addition de 100 unités de transcr ptase inverse, on Fait incuber les réactions à 42°C pendant 30 minutes et on purifie par passage sur des colonnes de 10 ml de Sephadex G-50. On traite les produits avec NaOH 0,3 N pendant 3D minutes à 70°C, on neutralise, et on précipite à l'éthanol.

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On combine les P-AONc avec 100 microgrammes d'.-ARNm poly[A] provenant de fibroblastes non induits dans 50 microlitres de phosphate de sodium 0,4 M [pH 6,8], dodécylsulfate de sodium [SDS] à 0,1%. On chauffe les mélanges à 98°C pendant 5 minutes et on les laisse se cycliser pendant 15 heures à 45°C. On sépare les hybrides AD.\'-ARN [contenant des séquences d'AONc non induites] de l'ADN à un seul brin [séquences d'ADNc induites] par chromatographie sur hydro xyapati te comme il est dit dans Galau et col. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 1020-1023 [1977]]. On traite les hybrides ADN-ARN avec un alcali

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pour retirer l'ARN.

H. Tri des plasmides recombinants avec des échantillons de 32P-ADNc

Dn prépare des échantillons d'environ 1 micro-5 gramme d'ADN de plasmide à partir de transformants individuels par un procédé publié CBirnboim et col., Nucleic Acides Res. 7,s 1513-1523 [1979]]. Dn linéarise les échantillons d'ADN par digestion avec EcoRI, on les dénature dans un alcali, et on les applique à trois Filtres à la 10 nitrocellulose par le procédé d'hybridation ponctuelle

[KaFatos et col., Nucleic Acids Res. 7_% 1541-1552 [1979]].

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On hydride les Filtres avec les échantillons de P-ADNc pendant 1S heures à 42 °C dans le Formamide à 50%, 10 x solution de Denhardt [Biochem. Biophys. Res. Comm. 23, 15 B41-54S [1966], BxSSC, 40 mM de Tris-HCl [pH 7,5],

2 mM d'EDTA, 40 microgramme/ml d'ARN de levure. On lave les Filtres avec D,1xSSC, 0,1% de SDS deux Fois pendant 30 minutes è 42°C, on sèche et on expose à une pellicule pour rayons X Kodak XR-2 en utilisant des écrans d'intensi-20 Fication DuPont Lightning-Plus à -80°C [le SSC contient du NaCl 0,15 M et du citrate de sodium 0,015 M, pH 7,0].

I. Construction de plasmides pour l'expression directe de FIF

On phosphoryle les amorces de synthèse I

CdATGAGCTACAAC] et II CdCATGAGCTACAAC] en utilisant de la T4

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25 polynucléotide kinase et du [- P]ATP à une activité

spéciFique de 700 Ci/mM comme il est dit dans Goeddel et col.,

Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 106—110 [1979], Les réactions de réparation des amorces s'eFFectuent comme suit: on combine

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250 pM des amorces au P avec 8 microgrammes [10 pM] d'un 30 Fragment de. restriction 1200 bp Hhal contenant la séquence d^ADNc du FIF. On précipite le mélange à l'éthanol, on le remet en suspension dans 50 microlitres d'H^O , on Fait

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t bouillir pendant 3 minutBs, on l'éteint dans un bain de glace carbonique et d'éthanol, et on le combine avec une solution de 50 microlitres de Tris-HCl HO mM CpH 7,5],

MgCl2 14 mM, NaCl 120 mM, dATP, dCTP, dGTP, dTTP 0,5 mM 5 à 0°C. On ajoute 10 unités de Fragment d'ADN polymérase I de Klenow et on Fait incuber le mélange à 37°C pendant

4 h /£. Après extraction avec du phér.oi/CHCl^ et restric-tionavec PstIon puriFie les produit désiré sur un gel de polyacrylamide à 6%. Les ligations ultérieures se Font à la température ambiante [extrémité agglutinante] ou à 4°C [extrémités non agglutinantes] dans les conditions mentionnées ci-dessus [Goeddel et al., supra].

J. Dosage de l'expression d'interféron chez E. coli

On prépare des extraits bactériens pour des 15 dosages IF comme suit: On cultive des cultures de 1 ml pendant la nuit dans le milieu LB [Luria-Bertani] contenant

5 microgrammes/ml de tétracycline, puis on dilue dans 25 ml de milieu M9 auquel on ajoute 0,2% de glucose, 0,5% d'acides

CasamiriO et 5 microgrammes/ml de tétracycline. On recueille 20 des échantillons de 10 ml par centriFugation lorsque l'absorption à 550 nm CA^g] atteint 1,0. On congèle rapidement les pastilles cellulaires dans un bain de glace carbonique et d'éthanol et on prépare les lysats' clarifiés comme il est dit dans Clewell Csupra]. On détermine l'activité 25 d'interféron dans les surnageants par comparaison avec les normes de FIF NIH en utilisant des dosages d'inhibition CPE. On utilise deux dosages diFFérents: [a] On ensemence des cellules WISH [amnios humain] dans des boîtes de microtitrage. On ajoute des échantillons 16 à 20 heures plus 30 tard et on les dilue par une série de dilutions au double. On ajoute le virus Sindbis au bout d'au moins 3 heures d'incubation. On colore les plaques 20 à 24 heures plus tard avec du violet de gentiane. Cb] On ensemence une

15

lignée cellulaire MOBK {rein de boeuf] simultanément avec des dilutions au double d'échantillons. On ajoute le virus de la stomatite vésiculaire au bout de 2 à 3 heures d'incubation et on colore les plaques avec du violet de gentiane 5 16 à 1B heures plus tard. Pour tester la stabilité à pH 2, On dilue des extraits bactériens et des témoins dans le milieu essentiel minimum à une concentration de 1QD0 unités/ml. On ajoute des fractions d'1 ml à pH 2 avec HC1 1 N, on fait incuber à 4°C pendant 15 heures, et on 10 neutralise par addition de NaDH. On détermine l'activité

IF par le dosage d'inhibition CPE en utilisant des cellules d'amnios humain. Pour établir l'identité antigénique, on fait incuber des fractions de 25 microlitres des échantillons d'interféron à 1000 U/ml [non traités] avec 25 micro-15 litres d'interféron de leucocyte antihumain de lapin pendant 60 minutes à 37°C, on centrifuge à 12 000 g pendant 5 minutes Bt on dose le surnageant. Les standards d'interféron de fibroblaste et de leucocyte proviennent des Instituts nationaux de la Santé. L'interféron de leucocyte 20 antihumain de lapin provient de l'Institut national de l'Allergie et des Maladies infectieuses.

