DD218632A5

DD218632A5 - Verfahren zur herstellung von interleukin-2

Info

Publication number: DD218632A5
Application number: DD25780883A
Authority: DD
Inventors: Tadatsugu Taniguchi; Masami Muramatsu; Haruo Sugano; Hiroshi Matsui; Nobukazu Kashima; Junji Hamuro
Original assignee: Ajinomoto Gmbh
Priority date: 1982-12-15
Filing date: 1983-12-12
Publication date: 1985-02-13
Also published as: HU197938B; DK577283D0; DK173788B1; AU556353B2; AU2147283A; AT392082B; DK577283A; ATA435083A

Abstract

Ein Verfahren zur Herstellung von Interleukin-2 durch Zuechtung einer Interleukin-2 bildenden, transformierten eukaryontischen oder prokaryontischen Zellinie wird zur Verfuegung gestellt. Diese Zellinie wird erhalten, indem zunaechst ein fuer ein Polypeptid mit Interleukin-2-Aktivitaet kodiertes Gen isoliert und mit einer Vektor-DNA, die zur Replikation in prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen in der Lage ist, in einer Stellung abwaerts zu einem Promotor-Gen im Vektor verknuepft wird. Mit der so erhaltenen rekombinanten DNA werden die prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen transformiert und somit zur Bildung von Interleukin-2 befaehigt.

Description

V-

20 Titel der Erfindung :

Verfahren, zur Herstellung von Interleukin-2

25 Anwendungsgebiet der Erfindung :

30 Die Anwendung de.r vorliegenden Erfindung erfolgt' auf dem Gebiet der Arzneimittel zur Bekämpfung von immunologischen Störungen. ' . \ '

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen:35 . ·

- Interleukin-2 (nachstehend auch als "IL-2" abgekürzt ), das . früher als T-Zellwachstumsfaktor bezeichnet wurde, ist ein lösliches, Protein (im allgemeinen bekannt als."Lymphokin")y das von mit einem Lectin oder einem Antigen aktivierter. T-

Zellen gebildet wird; D.A. Mor.gan..et al., Science, Bd. 193 (1976) , S/ 1007-1008,. S. Gillis et. al., J. Immunol., Bd. (1978), S. 2027-2033. Interleukin 2 (IL-2) ist in <er Lage, die Lymphozytenreaktivität zu regulieren und die in vitro'-Langzeitkultür von antigenspezifischen Effektor-T-Lymphozyten zu fördern; S. Gillis et al., Nature, Bd. 268 (1977), S. 15^-156. Ferner weist. IL-2 auch ändere bedeutende biologiscne Wirkungen auf, wie eine Verstärkung der Thymozytenmitogenese (B. M. Chen et al., Cell. Immunol., Bd. 22 (1977)', S. .2-11-224, J.. Shaw et al., J. Immunol., Bd. 120 (1978), S.

1967-1973), Induktion der zytotoxischen T-Zellreaktivität ' (Wagner et al.,Nature, Bd. 284 (1980), S. 278-280) und anti-SRBC-plaquebildende Zellreaktionen (S. Gillis et al., . J.. Exp. Med.-Bd. U 9 (1979), S. 196O-I968 in Kulturen von nackten Mäusemilzzellen. Demzufolge eignet sich diese lymphozytenregulatorische Substanz zur Verstärkung der humoralen und zellulären Immunreaktionen und zur Behebung von immundefizitären Zuständen zu einem normalen humoralen und zellulären Immunzüstand. Diese bekannten immunologischen Aktivitäten .von IL-2 geben einen starken Hinweis darauf, dass IL-2 einen wertvollen Arzneistoff zur Immunotherapie gegen· immunologische; Störungen unter Einschluss von neoplastischen Erkrankungen, bakteriellen oder viralen Infektionen, Immunodefiziterkrankungen, Autoimmunerkrankungen und dergleichen

· ·.. r . ... '

darstellt; B.' Papermaster et al., Adv. Immunopharm., (1980),

S. -507. Wie bei interferonen wurde bei IL-2 nachgewiesen , dass es die natürliche Killerzellaktivität erhöht, was eine mögliche Verwendung bei der Behandlung von neoplastischen Erkrankungen' nahelegt. Ferner ermöglicht IL-2 die Aufrechterhaltung von Kulturen von funktionellen, monoklonalen T-Zellen und scheint damit eine Schlüsselrolle bei der Untersuchung der molekularen- Natur der T-Zelldifferenzierung und des'Mechanismus der differenzierten T-Zellfunktionen sowie, des Mechanismus der T-Zellantigenrezeptoren zu spielen. Es 35- eignet sich auch bei Langzeitzüchtung von monoklonalen T-Zellen zur Bildung von vielen anderen von T-Zellen abgeleiteten Lymphokinen, die sich auf einer Reihe von Gebieten als wertvoll erweisen. Ferner können die IL-2-Bildung. und

die Reaktion von Lymphozyten auf IL-2 wichtige Parameter immunologischer Funktionen darstellen, die bei der klinischen Diagnose von Immunitätsabweichungen wertvoll sind.

IL-2 wurde bisher durch Stimulierung von Mäuse-, Ratten-, oder Hurnanlymphozyten mit einem Mitogeh gebildet; S. Gillis et al., Nature, Bd. 268 (1977), S. 154-156., J. Farrar et al., J. Immunol., Bd. 121 (1978'), S. 1353-1360, S. Gillis. et al., J. Immunol., Bd. 120 (1978), S. 2027-2033- S. Gillis. et al.V J- Immunol., Bd. 12-M (1980),"S. 195^4-1962 stimulierten ,humane, periphere, mononukleare Blutlymphozyteri mit einem Mitogen. Ferner berichteten S. Gillis et' al., J. Immunol., Bd. 125 (1980), S. 2570-2578 über die Bildung von Mäuse-IL-2 aus Mäuse-T-Zellymphom-Zellinien und über die Bildung von Human-IL-2 aus humanen Leukämiezellinien (S. Gillis et al., J. Exp./ Med.., Bd. 152 (198O), S. 1709-1719-

Die vorerwähnten Arbeiten von Gillis et al. erörtern das Verfahren der Bildung von Human-IL-2 aus mitogenstimulierten Human-T-Ze.llen-Leukämiezellinien durch Zellkulturverfahren. Jedoch führt diese Technik zu unerwünscht niedrigen Konzentrationen an Human-IL-2 und erfordert selbst zur Bildung von geringen Mengen an IL-2 aus grossen Volumina an Kulturmedien komplizierte Reinigungsverfahren. Da ausserdem Human-

25, T-Zellen-Leukämiezellinien Spurenmengen an vielen anderen biologisch aktiven Substanzen, die analog zu Human-IL-2 sind, bilden, treten bei der Abtrennung von IL-2 von die-_l sen anderen immunologisch aktiven Molekülen oder bei 'der Abtrennung von IL-2 von gelegentlich vorhandenen toxischen Leetinen beträchtliche Schwierigkeiten auf.

Ein, anderer wünschenswerter Weg zur Herstellung von IL-2 . scheint in der Anwendung rekombinanter DNA-Techniken- (DNA ist eine Abkürzung für Desoxyribonucleinsäuren zu bestehen, wie sie bei der Bildung von änderen biologisch aktiven Humanproteinen eingesetzt werden, z.B. bei' Interf eronen . ( P. W.' > Gray et al., Nature, Bd. 295 (19δΤ), S. 503-508, S. Nagata et al., Nature,. Bc. 284 ( 1980 ) , ' S. 316-320, T.. Taniguchi

et al., Gene, Bd. 10 (1980), S. 11-15). Jedoch waren bisherige Versuche zur Bildung von IL-2 durch rekombinante DNA- - Techniken nicht erfolgreich. Beispielsweise wird in NIKKEI. BIOTECHNOLOGY (Japan), Nr. 19, 5, Juli 1982. berichtet, dass Versuche zum Aufbau von IL-2-bildenden Organismen durch rekombinante DNA-Techniken erfolglos waren, was vermutlich auf die Tatsache zurückzuführen ist, dass das für das IL-2-Polypeptid kodierende Gen noch nicht geklont worden war.

Ziel; der Erfindung:. - -, -

Ziel der Erfindung ist es, einen Weg zur Bildung von' IL-2 durch rekombinante DNA-Technik bereitzustellen.

Darlegung des Wesens der Erfindung:

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur .Bildung von Interleukin-2 unter Verwendung einer Zellinie . ;20 -bereitzustellen, die ein für Interleukin-2 kodiertes, geklöntes Gen iii einer durch rekombinante Technik gebildeten DNA, die dieses Gen- trägt., . enthält. . .

: Erfindüngsgemäß wird IL-2 durch aerobe Züchtung einer eukaryontischen oder prpkaryontischen Zellinie in einem Medium gebildet. Diese Zellinie ist mit einer erfindungsgemäß durch rekombinante Technik modifizierten DNA mit einem Gen, das für ein Polypeptid mit der Aktivität von IL-2 kodiert ist, und durch Insertion in eine Vektor-BNA, die in prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen zur Replikation der kodierenden,Sequenz dieses Gens, das sich in einer Stellung, nach einer Promotor.-' sequeiiz befindet, in der Lage-ist, transformiert.

Nachstehend werden spezielle Ausführungsformen der Erfindung und die erfindungsgemäss erzielten Vorteile anhand der Zeichnungen naher erläutert. Es zeigen: -..· .

'"' Fig. 1 eine Restriktionsendonuclease-Spaltungskarte eines, geklonten Gens, das zur Bildung eines Polypeptids mit der Aktivität von IL-2 (nachstehend kurz als "IL-2-.Polypeptid" bezeichnet)" kodiert ist; .

1 Fig. 2(a) die Basensequenz des geklonten Gens;

Fig. 2(b) die Aminosäuresequenz I und die Aminosäuresequenzen II und III der Polypeptide mit IL-2-Aktivität;

Fig. 3 ein Fliesschema, das den Aufbau einer rekombinanten

DNA (pCEIL-2) in die das kodierte Gen eingesetzt ist, , zeigt ;

¹⁰ Fig.iJ den Plasmidvektor pTrS-3; ...' ' '

Figuren 5(a), 5(b) und 5(c) Fliesschemata, die den Aufba.u

rekombi*nanter DNAs (pTIL2-22, pTIL2-21, pTIL2-TiJ und pTIL2-15) unter Verwendung von pTrS-3 als Vektor'er-15 ; läutern; . '

Fig. 6 ein Fliesschema, das den Aufbau einer rekombinanten DNA (pKIL2-21) unter Verwendung von pKT2i8 als Vektor erläutert; ,

5 Fig. 7 ein Fliesschema, das den Aufbau einer rekombinanten. DNA (pTuIL2-22) unter Verwendung von pTUBlP-5 als Vektor erläutert; und

Fig.^: 8 Vektor-DNAs, die zur Replikation in Zellen von . Saccharomyces cereviseäe in der Lage sind.

In den Figuren bedeuten A, G, C.-und T Desoxyadenylsäure, Desoxyguariylsäure, Desoxycytidylsäure bzw. Thymidylsäure.

Das für ein IL-2-Polypeptid kodierte, klonierte Gen kann durch Transkription einer. IL,-2 entsprechenden Messenger-RNA (mRNA,' "RNA" ist, eine Abkürzung für Ribonucl;einsäure) (nachstehend als "IL-2-inRNA" abgekürzt) ,die aus Säugetierzellen mit der Fähigkeit zur Bildung eines P.olypeptids mit -IL-2-

2Q Aktivität stammt, zu einer komplementären DNA (cDNA) gebildet werden. Die erhaltene einzelsträngige cDNA (SS-CDN⁷A) kann in eine doppelsträngige cDNA (ds-cDNA) übergeführt werden.

,Die als Matrize für die Herstellung von cDNA verwendete mRNA kann auf «herkömmliche Weise aus Säugetierzellen, die zur Bildung des IL-2-Polypeptids in der Lage sind, abgetrennt werden.. Die abgetrennte RNA wird der Pölyadenylierung unterworfen (Gillis et al-, Immunological Rev., Bd. 63 (1982),

S. 167-209- Die polyadenylierte RNA kann beispielsweise durch Zentrifugation an einem Saccharosedichtegradienten, als Sediment von 11 bis 12 S fraktioniert werden.- Gelegent-

, lieh zeigt mRNA mit .13S IL-2-mRNA-Aktivität. In diesen Fällen wird angenommen, dass mRNA in einer aggregierten Form von 11 bis 12 S mRNA vorliegt.

Als -zur Bildung von IL-2 fähige Säugetierzellen, die die erfindungsgemässe mRNA-Quelle darstellen, kpnnen T-Lympho-

- 7 -

zyten, wie periphere, mononukleare Blutzellen, Mandelzellen, . . Milzzellen oder dergleichen, die aus Säugetieren erhältlich sind, verwendet werden.¹ Die Zellen können auf herkömmliche Weise vorbehandelt werden, beispielsweise, mit Nylon-Säulen, Antiserum-Komplement, Dichtegradientenf raktiori'ierung, mehrfache Enzymbehandlung, z.B. mit einer Kombination aus .Neuraminidase und Galactose-oxidase, Röntgenbestrahlung oder Trypsin, um den Zellen die IL-2-Produktivität zu verleihen oder die- IL-2-Aktivität zu⁵' erhöhen. Auch geklonte T-Lympho- IQ zyten, die, aus den genannten Säugetierzellen nach Züchtung in Gegenwart von T-Zellwachstumsfaktor erhalten worden sind, .können als mRNA-ZeIlen verwendet werden. Diese werden als T-r(7j .Lymphozyten bevorzugt. Transformierte Lymphozyten-Zellinien,

wie von Leukämie- oder Lymphorn-Zellinien selbst oder von. · deren Derivaten, die durch die vorstehenden Vorbehandlungsoder Mutationsverfahren erhalten worden sind, oder geklonte transformierte·Zellinien stellen bevorzugte mRNA-Quellen dar. Offensichtlich enthalten^geklonte Zellen im allgemeinen grössere Mengen IL-2-mRNA,als dies bei ursprünglichen ZeIlliⁿi-^en der Fall ist. T-Zellhybridome, die durch Fusion der vorerwähnten Lymphozytenderivatzellen und TumorzelLinien, wie CEM, MoIt 4F und BW5147, erhalten worden sind, stellen ebenfalls erfindungsgemäss bevorzugte Säugetierzellinien dar. In diesem Fall umfassen die· von' Lymphozyten abgelei — /Tv 25 teten Zellinien (1) !constitutive Bildner von IL-2 und (2) ^: solche, die IL-2 nur in Gegenwart eines.in die Kultur eingeführten Mitogens bilden, entweder in Abwes'enhe,it oder in Gegenwart von anderen,die IL-2-Bild.ung mitstimulierenden . . Zellen. ' : . ~ ,

30

Um IL-2-mRNA. in konstitutiven IL-2-Bildnerzell'en zu erzeugen,

. werden die konstitutiven IL-2-Bildnerzellen unter allgemein auf dem Gebiet der Zellkultur üblichen Bedingungen gezüchtet. Für die Erzeugung der mRNA' in Zellen, die IL-2 nur in gg Gegenwart eines Mitogens bilden, werden die gezüchteten Zellen gründlich mit Kulturmedium gewaschen.und in einem Kulturmedium, wie Rosewell Park Memorial Institute 16^0 (anschliessend als "RPMl 16 4 Q" bezeichnet), Dulbecco Modi-

.' · ". -δι fied Eagle Medium (kurz "DMEM") oder in Click-Medium, die gegebenenfalls Serum enthalten können, resuspendiert. Diese Kulturmedien können mit, verschiedenen Zusätzen, wie Penicillin, Streptomycin oder anderen Antibiotika, oder mit frischem !-Glutamin, Hepes-Puffer und Natriumhydrogencarbonat in Konzentrationen, die auf dem Gebiet der Zellkulturtechnik üblich sind, ergänzt werden. Die bevorzugte Zelldichte beträgt 0,5 bis 4 χ IG Zellen/ml. Um die* Aktivierung von mR.NA und -'Bildung von IL-2 zu induzieren, werden geeignete Stimulanti en zugesetzt. Beispiele für" entsprechende Stimulantien sind Mitogene, Neuraminidase, Galactose-oxidase , Zinkderivate, wie Zinkchlorid, oder lymphozytenaktivierende Substanzen aus Mikroorganismen, wie Protein·. A und Streptolysin-O. Die stimulierten Zellen werden gewonnen und gewaschen. Die Mitan-Wesenheit 'von Macrophagen oder dendritischen Zellen während der Mitogenstimulation kann ebenfalls die mRNA aktivieren oder die Menge an; aktivierter mRNA erhöhen. In ähnlicher Weise kann.die Mitanwesenheit von' Zellinien, die von B-Lym- ^:phozyten oder von B-Lymphozytenlinien, - wie Raji, Daudi, K562 und BALL-1, abgeleitet sind, die mRNA aktivieren oder die Menge an aktivierter mRNA erhöhen.

