DD210071A5

DD210071A5 - Verfahren zur herstellung einer lebensfaehigen kultur

Info

Publication number: DD210071A5
Application number: DD80244149A
Authority: DD
Inventors: David V Goeddel; Herbert L Heyneker
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 1979-07-05
Filing date: 1980-07-04
Publication date: 1984-05-30
Also published as: AU574351B2; MY8500764A; IE50460B1; JP2622479B2; IL60312A0; YU121283A; MY8500765A; IE50462B1; RO93374B; DK97381A; NO167673B; CA1164375A; NO860680L; GB2055382A; YU121183A; IL69492A0; IL60312A; AR244341A1; GR69320B; EP0022242B1

Abstract

Die Erfindung betrifft die mikrobielle Expression von quasi-synthetischen Genen ueber die Herstellung eines sich replizierenden klonierenden Vektors. Die Erfindung stellt ein genetisches Verfahren zur Herstellung von medizinisch einsetzbarem, menschlichem Wachstumshormon dar. Erfindungaufgabe ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung eines Polypeptids. Es werden Verfahren und Mittel fuer die Konstruktion und mikrobielle Expression quasi-synthetischer Gene beschrieben, die aus der Kombination von organischer Synthese und enzymatischer, reverser Transkription von Boten-RNA-Sequenzen hervorgehen, die vom Standpunkt des gewuenschten Proteinprodukts unvollstaendig sind. Bevorzugten Produkten der Expression fehlen bioinaktivierende Fuehrersequenzen, die in eukaryotischen Expressionsprodukten ueblich sind, jedoch problematisch in bezug auf das mikrobielle Schneiden, das erst das bioaktive Material liefert. Eine bevorzugte Ausfuehrungsform ist naeher erlaeutert, bei der ein Gen, das fuer menschliches Wachstumshormon codiert(welches beispielsweise fuer die Behandlung von hypophysaerem Zwergenwuchs benoetigt wird), konstruiert und exprimiert wird.

Description

O' f / i / Π ^! Berlin, den 11.4.1983

Jan -.44 -w J /4 · "^

." i w ^ Ausscheidung I aus

AP C 12 N/222 413 (57 800/12)

Verfahren zur Herstellung einer lebensfähigen Kultur Anwendungsgebiet der Erfinduns;

Die Erfindung betrifft die aikrobielle Expression von quasi-synthetischen Genen über die Herstellung eines sich replizierenden klonierenden Vektors· Ss gelingt dadurch die Bereitstellung eines menschlichen Wachstumshormons,. das in der Medizin bei der.Behandlung von hypophysärem Zwergenwuchs eingesetzt werden kann.

Bekannte technische Lösungen-

Die DNA oder DNS (Desoxyribonueleinsäure) aus der Gene bestehen, enthält sowohl Protein codierende oder "Struktur"-Gene als auch Kontrollregionen,., welche, die jSxpresaion ih^er Information dadurch vermitteln, daß sie Bereiche (sites) für die RN8-?olymerase-3indung, Information für ribosomale Bindestellen usw» bereitstellen. Codiertes Protein wird von der korrespondierenden DNS innerhalb eines Organismus durch einen vielstufigen Prozeß exprimiertj wo6ei:

1. das Enzym RliS-Polymerase in der Kontrollregion (im folgenden "Promotor" genannt) aktiviert wird und sich an den Struktur-Genen entlang arbeitet, wobei deren codierte Information in Boten-(Messenger)-Ribonucleinsäure (mENS) transkribiert wird, bis die Transkription bei einem oder mehreren "Stop"-Codons beendet wird;

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2. die mRNA-Sotschaft an den Ribosomen in ein Protein translatiert wird, für dessen Aminosäuresequenz das Gen codiert, beginnend bei einem "Start"-Signal für die Translation» überwiegend einem ATG (das in "f-Methionin" translatiert wird)«

In Übereinstimmung mit dem genetischen Code spezifiziert da DNA jede»Aminosäure durch ein Triplet oder "Codon" von drei benachbarten Nucleotiden, die einzeln ausgewählt werden aus Adenosin, Thymidin, Cytidin und Guanin, die im folgenden A, T_# C oder G genannt werden. Diese treten in dem codierenden Strang oder der codierenden Sequenz einer Doppelstrang-{"Duplex")-DNA auf, dessen bleibender oder "kofiip lerne nt arer^!' Strang aus Nucleotiden ("Sasen") gebildet wird, die mit den ihnen- komplementären Basen im codierenden Strang Wasserstoffbrückenbindungen eingehen. A ist korn- . plementär zu T, und C ist komplementär zu G. Die bisher beschriebenen und weitere Erkenntnisse, die sich auf den Hintergrund der Erfindung beziehen, sind ausführlich diskutiert in Benjamin Lewin, Gene Expression, 1, 2 (1974) .und 3 (1977) John Wiley und Sons, M. Y, Diese und andere Veröffentlichungen, die hier angesprochen sind, sind durch Verweis in die Offenbarung mit einbezogen»

Schneiden und Verbinden von DNA

Hs steht eine Anzahl von Techniken für DNA-Rekombination zur Verfugung, nach denen aneinandergrenzsnds Enden separater DNA-Fragmente auf die eine oder andere Weise geschnitten werden, um das Verbinden zu erleichtern» Das Verbinden geschient durch Bildung von Phosphodiesterbindungen zwischen

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aneinandergrenzenden Nucleotiden» meistens durch die Wirkung eines Enzyms, einer T4-DNA-Ligase. Auf diese Weise können stumpfe Enden direkt miteinander verbunden werden. Alternativ dazu sind Fragmente mit komplementären Einzelsträngen an ihren aneinandergrenzenden Enden vorteilhaft, da durch die Wasserstoffbrückenbindungen die jeweiligen"Enden in die Position für die anschließende Verbindung gebracht werden» Solche Einzelstränge, als kohäsive Enden bezeichnet, können dadurch gebildet werden, daß man an stumpfe Enden unter • Verwendung einer terminalen Transferase Nucleotide anhängt, ^v- und manchmal einfach dadurch, daß ein Strang eines stumpfen f"~- Endes mit einem Enzym v/ie Ά. -Exonuclease abgeknabbert wird. Meistens jedoch verwendet man Restrilctionsendonucleasan (im folgenden "Restriktionsenzyse"), die Phosphodiesterbindungen in und im Bereich von spezifischen Nucleotidsequenzen, die eine Länge von etwa 4 bis 6 Basenpaaren haben ("Restriktionserkennungsstelle" ), schneiden. Es sind sehr viele Restriktionsenzyme und ihre Erksnnungsstellen bekannt

Siehe z. B. R. 0. Roberts, CRC Critical Reviews in Biochemistry, 123 (Nov.. 1975), Viele davon machen versetzte Schnitte, wodurch kurze komplementäre Einzelstrangsequenzen ,-... an den Enden eines an sich doppelst rängigen Fragments

entstehen. Als komplementäre Sequenzen können die überstehenden oder "kohäsiven" Enden durch 3asenpaarung rekombinieren. Wenn zwei unterschiedliche Moleküle.mit diesen Enzymen geschnitten werden, entsteht durch kreuzweise Paarung der komplementären Einzelstränge ein neues DNA-Molekül. Durch die Verwendung von Ligase, die die an den Verschmelzungspunkten bleibenden Einzelstrangbrüche heilt, erhalten die neuen DNA-Moleküle eine feste kovalente Bindung.

