DD219771A5 - Verfahren zur herstellung neuer konjugierter verbindungen von vinblastin und seinen derivaten - Google Patents
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Abstract
Verfahren zur Herstellung neuer konjugierter Verbindungen des Vinblastin und seiner Derivate. Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung neuer konjugierter Verbindungen von Vinblastin und bestimmter bekannter Derivate desselben mit Proteinen, Proteinfragmenten, Aminosaeuren oder Aminen, die als Antitumormittel verwendbar sind. Diese Verbindungen entsprechen der folgenden allgemeinen Formel in welcher A eine "Bruecke" wie -COCH2-, -COCH2-CH2CO- oder COCH2-CH2-CH2CO darstellt, R1 einen gegebenenfalls modifizierten Proteinrest, eine Aminogruppe NR3R4, Chlor oder eine ueber die Aminofunktion gebundene Aminosaeureestergruppe bedeutet und R2 fuer eine Methoxygruppe, eine Aminogruppe oder einen alpha-Aminosaeurerest steht, der durch eine Amidbindung gebunden ist und dessen Estergruppe ein bis sechs Kohlenstoffatome enthaelt, wobei R3 und R4 Alkylgruppen mit ein bis drei Kohlenstoffatomen oder gemeinsam eine Alkandiylgruppe mit drei bis fuenf Kohlenstoffatomen darstellen. Formel
Description
W "i mm.
Verfahren zur Herstellung neuer·konjugierter Verbindungen von Vinblastin und seinen Derivaten ' '
Anwendungsgebiet der Erfindung ' ; /
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung .ηθμθΓ.konjugierter Verbindungen von Vinblastin und von bestimmte:, bekannten Derivaten desselben mit Proteinen, Proteinfragmenten, Aminosäuren oder Aminena die als Antitumormittel verwendet werden.
Charakteristik der bekannten technischen Lösungen ; '
Das Vinblastin und bestimmte seiner Derivate, insbesondere das Vincristin oder> das Vindesin, wurden bereits mit Proteinen, bei- .spielsweise mit. Albumin oder verschiedenen Immunoglobulinen gekuppelt. Daraus resultieren Kupplungsprodukte oder Verbindungen,, die ''konjugierte Verbindungen" genannt werden. Wir beziehen uns insbesondere auf die folgenden Literaturstellen: . .
- J.D.Teale, Jacqueline M.CIough et V.Marks, Br.J.Clin.Pharmac. 4, 169-172 ,1977
-'C,H„J.Ford, C.E.Newman, J.R.Johnson, C.S.Woodhouse, T.A.Reeder, G.F.Rowland, R.G,Simmonds, Br.J.Cancer 17, 35-42, 1983
- M.J.Embleton, G.F.Rowland, R.G„Simmonds, E.Jacobs, C.H.Marsden, , R.W.Baldwin Br.J,Cancer 47,43-49, 1983
-J.R.Johnson, C,H.J.Ford, C.E.Newman, C. S. Wood house, G.F.Rowland, R.G.Simmonds Br,J.Cancer , 44, 472-475, 1981
- EU Lilly Eur.Pat.Applic. , Publ. n°56.322, 21.07.82
- R.A. Conrad, G.J.Cullinan, K.Gerzon, G.A.Poofe J.Med.Chem. 22, 391. 1979 ;
Die Kupplung dieser bis-Indol- Derivate wurde nicht nur zu dem Zweck vorgenommen, neue immunologisch reaktive Stoffe zu entwickeln,
erfolgte ' - .,v , .
sondern /Vw allem im Hinblick auf die Herstellung von Antitumcrmitteln, die aktiver, selektiver und weniger toxisch sind,
' 0 0 f ! ; 4 ' '.' ν ·' " ' i ν '
63 939 18
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Zu diesem letztgenannten Zweck wurden zahlreiche konjugierte Proteinverbindungen mit anderen Antitumormitteln bisher studiert. Das gilt insbesondere für konjugierte Verbindungen eines Antikörpers und eines Ricin-Fragjaents oder für konjugierte Verbindungen von Albumin und Methotrexat (französische Patentanmeldung Hr. 2 437 213, C M Industriesf B.C.F. Ohu, S.B. Howell J. of Pharmacology and Ixp. Therapeutics, 219 (2), 389-393, 1981). V
Die monoclonalen Antikörper, insbesondere solche menschlichen Ursprungs, die mit bekannten Antitumarmedikamenten gekuppelt sind/ sind insbesondere Gegenstand verschiedenster Untersuchungen.
Schließlich wird hervorgehoben, daß die Verwendung und Bewertung von 1:1-Komplexen von bis-Indoalkaloiden mit Tubulin in der belgischen Patentschrift Nr, 854 053 beschrieben wurde, In bestimmten Fällen kann sich dadurch eine geringere Toxizität und eine stärkere chemotherapeutische Wirksamkeit als für die entsprechenden freien Alkaloide ergeben.
Die durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellten neuen Verbindungen stellen Antitumormittel dar, die aktiv, selektiv und wenig toxisch sind.
Der üirfindung liegt die Aufgabe zügrunde, ein Verfahren zur Herstellung von neuen konjugierten Verbindungen von Vinblastin zur Verfugung zu stellen. '
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung neuer Produkte, die konjugierte Verbindungen von Vinblastin oder Derivaten des Vinblastin mit Proteinen, J?r ot einf ragment en, Aminosäuren oder einfachen Aminen sind, das dadurch gekennzeichnet ist, daß die Kupplung über eine Estergruppe vorgenommen "wird, die von der Hydroxylgruppe des 4-KOhIenstoffatoms des Vinblastin-Skeletts abgeleitet ißt. Gemäß einer bevorzugten Ausfuhrungsform ist das ! erfindungsgemäße Verfahren dadurch gekennzeichnet, daß das Protein, das Proteinfragment oder das Amin mit der Vinblastinverbindung über eine Brücke gekuppelt wird, die durch vorangehende Kondensation des Vinblastinderivats mit einer bifunktioneilen organischep Verbindung, die gegebenenfalls aktiviert ist, hergestellt wurde.
Das U-O-Desacetylvinblastin-Derivat kann beispielsweise das Vindesin, das 4-O-Desacetylvinblastinsein, das am 3-C mit einer Aminosäure gekuppelt ist oder das 4-O-Desacetyl-i}' desoxy- -Vinblastin oder ein 23-Vinblastinoylesterderivat- einer Aminosäure. . K " .
Das Verfahren gestattet insbesondere die Herstellung von Verbindungen, die der folgenden.allgemeinen Formel entsprechen:
CH3OOC
CH3O
"*"" A mmm κ ι
CO
in welcher A eine "Brücke" wie das -COCH2- oder -CO(CH2)n-CO-·.-darstellt, wobei η von 1 bis 5 variiert, PL einen gegebenenfalls modifizierten Proteinrest bedeutet, Ro für eine Methoxygruppe, eine Aminogruppe oder einen alpha-Aminosäurerest steht, der durch eine Amidbindung gebunden ist und dessen Estergruppe ein bis sechs Kohlenstoffatome enthält,und R, ein Wasserstoffatom öder eine Hydroxylgruppe bedeutet, die jeweils in den beiden möglichen Konfigurationen vorliegen können, sowie von Additionssalzen derselben·mit einer mineralischen oder organischen Säure. · , ...
Es versteht sich, das die Acetat-, Hemi-succinat -, Hemiglutarat· Brückender ein höheres Homologes beispielsweise durch eine Alkyl- oder Am'inogruppe substituiert sein kann, ohne daß die Wirkung verloren geht, die die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Verbindungen kennzeichnet.
Bei den Arbeiten des Standes der Technik wurde die Bindung über ein Amidbindeglied im Bereich der23-Vinblastoylfunktion des bis-Indolderivats bewirkt. In überraschender Weise haben wir festgestellt, daß die Antitumorwirkung besser' bewahrt . bleibt, wenn die Bindung am ^-Kohlenstoffatom und nicht am 23-Kohlenstoffatom vorgenommen wird. , .
Gemäß der Erfindung werden die Derivate in einer ersten Stufe durch Kondensation von Chloressigsäurechlorid öder eines Anhydrids, beispielsweise des Cloressigsäure-, Bernsteinsäure-, Glutarsäure-Anhydrids oder eines höheren Homologen an dem ^-G-Hydroxyl des 4-0-Desacetylvinblastin oder eines Derivats der Art des iJ-O-Desacetylvinblastin-J-carboxamids hergestellt.
