JPH0612996B2 - 部分的合成遺伝子の微生物学的発現法 - Google Patents

部分的合成遺伝子の微生物学的発現法

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、目的とする蛋白質生成物の観点からは不完全
なメッセンジャーＲＮＡ（以下ｍＲＮＡと略す）配列か
らの酵素による逆転写と有機合成を組み合わせることに
より、部分的合成遺伝子を作製する方法及びこれを微生
物により発現させる方法に関する。
発現された好ましい生成物には、微生物を開裂させて生
物活性物質を生産する際に問題となる、真核性の発現生
成物に共通して存在する、生物活性を不活性化するリー
ダー配列が含まれていない。本明細書では、好ましい列
として、ヒトの生長ホルモン（例えば下垂体機能減退矮
小発育症の治療に有用である）をコードする（暗号化す
る）遺伝子の作製およびその発現について例示する。
遺伝子を構成しているＤＮＡ（デオキシリボ核酸）は、
蛋白質を暗号づけている遺伝子、即ち構造遺伝子と、Ｒ
ＮＡポリメラーゼの結合部位、リボゾーム結合のための
情報部位などを提供することによって構造遺伝子の情報
の発現化の仲立ちをつとめる調節領域の両者を含んでい
る。暗号化づけされた蛋白質は、その対応するＤＮＡか
ら、微生物内で、複数の過程を経て発現される。即ち、 1.調節領域（以下プロモーターという）内で酵素ＲＮＡ
ポリメラーゼが活性化され、これは構造遺伝子に沿って
移動し、その暗号づけされた情報をメッセンジャーリボ
核酸（ｍＲＮＡ）に転写する。この転写は１個またはそ
れ以上の終止コードンの位置で終了する。
2.ｍＲＮＡの「伝言」は、リボゾームにおいて、そのｍ
ＲＮＡが暗号づけているアミノ酸配列を持った蛋白質に
翻訳される。翻訳は開始信号、大抵はＡＴＧ（これはｆ
−メチオニンと翻訳される）から始まる。
ＤＮＡは遺伝暗号に従い、トリプレット、即ち、アデノ
シン、チミジン、シチジンおよびグアニン（以下各々
Ａ，Ｔ，ＣおよびＧと表わす）から個々別々に選ばれる
隣接する３個のヌクレオチドの「コドン」によって個々
のアミノ酸を指定する。これらはコードストランド（暗
号鎖）、即ち２本鎖（duplex）ＤＮＡの暗号配列中にあ
る。２本鎖の残りの鎖、即ち「相補ストランド」は、コ
ードストランド中の相補体と水素結合するヌクレオチド
（塩基）で形成されている。ＡとＴ、およびＣとＧが相
補関係にある。本発明の背景となる上記の事実およびそ
の他の関連事項はGene Expressionに詳しく述べられて
いる（Benjamin Lewin，Gene Expression１，２（１９
７４年）および３（１９７７年），John Wiley and Son
s，N.Y.）。
本明細書で言及するこの文献およびその他の文献につい
ては、参考までにその都度言及することとする。
ＤＮＡの組み換えには、別々のＤＮＡ断片の結合を促進
するために、その隣接末端を色々の態様に修復する種々
の方法を利用することができる。ここでいう「結合」と
は、隣接するヌクレオチド間にホスホジエステル結合が
形成することであり、これは大抵の場合、酵素Ｔ４ＤＮ
Ａリガーゼにより達成される。例えば平滑末端（鈍感末
端）も直接結合することができる。あるいはまた、隣接
末端に相補性の１本鎖を含んでいる断片は、水素結合に
よって、「結合」のためのそれぞれの位置に配置される
ので好都合である。このような接着末端と呼ばれる１本
鎖は、ターミナルトランスフエラーゼを用いて鈍感末端
にヌクレオチドを付加することにより生成させることが
できる。またこれは、鈍感末端の１本の鎖をλ−エキソ
ヌクレアーゼの如き酵素で切り取ることにより生成させ
ることもできる。しかしこれは、制限エンドヌクレアー
ゼ（以下制限酵素という）によるのが最も普通である。
この制限酵素は、塩基対が４ないし６個の長さのヌクレ
オチドの特異な配列（制限部位という）内またはその隣
接部位のホスホジエステル結合を切断するものであり、
多くの制限酵素およびその認識部位が知られている（例
えばR.J.Roberts，CRC Critical Reviews in Biochemis
try，１２３，（１９７６年１１月）参照）。多くのも
のは互い違いに切断し、２本鎖断片の端に短い相補性の
１本鎖配列ができる。相補性配列であるので、はみでた
末端、即ち接着末端は塩基対によって再結合することが
できる。２個の異なった分子をこの酵素で切断すると、
相補性１本鎖が交叉した対をつくり、新しいＤＮＡ分子
ができる。この新しいＤＮＡ分子は、アニーリングした
位置にある１本鎖の切断点を結合するリガーゼを用い
て、共有結合した完全なＤＮＡ分子とすることができ
る。開裂した２本鎖ＤＮＡに「コターミナル」、即ち鈍
感末端を残す様な制限酵素の場合は、この鈍感末端を他
の鈍感末端配列のものと、例えばＴ４リガーゼにより再
結合して組換えすることができる。
本発明の目的に使用される「クローニング媒体」は完全
な「レプリコン」を含有する非染色体性の１つの２本鎖
ＤＮＡであり、この媒体は形質転換により単細胞生物
（微生物）に入れられた時、複製され得るものである。
この様に形質転換された微生物は形質転換体と呼ばれて
いる。現在クローニング媒体として一般に使用されてい
るのはビールスまたは細菌から得られるものであり、最
も普通にはプラスミッドと呼ばれる環状の細菌ＤＮＡで
ある。
最近の生化学の進歩により、例えばプラスミッドが外来
性のＤＮＡを含む様な、「組換型」クローニング媒体が
作製される様になった。特殊な例では、この組み換え体
はヘテロローガスＤＮＡを含有することができる。ここ
でいうヘテロロー音ガスＤＮＡとは、この組換型媒体に
より形質転換することのできる微生物によって通常は産
生されないポリペプチドをコードするＤＮＡを意味す
る。例えば、プラスミッドを制限酵素で切断して結合可
能な末端を有する直鎖状ＤＮＡを得る。これを結合可能
な末端を持った外来性遺伝子と結合させると、生物学的
機能部分に完全なレプリコンと形質転換体を選択するの
に有用な表現型の性質が付与されることになる。この組
み換え体を微生物に挿入して形質転換し、この形質転換
体を単離してクローン化する。この目的は外来性遺伝子
のコピーを含有している多数の転換体を得ることであ
り、また特殊な場合には、さらにその遺伝子がコードし