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Restriktionsenzyme, die ,an geschnittener doppelstrangiger DUA "stumpfe" Enden hinterlassen, erlauben eine Rekombination mit anderen stumpfendigen Sequenzen durch beispielsweise T4--Ligase„

Spionierende Vektoren und rekombinante DHA

Für den vorliegenden Zweck wird folgendes "klonierender Vektor" genannt: ein niohtchromosoaales Stück einer doppelsträngigen DIAj das ein intaktes Replikon enthält, so daß der'Vektor repliziert werden kann, wenn er in einen einzelligen Organismus ("Mikrobe") durch Transformation gebracht wird« Ein auf diese Weise transformierter Organismus wird "Transformante" genannt. Derzeit sind die klonierenden Vektoren, die .üblicherweise verwendet werden, von Viren und Bakterien abgeleitet und sind überwiegend Ringe von bakterieller DUA, genannt "Plasmide"»

Die Fortschritte in der Biochemie haben in den letzten Jahren zur Konstruktion von "rekombinanten" klonierenden Vektoren geführt, die beispielsweise aus einem Plasmid, das exogene DHA enthält, bestehen_e In besonderen Beispielen kann die Rekombinante "heterologe¹* DUA einschließen, wobei damit eine DIA gemeint ist, die für Polypeptide codiert _t die normalerweise nicht durch den Organismus.hergestellt werden, welcher empfindlich ist für die Transformation durch den rekombinanten Vektor«, Ss werden somit Plasmide mit Restriktionsenzymen geschnitten, um lineare DUA₉ die verbindbare Enden hat, zuua Verfügung zu stellen. Diese werden an ein exogenes Gen gebunden, das ebenfalls verbindbare Enden aufweist, um ein biologisch fuiasfcioniersndea Teil zur Verfügung zu stellen, das ein intaktes Replikon.und eine phänotypische Eigenschaft aufweist, die benutzt werden kann,

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um Transformanten zu selektieren. Das rekombinante Teil wird durch Transformation in einem" Mikroorganismus überführt, und die Transformante wird isoliert und geclont. Das Ziel ist j große Populationen zu erhalten, die Kopien des exogenen Gens enthalten, und in besonderen Fällen ist das Ziel die Expression des Proteins, für welches das Gen codiert, über die hiermit verbundene Technologie und deren mögliche Anwendung ist in extenso berichtet in Miles International

( Symposium Series 10; Recombinant Molecules: Impact on Science and Society, Beers und Bosseff, eds», Raven Press,

Q N. Y. (1977).

Expression von rekombinanter DNA

Neben der Verwendung von clonierenden Vektoren, um den Vorrat von Genen durch Replikation zu vergrößern, hat es Versuche gegeben, einige davon erfolgreich, tatsächlich eine Expression der Proteine zu erhalten, für die die Gene codieren. In einem ersten derartigen Versuch wurde ein Gen für das Hirnhorraon Somatostatin unter dem Einfluß des lac-Promote rs in einem Ξ. coli Sakterium exprimiert

;_v / (K. Itakura et al., Science, 198, 1056 (1977)). Kürzlich

gelang auf.dfese gleiche Weise die Expression der A- und

' -^J B-Kette des menschlichen Insulins, die zusammengefügt das

, Hormon bilden (D, V. Goeddel et al., Proc. Nat'l. Äcad. Sei., USA, 75, 106" (1979)). In jedem Fall wurden die Gene vollständig durch Synthese konstruiert.. In jedem Fall würden offensichtlich proteolytische Enzyme innerhalb der Zelle das gewünschte Produkt abbauen, wodurch dessen Herstellung in konjugierter Form nötig ist, d. h. als Tandem mit einem

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anderen Protein, das das gewünschte Produkt durch Kompartimentierung schützt und das außerhalb der Zelle abgeschnitten werden kann, um das angestrebte Produkt zu erhalten. Diese Arbeit ist in den folgenden veröffentlichten englischen Patentschriften des Anmelders der vorliegenden Anmeldung beschrieben: GB-PS 2 007 675 A, 2 007 670 A, 2 007 67δ Α und 2 008 123 A.

Während sich der Weg über synthetische Gene in den bisher diskutierten, verschiedenen Fällen als zweckmäßig erwiesen hat, zeigten sich wirkliche Schwierigkeiten für den Fall von sehr viel größeren Proteinprodukten, z, B, Wachstumshormonen, Interferon USV/,, deren Gene in korrespondierender Weise komplexer und weniger geeignet für eine leichte Synthese waren. Gleichzeitig wäre es wünschenswert, derartige Produkte ohne die Begleitung durch konjugierendes Protein zu expriraiersn, da die Notwendigkeit von deren Expression die Verwertung von Material .erfordert, das innerhalb des Organismus, besser für die Konstruktion des angestrebten Produkts verwendet werden könnte.

In anderen Arbeiten ist die Expression von Gsnen versucht worden, die nicht durch organische Synthese erhalten wurden, sondern durch reverse Transkription von korrespondierender Messenger-RNA, die aus Gewebe gereinigt wurde, Disser Versuch ist mit zwei Problemen behaftet, Erstens kann die reverse Transkriptase die Transkription von der mRNA kurz vor der Fertigstellung der cONA für die komplette gewünschte Aminosäuresequenz beenden,-So haben beispielsweise Villa-Koma roff et al, eine cDNA für Ratten-Proinsulin erhalten,

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-^? ι 4| .^ iC - 7 -

der die ersten drei Aminosäuren des Insulinvorläufers fehlten (Proc. Nat ¹I Acad. Sei,, "USA, 75, 3727 (1978)). Weiterhin hat die reverse Transkription von mRNA für Polypeptide, die in Vorläuferform exprimiert werden, eine cONA für den Vorläufer ergeben, statt des bioaktiven Proteins, das man erhält, wenn in einer eukaryotischen Zelle Führersequenzen (im folgenden Leader-Sequenzen) enzymatisch abgetrennt werden. Bisher ist keine Bakterienzelle aufgezeigt worden, die diese Fähigkeit hätte, so daß das raRNA-Transkript eher die Expression von Produkten ergeben hat, die die Le_ader-Sequenz der Vorläuferform enthalten als das bioaktive Protein selbst (Villa-Komaroff, a. a, O. (Ratten-Proinsulin); P. H, Seeburg et. al«, Nature, 275, 795 (1978) (Rattenwachstumshormon)),

Schließlich haben vergangene Versuche durch andere zur bakteriellen Expression menschlicher Hormone (oder deren Vorläufern) von mRNA-Transkripten gelegentlich nur zur Produktion des konjugierten Proteins geführt, das offensichtlich nicht dem extrazellulären Schneiden zugänglich ist, z. 8, Villa-Komaroff, a, a, 0. (Peniciilinase-Proinsulin); Seeburg, a. a, O. (ß-Lactamase-Wachstumshorraon)«

Menschliches Wachstumshormon

Menschliches Wachstumshormon ("HGH") wird abgesondert in der menschlichen Hypophyse» Ss besteht aus 191 Aminosäuren und ist mit einem Molekulargewicht von etwa 21.500 mehr als dreimal so groß wie Insulin, 3is zur vorliegenden Erfindung konnte menschliches Wachstumshormon nur arbeitsaufwendig aus einem sehr limitierten Angebot gewonnen werden - der

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Hypophyse aus menschlichen Leichen, Die daraus folgende Knappheit dieser Substanz hat ihre Anwendung bei der Behandlung von durch Funktionsstörung der Hypophyse verursachten hypophysärem Zwergenwuchs begrenzt, und sogar hier-wird aufgrund zuverlässiger Schätzungen vermutet, daß vom Menschen abgeleitetes HGH nur in einer solchen Menge erhalten werden kann, daß nicht mehr als 50 % der Betroffenen damit behandelt werden können«

Ziel der Erfindung;

Zusammengefaßt besteht daher eine Notwendigkeit für neue Methoden, um HGH und andere Polypeptidpredukte in großen Mengen herzustellen.« Diese Notwendigkeit ist besonders akut in dem FaIl₅ wenn Polypeptide zu groß sind, um organische Synthese zuzulassen oder, aus diesem Grund", mikrobiologische Expression von vollständigen synthetischen Genen, Die Expression von Säugetierhormonen von rnRNA-Transkripten hat die Aussicht eröffnet, die Schwierigkeit, die/äem synthetischen Versuch anhaften, zu umgehen, andererseits jedoch bis heute lediglich die mikrobielle Produktion von bioinaktiven Kongugaten erlaubt, von denen die gewünschten Hormone nicht brauchbar getrennt werden können»

Wesen der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde_s ein Verfahren zur Herstellung einer lebensfähigen Kultur zu entwickeln, die in einem mikrobiellen Organismus zur Expression eines speziellen Polypeptide mit bekannter Aminosäuresequenz fähig ist, bei dem ein für das Polypeptid codierendes Gen in einen klonierenden Vektor eingefügt und unter Kontrolle eines Sxpres-slonspromotors gebracht-wird»

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Erfindungsgemäß bereitgestellt wird somit ein Verfahren zum Herstellen einer lebensfähigen Kultur eines mikrobiellen Organismus, der einen sich replizierenden klonierenden Vektor trägt und der fähig ist, menschliches Wachstumshormon zu exprimieren, wobei ein für menschliches Wachstumshormon codierendes Gen in einen klonierenden Vek'tor inseriert und unter die Kontrolle eines Expressionspromotors gestellt ist· Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß

- ein erstes Genfragment für ein Expressionsprodukt er-, halten wird, wobei das besagte Fragment einen Teil der codierenden Sequenz für das genannte menschliche Wachstumshormon enthält .und das genannte erste fragment für weniger als alle Aminosäuren der -Aminosäuresequenz des genannten Wachstumshormons codiert,

- ein zweites Genfragment zur Verfugung gestellt wird, das für den Reat der Aminosäuresequenz des menschlichen Wachstumshormons codiert, wobei das genannte zweite Genfragment für mindestens den Amino-Ende?-Bestandteil des menschlichen Wachstumshormons codiert,

- die genannten Genfragmente in einem sich-replizierenden klonierenden Vektor in richtiger Lesephase relativ zueinander und unter die Kontrolle eines Expressionapromotors angeordnet werden., wodurch ein sich replizierender klonierender Vektor gebildet wird, der zur Expression der Aminosäuresequenz des genannten menschlichen Wachstumshormons ohne anhängendes Fremdprotein fähig ist,

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- der Mikroorganismus mit dem klonierenden Vektor transformiert wird, und

- der transformierte Mikroorganismus in einer Kultur mit Nährstoffen gezüchtet wird*

Die Tragmente werden so ausgewählt, daß sie als wesentlichen Bestandteil cDIA oder eine Replikation davon enthalten·

Als klonierenden Vektor wird ein Plasmid selektiert, und das Plasciid wird gegenüber mindestens einem Antibiotikum resistent gemacht*

Ss wird ein solches Plasmid gebildet, dem der tet-Promotor" fehlt und das dennoch gegenüber Tetracyclin resistent ist»

Das Verfahren ist weiterhin dadurch gekennzeichnet, daß das für das menschliche Wachstumshormon codierende Gen unter die Kontrolle eines lac-Promotors in 2andem-Struktur gestellt wird j wobei erfindungsgemäß der sich replizierende klonierende Vektor das Plasmid pHGH 10? ist«

Der sich replizierende klonierende Vektor kann auch das Plasmid pHGH 107-1 sein«

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Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung einer lebensfähigen Kultur eines mikrobiellen Organismus, der einen sich replizierenden klonierenden Vektor trägt, ist ferner dadurch gekennzeichnet, daß dieser Punktion3gene für Ampicillin- und Tetracyclinresistenz enthält, sowie einen lac-Promotor in Tandem-Struktur, der zwischen den genannten Genen liegt, und so orientiert ist, daß er die Expression in Richtung des Gens für Tetracyclinresistenz in Gang setzt, und daß ferner eine Mehrzahl von Restriktionserkennungssteilen enthalten sind, die stromabwärts vom genannten Protorsystem liegen, wobei die genannten Restriktionserkennungsstellen jeweils cohäsive und stumpfe Enden nach dem Schneiden liefern, wodurch richtiges Einfügen von heterologer DlA zwischen den genannten Srkennungsstellen ermöglicht wird, so daß diese unter die Kontrolle des genannten Promotor-Systems ge_;langen_s und daß der klonierende Vektor transformiert wird, um einen Mikroorganismus mit dem klonierenden Vektor zu erhalten, und daß der transformierte Mikroorganismus in einer Hährmedium enthaltenden Kultur gezüchtet wird·

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Der oben genannte, sich replizierende klonierende Vektor ist das ilasinid pGH 6_e

Die vorliegende Erfindung stellt Methoden und Mittel zur Expression quasi-synthetiseher Gene aur Verfügung _t wobei durch reverse Iranskription ein wesentlicher Bestandteil, vorzugsweise die Mehrheit der codierenden Sequens, zur Verfügung gestellt wird, ohne den arbeitsaufwendigen Umweg der

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vollständigen synthetischen Konstruktion, während die Synthese des Restes der codierenden Sequenz ein komplettes Gen liefert, das fähig ist zur Expression des gewünschten Polypeptids, ohne die Begleitung von bioinaktivierenden Leader-Sequenzen oder anderem Fremdprotein, Alternativ dazu kann der synthetische Rest ein gegen Proteolyse resistentes Konjugat ergeben, so gebaut, daß das Schneiden des Fremdproteins außerhalb der Zelle ermöglicht ist,

\,_. wodurch die bioaktive Form erhalten wird. Die Erfindung stellt folglich Methoden und Mittel für die mikrobielle \ ' Produktion von zahlreichen Materialien zur Verfügung, die bisher lediglich in sehr begrenzter Menge durch kostenaufwendige Extraktion aus Gewebe hergestellt werden konnten, und weitere, die früher zur industriellen Herstellung ungeeignet waren. Jn ihrer am meisten bevorzugten Form stellt die Erfindung die erste Möglichkeit dar, mit der ein medizinisch signifikantes Polypeptidhormon (menschliches Wachstumshormon) bakteriell experimiert wird, wobei sowohl die intrazelluläre Proteolyse als auch die Notwendigkeit der Kompartimentierung der bioaktiven Form mit Fremdprotsin

,.• ~ bis zum extrazellulären Schneiden vermieden werden. Der mikrobielle Ursprung für menschliches Wachstumshormon, ermöglicht durch die Erfindung, bietet vorerst einen

"^ reichen Vorrat des Hormons für de Behandlung von Zwergenwuchs, zusammen mit anderen Anwendungsmöglichkeiten, die bisher jenseits der Kapazität des Hormons lagen, die aus Geweben zu erhalten waren, einschließlich diffusem Magenbluten, Pseudoarthrose, der Therapie von Brandwunden, Wundheilung Dystrophie und der Heilung von Knochenbrüchen,

Der generelle Weg der Erfindung ist ds Kombination mehrerer Genfragtnente in einem einzigen clonierenden Vektor, wobei

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diese Genfragmente in. Kombination für die expression des gewünschten Produkts codieren. Von den Genfragmenten ist mindestens eines ein cDNA-Fragment, das durch reverse Transkription von mRNA abgeleitet ist, welches aus Gewebe isoliert wurde, wie durch die Methode nach A, Ullrich et al., Science, 196.» 1313 (1977)* Die cDNA stellt einen wesentlichen Bestandteil, vorzugsweise mindestens eine Mehrheit der Codons, für das gewünschte Produkt zur Verfügung, während restliche Teile des Gens'synthetisch erhalten werden. Die synthetischen und die raRNA-Transkriptfragmente werden getrennt geclont, um ausreichende Mengen für den Einsatz in dem späteren Korabinationsschritt zur Verfugung zu stellen.

Eine,Vielzahl von Überlegungen beeinflußt die Verteilung der Codons für das Endprodukt, z, 3, zwischen synthetischer

und cDNA, ganz besonders die DNA-Sequenz der komplementären DNA, wie es beschrieben ist in dem Verfahren nach Maxara und Gilbert, Proc. Nat'l, Acad, Sei., USA, 74, 560 (1977). Komplementäre DNA, die durch reverse Transkription erhalten wird, wird auf unveränderliche Weise Codons für mindestens eine Carboxylendgruppe des gewünschten Produkts enthalten, ebenso wie andere, stromabwärts von einem oder mehreren Translations-Stopsignalen, benachbart zum Carboxylende liegende Codons für nichttranslatErte mRNA, Die Anwesenheit von DNA für nichttranslatierte RNA ist weitgehend unerheblich, obwohl übermäßig verlängerte Sequenzen dieser Art z, B» durch Schneiden rait Restriktionsenzymen entfernt werden können, um zelluläres Material zu erhalten, das für die Replikation und Expression der DNA für das angestrebte Produkt benötigt wird. In besonderen Fällen werden die cDNA-Codons für die vollständige gewünschte Aminosäuresequenz enthalten, ebenso wie fremde Codons stromaufwärts

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vom Aminoende des angestrebten Produkts, Zum Beispiel werden viele, wenn nicht alle, Polypeptidhormone in einer Vorläuferform exprimiert mit Leader- oder Signalsequenzen für ein Protein, das beispielsweise beim Transport zur Zellvvand beteiligt ist. Während der Expression von eukaryotischen Zellen werden diese Sequenzen enzymatisch beseitigt, so daß das Hormon in seiner freien bioaktiven Form in den periplasmatischen Raum eindringt» Man kann sich jedoch nicht

( darauf verlassen, daß rnikrobielle Zellen diese Funktion ausführen, und es ist folglich wünschenswert, Sequenzen,