K. Synthèse chimique de lots d'amorces complémentaires de l'ARNm de FIF

La séquence protéique amino-terminale connue de 25 l'interféron de fibroblaste humain nous permet de déduire les 24 séquences possibles d'ARNm susceptibles de donner le code des quatre premiers acides aminés. On synthétise les 24 désoxyoligonucléotides complémentaires en 6 lots de 4 dodécamères chacun [Figure 1]. 30 On synthétise les 6 lots de 4 désoxyoligo nucléotides chacun par le procédé du phosphotriester modifié en solution et sur phase solide [Créa et col., supra]. La stratégie de base consiste à faire réagir deux trimères

16

bloqués en 3' différents avec un excès d'un seul trimère protégé en 5' pour donner un lot de deux hexarnères, chacun également représenté. Le couplage de deux lots, contenant chacun deux hexarnères, aboutit alors à un lot de 4 dodéca-mères.

L. Identification des clones d'ADNc de FIF

En utilisant de l'ARNm 12S provenant de fibroblastes humains induits [1000 unités d'activité IF par microgramme dans le dosage d'oocyte] on prépare un ADNc à deux brins et on l'insère dans pBR322 au site PstI par le procédé classique dG : dC d'allongement de queue comme il est dit dans Chang et col. supra. On obtient une "bibliothèque" d'ADNc de fibroblaste consistant en 30 000 transformants sensibles à 1'ampicilline, résistants à la tétracycline, d'E. coli K-12 souche 234 à partir de 20 ng d'ADNc de taille comprise entre 550 et 1300 paires de bases. On prépare l'ADN de plasmide à partir de 600 des transformants et on l'applique à trois ensembles de filtres de nitrocellulose comme il est dit ci-dessus.

L'approche adoptée dans l'identification des plasmides hybrides contenant des séquences d'ADNc d'interféron de fibroblaste est semblable à celle que l'on utilise pour identifier les plasmides recombinants d'interféron de leucocyte humain [Goeddel et col., Nature 2S7, 411-416 [1980]]• On prépare des échantillons d'hybridation d'ADNc radiomarqués en utilisant soit les 24 dodécamères de synthèse soit les oligo[dTD^2 -jg comme amorces et l'ARN 12S à partir de fibroblastes induits [50D0 unités/mg dans les oocytes]

32

comme modèle. On hydride les P-ADNc [activité spécifique 6

5 x 10 cpm/microgramme] obtenus avec un large excès d'ARNm isolé à partir de fibroblastes humains non induits, et on sépare les hybrides ARNm-ADNc de l'ADNc n'ayant pas réagi par chromatographie à 1 *hydroxyapatite [Galau et

17

col., supra]. Les Fractions d'ADNc à un seul brin doivent être enrichies en séquences qui sont présentes dans les Fibroblastes induits mais absentes dans les cellules non induites, et les hybrides ARNm-ADNc doivent représenter les séquences communes aux cellules induites et non induites. On obtient environ 4 x ID*3 cpm d'ADNc à un seul brin [échantillon d'hybridation A] et S x 10° cpm d'hybrides ADNc-ARNm en.utilisant de l'AONc amorcé avec g

oligo[dT],j2 ^ ; on obtient 1,5 x 10 cpm de brin simple

[échantillon d'hybridation B] et 1,5 x 10° cpm d'hybrides

à partir d'ADNc amorcé en utilisant des lots de dodécamères de synthèse 1-6. On combine les hybrides AQNc-ARNm des deux Fractionnements, on hydrolyse l'ARN par traitement

32

avec un alcali, et on utilise le . F-ADNc comme échantillon d'hybridation C. Un grand nombre des 600 échantillons de plasmide s'hybrident avec les deux échantillons A et

C, indiquant que les réactions d'hybridation entre l'ARNm

32

non induit et le P-ADNc [avant l'étape de Fractionnement

à 1'hydroxyapatite] n'ont pas été jusqu'à leur terme.

Cependant, un seul des 600 plasmides [pF526] s'hybride

Fortement avec l'échantillon B d'ADNc induit, spéciFiquement amorcé [Figure 2], Le plasmide pF526 s'hybride également avec l'échantillon A total amorcé avec oligo[dT]^ ^q»

induit à l'ADNc, et ne donne pas d'hybridation détectable avec l'échantillon non induit combiné C.

La digestion au PstI de pF526 montre que 1'insert d'ÏADNc cloné a environ 550 paires de bases de longueur, ce qui est probablement trop court pour contenir la totalité de la région d'encodage de l'interFéron de Fibroblaste. On

32

préparé donc un échantillon d'ADN marqué au P à partir de ce Fragment de PstI par amorçage aléatoire avec de l'ADN de thymus de veau [Taylor et col., supra]. On utilise cet échantillon pour trier 2000 colonies diFFérentes provenant d'une "bibliothèque" d'ADNc de Fibroblaste nouvellement construite [on prépare la nouvelle "bibliothèque"

18

d'ADNc en utilisant de l'ARNm 12S provenant de Fibroblaste induit ayant un titre de 6000 unités/ml dans le système de dosage des oocytes]. Seize clones s'hybrident à l'échantillon. Des plasmides préparés à partir de la majori-5 de ceux-ci libèrent deux Fragments lorsqu'on les clive avec PstI, ce qui indique que l'ADNc contient un site de PstI interne. C'est le clone pFIF3 qui contient le plus grand insert d'ADNc, environ 800 paires de bases. On détermine la séquence d'ADN de 1'insert par le procédé de Maxam--) □ Gilbert Csupra], et elle est exposée dans la Figure 3. La séquence d'acides aminés de l'interFéron de Fibroblaste humain prédit à partir de la séquence de nucléotides est identique à celle citée récemment par Taniguchi et col.

