DD220315A5

DD220315A5 - Verfahren zur herstellung eines peptids

Info

Publication number: DD220315A5
Application number: DD84260704A
Authority: DD
Inventors: Jun Wylie W Vale; Jean E F Rivier
Original assignee: Salk Inst For Biological Studi
Priority date: 1983-03-10
Filing date: 1984-03-08
Publication date: 1985-03-27
Also published as: PT78209A; HU190949B; DK81484A; DK81484D0; GR82639B; ES530385A0; FI840909A7; ZW1784A1; IL70888A0; PT78209B; EP0122712A2; FI840909A0; AU2503884A; ES8504677A1; NO840880L; KR840009071A; AU569060B2; EP0122712A3; PH21615A; PL246597A1

Abstract

DIE ERFINDUNG BETRIFFT PEPTIDE, DIE DIE AUSSCHEIDUNG VON GONADOTROPINEN DURCH DIE HYPOPHYSE INHIBIEREN UND DIE FREISETZUNG VON STEROIDEN DURCH DIE KEIMDRUESEN. DIE VERARBREICHUNG EINER WIRKSAMEN MENGE VERHINDERT DIE OVULATION VON WEIBLICHEN SAEUGETIEREIERN UND/ODER DIE FREISETZUNG VON STEROIDEN DURCH DIE KEIMDRUESEN. DIE PEPTIDE WEISEN FOLGENDE STRUKTUR AUF X-R TIEF 1-R TIEF 2-D-TRP-SER-R TIEF 5-R TIEF 6-LEU-ARG-PRO-R TIEF 10, WORIN X WASSERSTOFF ODER EINE ACYLGRUPPE MIT 7 ODER WENIGER KOHLENSTOFFATOMEN IST; R TIEF 1 IST DEHYDRO-PRO, D-PGLU, D-PHE, D-TRP ODER BETA-D-NAL; R TIEF 2 IST CI-D-PHE, C HOCH A ME-4-CI-D-PHE, NO TIEF 2-D-PHE, CI TIEF 2-D-PHE ODER BR-D-PHE; R TIEF 5 IST TYR, I-TYR, CH TIEF 3-PHE, F-PHE ODER CI-PHE; R TIEF 6 IST EIN D-ISOMERES EUBER LIPOPHYLEN AMINOSAEURE ODER 4-NH TIEF 2-D-PHE, 4-GUA-D-PHE, D-HIS, D-LYS, D-ORN, D-HAR ODER D-ARG; UND R TIEF 10 IST GKY-NH TIEF 2, D-ALA-NH TIEF 2 ODER NH-Y, WOBEI Y NIEDERALKYL, CYCLOALKYL, FLUORNIEDERALKYL ODER NH-C-NH-Q, WOBEI Q WASSERSTOFF ODER NIEDERALKYL IST. WENN R TIEF 1 BETA-D-NAL IST, IST R TIEF 6 4-GUA-D-PHE, D-HIS, D-LYS, D-ORN, D-HAR ODER D-ARG WENN R TIEF 5 TYR ODER 2-CI-PHE IST, IST ENTWEDER ORN, AAL ODER ABU FUER SER SUBSTITUIERT ODER R TIEF 1 IST BETA-D-NAL UND R TIEF 6 IST D-HIS ODER 4-GUA-D-PHE. N HOCH A ME-LEU KANN GEGEBENENFALLS FUER LEU SUBSTITUIERT SEIN.

Description

zu bilden, worin X¹ Wasserstoff oder eine a-Aminoschutzgruppe ist; X² ist Wasserstoff oder eine Schutzgruppe für den Indolstickstoff; X³ ist Wasserstoff oder eine Schutzgruppe für die alkoholischen Hydroxylgruppe von Ser oder für eine Seitenkettenaminogruppe; X⁴ ist Wasserstoff oder eine Schutzgruppe für die phenolische Hydroxylgruppe vqn Tyr; X^s ist Wasserstoff oder eine Schutzgruppe für die Seitenkette; und X^е ist ausgewählt aus der aus GIy-O-CH₂ (Harzträger), 0-CH₂-(Harzträger), D-Ala-O-CH₂-(Harzträger), Gly-NH-(Harzträger), D-Ala-NH-(Harzträger), GIy-NH₂, und Estern, Amiden und Hydraziden bestehenden Gruppe;

(b) eine oder mehrere der Gruppen X¹ bis X^s abzuspalten und/oder Abtrennen von irgendeinem Harzträger, der zu X^е gehört, und gewünschtenfalls

(c) Umwandeln eines erhaltenen Peptids in eines seiner nichttoxischen Salze.

2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß X¹ entweder Wasserstoff oder eine a-Aminoschutzgruppe ist; X² ist entweder Wasserstoff oder eine Schutzgruppe für das Indol-Stickstoffatom von Trp, ausgewählt aus der aus Formyl und Benzyl bestehenden Gruppe; X³ ist eine Schutzgruppe für die alkoholische Hydroxylgruppe von Ser, ausgewählt aus der aus Acetyl, Benzoyl, Tetrahydropyranyl, ter.-Butyl, Trityl, Benzyl und 2,6-Dichlorbenzyl bestehenden Gruppe; X⁴ ist entweder Wasserstoff oder eine Schutzgruppe für die phenolische Hydroxylgruppe von Tyr, ausgewählt aus der aus Tetrahydropyranyl, tert.-Butyl, Trityl, Benzyl, Benzyloxycarbonyl, 4-Brombenzyloxycarbonyl und 2,6-Dichlorbenzyl bestehenden Gruppe, X⁵ ist entweder Wasserstoff oder eine Schutzgruppe für die Guanidingruppe von Arg oder die Aminogruppe von Lys oder die Imidazolgruppe von His, ausgewählt aus der aus Nitro, Tos, Trityl, Benzyloxycarbonyl, Adamantyloxycarbonyl, Z und BOC bestehenden Gruppe; und X^е ist ausgewählt aus daraus OCH₂-[Harzträger], D-AIa-OCH? [Harzträger], D-Ala-NH-[Harzträger] und der freien Säure, dem Ester, Amid oder Hydrazld von entweder GIy oder D-AIa bestehenden Gruppe oder direkt anPro gebunden.

3. Verfahren nach Punkt 2, gekennzeichnet dadurch, daß X¹ Boc, X² Wasserstoff, X³ Benzyl, X⁴ Wasserstoff oder 2,6-Dichlorbenzyl, X^sTos und X^е Gly-NH-[Harzträger] ist.

4. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 3, gekennzeichnet dadurch, daß R₂ 4-CI-D-Phe oder 4-F-D-Phe ist.

5. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 4, gekennzeichnet dadurch, daß R₁ /3-D-2NAL und R₈ D-Arg ist

6. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 5, gekennzeichnet dadurch, daß R₆ 2-CH₃-Phe, 3-CH₃-Phe oder 3-l-Tyr und R₄ Ser ist.

7. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 6, gekennzeichnet dadurch, daß X Ac oder Acr und R₇ Leu ist.

8. Verfahren nach Punkt 4, gekennzeichnet dadurch, daß X Ac, R₁, Dehydro-Pro, R₄ Ser, R₆ 3-F-Phe, R₆ D-Trp und R₇ Leu ist.

9. Verfahren nach Punkt 4, gekennzeichnet dadurch, daß X Ac, R₁ /3-D-2NAL, R₂ 4-F-D-Phe, R₄ Ser, R₆ 2-CH₃-Phe, 3-l-Tyr oder 3-CH₃-Phe und R₆ D-Arg ist.

10. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß das Peptid die Formel Ac-Dehydro-Pro^-F-D-Phe-ß-D^NAL-Orn-Tyr-ß-D^NAL-Leu-Arg-Pro-Gly-NHj aufweist.

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Peptiden, die die Freisetzung von Gonadotropien durch die Hypophyse von Säugetieren einschließlich des Menschen inhibieren sowie Verfahren zur Ovulationsverhütung und/oder zur Inhibierung der Freisetzung von Steroiden. Insbesondere ist die vorliegende Erfindung auf Peptide gerichtet, die die gonadale Funktion und die Freisetzung der steroiden Hormone Progesteron und Testosteron inhibieren.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Die Hypophyse ist über den Hypophysenstiel an den als Hypothalamus bekannten Bereich der Basis des Gehirns gebunden. Insbesondere Follikel stimulierende Hormone (FSH) und luteinisierendes Hormon (LH), oft als Gonadotropine oder gonadotrope Hormone bezeichnet, werden durch die Hypophyse freigesetzt. Diese Hormone regulieren in Kombination die Funktion der Keimdrüsen, in den Hoden Testosteron und in den Eierstöcken Progesteron und Östrogen zu produzieren; sie regulieren somit die Produktion und Reife der Gameten.

Die Freisetzung eines Hormons durch den Hypophvsenvorderlappen erfordert üblicherweise eine vorherige Freisetzung einer anderen Gruppe von Hormonen, die vom Hypothalamus produziert werden. Eines der Hypothalamus-Hormone wirkt als ein Faktor, der die Freisetzung der gonadotropen Hormone auslöst, insbesondere LH, und dieses Hormon wird hier als GnRH bezeichnet, obwohl es auch schon als LH-RH und LRF bezeichnet worden ist. GnRH ist isoliert und als ein Dekapeptid der folgenden Struktur charakterisiert worden: p-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly^jNH₂.

Peptide sind Verbindungen, in zwei oder mehr Aminosäuren enthalten, bei denen die Karboxylgruppe der einen Säure mit der Aminogruppe der anderen Säure verbunden ist. Die oben dargestellte Form für GnRH steht in Übereinstimmung mit der üblichen Darstellung von Peptiden, bei der das Aminoterminal links und das Karboxylterminal rechts erscheint. Die Position des Aminosäurerestes wird durch Numerierung der Aminosäurereste von links nach rechts festgestellt. Im Falle von GnRH ist der Hydroxylteil der Karboxylgruppe des Glycins durch eine Aminogruppe (NH₂) ersetzt worden. Die Abkürzungen für die einzelnen oben genannten Aminosäurereste sind bekannt und basieren auf dem Trivialnamen der Aminosäure, zum Beispiel p-Glu ist Pyroglutaminsäure, His ist Histidin, Trp ist Tryptophan, Ser ist Serin, Tyr ist Tyrosin, GIy ist Glycin, Leu ist Leucin, Orn ist Ornithin, Arg ist Arginin, Pro ist Prolin, Sar ist Sarcosin, Phe ist Phenylalanin und AIa ist Alanin. Diese Aminosäuren sind zusammen mit Valin, Isoleucin, Threonin, Lysin, Aspartinsäure, Asparagin, Glutamin, Cystein, Methionin, Phenylalanin und Prolin allgemein im Handel erhältlich, natürlich auftretend oder Protein-abgeleitete Aminosäuren. Mit Ausnahme von Glycin weisen die Aminosäuren der erfindungsgemäßen Peptide L-Konfiguration auf, wenn nicht anders vermerkt. Es ist bekannt, daß die Substitution von D-Aminosäuren für GIy in der 6-Stellung des GnRH-Dekapeptide oder -Nonapeptids zu GnRH-Analogen führt, die eine im wesentlichen größere Potenz als GnRH aufweisen, die Freisetzung von LH und FSH (also der Gonadotropine) durch die Hypophyse von Säugetieren zu bewirken. Es ist ebenfalls bekannt, daß die Substituenten verschiedener Aminosäuren für His (oder die Abtrennung von His) in der 2-Stellung des GrrRH-Dekapeptids zu Analogen führt, die eine inhibierende Wirkung auf die Freisetzung von LH und anderen Gonadotropinen durch die Hypophyse von Säugetieren aufweist.

Dies sind Gründe für den Wunsch, die Ovulation bei weiblichen Säugetieren zu verhüten, und die Verabreichung von GnRH-Analogen, die Antagonisten für die normale Funktion des GnRH darstellen, ist dazu benutzt worden, die Ovulation zu unterdrücken oder, zu verzögern. Aus diesem Grunde sind Analoge von GnRH, die GnRH-Antagonisten sind, dazu bestimmt gewesen, potentiell als Kontrazeptiva oder zur Regulierung der Empfängniszeit eingesetzt zu werden. GnRH-Antagonisten können ebenfalls für die Behandlung der verfrühten Pubertät (Pubertas praecox) und Endometriosis verwendet werden, um das Wachstum bei weiblichen Tieren zu beschleunigen. Es wurde auch gefunden, daß derartige Antagonisten für die Regulierung der Sekretion von Gonodatropinen bei männlichen Säugetieren nützlich sind und dazu eingesetzt werden können, die Sperrnatogenese zu hemmen, z. B. als männliche Kontrazeptiva sowie für die Behandlung der Prostatahypertrophie. Weiterhin ist aus der US-PS 4 211 693 ein Verfahren zur Herstellung von Peptiden bekannt über klassische Lösungssynthesen oder durch Festphasentechnik unter Verwendung eines chlormethylierten Harzes, eines Methylbenzhydrylaminharzes (MBHA) eines Benzhydrylaminharzes (BHA) oder irgend eines anderen geeigneten bekannten Harzes.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung verbesserter Peptide, die stark antagonistisch auf die endogene GnRH wirken und die Sekretion von LH sowie die Freisetzung von Steroiden durch die Keimdrüsen von Säugetieren verhindern.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, neue Peptide mit den gewünschten Eigenschafen und Verfahren zu ihrer Herstellung aufzufinden.