ている蛋白質を発現することにある。これに関連する技
術およびその応用についてはRecombinant Moleculesに
詳しく記載されている（Miles International Symposiu
m Series 10：Recombinant Mol−ecules：Impact on Sc
ience and Society, Beers and Bosseff,eds., Raven P
ress, N.Y.１９７７年）。
複製により遺伝子の数を増やすためにクローニング媒体
を使用することとは別に、遺伝子がコードしている蛋白
質を実際に発現しようという試みがなされ、そのいくつ
かは成功している。その最初の例として、脳ホルモン、
ソマトスタチンがlacプロモーターのコントロールの下
に大腸菌中で発現された（K.Itakura et al. Science 1
98 1056. 1977年）。極く最近、ヒトインシュリンのＡ
鎖およびＢ鎖が同じ方法で発現され、結合されてこのホ
ルモンを生成した（D.V.Goeddel et al.Proc.Nat′l. A
cad. Sci., USA 76 106、1979年）。この両者では、遺
伝子はその全てを合成により作製したものであった。い
づれの場合も、細胞内で蛋白質分解酵素が目的とする生
成物を分解するのは明らかであるので、その生成物を複
合体の形で、即ち、「隔離」（compartmental−izatio
n）により目的物を保護し、そして細胞外で切り離され
ることができて所望の生成物を与え得る別の蛋白質と結
合した複合体の形で生成させる必要があった。この研究
は本出願人の出願に係る英国特許ＧＢ２００７６７５Ａ
号、ＧＢ２００７６７０Ａ号、ＧＢ２００７６７６Ａ号
およびＧＢ２００８１２３Ａ号明細書に記載されてい
る。
以上述べたいくつかの例で合成遺伝子による方法が有用
であることがわかったが、生成物がもっと大きい蛋白質
である場合、例えば生長ホルモン、インターフエロンな
どである場合には、それらの遺伝子はこれに応じてさら
に複雑であり、手軽に合成することができないという現
実的な問題がある。同時に、複合蛋白質を伴なっていな
い生成物を発現することが望ましいであろうが、この様
な発現の必要性から、使用する微生物を、目的とする生
成物を製造するのにもってと好適な微生物に変更しなけ
ればならない。
ある研究者たちは、有機合成からではなく、組織から精
製した相当するｍＲＮＡからの逆転写により得られた遺
伝子を発現しようと試みた。この試みには２つの問題が
あった。まず第１は、逆転写酵素は所望の全アミノ酸配
列のためのｃＤＮＡ（相補ＤＮＡ）を完成しない前に、
ｍＲＮＡからの転写を停止することがある、ということ
である。従って、例えばVilla−Komaroffらはラットの
プロインシュリンのためのｃＤＮＡを得たが、それには
そのインシュリンプリカーサー（前駆体）の最初の３個
のアミノ酸のためのコードンが欠落していた（Proc.Na
t′l.Acad.Sci.， ＵＳＡ、75 ３７２７、１９７８
年）。次に、プリカーサーの形で発現されるポリペプチ
ドのためのｍＲＮＡを逆転写したところ、生物活性蛋白
質ではなくそのプリカーサーのためのｃＤＮＡが生成し
た。ところでこの生物活性蛋白質は、真核細胞内におい
てはリーダー配列が酵素的に切断除去された結果として
生成するものである。現在まで、この様な機能を発揮す
る細菌は知られていない。従って、ｍＲＮＡ転写体は、
生物活性蛋白質自体ではなくプリカーサーの形の、リー
ダー配列を含んだ発現生成物を製造してしまうのである
（Villa-Komaroff、前記（ラットプロインシュリン）、
P.H.Seeburg et al Nature 276、276、1978年（ラット
のプレ生長ホルモン））。最後に、ヒトのホルモン類
（またはそれらのプリカーサー）をｍＲＮＡ転写体から
細菌により発現しようという試みでは、明らかに細胞外
で開裂され得ない複合蛋白質が製造されただけであった
（例えば、Villa-Komaroff、前記（ペニシリナーゼ、プ
ロインシュリン）、Seeburg、前記（ベーターラクタマ
ーゼープレ生長ホルモン））。
ヒト生長ホルモン（ＨＧＨ）はヒトの脳下垂体で分泌さ
れる。１９１個のアミノ酸からなり、分子量が約２１，
５００であるこのＨＧＨはインシュリンの３倍以上大き
い。これまで、ＨＧＨは限られた供給源、即ちヒトの死
体の下垂体から面倒な抽出によって得られるだけであっ
た。この物質は絶えず不足しており、その適用は下垂体
機能減退矮小発育症の治療に制限されており、またそれ
ですら、信頼できる計算によると、ヒト由来のＨＧＨは
約５０％の患者に供給するのがやっとである。
従って、ＨＧＨおよびその他のポリペプチド生成物を多
量に製造し得る新規な方法を開発する必要があり、この
要求は、有機合成で製造するには大きすぎるか、従って
また、全合成遺伝子を用いて微生物に発現させることが
困難なポリペプチド類において特に火急を要するもので
ある。哺乳類のホルモンをｍＲＮＡ転写体から発現する
方法は、合成法に伴なう困難さを回避し得ることを約束
するものではあるが、現在のところ、所望のホルモンを
実際に切り離すことのできない、生物活性のない複合体
を微生物により製造することができるに過ぎない。
本発明は、面倒な全合成による作製に頼らず、暗号配列
の実質的な部分、好ましくは大部分を逆転写により得、
一方その暗号配列の残りを合成することにより、生物活
性を不活性化するリーダー配列またはその他の異質蛋白
質を伴なっていない所望のポリペプチドを発現すること
のできる完全な遺伝子を得、この部分的合成遺伝子を発
現する方法を提供するものである。あるいは、この合成
による残りの部分は、外来性蛋白質が細胞外で開裂され
て生物活性体が得られる様に設計された、蛋白質分解に
抵抗する複合体を生成させるものであってもよい。従っ
て、本発明は、従来、組織から多額の費用をかけて抽出
することにより、限られた量だけ生産されていた種々の
物質、およびこれまで工業的に生産することの出来なか
ったその他の物質を、微生物学的に生産する方法を可能
にするものである。本明細書では、その最も好ましい実
施形式として、細胞内での蛋白質分解を避け、かつ細胞
外での開裂の間生物活性体を異質蛋白質中に隔離してお
く必要性を避けながら、医学的に重要なポリペプチドホ