[Gène 1_0, 11-15 [19803 3 et par Derynck et col. [supra3 15 d'après détermination à l'ADN des clones d'ADNc de FIF. Un précurseur ou peptide signal de 21 acides aminés est suivi par une séquence de 166 acides aminés représentant l'interFéron mûr, une section de 196 nucléotides non traduits en 3* et une queue poly[A3. Les 20 acides aminés 20 NH^-terminaux du FIF mûr sont déterminés directement par microséquençage protéique et sont les mêmes que ceux qui sont prédits d'après la séquence d'ADN.,

M. Expression directe d'interFéron de Fibroblaste

Pour exprimer de grandes quantités d'interFéron 25 de Fibroblaste mûr chez E. coli, l'initiation de la synthèse protéique doit se produire au codon ATG du polypeptide mûr [acide aminé 13 plutôt qu'à 1'ATG du peptide signal Cacide aminé S13 [Figure 33.

Notre procédé pour enlever le peptide signal codant 30 des régions de pFIF3 est décrit dans la Figure 4. On isole un Fragment d'ADN à 1200 bp qui contient 1'insert d'ADNc en entier à partir d'un gel de polyacrylamide après avoir digéré pFIF3 avec Hhal. On prépare deux amorces désoxy-oligonucléotides de synthèse, dATGAGCTACAAC [13 et

19

dCATGAGCTACAAC[II]. Les deux amorces contiennent la séquence d'encodage des quatre premiers acides aminés de l'interFéron de Fibroblaste mûr; l'amorce II possède un C additionnel à l'extrémité 5'. Les réactions de répa-5 ration des amorces et les liaisons ultérieures sont effectuées séparément pour les amorces I et II, et donnent des résultats presque identiques. Seules les réactions utilisant l'amorce I sont donc examinées ici en détail. On fait subir aux amorces un marquage radioactif en 5' en

32

10 utilisant du C^- P]ATP et de la T4 polynucléoti de kinase, on combine avec le fragment d'ADN Hhal à 1200 bp et on dénature les mélanges en les faisant bouillir. Après avoir hybridé l'amorce au Fragment d'ADN Hhal dénaturé, on utilise un fragment de Klenow d'ADN polymérase I d'E. coli [Klenow 15 et col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA S5_, 168-175 [1070]

pour catalyser la synthèse de réparation du brin plus

[supérieur] Cfigure 4], En outre, l'activité de 3' 5 '

exonucléase associée du fragment de Klenow retire l'extrémité 3' saillante du brin moins [inférieur], ce qui laisse 20 une extrémité agglutinante. L'analyse des échantillons du mélange réactionnel par électrophorèse sur gel de poly-acrylamide indique que la synthèse de réparation n'est pas allée à son terme, mais s'est arrêtée à plusieurs sites discrets. Dn traite donc le mélange réactionnel entier 25 avec PstI et on purifie le fragment à 141 bp désiré

[180 ,000 Cerenkow cpm; env. 0,3 pM] par électrophorèse sur gel de polyacrylamide. La liaison de ce fragment à 1 microgramme [env. 4 pM] du fragment Pstl-BglII à 3S3 bp isolé à partir de pFIF3 [figure 4], suivie par digestion à 30 BglII, donne 50 000 Cerenkov cpm [env. 0,1 pM, env. 30 ng] du Fragment d'ADN à 504 bp contenant toute la séquence d'encodage de l'interFéron de bibroblaste mûr. Les mêmes réactions utilisant l'amorce II donnent 83 000 cpm [env. 0,15 pM, env. 50 ng] de produit à 505 bp.

S

20

La construction des plasmides qui dirigent la synthèse de l'interféron de fibroblaste humain est donnée dans la figure B. On construit des plasmides d'expression séparés qui placent la synthèse de FIF sous la commande 5 des systèmes promoteur-opérateur- lac ou trp d'E. coli. Ces deux systèmes se sont révélés utiles pour l'expression directe des gènes eucaryotiques chez E. coli: l'hormone de croissance humaine a été efficacement synthétisée en utilisant le système lac [Goeddel et col., Nature 281 , . 10 544-548 [19793] et l'interféron de leucocyte humain a été produit en grandes quantités en utilisant le système trp CGoeddel et col., Nature 287, 411 C1980 33-

On digère le pBRH trp avec l'enzyme de restriction EcoRI et on isole le fragment obtenu par PAGE et électro-15 élution. Dn combine le plasmide pSom 1.1 digéré avec EcoRI [Itakura et col., Science 198, 1055—1DB3 C^377J; brevet anglais n° 20D7 B7B A3 avec le fragment ci-dessus. On lie le mélange avec l'ADN ligase et on transforme l'ADN obtenu dans E.i coli K-12 souche 294 comme il est dit 20 -ci-dessus. On choisit.,' les bactéries transformantes sur des plaques contenant de 1'ampici 11ine. On trie les colonies résistantes à 1 *ampicilline obtenues par hybridation des colonies [Brunstein et col., supra3 en utilisant comme échantillon le promoteur-opérateur trp contenant le

25 fragment ci-dessus isolé à partir de pBRHtrp, qui a subi un

32

marquage radioactif avec P. On choisit plusieurs colonies que l'hybridation des colonies montrencomme positives, on isole l'ADN de plasmide et on détermine l'orientation des fragments insérés par analyse de restriction en employant 30 les enzymes de restriction BglII et BamHI en double digestion. Dn cultive E. coli 294 contenant le plasmide appelé pS°m7,A2, qUi a le fragment promoteur-opérateur trp dans l'orientation désirée dans un milieu LB contenant 10 microgrammes/ml d'ampicilline. On cultive les cellules 35 à une densité optique de 1 [à 55D nM3, on les recueille

7'1

par centriFugatiDn et on les remet en suspension dans le milieu M9 dilué à dix Fois son volume. Un cultive les cellules pendant 2 à 3 h, là encore à la densité optique 1, puis on les lyse et on analyse les protéines cellulaires 5 totales par' PAGE à 3DS urée [15%] [Maizel et col., Methods Virol. 5, 180-246 [1971] ].

On digère le plasmide pBR322 avec Hind III et on digère à leur tour les extrémités Hind III saillantes avec la S1 nucléase. La digestion à la S1 nucléase 10 implique de traiter 10 microgrammes de pBR32£ clivés avec HindiII dans 30 microlitres de tampon S1 [0,3 M NaCl, 1 mM ZnCl^ , 25 mM d'acétate de sodium, pH 4,5} avec 300 unités de S1 nucléase pendant 30 minutes à 15°C. On arrête la réaction par addition de 1 microlitre de solution d'arrêt 15 de 3D x S1 nucléase [0,8 M de base tris, 50 mM d'EDTA).