Erfindungsgemäß werden neue Peptide zur Verfugung gestellt, die die Freisetzung von Gonodatropinen bei Säugetieren, einschließlich von Menschen, inhibieren, sowie weiterhin Verfahren zur Inhibierung der Freisetzung von Steroiden durch die Keimdrüsen von männlichen und weiblichen Säugetieren. Die verbesserten GnRH-Analogen sind stark antagonistisch für GnRH jnd weisen eine inhibierende Wirkung auf die Reproduktionsprozesse bei Säugetieren auf. Diese Analogen können dazu verwendet werden, die Produktion von Gonodatropinen und Geschlechtshormonen unter verschiedenen Umständen zu inhibieren, einschließlich verfrühter Pubertät, hormonabhängiger Tumorbildung, Dysmenorrhe und Endometriosis. Im allgemeinen und in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung sind Peptide synthetisiert worden, die die Sekretion von Gonodatropinen durch die Hypophyse von Säugetieren, einschließlilch Menschen, inhibieren und/oder die Freisetzung von Steroiden durch die Keimdrüsen inhibieren. Diese Peptide sind Analoge der GnRH, worin es eine Substitution in 1-Stellung gibt, wie Dehydro- Pro, D-pGlu, D-Phe, D-Trp oder /3-(2-Naphthyl)-D-alanin (hier als /3-D-2NAL bezeichnet), eine 2-Stellung-Substitution in der Art einer halogenieren D-Phe, eine 3-Stellung-Substitution in der Art wie D-Trp oder /3-D-2NAL, eine 6-Stellung-Substitution, plus einem Substituenten in 5-Stellung in der Art wie halogeniertes L-Phe oder L-Tyr und/oder die Substitution einer Diaminosäure mit nicht mehr als 5 Kohlenstoffatomen in 4-Stellung. Der Substituent in 1-Stellung kann modifiziert werden, so daß seine alpha-Aminogruppe eine Acylgruppe enthält, wie Formyl, Acetyl, Acrylyl, Vinylacetyl oder Benzoyh wobei Acetyl (Ac) und Acrylyl (Acr) bevorzugt werden. Modifizierte L-Phe oder L-Typ in 5-Stellung führt zu gesteigerter antagonistischer Aktivität als Ergebnis der spezifischen Modifikationen, die im Benzolring auftreten. Einfache Substitutionen für Wasserstoff erfolgen entweder in 2- oder 3-Stellung, und die Substitutionen werden ausgewählt unter Chlor, Fluor, Iod, * Brom und Nitro, wobei Chlor und Fluor bevorzugt werden. Wenn beispielsweise I-Tyr in die 5-Stellung eingesetzt wird, ist 1 vorzugsweise in der meta- oder 3-Stellung vorhanden. Wenn /3-D-NAL in 1-Stellung ist, ist ein hydrophiler D-Aminosäurerest wie 4-NHj-D-Phe, 4-Guanidin-D-Phe, D-His, D-Lys, D-Orn, D-Arg oder D-Har (Homoarginin) in 6-Stellung vorhanden. Wenn Dehydro-Pro in 1-Stellung ist, ist ein D-Isomeres einer lipophilen Aminosäure wie D-Trp, D-Phe, D-Leu, D-IIe, D-NIe, D-Tyr, D-VaI, D-AIa, D-Ser (OtBu), /3-D-2NAL oder (imBzl)D-His vorzugsweise in 6-Stellung vorhanden. Die Substitutionen in den 4-, 7- und 10-Stellungen sind; allgemein betrachtet, gegebenenfalls-Substitutionen.

Da diese Peptide hochwirksam darin sind, die Freisetzung von LH zu inhibieren, werden sie oftmals als GnRH-Antagonisten bezeichnet. Die Peptide inhibieren die Ovulation weiblicher Säugetiere, wenn sie in sehr geringen Gaben im Proöstrus gegeben werden, und sie sind ebenso wirksam, die Resorption von befruchteten Eiern hervorzurufen, wenn sie kurz nach der Konzeption gegeben werden. Diese Peptide sind auch wirksam für die kontrazeptive Behandlung männlicher Säugetiere. Insbesondere werden die Peptide der vorliegenden Erfindung durch die folgende Formel I repräsentiert X-R,-R2-D-Trp-R₄-R₅-R_e-R₇-Arg-Pro-Rio

worin X Wasserstoff oder eine Acylgruppe mit sieben oder weniger Kohlenstoffatomen ist; R₁ ist Dehydro-Pro-, D-pGlu, D-Phe, D-Trp oder /3-D-NAL; R₂ ist Cl-D-Phe, F-D-Phe, NO₂-D-Phe, C^eMe-4-CI-D-Phe, CI₂-D-Phe oder Br-D-Phe; R₄ ist Ser, Om, AAL oder aBu, R₅ ist Tyr, 3-F-Phe, 2-F-Phe, 3-l-Tyr, 3-Ch₃-Phe, 2-CH₃-Phe, 3-CI-Phe oder 2-CI-Phe; R₈ ist ein D-Isomeres einer lipophilen Aminosäure oder ist 4-NH₂-D-Phe, D-Lys, D-Orn, D-Har, D-His, 4-gua-D-Phe oder D-Arg; R₇ ist Leu oder N« Me-Leu; und R₁ „ ist GIy-NH₂, GIy-OCH₃. GIy-OCH₂CH₃, Sar-NH* D-AIa-NH₂ oder NH-Y, wobei Y Niedertrikyl, Cycloalkyl, Fluor-Niederalkyl oder NH-C—ISIH Q

U ist, wobei Q Wasserstoff oder Niederalkyl ist, und worin 0-D-2-NAL für D-Trp in 3-Stellung substituiert sein

kann; mit der Maßgabe, daß, wenn R₁ 0-D-NAL ist, R₆ 4-NH₂-D-PKe, D-Lys, D-Orn, D-Har, D-His, 4-gua-D-Phe oder D-Arg ist, und mit der weiteren Maßgabe, daß, wenn R₆ Туг oder 2-CI-Phe ist, entweder R₄ Om, AAL oder aBu ist oder R₁ /3-D-2NAL ist und R₆ D-His oder 4-gua-D-Phe ist.