^Derart hergestellte 4-Chloracetat-, Hemisuccinat- oder Hemiglutarat -Derivate werden nun in einem Lösungsmittel, in welchem diese Verbindungen löslich sind, mit dem Protein, der Aminosäure oder dem einfachen,Amin kondensiert. Zu diesem Zweck kann man eine Mischung von Wasser und Dioxan verwenden, die mit Hilfe eines Puffers, beispielsweise eines Borat-Puffers, auf einem entsprechenden pH-Wert gehalten wird. Eine Bestätigung der Kondensation erfolgt durch Chromatographie oder Elektrophorese. In diesem letztgenannten Fall kann man radioaktives Vinblastin v; (beispielsweise tritiiert) zur.Erleichterung der Kennzeichnung verwenden. . . ' '
Die Gewinnung des Chloracetats am 4-K'ohlenstoff des Vinblastin wird, von W.W. Hargrove Lloydia, 27 (4), 3,^2, 1964 beschrieben. Es kann auch durch Einwirkung des Chloressigsäureanhydrids auf das Desacetylvinblastin in Dichlormethan erhalten ;werden.
Vom chemischen Standpunkt aus läßt sich die Kondensation mit ,den Proteinen durch die Gewinnung kovalenter Bindungen erklären, die durch die Reaktion der Aminogruppen des·Proteinlysins mit dem aktivierten Chlor der Chloracetatfunktion oder mit der. aktivierten Estergruppe des Hemisuccinat- oder Hemi-·,. glutarat-Derivats entstehen. ' ,
Das Albumin aus Rinderserum weist beispielsweise 56aminierte . Lysinreste auf .Die. Anzahl der Vinblastinmoleküle pro Protein variiert in Abhängigkeit von den Arbeitsbedingungen, wird iir, allgemeinen jedoch/zwischen 1 und 3^ liegen, ·
ι . ' .
Die Aktivierung kann in klassischer Weise' durch Behandlung mit einem Alkylchloroformiat, vorzugsweise mit Äthyl- oder Isobutyl-Chloroformiat3 in Gegenwart einer Aminobase, wie dem N-Methyl-Piper'idin oder dem N-Methyl-Morpholin vorgenommen werden. ._, l ,"""'""
ι ' λ '.' . j
Die Kondensation kann mit der das aktivi-erte Anhydrid enthaltenden Reaktionsmischung in situ vorgenommen werden. In den meisten Fällen kann das aktivierte Anhydrid jedoch -auch isoliert werden. / ! ;
Die erhaltene konjugierte Verbindung wird auf klassische Weir-e. . wie es in der Chemie oder im Fall konjugierter Proteinver-. bindungen, in der Biochemie üblich ist, isoliert. Die konjugierte Proteinverbindung wird dabei durch. Zusatz von Aceton aus dem . Reaktionsmedium ausgefällt, dann'zentrifugiert, gewaschen, : lyophil-isiert und durch Gelfiltration gereinigt. Gegebenenfalls kann man das so erhaltene Derivat einer klassischen Succinylierungsreaktion unterwerfen, wodurch;Aggregationsprobleme, die für bestimmte konjugierte oder nicht konjugierte Proteine, charakteristisch sind,vermieden werden.
Die vorteilhafter^weise verwendeten Proteine sind insbesondere das Albumin aus Rinderserum oder.Humanserum, das Fötuin oder Immunoglobuline, wobei diese letzteren gegebenenfalls durch-
In diesem letztgenannten Fall hat sich die Verwendung monoc.-lonaler Antikörper menschlichen Ursprungs, die eine bestimmte, Wirkung gegenüber menschlichen Tumoren zeigen,als' besonders interessant erwiesen. ' /..·.. ,' '.
Die verwendeten Proteine können auch im Hinblick auf eine selektive. Modifizierung behandelt werden. Diese Modifizierungen gestatten die Gewinnung,konjugierter Proteinverbindüngen, die bei ihrer therapeutischen Verwendung bevorzugt im Bereich bestimmter Gewebe,beispielsweise im Bereich der Leber,angereichert werden.So ist es möglich, vor der Kondensation des' Vinblastin- . derivatS;mit dem Protein dieses letztere - zugalakto.sylieren. Die Galaktosylierung wird beispielsweise durch Anwendung der , von G.Wilson in The Journal of Biochemistry, 253· (7) 2070-2072, 1978 beschriebenen Methode vorgenommen.
,Die, mit diesen erfindungsgemäßen Verbindungen vorgenommenen in-vitro-Versuche zur Aufzeigung ihrer Antitumorwirkung deuten darauf hin, daß die Bildung der konjugierten Verbindung über die C-4-Biridung vorteilhafter sein kann wenn die Bindung über C-3 .
Die Kupplung über das 3-Kohlenstoffatom. des Vinblastin oder «einer Derivate erfolgt auf klassische Weise dadurch,1 daß in. ,.einer ersten1 Stufe das Hydrazid am C-23 (Carbohydrazid) und ,dann durch, Nitrosiierung das entsprechende Azotierungsprodukt der Säure gebildet wird. Das Azot ierungsprodukt wird dann direkt mit den;-Protein gekuppelt. . Λ .
K . .. :
Dieses Azotierungsprodukt der Säure kann jedoch auch in ebenfalls bekannter Weise mit einem Aminosäureester, beispielsweise.einem Methylester, kondensiert werden. Die Esterfunktion der Aminosäure kann ihrerseits einer Hydrazinolyse und dann einer Nitrosierung unterzogen werden. Das neue ',Säureazotierungsprodukt. der Kupplungs verbindung Amihosäure-Vinblastin wird dann mit dem Protein konden siert. In diesem Fall stellt die Aminosäure das Bindeglied dar,. -
- 7 -
das das Protein mit dem Vinblastinmolekül vereinigt.
Auf diese Weise wurden Kondensationverbindungen erhalten, die am C-3 oder C-'4 gekuoüelt und am 0-4 desacetyliert und, beispielsweise folgendermaßen aufgebaut sind:
a) Kupplung über den C-3-Kohlenstoff " . 5Vinblastin/Fötuin, über C-3 gekuppelt (FötVDS-C-3) Vinblastin/Fötuin, succinyliert und über C-3 gekuppelt (FOt(S)-VDS-C-?) Vinblastin-Isoleucyl-Fötuin (Föt-Ile-VDS-C-3) ! Vinblastin-Tryptqphyl-Albumin aus, Rinderserum (RSA-TrpV-C-3) (Beispiel 1) :
Vinblastin-Tryptophyl-succinyliertes Albumin aus Rinderserum (RSA(S)-TrpV-C-3) . . '.' '..
b) Kupplung über den C-il-Kohlenstoff "Vindesin-4-O-Chlorac.etat (Beispiel 2) .
. yindesin-^-O-Chloracetat + Albumin aus Rinderserum (RSA-VDS-C-'I) (Beispiel 3a) . .
Vindesin-4-O-Chloracetat + succinyliertes Albumin aus Rinder-. serum·(RSA(S)-VDS-C-4h (Beispiel 3b)
Vindesln-^-O-Chloracetat + Albumin, aus Humanserum (AH-VDS-C-·1!) (Beispiel Ha) ' · "^
Vindesin-4-O-Chloracetat .+ galaktosyiliertes Albumin aus, Humanserum (AHgäl-VDS-C-4). (Beispiel 4b) . '
Vindesin-4-O-Chloracet.at + Pynrolidin . ".-.
. Vinblastin-C-3-Athyl-Isp.leucinat-'4-O-Chloraceta't' (Beispiel 5) Vinblastinoyl-23-Äthyl-Isoleucinat-4-Ό-Chloracetat + succinyliertes Albumin aus Rinderserum (RSA(S)-VIle-C~4) (Beispiel 5) ' Vindesin-4-O-Hemisuccinat + Py'nsslidin (Beispiel 6) Vindesin-4-O-Hemisuccinat + Albumin aus Rinderserum '(RSA-Sücc-VDS) (Beispiel 7)
Vindesin-4-O-Hemisuccinat +Albumin aus Humanserum (AH-Succ-VDS) (Beispiel .8) . > ... ;
Vindesin-4-O-Hemisuccinat + galaktosyliertes Albumin aus Humanserum (AHgal-Succ-VDS) (Beispiel 9)
;v ' ' :/ - 8 - ' Λ .' -Λ" '
yindesin-^-O-Hemisuccinat +.unspezifische Immunoglobuline (IgG)(IgG-SuCC-VDS) (Beispiel 10)
Vindesin-4-O-Hemisuccinat + IgG anti-Milch-Fettglobuli / (IgGanti-MFG) (IgG anti-MFG^Sücc-VDS) (Beispiel 11) , , Vinblastin-^-O-Hemisuccinat + Pyoollidin (Beispiel .12) Vinblastin-^-O-Hemisüccinat + Äthyltryptophänat.(Beispiel 13) Desoxyvinblastinoyl'-^-Äthyltryptophanat^-O-Hemisuccinat . + ·, . Pyrrolidin (Beispiel l4) . '· ; ' DesoxyvinbIastinoyl-23~Äthyltryptöphanat-4-0-Hemisuccinat + Albumin aus Rihderserum (RSA-Succ-DesoxyVTrpE) (Beispiel 15) Deso^xyvindesin-4-O-Hemisuccinat + Äthyltry.ptophanat (Beispiel 16) Vinblastinoyl-23-Äthy^ltryptophanat-4-0-Hemisuccinat + Pyrrolidin (Beispiel 17) ·
Vinblastin-4-O-Hemiglutarat + Pyrrolidin (Beispiel 18).