/" . die für solche Signale oder Leader-Sequenzen codieren, vom mRNA-Transkript zu entfernen. Im Verlauf dieses"Entfernungsvorgangs geht auch das Translations-Startsignal verloren, und nahezu immer werden ebenso einige Codons für das angestrebte Produkt entfernt. Die synthetische Komponente des quasi-synthetischen Genprodukts der Erfindung ersetzt diese letztgenannten Codons, ebenso stellt sie ein neues Translations-Startsignal zur Verfugung, wobei der Vektor, in dem sich das;Hybridgen"letztlich entwickeln wird, selbst keinen günstig gelegenen Start aufweist,

.._ ' Das Eliminieren der Leader-Sequenz aus Wachstumshormon-cDNA

wird begünstigt durch das Zurverfügungsteilen einer Rev.„-st riktionserkennungsstelle innerhalb des .das Wachstumshormon codierenden Teils des Gens. Die Erfindung kann nichtsdestotrotz auch ohne das Zurverfügungstsllen einer solchen Erkennungsstelle durchgeführt werden, oder in jedem Fall ohne Rücksicht auf die Erhältlichkeit einer Restriktionserkennungsstelle , die ausreichend nahe am Aminoende des gewünschten Polypeptids liegt, um die Notwendigkeit für eine umfangreiche Synthese der Genkomponente zu vermeiden, die nicht von in RNA abgeleitet ist, In jeder cQNA,-die

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für das gewünschte Polypeptid und eine Leader- oder andere bioinaktivierende Sequenz codiert <> wird sich daher die Grenze zwischen den Codons der letzteren and denen des reifen Polypeptide an der Aminosäuresequenz des reifen Polypeptide zeigen* Man kann einfach in die Gene verdauen, die für das Peptid der Wahl codieren^ und so die ungewünschten Leader- oder andere Sequenzen entfernen«, Wenn daher beispielsweise eine cDHA folgender Struktur gegeben ist:

TTAAGCCCTGATCGT._β

6 SiC ♦

AATTCGGGACTAGCA*..

wobei der Endpunkt der Verdauung durch einen Pfeil bezeichnet ist, kann eine Reaktionsbedingung für eine Bxonuclease-Yerdaaiing gewählt werden, um die oberen Sequenzen "a" und "b" au entfernen, wonach eine SI-luclease-Yerdauung automatisch die unteren Sequenzen "c" und "d" eliminiert* Alter« nativ dazu und präziser kann man DIA-?οlymerase-Verdauung in Gegenwart von Desosynucleotidtriphosphaten (ⁿd(A,T,C,G)T?^u) einsetzen, Lm oben genannten Beispiel wird daher DHA-?ölymerase in Gegenwart von dGTP die Sequenz "c" entfernen (und bei "G" anhalten), daraufhin wird S1-Huclease ^!1ä^!! verdauen; DNA-?olyinerase in Gegenwart von dTT? wird "d" entfernen (und bei "T" anhalten), und 31-Huclease wird dann "d^!1 herausschneiden usw<> Siehe allgemein A* Kornberg, DlJA-Synthesis, S, 87 bis 88, W_e H₀ Preeman und Co*, San Francisco (1974).

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Vorzugsweise kann man ganz einfach eine Restriktionser- . kennungsstelle an einem passenden Punkt innerhalb des Bereichs der cDNA, die für das gewünschte Produkt codiert, konstruieren, durch Anwendung der "unpassenden" (mismatch) Reparatursynthesetechnik von A, Razin et al/_ä Proc, Nat'l, Acad. Sei., USA, 75, 4258 (1978). Bei dieser. Technik können eine oder mehrers Basen in eine bestehende DNA-Sequenz substituiert werden, wobei Primer verwendet werden, die den unpassenden Substituenten enthalten. Mindestens sieben palindromartäge 4-3asenpaarsequenzen werden selektiv durch bekannte Restriktionsenzyme erkannt, das sind AGCT (AIuI), CCGG (HpaII), CGCG (Thal), GATC (Sau3A), GCGC (Hha), GGCC (Haelll) und TCGA (Taql). Wenn die cDMA-Sequenz eine Sequenz enthält, die sich von einer derartigen Erkennungsstelle in nur einer einzigen 3ase unterscheidet, was statistisch sehr .wahrscheinlich ist, ist mit der Reparatursynthese eine replizierte cDNA zu erhalten, die die geeignete substituierte Base enthält und damit die gewünschte Restriktionserkennungsstella» Durch einen Schnitt Wird dale DNA vom unerwünschten Leader entfernt, wonach durch Synthese die Codons wieder angefügt werden, die für die Expression des kompletten Polypeptide benötigt werden.

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Zum Beispiel

Leader-

Godon für gewünschtes Produkt

_ CAGG : —

"mismatch''Reparatursynthese

c DH A

Synthese "a"

Godons für gewünschtes Produkt

quasisyntheti sche DUA

Ss ist natürlich offansichtlich, daß längere Hestriktionserkennungasteilen auf ähnliche Weise eingesetzt werden können, wo das erwünscht ist, oder daß durch sukzessive Reparatur ^-Basenpaare-Restriktionserkennungsstellen gebildet werden können, wo lediglich zwei Basen gemeinsam mit der Erkennungsatelle am gewünschten Punkt erscheinen usw»

Bs werden sich Anwendarigsraöglichkeiten zeigen, bei denen es wünschenswert ist, nicht nur die Aminosäuresequenz des angestrebten Produkts, sondern auch eine bestimmte Menge fremdes, aber speziell hergestelltes Protein zu esprimieren.

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Vier derartige Anwendungen werden durch Beispiele erwähnt werden. Erstens kann das quasi-synthetische Gen ein Hapten oder eine andere immunologische Determinante repräsentieren, auf welche Immunogenität durch Konjugation zu einem zusätzlichen Protein übertragen wird, so daß eine Vaccine produziert wird (siehe allgemein GS-PS 2 008 123 A), Es kann jedoch wieder aus Sicherheitsgründen wünschenswert sein, das angestrebte Produkt als eine Konjugate eines anderen

k^J bioinaktiven Proteins zu exprimieren, die so gebaut ist, daß extrazelluläres Schneiden ermöglicht ist, um die aktive

f^\ Form zu erhalten. Drittens werden Anwendungen vorgestellt, bei denen Polypeptide mit Transportsignalen dem gewünschten Produkt vorausgehen, um die Herstellung des Produkts durch Ausschleusen durch die Zellmembran zu ermöglichen, solange das Signal-Peptid danach geschnitten werden kann. SchlieS-lich kann eine Fremdverbindung verwendet werden, .die so gebaut ist, daß ein spezifischer extrazellulärer Schnitt möglich ist, um das angestrebte Produkt abzuschirmen, das sonst empfindlich wäre für den Abbau durch endogene Proteasen des mikrobiellen Wirts. Zumindest in den letzten drei Anwendungsbereichen kann der synthetische molekulare Adapter, der verwendet wird, um die codirende Sequenz des mRNA-Transkripts zu vervollständigen, zusätzlich Codons eingebaut haben für Aaiinosäuresequenzen, die spezifisch geschnitten werden, beispielsweise durch enzymatische Wirkung« Beispielsweise schneidet Trypsin oder Chymotrysin bei Arg-Arg oder Lys-Lys usw. (siehe GB-PS 2 008 123 A).

Aus dem bisher Geschilderten ist ersichtlich, daß die Erfindung in ihrem breitesten Bereich die mannigfaltigsten Anwendungen erlaubt, von denen alle die folgenden Eigenschaften gemeinsam aufweisen:

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- Es wird ein mRNA-Tränskript verwendet, das für einen wesentlichen Bestandteil der angestrebten„Aminosäuresequenz des Polypsptids codiert, das jedoch, falls es allein exprimiert wird, ein vom angestrebten Produkt verschiedenes Polypeptid produzieren würde, entweder kleiner oder größer als das angestrebte Produkt;

- Protein codierende Codons für andere als solche Aminosauren, die iin angestrebten Produkt enthalten sind, werden, falls vorhanden, entfernt;

- organische Synthese liefert ein Fragment oder Fragmente, die für den Rest der gewünschten Sequenz .codieren; und

- das nrRNA-Transkript und das (die) synthetischen) Fragment(e) werden zusammengefügt und in einen einen Promoter enthaltenden clonierenden Vektor eingefügt, damit entweder das angestrebte Produkt ohne fremdes konjugiertes.Protein, oder das angestrebte Produkt kon~ jugiert mit, aber spezifisch abtrennbar von Fremdprotein repliziert und expriraaert wird.