Um die Säugetierzelien zu vermehren, werden sie unter normalen Bedingungen in einer in vitro-Zellkultur oder in Tieren,· die in Bezug auf ihre Gewebsverträglichkeit passend sind, gehalten. Bei Anwendung der in. vitro-Kultur zur Herstellung der mRNA-Quelle werden; die Zellen in beliebigen Züchtungsmedien, von.denen vorher feststellt wurde, dass sie das Wachstum von T-Zellen ermöglichen, gezüchtet. Diese Züchtungsm.edien können gegebenenfalls mit Säugetierserum, Serumbestandteilen oder Serumalbumin ergänzt,werden. Die Züchtungsdauer zur Aktivierung der mRNA entspricht der Dauer, die für die Aktivierung der Zellen zur Bildung von mRNA erforderlich ist. ,Dieser Zeitraum entspricht im allgemeinen der Dauer, die erforderlich ist, bis die Ausscheidung an IL-2 in das Züchtungsmedium beginnt. Ein bevorzugter Zeitraum beträgt 3 bis 12 Stunden nach Zugabe eines Stimulans, wie eines Mitogens. Eine unnötige Verlängerung der Züch-

tungsdauer kann gelegentlich zu einer Zersetzung der gebildeten IL-2 mRNA führen. Während des Verlaufs der Aktivie- ν rung von IL-2 bildenden Zellen, können Phorbolester, wie PMA oder TPA vorzugsweise in einer Konzentration von 10 '-bis 50 ng/ml, verwendet werden, um den Aktivierungsgrad zu fördern.

Das vorerwähnte Verfahren .zur Aktivierung von IL-2-mRNA kann bei Temperaturen im Bereich von 32 bis 38 C in einer angefeuchteten Atmosphäre und bei einem pH-Wert von etwa 7,0 bis 7,H durchgeführt werden. . .

Nachstehend werden, die Verfahren zur Gewinnung und Züchtung von Säugetierzellen, die zur\Bildung von IL-2 in der Lage sind, näher erläutert. '

^:

(1 ) Bereitstellung einer Zellinie mit konstitutiver IL-2-Bildung · ' · ' ,

Eine Jurkat-Zellinie einer humanen, leukämischen -T-Zelle (frei erhältlich beim Fred Hutchinson Cancer Institute, Seattle,.V. St. A., SaIk Institute, San Diego, V-. St. A., Deutsches Krebsforschungszentrum, Heidelberg) wird in Click-Medium in einer Zelldichte von 1 χ 10 Zellen/ml suspendiert und mit 8 χ 10 . R Röntgenstrahlen mit einer Bestrahlungsmenge von 150 R/min bestrahlt. Anschliessend werden

von den auf diese Weise bestrahlten Zellen 0,1 Zellen pro 200 pl Medium in Click-Medium mit einem Gehalt an 5 Prozent FCS (fötales Kälberserum) in' flachbodige Mikroplatten mit 96 Vertiefungen (Falccm 3072) überimpft und 3 Wochen bei 37 C /in einem Inkubator mit 5 Prozent C0_? gezüchtet (Klo- nierüng mit beschränkter Verdünnung). Die gezüchteten lebenden Zellen werden vor der Bildung von konfluenten Zellschichten in Züchtungsplatten (Nunc) mit 24 Vertiefungen übertragen und weitere 5 Tage gezüchtet. Diese Zellen werden sodann etwa 2 Tage bei einer ursprünglichen Zelldichte ^ö von etwa 1 bis 2 χ 10 /ml in einem synthetischen Züchtungsmedium,das frei von Serum und Serumalbumin ist, gezüchtet! Der -Kulturüberstand wird durch Zentrifugation geerntet und ' durch 0,22 Millipore-Filterpapier filtriert, um Zellbruch-'

. -ΙΟΙ stücke abzutrennen und den überstand zu sterilisieren. Anschliessend werden durch Röntgenbestrahlung erzeugte Mutanten, die zur konstitutiven Bildung von IL-2 in der Lage sind, ,. ausgewählt und geklont, wobei man die im überstand vorhari-5-dene IL-2-Aktivität misst.

(2) Bereitstellung von IL-2-Bildnerzellen aus humanen, peripheren, mononuklearen Blutzellen

Peripheres Humanblut wird gewonnen. Daraus werden periphere Blutlymphozyten (kurz "PBL") durch Dichtegradientenzentrifugation an einer Ficoll-Hypaque-Vorrichtung isoliert. Die PBL werden in 2 ml Click-M.edium mit einem Gehalt an 5 Prozent FCS mit einer Zelldichte von 1 χ 10 Zellen/ml in .ein Nunc-Züchtungsplatte mit 24 Vertiefungen zusammen mit TOO einer 5 ^ug/ml-Lösung von Phytohämaglutinin-M (Gibco) (pHA) überimpft und 48 Stunden unter den vorstehend angegebenen Bedingungen gezüchtet. Sodann werden die Zellen gewaschen

und wieder auf T ml Click-Medium in einer Zelldichte von 2.0

1 χ 10'. Zellen/ml zusammen mit 1 ml eines konditionierten Mediums, das aus,Humansplenozyten hergestellt worden ist, unter Stimulation mit 2,5/Ug/ml Concanavalin (kurz, "Con A") 48 Stunden überimpft. Das Kulturmedium mit einem Gehalt an 50 Prozent des konditionierten Mediums wird jeden dritten Tag ausgetauscht, um eine Langzeitkultur von humanen T-Lym-

phozyten aus PBL zu erhalten. Die auf diese -Weise hergestellten Langzeitkülturen von humanen T-Lymphozyten werden, wie vorstehend erläutert, durch das begrenzte.Verdünnungsverfahren in Gegenwart* von aus konditioniertem Medium abgeleiteten humanen Splenozyten geklont. Die Zellklone wer--

, den in entsprechender Weise vermehrt. Anschliessend werden geklonte humane T-Lymphozyten auf 1 ml RPMi 1640 in einer /Zelldichte von 1 χ 10 Zellen/ml in Nunc-Kulturpla.t'ten- mit 24 Vertiefungen in Gegenwart von TO _ug/ml PHA überimpft und

24 Stunden ^!bei 37 C in einem Inkubator in Gegenwart voi 7,5 Prozent C0_? gezüchtet. Die überstände der KuIturflüssigkeit werden geerntet, 2entrifugiert, durch ein 0.22 ^m Millipore-Filter filtriert und auf ihre IL-2-Aktivität ge-

testet, um die, humanen, normalen T-Lymphozytenklone mit IL-2-Bildung zu identifizieren.

(3) Bereitstel1ung von malignen Zellinien, die' sich von ;

Humanlymphozyten ableiten, die'in Gegenwart eines Mitogens

zur'Bildung von IL-2 in der Lage sind

Jurkat-Zellinien oder geklonte Zellinien, wie Jurkat 111, die durch das vorstehend beschriebene begrenzte Verdünnungsverfahren erhalten worden sind, sind, in der Lage, 10 bis MOOO Einheiten/ml IL-2 zu bilden,.wenn sie 24 Stunden, in einem vorerwähnten serumfreien, synthetischen Medium oder in RPMI 16MO mit einem Gehalt an 1 bis 2 Prozent Säugetier-

· serum in Gegenwart eines Mitogens, wie 10 pg/ταϊ Con A.'oder 2,5 ^g/ml PHA gezüchtet werden. Diese malignen, humanen ZeIl-

15' '

linien bilden auch in Gegenwart von Zinkchlorid, Protein A oder Picibanil IL-2.

(M) Bereitstellung von Zellen, die zur IL-2-Bildung in Mitan wesenheit eines Mitogens und anderen kostimulierenden

20

Zellen oder kostimulierenden löslichen Faktoren in der

- Lage sind

Die humane, maligne ZeTlinie MoIt FM und einige geklonte Zell-_s

linien, wie Jurkat J99, die nach dem begrenzten Verdünnungs-. _ηΐ. verfahren erhalten worden sind, bilden kein IL-2, selbst λ-"' . wenn sie 24 bis 72 Stunden in Gegenwart von Lectinen oder Mitogenen in beliebigen Konzentrationen gezüchtet werden.

Jedoch werden diese Zellen zur Bildung von IL-2 in erheb-... . liehen Mengen (10 bis lOOjjg/ml) bei einer Züchtungsdauer

von 2M Stunden bei 37°C fähig, wenn sie zusammen mit 5 bis

du ,

10 ug/ml Interleukin-1, einem der Monokine oder mit einer 50-prozentigen Anzahl an K562- oder Raji-Zellen gezüchtet , werden. _ , .

Die Extraktion von IL-2-mRNA aus auf die vorstehende Weise ,

ο Ο

. aktivierten Zellen wird unabhängig von den unterschiedlichen Zellquellen nach herkömmlichen Verfahren durchgeführt. Beispielsweise werden Zellen teilweise oder voll.ständie;

durch Zusatz eines Detergens, wie NP-¹IO, SDS, Triton-X und Desoxycholsäure, oder durch mechanische Homogenisierung oder Gefrieren/Auftauen aufgebrochen. Um einen Abbau von RNA durch Ribonuclease während der mRNA-Extraktion zu verhindern, werden vorzugsweise RNase-Inhibitoren, wie Heparin, Polyvinylsulfat, Bentonit, Macaroid, Diäthylpyrocarbonat oder Vanadyl-Komplex, zugesetzt. IL-2-mRNA kann aus präzipitiertem Polysorr bei der IL-2-Biosynthese erhalten werden, das mit anti-IL-2-Antikörper durch Extraktion mit einem Detergens präzipitiert wird.

Die poly-A-enthaltende mRNA.kann auf herkömmliche Weise fraktioniert oder konzentriert werden, beispielsweise durch Affinitätschromatographie oder durch absatzweise Absorption an oligo, dT-Cellulose, poly U-Sepharose von Sepharose 2B, Saccha'rose-Dichtegradientenzentrifugation oder Agarcsegelelektrophorese. · .

Die mRNA-Fraktionen werden sodann auf ihre IL-2-mRNA-Aktivitat getestet, indem man die. biologischen Aktivitäten von durch Translation aus den mRNA-Fraktionen erhaltenen Proteinen testet oder das durch Translation erhaltene Protein unter Verwendung von monoklonalem Antikörper gegen das IL-2-Peptid. identifiziert. Beispielsweise wird mRNA im allgemeinen durch Mikroinjektionen in Froscheier (Xenopus laevis)

(JiB.. Gurdon et al., Nature, Bd. 233 (1972), S. 177-182) . oder unter Verwendung des mRNA-abhängigen Retikulolysats oder von zellfreien Weizenkeimtranslationssystemen translatiert.

Die IL-2-Aktivität kann durch'das von Gillis et al., (J.

Immunol., Bd. 120 (1978), S. 2027-2033) grundlegend erörterte Mikrobestimmungsverfahren ermittelt werden. Bei diesen Tests wird die IL-2-abhängige zelluläre Proliferation von zyto- toxischen T-Lymphozytenzellinien (kurz ''CTLL"), die g.emäss : den' Verfahren von Gillis et al- erzeugt worden sind, festgestellt. Dabei werden ^ χ 1Ό³ CTLL-Zellen auf 100 ^l RPMI 16^0-Mediurn mit einem^ Gehalt an 2 Prozent FCS in flachbodige Mikroplatten mit 9.6 Vertiefungen zusammen mit 100 μΐ serie.n-

massig verdünnten Translationsprodukten überimpft. Nach 20-stündiger Inkubation bei 37°C in einem Inkubator mit 5 Pr ο . zent CO₂, werden die Zellen U Stunden mit 0,5^Ci ³H-TdR gepulst, und mit Hilfe eines automatischen Zellerntegeräts ä-n Glasfaserstreifen geerntet. Anschliessend wird die einge-^ baute Radioaktivität durch Flüssigszintillationszählung gemessen. Gemäss diesem .Testverfahren wi,rd festgestellt, dass die in-Gegenwart von IL-2 gezüchteten CTLL-Zellen H-TdR in einer dosisabhängigen Weise einbauen, was eine Berechnung der Menge an in den Testproben eingebautem IL-2 ermöglicht.

IL-2 ist in der Lage,,die Proliferation von T-Lymphözyten .>.,.;.? zu fördern, was die Messung der IL-2-Aktivität unter Verwendung eines Index der C-Zellwachstumsaktivitat ermöglicht. Dabei werden 5 CTLL-Zellen auf IOO^ul DMEM mit einem Gehalt an 2 Prozent FCS in flachbodige Mikroplatten mit 96 Vertiefungen zusammen mit 10O_xUl der serienmässig verdünnten Trans-

' . lationsprodukte übertragen. Nach 72- bis 96-stünd.iger Inkubation bei 37 C in einem Inkubator bei 5 Prozent CO₂ wird die

20 Anzahl der gezüchteten und aktivierten Zellen unter dem Mi- : kroskop gezählt. -Als positive externe Kontrolle werden . 1 O₁O

Einheiten/ml bzw. 10 Einheiten/ml an IL₇-2 zugesetzt. Die IL-2- *. Aktivität der Testprobe wird im Vergleich mit der Anzahl der

in diesen Kontrollgruppen gezüchteten lebensfähigen Zellen /vY 25 berechnet.

Die auf diese Weise erhaltene IL-2-mRNA aus der aktivsten Fraktion wird als Schablone zur Synthese von ds-cDNA ver- wendet. Die ds-cDNA wird mit einer Vektor-DNA verknüpft. Die Synthese von cDNA wird nach üblichen Verfahren durchge- ; ' führt.

Zunächst wird ss-cDNA, die zu mPNA komplementär. ist, in Gs genwart von dATP, dGTP, dCTP, dTTP unter Einsatz von reverser Transkriptase und unter Verwendung von mRNA.als Matrize (template) und oligo-dT als Initiator (primer) hergestellt. Die Matrizen-mRNA wird sodann durch alkalische Behandlung ,ent.fernt. Man erhält ds-cDNi¹ unter Verwendung von

reverser Transkriptase oder DNA-Polymerase und unter Einsatz der vorstehend synthetisierten ss-cDNA als Matrize.

Durch rekombinante Technik gebildete DNA wird aus der auf diese Weise erhaltenen ds-cDNA und einer Vektor-DNA mit. einem Replikon, das zur Replikation in eukaryontischen oder prokaryontischen Zellen in der Lage ist, erhalten. Die rekombinante DNA wird anschliessend in die Wirtszellen eingebaut .

Die ds-cDNA und eine zur Vermehrung in eukaryontischen oder prokaryontischen Zellen fähige Vektor-DNA werden vor der Ligation durch verschiedene '-Verf ahren, wie Behandlung mit Exonuclease, Zugabe von chemisch synthetisierten DNA-Stücken und G, · C-Schwänzung unter Bildung von mit .den En- : den der ds-cDNA und der Vektor-DNA verknüpfbaren Termini, modifiziert. Die Verknüpfung der verknüpfbaren DNA wird beispielsweise durch TV-Phagen-DNA-Ligase in Gegenwart von ATP durchgeführt.· : , '

· ' ' ' ' '.·' ' .

Mit der auf. diese Weise erhaltenen rekombinanten DNA werden lebende Zellen zur Verstärkung der klonierten cDNA oder zur Bildung von IL-2-Polypeptld transformiert.