.Die folgenden Beispiele erläutern in nicht einschränkender Weise das erfindungsgemäße Verfahren. .-'
A. Kupplung über den C-3-Kohlenstoff ;
Beispiel 1 . . , ; · . ;
Vinblastin-Tryptophyl-Albumin aus Rinderserum (RSA-Trp V-C-3)
' .,'. ' , ' ' '
in einen mit Rückflußkühler ausgestatteten Kolben wird der radioaktive ^-Öesacetyl-VBL^-Trp-Methylester (250 mg, 0,26,'mmol) in .^,5 ml. einer 1:1 (v/v)-Lösung von wasserfreiem Hydrasin ir. Äthanol eingebracht. Die Lösung wird fünf Stünden bei 60° C und während einer Nacht bei Raumtemperatur unter Stickstoff gerührt. Die Mischung wird- abgekühlt, mit 50 ml entionisiertem ' Wasser und 50 ml gesättigter NatriumchloriÜlösung verdünnt und mit dreimal 50 ml CHpCIp extrahiert. Die organischen Phasen .werden vereinigt, nacheinander mit' 50 ml Wasser und 100 ml gesättigter NaCl-Lösung gewaschen sowie über Na2SO^. getrocknet. Nach dem Abdampfen des Lösungsmittels werden 217, mg (0,23 mmol)
" . - , ' .,- 9 -: , : · " ·. :
4-Desacetyl-VBL~~Trp-Monohydrazid isoliert, die man ohne Reinigung in den folgenden Reaktionen einsetzt. . .
Das 4-Desacetyl-VBL-Trp-M6nohydrazid (0,23 mmol) wird in einer Lösung von 5 ml Methanol und 16 ml IN HCl gelöst. Die Lösung wird auf -10° C abgekühlt und unter starkem Rühren werden 45 mg NaNOp zugesetzt. Nach 10 Minuten wird der pH-Werr. der Lösung mit Hilfe einer gesättigten NaHCO-.-Lösung auf 8,5 eingestellt.. Das Azid wird rasch mit mehreren Portionen kaltem CHpCIp extrahiert. Dir organischen Phasen werden verr ' . einigt, über Na2SOj. -getrocknet'und im Rotationsverdampfer eingeengt. Das CHpCIp wird laufend durch Dioxan ersetzt.
Das in Dioxan gelöste Azid wird tropfenweise in äquimolarer Menge zu einer Lösung von RSA (269 mg) in ..0,1N Na2JiPO1.-, das mit verdünnter Natronlauge auf pH 9 eingestellt ist, zügesetzt. Nach beendeter Zugabe wird der pH-Wert, mit IN NaOH auf · ;. 9 eingestellt. Die Mischung wird 72 Stunden bei Raumtemperatur ; gerührt. Das überschüssige Azid wird durch Zusatz von 100 ul lO^igem NH1,OH und Rühren während einer Stünde zerstört. Das Frotei: wird durch Zusatz von 6 V-Teilen kaltem Aceton ausgefällt und zentrifugiert (Centrifugeuse Internationale 30 min, 1500 UpM). ,-Der Rückstand wird zweimal mit kaltem Aceton gespült und lyophilisiert. Die konjugierte Verbindung wird durch Chromatographie über Sephadex G 2F> gereinigt. Die die konjugierte Verbindung enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und entweder : lyophilisiert oder durch Ultrafiltration mit einer Diaflo- . ,
Membran konzentriert. Die Ausbeute beträgt 270 mg RSA-Trp-V-C-3·
B. Kupplung über den C-4-Kohlenstoff
Beispiel 2 · , ' ' " -
Vindesin-^-O-Chlorazetat
In einen Kolben werden ÖS92 mmol Vindesin, 25 ml CHpCIp und 4,1 mmol Chloressigsäzreanhydrid eingebracht. Die Lösung wird 14 Stunden' im Finteren gerührt. Man setzt 25 ml Methanol ,zu und rührt zwei Stunden lang bei Normaltemperat-ur. Das Lösungsmittel wird unter Vakuum abgedampft, der Rückstand in 500 in] CHpCIp gelöst und in der Kälte mit einer verdünnten ,wässerigen
-ΙΟ-
Ammoniaklösung gewaschen. Nach dem Abdampfen der organischen Phase wird der Rückstand in 47 ml Methanol, das 11,2 ml Wasser und 2,33 g Siliciumdioxyd enthält, gelöst. Die Mischung wird 6 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Siliciumdioxyd wird durch'Filtration abgetrennt und mehrmals mit heiße'm Methanol gewaschen. Das Filtrat wird1 unter Vakuum eingedampft, mit einer verdünnten Ammoniaklösung alkalisch gemacht und mit CH0Cl0 extrahiert: Die Extrakte werden vereint, über Na0SOu getrocknet und zur Trockene eingedampft. Die Reinigung erfolgt auf einer Siliciumdioxyd-Kolonne durch Eluierung mit einer Mischung von CH2C12:5% MeOH. Ausbeute 88%,
IR-Spektrum : 3-470, 3040, 2970, 2880. 1740, 1690, 1615, 1510,
1500, 1430, 1225, 1190, 1010, 740 cm"1
Massenspektrum 830 (M + 1), 813, 796, 773, 754, 297, 277, 293, 108 NMR-Spektrum: t · ppm 8(lH,s,NHind),
7,45(1H,d), 7,2-7,0(4H,m), 6,9(1H,d), 6,5(1H,s), 6,05(lH,s, 5,$(lH,m). 5,5 (IH,m), 5,28(1H,d), 4,O(2H,CH2C!).
3,7(3H,s,-CO2CH3), 3j,55(3H,s,OCH3). 2,8(3H,s,NCH3), 0,9-0,65(8H,m).
Beispiel 3 ' · ^ ,
a) Kupplung über C-4 des 4-0-Desacetyl-Vindesin (RSA-VDS-C-4)
Das radioaktive C-4-Chloracetat des O-4-Desacetylvindesin GL50 mg), gelöst, in 5 ml Dioxan, wird zu einer Lösung von 2l6 ng RSA (Albumin aus Rinderserum, CaI Biochem) in 5 ml Borat-Puffer 0,4 «M pH 9,0 zugetropft. Die Mischung wird bei Raumtemperatur 4 8 Stunden gerührt. Die konjugierte Verbindung wird durch Zusatz von 6 V-Teilen Aceton ausgefällt und 30 Minuten bei 1'3OO UpM zentrifugiert. Der Rückstand wird zweimal mit Aceton gewaschen und unter den'gleichen Bedingungen zentrifugiert. Nach diesen beiden Spülungen wird der Niederschlag lyophil-isiert und durch Filtration über G-25-Gel (3x90 cm), das in einer Lösung von NHhHCO-, -0,1 M pH 7,8 äquilibriert wurde, gereinigt. Der ausgeschlosserte Peak wird gewonnen und lyophil-isiert. Der Protein-' •.gehalt wird durch das Lowry-Verfahren gemessen und ,der Alkaloidgehalt durch Messung der Radioaktivität bestimmt.