On extrait le mélange au phénol, on l'extrait au chloro-Forme et on le précipite à l'éthanol, puis on le digère avec EcoRI comme il est dit ci-dessus et on obtient le grand Fragment [1] par un processus de PAGE suivi par une 20 électroélution. Le Fragment obtenu possède une première extrémité EcoRI agglutinante et une seconde extrémité non agglutinante dont le brin d'encodage commence avec la thymi dine du nucléotide.

On digère le plasmide pSom7^2, tel que préparé 25 ci-dessus, avec BglII et on transForme les extrémités

BglII agglutinantes obtenues en extrémités à deux brins par le procédé de la polymérase I de Klenow en utilisant les quatre désoxynucléotide triphosphates. Le clivage avec EcoRI du produit obtenu suivi par PAGE et électro-30 élution du petit Fragment [2] donne un Fragment linéaire d'ADN contenant le promoteur-opérateur tryptopbane et les codons de la séquence LE' "proximale" en amont à partir du site BglII ["Le' [p]"3. Le produit a une extrémité EcoRI et une extrémité non agglutinante résultant du 35 remplissage du site BglII. Cependant, le site BglII est

22

reconstitué par liaison de l'extrémité non agglutinante du fragment [2 3 avec l'extrémité non agglutinante du fragment [1]. Ainsi, on lie les deux fragments en présence d'ADN ligase T4 pour former le plasmide recirculé pHKY 1D 5 que l'on propage par transformation dans les cellules compétentes d'E. cdIî souche 594.

Le plasmide pGM1 porte l'opéron tryptophane d'E. coli contenant la délétion *^LE1413 CMiozarri et col., J. Bacteriology 133, 1457-1465 [197833 et exprime donc 10 une protéine de fusion comprenant les six premiers acides aminés du directeur trp et environ le dernier tiers du polypeptide E trp Cappelé ci-dessous concurremment LE'], ainsi que le polypeptide D trp dans son entier, le tout sous la commande du système promoteur-opérateur trp. Dn 15 digère le plasmide, 20 microgrammes, avec l'enzyme de restriction Pvull qui segmente le plasmide en cinq sites. On combine ensuite les fragments de gène avec des protéines de liaison EcoRI [consistant en un oligonucléotide auto—complémentaire de séquence: pCATGAATTCATG3 fournissant 20 un site de clivage EcoRI pour un clonage ultérieur dans un ■prlasmide contenant un site EcoRI. On traite les 2D microgrammes de fragment d'ADN obtenus à parjtir de pGM1 avec 10 unités d'ADN ligase en présence de 200 picomoles de 1'oligonucléotide de synthèse 5'-phosphorylé 25 pCATGAATTCATG et dans 20 microlitres de tampon ADN ligase T" [20 mM de Tris, pH 7,6 , 0,5 mM d'ATP, 10 mM de MgCl„ , 5 mM de dithiothréitoi 3 à 4°C pendant la nuit. On chauffe alors la solution pendant 10 minutes à 7D°C pour arrêter la liaison. On segmente les protéines de liaison par 30 digestion avec EcoRI et on sépare les fragments , comportant alors des extrémités EcoRI, en utilisant PAGE à S'/, et on isole du gel les trois plus grands fragments en commençant par colorer avec du bromure d'éthidium, en mettant en place les fragments à la lumière ultraviolette, et en découpant 35 à partir du gel les parties intéressantes. Chaque fragment

23

f de gel avec 300 microlitres de 0,1 x TBE, est disposé dans un Fragment de dialyse et soumis à une électrophorèse à 100 V pendant une heure dans un tampon 0,1xTBE [le tampon TBE contient: 10,8 g de base Tris, 5,5 g d'acide borique, 5 0,09 g de Na^EDTA dans 1 litre d'H^O], On recueille la solution aqueuse à partir du sac de dialyse, on l'extrait au phénol et on la rend 0,2 M avec du chlorure de sodium, et on recueille l'ADN dans l'eau après précipitation à l'éthanol. On identifie le gène contenant le promoteur-10 opérateur trp avec extrémités agglutinantes EcoRI dans le procédé décrit ci-dessous, qui comporte l'insertion de fragments dans un plasmide sensible à la tétracycline qui, après insertion du promoteur-opérateur, devient résistant à la tétracycline.

15 Le plasmide pBRHl [Rodriguez et col., Nucleic

Acids Research G, 3267-3267 -1973]] exprime la résistance à 1'ampicilline et contient le gène de la résistance à la tétracycline mais, comme il n'y a pas de promoteur associé, n'exprime pas cette résistance. Le plasmide est donc 20 sensible à la tétracycline. En introduisant un système promoteur-opérateur dans le site EcoRI, on peut rendre le plasmide résistant à la tétracycline.-

zyme par extraction au phénol suivie par extraction au 25 chloroforme et on la recueille dans l'eau après précipitation à l'éthanol. La molécule d'ADN résultante est, dans des mélanges réactionnels séparés, combinée avec chacun des trois fragments d'ADN obtenus ci-dessus et liée avec l'DN ligase oomme il est dit ci-dessus. On :utilise 30 l'ADN présent dans le mélange réactionnel pour transformer l'E. coli K-12 souche 294 compétente par des techniques classiques [Hershfield et col., supra] et on dépose les bactéries sur des plaques LB contenant 20 microgrammes/ml d'ampicilline et 5 microgrammes/ml de tétracycline. Dn 35 choisit plusieurs colonies résistantes à la tétracycline,

On digère le pBRHl avec EcoRI et on retire l'en-

24

on isole l'ADN du.plasmide et on confirme.la présence du Fragment désiré par analyse à l'enzyme de restriction. Le plasmide obtenu est désigné par pQHHtrp.