Beispiele für eukaryontische Wirtsorganisman, die zur BiI-

. . dung von IL-2 verwendet werden können, sind Wirbeltiere, Hefen und dergleichen. Beispielsweise können Affenzellen, wie CV-1-Zellen, die durch eine ursprüngliche defektive Mutante von SV-40 transformiert sind und das SV-40-grosse - T-Antigen exprimieren (COS-Zellen gemäss Y. Gluzman (Cell, Bd. 23, (1981), S. 175-182), von Mäusen abgeleitete Zellen gemäss S.Ohno und T. Taniguchi (Nucleic Acids Research, Bd. 10 (1982), S. 967-977) und zur Expression von' IFN-Gen angewandte Hef ewirtsvektorsysteme gemäss R'. Hitzeman- et' al.

(Nature, Bd. 293 (1981), S. 717-722), verwendet werden. Geeignete prokaryontische Wirtsorganismen sind Escherichia coli, Bacillus'subtilis und dergleichen. Zur Amplifikation von DNA in Wirtsorganismen wird E. coli als Wirt bevor-

-.15 - .

zugt, jedoch können auch andere Wirte eingesetzt werden.

Geeignete Vektoren für E. coli sind Plasmidvektoren vom EK-Typ (stringenter Typ), wie p.SCIO'1, pRK353 ,' pRK'6i)6 , pRK248 , pDF41 und dergleichen, Plasmidvektoren vom EK-Typ ("relaxed"-Typ), wie ColE1 , pVH51, pÄCIO-5, RSF2124, pGR1 , pMB9, pBR3'13, pBR322, pBR32iJ, pBR325, pBR327., pBR328, pKY2289, pKY2700, pKN80, pKC7, pKB158, pMK200ü, pACYCT, PACYC184, dul und dergleichen, sowie Phagenvektoren von Agt-Typ: ^gt. Xc_} •Igt.

Xh, AWES, Xc, -A WES. X B, J_ZJvir. , J. B' , >1aL0, J. B₁ ^{WES. Ts622, Aüarn und dergleichen. Im allgemeinen, wird pBR322 häufig als Vektor für E. coli verwendet. In diesem Fall sind die besten klonierenden Stellen die Pstl- und EcoRI-Stellen.

' ' . ' ' .' ·

Die Transformation der Wirtszelle mit der rekombinanten DNA kann auf übliche Weise folgendermassen durchgeführt werden:

Handelt es sich beim Wirt um einen Prokaryonten, wie E. coli, werden entsprechende Zellen, die zur DNA-Aufnahme geeignet sind, aus Zellen hergestellt, die nach bekannten Verfahren' nach der exponentiellen Wachstumsphase" geerntet;, und anschliessend gemäss dem CaClp-Verfahren behandelt worden sind. Wenn MgCl„ oder RbCl im Reaktionsmedium der Transformation vorhanden ist, erhöht sich die' Trahsformationswirksamkeit.

Die Transformation kann auch nach Bildung eines Prötoplasten der Wirtszelle durchgeführt werden. '

Handelt es sich beim WJ.rt um einen Eukaryonten, kann ein Transfektionsverfahren von DNA, wie Calciumphosphat-Nieder-Schlagsbildung, herkömmliche mechanische Verfahren, z.B.' Mikroinjektion, Insertion eines in rote Blutzellwirte oder in Liposomen eingekapsel'ten Plasmids, Behandlung von Zellen mit Mitteln wie Lysophosphatidylcholin oder Verwendung von Virus vektoren oder . dergleichen, angewandt werden.

Zellen mit dem IL-2-Gen können nach der Transformation nach

einem der folgenden beiden Verfahren isoliert werden.

(1) Beim Plus-Minus-Verfahren wird partiell gereinigte IL-2-

mRNA durch Saccbarosedichtegradientenzentrifugati on von ' ITiRNAs, die aus mit einem Mitogen aktivierten Säuge.tierzellen als 11- oder 12s-Sediment extrahiert worden sind, erhalten, und anschliessend wird 32P-radicaktiv markierte ss-cDNA unter Verwendung von teilweise gereinigter mRNA als Matrize .synthetisiert. Nach Entfernung der Matrizen-mRNA durch alkalische Behandlung, wird die isolierte cDNA mit partiell gereinigter 11- oder 12s-mRNA, die aus nicht mit einem Mitogen aktivierten Säugetierzellen extrahiert worden

l'O ist, hybridisiert. Anschliessend werden nicht hybridisierte und hybridbildende cDNA an einer Hydroxylapatitsäule chromatographisch fraktioniert.. Die nicht-hybridisierte cDNA und die hybridisierte cDNA werden vorläufig als "Sonde" A bzw. "Sonde" B bezeichnet. Transformanten werden auf 2 Nl-.trocellulosefaltern praktisch in gleicher Weise gezüchtet. Die DNA der Zellen wird durch Alkalibehandlung auf dem Filterpapier fixiert. Sonde A und Sonde B werden mit der DNA an 2 verschiedenen Filterpapieren hybridisiert. Anschlie-

. ssend. wird eine autoradiographische Bestimmung durchge-.

führt, um die Transformanten auszuwählen, die mit der Sonde

A positiv reagieren (+ '), aber mit der Sonde B schwach oder • gar nicht reagieren (-) (Taniguchi et al., Proc. Jpn. Acad., Bd. 155B (1979), S.-464-469).

(2) Das zweite Verfahren besteht darin, beispielsweise 1000 bis 10 000 Transformantenklone in Gruppen von jeweils einige ; 10 bis einige 100 Klone aufzuteilen. Die aufgeteilten Klongruppen werden jeweils- auf-herkömmliche Weise zur Bildung von Plasmid-DNAs gezüchtet. Anschliessend werden diese Pias- · mid-DNAs.in ss-cDNAs umgewandelt, ,beispielsweise durch Wärmedenaturierung. Die erhaltenen ss-cDNAs werden auf Nitrocellulosefilterpapier fixiert, um die Hybridisierung von mRNA, die^komplemehtär zu. den fixierten DNAs ist und aus Säugetierzellen hergestellt worden ist, unter Einschluss von aktivierter IL-2-mRNA zu erreichen. Eine andere.Möglichkeit besteht darin, mRNAs mit einem Gehalt an IL-2-mRNA mit wärmedenaturierten Plasmid-DNAs zu hybridisieren und anschliessend das DNA-mRNA-Hybrid auf Nitrocellulosefilterpapiere zu fi-

xieren„ Diese Filterpapiere werden sodann mit einem Puffer : niedriger Salzkonzentration, wie 1 millirnolar Hepes oder mit 10 millimolar NaCl, gewaschen. Die am' Filterpapier ad-'sorbierte. mRNA wird durch Behandlung von beispielsweise t .5 Minute bei 95⁰C mit einer Lösung'mit einem Gehalt an 0,5 millimolar EDTA und 0,1 Prozent SDS extrahiert. 'Gereinigte ' mRNA wird säulenchromatographisch unter Verwendung von oligodT-Cellulose gewonnen. Anschliessend wird die Translation der mRNA in Protein durch Mikroinjektion in Eier von Xeno.pus 10' laevis durchgeführt, um die IL-2-Aktivität festzustellen, oder die mRNA wird in ein Protein· translatiert, wobei das inRNA-abhängige Retikulozytensystem oder das in vitro-zellfreie Weizenkeimtranslationssystem verwendet wird, um die IL-2-Aktivität unter Verwendung von anti-IL-2-Antikörper zu analysieren. Gemäss diesen Verfahren wird die Gruppe, in der die Anwesenheit von IL-2-Aktivität festgestellt wird, . wiederholt in weitere Gruppen mit einer geringeren Anzahl an Transformantenklonen unterteilt·, bis ein einziger Klon mit IL-2-DNA spezifiziert ist.

20

Um für IL-2-Polypeptid kodierende cDNA aus der· IL-2-bildenden Transformante zu erhalten, wird die rekombiriante DNA . ,in der Transformante abgetrennt und mit einer Restriktions-. endonuclease gespalten. Aus den durch die Spaltung gebil-' deten DNA-Fragmenten wird die Insert-cDNA-Fraktion.. abge-

C" . trennt.

Die vollständige Nucle.otidsequenz des Pstl-DNA-Inserts, das für das IL-2-Polypeptid kodiert, aus der rekombinanten DNA von pIL2-50A wurde nach dem Verfahren von Maxam.und Gilbert (Meth. Enzym., Bd. 65 (1980), S. 499-560) und nach dem Didesoxynucleotid-Kettenbeendigungsverfahren (A.J.M. Smith, Meth. Enzym., Bd. 65. (1980), S. 560-580) bestimmt.

Die Restriktionsendonuclease-Spaltüngskarte des cDNA-Inserts und die Basensequenz des Inserts sind in Fig. 1 und Fig. (a) angegeben, wobei die cDNA Spaltungsstellen mit Restrik-

. tionsendonuclease von BstNI, Xbal und BstNI in der ange-

geb.enen Reihenfolge aufweist.

Die DNA-Sequenz des Inserts enthält einen, einzigen grossen ". offenen Ableseraster. Die erste ATG-Sequenz, die üblicher- · weise bei Eukaryönten als Initiationssequenz dient (M. Kozak, Cell, Bd. 15 (1978),' S. 1109-1123) wird bei den Nucleotiden 48 bis 50 vom 5'-Ende an gefunden. Diesem ATG folgen 152 Codons, wonach sich bei den .Nucleotiden,507 bis 509 das '. - Terra.inationstriplett TGA"anschliesst.

Ein Bereich von Α-Resten entsprechend dem 3'-poly (A)-Terminus der mRNA wird am Ende der cDNA gefunden. Voraus geht das Hexanucle.otid AATAAA (Positionen 771 bis 776), das sich üblicherweise in den meisten eukaryontischen mR'NAsfin-

1.5 .det (N.J.- Pr oud foot und CG. Brownlee, Nature, .· Bd. 263

(.1976), S. 21 1-214). . .

Die Aminosäuresequenz, für die die cDNA kodiert, konnte, wie in Fig. 2 Cb) gezeigt, abgeleitet werden (Aminosäuresequenz I).Das Polypeptid der Aminosäuresequenz I besteht , aus 153 Aminosäuren, dessen Molekulargewicht sich zu 17 631,7 Dalton berechnet. Entsprechend einem gemeinsamen Merkmal der meisten bisher bekannten Sekretionsproteine· (G.Blobel et al., Symp. Soc. Exp. _ Med _v, Bd. 33 (1979), 'S. 9-36) ist der N-terminale Bereich, des abgeleiteten IL-2-Polypeptids ebenfalls recht hydrophob. Dieser Bereich dient vermutlich als Signalpeptid, das während dem Sekretionsprozess von reifem IL-2 ;abgespalten wird. Dies^e Spaltung erfolgt entweder zwischen Ser und AIa in den Stellungen 20 und 21 oder zwischen AIa -und Pro in den.Stellungen 21 und 22, wodurch das Polypeptid mit den Aminosäuresequenzen II und III entsteht. Ähnliche Spaltungsstellen finden sich häufig bei anderen Sekretionsproteinen (G. Blobel et al.., Symp. Soc. Exp. Med. , Bd. 33 (1979), S. 9-36). Das reife IL-2-Polypeptid enthält somit 133 oder 132 Aminosäuren, woraus sich ein berechnetes Molekulargewicht von 15 420,5 bzw. 15 349,4 Dalton ergibt. Dieser Wert wird mit dem bekannten Wert für Human-IL-2-Protein aus Jurkatzelien (15 000 Dalton.) (S. Gillis et al.., Immunologi-

cal Rev., Bd. 63 (1982), S. 67-209) verglichen. Ferner wurde bestätigt, dass das DNA-Fragment ab dem CCT-Codon in den Stellungen 111 bis 113 in der Basensequenz, das somit für . ein Polypeptid ab Pro in der Stellung 22 (Aminosäuresequenz'¹ III in Fig- 2 (b)) kodiert,- ein Folypeptid mit IL-2-Aktivität exprimiert,, wie in Beispiel 5 gezeigt ist. Es wurde auch bestätigt, dass das DNA-Fragment ab der GCA-Sequenz in den Stellungen 107 bis 110 in der Basensequenz, das somit für _ ein Polypeptid . ab AIa in der Stellung 21 .·( Aminosäuresequenz II in Fig. 2 (b)) kodiert, ein Polypeptid mit IL.-2-Aktivi- "' tat exprimiert, wie in Beispiel 8 gezeigt ist.

Bekanntlich tritt bei Eukaryontengenen häufig Polymorphismus auf, z.B. bei Humaninterf erongenen (Taniguchi et al., Gene,- ,

15.BO... 10 (1980), S. 11-15, Ohno und Taniguchi, Proc. Natl.

Acad. Sei. USA, Bd- 77 (19 80), S. 5305-5309, Gray et al., - ' Nature, Bd. 295 (1981), S. 501-508). In einigen Fällen ist der Polymorphismus von einem Ersatz bestimmter Aminosäuren der Proteinprodukte begleitet, währ'end in anderen Fällen die Struktur, des Proteinprodukts unverändert bleibt. Im Fall von Human-IL-2-cDNA, kann ein weiterer cDNA-Klon (pIL2-503), "bei dem der A-Eest in der Stellung 503 von "..'..-pIL2-50A-cDNA (Fig. 2) durch einen G-Rest ersetzt ist, nach-, gewiesen werden. Weitere cDNA-Klone mit einigen Basensubstitutionen im Vergl-eich zu pIL2-50A-cDNA lassen sich erwarten.

Aus den vorstehenden Ausführungen ergibt sich, dass die erfindungs- /gemäß. , geeigneten Gene folgendes einschliessen: DNA mit der

; · in Fig. 2 (a) gezeigten Basensequenz, DNAs ab der ATG-Se- quenz in den Stellungen 48 bis 50 mit den sequentiellen Easen im Anschluss an die ATG-Sequenz bis mindestens zur ATC-Sequenz in den Stellungen 504 bis 506, DNAs ab der GCA-

Sequenz in den Stellungen 108 bis 110 mit den sequentiellen Basen im Anschluss an die GCA-Sequenz bis mindestens zum ,ATC-Codon und DNAs ab der CCT-Sequenz in den Stellungen 111 bis 113 mit de"n sequentiellen Basen im Anschluss an die CCT-Sequenz bis mindestens zur ACT-Sequenz. Die erfindungsgemäß geeigneten Gene umfassen auch DNAs, die bei der ACT-Sequenz in

den Stellungen 5OiJ bis 506 enden und mit A in Stellung 1, der ATG-Sequenz in den Stellungen US bis 50, der GCA-Sequenz in den Stellungen ,.1 08 bis 110 oder der CCT-Sequenz in den /Stellungen 111 bis 113 beginnen- Die erfindungsgemäß angewendeten Gene umfassen ferner DNAs, -die bei der TGA-Sequenz in den Stellungen 507 bis 509 enden und mit A in der Stellung 1, der ATG-Sequenz in den Stellungen ^8 bis 50, der GCA-Sequenz in den Stellungen 108 bis 110 oder aer CCT-Sequenz in den Stellungen 111 bis 113 beginn-en. Ferner um-

]0. fassen die Gene der Erfindung DNAs^ die bei G in Stellung . 801 enden und mit A in Stellung 1, der ATG-Sequenz in den Stellungen ^8 bis 50, der GCA-Sequenz in den Stellungen 108 bis 110 oder der CCT-Sequenz in den Stellungen 111 bis 113 beginnen. Weiterhin umfassen d-ie erfindungsgemäß eingesetzten

15' Gene DNAs, die bei Poly (A) enden und mit dem ATG-Codon in den Stellungen M8 bis 50, der GCA-Sequenz in den Stellungen 108 bis 110 oder der CCT-Sequenz in den Stellungen 111 bis 113 beginnen. Ferner umfassen die Gene der -Erfindung Basensequenzen entsprechend den Aminosäuresequenzen I, II und III· Ferner können Polypeptide, denen eine oder mehrere Aminosäuren in>der Aminosäuresequenz I fehlt, oder Polypeptide, bei denen eine oder mehrere der Aminosäuren der Aminosäuresequenz I durch eine oder mehrere andere Aminosäuren ersetzt sind, IL-2-Aktivität besitzen. Daher sind auch Gene, die.für diese Polypeptide kodieren, geeignete Gene im Sinne der Erfindung. ,,In ähnlicher Weise.eignen sich erfindungsgemäss auch Gene mit einer additiven Verbindung von einer oder mehrereji Basensequenzen, die zur Expression von einer oder mehrerer Aminosäuren zusätzlich zu.den Aminosäuresequenzen I, II oder III in der Lage sind, sofern die.zusätzlich verknüpften Aminosäuren die Wirkung der Polypeptide hinsichtlich ihrer IL-2-Aktivität nicht stören. Modifizierte, zusätzlich verknüpfte Aminosäurebereiche,, die die Poiypeptidfunktion im Hinblick auf IL-2-stören, können _:.

erfindungsgemäss ebenfalls verwendet werden, sofern die zusätzlich verknüpften Bereiche leicht beseitigbar sind. Entsprechendes gilt für die additive Verknüpfung von DNA an , den 3'-Terminus von Genen entsprechend den Aminosäurese-

- 21 - ;

, _ 1 quenzen I, II und 'III,-die für zusätzliche Aminosäuren am - C-Terminus von I, II oder III mit den Aminosäuresequenzen I, II bzw. Ill kodieren. Daher kommt erfindungsgemäss die Verwendung von Genen, die für derartige Polypeptide kodiert sind, in Frage.