Das Produkt der Expression wird natürlich in jedem Fall mit der Aminosäure beginnen, für die das Translations- Startsignal codiert (für den Fall von ATG, f-Methionin)♦ Man kann erwarten, daß diese Aminosäure intrazellulär ent-, fernt wird' oder jedenfalls die Bioaktivität des resultierenden Produkts im wesentlichen unbeeinflußt läßt.

Obwohl die Erfindung ein Verfahren allgemeiner Anwendbarkeit bei der Produktion von nützlichen Proteinen, einschließlich Antikörpern, Enzymen und ähnlichem zur Verfugung

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stellt, ist die Erfindung im besonderen auf die Expression von Polypeptidhormonen von Säugetieren und anderen Substanzen mit medizinischer Anwendung gerichtet, 2. B. Glucagon, gastrointestinale Inhibitorpolypeptide, Polypeptide der Bauchspeicheldrüse, Adrenokortikotrbpin, ß-Endorphine, Interferon, Urokinase, Blutgerinnungsfaktoren» menschliches Albumin usw.

Ausführunqsbeispiel

i._,'.^: Die Erfindung wird nachstehend durch Beispiele näher erläutert» In der dazugehörigen Zeichnung, die sich auf bevorzugte Beispiele bezieht, zeigen:

Fig. 1: das Syntheseschema für die Konstruktion eines Genfragments, das für die ersten 24 Aminosäuren des menschlichen Wachstumshormons codiert, zusammen mit dem Startsignal ATG und Bindegliedern, die beim C.Ionen, verwendet werden.JQie Pfeile im codierenden oder oberen Strang ("U") und in dem komplementären s-'™') oder unteren Strang ( "L" )'bezeichnen die Oligo-

nucleotide, die miteinander verbunden wurden, um

^ das gezeigte Fragment zu bilden;

Γ ;

Fig. 2: die Verbindungen der "U"- und "L"-01igonucleotide für-die Bildung des Genfragments aus Fig. 1 und dessen Insertion in ein Plasmid als clonierendera Vektor;

Fig. 3: die DNA-Sequenz (nur der codierende Strang) eines

Haelll-Restriktionsenzymfragments eines HypophysenmRNA-Transkripts mit den numerierten Aminosäuren

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H Ό £> - 22 -

des menschlichen Wachstumshormons, für das sie codieren; Schlüssel restriktionserkennungssteilen sind bezeichnet, ebenso DNA (auf "Stop" folgende) für nichttrans.latierte mRNA;

Fig. 4: die Konstruktion eines clonierenden Vektors für ein Genfragment, das für die Aminosäuren des menschlichen Wachstumshormons codiert, welches nicht synthetisch erhalten wurde, und die Konstruktion dieses Genfragments als komplementäre DNA durch reverse Transkription von mRNA, die aus der Hypophyse menschlichen Ursprungs isoliert wurde;

Fig. 5: die Konstruktion eines Plasmids, das in Bakterien zur Expression des menschlichen Wachstumshormons fähig ist, beginnend mit den Plasmiden der Fig. und 3.

Im folgenden wird eine bevorzugte Ausführungsform, die die Erfindung erläutert, beschrieben, bei der ein quasi-synthetisches Gen, das für menschliches Wachstumshormon codtert, konstruiert, geclont und mikrobiell exprimiert wird,

Konstruktion und Expression eines clonierenden Vektors

für- ,jnerjScjTJ^iches Wachstumshormon

1. Cionieren des Haelll-Fragments des mRNA-Transkripts (Fig. 5 und 4) ______

Polyadenylierte mRNA für menschliches· V^!/achsturashormon (HGH) wurde aus hypophysäres Wachstumshormon produzieren-

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den- Tumoren gewonnen nach dem Verfahren von A· Ullrich et al·, Science, 196, 1313 (1977). 1,5/Ug von Doppelstrang-("ds")-cDNA werden präpariert aus 5/Ug dieser RIA, im "wesentlichen wie beschrieben bei Wickens et al«, Js Biol« Chem,, 253, 2483 (1978), mit der Ausnahme, daß die RliA-Polymerase "Klenow-Fragment", (H₀ Klenow, Proc_e Hat*Iv Acad, Sci₀, USA, 65, 168 (197O)) für die DNA^PoIymeraae I in der Zweit-Strangsynthese eingeaetat wurde» Das Reatriktionsmuster von"HGH ist derartig, daß Haelll-Restriktionserkennungsstellen in der 3' nichtcodiarenden Region und in der Sequenz, die für die Aminosäuren 23 und. 24 des HGH codieren, vorhanden sind, wie gezeigt in Fig· 3* Sine Behandlung der da-HGH-cDlA mit Haelll gibt ein DNA-Fragment von 551 Basenpaaren ("bp")»- die für die -aminosäuren 24 bis 91 des HGH codieren^ 90'ng'"der cDHA werden mit Haelll behandelt, in einem 8%igen Polyacrylamid-Gel einer Elektrophorese unterworfen und die Region bei 550 bp eluierto Man erhält annähernd 1 ng cDNA«,

pBR322, hergestellt nach F„ Bolivar et al·-, Gene 2 (1977) 95 bis 113, wird als klonierender Vektor für die cDHA ausgewählt« p3R322 ist vollständig charakterisiert (J* G, Sutcliffe, Gold Spring Harbor Symposium, 43, 70, "1978))', und ist ein mit zahlreichen Kopien (multicopy) replizierende 3 Plasmid, das sowohl Ampicillin- als auch Tetraeyclin-Resistenz aufweist, die auf den Einschluß der korresponr dierenden Gene ("Ap ^t1 bzw* "Tc " in Fig_o 4) zurückzuführen aind, wobei das Plasmid Brkennungssteilen für die Restriktionsenzyme Pstl, EcoRI und Hindill enthält, wie in der Figur gezeigt.

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Die Schneideprodukte von HaeIII und Pstl haben stumpfe Enden» Es kann folglich das" GC-Anhängeverfahren nach Chang A. C, Y. et al,, Nature, 275, 617 (1978) angewendet werden/ um die stumpfendigen Produkte der Pstl-Schnitte von pBf?322 mit der Haelll-Verdauung des mRNA-Transkripts

zu verbinden, so daß das cDNA-Fragrnent in die Psrl-Er-

kennungsstelle von pBR322 eingefügt wird, und zwar in der Weise, daß die Haelll-Restriktionserkennungsstellen J (GG^CC) auf der cDNA und die Pstl-Restriktionserkennungs-. stellen (CTGCA^G) an jedem Ende des eingeschobenen Teils wieder hergestellt werden·

Es wird also terrainale Desoxynucleotid-Transferase (TdT) verwendet, um annähernd 20 dC-Reste an das 3'-Ende anzufügen, wie bereits früher beschrieben, Chang A, C, Y., a. a. O₊ Auf ähnliche Weise werden an das 3*-Ende von 60 ng Pstl-faehandeltem p8R322 etwa 10 dG-Reste angehängt.. Das Verschmelzen der dC-ergänzten ds-cDNA mit der dG-ergänzten Vektor-ONA wird in 130^1 von 10 tnM Tris~HCl (pH = 7,5), 100 mM NaCl und 0,25 raM EDTA durchgeführt. -v Die Mischung wird auf 70 °C erhitzt, langsam (12 Stunden) ^J auf 37 ⁰C abgekühlt und schließlich auf 20 ⁰C (6 Stunden) abgekühlt, ehe sie zum Transformieren von E. coli χ 1776 verwendet wird. Eine DNA-Sequenzanalysa des Plasraids pHGH31 nach der Methode von Maxara und Gilbert, Proc. Nat'l, Acad. Sei«, USA, .74, 560 (1977)-, nach dem Clonen des Plasmids in χ 1775, .stimmte in den Codons für die Aminosäuren 24 bis 191 des HGH überein,.wie in Fig. 3 gezeigt.