ルモン（ＨＧＨ）を細菌により発現する最初の例を提供
する。本発明によって利用できる様になったＨＧＨのた
めの微生物資源により、下垂体機能減退矮小発育症の治
療、並びにこれまで組織から得ていたホルモンではまか
ないきれなかったその他の症状、例えば汎発性胃内出
血、仮関節、火傷治療、傷治療、ジストロフィーおよび
骨結合用として、このホルモンを多量に提供することが
初めて可能となった。
本発明の以上述べた、およびその他の目的や特徴は以下
の記載および好ましい実施形式を例示した添付の図面か
ら、より明らかになるであろう。
第１図は、クローニングに使用するリンカー、開始信号
ＡＴＧおよびＨＧＨの最初の２４個のアミノ酸をコード
する遺伝子断片を作製するための合成機構を示す。コー
ドストランド、即ち上側の鎖（Ｕ）および相補性ストラ
ンド、即ち下側の鎖（Ｌ）の矢印は、描かれた断片の形
成に使用されるオリゴヌクレオチドを表わしている。
第２図は、ＵおよびＬオリゴヌクレオチドを結合させて
第１図の遺伝子断片を形成させる結合媒体および該遺伝
子断片のプラスミッドクローニング媒体への挿入を示し
ている。
第３図には、下垂体ｍＲＮＡ転写体のHaeIII制限酵素断
片のＤＮＡ配列（コードストランドのみ）が描かれてお
り、それらがコードしているヒト生長ホルモンのアミノ
酸も番号付けして記入してある。ここには非翻訳ｍＲＮ
Ａに相当するＤＮＡ（ストップ以下）および主要な制限
部位も示されている。
第４図には、合成に由来しないＨＧＨのアミノ酸をコー
ドする遺伝子断片のためのクローニング媒体の作製およ
びヒト下垂体から単離されたmRNAからの逆転写による相
補ＤＮＡの形の該遺伝子断片の作製が示されている。
第５図は、第２図および第４図のプラスミッドを用い
て、細菌内でＨＧＨを発現し得るプラスミッドを作製す
る方法を示す。
本発明の一般的手法は、一緒になって所望の生成物の発
現をコードする複数個の遺伝子断片を、１つのクローニ
ング媒体中に組み合わせることにある。これらの内少な
くとも１個は、Ullrichらの方法(A.Ullrich et al,Scie
nce 196 1313、１９７７年)などにより組織から単離さ
れたmRNAの逆転写によって得られるｃＤＮＡ断片であ
る。このｃＤＮＡは目的生成物のためのコドンの実質的
な部分、好ましくは少なくとも大部分を提供し、一方遺
伝子の残りの部分は合成により供給される。この合成に
より断片およびｍＲＮＡ転写による断片は別々にクロー
ンし、最後の組合わせ段階での使用のために量産する。
合成遺伝子と、MaxamおよびGilbert(Proc. Nat′l. Aca
d. Sci. ＵＳＡ ７４ ５６０、１９７７年)の方法で
決定された相補ＤＮＡの間に、目的産物のためのコドン
をどの様に分配するかは、種々の考え方によって影響を
受ける。逆転写によって得られる相補ＤＮＡは必ず、少
なくとも目的生成物のカルボキシル末端部のためのコー
ドンを含有しており、そのカルボキシル末端に隣接する
翻訳終止信号の下流に非翻訳ｍＲＮＡのためのその他の
コードンを合せて含有している。非翻訳ＲＮＡのための
ＤＮＡの存在は、ほとんど無関係である。この種の不当
に長い配列は、所望の生成物のためのＤＮＡを複製し、
発現するのに使用される細胞源を確保しつつ、制限酵素
による開裂等によって除去してもよい。特殊な場合に
は、このｃＤＮＡは所望の全てのアミノ酸配列と共に、
目的産物のアミノ末端の上流に異質のコドンを含んでい
る。例えば、全部ではないが、多くのポリペプチドホル
モンは、リーダー配列や例えば細胞膜移送に関連する蛋
白質の信号配列を含んだプリカーサーの形で発現され
る。真核細胞内で表現される場合には、これらの配列は
酵素により除去され、ホルモンはその遊離した形、即ち
生物活性な形でペリプラズム域に入る。しかし微生物細
胞がこの様な機能を営むことは期待し得ないので、mRNA
転写体からこの様な信号配列やリーダー配列を除去して
おくことが望ましい。この様な除去操作中に、翻訳開始
信号も失なわれ、またほとんどの場合、目的産物のため
のコドンの一部も失なわれる。本発明の部分的合成遺伝
子の合成による成分は、これらの後者のコドンを回復す
るものであり、さらに、このハイブリッド（雑種）遺伝
子を最終的に挿入しようとしている媒体が適切に配置さ
れた開始信号を欠いている場合には、新たに翻訳開始信
号を供給するものである。
前駆体生長ホルモンｃＤＮＡからのリーダー配列の除去
は、遺伝子の生長ホルモンを暗号づけている部分の内部
にある制限部位を利用することによって好適に行なうこ
とができる。しかし本発明はこの様な部位を利用できる
かどうかに無関係に実施することもできる。即ち、ｍＲ
ＮＡに由来しない遺伝子を広範囲に合成する必要性を避
けるための、所望のポリペプチドのアミノ末端に十分近
い場所の制限部位を利用できるかどうかに無関係に実施
することができる。所望のポリペプチドおよびリーダー
配列または他の生物活性を不活性化する配列をコードし
ているｃＤＮＡにおいて、後者のコドンと完全（成熟）
なポリペプチドのためのコドンとの境界は、その完全な
ポリペプチドのアミノ酸配列からわかる。単に選択した
そのペプチドをコードしている遺伝子内へ消化してい
き、望ましくないリーダー配列またはその他の配列を除
去すればよい。従って、例えば次の様なｃＤＮＡである
とすると、 〔ここで矢印は消化の終止を表わす〕 上側の配列ａおよびｂを除去する様にエキソヌクレアー
ゼ消化の反応条件を選ぶと、その後Ｓ１ヌクレアーゼ消
化により下側の配列ｃおよびｄが自動的に除去される。
あるいは、より正確には、デオキシヌクレオチドトリホ
スフェート（ｄ（A,T,C,G）ＴＰ）の存在下でＤＮＡポ
リメラーゼ消化を行なうこともできる。例えば、上の例
では、ｄＧＴＰの存在下でＤＮＡポリメラーゼを作用さ
せて配列Ｃを除去し（Ｇで停止する）、次いでS1ヌクレ
アーゼでａを消化する。ｄＴＴＰの存在下でＤＮＡポリ
メラーゼを作用させてｄを除去し（Ｔで停止する）、次
いでＳ１ヌクレアーゼでｂを切断する、等々（A.Kornbe
rg,DNA Synthesis,p87−88、T.H.Freeman and Co.,San
Fra−ncisco、１９７４年参照）。
より好ましくは、Razinらのミスマッチ（不適切な組み
合せ）修復合成法（A.Razin et al,Proc.Nat′l Acad.