Rekombinante DNAs, die die ^Bildung von,IL-2 in lebenden Zellen dirigieren, können nach verschiedenen Methoden konstru- :'. ·.'· iert werden; Beispielsweise kann die kodierende Sequenz von IL-2-cDNA in ein Expressionsvehikel abwärts der Promotor- ,1 sequenz -eingesetzt werden. Eine andere Möglichkeit besteht darin, ein cDNA-Stück mit einer Promotorsequenz aufwärts L. .. zur IL-2-Kodierungssequenz nach oder vor der Insertion von Λ"' cDNA in das Exp'ressiorisvehikel einzusetzen. ,15 . , .

Verfahren zur Konstruktion von prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen, die IL-2-cDNA exprimieren und das IL-2-Polypeptid bilden, sind nachstehend näher erläutert.

(1) Expression von IL-2-cDNA in E. coli

Um IL-2-cDNA.in E. coli zu exprimieren, wird cDNA mit verschiedenen bakteriellen Promotoren verschmolzen. Es werden Hybridplasmide, die cDNA abwärts von den Promotoren ent-

,' halten, erhalten- Die Plasmide werden der Transfektion, z.B.

ν--*, 25 ' ' ^S

,: >^; ' in den Stamm E. coli.HB101 unterzogen und Bakterien, die ^-- ein Proteinprodukt mit humaner IL-2-Aktivität synthetisie- ^;,.-· ren, werden kloniert. Im wesentlichen sollten beliebige

Arten von bakteriellen- Promotoren die Expression von IL-2- : cDNA dirigieren, wenn sie in entsprechender Weise an der

QQ , -

; cDNA anliegen. Beispiele für diese cDNA-Expression sind hier . · beschrieben . '.

Die klonierte cDNA für IL-2 kodiert ein aus 153 Aminosäuren bestehendes Folypeptid, wie in Fig. 2 gezeigt. Der N-termi-

QC

: nale Bereich entsprechend etwa.20 Aminosäuren.dieses'PoIypeptids ist recht hydrophob, was eine charakteristische Eigenschaft der meisten Sekretionsproteine darstellt. Eine derartige hydrophobe Sequenz, die sogenannte Signalsequenz,

wird während des Sekretionsprozesses abgespalten. Daher soll das reife IL-2-Polypeptid weniger als 153 Aminosäuren enthalten.. Somit ist es erwünscht, den cDNA-Teil,·der das reife IL-2-Polypeptid kodiert, jedoch nicht den Bereich,.' der der IL-2-Signalsequenz entspricht, zu exprimieren.

j ... ' (i) Konstruktion eines Expressionsplasmidvehikels, pTrS-3, das E. coli-trp-Promotor, dessen Ribos'omenbind'ungsstelle (SD-Sequenz) für das Leitpeptid kürzlich beschrieben wurde

¹IO (G. Miozzari und C. Yanofsky, J. Bacteriol/, Bd. 133 (1978), S. 1457-1466) und ein ATG-Codon in einer Entfernung von 13 bp. abwärts zur SD-Sequenz umfasst (Nishi et al., SEIKAGAKU,. Bd. 54, Nr. 8 (1982), s. .6.76:. Das Plasmidvehikel enthält auch eine einzige Sphl-Stelle unmittelbar "abwärts von der ATG-Initiationssequenz (Fig. 4).

Zur Expression von IL-2-cDNA wird· das Plasmid zunächst mit Sphl gespalten und -entweder mit . E. Coli-DNA-Polymerase I > (Klenow-Fragment) oder mit Bakteriophagen-T4-DNA-Polymerase I behandelt, um die 3'-vorstehenden Enden (Fig. 5 (a)) zu entfernen. Das Plasmid pIL2-50A wird 2-fach mit Pstl.und HgiAI gespalten ,und. ein grösseres cDNA-Fragment wird isoliert. Die DNA wird sodann entweder mit E. Coli-DNA-Polymerase jl (Klenow-Fragment) oder mit Bakteriophagen-T4-DNA-Polymerase behandelt, so dass die 3'-vorstehenden Enden geglättet werden. Die auf diese Weise behandelte cDNA kodiert IL-2-Polypeptid mit 132 Aminosäuren, wie in Fig. 5 (a) gezeigt:. Diese cDNA wird.sodann, mit der auf die vorstehende Weise vorbehandelten pTrS-3-Plasmid-DNA so verknüpft, dass das ATG-Initiationscodon an der CCT (Pro)-Sequenz der IL-2-cDNA anliegt. Somit erhält man ein Plasmid pTIL2-22. Die Verbindung zwischen der trp-Promotor.sequenz und der IL-2-. cDNA-Sequenz von pTIL2-22 ist ebenfalls in Fig. 5 (a) dargestellt". . .

. - :

Das Plasmid pTIL2-22 sollte in E. coli die Synthese eines

IL-2-Polypeptids mit 132 Aminosäuren ausgehend von Prolin dirigieren. ' .

(ii) Da es auch möglich ist, dass das reife IL-2 Alanin . (Stellung 21) als N-terminale Aminosäure anstelle von Prolin enthält, wird· das folgende Plasmid, das die Synthese von IL-2-Polypeptid mit 133 Aminosäuren dirigiert, erörtert.

Das Plasmid pTrS-3 enthält eine einzige Clal-Stelle zwischen der SD-Sequenz und der ATG-Sequenz (Fig. 4). Dieses Plasmid wird durch CIaI und Sail gespalten. Das Plasmid pIL2-50A ... wird partiell mit pstl gespalten, mit E. coli-DNA-Polymerase I behandelt, und die grösste lineare DNA wird isoliert. Die DNA wird sodann mit einem synthetischen DNA-Linker mit einem Gehalt an einer 'Restriktions-Xhol-Spaltungsstelle ver-', knüpft, und ein Klon mit einem Gehalt am Plasmid, pIL2-50A . (Xho),in dem die Linker-DNA in der 3 ' -Stellung abwärts v.on' der IL-2-kodierenden Sequenz eingeführt ist, wird isoliert. Das Plasmid pIL2-50A (Xho) wird zunächst mit HgiAI gespalten, entweder mit E. Coli-Klenow-Fragment oder mit T¹I-DNA-Polymerase behandelt, mit Xhol gespalten, und das cDNA-Fragment wird isoliert. Dieses cDNA-Fragment wird sodann mit pTrS-3-DNA, die mit CIaI und Sail und mit einer synthetischen DNA vorbehandelt ist, verknüpft, wie in Fig. 5 (b) gezeigt ist- Somit lässt sich ein Plasmid pTIL2-21, das in E. coli die Synthese eines IL-2-Polypeptids mit 133 Aminosäuren, ausgehend von Alanin, dirigieren sollte, herstellen, wie in Fig. 5 (b) .erläutert ist. Eine ähnliche Konstruktion kann auch ohne Verwendung von Xhol-Linker durchgeführt werden.

(iii) IL-2-Polypeptide abweichender Grosse mit abweichender N-terminaler Aminosäure können unter Verwendung des pTrS-3-Expressionsplasmidvehikels nach folgenden Verfahren hergestellt werden. Die geklonte IL-2-cDNA in pIL2-50A enthält eine einzige Ddel-Stelle in den Nucleotidstellungen 81 bis 85. Das Plasmid.pIL2-50A (Xho) wird durch Ddel gespalten, und das DNA-Fragment mit einem Gehalt am grösseren Teil der cDNA wird isoliert. Das Fragment sollte auch DNA mit . etwa 3000 Basenpaaren von p3R322 enthalten (Fig. 5 (c))). Das DNA-Fragment wird mit Exonuclease' Bal31 behandelt und anschliessend mit Xhol gespalten. Die so behandelte DNA

wird sodann mit pTrS-3, das rait.Sphl gespalten, entweder mit Klenow-Fragment oder mit T^I-DNA-Polymerase behandelt und sodann mit Sail gespalten ist, verknüpft, wie in Fig. 5 (c) gezeigt ist. Die verknüpfte DNA wird sodann der Transfektion in E. coli HB101 unterworfen, und bakterielle Klone, die humanes IL-2 exprimieren, werden ausgesucht (Screening). Diese Klone sollten humanes IL-2 unterschiedlicher Grossen exprimieren, da die DNA entsprechend dem N-terminalen Bereich von humaner IL-2 auf unterschiedliche Weise entfernt ist., Somit lassen sich p.T-IL2-1-4 und pTIL2-15, die IL-2-DNA tragen,, erhalten. .

(iv) Die IL-2-cDNA kann auch\unter Verwendung von pKT2i8 (bereitgestellt von K.Talmage, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, Bd. 77 (1980), S. 3369-3373) exprimiert werden. PlasmidpKT2i8 wird mit pst'I gespalten und mit einem IL-2-cDNA-· Insert, das durch Spalten von· pIL2--50A-DNA mit HgiAI und .,pst'I erhalten worden ist, verknüpft (Fig. 6). Das erhaltene Plasmid pKIL2-21 weist die Sequenz zu Beginn der Proteinsyntheseinitiation auf, wie in ,Fig. 6 gezeigt. Somit, sollte.das Plasmid pKIL2-21 in E. coli die Synthese eines verschmolzenen Polypeptids mit 133 Aminosäuren von IL-2 und den Aminosäuren von-ß -Lactamase dirigieren (das erste Methionin ist in E. coli abgespalten).

(v) Ein Expressionspiasmid pTuBlP-5, ,bei dem die Promotorsequenz für tufB in pET322 eingesetzt ist, wird zunächst konstruiert;(Taniguchi^et al., SEIKAGAKU, Bd. 53 (19Ö1), S. 966. Das Plasmid enthält eine einzige Clal-Stelle, die sich 2 Basenpaare abwärts von der SD-Sequenz befindet, wie in Fig. 7 gezeigt. ',

Da pTrS-3 auch eine Clal-Stelle zwischen der.SD-Sequenz, und der ATG-Initiationssequenz enthält und da diese Clal-Stelle während der Konstruktion des Expressionsplasmics unter

Verwendung von pTrS-3 und IL-2-cDNA auf die vorstehend be-, schriebene ,Weise nicht zerstört wird, ist es sehr einfach, den .bakteriellen Trp-Promotor mit dem von tufB zu ersetzen,

- 25 - .

so dass humane IL-2-cDNA unter der Kontrolle,des tufB-Promotors exprimiert wird. Beispielsweise wird pTIL-2-2'2 mit CIaI und "PvuII gespalten, und das DNA-Fragment mit einem 'Gehaltan IL-2-cDNA wird isoliert. Dieses Fragment wird sodann mit pTUBlP-5-DNA, die vorher mit CIaI und PvuII gespalten ist, verknüpft. Somit wird ein Plasmid pTuIL2-22 konstruiert, wie in Fig. 7 gezeigt ist. Die IL-2-Aktivität konnte im Extrakt von E. coli HB1Ö1 mit einem Gehalt am' Plasmid pTuIL2-22 nachgewiesen werden.

.ίο ·

(vi) Eine ähnliche Konstruktion kann auch unter Verwendung von pTIL2-21 und von im wesentlichen sämtlichen Expressions-' 1 ..· plasmiden, die bei Verwendung von pTrS-3 konstruiert werden,

' durchgeführt werden. Es ist auch möglich, den Abstand zwisehen der SD- und ATG-Sequenz durch Spalten, ζ.P. pTuIL.2-22 mit CIaI, Entfernen (oder Zusetzen) einiger, Basenpaare von DNA durch BaI31 oder Sl oder DNA-Polymerase I (E. coli) und anschliessendes Wiederverknüpfen des Pläsmids zu optimieren.

(2) Expression der IL-2-cDNA in Hefe .

IL-2-cDNA kann auch in Hefe exprimiert werden, indem man die cDNA in geeignete Expressionsvektoren einsetzt und das Produkt in Wirtszellen einfuhrt. Es wurde über verschiedene

shuttle-Vektoren zur Expression fremder Gene in Hefe be- :."_) ²⁵ richtet (R. Heitzman et al., Nature, Bd. 293 (1981), S, 71.7-722, P. Valenzuela et al. ,'"Nature, Bd. 298 (1982 ), S. 350, Miyahohara et al., Pröc. Nati. Acad.'Sci. USA, Bd. 80 (1983), S. 1-5). Die Vektoren sind zur Replikation . in E. coli- und -in Hefe-Wirten fähig und enthalten Promotor^u Sequenzen von Hefegenen. Im wesentlichen können alle derartigen Fxpressionsvek'toren zur Expression von IL-2-cDNA verwendet werden. Bei Verwendung von Hefe kann es. im Vergleich zur Verwendung von tierischen Zellen oder Bakterien zu höheren IL-2-Konzentrationen kommen. Nachstehend wird . ein Beispiel für die Expression von HuEan-IL-2-cDNA in Hefe ^: beschrieben. -

Die Hefe-Ε. coli-shuttle-Vektoren pAT77 und pAM82 wurden von

Miyanaohara et al., (Proc. Nafl. Acad . Sei. USA, Ed. 80 • (1983), S.. 1-5 beschrieben. Beim Vektor pAM82 handelt es sich um ein Derivat von pAT77. Beide tragen Marker von ars 1 (D.T.Stinchcomb et al., Nature, Ed. 282 (1979), S. 39-il3, 2 ;um ori (J.R. Broach et al., Gene, Bd. 8 (1979'), S'. 121-133) und Ieu2 (B. Ratzkin et al., Proc. Natl. Acad. Sei. ..: USA, Bd. m (1979), S. 'W-¹^I) und den Promotor für das

Gen der sauren Phosphatase (APase)" von Hefe. Sie tragen auch' das 3,7 kb-DNA-Segment von pBR322, das eine'n Marker für Ampicillinresistenz (Ap ) und den Replikationsursprung enthält (Fig. 8). Der APa.se-Promotor kann durch Verschiebung einer hohen Phosphatkonzentration zu einer niedrigen Konzentra- ^; tion 'in den Kulturmedien induziert werden. Um Human-IL-2-cDNA zu exprimieren, wird pIL2-50A nach Behandlung mit E-. coli-Klenow-Fragment· oder mit T^-DNA-Polymerase mit Pstl •.gespalten, die cDNA wird mit pAM82, das vorher mit Xhol ^: gespalten ist, verknüpft und mit dem E. coli-Klenow-Frag- ^; ment inkubiert, um die Enden aufzufüllen, Hybridplasmide,

bei denen die für. cDNA kodierende Sequenz abwärts der Hefe-'20 APase-Promotorsequenz liegt, werden durch Klonierung in '. E» coli ausgewählt. Das erhaltene Plasmid, pYIL-2a wird in He,fe eingeführt. Nach Induktion des APase-Promotors wird die IL-2-Aktivität im Hefeextrakt gemessen. Das Plasmid pYlL-2a enthält einen Bereich der GC-Reste zwischen dem ... 25 Hef epromotor und der IL-2-cDNA. Es i'st möglich, dass eine .derartige Sequenz die Expression von IL-2-cDNA hemmt. Um diese Schwierigkeit zu beseitigen," kann folgende Konstruk-. ':;:tion eines Plasmids durchgeführt werden: Das Plasmid pIL2-. . 50A wird mit Pstl gespalten, und das cDNA-Insert wird isoliert. Diese cDNA wird sodann mit T^-DNA-Polymerase in Gegenwart von dATP, dGTP und dTTP behandelt, so dass die Bereiche der G-Reste an beiden Enden der cDNA abgetrennt und a-nschliessend; mit Nuclease S1 behandelt werden, um die Bereiche der G-Reste zu entfernen. Diese DNA wird mit Xhol-DNA-Linker und Plasmid pBR'322., dessen EcoRI-Stelle gespalten und durch'EcoRI und das Klenow-Fragment stumpf gemacht worden ist verknüpft.;Das gebildete Plasmid pIL2-Xho wird mit Xhol gespalten, und das cDNA-lnsert wird isoliert. Die

cDNA wird sodann in die einzige Xhol-Stelle von pAM82 eingeführt, und ein Plasmid -mit einem Gehalt an der für IL-2 kodierenden Sequenz, die in bezug auf den Hefe-APase-Promotor korrekt orientiert ist, wird in E. coli kloniert. Das Plasmid pYIL-2b wird in Hefe eingeführt. Nach Induktion des APase-Promotors wird die IL-2-Aktivität im Hefeextrakt ge-' messen. ,

(3) Expression der cDNA in Säugetierzellen ' .