Die erhaltene konjugierte Verbindung enthält 2,5 mol VindVsin pro mol RSA. Durch Chromatographie über Agarose-Gel zeigt sich, daß die Radioaktivität sehr wohl an die Proteine gebunden ist.
b) Succinylierung (RSA(S)-VDS-C-M)
Die konjugierte Verbindung wird in Wasser in einer Konzentration von 100 mg pro 5 ml Wasser gelöst und der pH-Wert der Lösung mit 0,1 N Natronlauge auf 7 eingestellt. Anschließend werden 55.mg Succinylanhidrid in kleinen' Portionen zugesetzt. Durch Zusatz von 0,1 N Natronlauge wird der pH-Wert, auf 7 gehalten. Wenn der pH-Wert stabil wird, setzt man noch 55 mg Succihyfenhidrid zu. Die.Lösung wird eine Stunde bei-Raumtemperatur gerührt, bei 0° C eine Nacht lang gegen Wasser dialysiert und lyophilisiert Die Prot-ein-und Alkaloidgehalte werden nach den unter a) beschriebenen Verfahren bestimmt. , , :
Beispiel 4 ; .
a) Kupplung über C-I' des, 4-0-Desacetyl-Vindesin (AH-VDS-C-4)
Das C-4-Chloracetat des radioaktiven 4-0-Desacetyl-Vindesin (140 mg), gelöst in 3 ml Dioxan, wird zu einer Lösung von 200 mg Humanalbumin (Merieux), in 2 ml Borat-Puffer 0,34 M pH 9,0 züge-tropft'. Die Mischung'wird 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die konjugierte Verbindung wird durch Zusatz von β V-Teilen .Aceton ausgefällt und 30 Minuten bei 1300 UpM zentrifugiert. Der Niederschlag wird zweimal mit Aceton gewaschen, und unter,den1 gleichen Bedingungen zentrifugiert. Nach diesen beiden Spülungen· wird der Niederschlag lyophil-isiert und durch Filtration über G-25-Gel (3x90 cm) welches in einer Lösung von NH1JHCO, 0,1 M pH 7, S äquilibriert würde, gereinigt. Der ausgeschlossene Peak wird ge-·' wonnen und lyophilr.isiert. Der Proteingehalt wird durch das Verfahren von Lowry gemessen und -der Alkaloidgehalt durch Messung der Radioaktivität bestimmt. Die erhaltene konjugierte Verbindung enthält 2,6 mol Vindesin pro mol AH. . '.'
,. : : -; . · ·. -i2 - " . ; ' : .
b) Kupplung über .C-4" des 4-0-Desacetyl-Vindesin (AHgal-VDS-C-4)
Das C-^-Chloracetat des radioaktiven 4-0-Desacetyl-Vindesin (51 mg),· gelöst in 2ml Dioxan, wird zu einer Lösung von 200 mg AHgäl in 17 ml PBS und 3,1 ml Borat 1,7 N pH 9 (Phosphatpuffer) ' zugetropft. Die Mischung wird 2'4 Stunden bei Raumtemperatur gerührt . .Die konjugierte Verbindung wird durch Zusatz .von 6 V-Teilen Aceton ausgefällt und 30 Minuten bei 1300UpM zentrifugiert. Der Rückstand wird zweimal "mit Aceton gewaschen und unter den gleichen Bedingungen zentrifugiert. Nach diesen beiden Spülungen wird der Niederschlag lyophil-isiert und durch Filtration über G-25-Gel (3x 90 cm), das in einer Lösung von NH11HCO5 · 0,1 M pH 7,8 äquilibriert wurde, gereinigt. Der ausgeschlossene Peak wird gewonnen und lyophil-isiert. -Der Proteingehalt wird nach dem Ldwry-Verfahren gemessen und der Alkaloidgehalt durch Messung der Radioaktivität bestimmt. Die erhaltene konjugierte' Verbindung enthält 0,4 möl Vindesin pro mol AHgäl.'
Beispiel 5 - ... ' . .
il-O-Chloracetat des N(4-OrDesacetyl-3-decarbomethoxy-\vinblastin-23-oyl)-L-äthylisoleucinat (RSA(S)-VIIe-C-^)
Nach der Vorgangsweise von Beispiel 2 erhält man, ausgehend von dem entsprechenden Vinblastinderivat (vergleiche belgische Patentschrift 889 136),die Verbindung Vinblastin-C-3-äthylisoleucinat-1!-0 Chloracetat in einer Ausbeute von 85%· .-'...
IR-Spektrum: V 3470, 3H10, 3040, 2970/ 2880, 1740, 1680, 1615,
1500, 1460, 1430, 1300, 1225, 1190, 1150, 1010, 740 cm"1
Massenspektrum : 988 (M+17), 973(M+2), 939, 917, 391 #236, 94
NMR-Spektrum: ppm 9,85 (1H,s,OH),
8.6(1H,s,NH), 7,55(1H,d), 7,4(1H,d). 7.2-7,0 (m,3H), 6,65(1H.s), 6,1(1H.s), 5,85(1hl,m), 5,58(lH,s), 5,32(1H,m)/ 4,6(lH,q), 4,2(2H,m), 4,0(2H), 3,78(3H,s), 3,1(3H,s), 2,7(3H,s), 1,28(3H,t), 1,0-0,8(14H,m).
Nach der im.Beispiel 3 beschriebenen Verfahrensweise erhält man das RSA(S)-VIle-C-4.
Vindesin~4-0-Hemisuccinat -Pyrrolidinamid
Unter Anwendung einer analogen Verfahrensweise wie jener von Beispiel 12 erhält man ausgehend von Vindesin die entsprechende konjugierte Verbindung in einer Ausbeute von 62%. .
V . .·';' ..
Massenspektrum (DCI ,Isobutan ) : 921 (M+14), 907 (M) IR (CHCI35 4%) : 3400, 2975, 2882, 1732, 1693, 1632, 1503, 1462, 1380, 12147 cm"1.
RMN (360 MHz, CDCI3) 8,05 (1H,H17), 5,46(1H,H15), 3,96 (1H,H17'a), 3,80(3H,OMe), 3,64 (3H,OMe), 3,45 (2CH.,-Pyrrolidin ), 2,88 (3H.N-CH3), 0,95 (3H,CH3), 0,83 (3H^CH3).
Herstellung des 4-O-Hemisuccinats von Vindesin und Kupplung mit Rinderserum-Albumin (RSA-Succ-VDS). /
In .einen. Kolben werden 0,125 mmol Vindesin, 0,187 mmol . Succinylanhydrid und 4 ml wasserfreies Methylenchlorid eingebracht. Die Lösung wird unter Ausschluß von Licht 14 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Dann wird die Lösung in ein Eis-. bad getaucht. Man setzt O,25o mmol Triäthylamin, O,25o mmol Xthylchloroformiat und 5 ml Dioxan zu. Man rührt eine halbe Stunde. Unabhängig davon bereitet man eine Lösung von 90 mg RSA in 17,3 ml; Wasser und tropft-17,3 ml Dioxan zu. Der pH-Wert wird mit 1 N/ Soda auf 8,5 eingestellt. .Die Lösung,wird auf 5° C abgekühlt. Nach, einer halben Stunde wird der aktivierte . Ester zu der RSA-Lösung zugesetzt. Die Lösung wird vier Stunden
. - . " ., .. - 14 - , ..:
bei 5° C. gerührt, yobei der pH-Wert durch Zusatz von IN . NaOH auf 8,5. gehaiVen/. Die Ausfällung der konjugierten Verbindung und. ihre Charakterisierung werden wie oben be-' schrieben vorgenommen. Das Molverhältnis liegt bei etwa 18 und bleibt nach der Chromatographie Über Sepharose 6B in Gegenwart von 6M Guanidin konstant. ,
Beispiel 8 ; > .
' · -.- .. ' ' "" . . ' ... . ί Vindesin-4-O-Hemisuccrnät und Kupplung mit Humanalbumin .
0,28 mmol (210. mg) Vindesin, 42 mg (0,4 mmol) Succinyianhydrid und 6 ml wasserfreies Methylenchlorid werden in einen Kolben eingebracht. Die Lösung wird Unter Ausschluß von Licht 14 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wird abgedampft. Der Rückstand wird in 4,7 ml Dioxan:· aufgenommen. Dann wird die Lösung in ein Eisbad getaucht. Man setzt 0,56 ml- Triäthylamin in 3,5 ml Dioxan und 0,56 ml Isobutylchloroformiat in 3,5 ml Dioxan zu.
Man rührt eine Stunde. Unabhängig davon wird eine Lösung von 208 mg AH in 38 ml Wasser bereitet und 26 ml Dioxan werden zugetropft. Der pH-Wert wird mit. 1 N Soda . auf 8,5 einge~( stellt. Die'Lösung wird auf 5° C abgekühlt. Nach 1,0 Stunden wird der aktivierte Ester zu der Lösung des Humanalbumins zu- :' 'gesetzt. Die Lösung wird 14 Stunden bei 5 C gerührt,- wobei der pH-Wert durch Zusatz von 1 N'NaOH auf 8,5 gehalten wir'd. D,ie Ausfällung der konjugierten Verbindung und ihre Reinigung werden in der oben beschriebenen Weise vorgenommen. Das McI- ..' verhältnis liegt bei 13,8. ; ·
' . ' ' '. '/ ' . ' % ' ' - '' ' ' . '
\ . .' l' . . ' .'· ,. .