Unter /3-D-NAL ist das D-Isomere von Alanin zu verstehen, das durch Naphthyl am /3-Kohlenstoffatom substituiert ist unrd das

man auch als 3-D-NAL bezeichnen kann. Vorzugsweise wird /3-D-2N AL verwendet, was bedeutet, daß das ^-Kohlenstoffatom am Napthalen in 2-Stellung an der Ringstruktur gebunden ist. Es kann aber auch /8-D-1NAL eingesetzt werden.

Unter AAL ist /3-Amino-Ala zu verstehen und unter aBu ist a, -y-Diaminobuttersäure zu verstehen, von denen eines von beiden

oder Om für Ser in der 4-Stellung substituiert werden kann. Wenn eine solche Substituion für Ser erfolgt, wird vorzugsweise ß-

D-2NAL in den 3- und 6-Stellungen und Dehydro-Pro in der 1-Stellung eingesetzt. Die Peptide der vorliegenden Erfindung können über klassische Lösungssynthesen oder durch Festphasentechnik unter Verwendung eines chlormethylierten Harzes, eines Methylbenzhydrylaminharzes (MBHA), eines Benzhydrylaminharzes (BHA)

oder irgendeines anderen geeigneten, bekannten Harzes synthetisiert werden. Die Festphasentechnik wird durch schrittweisen

Einbau der Aminosäuren in die Kette in der Weise durchgeführt, die detailliert in der US-PS 4211 693 beschrieben worden ist. Ebenfalls bekannte Seitenkettenschutzgruppen werden vorzugsweise an Ser, Туг und Arg, falls vorhanden, angelagert, ebenso

an bestimmte unter den Substituenten, und können gegebenenfalls an Trp angelagert werden, bevor diese Aminosäuren an die Kette angeknüpft werden, die auf dein Harz aufgebaut wird. Diese Verfahren arbeitert mit dem vollständig geschützten

Zwischenprodukt Peptidoresin. Die Zwischenprodukte der Erfindung können durch die Formel I dargestellt werden: X¹-R_rR_rD-Trp(X²)-Ser(X³)-R_B(X⁴)-R_e(X⁵)-R_rArg(X⁶)-Pro-Xe

worin X¹ eine a-Amino-Schutzgruppe der Art ist, wie sie sich bei der bekannten schrittweisen Synthese von Polypeptiden als nützlich erwiesen hat, und wenn X in der gewünschten Peptidzusammensetzung eine bestimmte Acylgruppe ist, kann diese

Gruppe als Schutzgruppe verwendet werden. Unter die von X¹ repäsentierte Klasse von α-Amino-Schutzgruppen fallen

(1) Schutzgruppe vom Acyltyp, wie Formyl (For), Trifluoracetyl, Phthalyl, p-Toluolsulfonyl (Tos), Benzoyl (Bz), Benzolsulfonyl, o-Nitrophenylsulfenyl (Nps), Tritylsulfenyl, o-Nitrophenoxy-acetyt, Acrylyl (Acr), Chloracetyl, Acetyl (Ac) und -y-Chlorbutyryl;

(2) aromatische Schutzgruppen vom Urethanty, beispielsweise Benzyloxycarbonyl (Z) und substituiertes Benzyloxycarbonyl wie p-Chlorbenzyloxycarbonyl (CIZ), p-Nitrobenzyloxycarbonyl, p-Brombenzyloxycarbonyl und p-Methoxybenzylpxy carbonyl;

(3) aliphatische Urethanschutzgruppen, wie tert.-Butyloxycarbonyl (Boc), Diisopropylmethoxycarbonyl, Isoprophyloxycarbonyl, Ethoxycarbonyl und Allyloxycarbonyl;

(4) Cycloalkyl-Schutzgruppen vom Urethantyp, wie Cyclopentyloxycarbonyl, Adamantyloxycarbonyl und Cyclohexyloxycarbonyl; -v

(5) Schutzgruppen vom Thiourethantyp wie Phenylthiocarbonyl;

(6) Schutzgruppen vom Alkyltyp wie Allyl (AIy), Triphenylmethyl (Trityl) und Benzyl (BzI);

(7) Trialkylsilangruppen wie Trimethylsilan. Die bevorzugte a-Amino-Schutzgruppe ist Boc, wenn X Wasserstoff ist.

x² ist Wasserstoff oder eine Schutzgruppe für den Indolstickstoff, wie Formyl oder Benzyl; wobei in manchen Synthesen keine

Notwendigkeit zum Schutz von Trp vorhanden ist. X³ ist Wasserstoff oder eine Schutzgruppe für die alkoholische Hydroxylgruppe von Ser, wie sie aus der aus Acetyl, Benzoyl, Tetrahydropyranyl, tert.-Butyl, Trityl, Benzyl und 2,6-Dichlorbenzyl bestehenden Gruppe ausgewählt werden kann, wobei Benzyl bevorzugt ist. Alternativ dazu kann, wenn eine Substitution von Ser erfolgt, X³ eine Schutzgruppe für eine Seitenkettenaminogruppe wie Tos, Z oder CIZ sein. X⁴ ist Wasserstoff oder eine Schutzgruppe für die phenolische Hydroxylgruppe von Tyr, Wenn Tyr vorhanden ist, und sie wird

aus der aus Tetrahydropyranyl, tert.-Butyl, Trityl, Benzyl, Z, 4-Brombenzylöxycarbonyl und 2,6-Dichlorbenzyl bestehenden

Gruppe ausgewählt. Dabei wird 2,6-Dichlorbenzyl bevorzugt. X^s ist eine Schutzgruppe für die Seitenkettenguanidingruppe oder die Aminogruppe der Imidazolgruppe von Arg, Lys, His oder

ähnlichen, wie Nitro, Tos, Trityl, Benzyloxycarbonyl, Adamantyloxycarbonyl, Z und Boc, oder eine Schutzgruppe für Trp wie

X², oder X⁵ kann Wasserstoff sein, was bedeutet, daß sich an den Seitenkettengruppenatomen keine Schutzgruppe befindet. Tos wird im allgemeinen bevorzugt. X^е kann Gly-O-CH₂-[Harzträger]; O-CH₂-[Harztrager]; D-AIa-O-CH₂-1Harzträger]; Gly-NH-[Harzträger] oderD-Ala-NH-[Harzträger]

sein; und kann OH, Ester, Amid oder Hydrazid entweder von GIy oder D-AIa sein öder direkt an Pro gebunden sein.