Sci. USA 75,4268、１９７８年）を利用して、目的産物
をコードしているｃＤＮＡの部分内の好都合な位置に制
限部位を作製してもよい。この方法によって、ミスマッ
チ置換分を含んでいるプライマーを用いて存在している
ＤＮＡ配列中の１個またはそれ以上の塩基を置換するこ
とができる。少なくとも７種の回文的４−塩基対配列
が、既知の制限酵素によって特異的に認識される。それ
らは、ＡＧＣＴ(Alu I)、ＣＣＧＧ(Hpa II)、ＣＧＣＧ
(Tha I)、ＧＡＴＣ(San 3A)、ＧＣＧＣ(Hha)、ＧＧＣＣ
(Hae III)およびＴＣＧＡ(Taq I)である。確率的には非
常にしばしばあり得ることであるが、ｃＤＮＡ配列が、
上記の様な認識部位と１個の塩基だけが異なっている配
列を含んでいる場合は、修復合成によって、適切な置換
塩基を含んでる、従って所望の制限部位を含有している
複製ｃＤＮＡが得られる。開裂によって望ましくないリ
ーダー配列のＤＮＡが除去され、その後、完全なポリペ
プチドの発現に必要なコドンが合成により回復される
（下式参照）。
勿論、所望によりもっと長い制限部位を同様にして挿入
することができるし、また、希望する位置に、この制限
部位に共通している塩基が２個しか存在しない場合で
も、連続修復によって４−塩基制限部位を作製すること
ができることは容易に理解されるはずである。
この技術は、目的生成物のアミノ酸配列だけでなく、外
来性ではあるが特別に設計したある大きさの蛋白質を発
現するのが望ましい場合にも応用される。この様な応用
例として次の４種類のものを挙げることができる。まず
第１に、この部分的合成遺伝子は、付加蛋白と結合する
ことによって免疫原性が付与されるハプテンまたはその
他の免疫決定因子を発現してもよく、この様にしてワク
チンが製造され得る（英国特許第２００８１２３Ａ号明
細書参照）。また、生物学的安全性の見地から、目的と
する生成物を、細胞外で開裂して活性体に変換し得る様
に設計したその他の生物活性不活性化蛋白質との複合体
の形で発現してもよい。第３の応用は、細胞膜を通って
排泄された生成物の輸送信号ポリペプチドを開裂するこ
とが出来るならば、所望の生成物の前に輸送信号ポリペ
プチドをつけて、細胞膜を通して排泄させることにより
目的産物を製造することができる。最後に、細胞外で特
異的に開裂され得る様に設計された外来性蛋白質との複
合体は、そうしなければ微生物宿主にとって内因性の蛋
白質分解酵素で容易に分解されてしまう目的産物を隔離
するのに使用し得る。これらの内、少なくとも最後の３
つの応用例では、ｍＲＮＡ転写体の暗号配列を完全にす
る為に使用される合成によるこの「アダプター分子」
は、例えば酵素の作用によって特異的に開裂され得るア
ミノ酸配列のためのコドンをさらに持っていてもよい。
例えば、トリプシンまたはキモトリプシンはアルギニン
−アルギニン（arg−arg）またはリジン−リジン（lys
−lys）などで特異的に開裂する（英国特許第２００８
１２３Ａ号、前記） 以上記載したことから明なかな様に、本発明は非常に多
方面の応用性を持っており、それらはいづれも以下に述
べる共通した特質を持っている。
1.目的とするポリペプチドのアミノ酸配列の実質的な部
分をコードしているｍＲＮＡ転写体であるが、それ自体
を発現した場合、目的産物より大きいかあるいは小さ
い、異なったポリペプチドが産生されるであろうｍＲＮ
Ａ転写体を使用する。
2.目的産物に含まれているアミノ酸配列以外のアミノ酸
配列のための蛋白質暗号化コドンが存在する場合は、こ
れを除去する。
3.有機合成により、所望の配列の残りの部分をコードす
る断片を製造する。
4.ｍＲＮＡ転写体および合成断片を結合し、プロモータ
ーを含有しているクローニング媒体に入れ、これを複製
し、そして異質複合蛋白質を含まない目的産物、または
異質蛋白質と複合してはいるがそれから特異的に切断し
得る目的産物を発現する。
勿論、発現生成物はいづれの場合も、翻訳開始信号によ
って暗号化されているアミノ酸から始まる（ＡＴＧの場
合はｆ−メチオニン）。これは細胞内で除去されると期
待し得るし、またいづれにせよ、最終生成物の生物活性
には本質的な影響を与えないと期待し得る。
本発明は抗体、酵素などの有用な蛋白質の製造に一般に
利用し得るものであるが、特に哺乳動物のポリペプチド
ホルモン類およびその他の医療に使用し得る物質、例え
ばグルカゴン、胃腸抑制ポリペプチド、すい臓性ポリペ
プチド、アドレノコルチコトロピン、ベーターエンドル
フィン、インターフエロン、ウロキナーゼ、凝血因子、
ヒトアルブミンなどを発現するのに特に適している。以
下に本発明の好ましい実施形式を記載するが、これは、
ヒト生長ホルモンをコードする部分的合成遺伝子を作製
し、クローンし、そして微生物により発現するものであ
る。
ヒト生長ホルモンのためのクローニング媒体の作製およ
び発現 1.ｍＲＮＡ転写体のHae III断片のクローニング Ullrichらの方法により、ＨＧＨのためのポリアデニル
化ｍＲＮＡを、下垂体生長ホルモン産生腫瘍から作製し
た（A.Ullrich et al.Science 196,1313、1977年）。Wi
ckensらの方法に従い、このＲＮＡ５μgから２本鎖（ds
と略す）ｃＤＮＡ１．５μgを作製した(Wickens et al.