Vindesin-4-O-Hemisuccinat und Kupplung mit galactosyliertem Humanalbumin (AHgal) (AHgal-Succ-VDS)
,-' \:'- ' - 15 - - >' : .
i
0,16 mmol (119 mg) Vindesin, 0,24 mmpl (24 mg) Succinylanhydrid und 3*4 mi wasserfreies Methylenchlorid werden in einen Kolben eingebracht. Die Lösung wird unter Ausschluß von Licht l4 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wird abgedampft. Der Rückstand wird in 2,7 ml Diöxan aufgenommen. Dann wird die Lösung in ein Eisbad eingetaucht. Man setzt 0,32. mmol Triethylamin in 2 ml Dioxan und 0,32 mmol Isobutyl- : ehloroformiat in 2 ml Dioxan zu. Man rührt eine Stunde lang. Unabhängig davon wird ,eine Lösung von 164 mg AHgal in 17,5 .ml Wasser bereitet und 25 ml Dioxan zugetropft. Der pH-Wert wird mit 1 N Soda auf 8,5 eingestellt. Die Lösung wird auf. 5° C abgekühlt. Nach einer Stunde wird der aktivierte Ester zu der AHgal-Lösung zugesetzt'. Die Lösung wird 14 Stunden bei 5° C," gerührt, wobei der pH-Wert mit 1 N Soda auf 8,5 gehalten wird. Die Ausfällung der konjugierten Verbindung und ihre Reinigung .erfolgen'in der oben beschriebenen Weise. Das Molverhältnis beträgt 21,6.. .; . .
Beispiel 10 :
Vindesin-4-O-Hemisuccinat und Kupplung mit unspezifischen Immunoglobulinen aus Ziegenserum (IgG) (IgG-Succ-VDS)
0,07 mmol (50 mg) Vindesin, 0,1 mmol Succinylanhydrid und 4 ml wasserfreies Methylenchlorid werden in einen Kolben eingebracht . Die' Lösung wird unter Ausschluß von Licht 14 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wird abgedampft. Der Rückstand wird in 1 ml Dioxan aufgenommen. Dann wird die Lösung in ein Eisbad getaucht und es werden .0,14 mmol Triäthylamin und 0,14 mmol IsObutylchloroformiat zugesetzt. Man rührt eine Stunde lang. Unabhängig davon wird eine Lösung von 66 mg IgG in 12,7 ml Wasser bereitet und 12,7 ml Dioxan werden zugetropft. Der pH-Wert wird mit 1 N Soda auf 8,5 eingestellt. Die Lösung wird auf 5° C abgekühlt. Nach einer Stunde wird der aktivierte Ester zu der IgG-Lösung zugesetzt. Die Lösung wird 14 Stunden bei 5° C gerührt, wobei der pH-Wert durch Zusatz von IN NaOH auf 8,5 gehalten wird.
Di ^Ausfällung der konjugierten Verbindung und ihre Reinigung erfqlgen in der oben beschriebenen Weise. Das Molverhältnis beträgt 9. " '
Vindesin-4-O-Hemisuccinat und Kupplung mit polyclonalen anti-Milchfettglobuli-Immunoglobulinen (IgG-anti-MFG) (IgG-anti-MFG-Succ-VDS) :
0,035 mmol VDS (25 mg), 0,05 mmol Süccinylahhydrid und 1 ml wasserfreies Methylenchlorid werden in einen Kolben eingebracht. Die Lösung wird unter Ausschluß von Licht 14 Stunden bei,Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wird.abgedampft und der Rückstand in 0,25 ml Dioxan aufgenommen. Die Lösung wird dann in ein Eisbad eingetaucht. Man setzt 0,07 mmol Triäthylamir, , und 0,07 mmol Isobptylchloroformiat zu. Man rührt eine Stunde lang. Unabhängig davon wird eine Lösung von 25 mg IgG-anti-MFG in 21,3 ml Wasser bereitet. Der pH-Wert wird mit 1 N Soda auf 10,5 eingestellt. Die Lösung wird auf 5° C abgekühlt. Nach einer Stunde wird der aktivierte Ester zu der IgG-anti-MFG-Lösung zugesetzt. Die Lösung wird 14 Stunden bei 5 C gerührt, wobei' der pH-Wert durch Zusatz von 1 N NaOH auf 8,5 gehalten wird. Die konjugierte Verbindung wird gegen 9 °/oo NaCl dialysier.t und wie oben beschrieben über Sepha-dex G 25 gereinigt. Das Molverhältnis beträgt 15·
Beispiel 12 ' ; '-
Vinblastin-il-O-Hemisuccinat-Pyrrolidinamid (DAVI'iB-Pyrrolidin)
Zu einer Lösung von 500 mg (0,651 mmol) von 4-0-Deacetylvinblastin in 15 ml wasserfreiem Dichlormethan setzt man 97,6 mg (0,976 mmol) Süccinylanhydrid zu. Die Lösung wird 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Dann kühlt man in einem Eisbad auf 0° C ab und tropft nacheinander, eine Lösung von 131,5 mg (1,,303 mmol)' Triäthylamin
in 8 ml Dichlormethan und eine Lösung von 141,2 mg (1,302 mnol) Äthylchloroformiat in 8 ml Dichlormethan zu. Man rührt eine Stunde 30 bei 0° C und setzt eine Lösung von 92,5 mg (1,302 rnmol) Pyrrolidin in 8 ml Dichlormethan zu: Man läßt auf Raumtemperatur anwärmen und rührt die Mischung zwei Stunden lang. Dann setzt man 50 ml Dichlormethan und 50 ml einer 10%igen wässrigen Natriumcarbonatlösung zu. Man rührt, dekantiert .und ,trennt die organische Phase ab. Die organische Phase, wird dreimal mit Dichlormethan-extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden mit eerier gesättigten NaCl-Lösung gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Der nach dem Abdampfen erhaltene Rückstand wird durch Chromatographie über einer SiÖp-Säule (Eluierung mit Dichlormethan/Methanol 92:8) gereinigt. Nach dem Verreiben in einer Mischung aus Äthylacetat/Cyclohexan erhält man 386 mg des Produkts in Form eines amorphen Pulvers. Ausbeute 6-456".' . · ' ' .· '
Massenspektrum ( DCI ,Isobutan ) : 936 (M + 14), 922 (M)IR (CHCL, 5%): 3477, 3015, 2980, 2885, 1741, 1635, 1505, U50, 1250
NMR-Spektrum-: , . ' .. : (CDCI3, 360 MHz, ppm) r
8,05 (NH, IH), 7,53 (IH), 7,16(3H), 6,66 (1H), 6,10 (1H), 5,85 (1H) et S,US(IH)(HIU,H15). 5,51 (1H,H17)S 3,95 (1H,H17'a), 3,78 (3H,OMe), 3,75 (3H. OMe), 3,60 (3H,OMe), 3,70(1HtH2), 3,43(7H), 3,11(2H, H5'b+H6'b), 2,78 (2H,H21a'+H21lb)> 2,70 (3H,NMe), 2,61 (IH, H21), 2,25 (ΙΗ,ΗΠ1), V,90 (2H,CH2-CO), 1,80(2H,CH2CO), 1,73 (2H, beta Pyrrolidin ), 1.28 (2H,ldem), 1.U5 (IH. H15'a), 1,37 (IH, H14'b), 0,86(3H,CH3), 0,80(3H,CH3), 0,76(1H,HT*'). ;,.",'. ': . ' . . ·.' " J . ·
Kupplung von Vinblastin-ii-O-Hemisuccinat mit Äthyltryptophanat
Zu einer Lösung von 0,310 g (0,403 mmol) ^-O-Desacetylvinblastin in 7 ml wasserfreiem Dichlormethan werden '52 mg (0,524 mmol)
. . . , - 18 -
Succinylanhydrid zugesetzt. Die Lösung wird 15 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, dann auf 0° C abgekühlt. Nach aufeinander- i folgendem Zusatz einer Lösung von 81 mg (0,806 mmol·) Triethylamin in 5 ml Dichlormethan und einer Lösung von 87 mg Äthylchloroformiat in 5 ml Dichlormethan wird die Reaktionsmischung bei 0° C eineinhalb Stunden gerührt. Dann setzt man 187 mg ' (0,806 mmol) Äthyl-L-tryptophanat, gelöst in 7 ml Dichlormethan zu. Man läßt auf Raumtemperatur anwärmen und rührt die Mischung 15 Stunden., Die Lösung wird schließlich wie in Beispiel 12 behandelt. Der erhaltene Rückstand wird durch Chromatographie auf einer. SiO~- Säule (Eluierung Äther-NH,-gesättigtes Methanol 92:8) gereinigt. Auf diese .Weise .erhält man 305 mg des reinen Produkts in Form eines weißen Pulvers nach dem Verreiben mit Isopropanol. Ausbeute 70%. ' ' .' -.. ' .-
Massenspektrum (DCI, Isobutan ): 1097 (M+1U), 1083 (M) IR (CHCI3) : 3460, 2995, 2960, 2870, 1735/1669, 1613, 1502, 1457, 1331, 1251, 1167, 1010 cm"1 UV (Mothanol. max, log ): 216 (A,87), 265 (4,27), 288 (3,01)
RMN (360 MHz,CDCI3) : 8,44(1H,NH), 8,O8(1H,NH), 7,52(2H), 7,33(1H), 7,10(6H). 6,66(1H,H9), 6,06(1H,H12), 5,86 (1H,H14), 5,50(1H,H17). 5,38(1H,H15), 4,91(1H), 4,10(2H,CH2-O), 3,76(3H,OMe), 3,72 (3H,OMe), 3.63 (3H,OMe), 3,13 (2H,H5'b+H6'b), 2,80(H21l), 2,68 (NCH3), 0.90 (CH3.3H), 0.78(CH3,3H), 0.74 (H141).