Dn obtient un produit de digestion EcoRI et 5 BamHI du génome viral de l'hépatite B par des moyens classiques et on le clone dans les sites EcoRI et BamHI du plasmide pGH6 CGoeddel et col., Nature 28 1 , 544-548 [1379]] pour Former le plasmide pHS32. Dn segmente le plasmide pH332 avec Xbal, on l'extrait au phénol, on l'extrait au 10 chloroforme et on le précipite à l'éthanol. Dn le traite alors avec 1 microlitre d'E. coli polymérase I, fragment de Klenow^ dans 3D microlitres de tampon de polymérase [50 mM de phosphate de potassium pH 7,4, 7 mM de MgCl^ , 1 mM de (?> -mercaptoéthanol ] contenant 0,1 mM de dTTP et 15 0,1 mM de dCTP pendant 30 minutes à QDC puis pendant 2 h à 37DC. Ce traitement provoque 11introduction de deux des quatre nucléotides complémentaires de l'extrémité saillante 5' du site de clivage Xbal:

5' CTAGA 5' CTAGA

20 3' T > 3' TCT

Dn incorpore deux nucléotides, dC et dT, donnant une extrémité avec deux nucléotides saillants 5'. On segmente ce résidu linéaire de plasmide pHS32 [après extraction au phénol et au chloroforme et récupération dans l'eau après 25 précipitation à l'éthanol] avec EcoRI. On sépare le grand fragment de plasmide du plus petit fragment EcoRI-Xbal par PAGE et on l'isole après électroélution. On lie ce fragment d'ADN provenant de pHS3d [U,2 microgrammes], dans des conditions semblables à celles qui sont décrites ci-^ dessus, au fragment EcoRI-Taq I de l'opéron tryptophane [env. 0,01 microgrammes], provenant de pBRHtrp.

Dans le processus de liaison du fragment provenant de pHS32 au fragment EcoRI-Taq I, comme il est dit ci-

25

dessus, on lie l'extrémité saillante Taq I à l'extrémité saillante restante Xbal même si elle n'a pas une structure complète de paires de base selon Watson-Crick:

T , CTAGA . TCTAGA

+ f

AGC TCT AGCTCT

On transforme une fraction de ce mélange réactionnel de ligatLon dans des cellules d'E. coli 294,

on traite à la chaleur et on dépose sur des plaques LB contenant de 1'ampici11ine. Dn choisit 24 colonies, on les cultive dans 3 ml du milieu LB, et on isole les plasmides. On trouve que six de ceux-ci ont le site Xbal régénéré par réparation de l'ADN catalysé par E. coli et réplication.

TCTAGA TCTAGA

-^—AGCTCT ^ AGATCT

Dn trouve que ces plasmides se segmentent également à la fois avec EcoRI et Hpal et donnent les fragments de restriction attendus. Dn utilise un plasmide, désigné pTrp14, pour l'expression des polypeptides hétérologues,

comme on l'examine ci-dessous.

Le plasmide pHGH 1D7 [Goeddel et col., Nature 2B1, 544-548 [19793] contient un gène pour l'hormone de croissance humaine constitué de 23 codons d'acides aminés produits à partir de fragments d'ADN de synthèse et 183 codons d'acides aminés obtenus a partir d'ADN complémentaire produit par transcription inverse d'ARN messager d'hormone de croissance humaine. Ce gène, bien qu'il lui manque les codons de la "pré" séquence de l'hormone de croissance humaine, ne contient pas un codon d'initiation de traduction aTG. Dn isole le gène à partir de 10 microgrammes de pHGH 107 après traitement avec EcoRI suivi par un fragment de Klenow de polymérase I d'E. coli et par dTTP et dATP comme il est dit ci-dessus. Après extraction au phénol et au chloroforme

26

et précipitation à l'éthanol, on traite le plasmide avec BamHI.

On isole le Fragment contenant le gène de l'hormone de croissance humaine [HGH) par PAGE puis par 5 électroélution. Le Fragment d'ADN obtenu contient également les 35D premiers nucléotides du gène de structure de résistance à la tétracycline mais est dépourvu du système promoteur-opérateur de la tétracycline si bien que lorsqu'on le clone ultérieurement dans un plasmide d'expression, 10 les plasmides contenant 1'insert peuvent être mis en place par restauration de la résistance à la tétracycline. Etant donné que l'extrémité EcoRI du Fragment a été introduite par le procédé de la polymérase I de Klenow, le Fragment possède une extrémité non agglutinante et une extrémité 15 agglutinante, ce qui garantit une orientation correcte lorsqu'on l'insère ensuite dans un plasmide d'expression.

Dn prépare ensuite le plasmide d'expression pTrp14 à recevoir le Fragment contenant le gène HGH préparé ci-dessus. On digère ainsi le pTrp14 avec Xbal et on intro-20 duit les extrémités agglutinantes obtenues par le procédé de la polymérase I de Klenow en employant dATP, dTTP,

dGTP et dCFFP . Après extraction au phénol et au chloroforme et précipitation à l'éthanol, on traite l'ADN résultant avec BamHI et on isole le grand Fragment de plasmide 25 obtenu par PAGE et électroélution. Le Fragment dérivé

de pTrpl4 a une extrémité non agglutinante et une extrémité agglutinante, ce qui permet la recombinaison dans une orientation correcte avec le Fragment contenant le gène HGH décrit ci-dessus.

30 .On combine le Fragment du gène HGH et le Fragment pTRP14 /ÛXba-BamHI et on les lie ensemble dans des conditions semblables à celles qui sont décrites ci-dessus. On lie ensemble les extrémités Xbal et EcoRI introduites par liaison de 'extrémité non agglutinante pour recréer à la 35 Fois le site Xbal et le site EcoRI:

?7

Xbal introduit EcoRI introduit Initiation du gène HGH ——TCTAG AATTCTATG l|CTAG^ATTCTATG-