Kriterium für die Auswahl der Seitenkettenschutzgruppen für X² bis X^е ist, daß die Schutzgruppe dem Reaktionsmittel gegenüber

unter den für die Entfernung der a-Aminoschutzgruppen gewählten Bedingungen bei jedem Syntheseschritt stabil bleibt. Die

Schutzgruppe sollte unter Kupplungsbedingungen nicht abgespalten werden, und die Schutzgruppe sollte nach Vervollständigung der Synthese der gewünschten Aminosäuresequenz entfernbar sein bei Reaktionsbedingungen, die die Peptidkette nicht beeinträchtigen. Wenn die X^e-Gruppe Gly-O-CH₂-[Harzträger]_r D-Ala-O-CH₂-[Harztrager] oder O-CH₂-[Harzträger] ist ist der Esterteil einer der

vielen funktioneilen Gruppen des Polystyrolharzträgers repräsentiert. Wenn die X^e-Gruppe Gly-NH-[Harzträgerl oder D-AIa-NH-[Harzträger] ist, verbindet eine Amidverbindung GIy oder D-AIa mit dem BHA-Harz oder mit einem MBHA-Harz. Wenn X beispielsweise Acetyl in der Endformel ist, kann es möglich sein, daß es als X¹-Schutzgruppe für die a-Aminogruppe von D-

NAL oder welche andere Aminosäure auch verwendet wird, in der 1-Stellung eingesetzt wird, indem es vor dem Kuppeln

dieser letzten Aminosäure an die Peptidkette angefügt wird. Allerdings wird eine Reaktion vorzugsweise mit dem Peptid auf dem Harz durchgeführt(nach dem Entblockieren der a-Aminogruppe, während die Seitenkettengruppen geschützt bleiben), beispielsweise durch Umsetzen mit Essigsäure in Anwesenheit von Dicyclohexylcsrbodiimid (DCC) oder vorzugsweise mit

Essigsäureanhydrid oder über irgendeine andere aus dem Stand der Technik bekannte, geeignete Reaktion. Das voll geschützte Peptid kann von einem chlormethylierten Harzträger durch Ammonolyse abgespalten werden. Dies ist eine

bekannte Reaktion. Man erhält dabei das voll geschützte Amid-Zwischenprodukt. Die Entfernung der Schutzgruppen vom

Peptid sowie die Abspaltung des Peptids vom Benzhydrylaminharz kann bei O⁰C mit Fluorwasserstoffsäure (HF) erfolgen. Vor

der Behandlung mit HF wird dem Peptid vorzugsweise Anisol hinzugesetzt. Nach der HF-Entfernung unter Vakuum wird das abgespalten, ungeschützte Peptid in konventioneller Weise mit Ether behandelt, dekantiert, mit verdünnter Essigsäure aufgenommen und lyophilisiert.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung eines Peptids oder dessen nichttoxischen Salzes, wobei das Peptid

die Formel

X-R,-R2-D-Trp-R4-R₅-R_e-R₇-Arg-Pro-R₁₀

aufweist, worin

X Wasserstoff oder eine Acylgruppe mit sieben oder weniger Kohlenstoffatomen ist; R₁ ist Dehydro-Pro, D-pGlu, D-Phe, D-Trp

oder /3-D-NAL; R₂ ist Cl-D-Phe, F-D-Phe, NO₂-D-Phe, CMe^-CI-D-Phe, CI₂-D-Phe oder Br-D-Phe; R₄ ist Ser, Om, AAL oder aBu,

R₅ ist Tyr, 3-F-Phe, 2-F-Phe, 3-l-Tyr, 3-CH₃-Phe, 2-CH₃-Phe, 3-CI-Phe oder 2-CI-Phe; R₆ ist ein D-Isomeres einer lipophilen Aminosäure oder ist 4-NH_rD-Phe_r D-Lys, D-Om, D-Har, D-His, 4-gua-D-Phe oder D-Arg; R₇ ist Leu oder N"Me-Leu; und R₁₀ ist GIy-NH₂, GIy-OCH₃, GIy-OCH₂CH₃, Sar-NH* D-AIa-NH₂ oder NH-Y, wobei Y Niederalkyl, Cycloalkyl, Fluor-Niederalkyl oder NH-C-NH-Q _{jst wobe}j Q wasserstoff oder Niederalkyl ist, und worin /8-D-2-NAL für D-Trp in 3-Stellung substituiert sein

kann; mit der Maßgabe, daß, wenn R, /8-D-NAL ist, R₆ 4-NH₂-D-Phe, D-lys, D-Orn, D-His, 4-gua-D-Phe oder D-Arg ist, und mit der weiteren Maßgabe, daß, wenn R₅ Tyr oder 2-CI-Phe ist, entweder R₄ Om, AAL oder aBu ist oder R₁ /3-D-2NAL ist und R₆ D-His oder 4-gua-D-Phe ist

Das Verfahren besteht darin,

(a) ein Zwischenprodukt der Formel X¹-R_rR₂-D-Trp(X²)-R₄(X³)-R_s(X⁴)-Re(X⁵)-R₇-Arg(X⁵i-Pro-X⁶

zu bilden, worin X¹ Wasserstoff oder eine a-Aminoschutzgruppe ist; X² ist Wasserstoff oder eine Schutzgruppe für den

Indolstickstoff; X³ ist Wasserstoff oder eine Schutzgruppe für die alkoholische Hydroxylgruppe von Ser oder für eine Seitenkettenaminogruppe; X⁴ ist Wasserstoff oder eine Schutzgruppe für die phenolische Hydroxylgruppe von Tyr; X^s ist Wasserstoff oder eine Schutzgruppe für die Seitenkette; und X^е ist ausgewählt aus der aus Gly-O-CH₂[Harzträger], O-CH₂-[Harzträger], D-AIa-O-CH₂-

[Harzträger], Gly-NH-[Harzträger], D-Ala-NH-[Harzträger], GIy-NH₂, und Estern, Amiden und Hydraziden bestehenden

Gruppe;

(b) eine oder mehrere der Gruppen X¹ bis X⁵ abzuspalten und/oder Abtrennen von irgendeinem Harzträger, der zu X⁶ gehört, und gewünschtenfalls

(c) Umwandeln eines erhaltenen Peptids in eines seiner nichttoxrschen Salze.

Die Reinigung des Peptids erfolgt mittels lonenaustauschchromatografie auf einer CMC-Säule mit anschließender Verteilungschromatografie unter Verwendung des Eluierungssystems n-Butanol; 0,1 N Essigsäure (1:1 Volumenverhältnis} auf einer mit Sephadex G-25 gepackten Säule oder unter Verwendung von HPLC, wie dies aus dem Stand der Technik bekannt ist.