Beispiel l*i . , ,
Kupplung von N-(4-0-Desacetyl-i)-0-Hemisuccinat-pesoxy-Vinblastinoyl· 23)-Äthy 1-tryptophanat mit Pyrrolidin . ] ' \
Eine Lösung von400 mg (0,419 mmol) N-(4-0-Desacetyl-Desoxy-Vinblästinoyl-23)-Ä'thyltryptophanat (vergleiche belgische· Patentschrift 889'136), 105 mg (1,05 mmol) Succinylanhydrid in 20 ml einer Mischung von Dioxan und Toluol (50:50) wird drei Stunden >' unter Rückfluß erhitzt. Nach dem Abdestillieren der Lösungsmittel unter Vakuum wird der .Rückstand in 20 ml wasserfreiem Dichlor-
- 19 - , . .
methan gelöst. Nach dem Abkühlen auf 0° C und aufeinanderfolgender Zugabe einer Lösung von Triäthylämin (126 mg, 1,25 mmol) in 5 ml Dichlormethan und einer Lösung von Äthylchloroforrnint (136 mg, 1,25 mmol) in 5 ml Dichlormethan wird die Mischung eine Stunde gerührt. Dann wird eine Lösung von Pyrrolidin (,178 mg, 2,5 mmol) in 5 ml Dichlormethan bei 0° C/zugesetzt .-Nach dem Aufwärmen auf Raumtemperatur wird die Lösung vier Stunden gerührt und anschließend zwischen 50 ml Dichlormethan und 50 ml einer 5 $igen wässerigen Kaliumcarbonatlösung vorteilt. Die/Phasen werden.getrennt und die wässerige Phase mit zwei Portionen von 20 ml Dichlormethan.extrahiert. Die organischen Extrakte werden vereinigt, nacheinander mit 40 ml Wasser und 40 ml einer gesättigten wässerigen NACl-Lösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird durch Chromatographie über SiO2 (Eluierung mit Methylenchlorid:Methanol 95:5) und Verreiben· mit Äther gereinigt. Ausbeute: 346 mg (75%) der gewünschten Verbindung. ' "\ :
NMR-Spektrum ^ (CDCI3, 360 MHz) bs=Singulett
breit '
9,23 (lH,bs, NH), 7,95 (H,bs), 7,45-7,65(3H,m), 7.33(1H,m), 7,03-7.21 (6H,m), 6,U6 (IH, s), 6,05 (1H,s), 5,83 (1H,m), 5,53 (1H,s), 5,33 (1H,m), 5,01 (lH,m), 4,11 (2H,m), 3,76 (3H,s), 3,58 (3H,s), 3>8 (UH,m), 2,75 (3H,s), 2,65 (1H,s), 2,30 (IH,m), 1,93 (2H#rri), . 1 ,85 (2H,m), 1,21 (3H,t), 0,88 (3H,t), 0,76 (3H,t) 7 ;
IR-Spektrum (CHCI3, 5% v:v): 3U70, 3003, 2973, 2881, 1732, 1679, 1617, 1501, 1M60, 1180 cm"1.
Beispiel 15 ·
' ·.· . ' ·'.. . 1 4 'Desoxy-Vinblastinoyl-23-Ä"thyltryptophanat-4-0-Hemisuccinat und Kupplung mit Rinderserumalbumin (RSA) (RSA-Succ-Deoxy- ; VTTrpE)
. . - ·' · ' '
MOO mg (0,419 mmol) De oxy VTr pE, 126 mg (1,25 jnmol) Succinylanhy.drid und 20 ml Toluol:Dioxan 1:1 werden in einen Kolben eingebracht. Die Lösung wird drei Stunden unter Rückfluß erhitzt. Die Lösungsmittel werden abgedampft und der Rückstand in 20 ml Dioxan aufgenommen.
Anschließend wird die Lösung in1ein Eisbad getaucht. Man setzt 1,26 mmöl (126 mg) Triäthylamin, 1,25 mmol Isobutylchloroformiat^ und 5 ml Dioxan zu und rührt eine Stunde. Unabhängig davon bereitet man eine Lösung von 3^0 mg RSA in 65 ml Wasser und trcpft 28 ml Dioxan zu. Der pH-Wert wird durch 1 N Soda auf-8,5 eingestellt. Die Lösung wird auf 5 ° C abgekühlt. Nach einer Stunde wird der aktivierte Ester zu der RSA-Lösung zugesetzt. Die Lesung wird lh Stunden bei 5° C gerührt, wobei der pH-Wert durch Zusatz von 1 N NaOH auf 8,5 gehalten wird. Die Ausfällung der konjugierten Verbindung und ihre Reinigung erfolgen in der oben beschriebenen Weise. '.. V .' . ''' - >
Beispiel 16 .
.. -/' '.. .· ' . .
Kupplung von ^-O-pesacetyl-^-O-Hemisuccinat-Desoxy-Vindesin mit Äthyltryptophanat ; 7
Nach der im Beispiel 12 beschriebenen Arbeitsweise, jedoch unter Ersatz des Pyrrolidins durch eine äquimolare Menge Äthyl-L-tryptophanat erhält man k7% der gewünschten Verbindung.
NMR-Spektrum . (CDCI3 ,360 MHz) :
8,45 (IH, bs), 8,02 (IH, bs), 7,50 (2H,m), 7,32 (IH,m), 7,23-7.06 (6H„m), 7,02 (lH,m), 6,50 (IH,s). 6,10 (lH,s), 5,86 (1H,m), 5,50 (iH,s), 5,45 (ΐΗ,πι), 5,35 (1H,s). 2,86 (3H,s), 2,67 (IH,s), 2,46 (4H,m), 1,30 (3H.t), 0,90 (3H,t), 0,75 (3H,t).
IR-Spektrum (CHCI3, 5% v:v): 3480, 3400, 3010, 2978, 2882,
1732, 1690, 1615, 1505, 1460, 1298 cm"1 '
,. - 21 -' ' '
· '..' ' <"'
Kupplung von N-'Cii-O-Desacetyl-^-O-Hemisuccinat-Vinblastinoyl-23)-Ä'thyltryptophanat mit Pyrrolidin
Nach/iem in Beispiel 14 beschriebenen Verfahren erhält man ausgehend von 700 mg N(4-0-Desacetyl-Vinbp.astinoyl-23)-Äthyltryptophanät nach der chromatographischen Reinigung über SiOn und dem Verreiben in Äthanol 518 mg (64%) der gewünschten Verbindung.' ... .'·.' .,
NMR-Spektrum · (GDCI3, 360 MHz):
8, OU(IH. bs), 7,46-7,63(3H,m), 7,33(1H,m), 7,20-7,03(6H,m),
6,63(lH,s), 6,08(1H,s), 5,83(lH,m), 5,55 (IH,s), 5,33 (IH, m), 5,06(1H,m), 4,13(2H,m), 3,96(lH,m), 3#76(3H,s), 3,61(3H,s), 3,46(UH,m), 3;40(2H), 2,81(2H,m), 2,73(3H,s), 2,65(lH,s), -1,85Cm.), 1,20(t,3H), 0,89(t,3H), 0,71(t,3H).