Ein Plasmid, das die Synthese von Human-IL-2 in Säugetierzellen steuern sollte, lässt sich folgendermassen konstruieren: Ein Plasmid pCE-1 wird aus pKCR (K. O'Hare et al., ./Γ--·. Proc. Natl_;. Acad. Sei. USA,- Bd. 7& (1981), S. 1527-1531 ) : " "' und aus pBR328 (X. Soberon et al., Gene, Bd. 9.(198O)", S. 287,-305) gemäss einer Serie von Modifikationsverfahren gemäss Fig. 2 konstruiert. Die Initiationssequeriz ATG des _;. IL-2-Gens wird abwärts vom Promoter für das SV^O-frtfhe Gen verknüpft. Das Plasmid enthält eine einzige Pstl-Stelle unmittelbar abwärts vom SV40-frühen Promotor, und-aufwärts von

20

dem Teil des Kaninchen-ß-Globin-chromosomalen Gens, das ein Intron enthält. Das Plasmid enthält auch den Replikationsursprung von SV40 sowie die Polyadenylierungsstelle für·das frühe Gen. Somit wird ein Plasmid pCEIL-2, in dem das IL-2-Strukturgen vom frühen Promotor von SV40 in 'entsprechenden

nc

Wirtszellen transkribiert werden sollte, erhalten· (Fig. 2).

Dieses Plasmid wird mit Hhal gespalten und sodann durch DNA-Transfektion in die tr-ansformierte Affenzellinie COS-7 transformiert,die die Replikation von DNA mit SV^O-Ursprungs-

30

Sequenzen erlaubt. Es erscheint für eine wirksame Expression von cDNA wichtig, die Spaltung des Plasmids mi't Hhal vor der Transfektion durchzuführen, da Sequenzen, die eine Replikation der transfizierten DNA in COS-Zellen behindern könnten, durch diese Vorgehensweise vom für die cDNA-Expression wesentlichen Teil des Plasmids entfernt werden können. Nach Transfektion des Vektors auf Affenkulturzellen COS-7 (Y. Gluzman,, Cell, Bd. 23 (1981), S. 175-182) wird, nach 1- bis 3-tägiger Züchtung unter üblichen Züchtungsbe-

dingungen im allgemeinen IL-2 sekretiert und im gezüchteten Zellmedium gebildet. Um amplifizierte DNA in andere eukaryontisehe Zellen einzusetzen, wird in entsprechender Weise ein für den Wirtsorganismus geeigneter Vektor, der mit dem cDNA- - 5 Insert verknüpft ist, aus . prokaryontischen. Zellen gespalten und isoliert. Die eukaryontischen Zellen können mit dem auf © : diese Weise synthetisierten Vektor transfiziert .und gezüchtet werden..,-.'

10-Zellen mit der rekombinanten DNA werden zur Amplifikation der rekombinanten DNA oder zur Bildung von IL-2-Polypeptid gezüchtet. Die Züchtung wird mit herkömmlichen Mitteln durchgeführt. Beispielsweise kann -transformierte Hefe in einem Medium mit einem Gehalt an Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, .anorganischen Salzen und gegebenenfalls organischen Nährstoffen, wie Vitaminen ,und Aminosäuren, bei Temperaturen im Bereich von 20 bis 37°C und einem pH-Wert von A bis 7 unter aeroben.Bedingungen gezüchtet werden. Transformierte . prokaryontische. Organismen, wie E. coli oder B. subtilis .können ebenfalls unter herkömmlichen Bedingungen gezüchtetwerden. : . " . . ;·. .

Das intrazellulär oder extrazellulär gebildete IL-2 wird nach bekannten: Verfahren gewonnen, beispielsweise durch Präzipitation mit Amrooniumsulfat, Dialyse zur Entfernung von Sal-zen (unter Normaldruck oder unter vermindertem Druck), Gelfiltration,- Chromatographie, präparative isoelektrische Flachbett-Fokussierung_v Gelelektrophorese, Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) (Ionenaustausch, Gelfiltration und .Chromatographie in reverser Phase), und Affinitätschromatographie an einem mit einem Farbstoff verbundenen Träger, an mit monoklonalen Antikörpern gegen IL-2 gekuppelter Sepharose 4b oder an Sepharose AB mit daran gebundenem Lectin und dergleichen. Verfahren zur Gewinnung und Reinigung von IL-2 sind in folgenden Literaturstellen beschrieben: Watson et al., J.,Exp. Med., ¹Bd. 150 (1979), S. 8^9-861 , Gil.lis et al., J.

' Immunpl. , Bd. A2k (1.980), S. 1 9 5 J4 -1 9 6 2 , Mochizuku et al. , J. Immunol. Methods, Bd. 39 (1980), S. 185-201 und K. Weite

- 29 t letal., J. Exp. Med., Bd. 156 (1982), S. 454-464.

Das auf diese Weise erhaltene Polypeptid zeigt das gleiche biochemische und biologische Verhalten wie durch Säugetier-. 5 zellen unter Mitogenstimulation gebildetes IL-2;und besitzt IL-2-Aktivität. Das Molekulargewicht beträgt etwa·15 000 DaI-ton. Die IL-2-Aktivität wird mit monoklonalem anti-IL-2-Antikörpern in Gegenwart oder Abwesenheit von Imm-unoadsorbentien,. wie Igsorb (Enzyme Center).vollständig neutralisiert oder präzipitiert. Bei der Immunoelek.trophorese zeigt das IL-2-

Polypeptid nur ein einziges Präzipitat gegen den entsprechen-.. . den anti-IL-2-Antikörper. Die IL-2-Aktivität bleibt nach Re-C duktion mit 2-Mercaptoäthanol. stabil und ist gegen Behänd- \.J lung mit DNase und RNAse sowie gegen eine 30-minütige Wärmebehandlung bei 56⁰C beständig. Die Aktivität ist bei einem pH-Wert von 2 bis 9 stabil. Das gebildete IL-2 fördert das Wachstum von monoklonalen funktionellen T-Zellen (zytotoxische T-Lymphozyten) , verstärkt die Thymozytenmitogenese, führt zur . Bildung von antitumorspezifischen zytotoxischen T-Lymphozyten aus dem Gedächtnis heraus in Abwesenheit des Antigens und kann zur Erhöhung: der natürlichen Killerzellenaktivität gegen YAC-1- und RLo1-Zellen verwendet werden.

Ausführungsbeispiele: . . /.

' ²⁵ ' ' '

· . B e i s ρ i e 1 1

(1) Eine humane T-Leukämiezellinie, Jurkat-Zellen (in Japan, der Bundesrepublik Deutschland und den Vereinigten Staaten frei zugänglich) wurde in RPMI 1640-Medium mit einen Gehalt _an -jo Prozent (.Vol. /Vol.) FCS suspendiert und bei Raumtemperatur 50 Sekunden mit einer Roentgenapparatur ExsT5O/3OO-M (Toshiba/Japan) bis 10 000 Rcentgen bestrahlt. Anschliessend wurden die bestrahlten Zellen 5 Tage,bei 37⁰C in einem In- kubator bei 5 Prozent C0_ mit einer ursprünglichen Zelldichte von 1 χ 10 Zellen/ml im vorerwähnten ^Kulturmedium gezüchtet. Die mutierten Zellen (0,2 Zellen/Vertiefung) wurden, in .Vertiefungen von 10-teiligen, flachbodigen Mikroplatten mit 96 Vertiefungen gebracht und 21 Tage bei 37⁰C im Inkubator bei

5 Prozent C0~ gezüchtet. -

Aus diesen Vertiefungen erhaltene Klone wurden wiederholt in frisqhes Züchtungsmedium übertragen, um die Klongrössen zu steigern. Die vermehrten Klone wurden 2U Stunden bei einer ursprünglichen Zelldichte von 1 χ 10 Zellen/ml in Gegenwart von 50 ^ug/ml.ConA gezüchtet. Die IL-2-Aktivität wurde nach den vorstehend beschriebenen Verfahren gemessen. Dann wurde eine humane T-Zellinie,- bezeichnet als Jurkat-111 (kurz J-H1) (ATCC CRL8129), die aus den Ausgangs-Jurkatzellen kloniert worden war, ausgewählt, deren Produktivität in bezug auf IL-2 im Vergleich, zum Ausgangsstamm auf das 40-fache erhöht worden war. Die klonierte Zellinie J-111 wuchs, unter herkömmlichen Bedingungen. Die Wachstumsge-, schwindigkeit war praktisch gleich wie bei üblichen Jurkat-ZeIl en. , .

(2) Zellen (1 χ 10⁵YmI) von J-111 wurden in 1000 ml' serumfreiem, synthetischem Züchtungsmedium RITC 55-9 (T. Sato /

20...et' al. , Exp. Cell. Res. , Bd. 138 (1982), S. 127-.13¹O in Rollzüchtungsflaschen (Falcon 3027) überimpft und 4 Tage bei 37 C gezüchtet. Die vermehrten. Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet. Die geernteten Zellen wurden wiederum in das vorerwähnte Medium überimpft, das mit 25 Ug/ml ConA (Zellgehalt 1 χ 10 Zellen'/ml) versetzt worden war. In 4 Ansätzen von Rollkulturflaschen (Falcon) wurden jeweils 1000 ml des beimpften Züchtungsmediums gebracht. Die Züchtung wurde 6 Stunden unter Rotieren fortgesetzt.

(3 ) Jurkat-Zelle.n (1,2 χ 10 ), die auf diese Weise mit 25 ^g/ ml ConA stimuliert worden waren, wurden in 8000' ml mit Kochsalzlösung ausgeglichenem Phosphatpuffer (PBS) 6 Stunden suspendiert. Die Zellen wurden 2 mal durch Zentrifugation gewaschen und in ÖOO ml RSB-Lösung (.10. millimolar. Tris-HCl, pH-Wert -7,5, 10 millimolar NaCl, 1,5 millimolar HgCl₂) mit einem Gehalt an Ribonucleosid-Vana.dyl-Kompl.ex (10 milli- , molar) ,einem.Nuclease-Inhibitor, resuspendiert. Anschlie-. ssend wurde das Detergens NP-MO bis zu einem endgültigen

Gehalt von· 0,05 .Prozent zugesetzt. Sodann wurde massig gemischt und die Zellkultur wurde durch- 5-minütige Zentrifugation bei 30.00 U/min und 4°C entfernt. SDS (0,5 %) und EDTA (5 rail-limolar) wurden zum überstand gege-ben, und die zytoplasma- tische RNA wurde durch Zusatz eines gleichen -Volumens an Phenol extrahiert. Nach 3-maliger Extraktion mit Phenol wurde die RNA mit dem 2-fachen Volumen an ,Äthanol präzipitiert. Die Präzipitate wurden durch Zentrifugation gewon-,' ^l nen und in 10 millimolar Tris-HClι vom pH-Wert 7,5 in Lösung

ΊΟ gebracht. Die Menge an erhaltener RNA betrug 196 mg. ^;

Die Fraktionierung von mRNA wurde unter Anwendung von Affi-(/ nitätschromatographie an oligo-(dT)-Cellulose (P.L.Biochemi- -^;! cals, Typ'7) durchgeführt. 'Als Adsorptionslösung wurde eine Lösung vorn pH-Wert 7,5 mit einem Gehalt an 20 millimolar Tris-HCl, 0,5 m ¹NaCl, 1 millimolar EDTA und 0,5 Prozent SDS verwendet. Die Elution wurde mit Wässer und 10 milli-. > molar Tris-HCl (pH-Wert 7,5) abwechselnd nach

dem Waschen der Säule mit dem Puffer (20 millimolar Tris-HCl, pH-Wert 7,5, 0,5 m NaCl, 1 millimolar EDTA) durchgeführt·. Es wurden 3,6 mg mRNA eluiert. Anschliessend: wurden 2,4 mg der erhaltenen mRNA durch Saccharosedichtegradientenzentrifugation (5 bis 2,5 Prozent Saccharosedichtegradient in einer Lösung vom pH-Wert 7,5 mit einem Gehalt an 50 rail- f , 25 limolar Tris-HCl, 1 millimolar* EDTA und 0,2m NaCl) frak- \⁷j tioniert. Es wurde 24-, Stunden bei 26 000 U/min und 4°C zentrifugiert. Die 11- bis 12S-Fraktiön von mRNA wurde in die Fraktionen Nr. 12,^13 und 14 in Mengen von 59,i 46 bzw.· 60 ug fraktioniert. :

ί 30 .-. ..

(4) Die in Fraktion Nr. 13 erhaltene mRNA wurde durch Mikroinjektion in Oozyten von Xenopus laevis (50 ng mRNA/Ei) verbracht. Der Züchtungsüberstand diente zur Bestimmung der 11-2-, · Aktivität. Wie in Tabelle I gezeigt, wurde ein Anstieg des Einbaus an, H-TdR und ein Anstieg der Anzahl an aktivierten T-Lymphozyten 'festgestellt, was klar bestätigt, dass die mRNA in dieser Fraktion humane IL-2-mRNA enthält. .

	—	32 -	X	2	I	553	Menge an IL-2* Einheiten/ml
	Ta	belle	X	32			0
		(a)	X	8		590 "
	Probe Verdünnung	X	32		572	0
	Kontrolle I				683
	(Testmedium)			Aufnahme an -³H-TdR (cpm)	165	32
Kontrolle II
(Überstand von nicht behandelter Eik.ultur )
Translati onsprodukt
von Fraktion 13 *
		1 if
	10

(b)

Zellzahl an T-Lymphozyten (Anzahl pro

	Verdünnung	IV) -	Verti
Kontrolle I	X	16	. 0
(Testmedium)	X	2 ,	0
Kontrolle II	X	16	0
(Überstand von nicht behandelter Eikultur)	X	2	0
Tr an s 1 a t i on s pr od uk t	-X	16	115
von Fraktion 13"	X	55

Menge an IL-2* (Einheiten/ml)

* Die Einheiten wurden berechnet, indem man die Menge an eingebautem ^H-TdR gemäss der Probit-Analyse mit Standard-IL-2 (10 Einheiten/ml) verglich.

(5) Anschliessend wurde cDNA in vitro aus der Fraktion Nr. 13 von 11- bis 12S-mRNA^>mit einem Gehalt an IL-2-mRNA synthetisiert. Rekombinante DNA wurde mit dem Plasmidvektor PBR322 konstruiert. Mit der rekombinanten DNA wurde Escherichia coil, transformiert. Klone mit erworbener IL-2-cDNA wurden folgendermassen selektiert:

, ' - 33 -

'(5-T) 50 millimolarer Tris-HCl-Puffer (pH-Wert 7,5, 30 millimolar NaCl, 6 millimolar MgCIp, 5 millimolar Dithiothreit (kurz "DTT"), jeweils 0,5 millimolar dATP, dGTP, dCTP,dTTP (dCTP enthielt P-radioaktiv markiertes Produkt), 0,7 ug

5 oligo (dT')₁₀, 10 ^g mRNA und 15 Einheiten AMV-reverse Tran.skriptidase (J.W. B'eard) wurden vermischt und 90 Minuten bei 41°C.belassen. " . '

Nach beendeter 'Reaktion wurde DNA nach Phenolbehandlung als Athanolpräzipitat gewonnen. Die DNA wurde in einer Lösung vom'pH-Wert "7,5 mit einem Gehalt an 20 millimolar Tris und 1 millimolar EDTA in Lösung gebracht.^! >

C: λ . . . .