Die erfindungsgemäßen Peptide sind wirksam bei Spiegeln unter 100mg pro kg Körpermasse, wenn sie etwa am Mittag des Tages des Proöstrus verabreicht werden, um die Ovulation bei weiblichen Ratten zu verhindern. Für eine verlängerte Hemmung der Ovulatipn kann es erforderlich sein. Dosismengen im Bereich von etwa 0,1 bis etwa 2,5mg pro kg Körpermasse einzusetzen. Diese Antagonisten sind auch wirksam, die Spermatogenese zu hemmen, wenn sie männlichen Säugetieren regelmäßig verabreicht werden und können somit als Kontrazeptiva verwendet werden. Da diese Verbindungen die Testosteronspiegel reduzieren (eine unerwünschte Konsequenz beim normalen, sexuell aktiven männlichen Wesen), kann es angemessen sein, Testosteron-Ausgleichdosen zusammen mit dem GnRH-Antagonisten zu geben. Diese Antagonisten können auch dafür eingesetzt werden, die Produktion von Gonadotropinen und Geschlechtssteroiden für andere als die hier genannten Zwecke zu regulieren.

Ausführungsbeispiel Die in Tabelle I aufgeführten Peptide weisen die allgemeine Formel Ac-R_r4-F-D-Phe-D-Trp-Ser-R₅-R_e-Leu-Arg-Pro-R₁₀

auf und werden durch Festphasenverfahren, wie oben beschrieben hergestellt.

Ri Rs Re Rio

D-Arg GIy-NH₂

D-Trp GIy-NH₂

/3-D-2NAL Gly(/3-D-2NAL³|

/J-D-INAL Gly(4-Cl-D-Phe²)

D-Trp GIy-NH₂

D-Arg GIy-NH₂

4-gua-D-Phe GIy-NH₂

D-His GIy-NH₂

D-Leu NHCH₂CH₃ D-Phe NHCH₂CH₃ D-IIe D-AIa-NH₂ D-VaI GIy-NHNH₂

Zur beispielhaften Erläuterung wird nachstehend eine repräsentative Festphasensynthese des Peptids Nr. 1, das als [Ac-0-D-2NAL', 4-F-D-Phe², D-Trp³,2-CH₃-Phe⁵, D-Argi-GnRH bezeichnet wird, beschrieben. Dieses Peptid hat die folgende Formel: Ac-/3-D-2NAL-4-F-D-Phe-D-Trp-Ser-2-CH₃-Phe-D-Ärg-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂.

Es wurde ein BHA-Harz eingesetzt und Boc-geschütztes GIy wurde an das Harz über einen Zeitraum von 2 Stunden in CH₂CI₂ gekoppelt, wobei ein dreifacher Überschuß an Boc-Derivat und DCC als aktivierendes MIttel verwendet worden ist. Der Glycinrest ist an den BHA-Rest über eine Amidbindung gebunden.

1	0-D-2NAL	2-CH₃-Phe
2	0-D-2NAL	3-CH₃-Phe
3	/8-D-2NAL	3-l-Tyr
4	Dehydro-Pro	3-CI-Phe
5	Dehydro-Pro	2-F-Phe
6	Dehydro-Pro	2-CI-Phe(Orn⁴)
7	Dehydro-Pro	Tyr (Om⁴)
8	Dehydro-Pro	2-CH₃-Phe
9	Dehydro-Pro	2-CI-Phe
10	Dehydro-Pro	3-F-Phe
11	(3-D-2NAL	3-F-Phe
12	0-D-2NAL	Tyr
13	/3-D-2NAL	Tyr
14	Dehydro-Pro	Tyr (AAL⁴)
15	D-Trp	2-F-Phe(aBu⁴)
16	D-pGlu	2-F-Phe
17	D-Phe	2-F-(Om⁴)

Das anschließende Kuppeln jedes Aminosäurerestes, Waschen, Entblockieren und Kuppeln des nächsten Aminosäureesters wurde in Übereinstimmung mit dem folgenden Zeitplan unter Verwendung eines automatisierten Gerätes durchgeführt, beginnend mit etwa 5g Harz: Schritt Reagentien und Operationen Miscfrzeiten (Min.)

~ CH₂CI₂ Wäsche, 80 ml, (2mal) 3

2 Methanol (MeOH)-Wäsche, 30 ml (2mal) 3

3 CH₂CI₂ Wäsche, 80ml, (3mal) 3

4 50%TFAplus5%1,2-EthandithiolinCH2CI₂,70ml(2mal) 10

5 Isopropanol + 1 % Ethandithiol-Wäsche, 80 ml (2mal) 3

6 TEA 12,5% in CH₂CI₂,70 ml (2mal) 5

7 MeOH-Wäsche,40ml(2mal) 2

8 CH₂CI₂-WaSChC, 80 ml (3mal) 3

9 Boc-Aminosäure (10 mMol) in 30 ml entweder OMF ode'r CH₂CI₂, abhängig von der Löslichkeit dejr speziellen geschützten Aminosäure (1 mal), plus DCC (10 mMol) InCH₂CI₂ 30-300

10 MeOH-Wäsche,40ml(2mal) 3

11 TEA 12,5% in CH₂CI₂,70 ml(1 mal) 3

12 MeOH-Wäsche,30ml(2mal) 3

13 CH₂CI₂-Wäsche, 80 ml (2mal) 3

Nach Schritt 13 wird ein Aliquot für einen Ninhydrintest genommen: ist der Test negativ, wird mit Schritt 1 beginnend die nächste Aminosäure angekoppelt, ist der Test positiv oder leicht positiv, sind die Schritte 9 bis 13 zu wiederholen. Der oben aufgeführte Zeitplan wurde zum Kuppeln jeder der Aminosäuren des erfindungsgemäßen Peptids eingesetzt, nachdem die erste Aminosäure angefügt worden ist. Ein N'Boc-Schutz wurde verwendet für jede der verbleibenden Aminosäuren über die gesamte Synthese. №Boc-/3-D-2NAL wurde durch aus dem Stand der Technik bekannte Verfahren hergestellt, beispielsweise gemäß der detaillierten Beschreibung in der US-PS 4 234 571 vom 18.11.1980. Die Seitenkette von Arg wurde mit Tos geschützt. OBzI wurde als Seitenkettenschutzgruppe für die Hydroxylgruppe von Serverwendet. D-Trp bleibt ungeschützt. N"Boc-/3-D-2NAL wurde als Endaminosäure eingeführt. Boc-Arg (Tos) und Boc-D-Trp, die eine geringe Löslichkeit in CH₂CI₂ haben, wurden unter Verwendung von DMF: CH₂CI-Gemischen gekuppelt.