IR-Spektrum (CHCI3 5% ,v:v): 347*; 3002, 2977, 2882, 1730,
1678, 1617. 1500, 1460, 1173 cm"1
Kupplung von U-O-Desacetyl^-O-Hemiglutarat-Vinblastin mit Pyrrolidin
*
Eine Lösung von 4-O-Desacetyl-Vinblastin (700 mg, 0,911 mmol) und Gliiarsäureanhydrid (145 mg, y>7 mmol) in 25 ml wasserfreiem Dichlormethan wird unter Ausschluß von Licht 70 Stunden' gerührt. Nach dem Abkühlen auf 0° C und der aufeinanderfolgenden Zugabe einer Lösung vonN-Methyl-Piperidin (163 mg, 1,64 mmol) ;in 7 ml Dichlormethan und einer Lösung von Isobutylchloroformiat
'. ' ..' ' · ) (223mg, 1,6 4 mmol) in 7 ml Dichlormethan wird die Mischung
eine Stunde lang gerührt. Dann wird eine Lösung von Pyrrolidin (194 mg, 2,73 mmol) in 7 ml Dicftlormethan bei p°C zugesetzt. Nach dem Erreichen der Raumtemperatur wird die Lösung fünf Stunden läng gerührt. Dann wird sie zwischen 60 ml Dichlormethan und 60 ml einer 5%igen wässerigen Kaliumcarbonatlösung verteilt.. Die Phasen werden getrennt und die wässerige Phase zweimal mit .30 ml Dichlormethan extrahiert. Die organischen Extrakte werden vereinigt, mit Wasser und einer gesättigten wässerigen NaCl-Lösung gewaschen,über Magnesiumsulfat getrocknet und unter vermindertem Durck eingedampft. Der Rückstand wird durch SiQp-Chromatographie (Eluierung Methylenchlorid:Methanol 95:5). und Verreiben in einer Mischung von Äthylacetat :;Heptan gereinigt. Ausbeute: 605 mg (71%) der gewünschten Verbindung.
NMR-Spektrum . / (CDCI3, 360 MHz): 7,95 (IH,bs), 7,1»5(iH,m), 7,16-7,00(3H, m), 6,55(lH,s), 6,02(lH,s), 5.76(lH,m), 5,MO(VH,s), 5,20(lH,m), 3,88(1H^m), 3,71(6H,2s), 3,53(3H,s), 3,38(UH,m), 2,62(3H,s), 2,58(lH,s), l,92(4H,m), l,8Ö(2H,m), 0,80(3H,t), 0,73(3H,t).
IR-Spektrum (CHCI3, 5% v:v): 3473, 3003, 2977, 2884, 1738, 1620, 1500, V460, 1301 era"1
Die erfindungsgemäßen Verbindungen wurden %n BDF.- oder DBA2-Mäusen, denen auf intraperitoneale oder intravenöse Weise eine Leukämie P388 implantiert worden war, getestet, wobei die Antitumorwirkung durch den Prozentsatz ILS (Increased Life Span, Erhöhung der Überlebenszeit1) gemessen wurde. So zeigen-die mit , Vindesin, mit N-C'l-O-Desacetyl-^-de-imathoxycarbonyl)- vinblastinoyl-23)-A'thyltryptophariat (vergleiche europäische Patentanmeldung Nr. kl 935, Omnichem) sowie mit anderen C-4-Derivaten von Aminosäuren, die über den 3-Kohlenstoff mit Fötuin oder Rinderserum-Albumin in einem Verhältnis von 2 bis 6 gekuppelt sind, daß diese ' konjugierten Verbindungen auf die Tumqre P388 wenig wirksam sind..·;.. (Vergleiche Tabelle). .
Die Vera-breichung der konjugierten Verbindung erfolgte auf intraperitoneale oder intravenöse Weise, jeweils in gleicher Art wie die Tumorinjektion.
im Gegensatz dazu zeigen in überraschender Weise diese gleichen Substanzen, bei denen die Kupplung über C-4 erfolgt ist, eine signifikante Wirkung bei der Durchführung ähnlicher Untersuchungen. Es wurden Zunahmen der Überlebenszeit von mehr als 70$ beobachtet. Die verbesserte Wirksamkeit der erfindungsgemäßen konjugierten Proteinverbindungen hat sich auch an L1210 Zellen in vitro in einem 10$ fötales Kalbsserum enthaltenden RPMI-Medium erwiesen. Das gewählte Verfahren besteht nach der Inkubation darin, den " .Gehalt an Zellproteinen zu messen, welche Bestimmung durch das Lowry-Verfahren erfolgt. So erhält man nach 3 Tagen bei einer Konzentration von 10 bis 50 Mikrogramm/ml RSA(S)- : ! C-4-VDS eine Inhibierung des Zellwachstums, während sich die nichtbehandelte Zellkultur um einen Faktor 2,5 vervielfacht hat.. ;. ' ' '
Hepatomzeilen Hep.G2 (300.000 Zellen) wurden 8 Tage lang in Gegenwart von AHgal-VDS-C-4 und AHgal-VDS-C-3 bei variierenden Konzentrationen von 1,3 bis 21,700 ng VDS/ml inkubiert. Nach 8 Tagen wird das Ausmaß der Zellproteine durch das Lowry-Verfahren bestimmt. Die Resultate zeigen, daß die 50$ der Zellen abtötende ^Konzentration im Fall des AHgal-VDS-C-3 bei^l.000 ng/ml liegt, während sie im Fall des AHgal-VDS-C-4 bei 215 Hg/ml liegt.
WIRKUNGEN VON VINBLASTlN-DEHfVATEN AUF-TUMORE BEJ MÄUSEN
PkODIIKTE
RSA-TrpV-C-3
Föt-VDS-C-3 Föt(S)-VDS-C-3 Föt-Ile-VDSC3 RSA-VDS-C-U
RSA(S)-VDS-C-^ RSA(S)-VI le-C-4
RSA-Succ-VDS
RSA-(S)-SuCC-VDS RSA-(S)-SuCc-VDS
( über Guanidin -) RSA-Succ-VDS
RSA-Succ-VDS
(über Tierkohle) (über Guanidin)'
IgC unspez .-$UCc VDS A Hgal-Succ-VDS RSA-Succ-deoxyVtrpE
2 2 6 2 2
2,7 2,5 2.4 1.3
18 18
32 32
32 3.4 -19 16,6 17
24 21,6
10
6.3
15
15
10
423 261 298 298 294 398 500 332 27,5 968 165 550 771
173 371
97 208
208 196 351 403 393
643 356 146 284
DBA2 1(T P388 iv 9,4
DBA2 104 P388 iv -8
BDF1 106 P388 ip 4,1
BDF1 106 P388 ip 8,2
106 P388 ip 2,6
106 P388 ip
106 P388 ip i»8
106 P388 ip
106 P388 ip
106 P388 ip
VO6 P388 ip
106 P388 ip
106 P388 ip
106 P388 ip
BDF1 BDF1 BDF1 BDF1 BDF1 BDF1 BDF1 BDF
BDF. BDFj
BDF.
BDF lo|j P388 ip
BDF1 10 .P388 ip
106 P388 ip
iO6 P388 ip
IO6 P388 ip
IO6 P388 ip
106 P388 ip
IO6 P388 ip
BDF1 1Ö6 P388 ip
1 106 P388 ip BDF IO6 P388 ip
TABELLE (Fortsetzung)
(d)
VDS-Chloroacetat
10 12
15 4
8 12 16
6,25 12,5 25 50
DBA2 FR DBA2 FR
DBA2 FR DBA2 FR DBA2 US
DBA2
DBA2 DBA2 DBA3 DBA. DBA. DBA. DBA.
10" 105
10 10£ 105
ro
io6 io6 io6
ro5 ίο5 io5
P388 iv P388 iv
38
P388 iv P388 iv P388 iv
P388 Ip >60 P388 Ip .„ :
P388 ip
P388 ip
P388 ip -29
P388 iv
P388 iv
P388 iv
P388 iv
(a) Molverhältnis Vinca:Protein Cb-). Dosierung mg Vinca/kg
(c) Dosierung mg Protein/kg
(d) Mäusestamm ; . [ (e)Ahzähl ,der injizierten Zellen
(f) Art des injizierten Tumors ; \ ,
(g) Injeltiönsart
(h) Prozentsatz der Erhöhung der Überlebenszeit der überlebenden im Vergleich zu den nichtbehandelten Mäusen (ILS)
Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Verbindungen besitzen äußerst interessante Antitumor-Eigen-....schäften und können in der Humantherapie eingesetzt werden. Diese Vinblastin-Derivate können insbesondere für die Be- \ v' '-handlung von Leukämien, Gliomen, Lymphosarkomen und anderen bösartigen Tumoren, darunterauch den sogenannten "festen", Tumoren,, verwendet werden.