J.Biol.Chem. 253 2483、1978年)。ただし、２番目の鎖
の合成には、ＤＮＡポリメラーゼＩの代りにＲＮＡポリ
メラーゼ「Klenow frag−ment」を使用した(H.Klenow,Pro
c.Nat′l.Aci.USA.65 168,1970年)。ＨＧＨの制限パタ
ーンについては第３図に示す様に、Hae III制限部位が
３′非暗号領域内およびＨＧＨの２３および２４番目の
アミノ酸をコードする配列内に存在する。このds HGH c
DNAをHae IIIで処理するとHGHの２４から１９１番目の
アミノ酸をコードする５５１の塩基対（bpと略す）から
なるＤＮＡ断片が得られる。例えばｃＤＮＡ９０ngをHa
e IIIで処理し、８％ポリアクリルアミドゲルで電気泳
動し、５５０bpの領域を溶離すると、約１ｎｇのｃＤＮ
Ａが得られる。
Bolivarらの方法によって調製したpB322を、このｃＤＮ
Ａのためのクローニング媒体として選択した（F.Boliva
r et al.Gene 2 95−113、１９７７年）。pBR322の特徴
は十分に解明されており（J.G.Sutcliffe,Cold Spring
Harbor Symposium 43 70、１９７８年参照）、これは多
数のコピーを複製するプラスミッドである。また、この
プラスミッドはアンピシリンおよびテトラサイクル耐性
遺伝子（それぞれApR、TcRと表わす。第４図参照）を含
んでいるのでアンピシリンおよびテトラサイクリンの両
者に対して耐性を有し、また、制限酵素Pst I、EcoRIお
よびHind IIIの認識部位を含んでいる。
Hae IIIおよびPst Ｉの両者とも、それによる開裂生成
物は鈍感末端を有する。従ってChangらの「GCテイリング
法」(Chang.A.C.Y.et al.Nature 275 617、1978年)を用
いて、pBR322をPst Ｉで開裂した鈍感末端生成物とｍＲ
ＮＡ転写体をHae IIIで消化したものを結合することが
でき、ｃＤＮＡ断片をpBR322のpst Ｉ部位に挿入してｃ
ＤＮＡ上にHae III制限部位（ＧＧ↓ＣＣ）を復元する
一方、その挿入体のそれぞれの末端にPst Ｉ制限部位
（CTGCA↓Ｇ）を復元することができる。
前記した様に、ターミナルデオキシヌクレオチジルトラ
ンスフエラーゼ（ＴｄＴ）を用いて、３′末端に約２０
dCを付加した(Chang.A.Y.C.,前記)。同様にして、６０
ｎｇのPstＩで処理したpBR322の３′末端に約１０個の
ｄＧを付加した。このｄＣ付加Dds cDNAとｄＧ付加ベク
ター（媒体）ＤＮＡを、１０ｍＭトリス−Ｈｃｌ(pH
７．５)、１００mM NaCl、０．２５mM EDTAの１３０μ
ｌ中でアニーリングした。この混合物をE.Coli×1776の
形質転換に使用する前に、７０℃に加熱し、徐々に３７
℃まで冷却し（１２時間）、次いで２０℃に冷却した
（６時間）。×1776でクローンしたこのプラスミッドpH
GH３１につき、MaxamおよびGilbertの方法(Proc.NaT′
l.Acad.Sci.USA 74 560、1977年)を用いてＤＮＡ配列を
分析した結果、第３図に示す様にＨＧＨの２４から１９
１のアミノ酸のためのコドンが確認された。
E.Coli K−12株×1776はF-tonA53dapD8min A1 supE42
△40〔gal−uvrB〕λ−minB2 rfb−2 nalA25 oms−2 th
yA57* metC65 oms−1 △29〔bioH−asd〕 cycB2 cycA1
hadR2の遺伝子型を有する。×1776はアメリカ予防衛生
研究所（ＮＩＨ）により、ＥＫ２宿主ベクター系として
公認されている。
×1776はジアミノピメリン酸（ＤＡＰ）偏性要求性菌で
あり、ムコ多糖類コラン酸(colanic acid)を合成するこ
とができない。従って、細胞の代謝および生長を支える
に十分な栄養は存在しているが、ＤＡＰが欠乏している
環境ではＤＡＰ欠乏で死亡する。これはチミンまたはチ
ミジンを要求し、代謝活性を維持するに十分な栄養はあ
るがチミンおよびチミジンがない環境では、ＤＮＡの崩
壊を伴なってチミン欠乏で死滅する。×1776は胆汁に対
する感受性が極めて強く生存することができない。従っ
てラットの胃腸管を生きて通過することができない。ま
た、×1776は洗剤、抗生物質、薬物および化学薬品に対
して感受性が非常に強い。さらに×1776は紫外線による
損傷を暗回復または光回復することができず、従って野
生型のE.Coli（大腸菌）より太陽光に対する感受性が数
オーダー強い。×1776は多くの形質導入フアージに対し
て抵抗し、種々の突然変異がために、異なったタイプの
複合プラスミッド(conjugative plasmids)の遺伝には複
合が不十分である(con−jugation deficient)。×1776
は、ナリジクシックアシッド(nalidixic acid)、サイク
ロセリンおよびトリメトプリムに対して抵抗性がある。
従って、これらの薬物を培地に加えることにより、この
株をモニターし、形質転換中、汚染菌の形質転換を不可
能にすることができる。
×1776は、１００μg DAP／mlおよび４μgチミジン／ml
を追加したＬブロスまたはペナセイ(Penassay)ブロス
中、約５０分の世代時間で生長し、定常期には８〜１０
×１０8細胞／mlの密度に達する。１〜２分渦巻き状に
そして前後にゆっくり振盪して細胞を１００％生存可能
の状態に保って懸濁する。×1776についてのさらに詳し
いことはCurtisらの文献を参照のこと(R.Curtis et a
l.,Molecular Cloning of Recombinant DNA、99−177、
Scott and Werner eds.,Academic Press、N.Y.1977
年)。×1776は１９７９年７月３日、アメリカン・タイ
プ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託され
た（ＡＴＣＣ番目３１５３７、無制限寄託）。
2.合成遺伝子断片の作製およびクローニング（第１図お
よび第２図参照） ＨＧＨ部分的合成遺伝子の作製計画は、mRNA転写体と結
合するであろう位置に隣接して鈍感末端制限開裂部位を
有する合成遺伝子を作成することであった。従って、第
１図に示す様に、このＨＧＨの最初の２４個のアミノ酸
のための合成遺伝子は、２３番目のアミノ酸に続いてHa
e III開裂部位を含んでいる。この合成断片の遠位末端
にはリンカーが設けられている。このリンカーにより、
合成断片は、ｍＲＮＡ転写体および合成断片が最終的に
結合するプラスミッドの、制限開裂によって生じる１本
鎖末端とアニーリングすることができる。
第１図に示す様に、２本鎖断片の５′末端には、Eco RI
およびHindIII制限エンドヌクレアーゼのための一本鎖
接着末端が含まれており、これによりプラスミッドの作
製が容易に促進される。左末端のメチオニンコドンは翻
訳開始部位を提供している。１１量体から１６量体の種
々の大きさの１２本の異なったオリゴヌクレオチドをCr
eaの改良ホスホトリエステル法により合成した(Crea,R.