2,5 Ug ss-cDNA wurden synthetisiert. Zur Entfernung der in dieser Lösung vorhandenen mRNA wurde die Lösung durch Zusatz von NaOH auf eine NaOH-Konzentration von 0,33 gebracht und 15 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Anschliessend wurde die Lösung mit einem gleichen Volumen an 1 m Tris-HCl von pH-Wert 7,5 neutralisiert und über eine mit Sephadex G-50 gepackte Säule gegeben. Man erhielt 1,8^ug cDNA.

(5-2) 50 millimolarer Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,5, 10 millimolar MgCIp, 10 millimolar DTT, jeweils 0,75 millimolar dATP, dGTP, dCTP, dTTP (dCTP enthielt ³H-radioaktiv markier- ζ~- 25 tes Produkt), 1,8^g ss-cDNA und 8 Einheiten Polymerase I ;..} (BRL, V.St. A.) wurden vermischt · und 15 .Stunden bei 15°C umgesetzt. Nach beendeter Umsetzung wurde DNA nach Behandlung mit Phenol und Chloroform als Athanolpräzipitat gewonnen. Es wurden 1,10_xug ds-cDNA gebildet. Ein Gemisch ,aus 50 millimolar Natriumacetat (pH-Wert M,5, 0,2 m NaCl, 1 millimolar , ZnCl₂ und 1,10,Ug ds-cDNA 'wurde 20 Minuten bei 37°C inkubiert,'mit 0,25 Einheifeen Nuclease S₁ (Sankyo, Japan) versetzt und 15 Minuten inkubiert.

Nach beendeter Umsetzung wurde das 2 mal mit Phenol behandelte Reaktionsprod.ukt auf eine mit Sephadex G-50 gepackte Säule aufgesetzt, wodurch man 0,55 ug ds-cDNA erhielt.

(5-3) Ein Gemisch aus O", 1 ^ m Kaliumkakodylat, 30 millimolar Tris-Base, 0,1 millimolar DTT, 1 millimolar COCl₅, 0,64

op ^ CL

raillimolar '² P-dCTP (spezifische Aktivität 2,7 χ 10 cpm/nMol), 0,55,Ug ds-cDNA und 5 Einheiten terminale Transferase (BRL) .5 wurden 7 Minuten bei 37 C irikubiert und.anschliessend 'nach Phenolbehandlung auf eine mit Sephadex G-50 gepackte Säule aufgesetzt, wodurch man 0,50^g DNA als Athanolprazipitat erhielt. Die gewonnene DNA war an beiden 3'-Enden mit etwa 50 dCMP-Resten verlängert. . .

-.10 " ; ' .'·.-' ·

10_vug pBR3'22-DNA wurden mit dem Restriktionsenzym Pstl gespalten.An die 3'-Enden der gespaltenen DNA wurde nach dem gleichen Verfahren, das vorstehend beim Zusatz von dCMP an ds-cDNA angewandt wurde, angefügt, mit der Ausnahme, dass dGTP anstelle von dCTP verwendet wurde.. ..

(5-²O Ein Gemisch aus 50 millimolar Tris-HCl (pK-Wert 7,5), 0,1 m NaCl, 5 millimolar EDTA, 0,05 _yug pBR3.22 (verlängert mit dGMP-Resten) und 0,Ot_xUg cDNA (verlängert mit dCMP) wurde zunächst ,2. Minuten bei 65⁰C, dann 120 Minuten bei ' 46⁰C, 60 Minuten bei 37°C und schliesslich 60 Minuten bei Raumtemperatur ink.ubier,t.. E.: coli X 1776 (R. Curtiss III. et al., "Molecular Cloning of Recombinant DNA", Hrsg. W. A. Scott & R. Werner, Academic Press (1977)) wurde.in 50 ml/ L-Brühe mit einem Gehalt an 100 .ug/ml Diaminopimelinsäure,

Thymidin, 1 Prozent Tryptophan, 0,5. Prozent .Hefeextrakt, 0,5 Prozent NaCl und 0,1 Prozent Glucose uber'impft. Die Züchtung, wurde unter Schütteln bei 37°C durchgeführt, .. bis die Züchtungsflüssigkeit bei 562 mn eine Absorption von 0,3 aufwies. Nach beendeter Züchtung Hess man die

Kulturflüssigkeit 30 Minuten bei 0⁰C stehen. Sodann wurden die Bakterienzellen durch Zentrifugation gewonnen und 2 mal. mit 25 ml einer.. Lösung mit einem Gehalt an 5 millimolar ' Tris-HCl (pH-Wert 7,6), 0,1 m-NaCl, 5 millimolar MgCl₂ und 35. 10 millimolar RbCl gewaschen. .

Die auf diese Weise erhaltenen Zellen wurden in 20 ml einer Lösung mit einem Gehalt an 5 millimolar Tris-HCl (pH-Wert

• . _v 1 7,6), 0,25 m KCl, 5 millimolar MgCl₂, 0,1 m CaCl« und 10 millimolar RbCl suspendiert und 25 Minuten bei 0 C stehen-^: gelassen. Anschliessend wurden, die Zellen gewonnen¹ und in 1, ml der gleichen Lösung resuspendiert. Die vorstehend beschriebene rekombinante DNA wurde in 0,2 ml der Zellsuspension gegeben, und die Suspension wurde 60 Minuten bei 0°C ' stehengelassen. Anschliessend wurden 0,7 ml der L-Brühe zur Kultur zugesetzt. Es wurde 30 Minuten bei 37°C geschüttelt. 0,1 ml des erhaltenen Züchtungsmediums wurden gründlich auf die Oberfläche von 1,5 Prozent Agarosemedium, das aus L-Brühe mit einem Gehalt an 100/UgZml Diaminopimelinsäure, 50^UgZmI Thymidin und 15/UgZml Tetracyclin bestand, verteilt unä 2

^-_ Tage. bei. 37°C inkubiert. X . . .

(5-5) ^32 aufgetretene Kolonien wurden in 18 Gruppen von jeweils 24 verschiedenen Bakterienklonen aufgeteilt, auf 200 ml . L-Brühe mit. einem Gehalt an 100/UgZml^v Diaminopimelinsäure, 5O_xUgZmI Thymidin und 10 ^ugZml Tetracyclin übe.rimpft-.und 5 bis 7 Stunden unter Schütteln bei 37 C gezüchtet. Sodann wurden 200 ml einer frischen L-Brühe mit einem¹ Gehalt an

Chloramphenicol in einer Endkonzentration von 17O_xUgZmI zugesetzt , wonach die Züchtung über Nacht fortgesetzt '-wurde'. '--Die auf diese Weise amplifizierte Plasmid-DNA wurde auf herkömmliche Weise gereinigt. Klone mit einem Gehalt an ;(" ! 25 IL-2-cDNA wurden mittels eines mRNA-Hybridisierungs-Trans- ;_7 lafeion-stests (nachstehend . "H-T-Test") ausgewählt.. Der. H-T-Test wurde auf folgende Weise durchgeführt:

25/Ug gereinigte DNA wyr.den mit dem Restriktionsenzym HindTII gespalten, 3 mal mit Phenol behandelt, mit Phenol-Chloroform und mit Chloroform behand.elt, mit. Äthanol präzipitiert, mit 80 Prozent Äthanol gewaschen und in ¹IO_xUl 80-prozentigem Formamid gelöst.

Das Reaktionsgemisch wurde zur Denaturierung 5 Minuten auf 90°C,erwärmt >und sodann auf 1,3 ml mit 10 χ SSC (1,5 m.NaCl, 0,15 m Natriumeitrat) verdünnt. Die DNA wurde anschliessend auf Nitrocellulosefiltern fixiert. Diese Filter wurden 3-Stunden bei 80°C getrocknet und 18 Stunden bei 37°C in einer

. '. ' · - 36 - · / .

Lösung mit einem Gehalt an 50 Prozent Formamid, 20 millimolar ^c Pepes vom pH-Wert .6,5., .0,5 m NaCl, 5 millimolar EDTA, 0,2 Prozent SDS und 250 ug poly (A)-nrRNA aus induzier ten J-111 - . Zellen zur Hybridisierung der an den Filtern fixierten DNA mit IL-2-mRNA inkubiert. Anschliessend wurden die Filter 3 mal bei 65 C mit einer Lösung aus 10. millimolar Pipes vom' pH-Wert 6,5-, 0,15'm NaCl, 1 millimolar Pipes, 10 millimolar NaCl gewaschen und 1 Minute bei 95 C mit einer Lösung mit einem Gehalt an 0,5 millimolar EDTA und 0,1 Prozent SDS behandelt, um die hybridisierte riiRNA von den Filtern zu gewinnen. Die- auf . diese Weise extrahierte inRNA wurde an einer oligo dT-Cellulosesäule' auf herkömmliche Weise gereinigt und zur Bestimmung der IL-2-Äktivität der translatierten Proteine in Xenopus -Oozyten injiziert. Eine von'i8 Gruppen, die jeweils aus 2^4 Klonen bestanden, ergab beim vorbesehriebenen Test auf Einbau von H-TdR eine'positive Reaktionmit ¹IS Einheiten/ml/Il-2-Aktivität, während sich die übrigen klar negativ verhielten. Die 24 zur positiven Gruppe gehörenden Einzelkolonien wurden in 200 ml L-Brühe der vorstehend angegebenen Zusammensetzung überimpft und.unter aeroben Bedingungen 5 bis 7 Stunden bei 37°C gezüchtet. In entsprechender. Weise wurde frische L-Brühe mit einem Gehalt.an Chloramphenicol zugesetzt. Nach Amplifikation der Plasmid-DNA . durch Züchtung über Nacht wurde die Plasmid-DNA nach üblichen Verfahren gereinigt. Nach Spaltung von etwa 5 ^g der einzelnen Plasmid-DNAs mit Hindlll wurden die Plasmid-DNAs auf die gleiche Weise an Nitrocellulosefilt.er gebunden. Die Filter wurden mit*IL-2-mRNA hybridisiert. Die hybridisierte ' . mRNA wurde gewonnen und in Xenopus Oozyten injiziert, um die IL-2-Aktivität der translatierten Proteine'zu.bestimmen.

Wie sich aus Tabelle II ergibt, ergab nur die Plasmid-DNA, . die aus einer einzigen - Kolonie mit der Bezeichnung p3-i6 gereinigt worden war, eine positive IL-2-Aktivität. Dieser Klon wird somit als Klon mit einem Gehalt an IL-2-cDNA identifiziert v(E. coli X 1776/ρ3-1β AJ 11995 (FERM-BP-225)). Diese Plasmid-DNA p3-i6 weist genau die DNA (IL-2-Gen), die zur Bildung des speziellen Hybrids mit IL-2-mRNA'in der

1 Lage ist, auf.

10 15 20 25

Tabelle II

(a)

Probe Verdünnung Aufnahme an Menge an IL-2 , '^H-TdR (cpm) (Einheiten/ml)

Kontrolle I	-	2_: 010
(Testmedium)¹
Kontrolle II	x^; 2 .	2 120
(Überstand von nicht behandelter Eikultur)	x 32 ..	I 2 482
Translationsprodukt	χ 2	20 453
von mRNA	x 32	20 961
Probe	(S). Verdünnung	Zellzahl an T-Lymphozyten (Zellen pro Vertiefung)

0 58'

Menge an IL-2 (Einheiten/ml)

Kontrolle I (Testmedium) Kontrolle II

(Überstand von nicht behandelter

(Eikultur)	\ x.	32	88
Translationsprodukt .	X	OvJ	, 42
con mRNA* .	X	32

30 35

* mRNA, hybridisiert mit cDNA aus'Plasmid p3-i6.

Das cDNA-Insert des Plasmids p3-i6 wird durch das Restriktionsenzym Xbal .an einer einzigen Stelle und durch BstNI an 2 Stellen (aufwärts und abwärts zur Xbal-Spaltungsstelle·) " . gesparten. Jedoch enthält das Plasmid p3-i6ein cDNA-Insert mit einem Gehalt an etwa 650 Basenpaaren, das offensichtlich einem Teil von IL-2-mRNA der Grosse 11 bis 12S entspricht.

Eine weitere cDNA-Bibliothek wurde gemäss dem Verfahren von

- 38 -

Land et al., (Nucleic Acids Res.', Bd. 9 (1981), S. 2551) unter Verwendung von IL-2-mRNA als Matrize hergestellt. Einzelsträngige cDNA "(1,6^ug) wurde unter Verwendung von 4 ^g .IL-2-mRNA (yerlängert mit dCMP-Resten) synthetisiert. ds-~cDNA wurde unter Verwendung von oligo- (dG)_1? ..n als Primer für DNA-PoIymerase I (Klenow-Fragment) synthetisiert. Die cDNA (Ό ,6, pg) mit mehr als 680 Basenpaaren als DNA-Grössenmarker wurde durch Saccharosegradientenzentrifugation erhalten und nach dem Standard-G-C-Schwänzungsverfahren in die Pstl-Stelle von pBR322 eingesetzt. Nach Transformation.von E. coli Ύ-1776 durch die rekombinante DNA wurden etwa 2000 Kolonien gemäss dem in situ-Hybridisierungsverfahren von Grunstein-Bogness mit Nick-translatiertem p3-16-cDNA-Insert als Sonde aufgefunden. Die Kolonie mit einem Gehalt am Plasmid pIL-2 15. 5OA mit einem Gehalt an etwa 850 Basenpaaren und der trans-. formierte Klon (E. coli X 1776/pIL-2-50A AJ 11996 (FERM-BP-226)) wurden identifiziert. Eine Restriktionsendonuclease-

. Spaltungskarte des cDNA-Inserts von pIL-2-50A ist in Fig. T,

dargestellt, · . >

Zur Isolation eines für das IL-2-Peptid kodierenden Gens aus transformiertem E. coli "X 1776 pIL-2-50A wurde Plasmid-DNA ' nach Isolation des DNA-Bereichs aus den Zellen nach üblichen

Verfahren mit dem Restfiktionsenzym Pstl gespalten._:Bei dem auf diese Weise gebildeten kleineren Fragment aus 2 gebil-. deten DNA-Fragmenten handelte es sich um DNA, die das IL-2-Peptid kodierte--Die vollständige Nucleotidsequenz des Pstl-Inserts von pIL-2-50A wurde gemäss dem Verfahren von Maxam und Gilbert (Enzym., Bd. 65 (198O), S. 499-560) bestimmt. Die vollständige Struktur ist in Fig. 2 wiedergegeben.

. . B e i s ρ i e 1 2

Das Plasmid pKCR (O'Hare et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, Bd. 78, Nr. 3 (1981), S. 1527-1531) besteht aus (i) Segmenten von SV40-DNA (in Fig. 3 durch schraffierte Blöcke wiedergegeben) mit .einem Gehalt an frühem Genpromotor und einem Re-' plikationsursprung (0,725 bis 0,648 m.u.) und einer PoIyadenylierungsstelle aus dem frühen Gen (0,. i 69 bis 0,144 m.u.),

(ii) einem Teil des Kaninchen-ß-Globin-Gens (als offene Blöcke dargestellt) (BamHI-PvuII-Fragment) und (iii) einem Segment von pBR322 (EcoRI-BamHI-Fragment), enthaltend einen Replikationsursprung und das Ampicillinresistenzgen. Dieses Plasmid wurde mit BamHI gespalten. Nach Auffüllen beider Enden der gespaltenen DNA durch DNA-Polymerase I (KTenow-Fragment) wurde synthetische Pstl-Linker-DNA'zur Konstruktion von pKCR (Pstl) eingeführt. Plasmid-pKCR (Pstl) wurde mit Sail gespalten, zur Auffüllung der Enden mit Klenow-Fragment behandelt und sodann partiell mit EcöRI gespalten, um ein EcoRI-Sall-Fragment, das die gesamte von SV¹IO abgeleitete DNA und das Globingen enthält, zu erhalten. v-:~. Dieses Fragment wurde sodann ".mit einem Stück von pBR328.-DNA .'-'·'' ' verknüpft, das das Tetracyclinresistenzgen und einen :Replikationsursprung enthält, wie'in Fig. 3 dargestellt. Das

erhaltene Plasmid pCE-1 enthält.eine einzige Pstl-Stelle „ ' unmittelbar abwärts vom SV40-frühen Promot'or.