AGATC TTAAGATAC ^ AGATC|TTAAl3ATAC-

Xbal EcoRI

5 Cette construction recrée également le gène de résistance à la tétracycline. Comme le plasmide pHGH 107 exprime la résistance à la tétracycline à partir d'un promoteur situé en amont à partir du gène HGH [le promoteur lac], cette construction, désignée pHGH207, permet 10 l'expression du gène de résistance à la tétracycline sous la commando du promoteur-opérateur tryptophane. Ainsi le mélange de laison est transformé en E. coli 294 et les colonies sont choisies sur des plaques L8 contenant 5 microgrammes/ml de tétracycline. 15 On digère le plasmide pHGH 207 avec EcoRI et on recueille le promoteur trp contenant le Fragment EcoRI par PAGE suivie par électroélution. On digère le plasmide pBRHA avec EcoRI et on traite les extrémités segmentées avec la phosphatase alcaline lbactérienne [BAP, 1 micro-20 gramme, dans 50 mM de Tris, pH 8, et 10 mM de MgCl^

pendant 30 minutes à S5°C] pour retirer les groupes phosphate sur les extrémités EcoRI saillantes. On retire l'excès de phosphatase alcaline bactérienne par extraction au phénol, extraction au chloroforme et précipita-25 tion à l'éthanol. L'ADN linéaire obtenu, comme il est dépourvu de phosphates sur ses extrémités saillantes, n'accepte en liaison que les inserts dont les extrémités agglutinantes complémentaires sont phosphorylées mais ne se recircularise pas lui-même, ce qui permet un tri plus 30 Facile des plasmides contenant les inserts.

On combine le fragment EcoRI dérivé de pHGH 207 et l'ADN linéaire obtenu à partir de pBRHl en présence de T ligase comme il est dit ci-dessus et on les lie. On transforme une fraction du mélange obtenu dans E. coli

28

douche 394 comme il est dit ci-dessus, on dépose sur un milieu LB contenant 5 microgrammes/ml de tétracycline,

et on choisit 12 colonies résistantes à la tétracycline. On isole le plasmide de chaque colonie et on l'examine 5 pour y détecter la présence d'un insert d'ADN par analyse à 1'endonucléase de restriction employant EcoRI et Xbal. Un plasmide contenant l'insert est désigné piiKYI .

Le plasmide pHKYlO, décrit ci-dessus, est un dérivé de pB3322 qui contient un site BglII entre le

10 promoteur de la résistance à la tétracycline [Te D et le gène de structure. Le grand fragment d'ADN isolé après avoir digéré pHKYlO avec PstI et BglII contient donc une

H

partie du gène de résistance à 1'ampicilline [Ap 3 et la totalité du gène de structure Te , mais est dépourvu du 15 promoteur Te [figure B]. On digère le plasmide pGHS

[Goeddel et col., Nature 281, 544-548 [1979 3 3 avec EcoRI, on introduit les extrémités à un seul brin obtenues avec l'ADN polymérase I, et on segmente le plasmide avec PstI. On isole le petit fragment, contenant une partie du gène p

20 Ap , un double site de liaison promoteur lac et ribosome lac, mais dépourvu d'un triplet d'initiation ATG. On peut isoler un fragment promoteur trp analogue, contenant le site de liaison ribosomique directeur trp, mais dépourvu de séquence ATG [Goeddel et eol., Nature 287, 411-41o [1980 3 3 25 à partir du pHKY1 décrit ci-dessus.

Le fragment trp que l'on vient de mentionner est un analogue de l'opéron tryptophane d'E. coli dont on a enlevé ce qu'on appelle l'atténuateur trp [Miozzari et col., J. Bact. 133, 1457—146G [19783 3 pour accroître de façon 30 modulable les niveaux d'expression. On peut faire croître le plasmide d'expression contenant le régulon trp modifié à des niveaux prédéterminés dans des milieux nutritifs contenant" du tryptophane supplémentaire dans des quantités suffisantes pour réprimer le système promoteur-opérateur, puis les priver de tryptophane de manière à déréprimer

29

.t le système et occasionner l'expression du produit visé.

Les plasmides d'expression peuvent être assemblés par des réactions de liaison en trois parties comme le montre la Figure G. Dn lie 15 ng [env. 0,05 pM] du gène 5 FIF assemblé [504 ou 505 bp], 0,.5 microgrammes [env.

0,2 pM] du grand Fragment PstI-BglII de pHKY-10 et 0,e: microgrammes Cenv. 0,3 pM] du Fragment promoteur approprié et on utilise le mélange pour transFormer E. coli 294 [Goeddel et col., Nature 287, 411-415 [1980]]. On prépare 10 l'AON du plasmide à partir de transformants individuels et on l'analyse par cartographie par restriction. La jonction correcte du gène assemblé au Fragment promoteur doit restaurer les séquences de reconnaissance EcoRI [lac] ou Xbal [trp]. La majorité des plasmides donnant les schémas 15 de digestion par enzyme de restriction attendus. On cultive des clones isolés [12■contenant le promoteur trp et-12 contenant le promoteur lac] et on prépare des extraits pour le dosage de 1'interFéron comme il est dit ci-dessus.

20 _ Lorsqu'on les dose sur des cellules d'amnioB

humain [WISH] pour déterminer l'activité antivirale par le dosage de l'inhibition CPE, cinq des transFormants trp sont positifs [chacun approximativement éauivalent]; onze des transFormants lac donnent des activités IF équivalentes. 25 On choisit donc un transformant de chaque série [pFIFlac9 et pFIFtrp59] aux Fins d'étude ultérieure [Tableau 1]. L'analyse de la séquence de l'ADN montre que le rattachement souhaité du promoteur au gène de structure de FIF s'est produit dans les deux cas.

30

Tableau 1. Activité d'interféron dans les extraits d'E. coli

E. coli K-12

Activité IF

souche 234

Densi té

Cuni tés/1

Molécules de transformée par:

cellulaire de culture]

FIF par

[cellules/ml]

celIule pBR322

3,5 x 108

_

pFIFlac9

3,5 x 108

9,D

x

10S

2 250

pFIFtrpS9

3,5 x 1DS

1,8

X

107

4 5D0

pFIFtrp3S9

3,5 x 108

8,1

X

107

20 2D0

10 On cultive les cellules et on prépare les extraits-

comme il est dit ci-dessus. On utilise la lignée cellulaire d'amnios humain [WISH] pour le dosage d'inhibition CPE. Les activités données sont la moyenne de trois expériences indépendantes. Pour déterminer le nombre de molécules de IF 15 par cellule on utilise une activité spécifique FIF de

0

4 x 10 unités/mg [Knight, supra].