Proc.,Nat′l.Acad.Sci.USA 75 5765、1978年)。U1から
U6、およびL1からL6のこれらのオリゴヌクレオチドは矢
印で示してある。
１０μgのＵ２からＵ６およびＬ２からＬ６を、公知の
方法に従い、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼおよび（γ
32−Ｐ）ＡＴＰを用いて加燐酸化(phosphorylate)した
(Goeddel,D.V.ら、Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA 76 106、
1979年)。Ｔ４リガーゼを触媒として用いた３つの別々
の反応を行なった：即ち、１０μgの５′−ＯＨ断片U1
を加燐酸化したＵ２，Ｌ５およびＬ６と結合し；加燐酸
化したU3，U4，L3およびＬ４を結合し；そして１０μg
の５′−ＯＨ断片L1を加燐酸化したL2，U5およびU6と結
合した。これらの結合反応は３００μlの２０ｍＭトリ
ス−塩酸（pH7.5）、１ mM MgCl2、１０ｍＭジチオトレ
イット、０．５mMＡＴＰ中、Ｔ４リガーゼ１００単位を
用い、４℃で６時間行なった。次いで、これらの３種の
結合混合物を合わせ、Ｔ４リガーゼ１００単位を加え、
２０℃で１２時間反応させた。この混合物をエタノール
で沈殿させ、１０％ポリアクリルアミドゲル上で電気泳
動した。８４塩基対移動帯をゲルから切取り、溶離し
た。ｐＢＲ３２２（１μg）をEco RIおよびHibd IIIで
処理し、大きい断片をゲル電気泳動法で単離し、合成Ｄ
ＮＡと結合した。この混合体を用いてE.Coli.Ｋ−12株2
94(end A.thi- hsr-、hsmk +)を形質転換した。294株は
１９７８年１０月３０日、ＡＴＣＣに寄託された（ＡＴ
ＣＣ番目３１４４６、無制限寄託）。１個の形質転換体
のプラスミッドｐＨＧＨ３からのEco RI−Hind III挿入
体の配列をMaxamおよびGilbertの方法（前記）により分
析した結果、第１図に示した通りであることを確認し
た。
3.細菌によるＨＧＨの発現のためのプラスミッドの作製
（第５図） ｐＨＧＨ３中の合成断片およびｐＨＧＨ３１中のｍＲＮ
Ａ転写体を用い、発現用プラスミッドＰＧＨ６を使用し
て、第５図に示す様に、両方の断片を含有する複製可能
なプラスミッドを作製した。まず、縦列lacプロモータ
ーを含有するこの発現用プラスミッドを次の様にして作
製した。Backmanらの方法に従い、９５塩基対の非相同
(heterologous)ＤＮＡ断片で分離されている２個の９５
塩基対ＵＶ５lacプロモーター断片を含有する２８５塩
基対Eco RI断片をプラスミッドｐＫＢ２６８から単離し
た(K.Backman,et al.,Cell１３巻 ６５−７１、１９７
８年)。この２８５塩基対断片をｐＢＲ３２２のEco RI
部位に挿入し、テトラサイクリン耐性遺伝子を持った適
切な解読相内に向って配置しているプロモーター群を有
するクローンＰＧＨ１を単離した。このテトラサイクリ
ン耐性遺伝子から遠位のEco RI部位をEco RIによる部分
消化で破壊し、その結果得られる１本鎖Eco RI末端をＤ
ＮＡポリメラーゼＩで修復し、鈍感末端結合によりプラ
スミッドを再環化した。作成されたプラスミッドpGH6
は、完成したＨＧＨ用遺伝子を挿入することができるプ
ロモーター系について適切に配置された単一のEco RI部
位を含有している。
ＲＮＡ転写体と結合させるための合成断片を得るため
に、１０μgのｐＨＧＨ３をEco RIおよびHae III制限エ
ンドヌクレアーゼで開裂させ、ＨＧＨアミノ酸１〜２３
の暗号配列を含有している７７塩基対断片を８％ポリア
クリルアミドゲルで分離した。
次いで５μｇのプラスミッドｐＨＧＨ３１をHae IIIで
切断した。５５１塩基対ＨＧＨ配列および一緒に移動し
たｐＢＲ３２２の５４０塩基対をゲル電気泳動法により
精製した。次いでXma Ｉで処理してＨＧＨ配列のみを切
断し、３′非コード領域から３９塩基対を除去した。得
られた５１２塩基対断片を、５４０塩基対のｐＢＲ３２
２Hae III切片から、６％ポリアクリルアミドゲルを用
いた電気泳動により分離した。０．３μｇの７７塩基対
Eco RI−Hae III断片を１６μｌの反応液中、T4リガー
ゼを用いて４℃で１４時間ポリメリ化した。リガーゼを
不活性化するために、この混合物を７０℃で５分間加熱
し、次いでEco RI（Eco RI部位によってダイマー化（二
量化）した断片を開裂するため）およびSma Ｉ(Xma Ｉ
ダイマーを開裂するため）で処理し、Eco RI接着末端お
よびSma Ｉ鈍感末端を有する５９１塩基対断片を得た。
６％のポリアクリルアミドゲルを用いて精製し、この断
片約３０ｎｇを得た。ところで、発現性プラスミッドｐ
ＧＨ６はXma Ｉ認識部位を含んでいないことに留意すべ
きである。しかしながら、Sma ＩはXma Ｉと同じ部位を
認識し、しかしその中間部を切断し、鈍感末端を生成す
るのである。従ってｐＨＧＨ３１から導かれたこの断片
のSma−切断末端は、鈍感末端でpGH6に結合していくこ
とができる。
縦列lac UV5プロモーターを含む発現用プラスミッドｐ
ＧＨ６を、順次Hind III、ヌクレアーゼＳ１およびEco
RIで処理し、ゲル電気泳動法により精製した。この様に
して得た１個のEco RI接着末端および１個の鈍感末端を
有するベクター５０ｎｇを、１０ｎｇの５９１塩基対Ｈ
ＧＨ ＤＮＡと結合させた。この結合混合物を用いてE.