Das cDNA-Insert von pIL-2-50A wurde durch Pstl-Spaltung 20 herausgeschnitten und an Pstl-gespaltenes pCE-1 geknüpft, um. pCEIL-2 zu konstruieren, dem die Expression des IL-2-Strukturgens unter Kontrolle des SV40-frühen Promotors erfolgt. Plasmid-pGE-1 wurde ursprünglich zur cDNA-Klonierung durch das G-C-Schwänzungsverfahren (A.C.A.. Chang et (~ 25 al., Nature, Bd. 275 (1978), S. 617-624) in Bakterien und direkte Expression in Säugetierzellen konstruiert.

* '"

Das Plasmid wurde mit Hhal gespalten und sodann durch DNA- Transfektion (McCutchan et al., J. Natl. Cancer Inst., Bd. ^I (1968), S. 351-357, in die transformierte Affenzeillinie COS-7 eingeführt-, die eine Replikation der DNA mit einem Gehalt an SV40-Ursprungssequenzen enthält (erhältlich von Y. Gluzman (Cell, Bd.- 23 (1981), S. 175-182). Es erscheint für eine wirksame Expression von cDNA wichtig, ^; 35 das Plasmid vor der Transfektion mit Hhal zu spalten, da Sequenzen, die eine Replikation der transfizierten DNA in COS-Zellen hindern könnten,, von dem für die cDNA-Expression . bei diesem Verfahren wesentlichen Teil des Plasmids ent-

fernt werden können. COS-7-Zellen (6 χ 10 /ml) wurden in ,0,5 ml DMEM mit einem Gehalt an 5 Prozent FCS in Züchtungsplatten mit 24 Vertiefungen (Nunc) suspendiert und- 4 Stunden bei 3.7°C inkubiert. Sodann wurden die gezüchteten Zellen mit einem Gemisch aus 1 ug des vorstehend beschriebenen Vektors, . .17,6 LiI'- 1 millimolar Tris-HGl mit einem Gehalt an 0,1 millimolar EDTA, 2,4 jil 2 m CaCIp und 120 -ul 2 χ HBS mit einem Gehalt an 50 millimolar Pipes, 280 millimolar NaCl und 1,5 . .millimolar -Na^HPO₁J. 1-.2-HpO- (pH-Wert 7 , 1 Ö ) versetzt. Die Zellen wurden weitere 4 Stunden bei 37 C inkubiert. Anschliessen.d wurde das Züchtungsmedium abgesaugt. Nach Waschen mit 1 ml · PBS wurden 0,5 ml PBS mit einem Gehalt an 20 Prozent-Glycerin zugesetzt. Nach 3-minütigem Stehenlassen bei Raumtemperatur wurde das Medium wieder abgesaugt. Die Zellen· wurden mit 1 ml PBS gewaschen und in 1 ml DMEM mit einem Gehalt an 5 Prozent. FCS gezüchtet.· Jeweils nach 24 Stunden wurden 500 ^l Medium durch frisches Medium ausgetauscht. Die einzelnen, zu den entsprechenden Zeitpunkten gewonnenen . Medien wurden bis zur -. Verwendung bei 4 C belassen. 2. bis 3 Tage nach der Transfektion wurde das gezüchtete .Zellmedium auf seine Aktivität an Human-IL-2. getestet. Wie aus Tabelle III. hervorgeht, enthielt der. Kulturüberstand von mit pCETL-2 transfektierten C0S-7^Zellen die IL-2-Aktivität. In den Kulturmedien von mit pCE-1 transfizierten Zellen.konnte keine I-L-2-Aktivität nachgewiesen werden.

Tabelle' III

Transfektion IL-2-Akti.vität, gemessen Wachstum der T-der DNA mit durch H-TdR-Aufnahme Lymphozyten

pCEIL-2 ·.....·. 12 ^: ++++

' pCE-1 . 1 . ' - -

Die IL-2-Aktivität im Zellkulturmedium nach Transfektion von COS-7 mit pCEIL-2 wurde mit Mäuse-(BALB/c)-antihuman-IL-2- :monoklonalem Antikörper von 12 Einheiten/ml auf unter 1 Einheiten/ml neutralisiert. Das Ergebnis, dass mit pCEIL-2 transfizierte COS-7-Zellen Human-IL-2 sekretierten, zeigt

klar, dass mit einer rekombinanten DNA transformierte,Eukaryontenzellen, die ein für IL-2-Polypeptid kodierendes Gen und eine zur Replikation in diesen Zellen fähige Vektor-DNA enthalten, zur Bildung von IL-2 herangezogen ^werden kön-

η en . '

. Das in E, coli HB101 eingebaute Plasmid pCEIL-2 (AJ/2008) - erhielt die Hinterlegungsnummer FERM-BP 244.

Beispiel 3

Gemäss Beispiel 1 hergestelltes Escherichia coli 7. 1776/pIL-2-50A (AJ 11996 FERM-BP 226)) wurde auf 250 ml L-Brühe mit /","„.. einem Gehalt an 100^ug/ml Diaminopimelinsäure, 50>ig/ml

Thymidin, 1. Prozent Tryptophan, 0,5 Prozent Hefeextrakt,· 0,5 £5 Prozent NaCl und 0,1 Prozent Glucose" überimpft und bei 37 C : unter Schütteln bis zu einer optischen Dichte des Züchtungsmediums bei 562 nm von 0,5 gezüchtet. Nach beendeter Züchtung : - . Hess man das Züchtung.smedium 30 Minuten bei 0 C stehen.

. Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet, 1 mal mit 20-millimolar Tris-HCl mit einem Gehalf an 30 millimolar NaCl gewaschen und in 1,8 ml des gleichen Puffers resuspendiert. Eine-Lösung mit einem Gehalt an 0,2'^ul Lysozym (10 mg/ml) und 20^1 0,5 m EDTA wurde sodann zu den Zellen zugesetzt. Man liess das Gemisch 20 Minuten bei 0 C,stehen, ,--. 25 wonach 3 mal hintereinander eingefroren und aufgetaut wurde. ·. ' Sodann wurden Extrakte von Zellen (1,5 ml) nach 30-minütiger Zentrifugation bei 40 000 U/min erhalten. Der Extrakt wurde mit 85 Prozent'Ammoniumsulfat ausgesalzt, zur Entfernung der Salze auf Sephadex G15 aufgesetzt und anschliessend der Säulenchromatographie an DEAE-Cellulose unterworfen. Die

mit 0,06 m Tris-HCl-Puffer vom pH-Wert 7,6 eluierte Fraktion wurde vereinigt. Diese vereinigte Fraktion wurde gefriergetrocknet und sodann der Chromatographie an Glasperlen mit / .; kontrollierten Poren (250 S, Funakoshi Pharmaceuticals, Japan) unterworfen, wodurch man nach EIution mit 0,3 m

Glycin-HCl-Puffer eine Fraktion mit IL-2-Aktivität In einer Höhe von 12 Einheiten/ml erhielt. Die Ergebnisse zeigen, · dass E. coli X 1776/pIL-2-50A, AJ 11996 tatsächlich IL-2-

,1 bildet. ' . , ·

Beis.piel^

Die konstitutiv IL-2-bildende Zellinie J-AI886 (ATCC CRL8130), die gemäss Beispiel 1 aus Jurkat-Zellen kloniert worden war, wurde in entsprechender Weise in Rollkulturflaschen gezüchtet. Die gezüchteten Zellen-wurden in frischem synthetischem Medium RITC-55-9 mit einer ursprünglichen Zelldichte von 1. χ 10 . Zellen/ml resuspendiert. 8 Stunden nach Züchtungs- . beginn wurde eine Extraktion von IL-2-mRNA in Form einer 11- bis 12S-Fraktion aus 3 x 10 Zellen gemäss den in Beispiel 1 beschriebenen Stufen durchgeführt.

Doppelst rängige cDNA wurde gemäss Beispiel 1 synthetisiert, und die·cDNA mit mehr als 600 Basenpaaren {2,k _ug) wurde nach Fraktionierung an einem Saccharosedichtegradienten erhalten ..Die cDNA wurde sodann mit dCMP-Resten unter Verwendung der -terminalen Desoxynucleotidyl-trans.f erase erweitert. Ein Aliquot von 50 ng wurde mit 250 ng dGMP.-verlängertem, Pstl-gespaltenem pBR322 verschweisst. Die erhaltenen Hybridplasmide wurden zur Transformation von E..C0I1 X 1776 verwendet. Es wurden die Transformanten von etwa ^000 Klonen erhalten. Gemäss dem Verfahren von Grunstein-Hogness wurden 3 mit der als Sonde verwendeten Plasmid-3-16-cDNA komplementäre Klone ausgewählt. Bei den so ausgewählten Klonen handelt es sich um transformierte Klone, die humanes IL-2-Gen besitzen.

B e i s ρ i e 1 5 Ein Plasmid, das die Synthese von Human-IL-2 in E.coli-Zellen dirigiert, wurde folgendermassen konstruiert. Ein Plasmid pTIL2-22 wurde aus.pTrS-3 (T. Nishi, T. Taniguchi et al., SEIKAGAKU, Bd. 53 (1981), S. 967)) konstruiert. pIL-2-50A mit einem Gehalt an IL-2-cDN.A wurde nach einer Folge von modifizierten Verfahrensweisen gemäss Fig. 5 (a) konstruiert. Ein Plasmid pTrS-3 umfasst die Insertion des Bereichs des Trp-Promotors und von Shine Dalgarno (kurz SD)-zwischen der EcoRl-Stelle und der Clal-Stelle von pBR322.

Das Plasmid enthält auch ein ATG-Initiationskodon 13 Basen-.. 'paare abwärts von der SD-Sequenz sowie eine einzige Sphl-

Stelle^wie in Fig. 4 erläutert ist. Der Vektor ist¹ ein sehr wirksamer Bildner dieses. Proteins, wenn die diesem Protein entsprechende DNA-Sequenz unmittelbar abwärts' vom ATG-Kodon, das durch Sphl-Spaltung und anschliessende Behandlung mit T^-DNA-Polymerase von pTrS-3 erzeugt worden ist, eingesetzt wird. Deshalb wurde das Plasmid pTrS-3 (30,ug) mit dem Restriktionsenzym Sphl auf übliche Weise gespalten und anschliessend nacheinander mit Phenol und Chloroform behandelt. Die Athanolpräzipitate wurden gewonnen und beide Enden wurden durch Behandlung mit T^-DNA-Polymerase abge- ( ,.^ ; stumpft. Sodann wurde die DNA (21,*J ^ug) durch entsprechen-' '-' de aufeinanderfolgende Behandlung mit Phenol und Chloroform und Fällung mit Äthanol gewonnen. Andererseits wurden 38p _^g pIL-2-50A mit einem Gehalt an IL-2-cDNA mit Pstl gespalten. Das IL-2-cDNA-Insert wurde durch Agarosegel-Elektr'ophorese isoliert. Das cDNA-Insert (11 ug) wurde mit HgiAI. gespalten und mit T^-DNA-Polymerase behandelt. 10 ^g des grösseren DNA-Bruchstücks wurd.en durch Agarcsegel-Elektr.oph'or ese iso-. liert. Gemäss diesem Verfahren erhielt man eine cDNA (1,2 jjg die für '132 Aminosäuren' kodiert. Dieses- DNA-Fragment wies - stumpfe Enden auf (Fig. 5 (a)). Anschliessend wurde dieses cDNA-Frägment mit einem pTrS-3-Vektor verknüpft, der vorher (~--. 25 unmittelbar abwärts von der ATG-Sequenz mit Sphl gespalten ' " .^; und mit T4-DNA-Polymerase behandelt worden war. Dieses verknüpf te Plasmid 'wurde sodann nach üblichen Verfahren in E. '- coli HB101 transformiert.-Die Ligation wurde folgendermassen durchgeführt. Das grössere Fragment von IL-2-cDNA (0,4 pg) und 0,2^Jg pTrS-3-Vektor-DNA wurden mit 0,8 Einheiten von TU-DNA-Ligase in 66 millimolar Tris-HCl vom pH-Wert 7,5 mit einem Gehalt an 6,6 millimolar MgCl-, 1 millimolar ATP und 10 millimolar DTT vermischt. Man liess das Gemisch.über Nacht bei U C stehen. Unter den auf L-Brühe-Agarplatten mit einem Gehalt an Ampicillin auftretenden Transform.anten wurden Kolonien mit einem Gehalt an dem IL-2-cDNA-Bereich, der für 132 Aminosäuren kodiert, durch einen in situ-Kolonienhybridisierungstest ausgewählt. Die ausgewählten Kolonien

wurden wieder gezüchtet (10 ml), wonach Plasmid-DNA durch Behandlung mit Lysozym und durch Einfrieren/Auftauen hergestellt wurde.; DiePlasmid-DNAs wurden mit Pstl und Xbal gespalten. Die erhaltenen Produkte wurden durch Agarosegel-Elektrophorese analysiert, um pTIL-2-22 zu identifizieren, in dem die cDNA der ATG-Sequenz von pTrS-3 in korrekter Orientierung verknüpft war. Das E. coli HB101 mit einem Gehalt an pTIL-2-22 wurde unter herkömmlichen Bedingungen zur : Vermehrung der Mikroorganismen gezüchtet. Die Zellen wurden in 10 ml "X-Brühe (2,5 Prozent "Bactotrypton, 1,0 Prozent Hefeextrakt, 0,1 Prozent Glucose, 20 millimolar MgSO₁., 50 millijnolar Tris-HCl, pH-Wert 7,5) mit einem Gehalt an 25./Ug/ml Streptomycin und ,25^Ug Ampicillin über Nacht bei 37°C gezüchtet. 1 ml der Kultursuspension wurde auf die gleiche- "X-Brühe (100 ml) überimpft und bei.37°C gezüchtet. Sobald die optische.Dichte bei 650 rau etwa einen Wert von 1,5 bis 2,0 erreichte, wurde 3-Indolacrylsäure (IAA) zugesetzt. 3 -Stunden nach Zugabe des Induktors wurden die Zellen gewonnen, mit 20 millimolar Tris-HCl:(pH-Wert 7,5, 30 millimolar NaGl) gewaschen und. in 8-ml des gleichen Puffers resuspendiert. Zur wirksamen Funktionsweise des Trp-Prom ο tors Wurden Induktoren, wie IAA, in einer endgültigen Konzentration von 50 ug/ml zugesetzt. Die auf diese Weise in den Bakterien-, zellen gebildeten Proteine wurden durch Ultraschallbehandlung (0°C, 2 min) oder durch -Verdauung (0°C, 20 min) mit Lysozym (8 ug) unter anschliessendem 3-roaligen Einfrieren/ Auftauen extrahiert/ Nach diesem Verfahren wird IL-2 übli-. cherweise aus Organismen extrahiert. Die extrahierte IL-2-Aktivität betrug 10 000 bis 120 000 Einheiten/ml.

E. coli HBI01 mit einem Gehalt an pTIL-2-22 (AJ/2009) wurde unter der Nummer FERM-BP 2^45 hinterlegt.

B e i s ρ i e, 1 6 Ein Plasmid pTuIL-2-22, das IL-2-cDNA trägt, wurde aus pTu-B1P-5 (T. TanTguchi et al. , Seikagaku, Bd. 53 (1981), S. 966) und pTIL-2-22 von Beispiel 5, gemäss den in Fig. 7 erläuterten Verfahren konstruiert. Das Plasmid pTuBlP-5 umfasst die

Insertion der Promotorsequenz für tufB in pBR322. Das Plasmid ,enthält auch eine einzige Clal-Stelle, die sich 2 Basen-' paare abwärts von der SD-Sequenz befindet, wie in Fig. 7 gezeigt ist. Da pTrS-3 auch eine Clal-Stelle zwischen der SD-Sequenz und dem ATG-Initiationskodon enthält, und da diese. Clal-Stelle während der Kosntruktion des Expressionsplasmids unter Verwendung von pTrS-3 und IL-2-cDNA gemäss Beispiel 5 nicht zerstört wird, ist es sehr einfach, 'den bakteriellen trp-Promotor durch den von tufB zu ersetzen,, so dass IL-2-cDNA unter der Kontrolle von tufB-Promotor exprimiert, wird.