Nach dem Entblockieren der a-Aminogruppe am N-Terminal erreichte marfeine Acetylierung durch einen großen Überschuß an Essigsäureanhydrid in Dichlormethan. Dabei entstand das folgende Molekül Ac-/3-DNAL-4-F-D-Phe-D-Trp-Ser(OBzl)-2CH₃-Phe-D-Arg(Tos)-Leu-Arg(Tos)-Pro-Gly-NH-{Harzträger]. Die Abspaltung des Peptids vom Harzträger und vollständige Entfernung der Schutzgruppen an den Seitenketten erfolgte sehr leicht bei 0°C mittels HF. Vor der HF-Behandlung wurde Anisol als Reinigungsmittel hinzugegeben. Nach der Entfernung von HF unter Vakuum ^x wurde das Harz mit 50%iger Essigsäure extrahiert und die Waschflüssigkeiten wurden lyophilisiert, um ein rohes Peptidpulver zu erhalten.

Die Reinigung des Peptids erfolgte dann durch lonenaustauschchromatografie auf CMC (Whatman CM 32, unter Verwendung eines Gradienten von 0,05 bis 0,3M NH₄OAc in 50/50 Methanol/Wasser), gefolgt von einer Verteilungschromatografie in einer Gelfiltrationssäule unter Verwendung des Eluierungssystems n-Butanoi, 0,1 N Essigsäure (Volumenverhältnis 1:1). Das Peptid wurde als homogen angesehen nach Einsat? der Dünnschichtchromatografie und einiger unterschiedlicher Lösungsmittelsysteme sowie der Umkehrphasen-Hochdruck-Flüssigchromatografie und einer wäßrigen Triethylammoniumphosphatlösung plus Acetonitril. Die Aminosäureanalyse des erhaltenen, gereinigten Peptids stimmte mit der Formel für die hergestellte Struktur überein, sie zeigte im wesentlichen ganzzahlige Werte für jede Aminosäure in der Kette. Die optische Drehung wurde in einem photoelektrischen Polarimeter gemessen [α]" = -27,50° ±1 (с = 1,50% Essigsäure).

Das Peptid wurde in vitro und in vivo untersucht. Der in vitro-Test erfolgte in der Weise, daß dissozierte Zellen von Rattenhypophyse 4 Tage vor der Untersuchung in Kultur gehalten wurden. Die LH-Spiegel, die sich bei Anwendung der Peptide ergaben, wurden durch spezielle Radioimmunoassay für Ratten-LH untersucht. Kontrollschälchen mit Zellen enthielten nur eine 3 nanomolare Menge an GnRH; Experin^entalschälchen enthielten eine 3 nanomolare Menge an GnRH plus einer Menge, die entweder den gegenwärtigen Standardantagonisten für Vergleichszwecke enthielt, das ist [Ac-dehydro Pro¹,4-F-D-Phe', D Trp^{3 6}J-GnRH oder das Testpeptid, in Konzentrationen von 0,01 bis 10 nanomolar. Die in den Proben ausgeschiedene und nur mit GnRH behandelte Menge LH wurde verglichen mit der von den Proben ausgeschiedenen und mit dem Peptid plus GnRH behandelten Menge.

Die Fähigkeit des Testpeptids, die Menge an LH, die durch 3 nanomolare GnRH freigesetzt wurde, zu reduzieren, wurde mit der des vorhandenen Standardpeptids verglichen. Diese Ergebnisse würden unter Verwendung von 3-5 Dosen jeweils der Peptide mittels des statistischen Programms BIOPROG (von D. Rodband NICHD) berechnet und als eine Potenz relativ zum vorhandenen Standard ausgedrückt. Das Standardpeptid blockiert üblicherweise 50% der durch GnRH freigesetzten LH bei weniger als einem Verhältnis von

O₁1 (}

1 (СііШГ

Das oben beschriebene Peptid wird auch dazu eingesetzt, die Wirksamkeit zu bestimmen, mit der die Ovulation bei weiblichen Ratten verhindert wird. In diesem Test wird eine spezifische Anzahl reifer weiblicher Sprague-Dawley-Ratten, jeweils mit einer Körpermasse von 225 bis 250g mit 10 Mikrogramm Peptid in Maisöl etwa um Mittag des Tages des Proöstrus injiziert. Proöstrus ist der Nachmittag vor dem Östrus (der Ovulation). Eine getrennte Gruppe weiblicher Ratten wird als Kontrollgruppe eingesetzt, bei denen das Peptid nicht verabreicht worden ist. Jede der weiblichen Kontrollratten hatte die Ovulation am Östrus, keine der behandelten Ratten hatte eine Ovulation. Als Ergebnis kann das Peptid als signifikant wirksam angesehen werden, die Ovulation weiblicher Ratten bei sehr niedrigen Dosen zu verhindern, und das Peptid kann als vollständig wirksam bei einer Dosis von

etwa 10 Mikrogramm angesehen werden. Es wurden zusätzliche Tests bei niedrigeren Dosen durchgeführt, deren Ergebnisse in der nachfolgenden Tabelle H angeführt sind.

Dabei waren die Peptide Nr. 2-17 auf ähnliche Weise synthetisiert und gereinigt worden. Nach Abschluß der Aminosäureanalyse wurde die Reinheit durch HPLC (Hochdruck-Flüssigchromatografie) unter Verwendung unterschiedlicher Lösungsmittelsysteme bestätigt. In vitro-Tests ähnlicher Art zeigten, daß einige der Peptide jeweils eine wie angegebene Wirksamkeit aufwiesen, relativ zum vorhandenen Standardantagpnisten. In vivo-Tests wurden bei unterschiedlichen Dosen für andere der Peptide ausgeführt, deren Ergebnisse ebenfalls aus Tabelle Il zu entnehmen sind.