Coli×1776を形質転換した。テトラサイクリン（12.5μ
g／ml）に抵抗して生長するコロリーを選択した。ハイ
ブリッド（雑種）ＨＧＨ遺伝子をｐＧＨ６に挿入するこ
とによってテトラサイクリン耐性遺伝子のためのプロモ
ーターが破壊されるが、縦列lacプロモーターによって
テトラサイクリン耐性のための構造遺伝子が通読され、
この選択特性が保持されることに注目すべきである。こ
の様にして約４００の形質転換体を得た。Grunstein−H
ognessの方法によるフィルターハイブリダイゼーシヨン
によってＨＧＨ配列を含む１２のコロニーを確認した(P
roc.Nat′l.Acad.Sci.USA，72 3961、1975年)。これら
のコロニーの内、３種のコロニーから分離したプラスミ
ッドが、Hae III、Pvu IIおよびPst Ｉで開裂した時、
期待する制限パターンを示した。１個のクローン、ｐＨ
ＧＨ１０７のＤＮＡ配列を測定した。
この形質転換体によって発現されたヒト生長ホルモン
は、フアデバスＨＧＨプライストキット（Phadebas HGH
PRIST Kit、Farmacia）を用い、溶菌上澄液を順次希釈
したものを直接放射免疫分析することにより簡単に検出
された。
ＨＧＨの発現がlacプロモーターのコントロール下（支
配下）で行なわれたことを示すために、ｐＨＧＨ１０７
をlacレプレッサーを過剰生産するE.Coli株Ｄ１２１０l
ac＋（iQo＋Zty＋）に入れた。インデューサー、ＩＰＴ
Ｇ（イソプロピルチオガラクトシド）を添加するまで、
有意な量のＨＧＨ発現生成物は検出されなかった。
ｐＨＧＨ１０７のEca RI部位を除去することにより、la
cプロモーターのリボゾーム結合部位コドンとＡＴＧ開
始信号との距離は、天然におけるそのリボゾーム結合部
位コドンとβ−ガラクトシダーゼのための開始信号との
間の距離と同じになるであろう。この天然の距離を模倣
することによって発現が増加するかどうかを調べる為
に、ｐＨＧＨ１０７をEco RIで開裂し、得られた１本鎖
末端をＳ１エンドヌクレアーゼで消化し、次いでＴ４リ
ガーゼを用いて鈍感末端結合して再環化することによ
り、ｐＨＧＨ１０７をｐＨＧＨ１０７−１に変換した。
この様にして得たプラスミッドは同様にＨＧＨを発現す
ることができるけれども、驚くべきことに、発現の程度
はｐＧＨ１０７より低いことが直接放射免疫分析によっ
てわかった。
本発明は上に述べた好ましい実施形式に限定されるので
はなく、特許請求の範囲の記載によってのみ限定される
ものであることは、当業者には容易に理解されるだろ
う。プロモーター系、親プラスミッド、目的とするポリ
ペプチド生成物またはその他の因子を種々選択し直すこ
とにより、これまで述べたものに種々の変更を加えるこ
とは勿論可能である。例えば、他のプロモーター系を本
発明において使用することができる。この様なプロモー
ター系としてはラムダープロモーター、アルビノースオ
ペロン（Phi 80 d ara）、またはコリシンＥ１、ガラク
トース、アルカリホスフアターゼあるいはトリプトフア
ンプロモーター系などを挙げることができる。細菌によ
る発現のために使用する宿主生物としては、例えばエン
テロバクテリアケア(Enterobacteriaceae)、例えば大腸
菌株、サルモネラ(Salmonella)；バシラーケア(Bacilla
ceae)、例えば枯草菌(bacillus subtilis)；肺炎球菌(P
neumococcus)；連鎖球菌(Streptococcus)；およびイル
フルエンザ菌(Haemophilus influenzae)などが挙げられ
る。勿論、どの微生物を選ぶかによって、アメリカ予防
衛生研究所の組み換えＤＮＡのためのガイドライン(43F
ed.Reg.60,080、1978年)に従って行なわなければならな
いクローニングおよび発現操作において、物理的封じ込
めの程度を調節しなければならない。
本発明は実験室規模で実施するのは好ましいけれども、
E.Coli×1776は、生物学的安全性の為に故意に虚弱性が
導入されているので、大規模に工業生産するには限界が
あることがわかった。生物学的封じ込めよりも、むしろ
適当な物理学的封じ込めを行えば、E.Coli.K−12株294
（前記）およびE.Colf.株ＲＲＩ、遺伝子型：Pro- Leu-
Thi- RB - recA＋Strr Lacy-の様な微生物を大規模操作
に使用することができる。E.Coli.RRIは、Hfrドナー
（高頻度組換型供与菌）としてのE.Coli.Ｋ１２株ＫＬ
１６とかけあわせることにより、E.Coli HB101(H.W.Boy
erら、J.Mol.Bio.４１ ４５９−４７２、１９６９年参
照)から得ることができる(J.H.Miller,Experiments in
Molecular Genetics；Cold Spring Harbor,New York，
１９７２年参照)。E.Coli.RRIは、１９７８年１０月３
０日、ＡＴＣＣに寄託された（無制限寄託、ＡＴＣＣ番
号３１３４３）。×1776株そ同様に１９７９年７月３
日、ＡＴＣＣに寄託された（ＡＴＣＣ番号３１５３
７）。その他、プラスミッドｐＨＧＨ１０７（ＡＴＣＣ
番号４００１１）、プラスミッドｐＧＨ６（ＡＴＣＣ番
号４００１２）、pHGH１０７で形質転換した×1776株
（ＡＴＣＣ番号３１５３８）およびｐＧＨ６で形質転換
したＥ．Coli Ｋ１２株２９４（ＡＴＣＣ番号３１５３
９）も１９７９年７月３日、ＡＴＣＣに寄託された。
本発明によって製造される微生物は、ヒト生長ホルモン
を工業的スケールで発酵により製造する方法に使用する
ことができ、多量の生成物を得ることができ、従来不可
能であった分野に使用することができる。例えば形質転
換E.Coli株は、常法により通気し、攪拌している鋼鉄製
またはその他の発酵容器中の水性培地、例えば、適当な
栄養物（例えば炭水化物またはグリセロール）、硫酸ア
ンモニウムの様な窒素源、燐酸カリウムの如きカリウム
源、微量元素、硫酸マグチシウムなどを含んだ、ほぼ中
性ｐＨの（例えばｐＨ７±０．３）、約３７℃の水性培
地中で増殖させることができる。形質転換微生物は、抗
生物質耐性の如き１またはそれ以上の選択特性を示すこ
とが好ましく、それによって選択圧がかかって野生型E.