Der Stamm E. coli K-12 χ 1776 hat den Genotyp F"*tonA53, da-ρθβ, inInAl, supE42, δ 40(qal-uvrB) . <^", roin32, rf b-2 ,

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nalA25, oms-2, thyA57^x » metC65« oma-1, ^i 29(bioH-aad), oycB2, cycA1, hedR2, x1776 wurde vom National Institutes of Health als ein EK2-Wirts-Vektor-System bescheinigt,

X1776 hat ein obligates Bedürfnis für Diaminopimelinsäure (DAP) und kann .nicht die Mukopolysaccharidcolan-(colanic)-säure synthetisieren« Die Zelle unterliegt daher 'dem DAP-Mangeltod in all den Kulturmedien, in denen DAP begrenzt ist, jedoch genügend Hährsubstrat vorhanden ist, um den zellulären Stoffwechsel· und das zelluläre Wachstum aufrechtzuerhalten. Der Stamm ist Thymin- oder Thymidin-bedürft ig und unterliegt dem Thymin-Mangeltod mit Abbau der DjSA, wenn Thymin und Thymidin in der Umgebung fehlen,.jedoch genügend lährsubstrate vorhanden sind, um die Stoffwechselaktivität aufrechtzuerhalten, 2I776 ist hochgradig empfindlich gegen Galle und ist daher unfähig zu überleben, d« h, unfähig, eine Passage durch den Intestinaltrakt von Ratten zu überleben, χΐ77β ist hochgradig empfindlich gegen Detergentien, Antibiotika, Arzneimittel,, und Chemikalien«» x1776 kann weder, die DunkeL~ reparatur noch die Photo-Reaktivierimg von UY-induzierten Schaden durchführen und ist daher um mehrere Größenordnungen empfindlicher gegen Sonnenlicht als- der Wildtypstamin von 3» coli« χΐ77β ist resistent gegen viele transduzierende Phagen und läßt bei der Konjugation nur mangelhaft die genetische übertragung von vielen verschiedenen Typen von bei der Konjugation beteiligten Plasmiden zu, was auf die Anwesenheit von verschiedenen Mutationen zurückzuführen ist_o XI776 ist resistent gegen Halidixinsäure, Cycloserin und Trimethoprim, Diese Substanzen können daher dem Medium zugegeben werden, um das überprüfen des Stamms zuermög-

1 /

I 4

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lichen und eine Transformation von Kontaminanten während der Transformation auszuschließen,

xl776 wächst mit einer Generationszeit von etwa 50 Min, sowohl in L-Nährmedium (1-broth) als auch Penassay-Medium (Penassay broth), wenn diese mit 100 ^g DAP/ml und 4 pg Thymidin/ml suppletnentiert werden, und erreicht eine Enddichte von 8 bis 10 χ 10 Zellen/ml in der stationären Phase» Vorsichtiges kreisförmiges Hin- und Herschütteln für eine Zeitspanne von 1 bis 2 Hinuten suspendiert die Zellen vollständig bei Erhalt der Lebensfähigkeit von 100 %. Zusätzliche Details bezüglich xl776 sind zu finden bei R. Curtis et al,, Molecular Cloning of Recombinant DNA, 99 bis 177, Scott und Werner, eds,₍ Academic Press (N, Y, 1977)» xl776 wurde ohne Einschränkungen bei der Hinterlegungsstelle American Type Culture Collection am 3, 3uli 1979 unter der Nummer ATCC 31537 hinterlegt.

2» Konstruktion und Cionieren des

synthetischen Genfraqments {5g, 1 und 2)

Es ist Teil der Strategie für die Konstruktion des HGH-quasi-synthetischen Gens, daß ein synthetisches Fragment konstruiert wird, das stumpfendige Restriktionsschneidestellen aufweist, die. an den Punkten sitzen, an denen an das Fragment das mRNA-Transkript angeknüpft v/erden soll Das synthetische Gen für die ersten 24 Aminosäuren des HGH erhält daher, wie in Fig, 1 gezeigt, eine auf die Aminosäure 23 folgende Haelll-Schneideerkeanungsstelle, Das distale Ende des synthetischen Fragments wird mit einem Verbindungselement (im folgenden "Linker") ver-

4 149 2.27. ²⁰·⁸·¹⁹⁸²

sehen, das die Verschmelzung mit einem Einzelstrangende erlaubt, das durch Restriktionsschnitte in dem Plasmid erhalten wird, in das das mRNA-Transkript und das synthetische Fragment letztlich eingebaut werden sollen.

Wie in Fig, 1 gezeigt, haben die 5'-Enden des doppelsträngigen Fragments einzelsträngige kohäsive Enden für de EcoRI- und Hindlll-Restriktionsendonucleasen, um die Plastnid-Konstruktion zu erleichtern. Das Codon für Methionin am linken Ende stellt eine Erkennungsstelle für die Initiation der Translation zur Verfugung, Es werden zwölf verschiedene Oligonucleotide, dfe in ihrer Größe von undekamer bis hexadekamer variieren, synthetisiert, und zwar nach dem bewahrten Phosphotriester-Verfahren nach Cres, R. Proc, Nat'l» Acad. Sei«, USA, 75, 5765 (1978). Diese Oligonucleotide, U bis U

und L. bis L^, sind durch Pfeile bezeichnet. X ο

10 pq Substanz von Up einschließlich U_ft und Lp einschließlich L werden unter Verwendung der TV₁-PoIy-

32 _

nucleotidkinase und (-^- -P)AiP phosphoryliert, und zwar

(^/ nach dem veröffentlichten Verfahren von Goeddel, D₄₁ V,

et al., Proc. Nat ¹I. Acad. Sei«, USA, 75, 106 (1979).

Es werden drei getrennte T4-Ligase-katalysierte Reaktionen durchgeführt: 10 pg des 5'-0H-Fragments U werden mit phosphorylierteni U₂, L und L_fi vereint ;phosphoryliertes U-, U , L- und L. werden vereint; weiterhin werden

•J *t O ¹H*

10 yg des 5'-OH-Fragments L mit phosphoryliertem L₂, U₅ und Ug vereint. Diese Verknüpfungen werden bei 4 ⁰C für sechs Stunden durchgeführt in einem Medium, das 300 jjl von 20 mM Tris-HCl (pH = 7,5), 10 mM

k4 H 14 9 2 -²⁸~ 11.4,1983

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10 ml Dithiothreitol und 0,5 ml ATP enthält, wobei 100 Einheiten T4-Ligase verwendet werden» Eis drei Verknüpfungsmischungen werden dann vereint, 100 Einheiten.T4-ligase zugegeben, worauf man die Reaktion 12 Stunden lang bei 20 ⁰C ablaufen läßt» Die Mischung wird dann mit Äthanol ausgefällt und auf einem 10%igen Polyacrylamid-Gel einer Elektrophorese unterworfen«, Die Bande, die bis zur 84—Basenpaar-Stelle gewandert ist, wird aus dem Gel herausgeschnitten und elüiert« pBR322 (1/Ug) wird mit EcoRI und Hindill behandelt, das große Praginent wird durch Gel-Elektrophorese isoliert und mit der synthetischen DIiA verknüpft» Diese Mischung wird verwendet, um den Stamm E_e coli K-12-294 (end A, thi", hsr~, hsm,⁺) zu transformieren, Der Stamm 294 wurde am 30« Oktober 1978 bei der Hinterlegungsatelle American. Type Culture Collection unter der Hummer ATCC 31446 ohne Einschränkungen hinterlegt« Sine Sequenzanalyse nach der Masam- und Gilbert-Technik,^;a_o a« 0,, bei der EcoRI — Hindlll-Insertion von. einem Plasmid pHGH3 einer Transformante bestätigte das in £ig» 1 Dargestellte«

3« Konstruktion eines Plasmids für die bakterielle Expression -y^n.HGH (Fig;» 5)

Mit dem synthetischen Fragment in pEGH3 und dem Transkript in pHGH31 wird ein sur Replikation fähiges Plasmid konstruiert, das beide Fragmente enthält, wobei das Sxpressionsplasmid pGH6 verwendet wird, wie in Pig. 5 gezeigt«, Das Szpressionsplasmid, das einen lac-Promotor als Tandem enthält, wurde zuerst folgendermaßen konstruiert« Ein 285-Baaenpaare-langes EcoRI-Fragment,

244143 2 - 29 - 20.8.1932

das zwei 95-Basenpaare-lange UVS-lac-Promoter-Fragmente enthält, welche durch ein 95-Basenpaare-langes, heterologes DNA-Fragment abgetrennt wurden, wird aus dem Plasmid pKB258 isoliert, siehe K. Backman et al., Cell. Vol. 13, 65 bis 71 (1978). Das 285-bp-Fragment wird in die EcoRI-Erkennungsstelle von pBR322 eingesetzt und ein Clon pGHl isolert, in dem die Promoter auf das Gen für Tetracyclin-Resistenz hin und in richtiger Lesephase mit diesem orientiert sind. Die distal zu dem ~~' letztgenannten Gen gelegene EcoRI-Erkennungsstelle wird durch teilweise EcoRI-Verdauung zerstört, die resultierenden einzelsträngigen EcoRI-Enden werden mit DNA-PoIymerase I repariert, und das Plasmid vlrd durch stumpfendige Verbindung wieder in Ringform gebracht. Das resultierende Plasmid (pGH6) enthält eine einzige Ec-oRI-Erkennungsstelle, die passend liegt im Hinblick auf das Promoter-System, in das das komplette Gen für HGH eingebaut werden kann.