Daher wurde das Plasmid pTIL-2-22 (30 ug) auf herkömmliche ..-- Weise mit den Restriktio"nsenzymen CIaI und PvuII gespalten.

Das Fragment (etwa 2,2 kb) mit einem Gehalt an TL-2-cDNA wurde isoliert und durch Agarosegel-Elektrophorese gereinigt Mari erhielt 3 yg DNA. Andererseits wurden .20 jjg pTuBIP-5-Vektor auf entsprechende Weise durch CIaI und PvuII ge- . spalten. Das grössere Fragment (etwa 3,^ kb) mit einem Gehalt an dem ampieillinresistenten Gen wurde durch Agarose-" 20 gel-Elektrophorese isoliert und gereinigt. Man erhielt 3,5 ji DNA..Anschliessend wurden diese beiden Fragment-e, nämlich das eine .(etwa 3,^ kb) mit einem Gehalt an tufB-Promotor und das andere (etwa 2,2 kb) mit einem Gehalt ah IL-2-cDNA auf folgende Weise verknüpft. Das Fragment mit einem Gehalt an /~") 25 IL-2-cDNA (1,2^g) und 0 ,,3 Jig des Fragments mit einem Ge-' ' "'"" halt an tuf B-Promotor wurden mit 0,8 Einheiten TM-DNA-Li- ' .gase in 66 millimolar Tris-HCl vom pH-Wert 7,5 mit einem Gehalt an 6,6 millimolar MgCIp, 1 millimolar ATP und 10' . .millimolar DTT vermischt. Das Gemisch liess man über Nacht .30 bei H C reagieren. Das auf diese Weise verknüpfte Plasmid wurde sodann zur Transformation in E. coli HB101 nach üblichen Verfahren verwendet. Unter den auf L-Brühe-Agarplatten mit einem Gehalt an Ampicillin auftretenden Transformanten wurden 8 Kolonien mit einem Gehalt an dem IL-2-cDNA-Bereich, wie pTuIL-2-22 in Fig. 7, ausgewählt. Plasmid-DNA wurde "gemäss Beispiel 5 hergestellt. E. coli HB101 mit einem Gehalt an pTuIL-2-22 wurde bei 37°C in 100 ml L-Brühe gezüchtet. Bei Erreichen einer optischen Dichte bei

. - 14 6 -

650 nyj von etwa 0,5 bis 1,0 wurden die Bakterienzellen gewonnen, mit 20 millimolar Tris-HCl (pH-Wert 7,5, 30 millimolar NaCl) gewaschen und in 2 ml des gleichen Puffers resuspendiert. Die auf diese Weise erhaltenen Proteine wurden entsprechend Beispiel 5 extrahiert.- Die extrahierte IL-2-Aktivitäf betruf 6000 bis 56 000 Einheiten/ml.

Escherichia coli ΉΒ101 mit einem Gehalt an pTuIL-2-22 (.AJ/20 10). wurde unter der Nummer FERM-BP 246 hinterlegt.

·'

Beispiel 7

Ein Plasmid pGIL-2-22, das IL-2-cDNA trägt, wurde aus pGL 101 (T,M. Roberts und G.D. Laucer, Meth. Enzym., Bd. 68 (1979), S. 473-483) und pTIL-2-22 von Beispiel 5 konstru-

iert. ·

Das Plasmid pGL 101 (20 ug) mit einem Gehalt an einem lac-Promot-or wurde mit dem Restriktionsenzym PvuII auf her-. . kömmliche ,Weise gespalten..Durch anschliessende Behandlung

20. mit Phenol, Chloroform und Äthanolfällung erhielt man 17 ^Ug DNA. Ferner wurden 75^Ug pTIL-2-22 mit CIaI und Sail gespalten. Nach Ägarosegel-Elektrophorese erhielt man 2,2 ^ug . eines DNA-Fragments mit einem Gehalt an IL-2-cDNA. Dieses Fragment wurde durch Behandlung mit DNA-Po.lymerase I (KIenow-Fragment)^; abgestumpft..Die beiden, erhaltenen Fragmente '(O₅25/ig und 0,66/ig) wurden mit 1,0 Einheit T4-DNA-Ligase

• · gemäss Beispiel 6 verknüpft. Das verknüpfte Plasmid wurde auf herkömmliche.Weise, zur Transformation in E. coli HB101 verwendet. Unter den Transformanten wurden die Transfor-.manten, die die Insertion des Clal-Sall-Fragments mit einem .Gehalt an IL-2-cDNA als Sonde besass.en, in X-Brühe (10 ml) mit einem Gehalt an 25 ^g/ml Ampicillin gezüchtet. Die Herstellung von Plasmid-DNA erfolgte gemäss Beispiel 5. Die Plasmid-DNA mit der Initiationssequenz ATG von IL-2-cDNA unmittelbar abwärts vom lac-Promotor wurde durch Spaltung mit Pstl und Xbal erhalten.

Das auf diese Weise erhaltene pGIL-2-22 wurde auf 100 ml

L-Brühe mit einem Gehalt an 25^gZmI Ampicillin und 25>Jg/ml Streptomycin überimpft und gezüchtet. Nach Erreichen einer optischen Dichte bei 650 ταμ von etwa 0,5 wurde Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranosid (IPTG) in einer Konzentration von 1 millimolar zugesetzt. 1 Stunde später wurden die Bakterienzellen gesammelt. Die Zellextrakte wurden gemäss Beispiel 6 hergestellt.. Die extrahierte IL-2-Aktivität betrug 6000 bis 80 000 Einheiten/ml.

Escherichia coli HB101 mit einem Gehalt an pGIL-2-22 (AJ/ 2011) wurde unter der Nummer FERM-BP 247 hinterlegt.

B e i. s ρ i e 1 . 8 . . 10 )jg des Plasmids pTrS-3 wurden zunächst mit dem Restriktionsenzym Sail gespalten. Die Sall-Stelle wurde durch Behandlung mit DNA-Polymerase (Klenow-Fragment) oder mit Tk-DNA-Polymerase abgestumpft. Nach der Spaltung mit CIaI wurde ein grösseres Fragment, das den trp-Promotorbereich enthielt, durch Agarosegel-Elektrophorese auf übliche Weise ,

isoliert. Man erhielt 3^g DNA. .

^; Ferner wurden 11^_xUg eines cDNA-Inserts, das durch Pstl- '

Spaltung von pIL2-50A erhalten worden war, mit HgiAI gespalten und mit T4-DNA-Polymerase behandelt. Das grössere Frag-/. ';· 25 ment wurde isoliert und durch Agarosegel-Elektrophorese ger-einigt. Somit wurde ein für 132 Aminosäuren von Umkodierendes cDNA-Fragment in einer Menge" von 7,2.^ug erhalten. Anschliessend wurden 0,45^ug des Fragments mit einem Gehalt .an einem trp-Promotor (wie vorstehend beschrie-'30 ben), 0,5^g HgiAI-Pstl-Fragment mit einem Gehalt an IL-2-cDNA und synthetische Oligonucleotide (5M-CGATAAGCTATGGCa-(3¹) und (3¹3-TATTCGATACCGt-(S') (jeweils 20 pMol), die beide am 5'-Ende phosphoryliert waren, mit 1 Einheit T4-DNA-Ligase gemäss Beispiel 5 (vgl. Fig. 5 (b)) verknüpft. 35; ' . ' ' .

Das auf diese "Weise verknüpfte'Plasmid wurde sodann zur Transformation von E. coli HB101 verwendet. Unter den aufgetretenen Transformanten wurden die gewünschten Transformanten

- H8 -

folgendermassen ausgewählt. . . '

'.Die gewünschten Transfqrmänten, die zur Hybridisierung

mit lL-2-cDNA und synthetischen Oligonucleotiden in der Lage sind, wurden zunächst gemäss dem Kolonienhybridisie-. rungsverfahren ausgewählt. Anschliessend wurden die Transformanten, die die Insertion des DNA-Fragments beginnend . von der CCT-Sequenz in Stellung 11.1 bis 113 in Fig· 2 (a) ; . (CCTACT----) unmittelbar·abwärts der ATG GCA-Sequenz besassen, durch Pstl- und Xbal-Spaltung ausgewählt.

Die vorstehende Transformante, die pTIL2-21a oder pTIL2-21b enthielt, wurde gemäss Beispiel 5 in L-Brühe gezüchtet. Hohe Aktivitäten an IL-2 wurden in den Zellextrakten der' Transformänten beim Test gemäss Beispiel 5 festgestellt.

Escherichia coli Hb101 mit pTIL2-21a (AJ 12013) und Escherichia coli HB10.1 mit pTIL2-21b (AJ 12014) wurden unter den Nummern FERM-BP 248 und FERM-BP249 hinterlegt.

.'. .© ·-

. .Die Wirte,, E. coli \ 1776 und HB101 (H.W. Boyer . et al., J. Mol. Biol.,^: Bd. 41(1969), S. 459, die in den vorstehenden Beispielen verwendet wurden, sind bekannt und frei zugänglich. Ferner können die Wirte aus .den hinterlegten Trans-

· · /.

formänten durch Züchtung dieser Transformänten in"L-Brühe bei $7 C erhalten werden,, um die entsprechenden rekombinanten BNAs in den Transformänten freizusetzen. Anschliessend werden Stämme, die'"gegenüber..Tetracyclin und Ampicillin empfindlich sind, als Wirte ausgewählt. ' " ' ' . ' ·

Die Plasmidvektoren pBR322 (Handelsprodukt.der Bethesda Research Laboratory), pCE-1, pTrS-3 und pGLTOI sind bekannt und frei zugänglich. Ferner können die Plasmidvektqren aus den hinterlegten Transformänten erhalten werden, indem man die rekombinanten Plasmid-DNAs in den Transformänten auf herkömmliche Weise abtrennt und die Plasmidvektoren auf entsprechende Weise, wie in'den Beispielen beschrieben, abtrennt. Beispielsweise lässt sich .pCE-1 erhalten, indem man

1 pCEIL-2 durch pstl spaltet und das gebildete gröss.ere DNA-Fragment abtrennt. Ferner wurden pTrS-3 und pTuBlP-5 als E. coli FERM-P 6735 und E. coli ATCC 31871 hinterlegt.

Claims

ERFINDUNGSANSPRUCH

1. Verfahren zur Herstellung von Interleukin-2, gekenn-., zeichnet dadurch, dass man eine mit einer rekömbinanten DNA· transformierte, e'ukäryontische oder prokaryontische , Zelle, die zur Bildung von Interleukin-2 in der Lage

ist, in einem Züchtungsmedium züchtet und,das gebildete Interleukine gewinnt, -wobei die rekombinante DNA ein für ein Polypeptid ,mit der Aktivität von Interleukin-2 kodiertes Gen und eine Vektor-DNA,die zur Replication 1.0 in den Zellen in der Lage ist, aufweist und wobei sich die kodierende Sequenz des Gens in einer Stellung ab_T wärts-von,· einer Promotorsequenz befindet.
2. Verfahren "nach Punkt !,'gekennzeichnet dadurch, dass das Gen mit einer Messenger.-RNA hergestellt worden ist, die durch eine Interleukin-2 bildende Säugetierzellinie erhalten worden ist.
3. Verfahren nach Punkt . 2., gekennzeichnet dadurch, ²^ dass es sich bei der Säugetierzelle um einen humanen T-LymphOzyten, einen transformierten humanen Lymphoz.yten oder ein T-Zellhybridom handelt.

U". Verfahren nach Punkt -2, gekennzeichnet dadurch, dass die Messenger_rRNA als Sediment mit 11- bis 12S bei der Saccharosedich-tegradientenzentrifugation erhalten worden ist.
5. Verfahren nach Punkt' 1, gekennzeichnet dadurch, _ dass das Gen mit'Restriktionsendonuclease gespaltene

Stellen in der Reihenfolge BstNI, Xbal und BstNI vom ·. 5'-Ende der kodierenden' Sequenz her aufweist.
6. Verfahren'nach Punkt 1, gekennzeichnet' dadurch, 3-> ' dass da's Gen mit Restriktionsendonuclease gespaltene Stellen in der Reihenfolge Ddel, Hinfl, BstNI, Xbal,

BstNI und Sau3A vom 5'-Ende der kodierenden Sequenz her aufweist. '
7. Verfahren nach Punkt 1 » gekennzeichnet dadurch,

dass das Gen die in Fig. 2 (a) gezeigte Basensequenz aufweist. ·
8. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, dass die Basensequenz des Gens mit der ATG-Sequenz in den Stellungen 48 bis 50 beginnt und die sequentiellen Basen im Anschluss an die ATG-Sequenz mindestens bis zur ACT-Sequenz in den Stellungen 504 bis 506 in Fig. (a) gehen.

9- Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, dass die Basensequenz des Gens mit- der GCA-Sequenz in den Stellungen 108 bis 110 beginnt und die sequentiellen Basen im Anschluss an die GCA-Sequenz mindestens bis zur ACT-Sequenz in den Stellungen 504 bis 506 in

Fig. 2 (a) gehen. ..-..· . . .
10. Verfahren nach Punkt T, gekennzeichnet dadurch, dass die Basensequenz des Gens mit der CCT-Sequenz in.den Stellungen 111 bis 113 beginnt und die sequentiellen Basen im Anschluss an die CCT-Sequenz mindestens bis

·. zur AGT-Sequenz in den Stellungen 504 bis 506 in Fig. (a) gehen* . ' .

. Verfahren nach Punkt ' 1, gekennzeichnet dadurch, dass die Basensequenz des Gens bei A in Stellung 1 beginnt und die sequentiellen Basen im Anschluss an A bei der ACT-Sequenz in den Stellungen 504 bis 506 in Fig. 2 (a) enden.
12. Verfahren nach einem der Punkte 8 bis 10, gekennzeichnet ÖadurOh, dass die Basensequenz des Gens bei der ACT-Sequenz in den Stellungen 504 bis 506 in Fig. (a) endet. . ..

13- Verfahren nach Punkt 1,gekennzeichnet dadurch,

dass 'die Basensequenz des Gens bei A in Stellung 1 beginnt und die sequentiellen Basen im Anschluss an A bei , der TGA-Sequenz in den Stellungen 507 bis 509 in Fig." (a ) enden.
14. Verfahren nach einem der Punkte 8 bis 10, gekenn- ^: zeichnet dadurch, dass die Basensequenz des Gens bei

der TGA-Sequenz in den Stellungen 507 bis 509 in Fig. 10. (a) endet.

.15. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, dass die Basensequenz des Gens bei A in Stellung 1 beginnt und die sequentiellen Basen im Anschluss an A bei C.in Stellung 801 in Fig. 2 (a) enden.
16.. Verfahren nach einem der Punkte 8 bis 1O, gekennzeichnet dadurch, dass die Basensequenz des Gens bei Cvin Stellung 801 in Fig. 2 (a) endet. '

: '
17. Verfahren nach einem der Punkte 8 .bis 10, gekenn-'· zeichnet -dadurch, dass die Basensequenz des Gens bei Poly (A) in Fig. 2 (a) endet.
18. Verfahren nach Punkt 7, gekennzeichnet

- dadurch, dass die Basensequenz des Gens der Aminosäuresequenz I in Fig. 2 (b) entspricht. '

. Verfahren nach einem der Punkte 7, gekennzeichnet dadurch, dass die Basensequenz des Gens der Aminosäuresequenz II in Fig. 2' (b) entspricht.
20. Verfahren nach Punkt 7, gekennzeichnet dadurch, dass die Basensequenz des Gens der Aminosäuresequenz . III".in Fig. 2 (b) entspricht.

.Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, dass die prokaryontische Zelle zur Gattung Escherichia

.- 53 -

gehört.
22. Verfahren nach Punkt . 1, gekennzeichnet dadurch, dass die prokaryontische Zelle zu Escherichia coli /gehört.^:-

. Verfahren nach·Punkt 1; gekennzeichnet dadurch,

- dass die eukaryontische Zelle zur Gattung Saccharomyces gehört.

24 . Verfahren nach" Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, dass die eukaryontische Zelle zur Gattung Saccharomyces cereviseae gehört.

.'Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, ,15 dass es sich bei der eukaryontischen Zelle.um eine mit SV^O transformierte Affenzelle handelt, die konstitutiv grosses T-Antigen exprimiert.

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