Coliの競合増殖が抑制される。例えば、アンピシリンま
たはテトラサイクリン耐性微生物の場合、その抗生物質
を発酵培地に加え、それに対する耐性を持っていない野
生型生物を選別することができる。
発酵が完了したら細菌懸濁液を遠心分離するかあるいは
ブロスから細胞固形物を集め、次いで物理的または化学
的方法で細胞溶解する。上澄から細胞の残骸を除去し、
可溶性生長ホルモンを単離精製する。
ヒト生長ホルモンは、細胞抽出物から、以下のいづれか
の方法により、またはそれらを組み合わせることによっ
て精製することができる。(1)ポリエチレンイミン分別
法、(2)セフアクリル(Sephacr-yl)Ｓ−２００によるゲ
ル過クロマトグラフィー、(3)ビオレックス(Biorex)
−７０レジンまたはＣＭセフアデックスによるイオン交
換クロマトグラフィー、(4)硫酸アンモニウムおよび／
またはｐＨ分別法、および(5)ハイブリードマス(hybrid
omas)または免疫感作動物から単離した抗−ＨＧＨ IgG
から調製した抗体レジンを用いたアフィニィティークロ
マトグラフィー；このホルモンは酸性条件または僅かに
変性させた条件下で脱着させる。
【図面の簡単な説明】
第１図はＨＧＨの最初の２４個のアミノ酸をコードする
遺伝子を含有する合成遺伝子断片の模式図、第２図は合
成遺伝子のプラスミッドへの挿入を示す模式図、第３図
はＨＧＨをコードしているｍＲＮＡ転写体のＤＮＡ配列
を示す模式図、第４図はｍＲＮＡ転写体のプラスミッド
への挿入を示す模式図、第５図はＨＧＨを発現し得るプ
ラスミッドの作製を示す模式図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ３１５３９ (56)参考文献 特開 昭55−45395（ＪＰ，Ａ) 特開 昭54−163600（ＪＰ，Ａ) Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｖｏｌ．198（1977) 1056−1063 Ｎａｔｕｒｅ Ｖｏｌ．275（1978）617 −624

Claims (9)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】アミノ酸配列が知られている特定のポリペ
    プチドをコードしている遺伝子をクローニング媒体に挿
    入して発現プロモーターの支配下に置くことにより該ポ
    リペプチドを細菌中で発現する技術における複製可能な
    クローニング媒体の作製方法であって、 a)メッセンジャーＲＮＡからの逆転写により、該ポリペ
    プチドのための暗号配列の少なくとも実質的な部分を含
    んではいるが、該ポリペプチドとは異なった生成物を発
    現する第１遺伝子断片を得、 b)該第１遺伝子断片が、該ポリペプチドに含まれている
    アミノ酸配列以外のアミノ酸配列のための蛋白質暗号化
    コドンを含んでいる場合には、該ポリペプチドのための
    暗号配列の少なくとも実質的な部分を保持しながら該蛋
    白質暗号化コドンを除去し（この場合、得られた断片が
    尚該ポリペプチドとは異なる発現生成物をコードする様
    に該蛋白質暗号化コドンを除去する）、 （ただし、工程a）または、要すれば工程b)の生成物は
    該ポリペプチドの全てのアミノ酸配列より少ないアミノ
    酸配列を暗号化している断片であり）、 c)該ポリペプチドのアミノ酸配列の残部を暗号化する１
    個またはそれ以上の遺伝子断片を有機合成により得（少
    なくとも１個の遺伝子断片は、該ポリペプチドをコード
    するＤＮＡの先端に位置する開始コドンＡＴＧを含む該
    ポリペプチドのアミノ末端部を暗号化している）、そし
    て、 d)工程c)の合成遺伝子断片および、その時の事情次第で
    工程a)またはb)により作製した断片を、複製可能なクロ
    ーニング媒体の、発現プロモーターの支配下にあるお互
    いにとって適当な読み取り相に位置づけ、該ポリペプチ
    ド全長をコードするＤＮＡがその５′末端に開始コドン
    ＡＴＧを含む様にすることからなる、 該ポリペプチドのアミノ酸配列を発現し得る複製可能な
    クローニング媒体の作製方法。
  2. 【請求項２】工程d)のクローニング媒体が細菌プラスミ
    ッドである第１項に記載の方法。
  3. 【請求項３】該ポリペプチドのアミノ末端部を暗号化し
    ている合成断片は、さらに特異的に切断し得るアミノ酸
    配列の発現を暗号化しており、この断片は発現された蛋
    白質暗号化コドンの下流であって、しかも同じ読み取り
    相内に挿入されており、これによって複合プラスミッド
    発現生成物は特異的に切断されて該ポリペプチドを生成
    する、第２項に記載の方法。
  4. 【請求項４】該ポリペプチドのアミノ酸配列が異質蛋白
    質を伴なわずに発現され得る第２項に記載の方法。
  5. 【請求項５】工程a)の断片が、少なくとも該ポリペプチ
    ドの暗号配列の大部分を有している第４項に記載の方
    法。
  6. 【請求項６】合成断片およびメッセンジャーＲＮＡ転写
    体断片をクローニング媒体中に挿入する前に互いに結合
    させる（ここでこの合成断片および転写体断片の両末端
    は、この２個の断片が該ポリペプチドを発現するために
    適切な順序で結合する様に、種々の一本鎖末端または平
    滑末端としておく）、第２項に記載の方法。
  7. 【請求項７】該ポリペプチドがヒト生長ホルモンであ
    り、該第１断片がヒト生長ホルモンのアミノ酸配列以外
    のアミノ酸配列のための蛋白質暗号化コドンを含んでお
    り、b)の除去工程によって第１断片のＨaeIII制限酵素
    断片を生成する第５項に記載の方法。
  8. 【請求項８】工程b)が、ＨaeIII断片を異なった制限酵
    素で消化することにより、非翻訳メッセンジャーＲＮＡ
    のコドンを切断除去すると共に生成した断片の一端に一
    本鎖末端を与える操作を包含する第７項に記載の方法。
  9. 【請求項９】第２の制限酵素がＸmaＩである第８項に記
    載の方法。
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