Um das synthetische Fragment für die Vereinigung mit dem RNA-Transkript fertigzustellen, werden 10 yjg von pHGH3 / ) mit EcoRI- und Haelll-Restriktionsendonucleasen geschnitten, und das 77-8asenpaare-Fragment, das die codierenden Sequenzen für die HGH-Aminosäuren 1 bis 23 enthält, wird aus einem 8%igen Polyacrylamid-Gel isoliert.

Als nächstes wird das Plasmid pHGH31 (5 pg) mit Haelll geschnitten. Die 551-bp-HGH-Sequenz und ein mitgewandertes 540-bp-HaeIII-Fragment von pBR322 werden durch Gel-Elektrophorese gereinigt. Eine anschließende Behandlung mit Xmal schneidet nur die HGH-Sequenz, wobei 39 Basenpaare von der 3'-nichtcodierenden Region entfernt

w £ -30- 11.4.1983

61 113/12

werden« Das resultierende 512-bp-Pragment wird'von dem 540-bp-pBR322-HaeIII-Stück durch Elektrophorese in einem 6%igen Polyacrylamid-Gel getrennt» Q,3,ug des 77-bp-EcoRI-Kae IH-Fr agments werden mit T4-Ligase in einer 1€/Ul-Reaktion 14 Stunden lang bei 4 ⁰G polymerisiert» Die Mischung wird dann für 5 Minuten auf 70 ⁰C erhitzt, um die Ligase zu inaktivieren, anschließend mit EcoRI be-

lJ handelt (um Fragmente zu schneiden, die aufgrund ihrer ScoRI-Erkennüngssteilen dimerisiert haben), weiterhin

_Lj mit Smal behandelt (um Zaal-Dimere zu schneiden), wodurch ein 591-bp-Fragment'mit einem EcoRI-Ende, das kohäsiv ist, und einem Smal-Ende, das stumpf ist, erhalten wirde Uach dar Reinigung auf „einem 6%igen Polyacrylamid-Gel erhält man annähernd 30 ng dieses Fragments₉ Esssllte bemerkt werden, daß das Expressionsplasmid pGEo keine Xnial-Erkennungsstelle enthält* Smal erkennt jedoch die gleiche Srkennungsstelle wie Xmal/ aber schneidet ganau durch die Mitte, so daß stumpfe Enden erhalten werden* Das Smalgeschnittene Ende des Fragments, das von pHGH31 abgeleitet ist, kann folglich stumpfendig an pGH6 gebunden werden*

Das Expreasionsplasmid pGH6, das den lac-UY5-Promotor in J . Tandemform enthält, wird sukzessive mit HindlH, luclease S1 und EcoSI behandelt und durch Gel-Elektrophorese gereinigt« 50 ng des resultierenden Yektors, der ein kohäsives EeoRI-Ende und ein stumpfes Ende aufweist, wird mit 10 ng der 591-bp-HGH-DUA verbunden« Diese Verbindungsmischung wird verwendet, um E. coil χ177β zu transformieren, • Die Kolonien werden durch Wachstum auf Tetracyclin (12,5/U₁ selektiert. Es ist bemerkenswert, daß die Insertion "des hybriden HGH-Gens in

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pGH6 den Promoter für die Tetracyclin-Resistenz zerstört, daß jedoch der Tandem-lac-Promoter das Durchlesen der Strukturgene für Tetracyclin-Resistenz erlaubt und auf diese Weise die Selektionscharakteristik erhalten bleibt. Es wurden annähernd 400 Transformanten erhalten. Mit der Grunstein-Hogness-Methode, Proc, Nat'l. Acad. Sei,, USA, 72, 3961 (1975), wurden durch Filterhybridisierung 12 Kolonien identifiziert, die die HGH-Sequenz enthalten. Die aus drei dieser Kolonien isolierten Plasraide ergaben das erwartete Restriktionsmuster* wenn sie mit Haelll, PvuII und Pstl geschnitten wurden. Von einem Clon (pHGH107) wurde die DNA-Sequenz bestimmt.

Menschliches Wachstumshormon, das von Transformanten produziert wird, kann ohne weiteres durch direkten Radioimmunoassay nachgewiesen werden, welcher aus Verdünnungsreihen des Oberstands lysierter Zellen durchgeführt wird, unter Verwendung von Phadebas HGH FRIST kit (Farmacia).

Um aufzuzeigen, daß die HGH-Expression unter der Kontrolls des lac-Promoters steht, wird pHGH107 in einen E. coli-Stamra D1210 (lac+(i~0+z y+)), einem Stamm, der den Iac-Expressor überproduziert, transfordert» Bis zur Zugabe des Induktors IPTG (Isopropylthiogalactosidolipoid) kann keine nennenswerte Menge von HGH-Expression nachgewiesen werden.

Ein Entfernen der EcoRI-Erkennunsstelle in pHGH107 hätte zur Folge, daß das ATG-Startsignal von den Codons der Ansatzstelle für die Ribosomen des lac-Promoters den gleichen Abstand hätte, den diese Codons natürlicherweise vom Startsignal für o-Galactosidase haben. Um festzustellen, ob dia Expression durch Nachahmung dieses natürlichen Abstands

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zu steigern ist, wurde pHGH107 in pHGH107-l überführt, indem das erstere Plasmid mit EcoRI geöffnet wurde, die entstehenden Einzelstrangenden mit Sl-Endcnuclease verdaut wurden und das Plasmid durch Verbinden der stumpfen Enden mit T4-Ligase wieder in Ringform überführt wurde« Obwohl sich zeigte, daß das erhaltene'Plasmid in. ähnlicher Weise zur Expression von HGH fähig war, produzierte es ^ jedoch HGH überraschenderweise in geringerem Umfang als _:J pHGHlGT/ wie durch direkten Radioimmunoassay gezeigt werden konnte.

Für den Fachmann ist orfensichtlich^ daß die vorliegende Erfindung nicht auf die bisher geschildertes bevorzugte Ausführungsform beschränkt ist, sondern ausschließlich auf den Schutzbereich der Patentansprüche» Andere Abänderungen als die hier beschriebenen sind möglich, sei es die Wahl des Promoter-Systems, des Elternplasmids, des angestrebten Polypeptidprodukts oder sonstigem. Andere, für die vorliegende Erfindung anwendbare' Promoter-Systeme bestehen beispielsweise aus dem Lambda-Promoter, dem ") Arabinose—Operon (phiSO dara) oder dem Colicin-El-, Galactose-, alkalische Phosphatase- oder Tryptophan-Proraoter. Wirtsorganismen für die bakterielle Expression können ausgewählt werden beispielsweise aus der Familis der Enterobacteriaceae, z« 3. die Stämme Escherichia coli und Salmonella; aus der Familie der Bacillaceae, z. B, Bacillus subtilis; weiterhin Pneumococcus; Streptococcus und Haemophilus Influenzae« Natürlich wird die Wahl des Organismus das Niveau der physikalischen Beherrschung des Clonens und der Expression beeinflussen, welche nur unter Einhaltung der Richtlinien für rekonibinante DNA des National Institutes of Health, 43 Fed. Reg. 50 OSO (1978) durchgeführt werden sollen.