Les quantités d'interféron de fibroblaste produites par pFIFlac9 et pFIFtrpS9 sont données au Tableau 1. Le promoteur trp donne un niveau d'expression FIF mesurable 20 supérieur à ce que donne le promoteur lac. Dans un essai pour accroître encore les niveaux d'expression FIF, on segmente pFIFtrpE9 avec EcoRI et deux fragments d*EcoRI de 300 paires de bases contenant le promoteur trp [Goeddel et col., Nature 287, 411—41S, ["1980]].

31

.r 3

Le plasmide obtenu, pFIFtrp 69, contient trois promoteurs trp successifs qui se lisent en direction du gène FIF.

La quantité de FIF synthétisée par E. coli K-12 souche

3

294/pFIF trp 69 est 4 à 5 fois supérieure à celle produite '5 par pFIFtrpS9 [Tableau 1]. Ceci est apparemment dû à la dérépression du promoteur trp qui se produit lorsque les niveaux de répresseur trp sont titrés par les multiples exemplaires de l'opérateur trp.

Le FIF produit par E. coli K-12 souche 294/ 10 pFIFtrpB9 se comporte comme le FIF humain authentique. Comme le montre le Tableau 2, son activité antivirale est environ 30 fois plus forte sur les cellules humaines que sur les cellules de boeuf. En outre, le FIF produit par voie bactérienne est stable vis-à-vis du traitement à 15 pH 2 pendant la nuit et n'est pas neutralisé par les anticorps d'interféron de leucocyte antihumain de lapin [Tableau 3}.

Tableau 2. Activités d'interféron mesurées sur différents types cellulaires

20

Acti vi té

d'interféron [uni tés/ml 3

f

Cellules

LeIF

FIF

Extrait d'E. coli K-12 souche 294/pFIFtrpS9 •

Amnios n humain

20 000

10 000

12QD

25

Rein de boeuf

13 000

400

40

LeIF et FIF sont des solutions standard des NIH ayant 20 0Q0 unités/ml et 10 000 unités/ml respectivement. Les dosages sont effectués comme il est dit ci-dessus.

Tableau 3. Comparaison de l'activité d'extraits

/

d'E. coli K-12 souche 294/pFIFtrp59 avec des interférons humains standard de leucocyte et de fibroblaste

5 Activité d'interféron [unités/ml]

LeIF FIF E. coli K-12 souche

294/pFIF trp59

Non traité

1000

pH 2

1000

Anticorps LeIF

antihumai ns

de lapin

OS

1000

Les procédés expérimentaux sont décrits ci-dessus. Dosage par inhibition CPE utilisant des cellules WISH/virus 15 Sindbis.

N• Purification

Le procédé de purification pour l'interféron de fibroblaste d'origine bactérienne est le suivant:

1. Dn met en suspension des cellules congelées 20 dans 12 fois leur volume par rapport au poids,

avec un tampon de lyse au saccharose [100 mM de Tris-HCl, 10/i de saccharose, 0,2 M de NaCl, 50 mM d'EOTA, 0,2 mM de PMSF [chlorure de phénylméthyl-sulfonyle}, pH 7,93 contenant du lysozyme à 1 mg/ml. On agite la suspension 25 cellulaire pendant 1 h à 4°C et on centrifuge. L'activité d'interféron de fibroblaste reste dans le surnageant.

2. On ajoute de la polyéthyl ènimi ne C5°i, v/v3

au surnageant traité aux ultrasons jusqu'à une concentration finale de 0,5% Cv/v3. On agite la solution pendant 1 h

30 à 4°C et on centrifuge. L'activité d'interféron reste

^ ■

33

dans le surnageant.

3. On ajoute du sulfate d'ammonium solide au surnageant polyéthylène-imine à une concentration finale de saturation à 50%, on agite pendant 30 minutes à 4°C

5 et on centrifuge. L'activité d'interféron est dans la pastille à 50%.

4. On met en suspension la pastille de sulfate d'ammonium à 50% dans la moitié du volume de la suspension de sulfate d'ammonium à 50% avec du STP [20 mM de phosphate

10 de sodium, 0,15 M de NaCl, pH 7,4]. On ajoute du polyéthy-lèneglycol 6000 [à 50%, p/v, dans le STP) jusqu'à une concentration finale de 12,5% [v/v], on agite à 4°C pendant 2 h et on centrifuge. L'activité d'interféron est dans la pastille. On met la pastille en suspension dans un volu-15 me minimal de tampon de lyse au saccharose et on clarifie par centrifugation.

Ce procédé initial d'extraction aboutit à une purification de l'interféron de fibroblaste de 0,001% de la protéine totale à 0,05% de la protéine totale. On peut 20 purifier .cette matière plus avant jusqu'à l'homogénéité par les étapes de chromatographie sur colonne suivantes:

5. Chromatographie d'afinité sur Bleu Amicon B dans le tampon de lyse au saccharose.

6. Chromatographie d'échange d'anions sur Sephadex 25 QAE dans le tampon de lyse au saccharose en l'absence de NaCl

0,2 M.

7. Chromatographie d'exclusion de taille sur Sephadex G-75 dans le tampon de lyse au saccharose.

8. Chromatographie en phase liquide à haute 3D pression en phase inverse.

0. Administration parentérale

Dn peut administrer FIF par voie parentérale à des sujets nécessitant un traitement antitumoral ou antiviral. La posologie et la fréquence d'administration

peuvent reproduire celles que l'on utilise couramment dans les recherches cliniques sur les matières d'origine humaine, p. ex. environ [1-10] x 10^ unités par jour, et dans le cas des matières de pureté supérieure à 1%, éventuel-5 lement jusqu'à, p. ex., 15 xlO^ unités par jour. Les posologies de FIF obtenus par voie bactérienne pourraient être augmentées de Façon signiFicative pour obtenir un eFFet plus Fort étant donné l'absence essentielle de protéines humaines autres que FIF, protéines qui dans les 10 matières dérivées de Fibroblastes peuvent jouer le rôle de pyrogènes, présentant des eFFets nociFs, comme un malaise, une élévation w- , de température, etc.

A titre d'exemple d'une Forme posologique appropriée au FIF bactérien pratiquement homogène sous Forme 15 parentérale, on peut dissoudre 3 mg de FIF d'activité

g spéciFique, p. ex., de 2 x 10 U/mg dans 25 ml de sérum-albumine humaine à 5%, on Fait passer la solution à travers un Filtre bactériologique et on subdivise aseptiquement la solution Filtrée en 100 Flacons, contenant chacun g

20 =5 x 10 unités d'interFeron pur convenant à l'administration parentérale. Il est préFérable de garder les Flacons à Froid [-20°C] avant l'emploi.