In der Humantherapie werden sie daher zur Behandlung des Morbus Hodgkin und anderer Tumore, für die eine Behandlung . mit Vintolastin, Vincristin oder Vindesin vorgesehen ist, verwendet. ,
,Für ihre therapeutische Anwendung werden die.erfindungsgemäß erhaltenen Verbindungen gegebenenfalls in lyophilisierter Form vorzugsweise auf par-enterale Weise,in einem pharmazeutisch . ,. anwendbaren Lösungsmittel gelöst, verabreicht. Uhter den % Additionssalzen bevorzugt man nicht-toxische, pharmazeutisch anwendbare Salze, wie die Salze von Mineralsäuren, z.B. der Salz-, Phosphor- und Schwefelsäure oder von organischen Säuren, wie der Essig-, Propion-, Bernstein-, Wein-, Öxal-, Methan- ,.
... s.ulfon- oder Benzolsulfonsäure. Physiologische Kochsalzlösung oder andere beispielsweise mit einem Phosphat gepufferte Salzlösungen sind geeignete Lösungsmittel. /··' '.-'
: D,er Wirkstoff wird normalerweise in einer Dosierung v.erab- , reicht ,-die von 50 mg bis zu mehreren Gramm variieren kann. Dies,e Verbindungen können außerdem in Kombination mit anderen Arititumormititein· verwendet werden.
Claims (11)
- 63 939 18Jürf xndungsansprüche... ι1. Verfahren zur Herstellung konjugierter Verbindungen von Vinblastin oder Derivaten des Vinblastin mit Proteinen, Proteinfragmenten, Aminosäuren oder einfachen Aminen, gekennzeichnet dadurch, daß die Kupplung über eine Estergruppe erfolgt, die von der Hydroxylgruppe des 4-Kohlenstoffatoms des Vinblastin-Skeletts abgeleitet ist. ' . ' ' . '' ' . t2· Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß das Protein, das Proteinfragment oder das Amin über eine Brücke an die Vinblastin-Verbindung gekuppelt wird, die durch vorangehende Kondensation des Vinblastin-Derivats mit einer gegebenenfalls aktivierten bifunktionellen organischen Verbindung hergestellt wurde.
- 3. Verfahren nach Punkt 2, gekennzeichnet dadurch, daß die bifunktionelle Verbindung d s Chloressigsäurechlorid, das Chloreasigsäureanhydrid, das Bernsteinsäureanhydrid ,oder das Glutarsäureanhydrid ist.4« Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 3» gekennzeichnet dadurch, daß ein Protein oder ein Proteinfragment über ( eine Ssterbindung an die C-4-Hydroxy!gruppe des Vinblastin, des Vindesin oder eines 23-Vinblastinoyl~ esterderivats einer !Aminosäure gekuppelt wird.Verfahren nach den Punkten 1 bis 4, gekennzeichnet da~ durch, daß das Derivat des Vinblastin das 4-0-Desacetylvinblastin ist.
- 6. Verfahren nach den Punkten 1 bis 4, gekennzeichnet da-durch, daß das Derivat des Vinblastin das 4-0~Desacetyl-4-'-desoxy-Vinblastin ist·Verfahren nach irgend einem der Punkte 1 bis 6, gekennzeichnet dadurch, daß man eine Verbindung der FormelO-A-iLin welcher A eine "Brücke" wie -COOH2- oder darstellt, wobei η von 1 bis 5 variiert, R^ einen gegebenenfalls modifizierten Proteinrest bedeutet, R0 für eine Methoxygruppe, eine Aminogruppen oder einen alpha-Aminosäurerest steht, der durch eine Amidbindung gebunden ist und dessen Estergruppe 1 bis 6 Kohlenstoff atome enthält, und R^ ein Wasserstoffatom oder eine Hydroxylgruppe bedeutet, welche jeweils in den beiden möglichen Konfigurationenvorliegen können, sowie deren Additionssalze mit einer Mineralsäure oder einer organi schen Säure herstellt·
- 8. Verfahren nach irgend einem der Punkte 1 bis 7t gekennzeichnet dadurch, daß der Proteinrest ein Derivat des Pötuin oder des Albumin ist.9* Verfahren nach irgend einem der Punkte 1 bis 7, gekennzeichnet dadurch, daß der Proteinrest ein Derivat eines Immunoglobulins ist»
- 10. Verfahren nach irgend einem der Punkte 1 bis 9» gekennzeichnet dadurch, daß der Proteinrest ein Derivat eines monoclonalen Antikörpers ist.
- 11. Verfahren nach irgend einem der Punkte 4 bis 7t gekennzeichnet dadurch, daß der Aminosäureester das Athyltryptophan ist.
- 12. Verfahren nach irgend einem der Punkte 4 bis 7, gekennzeichnet dadurch, daß der Aminosäureester das Äthylisoleucinat ist.
- 13. Verfahren nach Punkt 7» gekennzeichnet, dadurch, daß R2 eine Metoxy^- oder Aminogruppe darstellt.
- 14. Verfahren nach Punkt 7» gekennzeichnet dadurch, daß E, ein Wasserstoffatom mit der Konfiguration des 41-Desoxyvinblastin-B darstellt.15· Verfahren nach irgend einem der funkte 7 bis 1Ö, gekennzeichnet dadurch, daß die Minogruppe eine Gruppe MJJ. oder ein über die Aminof unkt ion gebundener Aminosäureester ist, wobei K^ und R,- Alkylgruppen mit ein bis drei Kohlenstoffatomen oder gemeinsam eine AlKandiylgruppe mit drei bis führ Kohlenstoffatomen darstellen.16« Verfahren nach irgend-einem der Punkte 1 bis 15, gekennzeichnet dadurch, daß man in einer ersten Stufe das Chloressigsäuiechlorid oder ein Anhydrid mit dem . Hydroxyl in C-4-Stellung des 4-0~I)esacetylvinulastin oder eines Derivats der Art 4-0-Besacetylvinblastin~3~carbox*- amid kondensiert und anschließend die so erhaltenen Derivate mit dem Protein, der Aminosäure oder dem einfachen Amin in einem Lösungsmittel, in dem diese Verbindungen löslich sindj kondensiert,17· Verfahren nach Punkt 16, gekennzeichnet dadurch, daB das in der zweiten Kondensationsstufe verwendete Lösungsmittel aus einer Mischung von Wasser und Dioxan \ bei einem durch einen Puffer gehaltenen entsprechenden pH-Wert besteht· V
- 18. Verfahren nach Punkt 16 oder 17, gekennzeichnet dadurch, daß man die durch Ausfällung aus dem Reaktionsmedium gewonnene konjugierte Verbindung isoliert und das man zentrifugiert, wäscht, lyophilisiert und durch Gelfiltration reinigt sowie gegebenenfalls eine klassische Succinylierung vornimmt.19· Verfahren nach irgend einem der Punkte 16 bis 18, gekennzeichnet dadurch, daß die verwendeten Proteine zu ihrer selektiven Modofizierung behandelt werden»
- 20. Verfahren nach irgend einem der Punkte 16 bis 19, gekennzeichnet dadurch, daß man als Protein Hinderserum- oder Humanserumalbumin, Fötuin oder Immunoglobuline verwendet, die gegebenenfalls durch das Verfahren der monoclonalen Antikörper, vorzugsweise monoclonaler humaner üntikörper, gewonnen wurden.
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|---|---|---|---|
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| DD84263250A DD219771A5 (de) | 1983-12-29 | 1984-05-22 | Verfahren zur herstellung neuer konjugierter verbindungen von vinblastin und seinen derivaten |
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Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
| WO2008098788A3 (en) * | 2007-02-16 | 2009-06-11 | Ktb Tumorforschungs Gmbh | Receptor and antigen targeted prodrug |
-
1983
- 1983-12-29 LU LU85161A patent/LU85161A1/fr unknown
-
1984
- 1984-04-25 IL IL71642A patent/IL71642A/xx unknown
- 1984-05-22 DD DD84263250A patent/DD219771A5/de not_active IP Right Cessation
- 1984-06-06 PH PH30778A patent/PH21394A/en unknown
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008098788A3 (en) * | 2007-02-16 | 2009-06-11 | Ktb Tumorforschungs Gmbh | Receptor and antigen targeted prodrug |
| US9216228B2 (en) | 2007-02-16 | 2015-12-22 | KTB Tumorforschungsgesellschaft MBM | Receptor and antigen targeted prodrug |
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|---|---|
| PH21394A (en) | 1987-10-15 |
| LU85161A1 (fr) | 1985-09-12 |
| IL71642A (en) | 1990-11-05 |
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