*) A A 1 / Q O 20.8.1982

Für die Arbeit der vorliegenden Erfindung ira Labormaßstab eignet sch der Stamm E, coli xl775 besonders gut, es könnte sich jedoch zeigen, daß für die industrielle Herstellung ira großen Maßstab der Stamm weniger geeignet ist, und zwar aufgrund der ihm eigenen Schwächen, die absichtlich aus biologischen Sicherheitsgründen eingebracht wurden. Mit einer angemessenen Höhe an physikalischer Beherrschung, eher als biologischer, kennen für die Arbeit im großen r~\ Maßstab auch solche Organismen wie E, coli K-12 Stamm 294,

{ mm —· mn

KJ a. a« 0., und E. coli Stamm RRl, Genotyp: Pro Leu Thi R_R~ recA Str Lac y verwendet werden. E* coli RRl wurde durch Paarung aus dem Stamm E. coli HBlOl (H. VV. Soyer et al, 3. Mol. Bio. 41, 459 bis 472 (1969)) mit dem Stamm E₉ coli K-12, Stamm KL15 als Hfr-Donor erhalten. Siehe auch 3. H. Miller,- Experiments in Molecular Genetics (Cold Spring Harbor, New York, 1972). Eine Kultur von E. coli RRl wurde am 30, Oktober 1978 bei der American Type Culture Collection ohne Einschränkung bezüglich der Zugänglichkeit unter der Nummer ATCC 31343 hinterlegt. Auf ähnliche Weise wurde eine Kultur von xl776 am 3. öuli 1979 bei der American Type Culture Collection unter der Nummer ATCC < ; 31537 hinterlegt. Am 3. DuIi 1979 wurden bei der American ^w Type Culture Collection weiterhin hinterlegt: Plasmid pHGH107 (ATCC 40011); Plasmid pGH6 (ATCC 40012); der Stamm X1776, der mit pHGH107 transformiert wurde (ATCC 31538), und E. coli K-12 Stamm 294, transformiert mit pGH6 (ATCC 31539).

Nach der Erfindung hergestellte Organismen können für die in industriellem Maßstab durchgeführte fermentative Produktion von menschlichem »'Wachstumshormon eingesetzt werden, wodurch ein Produkt in solchen Mengen und für Anvvendungs-

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gebiete erhalten wird, wie es bisher unerreichbar war. Beispielsweise können transformierte E. coli-Kulturen gezüchtet werden in wäßrigem Medium in einem Stahl- oder einem anderen Fermentationsgefäß, auf übliche Weise belüftet und geschüttelt, in wäßrigem Medium bei beispielsweise 37 C und nahezu neutralem pH (beispielsweise pH = 7 + 0,3), ergänzt mit geeigneten Nährsubstraten (beispielsweise Kohlen hydrat oder Glycerin), Stickstoffquellen (z, B, Ammoniumsulfat), Kaliumquellen (z, 3, Kaliumphosphat), Spurenelementen, Magnesiumsulfat und ähnüchera, Transforraante Organismen weisen vorzugsweise eine oder mehrere Selektionscharakteristika auf, beispielsweise Antibiotika-Resistenzen, so daß ein Selektionsdruck ausgeübt werden kann, um konkurrierendes Wachstum von Wildtyp E. coli zu behindern, Für den Fall eines gegen Ampicillin oder Tetracyclin resistenten Organismus kann beispielsweise das Antibiotikum zura Fermentationsfflediura gegeben werden, so daß Wildtyp-Organisfiien ausselektisrt werden, die nicht gegen diese Antibiotika resistent sind. Nachdem vollständig fermentiert wurde, wird die bakterielle Suspension zentrifugiert oder die Zellmasse auf andere Weise aus der Kulturbrühe gesammelt daraufhin wird mit physikalischen oder chemischen Mitteln lysiert. Die Zeiltrüraraer werden vom überstand getrennt, und das lösliche Wachstumshormon wird isoliert und gereinigt.

Menschliches Wachstumshormon kann aus Bakterienextrakt gereinigt werden, indem man eine dar folgenden Methoden oder eine Kombination dieser anwendet:

1) Polyethylimin-Fraktionierung;

2) Gel-Filtrierungs-Chromatographie auf Sephacryl S-200;

3) Ionenaustausch-Chromatographie auf 3iorsx-70 Harz oder CM Sephadex;

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4) Ajnmoniumsulf at und/oder ph-Fraktionierung ; und

5) Affinitäts-Chromatographia, wobei Antikörper-Harze verwendet werden, die aus anti-HGH IgG hergestellt warden, welches aus immunosensitivierten Tieren oder Hybridgeweben (hybridomas) isoliert wurde; das Hormon wird unter sauren oder mild denaturierenden Bedingungen herausgelöst.

Claims

11.4.1983 61 113/12

Erfindungaanspruch

Verfahren zur Herstellung einer lebensfähigen Kultur eines mikro'biellen Organismus, der einen sich replizierenden klonierenden Vektor trägt und der fähig ist, menschliches Wachstumshormon zu exprimieren, wobei ein für menschliches Wachstumshormon codierendes Gen in einen klonierenden "Vektor inseriert und unter die Kontrolle eines Expressionspromotors gestellt ist, gekennzeichnet dadurch, daß

- ein sstes Genfragment für ein Expressionsprodukt erhalten wird, wobei das besagte Fragment einen Teil der codierten Sequenz für das genannte menschliche Wachstumshormon enthält und das genannte erste Fragment für weniger als alle .Aminosäuren der .Aminosäuresequenz des genannten Wachstumshormons codiert,

- ein zweites Genfragment zur Verfügung gestellt wird, das für den Hest der .Aminosäuresequenz des menschlichen Wachstumshormons codiert, wobei das genannte zweite Genfragment für mindestens den -Amino-Enele-Bestanteil des menschlichen Wachstumshormons codiert,

- die genannten Genfragmente in einem sich replizierenden klonierenden ^ektor in richtiger Lesephase relativ zueinander und unter die Kontrolle eines Sxpre3sionspromotors angeordnet werden, wodurch ein sich replizierender klonierender Vektor gebildet wird, der zur Expression der -Aminosäuresequenz des genannten menschlichen Wachstumshormons ohne anhängendes Fremdprotein fähig ist,

£*4 H I 4 ·> £ ^2^ 11.4.1983

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- der Mikroorganismus mit" dem klonierenden Vektor transformiert wird, und

- der transformierte Mikroorganismus in einer Kultur mit Nährstoffen gezüchtet wird»

( '; 2· Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die

Fragmente so ausgewählt werden, daß sie als wesentlichen ./"- Bestandteil cDNA oder eine Replikation davon enthalten·

3· Verfahren nach mindestens einem der Punkte 1 oder 2, gekennzeichnet dadurch, daß als klonierender Vektor ein Plasmid selektiert wird und das Plasmid gegenüber mindestens einem Antibiotikum resistent gemacht wird,

4« Verfahren nach Punkt 3_} gekennzeichnet dadurch, daß ein Plasmid gebildet wird, dem der' tet-Proiaotor,,,fehlt., und das. dennoch gegenüber Tetracyclin resistant ist«

5. Verfahren nach mindestens einem der Punkte 1 oder 2, gekennzeichnet dadurch, daß das für das menschliche Wachstumshormon codierende Gen unter die Kontrolle eines lac-Promotors in Tandem-Struktur gestellt wird»

6, Verfahren nach Punkt 5$ gekennzeichnet dadurch, daß der sich replizierende klohierende Vektor das Plasmid pHGH ist«

7* Verfahren nach Punkt 5» gekennzeichnet dadurch, daß der sieh replizierende klonierende Vektor das Plasmid pflGH 107-1 ist.

11.4 ο 1983 61 113/12

Verfahren nach Punkt 1 zur Herstellang einer lebensfähigen Kultur eines mikrobiellen Organismus, der einen sich replizierenden klonierenden Vektor trägt, gekennzeichnet dadurch, daß dieser Punktionsgene für Ampicillin- und letracyclinresistenz enthält, sowie einen lac-Promotor in Tandem-Struktor, der zwischen den_genannten Genen liegt, und so orientiert ist, daß er die Expression in Sichtung des Gens für Tetracycllnresistenz in Gang setzt, und daß ferner eine Mehrzahl von Restriktionserkennungsstellen'enthalten sind, die stromabwärts vom genannten Protorsystem liegen_} wobei die. genannten Eestriktionäericejinüngsstellen jeweils kohäsive' und stumpfe Enden nach dem Schneiden liefern, wodurch richtiges Einfügen von heterologer DHA zwischen den genannten Brkennungsstellen ermöglicht wird, so daß diese unter die Kontrolle- des^: genannten Promotor-Sy3tems gelangen und daß der kl©nierende Vektor transformiert wird, um einen Mikroorganismus mit dem klonierenden Vektor au erhalten, und daß der transformierte Mikroorganismus in einer lährmeäiam enthaltenden Kultur gezüchtet wird»

9» Verfahren nach Punkt 8, gekennzeichnet dadurch, daß der sich replizierende klonierende Vektor das Plasmid pGH.6 ist·