Tabelle Il Peptid in vitro in vivo Anz. ovu- Nr. Μ" Wirksamkeit* Dosis (/ng) lierend

_ __ - —— r-

0,5 12/19

2 -29,4 1 6/18

3 -24,5 5 0/10

1 2/10

-74,9 1,02 10 9/10

5 3/10

-84,5 1,9 10 0/10

5 2/10

7 -77,5 0,29 10 0/10

2,5 1/10

1 8/10

9 -79,5 1,15 5 0/10

2,5 5/10

10 -73,1 0,45 10 0/6

5 2/20

11 -30,2 1 6/7

12 -36,6 2,5 8/10

2,5 4/10

13 -31,4 1 8/16 • relativ zu [Ac-dehydro Pro', 4-F-D-Phe*, D-Trp^Ml-GnRH

Alle in Tabelle I aufgeführten Peptide wurden als wirksam angesehen, die GnRH-induzierte LH in vitro bei mäßigen Konzentrationen zu blockieren. Viele dieser Peptide sind in vivo wesentlich wirksamer als der gegenwärtige Standard. Alle diese Peptide, sind wirksam, die Ovulation bei weiblichen Säugetieren bei sehr niedrigen Dosen zu verhindern und einige ausgewählte davon können als zweimal so wirksam wie alle anderen bisher bekannten und getesteten GnRH Antagonisten angesehen werden.

Die erfindungsgemäßen Peptide können in Form pharmazeutisch annehmbarer nichttoxischer Salze verabreicht werden, so als Säureadditionssalze oder als Metallkomplexe, beispielsweise mit Zink, Barium, Kalzium, Magnesium, Aluminium oder ähnlichen (die für die Zwecke dieser Erfindung als Additionssalze betrachtet werden) oder als Kombination dieser beiden. Beispiele für derartige Additionssalze sind Hydrochloride, Hydrobromide, Sulfate, Phosphate, Nitrate, Oxalate, Fumarate, Glukonate, Tannate, Maleate, Acetate, Citrate, Benzoate, Succinate, Alginate, Maleate, Ascorbate, Tartrate und so weiter. Wenn der aktive Bestandteil in Tablettenform verabreicht wird, kann die Tablette ein pharmazeutisch annehmbares Verdünnungsmittel enthalten mit einem oder als Bindemittel, wie Tragacanth, Maisstärke oder Gelatine; ein zerfallsförderndes Mittel wie Alginsäure und ein Gleitmittel wie Magnesiumsterarat. Falls eine Verabreichung in flüssiger Form erwünscht ist, können Süßungs- und/oder Duftmittel als Teil des pharmazeutisch annehmbaren Verdünnungsmittels verwendet werden und für den Fall der intravenösen Verabreichung in isotonischer Salzlösung Phosphatpufferlösungen oder ähnliches. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen werden üblicherweise das Peptid mit einem bekannten, pharmazeutisch annehmbaren Trägerstoff enthalten. Die Dosis wird üblicherweise von etwa 1 bis etwa 100 Mikrogramm Peptid pro Kilogramm Körpermasse des Patienten bei intravenöser Gabe betragen; orale Dosen werden etwas höher liegen. Insgesamt erfolgt die Behandlung von Patienten mit diesen Peptiden im allgemeinen in gleicher Weise wie die klinische Behandlung unter Verwendung anderer GnRH-Antagonisten.

Diese Peptide können Säugetieren intravenös, subkutan, intramuskulär, oral, perkutan, beispielsweise intranasal oder intravaginal verabreicht werden, um eine Inhibierung der Befruchtung zu erreichen und/oder eine Steuerung sowie auch bei Applikationen für die reversible Unterdrückung der gonadalen Aktivität, so bei verfrühter Pubertät oder während der Bestrahlungs- oder Chemotherapie. Wirksame Dosismengen hängen von der Art der Verabreichung und der speziellen Art Säugetier ab, das behandelt werden soll. Ein Beispiel für eine typische Dosierungsform ist eine bakteriostatische wäßrige Lösung, die das Peptid enthält, mit einer Dosis von etwa 0,1 bis 2,5 mg/kg Körpermasse. Die orale Verabreichung des Peptids kann sowohl in fester als auch in flüssiger Form erfolgen.

Obgleich die Erfindung hinsichtlich bevorzugter Ausführungsformen beschrieben worden ist, so sollte klar sein, daß Veränderungen und Modifikationen im Bereich des fachmännischen Tuns liegen und damit der Schutzumfang der Erfindung nicht verlassen wird. Beispielsweise können andere Substitutionen, die aus dem Stand der Technik bekannt sind und nicht wesentlich die Wirksamkeit der Peptide beeinträchtigen, bei den erfindungsgemäßen Peptiden erfolgen.

Claims

Erfindungsansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung eines Peptide oder dessen nichttoxischen Salzes, wobei das Peptid die Formel X-R₁-R₂-D-TrP-R₄-R₅-R₆-R₇-ArQ-PrO-Ri₀
aufweist, worin

X Wasserstoff oder eine Acylgruppe mit sieben oder weniger Kohlenstoffatomen ist; R₁ ist Dehydro-Pro, D-p-Glu, D-Phe, D-Trp oder /3-D-NAL; R₂ ist Cl-D-Phe, F-D-Phe; N0₂-D-Phe, C" Me-4-CI-D-Phe, CI₂-D-Phe oder Br-D-Phe; R₄ ist Ser, Om, AAL oder aBu, R₆ istTyr, 3-F-Phe, 2-F-Phe, D-I-Tyr, 3-CH₃-Phe, 2-CH₃-Phe, 3-CI-Phe oder 2-CI-Phe; R₆ ist ein D-Isomeres einer lipophilen Aminosäure oder ist 4-NH₂-D-Phe, D-Lys, D-Om, D-Har, D-His, 4-gua-D-Phe oder D-Arg; R₇ ist Leu oder N" Me-Leu; und R₁₀ ist GIy-NH₂, GlV-OCH₃, GIy-OCH₁CH₃, Sar-NH₂, D-AIa-NH₁ oder NH-Y, wobei Y Niederalkyl, Cycloalkyl, Fluor-Niederalkyl oder ^NH-^C,~^NH~^Q j_st, wobei Q Wasserstoff oder Niederalkyl ist, und worin /3-D-2-NAL für D-Trp in 3-

O
Stellung substituiert sein kann; mit der Maßgabe, daß, wenn R₁ /3-D-NAL ist, R₆ 4-NH_rD-Phe, D-Lys, D-Orn, D-His, 4-gua-D-Phe oder D-Arg ist, und mit der weiteren Maßgabe, daß, wenn R₆ Tyr oder 2-CI-Phe ist, entweder R₄ Om, AAL oder aBu ist oder R₁0-D-2NAL ist und R₆ D-His oder 4-gua-D-Phe ist, gekennzeichnet dadurch, daß es darin besteht,

(a) nach den für die Peptidsynthese bekannten Flüssigphasen- oder Festphaeenmethoden ein Zwischenprodukt der Formel