Les composés de l'invention peuvent être Formulés selon des procédés connus pour préparer des compositions 25 pharmaceutiquement utiles, par lesquels on combine le présent polypeptide sous Forme de mélange avec un support pharmaceutiquement acceptable. Les véhicules appropriés et leur Formulation sont décrits dans Remington Pharmaceutical Sciences par E.W. Martin, cité ici à titre de réFérence. 3G Ces compositions contiennent une quantité eFFicace de la présente protéine d'interFéron avec une quantité eFFicace de véhicule aFin de préparer des compositions pharmaceutiquement acceptables appropriées à l'administration eFFicace à l'hôte. Le mode d'administration.préFéré est parentéral.

Claims

REVENDICATIONS

1. Procédé de production d'un polypeptide comprenant la séquence d'acides aminés d'un interFéron de Fibroblaste humain mûr non accompagné d'une quelconque préséquence ou partie de préséquence correspondante, procédé qui implique de Faire croître un micro-organisme transFormé avec un véhicule d'expression microbienne réplicable capable d'exprimer ledit polypeptide, de lui Faire exprimer ledit polypeptide et de le recueillir.

2. Procédé tel que revendiqué dans la revendication 1, où le polypeptide ne s'accompagne pas d'une glycosylation associée.

3. Procédé tel que revendiqué dans la revendicatbn 1, où le polypeptide peut comprendre l'acide aminé méthionine ccmme acide aminé venant ordinairement en premier dudit interFéron de Fibroblaste.

4. Procédé tel que revendiqué dans la revendication 1, où le polypeptide comprend un conjugué clivable ou une' protéine signal microbienne attaché^' à l'extrémité N de l'acide aminé venant ordinairement en premier dudit interFéron de Fibroblaste.

5. Procédé de production de micro-organismes capables de produire un polypeptide comprenant la séquence d'acides aminés d'un interFéron de Fibroblaste humain mûr qui ne s'accompagne pas d'une quelconque préséquence ou partie de préséquencè correspondante, procédé qui implique de transFormer un micro-organisme avec un véhicule d'expression microbienne réplicable capable d'exprimer ledit polypeptide

r

10

15

20

25

et de cultiver le micro-organisme transformé.

5. Procédé de production d'un véhicule d'expression microbienne réplicable capable dans un micro-organisme transformant d.'exprimer un polypeptide comprenant la séquence d'acides aminés d'un interféron de fibroblaste humain mûr qui ne s'accompagne pas d'une quelconque préséquence du partie de préséquence correspondante, procédé qui implique de construire une première séquence d'ADN donnant le code dudit polypeptide et de lier de façon opératoire ladite première séquence d'ADN avec une seconde séquence d'ADM capable de réaliser l'expression microbienne de ladite première séquence d'ADN.

7. Procédé de la revendication S où ladite seconde séquence d'ADN comprend un opérateur-promoteur trp multiple.

S. Procédé de préparation de compositions pharmaceutiques contenant un polypeptide produit par un moyen microbien comprenant la séquence d'acides aminés d'un interféron de fibroblaste humain mûr qui ne s'accompagne pas d'une quelconque préséquence ou partie de préséquence correspondante, procédé qui implique de mélanger ledit polypeptide avec des supports non toxiques, inertes, thérapeutiquement compatibles et d'amener le mélange obtenu sous une forme posolDgique pharmaceutique appropriée.

9. Composition pharmaceutique contenant un polypeptide produit par un moyen microbien comprenant la séquence d'acides aminés d'un interféron de fibroblaste humain mûr qui ne s'accompagne pas d'une quelconque préséquence ou partie de préséquence correspaidante et un support non toxique, inerte, thérapeutiquement compatible.

10. Les procédés de préparation de polypeptides, de véhicules d'expression microbienne réplicables et de

37

micro-organismes -tels que décrits ci-dessus.

11. Séquence d'ADN comprenant une séquence donnant le code de la séquence d'acides aminés d'un interFéron de Fibroblaste humain mûr qui ne s'accompagne pas d'une quelconque préséquence ou partie de préséquence.

12 . Séquence d'ADN comprenant une séquence donnant le code de la séquence d'acides aminés d'un interFéron de Fibroblast humain mûr, _■ . l'acide aminé méthionine étant l'acide aminé venant ordinairement en premier dudit interFéron .

13. Séquence d'ADN comprenant une séquence donnant le code de la séquence d'acides aminés d'un interFéron de Fibroblaste humain mûr ainsi que de la séquence d'acides aminés d'un conjugué clivable ou d'une protéine signal microbienne attaché à l'extrémité N de l'acide aminé venant ordinairement en premier dudit interFéron.

14. Séquence d'ADN selon l'une quelconque des revendications 11-13 liée de Façon opératoire avec une séquence d'ADN capable de réaliser l'expression microbienne du polypeptide encodé.

15. Véhicule d'expression microbienne réplicable capable, dans un micro-organisme transFormant, d'exprimer un polypeptide codé par une séquence d'ADN selon l'une quelconque des revendications 11-14.

1S. Véhicule d'expression tel que revendiqué dans la revendication 15 qui est un plasmide.

33

>

17. Plasmide choisi dans le groupe constitué par pFIF1ac9, pFIFtrpS9 et pFIFtrp^S9.

18. Micro-organisme transformé avec un véhicule d'expression selon l'une' quelconque des revendications 15-17.

19. Micro-organisme selon la revendication 18 obtenu en transformant une souche d'E. coli.

20. Micro-organisme transformé selon la revendication 19 où ladite souche d'E. coli est E. coli K-12 souche 294.

21. Micro-organisme transformé selon la revendication 1E obtenu en transformant Bacillus subtilis.

22. Micro-organisme transformé selon la revendication 18 obtenu en transformant Saccharomyces cerevisiae.

ORIGINAL

en pages

_ contenant —Renvois lé «root rayé nu?

R AU en Propriété Industrielle 26bi!| Boul. Princesse Charlotte MONTE-CARLO

Par procuration <i©

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